EA001092B1

EA001092B1 - Выделенные последовательности днк, кодирующие капсидные белки l1 и l2 папилломавируса человека типа 18, вектор для экспрессии последовательностей днк, способ получения вирусоподобных частиц и способ индуцирования иммунного ответа

Info

Publication number: EA001092B1
Application number: EA199700256A
Authority: EA
Inventors: Кетрин Дж. Хофманн; Кетрин У. Янзен; Майкл П. Нипер; Джозеф Г. Джойс; Хью А. Джордж
Original assignee: Мерк Энд Ко., Инк.
Priority date: 1995-03-22
Filing date: 1996-03-18
Publication date: 2000-10-30
Also published as: FR07C0023I1; EP0817851B1; DE122007000031I1; WO1996029413A2; DK0817851T3; HUP9801334A2; NL300273I1; EP0817851A2; SK284281B6; EP1422294A1; CN1185176A; AU5314196A; NO322254B1; MX9707208A; DE69631586T2; DE69631586D1; PL322333A1; ATE259879T1; DE122007000025I1; DE69631586T9

Description

Эта заявка является продолжением заявки И8 № 08/408669, зарегистрированной 22 марта 1995 г., в настоящее время ожидающей рассмотрения, и продолжением заявки и8 № 08/409122, зарегистрированной 22 марта 1995 г., в настоящее время ожидающей рассмотрения.

Область изобретения

Данное изобретение относится к молекулам ДНК, кодирующим капсидные белки Ь1 и Ь2 папилломавируса человека типа 18, и их производным.

Краткое описание рисунков

Фиг.1 показывает нуклеотидную и выведенную аминокислотную последовательности Ь1 НРУ18;

фиг. 2 - перечень аминокислотных изменений в белке Ь1 НРУ 18;

фиг. 3 - нуклеотидную и выведенную аминокислотную последовательности Ь2 НРУ 18;

фиг. 4 - иммуноблот белка Ь1 НРУ18, экспрессируемого в дрожжах;

фиг. 5 - иммуноблот белка Ь2 НРУ18, экспрессируемого в дрожжах;

фиг. 6 - электронная микрофотография вирусоподобных частиц, образованных белком Ь1 НРУ18, экспрессируемым в дрожжах.

Предпосылки изобретения

Инфекции, вызванные папилломавирусами (РУ), встречаются у различных животных, в том числе у человека, овец, собак, кошек, кроликов, обезьян, змей и коров. Папилломавирусы инфицируют эпителиальные клетки, как правило, индуцируя доброкачественные эпителиальные или фиброэпителиальные опухоли в месте инфекции. РУ являются видоспецифическими инфекционными агентами: папилломавирус человека не инфицирует животных.

Папилломавирусы могут быть разделены на различные группы в зависимости от хозяина, которого они инфицируют. Папилломавирусы человека (НРУ) подразделяются далее на более 70 типов на основе гомологии последовательности ДНК. По-видимому, различные РУ являются типоспецифическими иммуногенами в том смысле, что нейтрализующий иммунитет к инфекции, вызванной одним типом папилломавируса, не создает иммунитета против другого типа вируса папилломы.

У человека различные типы НРУ вызывают различные заболевания. Типы НРУ 1, 2, 3, 4, 7, 1 0 и 26-29 вызывают образование доброкачественных бородавок, как у нормальных индивидуумов, так и у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Типы НРУ 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 и 45-50 вызывают плоские повреждения у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Типы НРУ 6, 11, 34, 39, 41-44 и 51-55 вызывают доброкачественные кондиломы слизистой оболочки половых органов или дыхательных путей. Типы НРУ 1 6 и 1 8 вызывают эпителиальную дисплазию половых органов и связаны с большей частью ίη 8Йи карцином и инвазивных карцином шейки матки, вагины, вульвы и анального канала.

Папилломавирусы являются небольшими (50-60 нм), не имеющими оболочки, икосаэдральными ДНК-вирусами, которые кодируют до восьми ранних и двух поздних генов. Открытые рамки считывания (ОКТ) геномов этих вирусов обозначаются как Е1-Е7 и Ь1 и Ь2, где Е обозначает ранние (еаг1у) и Ь обозначает поздние (1а1е). Ь1 и Ь2 кодируют вирусные капсидные белки. Ранние (Е) гены ассоциированы с такими функциями, как репликация вируса и преобразование клеток.

Белок Ь1 является основным капсидным белком и имеет мол. массу 55-60 кДа. Белок Ь2 является минорным капсидным белком, который имеет предсказанную мол. массу 55-60 кДа и среднюю (кажущуюся) мол. массу 75-100 кДа, как определено при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Иммунологические данные предполагают, что большая часть белка Ь2 является внутренней по отношению к белку Ь1. ОКТ Ь1 является высококонсервативной среди различных папилломавирусов. Белки Ь2 являются менее консервативными среди различных папилломавирусов.

Было обнаружено, что гены Ь1 и Ь2 являются хорошими мишенями для иммунопрофилактики. Исследования в системах папилломавируса американского кролика (СКРУ) и бычьего папилломавируса (ВРУ) показали, что иммунизация белками Ь1 и Ь2, экспрессированными в бактериях, или с использованием векторов на основе вируса осповакцины защищали животных от вирусной инфекции. Экспрессия генов Ь1 папилломавируса в бакуловирусных системах или с использованием векторов на основе вируса осповакцины приводила к сборке вирусоподобных частиц (УЬР), которые были использованы для индуцирования ответов с высоким титром вируснейтрализующих антител, которые обеспечивают защиту от вирусной инфекции.

После типа 1 6 НРУ, НРУ1 8 представляет собой наиболее распространенный тип НРУ, обнаруженный в карциномах шейки матки. НРУ18 был обнаружен в 5-20% биопсий цервикального рака, собранных из различных частей мира (1кепЬегд, Н. 1990. Нитап рарШотау1ти8 ΌΝΑ ίη туалте депйа1 сагсшотак. Ιη Сепка1 РарШота νίπΐδ Шесйоп. Ο.Οτοδδ ека1., р.85-112). По-видимому, существует географическая зависимость инфекции НРУ18, поскольку опухолевые биопсии, взятые у женщин Африки и Южной Америки, несут НРУ 18 более часто, чем подобные биопсии, взятые у женщин из Европы и Северной Америки. Лежащие в основе этих географических различий причины неизвестны. Разработка вакцины против инфекции НРУ1 8 становится крайне важной, так как НРУ1 8 связан также с более агрессивно растущими раковыми опухолями и редко обнаруживается в бо3 лее мягких предшествующих повреждениях, ΟΝ Ι-ΙΙ.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к молекулам ДНК, кодирующим капсидные белки Ь1 и Ь2 папилломавируса человека типа 18 (НРУ 1уре 18, НРУ18), и к использованию этих молекул ДНК.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к молекулам ДНК, кодирующим капсидные белки Ь1 и Ь2 папилломавируса человека типа 18 (НРУ 1уре 18, НРУ18), и их производным. Такие производные включают (но не ограничены ими) пептиды и белки, кодируемые этой ДНК, антитела к этой ДНК или антитела к белкам, кодируемым этой ДНК, вакцины, содержащие эту ДНК, или вакцины, содержащие белки, кодируемые этой ДНК, иммунологические композиции, содержащие эту ДНК или белки, кодируемые этой ДНК, наборы, содержащие эту ДНК или произведенную из нее РНК, или белки, кодируемые этой ДНК.

Фармацевтически применимые композиции, содержащие ДНК или кодируемые этой ДНК белки, могут быть приготовлены в соответствии с известными способами, такими как смешивание с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры таких носителей и способы приготовления могут быть найдены в Вепипдΐοη'δ Рйаттасеийса1 8сюпсс5. Для получения фармацевтически приемлемой композиции, пригодной для эффективного введения, такие композиции должны содержать эффективное количество ДНК, или белка, или УТР. Такие композиции могут содержать ДНК, или белки, или УЪР, произведенные из более чем одного типа НРУ.

Терапевтические или диагностические композиции данного изобретения вводят индивидууму в количествах, достаточных для лечения или диагностики инфекций РУ. Эффективное количество может варьировать в зависимости от различных факторов, таких как состояние, вес, пол и возраст индивидуума. Другие факторы включают способ введения. Как правило, композиции следует вводить в дозах от ~1 мкг до ~1 мг.

Фармацевтические композиции могут вводиться индивидууму различными способами, такими как подкожный, местный, пероральный, через слизистую оболочку, внутривенный и внутримышечный.

Вакцины данного изобретения содержат ДНК, РНК или белки, кодируемые этими ДНК, которые содержат антигенные детерминанты, необходимые для индуцирования образования нейтрализующих антител у хозяина. Такие вакцины являются также достаточно безопасными для введения без риска клинической инфекции; не имеют токсических побочных действий; являются стабильными; совместимы с носителями вакцин.

Вакцины можно вводить различными способами, такими как пероральный, парентеральный, подкожный, через слизистую оболочку, внутривенный или внутримышечный. Вводимая доза может меняться в зависимости от состояния, пола, веса и возраста индивидуума; способа введения; и типа РУ вакцины. Вакцину можно использовать в дозированных лекарственных формах, таких как капсулы, суспензии, эликсиры или жидкие растворы. Вакцина может быть приготовлена с иммунологически приемлемым носителем.

Вакцины вводят в терапевтически эффективных количествах, т.е. в количествах, достаточных для генерирования иммунного протективного ответа. Терапевтически эффективное количество может меняться в зависимости от типа РУ. Вакцину можно вводить в виде одной дозы или в виде множественных доз.

ДНК или производные ДНК данного изобретения могут быть использованы для приготовления иммуногенных композиций. Такие композиции при введении в организм подходящего хозяина способны индуцировать иммунный ответ у хозяина.

ДНК и ее производные могут быть использованы для генерирования антител. Термин антитела в применении здесь включает как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также их фрагменты, такие как Ρν, РаЬ и Р(аЬ)2, которые способны связывать антиген или гаптен.

ДНК и производные ДНК данного изобретения могут быть использованы для серотипирования инфекции НРУ и скрининга НРУ. ДНК, рекомбинантные белки, УЪР и антитела могут быть использованы для приготовления наборов (китов), пригодных для обнаружения и серотипирования НРУ. Подобный набор мог бы содержать компартментализованный носитель, пригодный для удерживания в ограниченном пространстве, по меньшей мере, одного контейнера. Кроме того, носитель может включать в себя реагенты, такие как ДНК НРУ18, рекомбинантный белок НРУ или УЪР или антитела против НРУ, пригодные для обнаружения различных типов НРУ. Носитель может также содержать средства для детектирования, например, антиген или субстраты фермента и т. п.

ДНК и производные из нее белки применимы также в качестве маркеров молекулярной массы и молекулярного размера.

Поскольку генетический код является вырожденным, более чем один кодон может использоваться для кодирования конкретной аминокислоты, и, следовательно, аминокислотная последовательность может кодироваться любым из набора сходных ДНК-олигонуклеотидов. Только один член этого набора будет идентичен последовательностям НРУ18, но будет способен гибридизоваться с ДНК НРУ18 даже в присутствии ДНК-олигонуклеотидов с неправильными спариваниями оснований при соответствующих условиях. При других условиях неправильно спаренные ДНК-олигонуклеотиды могут все еще гибридизоваться с ДНК НРУ18, что позволяет индентифицировать и выделять кодирующую ДНК НРУ18.

Очищенную ДНК НРУ18 по этому изобретению или ее фрагменты можно использовать для выделения и очистки гомологов и фрагментов НРУ1 8 из других источников. Для выполнения этого первую ДНК НРУ18 можно смешать с пробой, содержащей ДНК, кодирующую гомологи НРУ18, при подходящих условиях гибридизации. Г ибридизованный ДНК-комплекс можно выделить и из него можно очистить ДНК, кодирующую эту гомологичную ДНК.

Известно, что имеется значительное количество избыточности в различных кодонах, кодирующих специфические аминокислоты. Таким образом, данное изобретение касается также тех последовательностей ДНК, которые содержат альтернативные кодоны, кодирующие возможную при некоторых обстоятельствах трансляцию идентичной аминокислоты. Для целей этой заявки последовательность, несущая один или несколько замененных кодонов, будет называться вырожденной вариацией. В сфере действия данного изобретения находятся также мутации либо в ДНК-последовательности, либо в транслированном белке, которые, по существу, не изменяют конечные физические свойства экспрессируемого белка. Например, замена валина на лейцин, лизина на аргинин, или аспарагина на глутамин может не вызывать изменения в функциональности данного полипептида.

Известно, что последовательности ДНК, кодирующие пептид, могут быть изменены таким образом, что они будут кодировать пептид, имеющий свойства, отличающиеся от свойств природно-встречающегося пептида. Способы изменения последовательностей ДНК включают в себя сайт-специфический мутагенез (но не ограничиваются им).

В применении здесь функциональным производным НРУ18 является соединение, которое обладает биологической активностью (функциональной или структурной), которая, в основном, сходна с биологической активностью НРУ18. Термин функциональные производные предназначен для фрагментов, вариантов, вырожденных вариантов, аналогов и гомологов или химических производных НРУ18. Термин фрагмент относится к любой полипептидной подсерии НРУ18. Термин вариант относится к молекуле, в основном сходной по структуре и функции либо со всей молекулой НРУ18, либо с ее фрагментом. Молекула в основном сходна с НРУ18, если обе эти молекулы имеют, по существу, сходные структуры или если обе молекулы обладают одинаковой биологической активностью. Таким образом, если две молекулы обладают, по существу, одинаковой активностью, они рассматриваются как варианты, даже если структура одной из этих молекул не обнаружена в другой, и даже если эти две аминокислотные последовательности не являются идентичными.

Термин аналог относится к молекуле, в основном сходной по функции либо со всей молекулой НРУ18, либо с ее фрагментом.

Многие способы, известные в данной области, можно применять для молекулярного клонирования ДНК НРУ18. К этим способам относится (но не ограничивается этим) прямая функциональная экспрессия генов НРУ1 8 после конструирования библиотеки НРУ18, содержащей кДНК или геномную ДНК в подходящей системе экспрессирующего вектора. Другим способом является скрининг библиотеки НРУ18, содержащей кДНК или геномную ДНК, сконструированной в бактериофаге или в плазмидном челночном векторе, меченым олигонуклеотидным зондом, построенным на основе аминокислотной последовательности НРУ18. Дополнительный способ состоит из скрининга библиотеки НРУ18, содержащей кДНК или геномную ДНК, сконструированной в бактериофаге или плазмидном челночном векторе, при помощи частичной ДНК, кодирующей НРУ18. Эту частичную ДНК получают амплификацией при помощи специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК-фрагментов НРУ18 посредством конструирования вырожденных олигонуклеотидных праймеров на основе аминокислотной последовательности очищенного НРУ18. Другой способ заключается в выделении РНК из продуцирующих НРУ1 8 клеток и трансляции этой РНК в белок при помощи системы трансляции ίη νίΐτο или ίη νίνο. Трансляция этой РНК в пептид или белок приведет к образованию, по меньшей мере, части белка НРУ18, который можно идентифицировать, например, по активности белка НРУ1 8 или по иммунологической реактивности с антителами против НРУ18. В этом способе пулы РНК, выделенной из продуцирующих НРУ1 8 клеток, могут быть анализированы на присутствие РНК, которая кодирует, по меньшей мере, часть НРУ18. Дальнейшее фракционирование этого пула РНК может быть осуществлено для очистки РНК НРУ1 8 от РНК, не относящейся к НРУ18. Пептид или белок, продуцируемый по этому способу, можно анализировать для обеспечения аминокислотных последовательностей, которые, в свою очередь, используют для создания праймеров для получения кДНК НРУ18, или РНК, используемую для трансляции, можно анализировать для обеспечения нуклеотидных последовательностей, кодирующих НРУ18, и получения зондов для скрининга библиотеки кДНК НРУ18. Эти способы известны в данной области и их можно найти, например, в Зат7

Ьгоок Ί., Ρπίδΐι Е.Р., ΜαηίαΙίδ Τ. ίη Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 8есопб Εάίίίοη, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ртезз, Со1б 8ртшд НагЬог, ΝΥ,1989.

Очевидно, что для выделения НРУ18кодирующей ДНК можно использовать другие типы библиотек, а также библиотеки, сконструированные из других клеток или типов клеток. Другие типы библиотек включают в себя (но не ограничиваются ими) библиотеки кДНК, полученные из других клеток или клеточных линий, содержащих НРУ типа 18, и библиотеки геномной ДНК.

Получение библиотек кДНК может быть осуществлено различными способами. Способы конструирования библиотек кДНК можно найти, например, в 8атЬтоок ί., е1 а1., зирга. Очевидно, что ДНК, кодирующую НРУ18, можно также выделить из соответствующей библиотеки геномной ДНК. Конструирование библиотек геномных ДНК можно выполнять различными способами. Способы конструирования библиотек геномных ДНК можно найти в 8атЬтоок ί., е1 а1., зирта.

Клонированные ДНК НРУ 18 или их фрагменты, полученные описанными здесь способами, могут рекомбинантно экспрессироваться молекулярным клонированием в экспрессирующий вектор, содержащий подходящий промотор и другие подходящие регуляторные элементы транскрипции, и переноситься в прокариотические или эукариотические клеткихозяева для продуцирования рекомбинантного НРУ18. Способы таких манипуляций полно описаны в 8атЬтоок ί., е1 а1., зирта и известны в этой области.

Экспрессирующие векторы определяются здесь как ДНК-последовательности, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в соответствующем хозяине. Такие векторы можно использовать для экспрессии эукариотических генов в многочисленных хозяевах, таких как бактерии, сине-зеленые водоросли, клетки растений, клетки насекомых, клетки грибов и клетки животных. Специально сконструированные векторы позволяют перемещать ДНК между такими хозяевами, как бактерии-дрожжи или бактерииклетки животных, или бактерии-клетки грибов, или бактерии-клетки позвоночных животных. Правильно сконструированный экспрессирующий вектор должен содержать: начало репликации для автономной репликации в клеткаххозяевах, селектируемые маркеры, ограниченное число применимых сайтов рестриктаз, потенциал для высокой копийности и активные промоторы. Промотор определяется как ДНКпоследовательность, которая направляет РНКполимеразу на связывание с ДНК и инициирует синтез РНК. Сильным промотором является такой промотор, который обусловливает высокую частоту инициации мРНК. Экспрессирующие векторы могут быть (но не только) клонирующими векторами, модифицированными клонирующими векторами, специально сконструированными плазмидами или вирусами.

Разнообразные экспрессирующие векторы млекопитающих можно использовать для экспрессии ДНК НРУ1 8 или ее фрагментов в клетках млекопитающих. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы млекопитающих, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного НРУ 18, включают (но не ограничиваются ими) рс^NА3 (1пуйтодеп), рМС1пео (§1га1адепе). рХТ1 (§1га1адепе). р8С5 (81та1адепе), ЕВО-р8У2-пео (АТСС 37593), рВРУ-1(8-2) (АТСС 37110), рбВРУ-ММТпео (342-12) (АТСС 37224), рК8У§р1 (АТСС 37199), рКБУпео (АТСС 37198), р8У2-бМт (АТСС 37146), рИСТад (АТСС 37460) и λΖΌ35 (АТСС 37565).

Множество бактериальных экспрессирующих векторов можно использовать для экспрессии ДНК НРУ18 и ее фрагментов в бактериальных клетках. Коммерчески доступные бактериальные экспрессирующие векторы, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного НРУ 18, включают (но не ограничиваются ими) рЕТ11а Щоуадеп), λ§ΐ11 Дпуйтодеп), рс^NАII (1пуйтодеп), рКК223-3 (Ркатшааа).

Множество экспрессирующих векторов грибных клеток можно использовать для экспрессии НРУ1 8 или его фрагментов в грибных клетках. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы грибных клеток, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного НРУ 18, включают (но не ограничиваются ими) рΥΕδ2 Дпуйтодеп), экспрессирующий вектор РюЫа Дпуйтодеп) и экспрессирующий вектор Напзепи1а (Ккеш Вю1еск. ЭиззеИогГ. Сегтапу).

Множество экспрессирующих векторов клеток насекомых можно использовать для экспрессии ДНК НРУ18 или ее фрагментов в клетках насекомых. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы клеток насекомых, которые могут быть пригодными для рекомбинантной экспрессии НРУ 18, включают (но не ограничиваются ими) рВ1иеВас111 (1пуйтодеп) и рАсИ^51 (РЬатМшдеп, 1пс.).

Экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую НРУ1 8 или его фрагменты, может быть использован для экспрессии белков НРУ1 8 или фрагментов белков НРУ1 8 в клетке, ткани, органе или животном (в том числе в человеке). Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, в том числе (но не только) бактериями, такими как Е.сой, клетками грибов, такими как дрожжи, клетками млекопитающих, в том числе (но не только), клеточными линиями человека, быка, свиньи, обезьяны и грызуна, и клетками насекомых, в том числе (но не только) клеточными линиями, произведенными из ИтокорШа и тутового шелкопряда. Клеточными линиями, произведенными из видов млекопитающих, которые могут быть пригодными и которые являются коммерчески доступными, являются (но не ограничены ими) Ь-клетки Ь-М (ТК-) (АТСС ССЬ 1.3), Ьклетки Ь-М (АТСС ССЬ 1.2), 293 (АТСС СКЬ 1573), Кац (АТСС ССЬ 86), СУ-1 (АТСС ССЬ 70), СО8-1 (АТСС СКЬ 1650), СО8-7 (АТСС СКЬ 1651), СНО-К1 (АТСС ССЬ 61), 3Т3 (АТСС ССЬ 92), ΝΙΗ/3Τ3 (АТСС СКЬ 1658), НеЬа (АТСС ССЬ 2), С1271 (АТСС СКЬ 1616), Б8-С-1 (АТСС ССЬ 26) и МК8-5 (АТСС ССЬ 171).

Экспрессирующий вектор может быть введен в клетки-хозяева посредством одного из ряда способов, таких как (но не только) трансформация, трансфекция, липофекция, слияние протопластов и электропорация. Содержащие экспрессирующий вектор клетки клонально размножают и индивидуально анализируют для определения, продуцируют ли они белок НРУ18. Идентификацию экспрессирующих НРУ18 клонов клеток-хозяев можно осуществлять несколькими способами, в том числе (но не только) по иммунологической реактивности с антителами против НРУ1 8 и по присутствию ассоциированной с клеткой-хозяином активности НРУ18, такой как связывание НРУ18специфического лиганда или трансдукция сигнала, определяемая как ответная реакция, опосредованная взаимодействием НРУ18специфических лигандов с экспрессируемыми НРУ1 8 белками.

Экспрессия ДНК-фрагментов НРУ18 может также осуществляться с использованием продуцируемой ίη νίΐτο синтетической мРНК или нативной мРНК. Синтетическая мРНК или мРНК, выделенная из продуцирующих НРУ1 8 клеток, может эффективно транслироваться в различных бесклеточных системах, таких как (но не только) экстракты зародышей пшеницы и экстракты ретикулоцитов, а также может эффективно транслироваться в системах на основе клеток, в том числе (но не только), посредством микроинъекции в ооциты лягушки, причем этот способ является предпочтительным.

После экспрессии белка (белков) НРУ18 в клетке-хозяине белок НРУ1 8 может быть извлечен для обеспечения НРУ1 8 в очищенном виде. Доступны и пригодны несколько способов очистки НРУ18. Как описано здесь, рекомбинантный белок НРУ1 8 может быть очищен из клеточных лизатов и экстрактов различными сочетаниями или отдельным применением солевого фракционирования, ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, адсорбционной хроматографии на гидроксилапатите и хроматографии гидрофобного взаимодействия.

Кроме того, рекомбинантный НРУ1 8 может быть отделен от других клеточных белков при помощи иммуноаффинной колонки, приготовленной с моноклональными и поликлональными антителами, специфическими для полноразмерного насцентного (строящегося) НРУ18 или полипептидных фрагментов НРУ18. Моноклональные и поликлональные антитела могут быть получены в соответствии со множеством способов, известных в данной области. Моноклональные или моноспецифические антитела в применении здесь, определяются как молекулы одного антитела или молекулы множественных антител с однородными характеристиками связывания в отношении НРУ18. Однородным связыванием здесь называют способность молекул антитела связываться со специфическим антигеном или эпитопом.

Очевидно, что способы получения моноспецифических антител могут быть использованы для получения антител, специфических для полипептидных фрагментов НРУ или полноразмерных полипептидов НРУ. В частности, ясно, что могут быть получены моноспецифические антитела, которые являются специфическими для полностью функциональных белков НРУ или их фрагментов.

Данное изобретение касается также способов скрининга на соединения, которые модулируют экспрессию ДНК или РНК, кодирующих НРУ18, а также функцию (функции) белка (белков) НРУ 18 ίη νίνο. Соединениями, которые модулируют эти активности, могут быть ДНК, РНК, пептиды, белки или небелковые органические молекулы. Соединения могут модулировать эти активности увеличением или аттенюированием экспрессии ДНК или РНК, кодирующих НРУ18, или функции белка НРУ18. Соединения, способные модулировать экспрессию ДНК или РНК, кодирующих НРУ18, или функцию белка НРУ18, могут быть обнаружены различными тестами. Такой тест может быть простым тестом нет/да для определения, имеется ли изменение в экспрессии или функции. Тест может быть сделан количественным путем сравнения экспрессии или функции испытуемой пробы с уровнями экспрессии или функции в стандартной пробе.

Могут быть приготовлены наборы, содержащие ДНК НРУ18, фрагменты ДНК НРУ18, антитела к ДНК НРУ18 или к белку НРУ18, РНК НРУ18 или белок НРУ18. Такие наборы используют для обнаружения ДНК, которая гибридизуется с ДНК НРУ18, или для обнаружения присутствия белка (белков) НРУ 18 или пептидных фрагментов этих белков в пробе. Такая характеристика является ценной для многочисленных целей, в том числе (но не только) для судебных анализов и эпидемиологических исследований.

Нуклеотидные последовательности, комплементарные кодирующей последовательности ДНК НРУ18, могут быть синтезированы для терапии при помощи антисмысловых последо11 вательностей. Такими антисмысловыми молекулами могут быть ДНК, стабильные производные ДНК, такие как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, РНК, стабильные производные РНК, такие как 2'-О-алкилРНК, или другие антисмысловые олигонуклеотидные миметики НРУ18. Антисмысловые молекулы НРУ18 могут быть введены в клетки микроинъекцией, инкапсулированием в липосомы или экспрессией из векторов, несущих эту антисмысловую последовательность. Терапия при помощи антисмысловых молекул НРУ18 может быть, в частности, применима для лечения заболеваний, при которых выгодно уменьшение активности НРУ18.

Термин химическое производное относится к молекуле, которая содержит дополнительные химические части молекулы, которые в норме не являются частью основной молекулы. Такие части молекулы могут улучшать растворимость, время полужизни, абсорбцию и т.д. основной молекулы. Альтернативно, эти части молекулы могут ослаблять нежелательные побочные эффекты основной молекулы или снижать токсичность основной молекулы. Примеры таких частей молекулы описаны во многих руководствах, таких как РепипДоп'з Рйаттасеийса1 8с1епсе8.

Соединения, индентифицированные согласно описанным здесь способам, можно использовать отдельно при подходящих дозах, определяемых рутинным тестированием, для получения оптимального ингибирования НРУ1 8 или его активности при минимизации любой потенциальной токсичности. Кроме того, может быть желательным совместное введение или последовательное введение других агентов.

Предпочтительно соединения по данному изобретению могут быть введены в виде одной суточной дозы или общая суточная доза может вводиться в виде нескольких разделенных доз. Кроме того, соединения по данному изобретению могут вводиться посредством таких способов, как (но не только) интраназальный, пероральный, трансдермальный способы или при помощи суппозитория.

Для комбинированного лечения более чем одним активным агентом, когда активные агенты находятся в раздельных дозированных готовых формах, активные агенты могут вводиться совместно или каждый может быть введен отдельно.

Схему введения соединений по данному изобретению выбирают в соответствии с различными факторами, такими как тип, вид, возраст, вес, пол и медицинское состояние пациента; тяжесть состояния, которое должно быть подвергнуто лечению; способ введения; функционирование почек и печени пациента; и конкретное применяемое соединение. Врач с обычной квалификацией может легко определить и прописать эффективное количество лекарства, требующееся для предотвращения, противодействия или остановки прогрессирования данного состояния. Оптимальная точность в достижении концентраций лекарственного средства в пределах, которые дают эффективность без токсичности, требует схемы, основанной на кинетике доступности данного лекарственного средства для сайтов-мишеней. Это включает в себя рассмотрение распределения, равновесия и элиминации лекарственного средства.

В способах по данному изобретению описанные здесь подробно соединения могут образовать активный ингредиент и их обычно вводят в смеси с подходящими фармацевтическими разбавителями, наполнителями или носителями (называемыми здесь в общем виде материаламиносителями), выбранными в соответствии с предполагаемой формой введения, т.е. введения в виде пероральных таблеток, капсул, эликсиров, сиропа, суппозиториев, гелей и т.п., и соответствующими обычной фармацевтической практике.

Например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы активный лекарственный компонент может комбинироваться с пероральным нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т. п. Кроме того, при желании или при необходимости, в эту смесь могут быть включены подходящие связующие вещества, дезинтегрирующие агенты и красители. К подходящим связующим веществам (без ограничения) относятся крахмал, желатина, природные сахара, такие как глюкоза или беталактоза, сахаристые вещества из кукурузы, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, воски и т. п. К смачивающим веществам, используемым в таких лекарственных формах, относятся (без ограничения) олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т. п. Дезинтеграторы включают в себя (без ограничения) крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и т.п.

Для жидких форм активный лекарственный компонент может комбинироваться с подходящими, содержащими корригент, суспендирующими или диспергирующими агентами, такими как синтетические и природные камеди, например трагакант, аравийская камедь, метилцеллюлоза и т.п. Другими диспергирующими агентами, которые могут применяться, являются глицерин и т. п. Для парентерального введения желательны стерильные суспензии и растворы. В случае внутривенного введения желательно использование изотонических препаратов, которые обычно содержат подходящие консерванты.

Препараты для местного нанесения, содержащие активный лекарственный компонент, могут быть смешаны с различными материала13 ми-носителями, хорошо известными в данной области, такими как, например, спирты, гель А1ое уега, аллантоин, глицерин, масла с витаминами А и Е, минеральное масло, РРС2 миристилпропионат и т.п., для образования, например, спиртовых растворов, очищающих средств для местного применения, очищающих кремов, кожных гелей, кожных лосьонов и шампуней в виде крема или геля.

Соединения по данному изобретению могут также вводиться в форме липосомных систем доставки, таких как небольшие однослойные везикулы, большие однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из различных фосфолипидов, таких как холестерин, стериламин или фосфатидилхолины.

Соединения по данному изобретению могут также доставляться с использованием моноклональных антител в качестве индивидуальных носителей, с которыми соединены молекулы конкретного соединения. Соединения по данному изобретению могут быть также связаны с растворимыми полимерами в качестве нацеливаемых носителей лекарственного средства. К таким полимерам относятся поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксиметакрил-амидфенол, полигидроксиэтиласпартамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный остатками пальмитоила. Кроме того, соединения по данному изобретению могут быть соединены с классом биодеградируемых полимеров, применимых в достижении контролируемого высвобождения лекарственного средства, например с полимолочной кислотой, полиэпсилонкапролактоном, полигидроксимасляной кислотой, полиортоэфирами, полиацеталями, полигидропиранами, полиакрилатами и перекрестно-сшитыми или амфипатическими блок-сополимерами гидрогелей.

Следующие далее примеры иллюстрируют данное изобретение без его ограничения только этими примерами.

Пример 1. Клонирование генома НРУ18.

Общую геномную ДНК выделяли из клеточной линии, полученной из злокачественной опухоли шейки матки человека, 8ЭД756 (ЕгееДтап К.8., е! а1., 1982, Ιη Уйто, Уо1.18, радек 719726), стандартными способами. ДНК расщепляли ЕсоК 1 и подвергали электрофорезу в 0,8% плавящемся при низкой температуре агарозном препаративном геле. Вырезали кусочек геля, соответствующий фрагментам ДНК с длиной приблизительно 12 т.п.н. Агарозу расщепляли при помощи фермента Адагаке™ (Воетшдет МаппНеип. 1пс.) и фракционированную по размеру ДНК осаждали, дефосфорилировали и лигировали с расщепленными ЕсоК 1 плечами ЕМВЬ4 лямбда (81та1адепе, 1пс.). Библиотека лямбда была упакована с использованием упаковочного экстракта О1драск II Оо1Д (81та1адепе, 1пс.). НРУ18-позитивные клоны идентифицировали с применением ДНК-зонда Ь1 НРУ18 700 п.н., который получали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ДНК 5\У756 в качестве матрицы и олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе опубликованной последовательности ДНК Ь1 НРУ18 (Со1е апД Иапок, 1987, !Мо1.Вю1., 193: 599-608: ОепЬапк Ассеккюп № Х05015). Выделяли НРУ18-позитивный клон лямбда, который содержал вставку фрагмента ЕсоК 1 12 т.п.н. и был обозначен № 187-1.

Пример 2. Конструирование дрожжевых экспрессирующих векторов.

Открытую рамку считывания Ь1 НРУ18 (ОКЕ) амплифицировали при помощи ПЦР с использованием клона № 187-1 в качестве матрицы, Уеп!-ро1утегаке™ (Ыете Епд1апД Вю1аЬк, 1пс.), 10 циклов амплификации (94°С, 1 мин; 50°С, 1 мин; 72°С, 2 мин) и следующих олигонуклеотидных праймеров, содержащих фланкирующие сайты Вд111 (подчеркнуты):

смысловой праймер,

5'-ОААОАТСТСАСААААСААААТООСТТТОТОО

СООССТАОТО-3', антисмысловой праймер, 5'-ОААОАТСТТТАСТТССТООСАСОТАС

АСОСАСАСОС-3'.

Смысловой праймер вводит дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность (Кшккетп, е! а1., 1986, Оепе, Уо1.46: 1351 41 ) непосредственно против хода транскрипции относительно инициирующего кодона метионина Ь1 НРУ18 (выделенного жирным шрифтом). Продукт ПЦР Ь1 размером 1,5 т.п.н. расщепляли Вд111 и очищали на геле.

Экспрессирующий вектор дрожжей рОАЫ-10 конструировали путем выделения фрагмента 8рН1 1,4 т.п.н. из плазмиды рИС18/двунаправленный ОАЬ промотор, который содержит дивергентные промоторы ОАЕ1ОАЕ10 из плазмиды рВМ272 (предоставляемый Магк 1оНпк1оп, \Уак1йпд1оп Ишуегкйу, БкЬошк, МО). Дивергентные промоторы фланкировали на каждой стороне копией терминатора транскрипции ДЭН! клонирующим сайтом ВатН1, расположенным между промотором ОАЬ1 и первой копией терминатора транскрипции АЭН1, и клонирующим сайтом 8та1, расположенным между промотором ОАЬ 10 и второй копией терминатора транскрипции АЭН1. Дрожжевой челночный вектор, состоящий из рВК322, гена дрожжей ЬЕШД и 2 мкм плазмиды дрожжей (подарок от Вефатш На11, ИпКеткйу оГ ХУакЫпдЮп, §еаД1е, ЭДА), расщепляли §рЫ и лигировали с фрагментом дивергентного промотора ОАЬ 8рН1 1,4 т.п.н. с получением рОАЫ-10. рОАЫ-10 линеаризовали при помощи ВатН1, разрезающей между промотором ОАЬ1 и терминатором транскрипции АЭН1. Расщепленный ВатН1 вектор и расщепленный Вд111 фрагмент ПЦР Ь1 НРУ18 лигировали и использовали для трансформации клеток ЭН5

Е.соН (СШто ВКЬ, 1пс.). Выделяли плазмиду рСЛЫ-10, которая содержит ген Ь1 НРУ18 и которая была названа р191 -6.

Конструировали экспрессирующий вектор дрожжей, который коэкспрессирует гены как Ь1, так и Ь2 НРУ18. Плазмиду р191-6 (рСЛЬ110+НРУ18 Ь1) расщепляли §та1, которая разрезает между промотором СЛЬ1 и терминатором транскрипции ΛΌΗΙ. Ген Ь2 НРУ18 1,4 т.п.н. амплифицировали при помощи ПЦР, как описано выше, с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров, которые содержат фланкирующие сайты §та1 (подчеркнутые):

смысловой праймер, '-ТСССССОООСАСААААСААААТО ОТАТСССАССОТОССОСАСОАС-3', антисмысловой праймер, 5'-ТСССССОООСТАООССОССАСАААОССАТСТОС-3'.

Смысловой праймер вводит дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность (Кшккетп е! а1., 1986, кирга) непосредственно против хода транскрипции относительно инициирующего кодона метионина (выделенного жирным шрифтом) Ь2 НРУ18. Фрагмент ПЦР расщепляли §та1, очищали на геле и лигировали с расщепленной §та1 плазмидой р191-6. Была выделена плазмида рСАЫ-10, содержащая гены как Ь1, так и Ь2 НРУ18, которая была обозначена р195-11.

Пример 3. Типирование клинических проб.

Пробы цервикальной биопсии брали в Административном медицинском центре ветеранов в Индианополисе, ΙΝ (разрешение было любезно предоставлено доктором Эаггоп Вго\\п) и в Медицинском центре Альберта Энштейна в Филадельфии, РА (разрешение было любезно предоставлено доктором 1оап Лй1ег) и замораживали при -20°С. ДНК выделяли, как описано В го ап е! а1., 1993, 1. СНп.МютоЪюЦ Уо1. 31: 2667-2673). Вкратце, клинические образцы обрабатывали при помощи микро-дезинтегратора Брауна II (В.Вгаип ПЩгитепК МеПипдеп, Сегтапу) и солюбилизировали в буфере, содержащем 10 мМ ЭДТК и 0,6% (мас./об.) додецилсульфат натрия (ДСН). Пробы доводили до рН 7,4 20 мМ Триса и белок расщепляли 50 мкг/мл протеиназы К в присутствии 0,1 мкг/мл РНКазы А с последующей экстракцией смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт. ДНК осаждали этанолом и определяли количественно при помощи спектрофотометрии.

Эти пробы ДНК подвергали скринингу на присутствие НРУ1 8 при помощи ПЦР и блотанализа по Саузерну. Сегмент 256 п.н. ОКЕ Ь1 НРУ1 8 амплифицировали ПЦР с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров:

смысловой праймер,

5'-СААТССТТАТАТАТТАААСССАСАССТАТС-3', антисмысловой праймер,

5'-САТСАТАТТССССАССТАСАССАСАСТСТС-3'.

Условия ПЦР соответствовали рекомендациям изготовителя для набора АтрБТад™ ^NА

Ро1утега8е/СепеАтр™ (Регкт Е1тег Согр.), за исключением того, что 0,5 мкл ДНК клинической пробы использовали в качестве матрицы и 10 пмолей каждого праймера, 2 мМ άΝΊΤ и 2,0 мМ М§С1₂ присутствовали в конечной реакционной смеси. После 2 мин стадии денатурации при 94°С следовали 40 циклов амплификации (94°С, 1 мин; 45°С, 1 мин; 72°С, 1 мин).

Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 3,0% агарозном геле, переносили блоттингом на найлоновые мембраны и гибридизовали с ³²Рмеченым специфическим для Ь1 НРУ18 олигонуклеотидным зондом.

Пример 4. Секвенирование генов Ь1 и Ь2.

Гены Ь1 и Ь2 НРУ18 в клонах № 187-1, р191-6 и р195-11 секвенировали с использованием набора для секвенирования РККМ и автоматизированного секвенатора ДНК АВ1 № 373А (АррНеН ВюууЦетЦ. Для получения консенсусной последовательности НРУ1 8 участки ДНК гена Ь1 амплифицировали ПЦР из клинических изолятов человека, секвенировали и сравнивали с заявленными и опубликованными последовательностями. Фрагмент 256 п.н. (нуклеотиды 817-1072) амплифицировали из каждого клинического изолята для этой цели с использованием олигонуклеотидов и циклов нагревания, описанных в примере 3. Следующие праймеры,

5'-СЛЛСЛТСТСЛСЛЛЛЛСЛЛЛЛТСССТТТСТСССССССТАСТС-3' и

5'-ССТААССТССТСАСАААСАТТАСАС-3' использовали для амплификации аминоконцевого участка размером 432 п.н. ДНК Ь1 (нуклеотиды 1-431) с применением циклов нагревания, описанных в примере 3. Оба продукта ПЦР лигировали раздельно с плазмидой рСКИ Цпуйтодеп Согр.) с использованием реагентов и процедур, рекомендуемых изготовителем. Плазмидную ДНК выделяли из трансформантов и секвенировали ту, которая содержала вставки ЕсоК1.

Пример 5. Анализ ДНК и выведенные аминокислотные последовательности.

Нуклеотидная и выведенная аминокислотная (аа) последовательности Ь1 НРУ18 показаны на фиг. 1. Последовательность ДНК получали из консенсусных клонов № 187-1, р191-6 и р195-11. Сравнение заявленной нуклеотидной последовательности Ь1 НРУ18 с опубликованной последовательностью Ь1 НРУ18 (СепЪапк Ассеккюп № Х05015) обнаружило 20 измененных п.н. из 1524 п.н. Пять нуклеотидных изменений (С на С в положении 89, С на А в положении 263, С на С в положении 848, С на А в положении 967 и С на С в положении 1013) приводят к аминокислотным заменам. Пять измененных остатков, отличающихся от опубликованных, таковы: Р заменен на К в положениях 30, 283 и 338, Т заменен на Ν в положении 88 и У заменен на I в положении 323 (фиг. 2). В по17 ложениях 88 и 323 замены консервативные, тогда как три замены Р на К могут существенно изменять физические свойства экспрессируемого белка Ь1.

Сравнение аминокислотных последовательностей, полученных из клинических изолятов (номера 354, 556, 755, 695, 795 и 23), с заявленной последовательностью и опубликованной последовательностью показано на фиг. 2. Существуют четыре положения, по которым клинические изоляты и заявленная последовательность отличаются от опубликованной последовательности. Нуклеотиды в положениях 30, 283 и 338 кодируют аргинин (К) во всех обнаруженных до настоящего времени изолятах, в том числе в заявленной последовательности. Это резко противоречит данным об опубликованной последовательности, у которой в каждом из указанных положений находится пролин (Р). Кроме того, в положении 88 изолятов и заявленной последовательности находится аспарагин (Ν), но в опубликованной последовательности в этом положении находится треонин (Т).

Последнее различие заключается в том, что в положении 323 находится валин (V) (многие клинические изоляты и опубликованная последовательность), тогда как в заявленной последовательности и одном из изолятов (№ 23) в указанном положении находится изолейцин (I). Можно сделать вывод, что заявленная последовательность соответствует преобладающим последовательностям вирусов, которые ассоциированы с клиническими инфекциями, и отсутствие изолятов, содержащих остатки пролина в положениях 30, 283 и 338, как в опубликованной последовательности, предполагает, что опубликованная последовательность является либо артефактом, либо неконсенсусным подтипом.

Нуклеотидную и выведенную аминокислотную последовательности Ь2 ΗΡν18 получали на основе консенсусной последовательности клонов № 187-1 и р195-11, и они показаны на фиг. 3. Сравнение нуклеотидной последовательности Ь2 с опубликованной последовательностью ΗΡν18 (СеиЬаик Ассеккюп № Х05015) обнаружило 40 измененных п.н. из 1389 п.н. Различия в п. н. приводят к 1 4 заменам на уровне аминокислот: Р на 8 в положении 29, Р на N в положении 33, А на 8 в положении 177, Ό на Е в положении 266, Ό на N в положении 270, Ό на С в положении 346, М на I в положении 355, V на М в положении 359, 8 на Р в положении 365, Р на 8 в положении 369, Р на V в положении 371, Р на 8 в положении 372, К на Т в положении 373 и 8 на Р в положении 409.

Пример 6. Получение антисыворотки против Ь2 ΗΡν18.

Специфические в отношении Ь2 ΗΡν18 антитела получали в козах с использованием слитого белка ΐτρΕ-ΗΡν18 Ь1, экспрессируемого в Е.сой. ОКР полноразмерного Ь2 амплифицировали ПЦР с применением олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих сайты ΗίηάΙΙΙ и ВатИГ фланкирующие 5'- и 3'концы соответственно. Фрагмент Ь2 встраивали в расщепленную ΗίηύΙΙΙ-ΒαιηΗΙ экспрессионную плазмиду рАТН23 (Коегпег е! а1., 1991, Ме1й.Еп/уто1. νοί. 194: 477-490). Слитый белок экспрессировался в клетках КК1 Е.сой (СЬсо ВКЬ, Шс.) после индукции 3-в-индолакриловой кислотой. Нерастворимую фракцию анализировали электрофорезом в ПААГ-ДСН окрашиванием Кумасси синим. Слитый белок 1грЕ-Ь2 составлял большую часть нерастворимой фракции Е.сой. Коз иммунизировали слитым белком 1грЕ-Ь2 в соответствии со стандартным протоколом Ροсοηο КаЬЬй Рагт апй ЬаЬогаФгу, Шс. для представляющих слитые белки антигенов (Ρ^οΐе^η КаЬЬй Рагт, Сапайеп818, ΡΑ).

Пример 7. Получение штамма И9 дрожжей.

Штамм 2150-2-3 (МА Та1рйа, 1еи2-04, айе1, сй°) 8ассйаготусе§ сеге\айае был получен от др. Ье1апй ИаПиеН (Ишуегейу о! ХУайипЦоп, 8еа!11е, \УА). Клетки штамма 2150-2-3 размножали в течение ночи при 30°С в 5 мл среды УЕИЭ (Сайу е! а1., Ипа.Мкяо 2 (1987) 117-121). Клетки промывали 3 раза в стерильной дистиллированной воде, ресуспендировали в 2 мл стерильной дистиллированной воды и 0,1 мл клеточной суспензии высевали на каждую из шести чашек с 5-фтороротовой кислотой (РОА) для отбора на мутанты ига3 (Со1й 8рйпд Иагйог ЬаЬогаФгу Мапиа1 Гог Уеа51 Сепейск). Чашки инкубировали при 30°С. Среда содержала на 250 мл дистиллированной воды: 3,5 г азотистого основания дрожжей Эйсо без аминокислот и сульфата аммония; 0,5 г 5-фтороротовой кислоты; 25 мг урацила и 10,0 декстрозы.

Среду стерилизовали фильтрованием через мембраны 0,2 мкм и затем смешивали с 250 мл 4% бактоагара (Эйео), поддерживаемого при 50°С, 10 мл раствора аденина 1/2 мг/мл и 5 мл раствора Ь-лейцина (180 мг/50 мл). Полученную среду распределяли по 20 мл на чашку Петри.

После 5 дней инкубирования появились многочисленные колонии. Отдельные колонии выделяли путем повторного посева штрихом из исходных чашек с РОА на свежие чашки с РОА, которые затем инкубировали при 30°С. Ряд колоний из второй серии чашек с РОА тестировали на присутствие мутации ига3 при помощи посева методом реплик (отпечатков) как на чашки со средой УЕИЭ, так и на урацил-минус чашки. Желательным результатом был хороший рост на УЕПО и отсутствие роста на урацилминус среде. Был получен один изолят (и9), который обнаружил эти свойства. Его хранили в виде замороженного раствора в глицерине (штамм № 325) при -70°С для последующего использования.

Пример 8. Получение вектора для разрыва гена ΜΝΝ9 дрожжей.

Для получения вектора для разрыва гена ΜΝΝ9 необходимо было сначала клонировать ген МNN9 из геномной ДНК §.сегеу181ае. Это достигалось при помощи стандартной технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). 5'смысловой праймер и 3'-антисмысловой праймер для ПЦР полноразмерной кодирующей последовательности ΜΝΝ9 конструировали на основе опубликованной последовательности для гена дрожжей ΜΝΝ9 (2утодепейс8: ЕРО Ра1еи1 АррНсайои № 88117834.7, РиЫюайои №

0314096-А2). Использовали следующие олигодезоксинуклеотидные праймеры, содержащие фланкирующие сайты ΗίηάΙΙΙ (подчеркнутые):

смысловой праймер:

5'-СТТ ААА ОСТ ТАТ ОТС АСТ ТТС ТСТ ТОТ АТС 0-3' антисмысловой праймер:

5'-ТОА ТАА ОСТ ТОС ТСА АТО ОТТ СТС ТТС

СТС-3'.

Инициирующий кодон метионина для гена ΜΝΝ9 выделен жирными буквами. ПЦР проводили с использованием геномной ДНК из штамма ΤΚΥ188 З.сегетыае в качестве матрицы, ДНК-полимеразы Тад (Реткт Е1тег) и 25 циклов амплификации (94°С, 1 мин; 37°С, 2 мин; 72°С, 3 мин). Полученный ПЦР фрагмент 1,2 т.п.н. расщепляли ΗίηάΙΙΙ, очищали на геле и лигировали с расщепленной ΗίηάΙΙΙ, обработанной щелочной фосфатазой, плазмидой рИС13 (РЬаттааа). Полученная плазмида была названа р1183.

Для разрыва гена ΜΝΝ9 геном дрожжей ПКА3 плазмиду рВК322-иКА3 (которая содержит фрагмент ΗίηάΙΙΙ 1,1 т.п.н., кодирующий ген иКА3 З.сегеуыае. субклонированный в сайт ШМПрВК322) расщепляли ΗίηάΙΙΙ и фрагмент ДНК 1,1 т.п.н. очищали на геле, концы затупляли ДНК-полимеразой Т4 и затем лигировали этот фрагмент в расщеплением РтП плазмидой р1183 (РтП разрезает внутри кодирующей последовательности ΜΝΝ9). Полученная плазмида р1199 содержит разрыв гена ΜΝΝ9 функциональным геном ПКА.3.

Пример 9. Конструирование И9производного штамма 1372, содержащего разрыв гена ΜΝΝ9.

Для разрыва гена ΜΝΝ9 в штамме И9 (№ 325) плазмиды р1199 расщепляли ΗίηάΙΙΙ для создания линейной кассеты с разрывом тии9::υΚА.3. Клетки штамма 325 трансформировали расщепленной ΗίηάΙΙΙ ДНК р1199 при помощи сферопластного метода (Ηίιπκη е1 а1., 1978, Ртос.№П.АсаФ8ск И8А 75: 1929-1933) и трансформанты отбирали на синтетической среде с агаром без урацила, содержащей 1,0М сорбит. Синтетическая среда содержала на литр дистиллированной воды: агар, 20 г; азотистое основание дрожжей без аминокислот, 6,7 г; аденин, 0,04 г; Ь-тирозин, 0,05 г; сорбит, 182 г; глюкозу, 20 г; лейцин-минус раствор № 2, 1 0 мл. Лейцин-минус раствор № 2 содержит на литр дистиллированной воды: Ь-аргинин, 2 г; Ьгистидин, 1 г; Ь-лейцин, 6 г; Ь-изолейцин, 6 г; Ь-лизин, 4 г; Ь-метионин, 1 г; Ь-фенилаланин, 6 г; Ь-треонин, 6 г; Ь-триптофан, 4 г.

Чашки инкубировали при 30°С в течение 5 дней, когда появились многочисленные колонии. Препараты хромосомной ДНК получали из 10 колоний и затем расщепляли ЕсоК1 плюс ΗίηάΙΙΙ. Расщепленный ДНК-продукт оценивали при помощи блотов по Саузерну (ТЗатЪтоок е1 а1., Μо1еси1а^ Оошгщ: А ЬаЪогаЮгу Μаииа1, 2ηά еά^ι^оη. Сок Зрттд ИагЪог каЪогаЮгу Ргехх, 1989) с использованием фрагмента ΗίηάΙΙΙ 1,2 т.п. н., несущего ген ΜΝΝ9 (выделенный из плазмиды р1199), в качестве зонда. Идентифицировали изолят (штамм № 1372), который обнаруживал ожидаемые смещения полос ДНК на блоте по Саузерну, а также чрезвычайную агрегацию, обычно обнаруживаемую мутантами тии9.

Пример 1 0. Конструирование вектора для разрыва гена ΗΙ83 дрожжей.

Для конструирования кассеты с разрывом, в которой ген ΗΙ83 З.сегетыае разорван геном ИКА3, плазмиду ΥЕр6 (К. 81тиЫ е1 а1., 1979, Р^ос.NаίI.Асаά.δс^., И8А 76: 1035) расщепляли ВатШ и фрагмент ВатШ 1,7 т.п.н., несущий ген ΗΙ83, очищали на геле, концы его затупляли ДНК-полимеразой Т4 и лигировали этот фрагмент с рИС18, которую предварительно расщепляли ВатШ и обрабатывали ДНК-полимеразой Т4. Полученную плазмиду (названную р1501 или риС18-Ш83) расщепляли ΝΙκΙ (которая разрезает в кодирующей последовательности ΗΙ83) и фрагмент вектора очищали на геле, концы затупляли ДНК-полимеразой Т4 и затем фрагмент обрабатывали щелочной фосфатазой кишечника теленка. Ген ПКА.3 выделяли из плазмиды рВК322-ИКА3 расщеплением ΗίηάΙΙΙ и фрагмент 1,1 т.п.н., несущий ген ПКА3, очищали на геле, концы затупляли ДНКполимеразой Т4 и лигировали фрагмент с описанным выше фрагментом NЬеIрυС18-ΗIδ3. Полученная плазмида (названная риС18::Ш53::иКА.3 или р1505) содержит кассету с разрывом, в которой ген дрожжей ΗΙ83 разорван функциональным геном ПКА3.

Пример 11. Конструирование вектора для разрыва гена РКВ1 геном ΗΙ83.

Плазмиду РР8АН, несущую ген РКВ1 З.сетеу181ае, получали от др. ЕПоиех СатещеΜе11ои υηίν. (С^МоеШе е1 а1.,1987, ОетОс^ 115: 255-263). Ее расщепляли ΗίηάΙΙΙ плюс ХМ и фрагмент ДНК 3,2, т.п.н., несущий ген РКВ1, очищали на геле, концы затупляли обработкой ДНК-полимеразой Т4. Плазмиду риС18 расщепляли ВатШ, очищали на геле и затупляли концы обработкой ДНК-полимеразой Т4. Полученный векторный фрагмент лигировали с указанным выше фрагментом гена РКВ1 с получением плазмиды риС18-РКВ1. Плазмиду Υер6, которая содержит ген ΗΙ83, расщепляли ΒΑΜΗΙ. Полученный фрагмент ВатН1 1,7 т.п.н., несущий функциональный ген ΗΙ83, очищали на геле и затем затупляли его концы при помощи ДНК-полимеразы Т4. Плазмиду рИС18-РКВ1 расщепляли ЕсоРУ плюс ΝοοΙ. которые разрезают в кодирующей последовательности РКВ1 и удаляют активный сайт протеазы В и фланкирующую последовательность. Фрагмент ΕοοΚν-ΝοοΙ 5,7 т.п.н., несущий оставшиеся 5'- и 3'-части кодирующей последовательности РКВ1 в риС18, очищали на геле, концы затупляли обработкой ДНК-полимеразы Т4, дефосфорилировали фрагмент щелочной фосфатазой кишечника теленка и лигировали с имеющим тупые концы фрагментом ΗΙ83, описанным выше. Полученная плазмида (названная риС18::Ш§3, группа (штамм) № 1245)) содержит функциональный ген ΗΙ83 вместо части гена РКВ1, которая была делетирована, как описано выше.

Пример 1 2. Конструирование родственного и9 штамма дрожжей, содержащего разрывы генов ΜΝΝ9 и РРВ1.

Родственный И9 штамм 1372, который содержит разрыв гена ΜΝΝ9, был описан в примере 9. Клональные изоляты штамма 1372 пассировали на чашках с ΡΘΑ (как описано в примере 7) для отбора мутантов ига3. Получали ряд изолятов ига3 штамма 1372 и один конкретный изолят (штамм 12930-190-81-1) был отобран для последующего разрыва гена ΗΙ83. Вектор с разрывом гена риС18::ИКА3 (р1505) расщепляли ХЬ;-Н плюс ЕсоК1 с образованием линейной кассеты с разрывом Ηδ3::υΚΑ3 и использовали ее для трансформации штамма 12930-190-81-1 по методу с ацетатом лития (Ме1коЙ8 ίη Εηζνιηοΐоду, 194: 290 (1991). иКА⁺-трансформанты отбирали на синтетической среде с агаром, не содержащей урацила, пересевали методом штриха для получения клональных изолятов на той же самой среде и затем высевали методом реплик на среду, не содержащую ни урацила, ни гистидина, для скрининга тех изолятов, которые были как ига+, так и Ηίδ^-. Один изолят (штамм 12930230-1) был отобран для последующего разрыва гена РРВ1. Вектор с разрывом гена РРВ1 (риС18-ргЬ1::Ш83, группа (штамм) № 1245)) расщепляли 8Ι плюс ХЬа Ι для образования линейной кассеты с разрывом ргЬ1::Ш83 и использовали ее для трансформации штамма 12930230-1 по методу с ацетатом лития. Ηίδ+трансформанты отбирали на среде с агаром, не содержащей гистидина, и пересевали штрихом на ту же самую среду для получения клональных изолятов. Геномную ДНК получали из ряда полученных Шз+^золятов, расщепляли ее ЕсоЫ и затем подвергали электрофорезу на 0,8% агарозных гелях. Затем проводили блоттинг по Саузерну с использованием радиоактивно меченого зонда 617 п. к. для гена РКВ1, который был получен с применением следующих олигодезоксинуклеотидных праймеров:

5' ТОО ТСА ТСС САА АТС ТТО ААА 3'

5' САС СОТ АОТ ОТТ ТОО ААО СОА 3'

Получали 11 изолятов, которые обнаруживали ожидаемую гибридизацию зонда с фрагментом ДНК 2,44 т.п.н. ргЬ1::Ш83. В противоположность этому, не было гибридизации этого зонда с фрагментом 1,59 т.п.н. для гена РКВ1 дикого типа. Один из этих изолятов, содержащий желаемый разрыв ргЬ1::Ш83, был отобран для дальнейшего использования и назван штаммом № 1558.

Пример 13. Экспрессия Ь1 и Ь2 Ηθν18 в дрожжах.

Плазмиды р191-6 (рОΑ^1-10+ΗРV18 Ь1) и р195-11 (рОАЬ1-10+ОТУ18 Е1+Ь2) использовали для трансформации штамма № 1558

8.сегеу181ае (МАТа, 1еи2-04, ргЬ::Ш83, тпп9::иРА3, абе1, с1г°). Клональные изоляты выращивали при 30°С в среде ΎΕΗΌ, содержащей 2% галактозу, в течение 88 ч. После сбора клеток осадки клеток разбивали стеклянными гранулами и клеточные лизаты анализировали на экспрессию белка Ь1 Ηθν18 и/или белка Ь2 Ηθν18 при помощи иммуноблоттинга. Пробы, содержащие 25 мкг общего клеточного белка, подвергали электрофорезу на 1 0% трисглициновых гелях (№уех, Ею.) при денатурирующих условиях и переносили электроблоттингом на нитроцеллюлозные фильтры. Белок Ь1 иммунодетектировали с использованием кроличьей антисыворотки, образованной против слитого белка 1грЕ-ОТУ18 Ь1 в качестве первичного антитела (Вгомп е! а1., 1994, У1го1оду 201: 46-54) и связанного с пероксидазой хрена ШИР) ослиного антикроличьего ПО (Атегзкат, Ею.) в качестве второго антитела. Фильтры обрабатывали с использованием хемилюминесцентного набора для детектирования ЕСЬ™ (Атегзкат, Ею.). Полосу Ь1 50-55 кДа обнаружили как в экспрессирующем Ь1, так и в экспрессирующем Е1+Ь2 клонах дрожжей (штаммах 1 725 и 1 727 соответственно), но не в негативном контроле (рОАЫ-10 без генов Ь1 или Ь2) (фиг. 4).

Белок Ь2 ОТУ 18 детектировали Вестернанализом с использованием козьей поликлональной антисыворотки, образованной против слитного белка 1геЕ-ОТУ18 Ь2, в качестве первичного антитела, и затем ИРРконъюгированного кроличьего антикозьего ПО (Кикедаагб апб Репу ЬаЬогаФпез, ОаИкегзЬигд, ΜΌ). Фильтры обрабатывали, как описано выше. Белок Ь2 детектировали в виде полосы 75 кДа в клоне, коэкспрессирующем Е1+Ь2 (штамме 1 727), но ни в любом негативном контроле, ни в экспрессирующем Ь1 клоне (фиг. 5).

Пример 14. Ферментация Ь1 ОТУ 18 (штамма 1725) и Е1+АЬ2 ОТУ18 (штамма 1727).

Поверхностную культуру на чашках штаммов 1 725 и 1 727 асептически переносили на не содержащую лейцина среду, содержащую (на л): 8,5 г Эйс о дрожжевого азотистого основания без аминокислот и сульфата аммония; 0,2 г аденина; 0,2 г урацила; 10 г янтарной кислоты; 5 г сульфата аммония; 40 г глюкозы; 0,25 г Ьтирозина; 0,1 г Ь-аргинина; 0,3 г Ь-изолейцина; 0,05 г Ь-метионина; 0,2 г Ь-триптофана; 0,05 г Ь-гистидина; 0,2 г Ь-лизина; 0,3 г Ьфенилаланина; эту среду доводили до рН 5,0-5,3 ΝαΟΗ перед стерилизацией. После роста в течение 25 ч при 28°С, при 250 об/мин на ротационном шейкере готовили флаконы с замороженной культурой путем добавления стерильного глицерина до конечной концентрации 17% (м/об.) перед хранением при -70°С (1 мл на криофлакон). Инокуляты получали в той же самой среде (500 мл 2-литровую колбу) и заквашивали перенесением оттаянного содержимого замороженного культурального флакона и инкубированием при 28°С, при 250 об/мин на ротационном шейкере в течение 29 ч. Для ферментации каждого штамма использовали ферментер Νον Втипкмтск 8Р-116 с рабочим объемом 10 л после инокуляции. Продукционная среда содержала (на л): 20 г дрожжевого экстракта ЭГсо; 10 г пептона (ЗНсГПсИ Ну8оу); 20 г глюкозы; 20 г галактозы; 0,3 мл противовспенивателя Ишоп СатЫбе υί'ΌΝ ЬВ-625; среду доводили до рН 5,3 перед стерилизацией. Все содержимое (500 мл) 2-литровой колбы с инокулятом переносили в ферментер, который инкубировали при 28°С, 5 л воздуха в минуту, 400 об/мин, давлении 3,5 ρδί (24131,6 Па). Перемешивание увеличивали по необходимости для поддержания уровней растворенного кислорода более 40% от насыщения. Развитие ферментации подвергали мониторингу посредством автономных измерений глюкозы (Весктап 01исове 2 Апа1у/ег) и неавтономной масс-спектрометрии (Рег кт-Е1тет 1200). После 66 ч инкубации плотности клеток достигали 9,59,7 г сухого веса клеток на л. Культуры концентрировали при помощи фильтрования через полые волокна (Аписом Н5МР01-43 каПпбде в системе фильтрования Атюоп ЭС-10) до приблизительно 2 л, диафильтровали с 2 л забуференного фосфатом солевого раствора и концентрировали далее (приблизительно до 1 л) перед разливом в 500-миллилитровые центрифужные склянки. Осадки клеток собирали центрифугированием при 8000 об/мин (ротор 8отуа1 083) в течение 20 мин при 4°С. После декантации супернатанта осадки (всего 191-208 г сырых клеток) хранили при -70°С до использования.

Пример 15. Очистка рекомбинантных капсидных белков Ь1 НРУ18.

Все стадии проводили при 4°С, если нет других указаний.

Клетки хранили в замороженном виде при -70°С. Замороженные клетки (сырой вес 126 г) оттаивали при 20-23°С и ресуспендировали в 70 мл разрушающего буфера (20 мМ фосфат натрия, рН 7,2, 100 мМ ИаС1). Ингибиторы протеаз ПМСФ и пепстатин А добавляли до конечных концентраций 2 мМ и 1,7 мкМ соответственно. Суспензию клеток разрушали при давлении приблизительно 16000 ρδί (11031611 Па) посредством трех проходов в микрофлюидизаторе М110 (МюгоГ1шбю8 Согр., №\\1оп. МА). Разрушенную клеточную суспензию центрифугировали при 12000 х д в течение 40 мин для удаления клеточного дебриса (остатков клеток). Супернатант, содержащий антиген Ь1, извлекали.

Жидкий супернатант разводили 1:5 добавлением Буфера А (20 мМ МОР8, рН 7,0) и наносили на анионообменную улавливающую колонку (9,0 см внутр. диаметр х 3,9 см) со смолой Ртас1оде1^К ЕМЭ ТМАЕ-650 (М) (ЕМ §ератайоп8, 0№Ь81омш, N1), уравновешенную в Буфере А. После промывания Буфером А антиген элюировали градиентом 0-1,0М ИаС1 в Буфере А. Фракции колонки анализировали на общий белок методом Бредфорда. Затем фракции анализировали при равных нагрузках белка Вестернблоттингом и электрофорезом в ПААГ-ДСН с окрашиванием серебром.

ТМАЕ-фракции, обнаруживающие сравнимые чистоту и обогащение белка Ь1, объединяли. Антиген концентрировали фракционированием при помощи сульфата аммония. Раствор доводили до 35% насыщения путем добавления твердого сульфата аммония при осторожном перемешивании в течение более 1 0 мин. Пробу помещали на лед и давали образоваться осадку в течение 4 ч. Пробу центрифугировали при 16000 х д в течение 45 мин. Осадок ресуспендировали в 20,0 мл РВ8 (забуференного фосфатом солевого раствора) (6,25 мМ фосфата Иа, рН 7,2, 150 мМ ИаС1).

Ресуспендированный осадок хроматографировали на гель-фильтрационной колонке (2,6 см внутр. диаметр х 89 см) со смолой 8ерйасту1 500 НК (Рйаттааа, Р18са1атау, N1). Подвижным буфером был РВ8. Фракции анализировали Вестерн-блоттингом и электрофорезом в ПААГДСН с окрашиванием серебром. Самые чистые фракции объединяли. Полученный пул концентрировали в перемешиваемой ячейке на 50 мл с использованием плоскослойных мембран 43 мм УМ-100 (Атюоп, Веуег1у, МА) при давлении Ν₂4-6 ρδί (27579-41369 Па).

Конечный продукт анализировали Вестерн-блоттингом и электрофорезом в ПААГДСН с окрашиванием коллоидным Кумасси. Белок Ь1 обнаружил 50-60% гомогенность. Идентичность белка Ь1 подтверждали Вестернблоттингом. Конечный продукт разделяли на аликвоты и хранили при -70°С. Этот процесс дал в целом 12,5 мг белка.

Метод Бредфорда для общего белка

Общий белок определяли с применением коммерчески доступного набора Сооптче Р1и8^К кй (Р1етсе, КоскГогб, 1Ь). Пробы разводили до подходящих уровней в МПН-О-Н20. Для стандартного протокола и протокола микротеста требовались объемы 0,1 мл и 1,0 мл соответственно. Для обоих протоколов для получения стандартной кривой использовали БСА (Йетсе, РоскГогД, 1Ь). Определение проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя. Стандартные кривые строили с применением программного обеспечения Спске10гарй^Р на компьютере Масш1о8Й 11с1.

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) и Вестерн-блоттинг

Все гели, буферы и прибор для электрофореза были получены из Ыоуех (Зап И1едо, СА) и электрофорез проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя. Вкратце, пробы разводили до равной концентрации белка в МПП-ОН₂О и смешивали 1:1 с буфером для инкубирования пробы, содержащим 200 мМ ДТТ. Пробы инкубировали 15 мин при 100°С и наносили на предварительно залитые 12% трис-глициновые гели. Пробы подвергали электрофорезу при 1 25 В в течение 1 ч 45 мин. Гели проявляли с применением либо окрашивания серебром по вариации метода Ыеикеккоуеи апД Иетшск [Е1ес1горйоге818, 6 (1985) 1030112], либо окрашивания коллоидным Кумасси с использованием коммерчески полученного набора (1йедга1еД Зератайоп ЗуЧет, Ыайск, МА).

Для Вестерн-блотов белки переносили на ПВДФ-мембраны при 25 В в течение 40 мин. Мембраны промывали МИй-Ц-ЩО и сушили на воздухе. Первичным антителом была поликлональная кроличья антисыворотка, полученная против слитого белка йрЕ-НРУ11 Ь1 (подарок доктора И.Втомш). Предварительные эксперименты показали, что эта антисыворотка перекрестно реагирует с Ь1 НРУ 18 на Вестернблотах. Раствор антител готовили разведением антисыворотки в буфере для блоттинга (5% обезжиренное молоко в 6,25 мМ фосфате Ыа, рН 7,2, 150 мМ ЫаС1, 0,02% ΝηΝ₃). Инкубирование проводили в течение, по меньшей мере, 1 ч при 20-23°С. Блот промывали в течение 1 мин каждый раз в трех сменах ПБС (6,25 мМ фосфат Ыа, рН 7,2, 150 мМ ЫаС1). Раствор вторых антител готовили разведением конъюгированной антисыворотки козьего антикроличьего 1дО, связанного со щелочной фосфатазой (Р1етсе, РоскГогД, 1Ь) в буфере для блоттинга. Инкубирование проводили при тех же условиях в течение, по меньшей мере, 1 ч. Блоты промывали, как описано выше, и детектировали с применением одностадийного субстрата ЫВТ/ВС1Р (Р1етсе, РоскГогД, 1Ь).

Пример 1 6. Электронно-микроскопические исследования.

Для электронно-микроскопического анализа (ЭМ) (З1гис1ите РтоЬе, АеЧ Сйе81ет, РА) аликвоту каждой пробы помещали на медную сетку с угольной пленкой 200 меш. Каплю 2% фосфовольфрамовой кислоты (РТА), рН 7,0, помещали на сетку на 20 с. Сеткам давали высохнуть на воздухе перед исследованием при помощи трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии (ТЕМ). Вся микроскопия была выполнена с использованием ГЕОЬ 100СХ трансмиссионного электронного микроскопа (ГЕОЬ ИЗА, 1пс.) при ускоряющем напряжении 1 00 кВ. Полученные микрофотографии имеют конечное увеличение 100000Х. Вирусоподобные частицы (УЪР) наблюдали в диапазоне размеров диаметра 50-55 нм во всех пробах дрожжей, несущих Ь1 НРУ18 экспрессирующую плазмиду (фиг. 6). В пробах контрольных дрожжей не наблюдали УЪР.

Пример 17. Субклонирование кДНК НРУ1 8 в экспрессирующие векторы.

Кодирующую НРУ1 8 кДНК субклонируют в несколько векторов для экспрессии белка НРУ1 8 в трансфицированных клетках-хозяевах и для транскрипции/трансляции ш νίίτο. Эти векторы включают рВЫекспр! II ЗК+п (где экспрессия запускается промоторами Т7 или Т3), рсИЫА Ι/Атр (где экспрессия инициируется промотором цитомегаловируса (СМУ)), рЗ29016-1 (где экспрессия инициируется промотором длинного концевого повтора (ЬТР) Н1У (ВИЧ)) и бакуловирусным трансфицирующим вектором рАсИА51 (РйатМшдеп, 1пс.) (где экспрессия инициируется промотором полиэдрина (РН)) для получения рекомбинантного бакуловируса, содержащего последовательность ДНК, кодирующую НРУ 18.

a) рВЬекспр! II ЗК+:НРУ18. Клон кДНК полноразмерного НРУ1 8 получают из бактериофага лямбда ограниченным расщеплением Есо ΚΙ и лигированием в разрезанную Есо М, обработанную С4Р рВШекспр! II ЗК+. Извлекали отдельные субклоны, в которых смысловая ориентация НРУ1 8 сопровождалась либо промотором Т7, либо промотором Т3.

b) рсИЫА ЕАтр:НРУ18. Для облегчения направленного клонирования НРУ1 8 вырезают из очищенного плазмидного препарата рВ1ие5спр1 II ЗК+:НРУ18, в котором ДНКпоследовательность НРУ1 8 находится по ходу транскрипции от промотора Т7, при помощи Есо РУ и ХЬа I. Полученный фрагмент Есо Ρζ ХЬа I НРУ 18 очищают и лигируют в разрезанную Есо ΡI и ХЬа I, обработанную С4Р рсИЫА ЕАтр, так что кодирующая НРУ 18 ДНК находится по ходу транскрипции от промотора СМУ.

c) рЗ29016-1:НРУ18. НРУ18 вырезают из рВШекспр! II ЗК+:НРУ18 ограниченным расщеплением Есо ΡI и последующей очисткой фрагмента 1,3 т.п.н. из агарозных гелей. Полученный фрагмент Есо ΡI НРУ 18 лигируют в разрезанную Есо Рф обработанную С4Р рЗ29016-1. Отбирают субклоны, в которых смысловая ориентация НРУ1 8 находится по ходу транскрипции от промотора ЬТР ШУ.

ά) рАси^51:ИРУ18 Ь1. ОКР полноразмерного Ь1 НРУ18 амплифицировали ПЦР из клона № 187-1 с использованием олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих фланкирующие сайты Вд111. Ген Ь1 встраивали в сайт ВатН1 бакуловирусного трансферного вектора, рАсИ^51 (РйагМтдеп, 1пс.), под контролем промотора полиэдрина. Рекомбинантные бакуловирусы, содержащие экспрессионную кассету Ь1 НРУ 18, получали в соответствии со способами, описанными в Рйагттдеп Мапиа1. Рекомбинантные клоны очищали путем серийного разведения и дот-блот-гибридизации.

Пример 18. Экспрессия полипептида НРУ18 транскрипцией/трансляцией т νίΐΓο и трансфекцией в клетки-хозяева.

Векторы, содержащие ДНК-последовательности НРУ, используют для проведения трансляции полипептида НРУ1 8 в лизатах ретикулоцитов кролика, клетках-хозяевах млекопитающего и в инфицированных бакуловирусом клетках насекомых. Экспериментальные процедуры, в основном, соответствуют описанным в инструкциях изготовителя.

a) 1п уйго транскрипция/трансляция. Плазмидную ДНК рВ1иезспр! III БК+:НРУ18 (с НРУ18 в Т7 ориентации) линеаризуют расщеплением Ват Н1 по ходу транскрипции от вставки НРУ18. Линеаризованную плазмиду очищают и используют в качестве матрицы для проведения транскрипции РНК-полимеразой Т7 в присутствии т7О(5’)ррр(5’)О. Полученные кэпированные транскрипты НРУ18 очищают осаждением ЫС1 и используют для запуска трансляции НРУ1 8 в предобработанном нуклеазой лизате ретикулоцитов кролика в присутствии Ь-[³⁵Б]метионина.

b) Экспрессия в клетках млекопитающего. Белок НРУ экспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающего после трансфекции либо рсИИА 1/Атр:НРУ18 (под контролем промотора СМУ), либо рБ29016-1:НРУ18 (под контролем промотора ЬТК Н1У). В последнем случае φδΖ9016-1 :НРУ 18) клетки ко-трансфицируют экспресирующей ТАТ плазмидой |.ο8Ζ90161:ТАТ. Для обеих экспрессирующих НРУ 18 плазмид клетки СОБ-7 трансфицируют с применением либо ДЭАЭ-декстрана, либо липофекции липофектамином (ВКЬ).

c) Экспрессия в клетках насекомых. Содержащий Ь1 НРУ 18 бакуловирусный трансфицирующий вектор рАс1Ж51 :НРУ 18 Ь1 используют для получения рекомбинантного бакуловируса (Аи1одгарйа саНГогшса) гомологочной рекомбинацией т νίνο. Затем НРУ 18 с меченым эпитопом экспрессируют в клетках насекомого 8ί9 (Бройор!ега Ггид1регйа), росших в суспензионной культуре, после инфекции содержащим НРУ1 8 рекомбинантным бакуловирусом.

Пример 1 9.

Соединения, влияющие на активность НРУ1 8, можно детектировать различными способами. Способ идентификации соединений, влияющих на НРУ1 8, предусматривает:

(a) смешивание испытуемого соединения с раствором, содержащим НРУ1 8, с образованием смеси;

(b) измерение активности НРУ1 8 в полученной смеси; и (c) сравнение активности НРУ1 8 в смеси со стандартом.

Соединения, действующие на активность НРУ1 8, могут быть использованы для приготовления фармацевтических композиций. Такие фармацевтические композиции могут быть использованы для лечения заболеваний или состояний, характеризующихся инфекцией НРУ18.

Пример 20.

ДНК, которая структурно родственна ДНК, кодирующей НРУ 1 8, обнаруживают при помощи зонда. Пригодный для этого зонд может быть получен на основе ДНК, имеющей полную нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг. 1 или 3, или ее часть, РНК, кодируемой ДНК, имеющей всю нуклеотидную последовательность, указанную на фиг. 1 или фиг. 3, или ее часть, или вырожденных олигонуклеотидов, сконструированных на основе части последовательности, указанной на фиг. 1 или 3.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенная последовательность ДНК, кодирующая капсидный белок Ь1 папилломавируса человека типа 1 8, имеющего следующую структуру:

1ΜΑΙ_ΚΚ-Ρ.50ΝΤνΥΙ.ΡΡ Ρ5νΑΚ 20
2ΐννΝΤ00ΥνΤΒΤ5ΙΡΥΗΑ62 5 40

41Η11_Τν.6ΝΡΥΕΚνΡΑΕ06ΝΚ0 60

61 0 I Р К V 5 А Υ 0 Υ В V Е Ρ. V С) |_ Ρ ϋ Ρ 80

81ΝΚΕ

3ΓΡ0Ν5ΙΥΝΡΕΤ0Κ Ι_νω ЮС

101 А С А е V Ε I 6 К 6 0 Ρ Ь 6 V е Ь 5 6 Η 120

121 Ρ Ε^ζ Υ N К Г 0 О Τ Е 2 2 Н А А Т 5 Ν V 5 140

141 Е С V К ϋ Ν V 2 V 0 Υ К 0 Т О I С I I С 160

161 С А Р А I б Е Η М А К Ё Т А С К 5 К Ρ I 180

181 2 0 6 0 С Р Р Ь Е 1_ К Ν Т V ί Е β С ϋ М 200

201 V 0 Т 6 Υ 6Ά Н 0 Е 5 Т Ь 0 Ό Т К С Е V 220

221 Ρ I 0 I С а 2 I С К Υ Ρ ϋ Υ I а М 2 А ϋ 240

241 Ρ Υ С ϋ. 5 Μ Е Е С Ь В К Е 0 Ь Г А К Η Р 260

261 VI N В - А 6 Т М 6 ϋ Τ V Р С 2 I Υ 1 К С Т 280

281 <3 Μ Р А 3 Р 6 3 С V Υ 2 Р 2 Р 2 Ε $ I V 300

301 Т 5 ϋ 5 О ί_ Р N К Р Υ К к Н К А о е н N 320

321 ν е I с и н ν α ι_ г ν т ν ν о т т к $ т здо

341 Ν I Т I С А 5 7 0 2 Р V Р Е О Υ О А 7 К 360

361 Г к о Υ . 5 к Η V Е Е Ύ □ к О Р I Г 0 к С 380

381 Т '1 Т ί Т А ϋ V М 5 Υ I Н 5 Μ N 5 5 1 ί 400

401 Е ϋ У N Р С V Р Р Р Р Т Т 5 к V О Т Υ К 420

421 Р V 0 5 V А I Т С О К О А А Р А Е N К 0 440

441 Р Υ О К Ь К Р Ц Ν V 0 к К Е К Р 5 ί 0 к 460

461 'о а γ р 1 е я к г ь ν а а а ι. κ к к. р т 48о

481 I С Р К К Р 5 А Р 2 А Т Т 5 2 К Р А К К 500

501 V Я V К А К К * 508

2. Выделенная последовательность ДНК, кодирующая капсидный белок Ь2 папилломавируса человека типа 18, имеющего следующую структуру:

1Μν5ΗΒΑΑΡβΚΒΑ5νΤ ΟΙΥΚΤ 20

21ΟΚα56Τ0Ρ2ϋννΝΚνΕΞΤΤΙ 40

41 А ϋ к ι - о и $ $ к е ι е и е е ι 6 I С ее б1тс5етеектеУ1Ркесв5мт.8о

8ΐ ’ν ν ϋ ν е - р т к р р ν ν ι е р ν е р т о юо

101 Р 5 I V 7 1_ I Е Э 5 5 V V Т 5 С Ά Р К Р 120

121 Т Г Т е Т 5 е Р 0 I Т 5 А 6 Т Т Т Р А V 140

141 к ϋ I Т Р 5 5 Т 5 V 5 I 5 Т Т N Р Т N Р 160

161 А Е 3 О Р 2 I I Е V Р О Т Е Е V 2 Е Ν V 180

181 Е V 6 Т Р Т 5 5 Т Η Е Υ Е Е I Р I 0 7 Р 200

201 А 5 5 6 Т 6 Е £ Р I 3 2 7 Р 1_ Р 7 V К Я 220

221 V А Е Р К к Υ 5 К А Υ 0 0 V 5 V А N Р Е 240

241 Р I 7 К Р 3 2 1_ 1 7 Υ 0 N Р А Е Е Р V ϋ 260

261 Т Т I Т Е Е Р К 5 Ν V Р 0 3 О Е М 0 1 1 280

281 Я ί н 8 ’Р А ь т $ к к с Т V Р Е 5 К ь 300 301 0 И А Т м Е т К 3 с т 0 т 2 А К V Н Е Υ 320 321 к 0 I 5 Р I А Р 2 Р £ Υ I Е 1 0 Р 1 V 3 340 341 А т Е й N е 1 Е 0 1 Υ А 0 . ϋ I 0 Р А И Р 360 361 V Р / 3 К Р т т 5 2 А V 5 7 Υ 2 Р Т I 3 5 380 381 А 5 2 Υ 5 N V 7 V Р 1 7 5 2 М 0 V Р V Υ 400 401 Т 6 Р 0 I Т ь Р Р Т 7 2 V И Р I V 3 Р т 420 421 А Р А 5 т 0 Υ I 6 I н 6 7 Н Υ Υ 1 и Р 1 440 441 Υ Υ Е I Р к •К И К К V Р Υ Е Е А 0 б Е V 460 461 А А 3. * Вектор для экспрессии 463 последователь-

ностей ДНК по пп.1 и 2 формулы в клеткаххозяевах, сконструированный на основе дрожжевого челночного вектора, включающего рВК322, ген дрожжей ЬЕи2б и 2ц-плазмиду дрожжей, и содержащий δρΗΙ-фрагмент размером 1,4 т.п.о. из плазмиды рИС18, в состав которого входят следующие конструктивные элементы:

- дивергентные промоторы 8.сегеу1з1ае САЫ-САЫО из плазмиды рВМ272, которые фланкированы с каждой стороны копией терминатора транскрипции АИШ;

- ВатН1-клонирующий сайт, расположенный между промотором САБ. 1 и первой копией терминатора транскрипции ΑΌΗΙ, и

- 8та1-клонирующий сайт, расположенный между промотором САБ. 10 и второй копией терминатора транскрипции АИН1.

4. Вектор экспрессии по п.3, отличающийся тем, что представляет собой вектор р191-6, содержащий последовательность ДНК по п.1 формулы, встроенную в ВатН1-клонирующий сайт.
5. Вектор экспрессии по п.3, отличающийся тем, что представляет собой вектор р195-11, содержащий последовательность ДНК по п.1 формулы, встроенную в ВатН1-клонирующий сайт, и последовательность ДНК по п.2 формулы, встроенную в 8та1-клонирующий сайт.
6. Способ получения вирусоподобных частиц папилломавируса человека типа 1 8, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии:

- трансформируют клетки дрожжей вектором экспрессии по любому из пп.3-5 формулы;

- культивируют трансформированные клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию последовательности ДНК, кодирующих белок Б. 1 и белки Ы+Ь2 папилломавируса человека типа 1 8; и

- выделяют вирусоподобные частицы, которые спонтанно формируются в клетке после экспрессии в ней указанных белков.
7. Способ индуцирования иммунного ответа на папилломавирусы у млекопитающего, отличающийся тем, что млекопитающему вводят вирусоподобные частицы, полученные в соответствии со способом по п.6.