DE69631586T9

DE69631586T9 - Für menschliches papillomavirus stamm 18 kodierende dns

Info

Publication number: DE69631586T9
Application number: DE69631586T
Authority: DE
Inventors: J. Kathryn HOFMANN; U. Kathrin JANSEN; P. Michael NEEPER; G. Joseph JOYCE; A. Hugh GEORGE
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1995-03-22
Filing date: 1996-03-18
Publication date: 2005-06-16
Also published as: EP0817851B1; CZ293697A3; MX9707208A; KR100430698B1; EP0817851A2; EP1422294A1; WO1996029413A2; ATE259879T1; CZ291242B6; NO974322L; NO974322D0; NL300272I1; EA001092B1; NZ305188A; DK0817851T5; DE122007000031I1; AU5314196A; CA2215834A1; NO322254B1; PT817851E

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die für gereinigtes Human-Papillomavirus Typ 18 und Derivate davon kodieren.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von HPV18-L1.
2 ist eine Liste von Aminosäurevariationen innerhalb des L1-Proteins von HPV18.
3 zeigt die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von HPV18-L2.
4 zeigt einen Immunblot von HPV18-L1-Protein, das in Hefe exprimiert wurde.
5 zeigt einen Immunblot von HPV18-L2-Protein, das in Hefe exprimiert wurde.
6 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von virusähnlichen Partikeln, gebildet von HPV18-L1-Protein, das in Hefe exprimiert wurde.
Hintergrund der Erfindung
Papillomavirus (PV)-Infektionen treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind speziesspezifische infektiöse Agenzien; ein Human-Papillomavirus kann kein nicht-menschliches Lebewesen infizieren.
Papillomaviren können auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 70 Typen eingeteilt. Papillomavirus-Typen scheinen insofern typspezifische Immunogene darzustellen, als eine neutralisierende Immunität gegen Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.
Beim Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen. Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26-29 verursachen gutartige Warzen bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 und 46-50 verursachen flache Läsionen bei immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41-44 und 51-55 verursachen gutartige Condylome der Schleimhäute der Genitalien oder Atemwege. Die HPV-Typen 16 und 18 verursachen eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina, Vulva und des Analkanals assoziiert.
Papillomaviren sind kleine (50-60 nm), nicht von einer Hülle umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche für bis zu acht frühe und zwei späte Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet und "L" spät bedeutet. L1 und L2 kodieren für Virus-Kapsidproteine. Die frühen (E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und zellulärer Transformation assoziiert.
Das L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht von 55-60 kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55-60 kD und ein scheinbares Molekulargewicht von 75-100 kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist. Immunologische Daten legen nahe, daß sich der größte Teil des L2-Proteins innerhalb des L1-Proteins im viralen Kapsomer befindet. Der L1-ORF ist bei verschiedenen Papillomaviren hoch konserviert. Die L2-Proteine sind bei verschiedenen Papillomaviren weniger hoch konserviert.
Die L1- und L2-Gene wurden als gute Ziele für für die Immunprophylaxe identifiziert. Studien in den Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus (CRPV)- und Rinder-Papillomavirus (BPV)-Systemen haben gezeigt, daß Immunisierungen mit den L1- und L2-Proteinen, exprimiert in Bakterien oder unter Verwendung von Vaccinia-Vektoren, Tiere vor einer Virusinfektion schützten. Die Expression von Papillomavirus-L1-Genen in Baculovirus-Expressionssystemen oder unter Verwendung von Vaccinia-Vektoren führte zur Assemblierung von virusähnlichen Partikeln (VLP), welche zur Induktion von virus-neutralisierenden Antikörperreaktionen mit hohem Titer, die mit dem Schutz vor einer viralen Herausforderung korrelieren, eingesetzt wurden.
Nach HPV Typ 16 ist HPV18 der zweithäufigste HPV-Typ, der bei Gebärmutterhalskarzinomen gefunden wird. HPV18 wurde in 5-20 % von Gebärmutterhalskrebs-Biopsien, die aus verschiedenen Teilen der Welt gesammelt wurden (Ikenberg, H., 1990, Human papilloma virus DNA in invasive genital carcinomas, in Genital Papillomavirus Infections, G. Gross et al., Hrsg., S. 85-112) nachgewiesen. Es scheint eine geographische Abhängigkeit der Infektion mit HPV18 zu geben, da Tumor-Biopsien von afrikanischen und südamerikanischen Frauen HPV18 häufiger als ähnliche Biopsien von europäischen und nordamerikanischen Frauen aufweisen. Die Gründe für diese geographischen Unterschiede sind nicht bekannt. Die Entwicklung eines Vakzins gegen eine HPV18-Infektion wird äußerst wichtig, da HPV18 auch mit aggressiver wachsenden Krebsarten assoziiert ist und selten bei den milderen Vorläuferläsionen, CIN I-II, gefunden wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die für die in 1 und 3 gezeigten gereinigten Human-Papillomavirus Typ 18 (HPV Typ 18; HPV18)-L1- und -L2-Proteine kodieren, und Verwendungen der DNA-Moleküle.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die für die in 1 und 3 gezeigten gereinigten Human-Papillomavirus Typ 18 (HPV Typ 18; HPV18)-L1- und -L2-Proteine kodieren, virusähnliche Partikel, die die in 1 und 3 gezeigten L1 und L2 enthalten, Peptide und Proteine, die von der DNA kodiert werden, Vakzine, welche die DNA umfassen, oder Vakzine, welche von der DNA kodierte Proteine umfassen, immunologische Zusammensetzungen, welche die DNA oder die von der DNA kodierten Proteine umfassen, Kits, welche die DNA oder von der DNA abgeleitete RNA oder von der DNA kodierten Proteine enthalten.
Pharmazeutisch geeignete Zusammensetzungen, welche die in 1 und 3 gezeigte(n) DNA oder Proteine umfassen, können nach bekannten Verfahren formuliert werden, wie z.B. durch die Zumischung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers. Beispiele solcher Träger und Formulierungsverfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences zu finden. Zur Bildung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die für eine wirksame Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge der DNA oder des Proteins oder VLP enthalten. Solche Zusammensetzungen können DNA oder Proteine oder VLP enthalten, die von mehr als einem HPV-Typ stammen.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden einem Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht, um PV-Infektionen zu behandeln oder zu diagnostizieren. Die wirksame Menge kann entsprechend einer Vielfalt von Faktoren, wie z.B. dem Zustand, Gewicht, Geschlecht und Alter des Individuums, variieren. Andere Faktoren umfassen den Verabreichungsmodus. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen in Dosen verabreicht werden, die von etwa 1 μg bis etwa 1 mg reichen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer Vielfalt von Routen, wie z.B. subkutan, topisch, oral, mukosal, intravenös und intramuskulär, verabreicht werden.
Die Vakzine der Erfindung umfassen DNA, RNA oder Proteine, die von der DNA kodiert werden, welche die antigenen Determinanten enthalten, die zur Induktion der Bildung neutralisierender Antikörper in dem Wirt erforderlich sind. Solche Vakzine sind auch sicher genug, um ohne Gefahr einer klinischen Infektion verabreicht zu werden, besitzen keine toxischen Nebenwirkungen, können auf einem effektiven Weg verabreicht werden, sind stabil und kompatibel mit Vakzin-Trägern.
Die Vakzine können auf einer Vielfalt von Routen verabreicht werden, z.B. oral, parenteral, subkutan, mukosal, intravenös oder intramuskulär. Die verabreichte Dosis kann mit dem Zustand, Geschlecht, Gewicht und Alter des Individuums, dem Verabreichungsweg und dem PV-Typ des Vakzins variieren. Das Vakzin kann in Dosierungsformen wie Kapseln, Suspensionen, Elixieren oder flüssigen Lösungen eingesetzt werden. Das Vakzin kann mit einem immunologisch annehmbaren Träger formuliert werden.
Die Vakzine werden in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht, d.h., in ausreichenden Mengen, um eine immunologisch schützende Reaktion hervorzurufen. Die therapeutisch wirksame Menge kann entsprechend dem PV-Typ variieren. Das Vakzin kann in Einzeldosen oder mehreren Dosen verabreicht werden.
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann bei der Formulierung immunogener Zusammensetzungen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen sind, bei Einführung in einen geeigneten Wirt, zur Induktion einer Immunreaktion in dem Wirt in der Lage.
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann zur Serotypenbestimmung einer HPV-Infektion und zum HPV-Screening eingesetzt werden. Die DNA, rekombinanten Proteine, VLP eignen sich zur Formulierung von Kits, die für den Nachweis und die Serotypenbestimmung von HPV geeignet sind. Ein solcher Kit würde einen aufgeteilten Träger umfassen, der dazu geeignet ist, in festem Einschluß mindestens einen Behälter zu enthalten. Der Träger würde ferner Reagenzien wie HPV18-DNA, rekombinantes HPV-Protein oder VLP oder Anti-HPV-Antikörper, die sich zum Nachweis einer Vielfalt von HPV-Typen eignen, umfassen. Der Träger kann auch Nachweismittel, wie z.B. markiertes Antigen oder Enzym-Substrate oder dgl., enthalten.
Die DNA und abgeleiteten Proteine, die in 1 und 3 gezeigt sind, eignen sich auch als Molekulargewichts- und Molekulargrößenmarker.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon zur Kodierung einer speziellen Aminosäure verwendet werden und deshalb kann die Aminosäuresequenz von irgendeinem aus einem Satz ähnlicher DNA-Oligonukleotide kodiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit der HPV18-Sequenz identisch sein, wird jedoch in der Lage sein, mit HPV18-DNA sogar in Gegenwart von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen unter geeigneten Bedingungen zu hybridisieren. Unter alternativen Bedingungen können die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide immer noch mit der HPV18-DNA hybridisieren, um eine Identifizierung und Isolierung von für HPV18 kodierender DNA zu ermöglichen.
Die gereinigte HPV18-DNA der Erfindung kann zur Isolierung und Reinigung von Homologen und Fragmenten von HPV18 aus anderen Quellen eingesetzt werden. Um dies zu erreichen, kann die erste HPV18-DNA mit einer Probe, welche DNA, kodierend für Homologe von HPV18, enthält, unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen gemischt werden. Der hybridisierte DNA-Komplex kann isoliert und DNA, welche für die homologe DNA kodiert, kann daraus gereinigt werden.
Eine Vielfalt von Verfahren kann zur molekularen Klonierung von HPV18-DNA eingesetzt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, direkte funktionelle Expression der HPV18-Gene nach der Erstellung einer HPV18-enthaltenden cDNA-Bank oder genomischen DNA-Bank in einem geeigneten Expressionsvektorsystem. Ein weiteres Verfahren ist das Screenen einer HPV18-enthaltenden cDNA-Bank oder genomischen DNA-Bank, die in einem Bakteriophagen oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer markierten Oligonukleotid-Sonde, die anhand der Aminosäuresequenz des HPV18 konstruiert wurde. Ein weiteres Verfahren besteht im Screenen einer HPV18-enthaltenden cDNA-Bank oder genomischen DNA-Bank, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer partiellen DNA, die für das HPV18 kodiert. Diese partielle DNA wird erhalten durch die spezifische Polymerasekettenreaktions (PCR)-Amplifizierung von HPV18-DNA-Fragmenten durch die Konstruktion degenerierter Oligo nukleotid-Primer anhand der Aminosäuresequenz von gereinigtem HPV18. Ein weiteres Verfahren ist die Isolierung von RNA aus HPV18-produzierenden Zellen und Translation der RNA in ein Protein über ein in vitro- oder ein in vivo-Translationssystem. Die Translation der RNA in ein Peptid oder ein Protein wird zur Produktion mindestens eines Teils des HPV18-Proteins führen, welches beispielsweise durch die Aktivität des HPV18-Proteins oder durch immunologische Reaktivität mit einem Anti-HPV18-Antikörper identifiziert werden kann. Bei diesem Verfahren können Pools von RNA, die aus HPV18-produzierenden Zellen isoliert wurden, hinsichtlich der Anwesenheit einer RNA, die für mindestens einen Teil des HPV18 kodiert, analysiert werden. Eine weitere Fraktionierung des RNA-Pools kann erfolgen, um die HPV18-RNA von Nicht-HPV18-RNA zu reinigen. Das nach diesem Verfahren hergestellte Peptid oder Protein kann analysiert werden, um Aminosäuresequenzen bereitzustellen, welche wiederum zur Bereitstellung von Primern für die Produktion von HPV18-cDNA eingesetzt werden, oder die für die Translation eingesetzte RNA kann analysiert werden, um Nukleotidsequenzen, die für HPV18 kodieren, bereitzustellen und Sonden für das Screening einer HPV18-cDNA-Bank zu ergeben. Diese Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise in Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, zu finden.
Es ist ersichtlich, daß andere Typen von Banken, sowie Banken, die aus anderen Zellen oder Zelltypen erstellt wurden, zur Isolierung von DNA, die für HPV18 kodiert, geeignet sein können. Andere Typen von Banken umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, cDNA-Banken, die von anderen Zellen oder Zellinien stammen, die HPV Typ 18 enthalten, und genomische DNA-Banken.
Die Erstellung von cDNA-Banken kann nach einer Vielfalt von Techniken erfolgen. Verfahren zur Erstellung von cDNA-Banken sind in Sambrook J., et al., oben, zu finden. Es ist ersichtlich, daß für HPV18 kodierende DNA auch aus einer geeigneten genomischen DNA-Bank isoliert werden kann. Die Erstellung von genomischen DNA-Banken kann nach einer Vielfalt von Techniken durchgeführt werden. Verfahren zur Erstellung genomischer DNA-Banken sind in Sambrook, J., et al., oben, zu finden.
Die klonierte HPV18-DNA, welche mit den hier beschriebenen Verfahren erhalten wurde, kann durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor, der einen geeigneten Promotor und andere geeignete regulatorische Transkriptionselemente enthält, rekombinant exprimiert und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen überführt werden, um rekombinantes HPV18 zu bilden. Techniken für solche Manipulationen werden vollständig in Sambrook, J., et al., oben, beschrieben und sind im Stand der Technik bekannt.
Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierter Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einen geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können zur Expression eukaryotischer Gene in einer Vielfalt von Wirten, wie z.B. Bakterien, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen und Tierzellen, eingesetzt werden. Speziell konstruierte Vektoren erlauben das Shuttling von DNA zwischen Wirten wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen oder Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebratenzellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promotoren. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und zur Initiierung von RNA-Synthese veranlaßt. Ein starker Promotor ist einer, welcher die Initiierung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlaßt. Expressionsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren.
Eine Vielfalt von Säuger-Expressionsvektoren kann zur Expression der HPV18-DNA in Säugerzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Säuger-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante HPV18-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pcDNA3 (Invitrogen), pMC1 neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) und λZD35 (ATCC 37565).
Eine Vielfalt von bakteriellen Expressionsvektoren kann zur Expression der HPV18-DNA in Bakterienzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche bakterielle Expressionsvektoren, welche geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pET11a (Novagen), Lambda gt11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).
Eine Vielfalt von Pilzzell-Expressionsvektoren kann zur Expression des HPV18 in Pilzzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Pilzzell-Expressionsvektoren, welche geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pYES2 (Invitrogen), Pichia-Expressionsvektor (Invitrogen) und Hansenula-Expression (Rhein Biotech, Düsseldorf, Deutschland).
Eine Vielfalt von Insektenzell-Expressionsvektoren kann zur Expression der HPV18-DNA in Insektenzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Insektenzell-Expressionsvektoren, welche geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pBlue Bac III (Invitrogen) und pAcUW51 (PharMingen, Inc.).
Ein Expressionsvektor, welcher die in 1 und 3 gezeigte, für HPV18 kodierende DNA enthält, kann zur Expression der HPV18-Proteine in einer Zelle, in Geweben, Organen oder Tieren eingesetzt werden. Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien wie E. coli, Pilzzellen wie Hefe, Säugerzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zellinien von Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagetieren, und Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, von Drosophila und Seidenraupe abgeleitete Zellinien. Zellinien, die sich von Säugerspezies ableiten, welche geeignet sein mögen und im Handel erhältlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, L-M(TK^–)-L-Zellen (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171).
Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen mit irgendeiner aus einer Vielzahl von Techniken eingeführt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Lipofektion, Protoplastenfusion und Elektroporation. Die Zellen, welche Expressionvektor enthalten, werden klonal vermehrt und individuell analysiert, um festzustellen, ob sie HPV18-Protein produzieren. Die Identifizierung von HPV18-exprimierenden Wirtszellklonen kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, immunologische(n) Reaktivität mit Anti-HPV18-Antikörpern, und Anwesenheit von wirtszell-assoziierter HPV18-Aktivität, wie z.B. HPV18-spezifische Ligandenbindung oder Signaltransduktion, definiert als eine Reaktion, welche durch die Wechselwirkung von HPV18-spezifischen Liganden mit den exprimierten HPV18-Proteinen vermittelt wird.
Die Expression von HPV-DNA kann auch mit Hilfe von in vitro hergestellter synthetischer mRNA oder nativer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA oder aus HPV18-produzierenden Zellen isolierte mRNA kann sowohl effizient in verschiedenen zellfreien Systemen translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakte und Retikulozytenextrakte, als auch effizient in Systemen auf Zellbasis translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Frosch-Oozyten, wobei die Mikroinjektion in Frosch-Oozyten bevorzugt ist.
Nach der Expression des/der HPV18-Proteine) in einer Wirtszelle kann HPV18-Protein gewonnen werden, um HPV18 in gereinigter Form bereitzustellen. Mehrere HPV18-Reinigungsverfahren sind verfügbar und zur Anwendung geeignet. Wie hier beschrieben, kann rekombinantes HPV18-Protein aus Zellysaten und Extrakten durch verschiedene Kombinationen von oder individuelle Anwendung von Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlußchromatographie, Hydroxylapatit-Adsorptionschromatographie und Chromatographie hydrophober Wechselwirkung gereinigt werden.
Darüber hinaus kann rekombinantes HPV18 von anderen zellulären Proteinen mit Hilfe einer Immunaffinitätssäule, die mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellt wurde, welche für naszierendes HPV18 voller Länge oder Polypeptid-Fragmente von HPV18 spezifisch sind, abgetrennt werden.
Es können Kits hergestellt werden, welche die HPV18-DNA, HPV18-RNA oder das HPV18-Protein enthalten. Solche Kits werden zum Nachweis von DNA eingesetzt, welche mit HPV18-DNA hybridisiert, oder zum Nachweis der Anwesenheit von HPV18-Proteinen) oder -Peptidfragmenten in einer Probe. Eine solche Charakterisierung ist für eine Vielzahl von Zwecken von Nutzen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, gerichtsmedizinische Analysen und epidemiologische Studien.
Für eine Kombinationsbehandlung mit mehr als einem Wirkstoff, wobei die Wirkstoffe in separaten Dosierungsformulierungen vorliegen, können die Wirkstoffe gleichzeitig verabreicht werden oder sie können jeweils zu separaten versetzten Zeiten verabreicht werden.
Der Dosierungsplan wird entsprechend einer Vielfalt von Faktoren ausgewählt, welche Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischen Zustand des Patienten, die Schwere des zu behandelnden Krankheitszustandes, den Verabreichungsweg, die Nieren- und Leberfunktion des Patienten und die speziell eingesetzte Verbindung einschließen. Ein durchschnittlich befähigter Arzt kann unschwer die wirksame Menge des Arzneiwirkstoffes, welche zur Verhinderung, Entgegenwirkung oder zum Stillstandbringen des Krankheitsfortschritts erforderlich ist, bestimmen und verschreiben. Eine optimale Präzision bei der Erzielung von Arzneiwirkstoffkonzentrationen innerhalb des Bereichs, der eine Wirksamkeit ohne Toxizität ergibt, erfordert einen Plan, der auf der Kinetik der Verfügbarkeit des Arzneiwirkstoffs für Zielstellen basiert. Dies beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung eines Arzneiwirkstoffs.
BEISPIEL 1
Klonierung des HPV18-Genoms
Genomische Gesamt-DNA wurde aus der von einem Human-Gebärmutterhalskarzinom abgeleiteten Zellinie SW756 (Freedman, R.S., et al., 1982, In Vitro, Bd. 18, S. 719-726) nach Standardverfahren hergestellt. Die DNA wurde mit EcoR1 verdaut und einer Elektrophorese durch ein 0,8%iges präparatives Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur unterworfen. Eine Gelscheibe wurde ausgeschnitten, welche DNA-Fragmenten von etwa 12 kb Länge entsprach. Die Agarose wurde mit Hilfe von Agarase^TM-Enzym (Boehringer Mannheim, Inc.) verdaut und die größenfraktionierte DNA wurde gefällt, dephosphoryliert und mit EcoR1-verdauten Lambda-EMBL4-Armen (Stratagene, Inc.) ligiert. Die Lambda-Bank wurde mit Hilfe des Gigapack II Gold-Verpackungsextrakts (Stratagene, Inc.) verpackt. HPV18-positive Klone wurden mit Hilfe einer 700 bp langen HPV18-L1-DNA-Sonde identifiziert, welche mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Einsatz von SW756-DNA als Matrize und Oligonukleotid-Primern, welche auf Grundlage der veröffentlichten HPV18-L1-DNA-Sequenz (Cole und Danos, 1987, J. Mol. Biol., Bd. 193:599-608; Genbank-Zugangs-Nr. X05015) konstruiert worden waren, hergestellt wurde. Ein HPV18-positiver Lambda-Klon, welcher ein 12-kb-EcoR1-Fragment-Insert enthielt, wurde isoliert und als # 187-1 bezeichnet.
BEISPIEL 2
Konstruktion von Hefe-Exgressionsvektoren
Der offene Leserahmen (ORF) von HPV18-L1 wurde mittels PCR unter Verwendung des Klons # 187-1 als Matrize, von Vent-Polymerase^TM (New England Biolabs, Inc.), 10 Amplifizierungszyklen (94° C, 1 Min.; 50° C, 1 Min.; 72° C, 2 Min.) und den folgenden Oligonukleotid-Primern, welche flankierende BgIII-Stellen (unterstrichen) enthalten, amplifiziert:
Sense-Primer:
Antisense-Primer:
Der Sense-Primer führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz (Kniskern, et al., 1986, Gene, Bd. 46:135-141) unmittelbar stromaufwärts des HPV18-L1-Initiations-Methionin- Codons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das 1,5-kbp-L1-PCR-Produkt wurde mit BgIII verdaut und gelgereinigt.
Der pGAL1-10-Hefe-Expressionsvektor wurde konstruiert durch Isolierung eines 1,4-kbp-Sphl-Fragments aus einem bidirektionalen pUC18/GAL-Promotorplasmid, welches die divergenten Saccharomyces cerevisiae-GAL1-GAL10-Promotoren aus dem Plasmid pBM272 enthält (zur Verfügung gestellt von Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). Die divergenten Promotoren sind auf jeder Seite von einer Kopie des Hefe-ADH1-Transkriptionsterminators, einer BamHI-Klonierungsstelle, die sich zwischen dem GAL1-Promotor und einer ersten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators befindet, und einer zwischen dem GAL10-Promotor und der zweiten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators befindlichen SmaI-Klonierungsstelle flankiert. Ein Hefe-Shuttle-Vektor, bestehend aus pBR322, dem Hefe-LEU2d-Gen und dem Hefe-2μ-Plasmid (Gabe von Benjamin Hall, University of Washington, Seattle, WA), wurde mit Sphl verdaut und mit dem 1,4-kbp-Sph1-Fragment des divergenten GAL-Promotors ligiert, was zu pGAL1-10 führte. pGAL1-10 wurde mit BamHI linearisiert, welches zwischen dem GAL1-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet. Der mit BamH1 verdaute Vektor und das mit BgIII verdaute HPV18-L1-PCR-Fragment wurden ligiert und zur Transformation von E. coli-DHS-Zellen (Gibco BRL, Inc.) eingesetzt. Ein pGAL1-10-Plasmid, welches das HPV18-L1-Gen enthält, wurde isoliert und erhielt die Bezeichnung p191-6.
Ein Hefe-Expressionsvektor, welcher die HPV18-L1- und -L2-Gene beide koexprimiert, wurde konstruiert. Das Plasmid p191-6 (pGAL1-10 + HPV18-L1) wurde mit SmaI verdaut, welches zwischen dem GAL10-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet. Das 1,4-kbp-HPV18-L2-Gen wurde mittels PCR wie oben beschrieben amplifiziert unter Verwendung der folgenden Oligonukleotid-Primer, welche flankierende SmaI-Stellen (unterstrichen) enthalten:
Sense-Primer:
Antisense-Primer:
Der Sense-Primer führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz (Kniskern et al., 1986, oben) unmittelbar stromaufwärts des HPV18-L2-Initiations-Methionin-Codons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das PCR-Fragment wurde mit SmaI verdaut, gelgereinigt und mit dem SmaI-verdauten p191-6-Plasmid ligiert. Ein pGAL1-10-Plasmid, welches die HPV18-L1- und -L2-Gene beide enthielt, wurde isoliert und als p195-11 bezeichnet.
BEISPIEL 3
Typenbestimmung klinischer Proben
Gebärmutterhalsbiopsie-Proben wurden am Veterans Administration Medical Center in Indianapolis, IN (Gefälligkeit von Dr. Darron Brown) und am Albert Einstein Medical Center in Philadelphia, PA (Gefälligkeit von Dr. Joan Adler) gesammelt und bei –20° C eingefroren. DNA wurde isoliert wie von Brown et al., 1993 (Brown, D., et al., 1993, J. Clin. Microbiol., Bd. 31:2667-2673) beschrieben. In Kürze, die klinischen Proben wurden mit einem Braun-Mikro-Dismembrator II (B. Braun Instruments, Melsungen, Deutschland) aufgearbeitet und in Puffer solubilisiert, der 10 mM EDTA und 0,6 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt. Die Proben wurden auf 20 mM Tris, pH 7,4, eingestellt und Protein wurde mit 50 μg/ml Proteinase K in Gegenwart von 0,1 μg/ml RNase A verdaut, gefolgt von Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol. DNA wurde ethanolgefällt und durch Spektrophotometrie quantitativ bestimmt.
Die DNA-Proben wurden mittels PCR und Southernblot-Analysen hinsichtlich der Anwesenheit von HPV18 gescreent. Ein 256-bp-Segment des HPV18-L1-ORF wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden Oligonukleotid-Primer amplifiziert:
Sense-Primer:
Antisense-Primer:
Die PCR-Bedingungen waren entsprechend den Empfehlungen des Herstellers für den AmpliTaq^TM-DNA-Polymerase/GeneAmp^TM-Kit (Perkin Elmer Corp.), mit Ausnahme dessen, daß 0,5 μl klinischer Proben-DNA als Matrize eingesetzt wurden und sich 10 pmol eines jeden Primers, 2 mM dNTPs und 2,0 mM MgCl₂ in der endgültigen Reaktionsmischung befanden. Einem Denaturierungsschritt von 2 Min. bei 94° C folgten 40 Zyklen Amplifizierung (94° C, 1 Min.; 45° C, 1 Min.; 72° C, 1 Min.).
Die PCR-Produkte wurden einer Elektrophorese durch ein 3,0%iges Agarosegel unterworfen, auf Nylonmembranen geblottet und mit einer ³²P-markierten HPV18-L1-spezifischen Oligonukleotid-Sonde hybridisiert.
BEISPIEL 4
DNA-Sequenzierung von L1- und L2-Genen
Die HPV18-L1- und -L2-Gene in den Klonen # 187-1, p191-6 und p195-11 wurden mit Hilfe des PRIZM-Sequenzierungskits und des automatischen DNA-ABI-Sequenzierers # 373A (Applied Biosystems) sequenziert. Um eine Konsensus-HPV18-Sequenz zu erhalten, wurden Teile der L1-Gen-DNA mittels PCR aus humanen klinischen Isolaten amplifiziert, sequenziert und mit den beanspruchten und veröffentlichten Sequenzen verglichen. Ein 256-bp-Fragment (Nukleotide 817-1072) wurde von jedem klinischen DNA-Isolat für diesen Zweck unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Oligonukleotide und Erwärmungszyklen amplifiziert. Die folgenden Primer
wurden zur Amplifizierung eines aminoterminalen 432-bp-Abschnitts von L1-DNA (Nukleotide 1-431) unter Anwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Erwärmungszyklen eingesetzt. Beide PCR-Produkte wurden separat mit dem Plasmid pCRII (Invitrogen Corp.) und Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Reagenzien und Prozeduren ligiert. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten isoliert und diejenigen, welche EcoRI-Inserts enthielten, wurden sequenziert.
BEISPIEL 5
Analyse von DNA-Sequenzen und abgeleiteten Aminosäuresequenzen
Die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz (AS) des beanspruchten HPV18-L1 sind in 1 gezeigt. Die DNA-Sequenz wurde von einem Konsensus der Klone # 187-1, p191-6 und p195-11 abgeleitet. Ein Vergleich der beanspruchten HPV18-L1-Nukleotidsequenz mit der veröffentlichten HPV18-L1-Sequenz (Genbank-Zugangs-Nr. X05015) identifizierte 20 bp Abweichungen von 1524 bp. Fünf der Nukleotidaustausche (C zu G bei Position 89, C zu A bei 263, C zu G bei 848, G zu A bei 967 und C zu G bei 1013) resultieren in Aminosäuresubstitutionen. Die Unterschiede von fünf Resten gegenüber der veröffentlichten Sequenz sind P zu R an den AS-Positionen 30, 283 und 338, T zu N bei AS 88 und V zu I bei AS 323 (2). Die Positionen 88 und 323 stellen konservative Austausche dar, während die drei P-zu-R-Austausche die physikalischen Eigenschaften des exprimierten L1-Proteins substantiell verändern können.
Ein Vergleich der von klinischen Isolaten (Nrn. 354, 556, 755, 697, 795 und 23) erhaltenen Aminosäuresequenzen mit der beanspruchten Sequenz und der veröffentlichten Sequenz ist in 2 gezeigt. Es gibt vier Positionen, an denen sich die klinischen Isolate und die beanspruchte Sequenz von der veröffentlichten Sequenz unterscheiden. Die Positionen 30, 283 und 338 kodieren für Arginin (R) in allen bisher gefundenen Isolaten, einschließlich der beanspruchten Sequenz. Dies steht in scharfem Gegensatz zur veröffentlichten Sequenz, die Proline (P) an jeder dieser Stellen aufweist. Ferner ist Position 88 ein Asparagin (N) in den Isolaten und der beanspruchten Sequenz, jedoch ein Threonin (T) in der veröffentlichten Sequenz. Die letzte Abweichung, Position 323, wurde als Valin (V) in vielen der klinischen Isolaten und der veröffentlichten Sequenz gegenüber einem Isoleucin (I) in der beanspruchten Sequenz und einem der Isolate (# 23) befunden. Die Schlußfolgerung ist, daß die beanspruchte Sequenz die überwiegenden viralen Sequenzen reflektiert, welche mit klinischen Infektionen assoziiert sind, und die Abwesenheit von Isolaten, welche an irgendeiner der Positionen 30, 283 oder 338 Proline der veröffentlichten Sequenz enthalten, legt nahe, daß der veröffentlichte Klon entweder ein Artefakt oder ein irrelevanter Subtyp ist.
Die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von HPV18-L2 wurden von einer Konsensussequenz der Klone # 187-1 und p195-11 abgeleitet und sie sind in 3 gezeigt. Ein Vergleich der L2-Nukleotidsequenz mit der veröffentlichten HPV18-Sequenz (Genbank-Zugangs-Nr. X05015) identifizierte 40 by Abweichungen von 1389 bp. Die Basenpaarunterschiede resultieren in 14 Änderungen auf der Aminosäureebene: P zu S bei AS 29, P zu N bei AS 33, A zu S bei AS 177, D zu E bei AS 266, D zu N bei AS 270, D zu G bei AS 346, M zu I bei AS 355, V zu M bei AS 359, S zu P bei AS 365, F zu S bei AS 369, F zu V bei AS 371, F zu S bei AS 372, K zu T bei AS 373 und S zu P bei AS 409.
BEISPIEL 6
Herstellung von HPV18-L2-Antiserum
HPV18-L2-spezifische Antikörper wurden in Ziegen unter Verwendung eines in E. coli exprimierten trpE-HPV18-L2-Fusionsproteins hergestellt. Der Vollängen-L2-ORF wurde mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die HindIII- und BamHI-Stellen bereitstellten, welche die 5'- bzw. 3'-Enden flankierten, amplifiziert. Das L2-Fragment wurde in das mit HindIII-BamHI verdaute Expressionsplasmid pATH23 (Koerner et al., 1991, Meth. Enzymol. Bd. 194:477-490) inseriert. Das Fusionsprotein wurde in E. coli-RR1-Zellen (Gibco BRL, Inc.) nach Induktion mit 3-β-Indolacrylsäure exprimiert. Die unlösliche Fraktion wurde mittels SDS-PAGE, gefolgt von Anfärbung mit Coomassieblau, analysiert. Das trpE-L2-Fusionsprotein machte den größten Teil der unlöslichen E. coli-Fraktion aus. Ziegen wurden mit dem trpE-L2-Fusionsprotein nach dem Standardprotokoll von Pocono Rabbit Farm und Laboratory, Inc. für Fusionsproteinantigene (Protein Rabbit Farm, Canadensis, PA) immunisiert.
BEISPIEL 7
Herstellung des Hefestamms U9
Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm 2150-2-3 (MATalpha, leu2-04, ade1, cir°) wurde von Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA) erhalten. Zellen des Stamms 2150-2-3 wurden über Nacht bei 30° C in 5 ml YEHD-Medium (Carty et al., J. Ind Micro 2 (1987), 117-121) vermehrt. Die Zellen wurden dreimal in sterilem, destilliertem Wasser gewaschen, in 2 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und 0,1 ml Zellsuspension wurde auf jede von sechs 5-Fluorotsäure (FOA)-Platten ausplattiert, um hinsichtlich ura3-Mutanten zu selektionieren (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Die Platten wurden bei 30° C inkubiert. Das Medium enthielt auf 250 ml destilliertes Wasser: 3,5 g Difco-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,5 g 5-Fluorotsäure, 25 mg Uracil und 10,0 g Dextrose.
Das Medium wurde mittels Filtration durch 0,2-μm-Membranen sterilisiert und dann mit 250 ml 4%igem Bacto-Agar (Difco), gehalten bei 50° C, 10 ml einer 1,2-mg/ml-Lösung von Adenin und 5 ml L-Leucin-Lösung (180 mg/50 ml) gemischt. Das resultierende Medium wurde mit 20 ml pro Petrischale aufgeteilt.
Nach 5 Tagen Inkubation waren zahlreiche Kolonien erschienen. Einzelkolonien wurden isoliert durch erneutes Ausstreichen von Kolonien von den ursprünglichen FOA-Platten auf frische FOA-Platten, welche dann bei 30° C inkubiert wurden. Eine Anzahl Kolonien von dem zweiten Satz von FOA-Platten wurde durch Replika-Plattierung auf sowohl YEHD-Platten als auch Uracil-Minus-Platten hinsichtlich der Anwesenheit der ura3-Mutation getestet. Das gewünschte Ergebnis war gutes Wachstum auf YEHD- und kein Wachstum auf Uracil-Minus-Medium. Ein Isolat (U9) wurde erhalten, welches diese Eigenschaften zeigte. Es wurde als eingefrorene Glycerinstammlösung (Stamm # 325) bei –70° C für die spätere Verwendung gelagert.
BEISPIEL 8
Herstellung eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-MNN9-Gens
Zur Herstellung eines Vektors für die Unterbrechung des MNN9-Gens war es erforderlich, zuerst das MNN9-Gen aus genomischer S. cerevisiae-DNA zu klonieren. Dies wurde erreicht durch eine Standard-Polymerasekettenreaktion (PCR)-Technik. Ein 5'-Sense-Primer und ein 3'-Antisense-Primer für die PCR der für MNN9 kodierenden Vollängen-Sequenz wurden auf Grundlage der veröffentlichten Sequenz für das Hefe-MNN9-Gen konstruiert (Zymogenetics: EP-Patentanmeldung Nr. 88 117 834.7, Veröffentlichungsnummer 0-314-096-A2). Es wurden die folgenden Oligodesoxynukleotid-Primer eingesetzt, welche flankierende HindIII-Stellen (unterstrichen) enthielten:
Das initiierende Methionincodon für das MNN9-Gen ist in Fettdruck hervorgehoben. Die PCR erfolgte unter Verwendung von genomischer DNA aus dem S. cerevisiae-Stamm JRY188 als Matrize, Taq-DNA-Polymerase (Perkin Eimer) und 25 Amplifizierungszyklen (94° C, 1 Min., 37° C, 2 Min., 72° C, 3 Min.). Das resultierende 1,2-kbp-PCR-Fragment wurde mit HindIII verdaut, gelgereinigt und mit HindIII-verdautem, mit alkalischer Phosphatase behandeltem pUC13 (Pharmacia) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als p1183 bezeichnet.
Zur Unterbrechung des MNN9-Gens mit dem Hefe-URA3-Gen wurde das Plasmid pBR322-URA3 (welches das 1,1-kbp-HindIII-Fragment, kodierend für das S. cerevisiae-URA3-Gen, in die HindIII-Stelle von pBR322 subkloniert enthält) mit HindIII verdaut und das 1,1-kbp-DNA-Fragment, welches das funktionelle URA3-Gen trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit dem PmII-verdauten Plasmid p1183 (PmII spaltet innerhalb der für MNN9 kodierenden Sequenz) ligiert. Das resultierende Plasmid p1199 enthält eine Unterbrechung des MNN9-Gens durch das funktionelle URA3-Gen.
BEISPIEL 9
Konstruktion des U9-Derivat-Stammes 1372, welcher eine Unterbrechung des MNN9-Gens enthält
Zur Unterbrechung des MNN9-Gens in dem Stamm U9 (# 325) wurden 30 μg des Plasmids p1199 mit HindIII verdaut, um eine lineare mnn9::URA3-Unterbrechungskassette zu schaffen. Zellen des Stamms 325 wurden mit der HindIII-verdauten p1199-DNA nach dem Sphäroplasten-Verfahren (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933) transformiert und Transformanten würden auf einem synthetischen Agarmedium, dem Uracil fehlte und das 1,0 M Sorbit enthielt, selektioniert. Das synthetische Medium enthielt pro Liter destilliertes Wasser: Agar, 20 g, Hefe-Stickstoffbase w/o Aminosäuren, 6,7 g, Adenin, 0,04 g, L-Tyrosin, 0,05 g, Sorbit, 182 g, Glucose, 20 g, und Leucin-Minus-Lösung #2, 10 ml. Leucin- Minus-Lösung #2 enthält pro Liter destilliertes Wasser: L-Arginin, 2 g, L-Histidin, 1 g, L-Leucin, 6 g, L-Isoleucin, 6 g, L-Lysin, 4 g, L-Methionin, 1 g, L-Phenylalanin, 6 g, L-Threonin, 6 g, L-Tryptophan, 4 g.
Die Platten wurden bei 30° C fünf Tage lang inkubiert, zu welchem Zeitpunkt zahlreiche Kolonien erschienen waren. Chromosomale DNA-Präparationen wurden von 10 Kolonien hergestellt und dann mit EcoRI plus HindIII verdaut. Die DNA-Verdauungen wurden dann mittels Southernblots (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) unter Verwendung des 1,2-kbp-HindIII-Fragments, welches das MNN9-Gen (isoliert aus dem Plasmid p1199) trägt, als Sonde beurteilt. Ein Isolat wurde identifiziert (Stamm # 1372), welches die erwarteten DNA-Banden-Verschiebungen auf dem Southernblot sowie die extreme Klumpigkeit zeigte, die typischerweise von mnn9-Mutanten gezeigt wird.
BEISPIEL 10
Konstruktion eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-HIS3-Gens
Zur Konstruktion einer Unterbrechungskassette, bei der das S. cerevisiae-HIS3-Gen durch das URA3-Gen unterbrochen wird, wurde das Plasmid YEp6 (K. Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76:1035) mit BamHI verdaut und das 1,7-kbp-BamHI-Fragment, welches das HIS3-Gen trägt, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit pUC18 ligiert, welches zuvor mit BamHI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase behandelt worden war. Das resultierende Plasmid (als p1501 oder pUC18-HIS3 bezeichnet) wurde mit NheI verdaut (welches innerhalb der für HIS3 kodierenden Sequenz spaltet) und das Vektorfragment wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelt. Das URA3-Gen wurde aus dem Plasmid pBR322-URA3 durch Verdauung mit HindIII isoliert und das 1,1-kbp-Fragment, welches das URA3-Gen trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit dem obigen pUC18-HIS3-NheI-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid (als pUC18-his3::URA3 oder p1505 bezeichnet) enthält eine Unterbrechungskassette, bei der das Hefe-HIS3-Gen durch das funktionelle URA3-Gen unterbrochen ist.
BEISPIEL 11
Konstruktion eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-PR81-Gens durch das HIS3-Gen
Das Plasmid FP8ΔH, welches das S. cerevisiae-PRB1-Gen trägt, wurde von Dr. E. Jones von der Carnegie-Mellon University (C. M. Moehle et al., 1987, Genetics 115:255-263) zur Verfügung gestellt. Es wurde mit HindIII plus XhoI verdaut und das 3,2-kbp-DNA-Fragment, welches das PR81-Gen trug, wurde gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18 wurde mit BamHI verdaut, gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das resultierende Vektorfragment wurde mit dem obigen PRB1-Gen-Fragment ligiert, um das Plasmid pUC18-PRB1 zu ergeben. Das Plasmid YEp6, welches das HIS3-Gen enthält, wurde mit BamHI verdaut. Das resultierende 1,7-kbp-BamHI-Fragment, welches das funktionelle HIS3-Gen trägt, wurde gelgereinigt und dann durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18-PRB1 wurde mit EcoRV plus NcoI verdaut, welches innerhalb der für PRB1 kodierenden Sequenz spaltet und die aktive Stelle der Protease B und flankierende Sequenz entfernt. Das 5,7-kbp-EcoRV-NcoI-Fragment, welches die restlichen 5'- und 3'-Abschnitte der für PRB1 kodierenden Sequenz in pUC18 trägt, wurde gelgereinigt, durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht, mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase dephosphoryliert und mit dem oben beschriebenen glattendigen HIS3-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid (als pUC18-prbI::HIS3 bezeichnet, Stamm # 1245) enthält das funktionelle HIS3-Gen anstelle des PRB1-Gen-Abschnitts, welcher oben deletiert worden war.
BEISPIEL 12
Konstruktion eines U9-verwandten Hefestammes, der Unterbrechungen sowohl des MNN9- als auch des PRB1-Gens enthält
Der U9-verwandte Stamm 1372, welcher eine MNN9-Gen-Unterbrechung enthält, wurde in Beispiel 9 beschrieben. Klonale Isolate des Stammes 1372 wurden einer Passage auf FOA-Platten (wie in Beispiel 7 beschrieben) unterworfen, um ura3-Mutanten zu selektionieren. Eine Anzahl von ura3-Isolaten des Stammes 1372 wurde erhalten und ein spezielles Isolat (Stamm 12930-190-S1-1) wurde für die nachfolgende Unterbrechung des HIS3-Gens ausgewählt. Der pUC18-his3::URA3-Genunterbrechungsvektor (p1505) wurde mit XbaI plus EcoRI verdaut, um eine lineare his3::URA3-Unterbrechungskassette zu schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-190-S1-1 nach dem Lithiumacetatverfahren [Methods in Enzymology, 194:290 (1991)] verwendet. Ura⁺-Transformanten wurden auf synthetischem Agarmedium ohne Uracil selektioniert, für klonale Isolate auf demselben Medium erneut ausgestrichen und dann auf Medium, dem entweder Uracil oder Histidin fehlte, replikaplattierf, um hinsichtlich derjenigen Isolate zu screenen, welche sowohl Ura⁺ als auch His^– waren. Ein Isolat (Stamm 12930-230-1) wurde für die anschließende Unterbrechung des PRB1-Gens ausgewählt. Der PRB1-Genunterbrechungsvektor (pUC18-prb1::HIS3, Stamm # 1245) wurde mit SacI plus XbaI verdaut, um eine lineare prb1::HIS3-Unterbrechungskassette zu schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-230-1 nach dem Lithiumacetat-Verfahren eingesetzt. His⁺-Transformanten wurden auf Agarmedium ohne Histidin selektioniert und auf demselben Medium für klonale Isolate erneut ausgestrichen. Genomische DNA wurde aus einer Reihe der resultierenden His⁺-Isolate präpariert, mit EcoRI verdaut und dann auf 0,8%igen Agarosegelen elektrophoresiert. Southernblot-Analysen erfolgten dann mit Hilfe einer radioaktiv markierten 617-bp-Sonde für das PR81-Gen, welche mittels PCR unter Verwendung der folgenden Oligodesoxynukleotid-Primer hergestellt worden war:
Es wurden 11 Isolate erhalten, welche die erwartete Hybridisierung der Sonde mit einem prb1::HIS3-DNA-Fragment von 2,44 kbp zeigten. Dies stand im Gegensatz zur Hybridisierung der Sonde mit dem 1,59-kbp-Fragment für das Wildtyp-PR81-Gen. Eines dieser Isolate, enthaltend die gewünschte prbI::HIS3-Unterbrechung, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt und als Stamm # 1558 bezeichnet.
BEISPIEL 13
Expression von HPV18-L1 und -L2 in Hefe
Die Plasmide p191-6 (pGAL1-10 + HPV18-L1) und p195-11 (pGAL1-10 + HPV18-L1 + -L2) wurden zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes # 1558 (MATa, leu2-04, prbI::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°) eingesetzt. Klonale Isolate wurden bei 30° C in YEHD-Medium, enthaltend 2 % Galactose, für 88 Stunden gezüchtet. Nach dem Ernten der Zellen wurden die Zellpellets mit Glasperlen aufgebrochen und die Zellysate hinsichtlich Expression von HPV18-L1- und/oder HPV18-L2-Protein durch Immunoblot-Analyse analysiert. Proben, die 25 μg zelluläres Gesamtprotein enthielten, wurden auf 10%igen Tris-Glycin-Gelen (Novex, Inc.) unter denaturierenden Bedingungen elektrophoresiert und auf Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. Das L1-Protein wurde mit Hilfe von Kaninchen-Antiserum, das gegen ein trpE-HPV11-L1-Fusionsprotein induziert worden war, als primärem Antikörper (Brown et al., 1994, Virology 201:46-54) und an Meerrettich-Peroxidase (HRP) gekoppeltem Antikaninchen-Esel-IgG (Amersham, Inc.) als sekundärem Antikörper immunologisch nachgewiesen. Die Filter wurden mit dem chemolumineszierenden ECL^TM-Detection Kit (Amersham, Inc.) auf-gearbeitet. Eine L1-Protein-Bande von 50-55 kD wurde sowohl in den L1- als auch den L1+L2-Coexpressor-Hefeklonen (Stämme 1725 bzw. 1727) und nicht in der negativen Kontrolle (pGAL1-10 ohne L1- oder L2-Gene) nachgewiesen (4).
Das HPV18-L2-Protein wurde mittels Western-Analyse unter Verwendung von polyklonalem Ziegen-Antiserum, induziert gegen ein trpE-HPV18-L2-Fusionsprotein, als primärem Antikörper, gefolgt von HRP-konjugiertem Antiziegen-Kaninchen-IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Die Filter wurden wie oben beschrieben aufgearbeitet. Das L2-Protein wurde als eine 75-kD-Proteinbande in dem L1+L2-Coexpressor-Hefeklon (Stamm 1727), jedoch weder in der negativen Kontrolle noch in dem L1-Expressorklon nachgewiesen(5).
BEISPIEL 14
Fermentation von HPV18-L1 (Stamm 1725) und 18-L1+ΔL2 (Stamm 1727)
Das Oberflächenwachstum einer Plattenkultur der Stämme 1725 und 1727 wurde steril auf ein leucin-freies flüssiges Medium überführt, das (pro l) enthielt: 8,5 g Difco-Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,2 g Adenin, 0,2 g Uracil, 10 g Bernsteinsäure, 5 g Ammoniumsulfat, 40 g Glucose, 0,25 g L-Tyrosin, 0,1 L-Arginin, 0,3 g L-Isoleucin, 0,05 g L-Methionin, 0,2 g L-Tryptophan, 0,05 g L-Histidin, 0,2 g L-Lysin, 0,3 g L-Phenylalanin; dieses Medium wurde vor der Sterilisation mit NaOH auf pH 5,0-5,3 eingestellt. Nach Wachstum bei 28° C, 250 UpM, auf einem Rotationsschüttler wurden eingefrorene Kulturgefäße vorbereitet durch Zugabe von sterilem Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 17 % (Gew./Vol.) vor der Lagerung bei –70°C (1 ml pro Kryogefäß). Impfgüter wurden im gleichen Medium (500 ml pro 2-l-Kolben) entwickelt und gestartet durch Überführung des aufgetauten Inhalts eines eingefrorenen Kulturgefäßes und Inkubation bei 28° C, 250 UpM, auf einem Rotationsschüttler für 29 h. Bei den Fermentationen eines jeden Stammes wurde ein New Brunswick SF-116-Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 10 l nach der Animpfung verwendet. Das Produktionsmedium enthielt (pro l): 20 g Difco-Hefeextrakt, 10 g Sheffield-HySoy-Pepton, 20 g Glucose, 20 g Galactose, 0,3 ml Union Carbide UCON LB-625-Antischaummittel; das Medium wurde vor der Sterilisation auf pH 5,3 eingestellt. Der gesamte Inhalt (500 ml) des 2-l-Impfkolbens wurde in den Fermenter überführt, welcher bei 28° C, 5 l Luft pro Minute, 400 UpM, 3,5 psi Druck inkubiert wurde. Die mechanische Bewegung wurde erforderlichenfalls erhöht, um Niveaus an gelöstem Sauerstoff von mehr als 40 % Sättigung aufrechtzuerhalten. Der Fortschritt der Fermentation wurde durch Offline-Glucose-Messungen (Beckman Glucose 2-Analysator) und Online-Massenspektroskopie (Perkin-Elmer 1200) überwacht. Nach 66 h Inkubation wurden Zelldichten von 9,5 bis 9,7 g Trockenzellgewicht pro l erreicht. Die Kulturen wurden durch Hohlfaserfiltration (Amicon H5MP01-43-Kartusche in einem Amicon DC-10 Filtrationssystem) auf etwa 2 l konzentriert, mit 2 l phosphatgepufferter Salzlösung diafiltriert und vor dem Abfüllen in 500-ml-Zentrifugenflaschen weiter konzentriert (auf etwa 1 l). Zellpellets wurden durch Zentrifugation bei 8.000 UpM (Sorval GS-3-Rotor) für 20 Minuten bei 4° C gewonnen. Nach Dekantierung des Überstands wurden die Pellets (insgesamt 191 bis 208 g nasse Zellen) bis zur Verwendung bei –70° C gelagert.
BEISPIEL 15
Reinigung von rekombinanten HPV Typ 18-L1-Kapsidproteinen
Alle Schritte wurden bei 4° C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben.
Die Zellen wurden bei –70° C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 126 g) wurden bei 20-23° C aufgetaut und in 70 ml "Aufbruchpuffer" (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 100 mM NaCl) resuspendiert. Die Proteaseinhibitoren PMSF und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 16.000 psi durch 4 Passagen in einem M110-Y-Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellaufschlämmung wurde mit 12.000 × g 40 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, L1-Antigen enthaltend, wurde gewonnen.
Die Überstandsflüssigkeit wurde 1:5 durch Zugabe von Puffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) verdünnt und auf eine Anionenaustausch-Einfangsäule (9,0 cm ID × 3,9 cm) von Fractogel^® EMD-TMAE-650 (M)-Harz (EM Separations, Gibbstown, NJ), äquilibriert in Puffer A, aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit Puffer A wurde das Antigen mit einem Gradienten von 0-1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Die Säulenfraktionen wurden einem Assay hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Verfahren unterworfen. Die Fraktionen wurden dann bei gleichen Gesamtproteinbeladungen durch Westernblots und SDS-PAGE mit Silberfärbungsnachweis analysiert.
TMAE-Fraktionen, die vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden gepoolt. Das Antigen wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung konzentriert. Die Lösung wurde auf 35 % gesättigtes Ammoniumsulfat eingestellt, indem festes Reagenz unter sanftem Rühren im Verlauf von 10 Minuten zugegeben wurde. Die Probe wurde auf Eis gestellt und die Präzipitation 4 Stunden lang fortschreiten gelassen. Die Probe wurde mit 16.000 × g 45 Minuten lang zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20,0 mL PBS (6,25 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) resuspendiert.
Das resuspendierte Pellet wurde auf einer Größenausschlußsäule (2,6 cm ID × 89 cm) von Sephacryl 500 HR-Harz (Pharmacia, Piscataway, NJ) chromatographiert. Der Laufpuffer war PBS. Die Fraktionen wurden durch Westernblots und SDS-PAGE mit Silberfärbungsnachweis analysiert. Die reinsten Fraktionen wurden gepoolt. Der resultierende Pool wurde in einer 50-ml-Rührzelle unter Verwendung von 43-mm-YM-100-Flachfolienmembranen (Amicon, Beverly, MA) bei einem N₂-Druck von 4-6 psi konzentriert.
Das Endprodukt wurde durch Westernblots und SDS-PAGE unter Einsatz von kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Das L1-Protein wurde als zu 50-60 % homogen abgeschätzt. Die Identität des L1-Proteins wurde durch Westernblots bestätigt. Das Endprodukt wurde in Aliquots aufgeteilt und bei –70° C gelagert. Diese Prozedur führte zu insgesamt 12,5 mg Protein.
Bradford-Assay hinsichtlich Gesamtprotein
Gesamtprotein wurde mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Coomassie Plus^®-Kits (Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen. Die Proben wurden auf geeignete Niveaus in Milli-Q-H₂O verdünnt. Die erforderlichen Volumina waren 0,1 ml und 1,0 ml für die Standard- bzw. Mikroassay-Protokolle. Für beide Protokolle wurde BSA (Pierce, Rockford, IL) eingesetzt, um die Standardkurve zu erstellen. Der Assay wurde nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Standardkurven wurden mit Hilfe von CricketGraph^®-Software auf einem Macintosh IIci-Computer graphisch dargestellt.
SDS-PAGE und Westernblot-Assays
Alle Gele, Puffer und elektrophoretischen Apparaturen wurden von Novex (San Diego, CA) erhalten und nach den Empfehlungen des Herstellers betrieben. In Kürze, die Proben wurde auf gleiche Proteinkonzentrationen in Milli-Q-H₂O verdünnt und 1:1 mit Probeninkubationspuffer gemischt, der 200 mM DTT enthielt. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 100° C inkubiert und auf vorgegossene 12%ige Tris-Glycin-Gele aufgetragen. Die Proben wurden bei 125 V für 1 h 45 Min. elektrophoresiert. Die Gele wurden unter Anwendung von entweder Silberfärbung mit einer Variation des Verfahrens von Heukeshoven und Dernick [Electrophoresis, 6 (1985) 103-112] oder kolloidaler Coomassiefärbung unter Verwendung eines im Handel erhaltenen Kits (Integrated Separation Systems, Natick, MA) entwickelt.
Für Westernblots wurden die Proteine bei 25 V für 40 Minuten auf PVDF-Membranen überführt. Die Membranen wurden mit Milli-Q-H₂O gewaschen und luftgetrocknet. Der primäre Antikörper war polyklonales Kaninchen-Antiserum, das gegen ein TrpE-HPV11-L1-Fusions protein induziert worden war (Gabe von Dr. D. Brown). Frühere Experimente hatten gezeigt, daß dieses Antiserum mit HPV Typ 18-L1 auf Westernblots kreuzreagiert. Die Antikörperlösung wurde durch Verdünnung von Antiserum in Blotting-Puffer (5 % fettfreie Milch in 6,25 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃) hergestellt. Die Inkubation erfolgte für mindestens 1 Stunde bei 20-23° C. Der Blot wurde für jeweils 1 Minute in drei Austauschen von PBS (6,25 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) gewaschen. Die Lösung eines sekundären Antikörpers wurde durch Verdünnen von Antikaninchen-Ziegen-IgG-Antiserum als Konjugat verknüpft mit alkalischer Phosphatase (Pierce, Rockford, IL) in Blotting-Puffer hergestellt. Die Inkubation erfolgte unter denselben Bedingungen für mindestens eine Stunde. Die Blots wurden wie zuvor gewaschen und ein Nachweis mit Hilfe eines einstufigen NBT/BCIP-Substrats durchgeführt (Pierce, Rockford, IL).
BEISPIEL 16
Elektronenmikroskopische Studien
Für die EM-Analyse (Structure Probe, West Chester, PA) wurde ein Aliquot einer jeden Probe auf ein kohlenstoffbeschichtetes 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Ein Tropfen von 2%iger Phosphorwolframsäure (PTA), pH 7,0, wurde 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Die Gitter wurden vor der Transmissions-Elektronenmikroskopie-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie wurde mit Hilfe eines JEOL-1000X-Transmissions-Elektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen haben eine 100.000fache Endvergrößerung. Virusähnliche Partikel wurden im Größenbereich von 50-55 nm Durchmesser in der Hefeprobe beobachtet, welche das HPV18-L1-Expressionsplasmid beherbergte (6). Keine VLPs wurden in den Hefe-Kontrollproben beobachtet.
BEISPIEL 17
Subklonierung der HPV18-cDNA in Expressionsvektoren
Die für HPV18 kodierende cDNA wird in mehrere Vektoren für die Expression des HPV18-Proteins in transfizierten Wirtszellen und für die in vifro-Transkription/Translation subkloniert. Diese Vektoren umfassen pBluescript II SK+ (wobei die Expression durch T7- oder T3-Promotoren gesteuert wird), pcDNA I/Amp (wobei die Expression durch den Cytomegalovirus (CMV)-Promotor gesteuert wird), pSZ9016-1 (wobei die Expression durch den Promotor des langen terminalen Repeats (LTR) von HIV gesteuert wird) und den Baculovirus-Transfervektor pAcUW51 (PharMingen, Inc.) (wobei die Expression durch den Polyhedrin (PH)-Promotor gesteuert wird) zur Herstellung von rekombinantem Baculovirus, welcher die für HPV18 kodierende DNA-Sequenz enthält.

a) pBluescript II SK+:HPV18: Der Vollängen-HPV18-cDNA-Klon wird aus Lambda-Bakteriophagen durch limitierte Eco RI-Verdauung freigesetzt und in Eco RI-gespaltenes, CIP-behandeltes pBluescript II SK+ ligiert. Es werden separate Subklone gewonnen, worin die Sense-Orientierung von HPV18 entweder den T7- oder den T3-Promotoren folgt.
b) pcDNA I/Amp:HPV18: Zur Erleichterung einer direktionalen Klonierung wird HPV18 aus einer gereinigten Plasmidpräparation von pBluescript II SK+:HPV18, worin sich die HPV18-DNA-Sequenz stromabwärts des T7-Promotors befindet, mit Hilfe von Eco RV und Xba I ausgeschnitten. Das resultierende Eco RV, Hba I-HPV18-Fragment wird gereinigt und in Eco RV-gespaltenes, Xba I-gespaltenes, CIP-behandeltes pcDNA I/Amp ligiert, so daß sich die für HPV18 kodierende DNA stromabwärts des CMV-Promotors befindet.
c) pSZ9016-1:HPV18: HPV18 wird aus pBluescript II SK+:HPV18 ausgeschnitten durch limitierte Eco RI-Verdauung und anschließende Reinigung des 1,3-kb-Fragments aus Agarosegelen. Das resultierende Eco RI-HPV18-Fragment wird in Eco RI-gespaltenes, CIP-behandeltes pSZ9016-1 ligiert. Es werden Subklone selektioniert, worin die Sense-Orientierung von HPV18 stromabwärts des HIV-LTR-Promotors ist.
d) pAcUW51:HPV18-L1: Der Vollängen-HPV18-L1-ORF wurde mittels PCR aus dem Klon # 187-1 mit Hilfe von Oligonukleotid-Primern, welche flankierende BgIII-Stellen bereitstellten, amplifiziert. Das L1-Gen wurde in die BamHI-Stelle des Baculovirus-Transfervektors pAcUW51 (PharMingen, Inc.) unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors inseriert. Rekombinante Baculoviren, welche die HPV18-L1-Expressionskassette enthielten, wurden nach den im Pharmingen Manual beschriebenen Prozeduren erzeugt. Rekombinante Klone wurden durch Grenzverdünnung und Dot-Blot-Hybridisierung gereinigt.

BEISPIEL 18
Expression des HPV18-Polypeptids durch in vitro-Transkription/Translation und durch Transfektion in Wirtszellen
Vektoren, die HPV-DNA-Sequenzen enthalten, werden zur Steuerung der Translation des HPV18-Polypeptids in Kaninchen-Retikulozytenlysaten, Säuger-Wirtszellen und in baculovirus-infizierten Insektenzellen eingesetzt. Die experimentellen Prozeduren sind im wesentlichen die in den Anweisungen des Herstellers angegebenen.

a) in vitro Transkription/Translation: pBluescript III SK+:HPV18-Plasmid-DNA (mit HPV18 in der T7-Orientierung) wird durch Bam HI-Verdauung stromabwärts des HPV18-Inserts linearisiert. Das linearisierte Plasmid wird gereinigt und als Matrize für eine Run-off-Transkription unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase in Gegenwart von m7G(5')ppp(5')G eingesetzt. Die resultierenden, mit einem Cap versehenen HPV18-Transkripte werden durch LiCl-Fällung gereinigt und zur Steuerung der Translation von HPV18 in nuklease-vorbehandeltem Kaninchen-Retikulozytenlysat in Gegenwart von L-[³⁵S]Methionin verwendet.
b) Expression in Säugerzellen: Das HPV18-Protein wird in Säugerwirtszellen nach der Transfektion mit entweder pcDNA I/Amp:HPV18 (unter der Kontrolle des CMV-Promotors) oder pSZ9016-1:HPV18 (unter der Kontrolle des HIV-LTR-Promotors) exprimiert. Im letzteren Fall (pSZ9016-1:HPV18) werden die Zellen mit dem TAT-exprimierenden Plasmid pSZ90161:TAT cotransfiziert. Für beide HPV18-Expressionsplasmide werden COS-7-Zellen mittels entweder DEAE-Dextran oder Lipofektion mit Lipofectamin (BRL) transfiziert.
c) Expression in Insektenzellen: Der HPV18-L1-enthaltende Baculovirus-Transfervektor pAcUW51:HPV18-L1 wird zur Produktion von rekombinantem Baculovirus (Autographa californica) durch homologe Rekombination in vivo eingesetzt. Epitop-markiertes HPV18-L1 wird dann in Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Insektenzellen, die in Suspensionskultur gezüchtet wurden, nach Infektion mit dem HPV18-enthaltenden rekombinanten Baculovirus exprimiert.

BEISPIEL 19
Verbindungen, welche die HPV18-Aktivität beeinflussen, können mit einer Vielfalt von Verfahren nachgewiesen werden. Ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche HPV18 beeinflussen, umfaßt:

(a) Mischen einer Testverbindung mit einer Lösung, die HPV18 enthält, um eine Mischung zu bilden;
(b) Messen von HPV18-Aktivität in der Mischung; und
(c) Vergleichen des HPV18 in der Mischung mit einem Standard.

Verbindungen, welche die HPV18-Aktivität beeinflussen, können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können sich zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen eignen, welche durch eine HPV18-Infektion gekennzeichnet sind.
BEISPIEL 20
DNA, welche strukturell mit für HPV18 kodierender DNA verwandt ist, wird mit einer Sonde nachgewiesen. Eine geeignete Sonde kann von DNA, welche die Gesamtheit oder einen Teil der Nukleotidsequenz von 1 oder 3 aufweist, RNA, kodiert von DNA, welche die Gesamtheit oder einen Teil der Nukleotidsequenz von 1 oder 3 aufweist, oder degenerierten Oligonukleotiden, abgeleitet von einem Teil der Sequenz von 1 oder 3, erhalten werden.

Claims

Virusähnliche Partikel, umfassend rekombinantes L1-Protein oder rekombinante L1- + L2-Proteine von Human-Papillomavirus 18, wobei die virusähnlichen Partikel zu mindestens 60 % rein sind, das L1-Protein in 1 gezeigt ist und das L2-Protein in 3 gezeigt ist.
Virusähnliche Partikel nach Anspruch 1, wobei das rekombinante L1-Protein oder die rekombinanten L1- + L2-Proteine in Hefe produziert wird/werden.
Verfahren zur Herstellung der virusähnlichen Partikel nach Anspruch 1, umfassend: (a) Transformation von Hefe mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das für Papillomavirus-L1-Protein oder Papillomavirus-L1- + L2-Proteine kodiert; (b) Kultivierung der transformierten Hefe unter Bedingungen, welche die Expression des rekombinanten DNA-Moleküls erlauben, um das rekombinante Papillomavirus-Protein herzustellen; und (c) Isolierung des rekombinanten Papillomavirus-Proteins, um virusähnliche Partikel nach Anspruch 1 herzustellen.
Rekombinantes Papillomavirus-Protein, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 3.
Vakzin, umfassend die virusähnlichen Partikel nach Anspruch 1.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend die virusähnlichen Partikel nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten.
Isoliertes und gereinigtes HPV18-L1-DNA-Molekül, gezeigt in 1, oder HPV18-L2-DNA-Molekül, gezeigt in 3.
Expressionsvektor zur Expression des DNA-Moleküls nach Anspruch 7 in einem Wirt.
Im wesentlichen gereinigtes Protein, kodiert von dem DNA-Molekül nach Anspruch 7.
Verfahren zur Expression eines Human-Papillomavirus-Typ 18-Proteins in einem Wirt, umfassend: (a) Überführung des Expressionsvektors nach Anspruch 9 in einen geeigneten Wirt; und (b) Kultivierung des Wirts von Schritt (a) unter Bedingungen, welche die Expression des Human-Papillomavirus-Typ 18-Proteins von dem Expressionsvektor erlauben.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung, die aus dem DNA-Molekül nach Anspruch 7, Peptiden, die von dem DNA-Molekül nach Anspruch 7 kodiert werden, RNA, die zu dem DNA-Molekül nach Anspruch 7 komplementär ist, oder Kombinationen davon ausgewählt ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.