PT1618888E - Produção de proteína da cápside de vírus de papiloma humano e partículas semelhantes a vírus - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 618 888/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Produção de proteína da cápside de vírus de papiloma humano e partículas semelhantes a vírus"
CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se genericamente ao vírus de papiloma (PV). A descrição descreve um método de expressão da sequência de codificação da proteína da cápside do vírus de papiloma humano de tipo 6 (HPV-6) e de tipo 11 (HPV-11) utilizando o sistema de expressão de baculovírus, à produção de partículas semelhantes a vírus (VLP) de HPV e à utilização destas VLP na produção de anticorpos que reconhecem epítopos em HPV, e para desenvolvimento de uma vacina de HPV e para desenvolvimento de testes serológicos para a detecção de infecção por HPV, mas estes não fazem parte do invento como tal.
ANTECEDENTES DO INVENTO A família Papovaviridae constitui um grupo de vírus de ADN que induzem infecções líticas e tumores benignos ou malignos. Estruturalmente, são todos viriões icosaédricos com 72 capsómeros e contêm ADN circular de cadeia dupla. Os vírus incluídos na família são: (1) vírus de papiloma humanos e de animais, (2) vírus de polioma de ratinho, (3) vírus de vacuolação símio e (4) os vírus humanos BK e JC.
Os vírus de papiloma humanos (HPV) infectam epitélios cutâneos, genitais, orais e respiratórios de um modo específico dos tecidos. A infecção com HPV foi infimamente associada ao desenvolvimento de lesões benignas e malignidades (Reichman et al., "Papillomaviruses", 1990, págs. 1191-1200; e Mandell et al., "Principies and Practice of Infectious Diseases", 3a Edição, Churchill Livingstone, New York, N.Y.). Por exemplo, o HPV de tipo 1 (HPV-1) está presente em verrugas plantares, os HPV de tipos 6 ou 11 (HPV-6 ou HPV-11) em condilomas acuminados (verrugas anogenitais), enquanto que os HPV de tipos 16 ou 18 (HPV-16 ou HPV-18) são vulgares em lesões pré-malignas ou malignas do epitélio escamoso cervical (Ver Crum et al., "Human papillomavirus infection and cervical 2 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ neoplasia: New perspectives", 1984, Int. J. Gynecol. Pathol., vol. 3, págs. 376-388; zur Hausen, "Genital Papillomavirus Infections", 1985, págs. 83-90; Rigby et al., "Viruses and Câncer", Cambridge University Press, Cambridge, UK; e Koutsky et al., "Epidemiology of genital human papillomavirus infection", 1988, Epidemiol. Rev., vol. 10, págs. 122-163).
No entanto, as dificuldades em propagar HPV in vitro conduziram ao desenvolvimento de abordagens alternativas à produção de antigénios para estudos imunológicos. Por exemplo, Bonnez et al., "The PstI-Xhol restriction fragment of the HPV-6b Ll ORF lacks imunological specificity as determined by sera from HPV 6 condyloma acuminatum patients and Controls", 1990, UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., Nova Série, vol. 124, págs. 77-80; Jenison et al., "Identification of immunoreactive antigens of human papillomavirus type 6b by using Escherichia coli-expressed fusion proteins", 1988, J. Virol., vol. 62, págs. 2115-2123; Li et al., "Identification of the human papillomavirus type 6b Ll open reading frame protein in condylomas and corresponding antibodies in human sera", 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 2684-2690; Steele et al., "Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papilomavirus type 1", 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398; e Strike et al., "Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete Ll and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the 'common antigen'", 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555, expressaram sequências de codificação recombinantes da proteína da cápside em sistemas procarióticos e utilizaram-nas em análises "Western blot" de soros obtidos de indivíduos com infecção por HPV do tracto genital. Os resultados destes estudos sugeriram que podem ser detectados anticorpos para epítopos desnaturados, i.e. lineares, de proteínas da cápside de HPV nos soros de alguns indivíduos infectados.
Foram também utilizadas partículas virais inteiras para detectar anticorpos em soros humanos, incluindo anticorpos dirigidos contra epítopos conformacionais. Estes estudos foram difíceis de conduzir porque a maioria das lesões induzidas por HPV de ocorrência natural produzem poucas partículas. No entanto, partículas virais inteiras podem ser obtidas em 3 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ quantidades suficientes para conduzir ensaios imunológicos a partir de verrugas plantares induzidas por HPV de tipo 1 (Kienzler et al., "Humoral and cell-mediated immunity to human papillomavirus type 1 (HPV-1) in human warts", 1983, Br. J. Dermatol., vol. 108, págs. 65-672; "Pfister et al., Seroepidemiological studies of human papilloma virus (HPV-1) infections", 1978, Int. J. Câncer, vol. 21, págs. 161-165; e Steele et al., "Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1", 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398) e xenoenxertos de HPV-11 em ratinhos atimicos induzidos experimentalmente (Kreider et al., "Laboratory production in vivo of infectious human papillomavirus type 11", 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 590-593; e Kreider et al., "Morphological transformation in vivo of human uterine cervix with papillomavirus from condylomata acuminata", 1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641). Mais particularmente, a Patente U.S. N° 5071757 para Kreider et al., divulga um método de propagação de viriões de HPV-11 infecciosos em laboratório utilizando um sistema modelo de xenoenxerto em ratinho atimico. Embora este sistema seja capaz de produzir quantidades de virus infeccioso que podiam ser utilizadas para o desenvolvimento de um teste serológico para infecção genital por HPV, este sistema é muito dispendioso e incómodo. Para além disso, apenas um tipo de HPV genital foi até agora propagado neste sistema, limitando assim a sua utilidade. Adicionalmente, o virus infeccioso produzido utilizando este sistema representa um risco de segurança biológica e, por isso, seria difícil de utilizar numa formulação de vacina.
Zhou et al., em "Expression of vaccinia recombinant HPV 16 Ll e L2 ORF proteins in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles", 1992, Virology, vol. 185, págs. 251-257, relataram a formação de partículas semelhantes a vírus HPV-16 em núcleos de células CV-1 após infecção com um vector de expressão recombinante duplo de vírus vacínia L1/L2 de HPV. No entanto, os autores não foram capazes de produzir VLP com um vector expressando apenas Ll. Para além disso, as VLP produzidas não tinham uma simetria bem definida e eram mais variáveis em tamanho e menores, apenas cerca de 35-40 nm de diâmetro, que os viriões de HPV (55 nm) 4 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ ou as VLP do presente invento (VLP de HPV-11 produzidas por baculovírus, cerca de 50 nm de diâmetro). A Patente U.S. N° 5045447, para Minson, divulga um método de pesquisa de sobrenadantes de cultura de hibridoma quanto a anticorpos monoclonais com especificidades desejadas. O método de Minson é exemplificado pela produção de anticorpos para a proteína Ll do vírus de papiloma humano de tipo 16 (HPV-16) utilizando esta proteína como antigénio alvo em ratinhos. No entanto, Minson não divulga a expressão da proteína Ll nem a produção de partículas semelhantes a vírus HPV (VLP). A Patente U.S. N° 4777239, para Schoolnik et al., divulga sequências peptídicas curtas derivadas de vários enquadramentos de leitura abertos da região inicial do vírus de papiloma que provocam anticorpos específicos do tipo para vírus de papiloma. No entanto, os inventores não divulgam nenhuma sequência dirigida ao principal enquadramento de leitura aberto tardio, Ll. A Patente U.S. N° 5057411, para Lancaster et al., divulga uma sequência polinucleotídica de cerca de 30 nucleótidos do enquadramento de leitura aberto da proteína da cápside Ll do vírus de papiloma que os inventores afirmam codificar um epítopo específico do tipo de vírus de papiloma. No entanto, os inventores não divulgam animais infectados que produzam anticorpos que reconheçam esta sequência. Em vez disso, sintetizaram uma versão de vírus de papiloma bovino de tipo 1 (BPV-1) da sequência (um péptido de 10 aminoácidos ou decapéptido), depois imunizaram coelhos e testaram a capacidade do anti- soro para reagir com tecido de fibropapiloma induzido por BPV-1 ou BPV-2. O anti-soro do péptido apenas reagiu com tecido de BPV-1 e não com o de BPV-2. Os inventores concluíram então que o péptido continha um determinante antigénico que era específico do tipo e por isso todas as sequências de codificação de Ll de vírus de papiloma continham um epítopo específico do tipo neste locus. Isto é especulação teórica por parte dos inventores, que não dão dados que apoiem esta hipótese. Adicionalmente, pensa-se geralmente que as sequências de aminoácidos divulgadas (10 aminoácidos) não são capazes de adoptar estruturas antigénicas de ordem superior, i.e., epítopos conformacionais que possuam 5 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ uma estrutura tridimensional tal como os produzidos através do método aqui descrito.
Outro problema associado a infecções por vírus de papiloma é a necessidade de modalidades terapêuticas e profiláticas alternativas. Uma dessas modalidades que recebeu pouco estudo recente seria vacinas de vírus de papiloma. Em 1944, Biberstein tratou doentes de condiloma acuminado com uma vacina autógena derivada das verrugas do doente (Biberstein, "Immunization therapy of warts", Arch. Dermatol. Syphilol., 1944, vol. 50, págs. 12-22). A partir daí, Powell et al. desenvolveram a técnica tipicamente utilizada actualmente para preparação de vacinas de verrugas autógenas para o tratamento de condiloma acuminado (Powell et al., "Treatment of condylomata acuminata by autogenous vaccine", 1970, South Med. J., vol. 63, págs. 202-205). Apenas um estudo duplamente cego, controlado com placebo tentou avaliar a eficácia da vacina autógena (Malison et al., "Autogenous vaccine therapy for condyloma acuminatum: A double-blind controlled study", 1982, Br. J. Vener. Dis., vol. 58, págs. 62-65). Os autores concluíram que a vacinação autógena não era eficaz no tratamento de condiloma acuminado, embora esta interpretação possa ser errónea. O pequeno número de doentes estudado impediu tirar conclusões negativas válidas. Em qualquer caso, as vacinas autógenas, tal como actualmente descritas, têm várias desvantagens. Primeiro, o doente necessita ter verrugas relativamente grandes (2 g a 5 g) para preparar a vacina. Segundo, o médico precisa de ter acesso a equipamento de laboratório e perícia cada vez que é tratado um novo doente. Assim, a preparação da vacina é muito dispendiosa, tediosa e, em casos que envolvem uma massa de lesão relativamente pequena, impossível. O pedido WO 93/02184 propõe-se descrever um método para proporcionar partículas semelhantes ao viris do papiloma. infelizmente, os métodos tradicionais de propagação de vírus não foram ainda adaptados ao estudo de vírus de papiloma e os métodos alternativos anteriormente descritos não produzem viriões infecciosos em quantidades significativas para estudos imunológicos. Também, a propagação in vivo de HPV-11 no sistema de ratinho atímico não é muito prática porque é 6 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ dispendiosa, laboriosa e actualmente limitada a HPV-11. Consequentemente, é necessário um método alternativo de produção de epitopos da cápside de HPV para utilizar em estudos imunológicos e produção de vacinas.
SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento é dirigido a um método de expressão da sequência de codificação da proteína da cápside do vírus de papiloma (PV) numa célula, compreendendo a transfecção da célula com um vector de expressão contendo a sequência de codificação da proteína da cápside do vírus de papiloma sob condições que facilitam a expressão da proteína na célula. 0 vírus de papiloma é qualquer entre HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-35.
Noutro aspecto do presente invento, é proporcionada uma ou mais partículas semelhantes a vírus (VLP), fragmento(s), capsómero(s) ou porção(ões) destes, formados a partir da proteína da cápside do vírus de papiloma. Foi descoberto que a(s) partícula(s) semelhante(s) a vírus compreende(m) uma ou mais características antigénicas semelhantes às das partículas infecciosas de vírus do papiloma nativas. A descrição descreve (mas não como parte do invento como tal) um método de expressão da sequência de codificação da proteína da cápside Ll do vírus de papiloma humano tipo-6 (HPV-6) e tipo-11 (HPV-11) em células de insecto Sf-9 utilizando o sistema de expressão de baculovírus. As sequências de codificação de HPV-6 e HPV-11 foram clonadas utilizando técnicas padrão na arte num vector de transferência de baculovírus. 0 vector de transferência de baculovírus resultante foi utilizado para co-transfectar células de insecto Sf-9 com o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) formando um baculovírus recombinante (Ac6Ll ou AcllLl) que foi recuperado. As células de insecto Sf-9 foram a partir daí infectadas com AcôLl ou AcllLl sob condições que facilitam a expressão da proteína nas células. Foi descoberto que a proteína Ll formava partículas semelhantes a vírus (VLP). Foram identificadas VLP através de microscopia electrónica de fracções de bandas de sacarose coradas negativamente obtidas a partir de células Sf-9 7 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ infectadas com ο baculovírus recombinante AcllLl. Foi ainda descoberto que as VLP possuíam características imunológicas e morfológicas semelhantes às dos viriões de HPV-11 nativos, tal como definido por anti-soros de coelho. A partícula ou partículas semelhantes a vírus produzidas de acordo com o presente invento, podem ser utilizadas em ensaios de diagnóstico, podem ter um papel na identificação e caracterização de um receptor celular de hpv e podem ser utilizadas para desenvolvimento de vacinas (terapêuticas e profiláticas). Entenda-se que o método tal como aqui descrito para produção de HPV-11 e HPV-6 pode ser utilizado para produzir reagentes imunológicos semelhantes de outros vírus de papiloma de animais e/ou humanos. Adicionalmente, as VLP produzidas de acordo com o presente invento proporcionarão reagentes abundantes com os quais se podem realizar estudos imunológicos de vírus de papiloma e para desenvolvimento de vacinas contra vírus de papiloma.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Na medida em que qualquer Figura se refira a um HPV que não HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-35, não faz parte do invento reivindicado como tal, o qual se refere a estes referidos tipos de HPV. A Fig. IA mostra um gel de SDS-poliacrilamida corado com azul de Coomassie de lisados de células Sf-9 infectadas com AcNPV de tipo selvagem e AcllLl recombinante. A Fig. 1B mostra um "Western blot" de lisados de células Sf-9 infectadas com AcNPV de tipo selvagem e AcllLl recombinante sondados com anti-soro policlonal de coelho específico para o epítopo comum de LI de HPV. A Fig. 2 mostra uma micrografia electrónica de partículas semelhantes a vírus de hpv-11 recuperadas através de centrifugação de densidade de sacarose de células Sf-9 infectadas com AcllLl. As VLP mostradas têm aproximadamente 52 nm de diâmetro (aumentadas através de padrões de ampliação) e possuem simetria icosaédrica, consistente com observações 8 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ publicadas em relação às características morfológicas de viriões de papiloma de ocorrência natural. A Fig. 3 mostra comparações de "Western blot" e "Immunodotblot" de anti-soros de coelho imunorreactivos com LI recombinante. No painel A, o lisado de células de insecto de Ll recombinante foi sujeito a "Western blot" sob condições desnaturantes. No painel B, Usados de células de insecto não recombinantes (+) ou de Ll recombinante (Ll) foram aplicadas a uma membrana de "blotting" sob condições não desnaturantes. As tiras A foram sondadas com um anti-soro policlonal de coelho específico para o epítopo comum de Ll de HPV; as tiras B foram sondadas com um anti-soro policlonal de coelho específico para a sequência de aminoácidos amino-terminal de Ll de HPV; as tiras C foram sondadas com um anti-soro policlonal de coelho para partículas virais inteiras. A Fig. 4 mostra um ensaio de "Western blot" utilizando lisados de células de insecto de Ll recombinante. As tiras A-x correspondem a diferentes anticorpos primários utilizados (as tiras A e B foram postas a reagir com anti-soro de coelho pré e pós-imune para partículas virais inteiras, respectivamente; a tira C foi posta a reagir com anti-soro de coelho pós-imune anti-epítopo comum de Ll desnaturado; as tiras D-0 foram postas a reagir com soros de doentes de condiloma acuminado; as tiras P-X foram postas a reagir com soros de controlo). A Fig. 5 mostra um ensaio de "immunodotblot" utilizando lisados de células de insecto. As letra acima das tiras correspondem a diferentes anticorpos primários utilizados, que foram os mesmos que descrito na Fig. 4. A Fig. 6 é uma micrografia electrónica de VLP de HPV de tipo 6, produzidas através da construção e expressão de um baculovírus recombinante de Ll de HPV-6 (Ac6Ll). A Fig. 7 é uma micrografia electrónica de VLP de HPV de tipo 16, produzidas através da construção e expressão de um baculovírus recombinante de Ll de HPV-16 (Acl6Ll). A Fig. 8 mostra a reactividade sérica de doentes de condiloma acuminado a VLP de Ll de HPV-11. 9 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ A Fig. 9 mostra a correlação entre as reactividades séricas a viriões de HPV-11 e VLP. A Fig. 10(a) mostra um "Western blot" (painel esquerdo) das proteínas LI de HPV-11 (Pista 2) e LI de HPV-16 (Pista 3). Os marcadores moleculares de referência estão à esquerda, a seta indica as posições aproximadas das proteínas LI recombinantes de hpv-11 e hpv-16. A Fig. 10(b) é um "Immunodotblot" (painel esquerdo) onde Pista 1: AcNPV (amostra infectada com baculovírus de tipo selvagem); Pista 2: AcllLl (amostra infectada com AcllLl recombinante); Pista 3: Acl6Ll (amostra infectada com Acl6Ll recombinante). A Fig. 11 mostra SDS-PAGE e detecção por "Western immunoblot" de Ll de HPV-11 recombinante no sobrenadante da cultura de células Sf-9 infectadas com AcllLl (Painel A: SDS-PAGE (corado com Coomassie); Painel B: "Western blot", utilizando o soro do antigénio comum de PVLl; Pista 1: Sedimento de alta velocidade do sobrenadante da cultura de células infectadas com AcNPV não recombinante; Pista 2: Sedimento de alta velocidade do sobrenadante da cultura de células Sf-9 infectadas com AcllLl; Os marcadores de peso molecular (Mr) estão à esquerda; A seta à direita indica a posição da Ll recombinante de Mr 55 kDa). A Fig. 12 mostra uma análise microscópica electrónica de preparações de VLP brutas e purificadas em CsCl (A - VLP sedimentadas a partir de sobrenadante de cultura isento de células Sf-9 infectadas com AcllLl; B - VLP purificadas em CsCl; barra = 50 nm). A Fig. 13 mostra análises de "immunodotblot" de VLP recombinantes purificadas e viriões inteiros de HPV-11 (Pista 1: soros pré-imunes; pista 2: soros pós-imunes; A - Coelho R-366, imunizado com viriões inteiros de HPV-11 purificados; B -Coelho R-399, imunizado com VLP de HPV-11 purificadas; Antigénios: VLP (partículas semelhantes a vírus de Ll de HPV-11); WVP (partículas inteiras de vírus HPV-11)). 10 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ A Fig. 14 mostra uma análise "dotplot" da média geométrica dos diâmetros (MGD) dos xenoenxertos. A Fig. 15 mostra um imunoensaio "Western blot" de preparações de VLP purificadas de HPV-11, HPV-16 e HPV-18 (Pista A, VLP de LI de HPV-11; pista B, VLP de LI de HPV-16; pista C, VLP de Ll de HPV-18). A Fig. 16(A-C) mostra uma micrografia electrónica de VLP purificadas em cloreto de césio derivadas de HPV dos tipos 11, 16 e 18. As VLP foram purificadas tal como descrito no fascículo e coradas negativamente com ácido fosfotúngstico a 2%. A) VLP de Ll de HPV-11; B) VLP de Ll de HPV-16; C) VLP de Ll de HPV-18; As barras correspondem a 100 nm. A Fig. 17 mostra as imunorreactividades dos anti-soros pós-imunes de coelho de VLP com preparações de VLP homólogas e heterólogas. Antigénios: VLP de Ll de HPV-11, barras brancas; VLP de Ll de hpv-16, barras às riscas; VLP de Ll de hpv-18, barras negras. Anti-soros: A) Anti-soro de coelho anti-antigénio comum de PVLl; B) Anti-soro de coelho de virião inteiro de HPV-11; C,D) de dois coelhos imunizados com VLP de Ll de HPV-11; E,F) de dois coelhos imunizados com VLP de Ll de HPV-16; G,H) de dois coelhos imunizados com VLP de Ll de HPV-18.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento é dirigido a um método de expressão da sequência de codificação da proteína da cápside do vírus de papiloma numa célula utilizando o sistema de expressão de baculovírus sob condições que facilitam a expressão da proteína na célula. Noutro aspecto do presente invento, foi descoberto que partícula(s) semelhante(s) a vírus (VLP), fragmento(s), capsómero(s) ou uma porção ou porções destes se formam a partir da proteína da cápside do vírus de papiloma. Foi ainda descoberto que a (s) partícula (s) semelhante(s) a vírus compreende(m) características antigénicas semelhantes às das partículas infecciosas nativas do vírus de papiloma. O vírus de papiloma é qualquer entre HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-35. 11 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ
Tal como aqui se utiliza, "partícula(s) semelhante(s) a virus (VLP)" refere-se a partícula(s) semelhantes a virus, fragmento(s), capsómero(s) ou uma porção ou porções destes produzidos a partir da sequência de codificação da proteina da cápside do virus de papiloma e compreendendo caracteristica(s) antigénica(s) semelhante(s) às das partículas infecciosas de vírus de papiloma. Tal como aqui se utiliza, "caracteristica(s) antigénica(s)" refere-se (1) à capacidade da(s) partícula(s) semelhante(s) a vírus para reagir de forma cruzada com partículas de tipo selvagem (partículas virais infecciosas nativas do mesmo tipo de HPV) tal como determinado através de anti-soros criados em animais e/ou humanos através de imunização com VLP ou vírus infeccioso; e/ou (2) à capacidade para reconhecer ou detectar anticorpos em soros humanos de pessoas que se saiba estarem infectadas com vírus homólogos.
Tal como aqui se utiliza, "sequência de codificação da proteína Ll" ou "sequência de codificação da proteína da cápside Ll" ou "sequência de codificação de Ll" refere-se ao enquadramento de leitura aberto que codifica para a proteína Ll no vírus de papiloma. Quando expressa, a sequência de codificação da proteína Ll produz uma proteína, ou complexo proteico, ou agregado, que possui características imunológicas e morfológicas semelhantes às dos viriões do vírus de papiloma nativo. A sequência de codificação de Ll utilizada no presente invento pode ser isolada e purificada a partir de ADN genómico de vírus de papiloma ou sintetizada utilizando técnicas de engenharia genética padrão.
Tal como aqui se utiliza, o termo "transfecção" refere-se a qualquer meio para introdução de um vírus, plasmídeo ou vector numa célula. Exemplos de tais meios incluem infecção, precipitação com fosfato de cálcio e electroporação. A descrição descreve (mas não como parte do invento como tal) um método de expressão da sequência de codificação para a proteína da cápside Ll do vírus de papiloma humano tipo-11 (HPV-11) ou do vírus de papiloma humano tipo-6 (HPV-6) em células de insecto Sf-9 utilizando o sistema de expressão de baculovírus. Entenda-se que as sequências de codificação da 12 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ proteína da cápside destes tipos de HPV são utilizadas apenas para fins de ilustração e que são utilizadas qualquer sequência de codificação da proteína da cápside Ll para os tipos de vírus de papiloma humano 18, 31, 33 e 35 (Gissman et al.r Câncer Cells, 1987, vol. 5, pág. 275. 0 sistema de expressão preferido utilizado no método do presente invento é o sistema de expressão de baculovírus, no entanto, entenda-se que pode ser aqui utilizado qualquer outro sistema ou sistemas de expressão desde que o sistema ou sistemas possam expressar a sequência de codificação da proteína Ll. Exemplos de tais sistemas incluem, sem limitação, quaisquer sistemas procarióticos e/ou eucarióticos incluindo adenovírus, SV40, E. coli, 9 Março,1993, células CHO, vírus vacínia, vírus de insectos, leveduras, vírus bacteriófagos ou vírus modificados, plasmídeos de ADN, vectores e semelhantes. A célula hospedeira para expressão da sequência de codificação de Ll é dependente do sistema de expressão utilizado. Exemplos de células hospedeiras adequadas incluem, sem limitação, bactérias (procarióticas), microrganismos tais como leveduras, células de mamífero (eucarióticas) e células de insecto. Quando se utiliza o sistema de expressão de baculovírus são preferidas células de insecto, tais como Sf-9 ou Sf-21.
Noutro aspecto do presente invento, foi descoberto que a proteína Ll produz partícula(s) semelhante(s) a vírus (VLP), fragmento(s), capsómero(s) ou porção ou porções destes, que se formam a partir da proteína da cápside do vírus de papiloma. Foi descoberto que a(s) partícula(s) semelhante(s) a vírus compreende(m) uma ou mais características antigénicas semelhantes às das partículas infecciosas nativas do vírus de papiloma. Mais particularmente, estas VLP contêm um determinante antigénico que é especificamente reconhecido por anticorpos presentes em soros obtidos de doentes infectados com HPV genital. Por exemplo, a reacção de extractos de células de insecto contendo VLP com anti-soros dirigidos contra epítopos da cápside desnaturados e não desnaturados, tal como deduzido através das imunorreactividades em ensaios de "Western blot" e "Immunodotblot", sugeriu que epítopos conformacionais presentes nos viriões infecciosos nativos de HPV-11 estavam também presentes nas VLP de HPV-11 produzidas por baculovírus. As VLP de HPV-11 não fazem, contudo, parte do 13 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ invento como tal. Ensaios de "immunodotblot" utilizando soros humanos obtidos de indivíduos com condilomas acuminados comprovados através de biopsia correlacionaram-se intimamente com resultados obtidos anteriormente em testes ELISA baseados em partículas virais inteiras de HPV-11 tal como descrito por Bonnez et al., "Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata", 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1343-1347.
Estas semelhanças morfológicas e imunológicas com viriões nativos de HPV-11 sugerem que as VLP recombinantes produzidas no sistema de baculovírus serão úteis em sero-epidemiologia e estudos de patogénese de não só infecção por HPV genital como também para qualquer vírus de papiloma e para o desenvolvimento de uma vacina. Ll tem uma capacidade intrínseca para auto-montagem. Assim, não são necessárias outras proteínas do vírus de papiloma para formação de VLP no sistema de baculovírus. Isto apoia a controvérsia de que podem ser produzidas VLP para todos os tipos de vírus de papiloma de acordo com o método aqui descrito.
As VLP do presente invento podem ser utilizadas para criar anticorpos, em sujeitos para os quais se deseja protecção contra infecção por HPV, i.e., vacinas, ou para elevar a resposta imunitária a uma infecção por HPV já presente. As VLP do presente invento podem ser injectadas em espécies animais para obter anti-soros úteis em diagnóstico. Adicionalmente aos anti-soros policlonais, podem ser obtidos anticorpos monoclonais utilizando os métodos de Kohler e Milstein, ou através de modificações destes, imortalizando células do baço ou outras células produtoras de anticorpos de animais injectados para obter clones produtores de anticorpos, i.e., hibridomas.
Os anticorpos obtidos podem ser utilizados para diagnóstico de infecção por HPV em biópsias cervicais ou esfregaços de Papanicolaou e na avaliação de níveis de doença em humanos ou outros sujeitos. Em particular, o diagnóstico utilizando os anticorpos do presente invento permite monitorizar a evolução da doença. Os anticorpos podem ser utilizados em análise de soro para detectar o vírus, bem como 14 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ para monitorizar ο progresso da terapia com agentes antivirais ou outros agentes terapêuticos dirigidos ao controlo da infecção ou do carcinoma. Os anticorpos podem também ser utilizados como terapia passiva, tendo em conta variações de espécie.
As VLP do presente invento podem ser utilizadas em imunoensaios para detectar a presença de anticorpos criados contra hpv no soro de doentes suspeitos de possuírem infecções por HPV ou para titular os soros de doentes a tratar com uma vacina anti-HPV.
As VLP do presente invento podem ser directamente administradas a um hospedeiro para induzir a formação de anticorpos neutralizantes (Bonnez et al.r 1992, aqui citado noutro local; e Rose et al., no prelo, aqui citado noutro local, para conferir imunidade protectora contra HPV ou, se o doente estiver já infectado, para reforçar a própria resposta imunitária do doente. Para todas as aplicações, as VLP são administradas na forma imunogénica. Opcionalmente, as VLP podem ser conjugadas com um material transportador que confira imunogenicidade, sendo o material de preferência antigenicamente neutro. Dependendo da utilização requerida, as VLP do presente invento têm a capacidade para servir como vacinas e diagnósticos específicos do tipo ou de amplo espectro.
As VLP a administrar como vacinas podem ser formuladas de acordo com métodos convencionais e/ou futuros para tal administração ao sujeito a proteger e podem ser misturadas com adjuvantes convencionais. 0 péptido expresso pode ser utilizado como imunogénio em formulações de vacina de subunidades, que podem ser multivalentes. A formulação de vacina multivalente pode compreender VLP codificando cada uma, uma proteína Ll diferente de diferentes HPV. 0 produto pode ser purificado para fins de formulação de vacina a partir de quaisquer sistemas vector/hospedeiro que expressem a proteína heteróloga. As VLP purificadas devem ser ajustadas a uma concentração apropriada, formuladas com qualquer adjuvante de vacina adequado e empacotadas para utilização. Adjuvantes adequados incluem, mas não se limitam a: géis minerais, p. ex., hidróxido de alumínio; substâncias activas à superfície 15 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ tais como lisolecitina, polióis plurónicos; polianiões; péptidos; emulsões em óleo; e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) e Cornebacterium parvum. 0 imunogénio pode também ser incorporado em lipossomas ou conjugado com polissacáridos e/ou outros polímeros para utilizar numa formulação de vacina. Muitos métodos podem ser utilizados para introduzir as formulações de vacina acima descritas; estes incluem, mas não se limitam a, vias oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea e intranasal. Se forem para utilizar directamente, como reagentes de diagnóstico, estas são purificadas utilizando métodos convencionais e empacotadas concordantemente para tal utilização. Se forem para ser utilizadas para produzir anticorpos para fins de diagnóstico, podem ser utilizados animais de teste convenientes para preparar os anti-soros apropriados. Hospedeiros adeguados incluem ratinhos, ratos, coelhos, cobaias ou mesmo mamíferos maiores tais como ovelhas. Os anticorpos podem ser utilizados terapeuticamente desde gue sejam compatíveis com o hospedeiro a tratar. Anticorpos monoclonais possuindo as características da espécie correctas são preferidos para esta aplicação.
Os seguintes Exemplos são proporcionados para melhor ilustrar o presente invento.
Na medida em que qualquer exemplo ou oarte de um exemplo se refiram a um HPV que não HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-35, não faz parte do invento reivindicado como tal.
EXEMPLO I Métodos 1. ADN Virai de HPV-11 e Construção do Vector de Transferência de Baculovírus pVLllLl. ADN genómico de HPV-11 foi obtido a partir de partículas virais que foram purificadas a partir de xenoenxertos de ratinhos atímicos induzidos experimentalmente tal como descrito por Rose et al., "Expression of the full-length Products of the HPV-6b and HPV-11 L2 open reading frames by 16 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ recombinant baculovirus, and antigenic comparisons with HPV-11 whole vírus particles", 1990, J. Gen. Virol., vol. 71, págs. 2725-2729. A sequência de codificação de LI foi clonada através de amplificação por PCR do ADN genómico purificado, utilizando iniciadores desenhados para introduzir locais das enzimas de restrição BglII e £coRI nas extremidades 5' e 3', respectivamente. As sequências dos iniciadores directo e reverso foram, respectivamente, 5'-CGC AGA TCT ATG TGG CGG CCT AGC-3' (SEQ ID NO:l) e 5'-CAT ATG AAT TCC CAC AAC ACA CTG ACA CAC-3' (SEQ ID NO:2). Os locais de restrição (sublinhados) foram introduzidos proximais ao putativo codão de início de LI (texto a cheio) e aproximadamente 30 nucleótidos a jusante do putativo codão de terminação de Ll, através de mutagénese dirigida pelo iniciador. A amplificação foi efectuada essencialmente tal como descrito por Bonnez et al., "Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction", 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, utilizando 500 ng de cada iniciador e 2 unidades de ADN-polimerase Taq (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, CT). Após a amplificação, o produto de PCR foi digerido com BglII e EcoRI. O produto de digestão de 1539 pares de bases (pb), que continha todo o enquadramento de leitura aberto (ORF) de Ll de HPV-11, foi purificado através de electroforese em gel de agarose tal como descrito por Rose et al., "Expression of the full-length products of the HPV-6b and HPV-11 L2 open reading frames by recombinant baculovirus, and antigenic comparisons with HPV-11 whole virus particles", 1990, J. Gen. Virol., vol. 71, págs. 2725-2729, e clonado nos locais correspondentes de um vector de transferência de baculovirus, pVL-1392 (M.D. Summers, Texas A&M University, College Station, TX) . A construção resultante, pVLllLl, foi utilizada para co-transfectar células Sf-9 com ADN genómico do vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) de acordo com os métodos de Summers et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", 1987, Texas A&M University, College Station, Texas. Os baculovirus recombinantes foram recuperados através de exame visual e selecção de placas fágicas de oclusão negativa (occ-) e foram sujeitos a mais dois ciclos de purificação por placas fágicas de acordo com os métodos de Summers et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors 17 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ and Insect Cell Culture Procedures", 1987, Texas A&M University, College Station, Texas. A expressão proteica a partir de reservas de vírus isolados foi determinada através de "Western blot". 2. Detecção por SDS-PAGE e "Western blot" de Expressão de Ll Recombinante em Células Sf-9,
Culturas de células Sf-9 infectadas foram criadas em balões de cultura de tecidos de 150 cm2 e preparadas para ensaio analítico de SDS-PAGE e "Western blot". Células infectadas com Ll não recombinante ou recombinante foram recolhidas dos balões através de ressuspensão com uma pipeta de Pasteur e um número igual de células infectadas com Ll de tipo selvagem ou recombinante foi centrifugado a 500 xg durante 10 minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram removidos e os sedimentos celulares foram transferidos para gelo, imediatamente ressuspensos em 1 ml de tampão de lise (Tris 30 mM, pH 7,6; MgCl2 10 mM; CaCl2 1 mM; fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM; leupeptina (10 μρ/πιΐ); NP-40 a 1%) e deixou-se estar à temperatura ambiente durante 15 minutos sujeitando periodicamente a vórtice. Após centrifugação a 500 xg durante 2 minutos a 4°C, a fracção solúvel em NP-40 contida no sobrenadante foi removida e diluída 1:1 com tampão de amostra de Laemmli 2x tal como descrito por Laemmli, "Cleavage of structural proteins during the assembly of de head of the bacteriophage T4", 1970,
Nature, vol. 277, págs. 680-685, e aquecida a 95°C durante 3 minutos. O sedimento insolúvel em NP-40 (contendo material nuclear) foi lavado uma vez com PBS frio (PMSF 1 mM: 10 μg/ml de leupeptina) e solubilizado fervendo e sujeitando a vórtice em tampão de Laemmli lx. As amostras foram sujeitas a electroforese em géis de SDS-poliacrilamida a 10%, seguido de coloração com azul de Coomassie (Fig. 1, painel A) ou transferência (Fig. 1, painel B) para uma membrana Immobilon-P (Millipore Corp., New Bedford, MA) tal como descrito por Rose et ai., "Expression of the full-length products of the HPV-6b and HPV-11 L2 open reading frames by recombinant baculovirus, and antigenic comparisons with HPV-11 whole virus particles", 1990, J. Gen. Virol., vol. 71, págs. 2725-2729. 18 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 3. Preparação de Soluções de Reserva de Ll Não Recombinante e Recombinante.
Estes ensaios foram efectuados utilizando diluições de soluções de reserva de sobrenadantes clarificados (a alta velocidade) preparadas a partir de extractos de células de insecto infectadas com AcNPV ou AcllLl. As culturas em suspensão (100 ml) de células Sf-9 infectadas com AcNPV ou AcllLl a uma multiplicidade de infecção aproximada de 10 unidades de formação de placas fágicas por célula foram incubadas a 27°C durante 72 horas. As culturas foram então centrifugadas a 1000 xg durante 10 minutos a 4°C e os sedimentos celulares foram ressuspensos em 20 ml de tampão de homogeneização (tampão de lise com NaCl 1 M) e homogeneizados com 50 golpes num homogeneizador Dounce em gelo. Os homogenatos foram transferidos para tubos Corex de 30 ml com tampa de rosca frios e centrifugados a 3000 xg durante 10 minutos a 4°C. As fracções de sobrenadantes de baixa velocidade foram então transferidas para um tubo limpo e centrifugadas a 100000 xg durante 30 minutos a 4°C. As concentrações de proteína total das fracções de sobrenadante de alta velocidade foram medidas através de absorção espectrofotométrica a 280 nm de acordo com o procedimento de Stoscheck, "Quantitation of proteins", 1990, em Methods in Enzymology, vol. 182, pág. 54, Academic Press, Inc., New York, e ajustadas para equivalência com tampão de homogeneização fresco (concentrações proteicas aproximadamente iguais a 30 mg/ml). Foi adicionado glicerol a 10% (v/v) e as soluções de reserva foram divididas em alíquotas e armazenadas a -20°C. 4. Ensaios de "Western blot" e "Immunodotblot".
Foram utilizados ensaios de "Western blot" e "immunodotblot" para determinar as especificidades do epítopo do anticorpo linear e conformacional em anti-soros de coelho e soros humanos. Os ensaios de "Western blot" (Fig. 3, painel A e Fig. 4) foram efectuados utilizando 2 μΐ (cerca de 60 μg da proteína total) de solução de reserva de Ll recombinante diluída 1:100 com tampão de amostra de Laemmli 1χ, que contém reagentes de desnaturação de proteínas tal como descrito por Laemmli, "Cleavage of structural proteins during the assembly of de head of the bacteriophage T4", 1990, Nature, vol. 277, 19 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ págs. 680-685, e aquecida a 95°C durante 3 minutos. A amostra desnaturada foi carregada num único poço de amostra de 100 mm de largura, sujeita a electroforese num gel de SDS-poliacrilamida a 10% e transferida para uma membrana Immobilon-P. Após bloqueio com uma solução de BSA a 2% (Kirkegaard and Perry Labs, Inc., Gaithersburg, MD) durante 2 horas a 37°C, a membrana foi cortada em 24 tiras de 4 mm de largura contendo cada uma cerca de 2,5 μρ de proteina total. A partir dai as tiras foram sondadas com anti-soros (Fig. 3, painel A e Fig. 4).
Para análise de "immunodotblot", soluções de reserva de Ll não recombinante ou recombinante foram diluidas 1:1000 com PBS frio (CaCl2 1 mM) e aliquotas de 100 μΐ (contendo cerca de 3,0 μg de proteina total) foram aplicadas numa membrana Immobilon-P. Os reagentes de desnaturação de proteínas foram omitidos da preparação da amostra de "immunodotblot" para conservar a conformação nativa da Ll recombinante. O bloqueio, as soluções diluentes do anticorpo primário e secundário, as lavagens e o substrato foram utilizados tal como descrito por Strike et al., "Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete Ll e L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the (common antigen)", 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555. As incubações do anticorpo primário foram efectuadas de um dia para o outro a 4°C, as incubações do anticorpo secundário foram feitas à temperatura ambiente durante 90 minutos. Para "immunodotblots" todas as soluções excepto a solução de substrato continham CaCl2 a 1 mM. As diluições de anticorpo primário foram 1:2000 para os anti-soros de coelho e 1:1000 para os soros humanos. Os anticorpos ligados especificamente foram detectados com conjugados anti-lgG de coelho (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) ou anti-lgG humano (TAGO Immunodiagnostics, Burlingame, CA)-fosfatase alcalina purificados por afinidade utilizados nas diluições 1:2000 e 1:5000, respectivamente, utilizando BCIP/NBT (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) como substrato. As reacções de "immunodotblot" foram avaliadas através de comparação visual das intensidades dos pontos de Ll não recombinante e recombinante. A reacção foi considerada positiva se a intensidade da cor do ponto de Ll recombinante 20 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ era maior que a intensidade da cor do ponto do controlo não recombinante presente na mesma tira. 5. Anti-soros. O anti-soro de LI desnaturada utilizado foi descrito anteriormente como anti-pEX480 por Strike et al., "Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete Ll e L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the (common antigen)", 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555. Este anti-soro foi obtido através de imunização de coelhos com uma proteína de fusão expressa em bactérias purificada em gel que continha uma sequência de 160 aminoácidos derivada da região média do enquadramento de leitura aberto de Ll de HPV-6b fundida com o terminal carboxilo da beta-galactosidase, tal como descrito por Stanley et al., "Construction of a new family of high efficiency bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones coding for human liver proteins", 1984, EMBO J., vol. 3, págs. 1429-1434; e Strike et al., "Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete Ll e L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the (common antigen)", 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555. Esta sequência contém o antigénio comum de Ll do vírus de papiloma tal como descrito por Strike et al., "Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete Ll e L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the (common antigen)", 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555. O anti-soro de partículas virais inteiras de coelho foi utilizado tal como descrito por Bonnez et al., "Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction", 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, e produzido através de imunização de coelhos com viriões de HPV-11 purificados não desnaturados, que foram obtidos a partir de xenoenxertos de prepúcio de ratinhos atímicos de acordo com Bonnez et al., "Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction", 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, e Kreider et al., "Laboratory production in 21 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ vivo of infectious human papillomavirus type 11", 1989, J.
Virol., 61, págs. 590-593. Os soros dos doentes foram obtidos de indivíduos com condiloma acuminado comprovado através de biopsia. Espécimes de soro anteriormente verificados como sendo positivos através de ELISA baseado em partículas virais inteiras de HPV-11 tal como descrito por Bonnez et ai., "Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata", 1991, J. Gen. Virol. 72, págs. 1343-1347, foram utilizados para maximizar a capacidade para detectar anticorpos dirigidos contra VLP. Os soros de controlo foram obtidos a partir de freiras que professavam nenhum contacto sexual ao longo da vida. Estes soros eram negativos para anticorpos de HPV-11 tal como determinado pelo ELISA baseado em partículas de HPV-11 tal como descrito por Bonnez et al., "Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata", 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1343-1347. 6. Produção e Purificação de Partículas Semelhantes a Vírus de LI de HPV-11. VLP recombinantes foram purificadas directamente a partir do sobrenadante de cultura sem células de culturas em suspensão de células Sf-9 infectadas com AcllLl através de uma série de passos de centrifugação de baixa e alta velocidade. As células Sf-9 infectadas foram sedimentadas a partir de uma cultura em suspensão de 200 ml a baixa velocidade (1000 xg) e o sobrenadante sem células foi novamente centrifugado a alta velocidade (100000 xg) durante 90 minutos a 4°C. O sedimento de alta velocidade foi ressuspenso em tampão A (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 1 M; MgCl2 10 mM; CaCl2 10 mM; fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 2 mMj ; 10 μg/ml de Leupeptina), foram adicionados 5 , 2 g de CsCl sólido e o volume final foi ajustado para um total de 13 ml com tampão A fresco (concentração final de 0,4 g/ml). Após centrifugação (100000 xg, 22 horas, 10°C), a única banda obtida foi removida e diluída com 12 ml de tampão A fresco (sem CsCl) e novamente centrifugada (100000 xg, 90 minutos, 4°C) para sedimentar as VLP purificadas. As VLP purificadas por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose foram identificadas através 22 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ de microscopia electrónica após coloração com ácido fosfotúngstico tamponado neutro a 2% (Fig. 2, 6 e 7).
EXEMPLO II
Expressão e Detecção imunológica de Proteína Ll de HPV-11 Recomblnante em Células Sf-9 A análise de SDS-PAGE das proteínas totais das células Sf-9 de células de insecto infectadas com o vírus recombinante AcllLl demonstrou uma nova proteína de 55 kDa observada através de coloração com azul de Coomassie em células infectadas com AcllLl (Fig. IA, pista 3) . Em relação às Figuras 1 (A e B), a Fig. IA mostra um gel de SDS-poliacrilamida corado com Coomassie de lisados de células Sf-9 infectadas com AcNPV de tipo selvagem e AcllLl recombinante e a Fig. 1B mostra um "Western blot" de lisados de células Sf-9 infectadas com AcNPV de tipo selvagem e AcllLl recombinante sondado com um anti-soro policlonal de coelho específico para o epítopo comum de Ll de HPV. Os lisados de células Sf-9 infectadas com Ll não recombinante (pistas 1, 2) e recombinante (pistas 3,4) foram fraccionados em fracções insolúveis (pistas 1,3) e solúveis (pistas 2,4), e sujeitos a electroforese em géis de poliacrilamida a 10%. Os marcadores moleculares de referência (Mr) são mostrados à esquerda e a seta à direita indica a posição aproximada da Ll recombinante (Mr de cerca de 55 kDa) . Esta proteína não está presente nos lisados de AcNPV de tipo selvagem e co-migra com uma proteína que é imunorreactiva (Fig. 1B, pistas 3 e 4) com um anti-soro de coelho preparado contra o antigénio comum de Ll de HPV linear tal como descrito por Strike et al., "Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete Ll e L2 open reading frames of human papilloma virus type 6b and the location of the (common antigen)", 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555. Foram também detectadas bandas imunorreactivas com Ll de Mr inferior que podem ser derivadas da degradação do produto Ll inteiro (Fig. 1B, pistas 3 e 4) . Embora a porção predominante da Ll produzida neste sistema tenha aparecido na fracção insolúvel em NP-40, aproximadamente 25-30% estava presente na fracção solúvel em NP-40 (Fig. 1B, pista 4). A acumulação máxima de Ll ocorreu 72 horas após a infecção. 23 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ
EXEMPLO III
Visualização por microscopia electrónica de VLP
As micrografias electrónicas das preparações coradas negativamente de VLP bandeadas com sacarose (Fig. 2, 6 e 7) mostraram VLP distintas. A Fig. 2 mostra partículas semelhantes à cápside de HPV-11 que estavam presentes a 50-60% da interface do gradiente de densidade de sacarose. A Fig. 6 mostra partículas semelhantes à cápside de HPV de tipo 6b (HPV-6b) que resultaram da expressão da sequência de codificação de Ll de HPV-6b no sistema de baculovírus e que foram purificadas exactamente do mesmo modo. A Fig. 7 demonstra que este método é também adequado para a produção de VLP de HPV de tipo 16 (HPV-16), após expressão da sequência de codificação da Ll de HPV-16. As Fig. 12 e 16 demonstram que podem também ser purificadas VLP através de centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio. Os diâmetros das partículas determinados através de medição directa das VLP na Figura 2 foram de aproximadamente 52 nm. Esta medição é consistente com o diâmetro dos viriões de vírus de papiloma isolados tal como descrito por Klug et al., "Structure of viruses of the papilloma-polyoma type I: Human wart vírus", 1965, J. Mol. Biol., vol. 11, págs. 403-423.
EXEMPLO IV imunorreactividade de Extractos de Células de insecto Contendo VLP de HPV-11 Com Anti-soros de Coelho
As propriedades imunológicas da proteína Ll recombinante foram estudadas utilizando anti-soros de coelho que reagiram com epítopos da proteína Ll nativa ou desnaturada. O anti-soro de coelho pEX480, dirigido contra o antigénio comum do vírus de papiloma, reagiu bem com Ll recombinante desnaturada em ensaios de "Western blot", mas não reagiu com a mesma preparação de antigénio através de "immunodotblot", um tipo de imunoensaio em que o antigénio é colocado na membrana de marcação sob condições não desnaturantes (Fig. 3, comparar as tiras A) . Em contraste com o padrão de reactividade exibido por anti-pEX480, o anti-soro policlonal de coelho criado 24 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ contra partículas virais inteiras de HPV-11 não reagiu com Ll recombinante através de "Western blot", mas reagiu fortemente com Ll recombinante no ensaio de "immunodotblot" (Fig. 3, comparar as tiras C) . Esta reactividade era específica tal como demonstrado pela falta de reactividade no soro pós-imune contra a preparação de controlo não recombinante nativa (Fig. 3, painel B, tira C) . 0 anti-soro de coelho pEX215 foi incluído nestes imunoensaios para permitir a comparação das quantidades relativas de Ll presentes nos dois tipos de imunoensaios. 0 nível de imunorreactividade do anti-soro pEX215 com Ll recombinante em ambos os formatos é quase equivalente (Fig. 3, tiras B), indicando que as quantidades de Ll presentes são aproximadamente iguais. Para além disso, a observação de que este anti-soro é capaz de reagir com Ll em ambos os formatos sugere que o epítopo ou epítopos amino-terminais de Ll imunorreactivos lineares reconhecidos pelo anti-soro pEX215 não são ocultados pela adopção de uma conformação de ordem superior de Ll.
EXEMPLO V
Imunorreactividade de Extractos de Células de Insecto Contendo VLP com Soros Humanos
Para determinar a prevalência de anticorpos em soros humanos dirigidos contra epítopos lineares versus conformacionais, soros obtidos de indivíduos com condiloma acuminado comprovado por biopsia foram avaliados em ensaios de "Western blot" e "immunodotblot" utilizando VLP como antigénios. Nenhum dos soros dos doentes ou dos controlos foi imunorreactivo com Ll recombinante desnaturada através de "Western blot" (Fig. 4, tiras D-0 (doentes) e P-X (controlos)). Ao contrário, 11 dos 12 soros de doentes (Fig. 5, tiras D-0 foram lidas como positivas, com a excepção da tira H) e 0 dos 9 soros de controlo (Fig. 5, tiras P-X) foram imunorreactivos com Ll recombinante através de "immunodotblot", uma diferença altamente estatisticamente significativa (p = 7xl0”5; teste exacto de Fisher). Este resultado correlaciona-se bem com resultados anteriormente obtidos utilizando os mesmos soros num ELISA baseado em partículas de HPV-11 tal como descrito por Bonnez et al., "Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect 25 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ specific antibodies in humans with condylomata acuminata", 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1343-1347.
EXEMPLO VI
Ensaio ELISA
As VLP purificadas em CsCl foram quantificadas por espectrofotómetro (A28o) e diluidas até uma concentração de 8 ng/μΐ em PBS frio. Alíquotas (100 μΐ) de PBS ou da solução de VLP diluída (800 ng de proteína total) foram carregadas em poços e as placas foram deixadas a repousar a 4°C de um dia para o outro. As placas foram bloqueadas durante 2 horas à temperatura ambiente com uma solução de BSA a 1%, seguido da adição de anti-soros, em duplicado, a uma diluição 1:100. Os anti-soros primários reagiram à temperatura ambiente durante 90 minutos. As placas foram lavadas quatro vezes e foi adicionado anticorpo secundário (conjugado de anti-IgG humana de cabra-fosfatase alcalina) (TAGO, 1:5000) e as placas foram deixadas a repousar à temperatura ambiente durante 90 minutos. Foi adicionado substrato a cada poço e a absorvância foi lida a 405 nm. A absorvância específica foi calculada subtraindo a absorvância do PBS da absorvância das VLP para cada replicado e tirando o valor da absorvância média.
Os resultados obtidos utilizando VLP (Fig. 8) foram equivalentes a resultados anteriormente relatados num teste ELISA dos mesmos soros (de doente de RRP), que utilizou partículas virais inteiras de HPV-11 como antigénio (50%) . A boa correlação com os resultados de um ELISA anterior baseado em partículas virais inteiras é dada na Fig. 9 (r2=0,75). EXEMPLO VII "Western blot" e "Immunodotblot"
Culturas em suspensão de Sf-9 (100 ml) foram infectadas com AcNPV (controlo não recombinante), baculovírus recombinantes AcllLl ou Acl6Ll tal como anteriormente descrito por Rose et al., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1936-1944, e incubadas 72 horas a 27°C. Em relação à Figura 11, as amostras foram preparadas, sujeitas a electroforese e imunomarcadas tal 26 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ como anteriormente descrito por Rose et al., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1936-1944; e Rose et al.r 1990, J. Gen. Virol., Vol. 71, págs. 2725-2729. Estavam presentes VLP em ambas as preparações de amostra, tal como verificado através de microscopia electrónica (dados não mostrados). As concentrações de proteína total das amostras foram equilibradas antes de utilizar o espectrofotómetro (A2so)·
Em relação à Figura 10(a), as amostras (20 μg de proteína total/pista) foram sujeitas a electroforese num gel de SDS-poliacrilamida a 10% e a "Western blot" de um dia para o outro tal como descrito por Bonnez et al., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380. A membrana de nitrocelulose foi sondada com anti-soro de coelho R5-409, utilizada a uma diluição 1:1000 tal como descrito por Christensen et al., 1991, Virus Research, vol. 21, págs. 169-179. Tal como demonstrado na Fig. 10(a) (painel esquerdo), as proteínas Ll recombinante de HPV-11 (pista 2) e Ll recombinante de HPV-16 (pista 3) foram detectadas em aproximadamente quantidades iguais pelo anti-soro R5-409 do epítopo comum de Ll antivírus de papiloma. A sequência de aminoácidos prevista da proteína Ll de HPV-16 é cinco aminoácidos mais longa que a sequência prevista da proteína Ll de HPV-11, o que é consistente com a taxa de migração ligeiramente mais lenta exibida pela proteína Ll recombinante de HPV-16.
Em relação à Figura 10(b), as amostras foram diluídas (diluições em série de duas vezes feitas com PBS) e aplicadas a nitrocelulose sob condições não desnaturantes, começando com uma concentração de proteína total de 25 μρ (em baixo) e terminando com uma concentração de proteína total de 25 ng (em cima). O anti-soro de coelho R-366 foi utilizado a uma diluição 1:1000. No painel direito (i.e., o "immunodotblot"), o anti-soro de partículas virais inteiras detectou a preparação de VLP de Ll recombinante de HPV-11 num espectro de diluição de 1000 vezes. No entanto, este mesmo anti-soro de coelho hiper-imune não foi imunorreactivo com a preparação de VLP de Ll recombinante de HPV-16 nativa, mesmo a uma concentração de antigénio (25 μρ) mais elevada que a utilizada para análise através de "Western blot" (20 μρ). 27 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ Ο anti-soro de coelho hiper-imune neutralizante do virião de HPV-11 nativo não reagiu de forma cruzada com a proteína Li de HPV-16 nativa, sugerindo que o epítopo ou epítopos conformacionais da cápside de HPV-11 que são reconhecidos por este anti-soro são imunologicamente distintos dos epítopos conformacionais presentes na preparação de VLP de HPV-16.
EXEMPLO VIII
Ensaio de "Western Immunoblot" VLP foram detectadas em, e purificadas directamente a partir de, o meio sobrenadante de uma cultura em suspensão (200 ml) de células Sf-9 infectadas com AcllLl. As células foram sedimentadas a baixa velocidade (1000 xg) e o sobrenadante sem células foi então centrifugado a alta velocidade (100000 xg) . As células foram removidas por centrifugação a baixa velocidade (1000 xg) e as VLP foram preparadas a partir dos sobrenadantes de cultura tal como descrito em Rose et al. em "Human papillomavirus type 11 (HPV-11) virus-like particles (VLP) induce the formation of neutralizing antibodies". (Submetido para publicação) 1993. O painel A é um gel de SDS-poliacrilamida a 10% corado com azul de Coomassie. O painel B é um "Western immunoblot" de um gel carregado de forma idêntica, sondado com um anti-soro de coelho específico para o antigénio comum de HPV tal como descrito por Strike et al., 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555, utilizado a uma diluição 1:1000. O exame dos sedimentos de alta velocidade obtidos dos sobrenadantes das culturas de células Sf-9 infectadas com Ll não recombinante ou recombinante indicaram a presença de VLP na fracção de sobrenadante infectado com Ll recombinante. O sedimento de alta velocidade de Ll recombinante ressuspenso foi purificado por centrifugação de gradiente de densidade em equilíbrio tal como anteriormente descrito em Bonnez et al., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380. A única banda obtida através deste método foi removida com uma agulha estéril de calibre 18, diluída com tampão A fresco (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 1 M; MgCl2 10 mM, CaCl2 10 mM; fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 2 mM; 10 μρ/πιΐ de Leupeptina) até um volume de 12 ml e novamente centrifugada a 100000 xg durante 90 minutos a 4°C. Após ressuspensão do sedimento em 0,5 ml de tampão A fresco 28 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ (glicerol a 50%), a análise por microscopia electrónica de uma porção da amostra, corada negativamente com ácido f osf otúngstico a 2%, confirmou a presença de VLP de HPV intactas (Fig. 12).
Tal como anteriormente descrito, as VLP recombinantes foram imunorreactivas com anticorpos dirigidos contra partículas virais inteiras de HPV-11. (Ver Rose et al., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1936-1944). Neste estudo, os requerentes imunizaram coelhos com as VLP purificadas e testaram os soros pós-imunes quanto a imunorreactividade com viriões inteiros. Coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados intramuscularmente em dois locais com uma emulsão 1:1 de VLP purificadas («20 μg de proteína) em adjuvante completo de Freund (0,25 ml por local). Os reforços foram dados após 30 dias com uma emulsão de VLP preparada em adjuvante incompleto de Freund e os soros imunes foram recolhidos 14 dias mais tarde. Os soros foram feitos reagir com viriões HPV-11 nativos ou VLP recombinantes num imunoensaio "dotblot", tal como anteriormente descrito em Rose et al., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1936-1944. A reactividade imunológica cruzada dos anticorpos anti-VLP com viriões inteiros, tal como mostrado na Figura 13, demonstra que as VLP são imunogénicas e parece que copiam fielmente o perfil antigénico dos viriões infecciosos de HPV-11. Em relação à Figura 13, foram aplicadas em nitrocelulose preparações de amostra purificadas não desnaturadas tal como descrito por Rose et al., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1936-1944.
EXEMPLO IX
Actividade de Neutralização A preparação da suspensão virai de HPV-llHershey de infecção (originalmente proporcionada por John Kreider, Department of Pathology and Microbiology and Immunology, The Milton S. Hershey Medicai Center, Hershey, PA) foi descrita por Bonnez et al., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376 — 380. Em quatro experiências em paralelo, foram incubados 450 μΐ da suspensão virai infectante (vez 4/90) a 37°C durante 1 hora com 50 μΐ (diluição final 1:10) de soro anti-HPV-11 pré- 29 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ imune (grupo 1), soro anti-HPV-11 pós-imune (grupo 2), soro anti-VLP pré-imune (grupo 3) ou soro anti-VLP pós-imune (grupo 4). Os grupos 1 e 2 foram controlos de neutralização que foram descritos anteriormente por Bonnez et al., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, e os grupos 3 e 4 foram os grupos de teste. A preparação de prepúcios humanos excisados para circuncisão de rotina foi também descrita por Bonnez et al., 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1343-1347. Os prepúcios foram cortados em quadrados de 1 χ 1 mm e um pequeno número de fragmentos de cada prepúcio foi rapidamente congelado e guardado. Os restantes fragmentos foram igualmente divididos em quatro grupos e cada grupo foi adicionado a uma das quatro misturas de suspensão viral-soro no final do período de incubação. As misturas foram incubadas durante uma hora a 37°C. Para cada grupo experimental, foi colocado um fragmento de prepúcio sob a cápsula renal de cada rim de 3 ratinhos nu/nu atímicos fêmea, da mesma ninhada, com 4-6 semanas de idade num fundo BALB/c (Taconic Farms, Germantown, NY) . A experiência foi repetida num dia diferente, com um prepúcio diferente. Assim, para cada grupo experimental foi implantado um total de 12 enxertos. Os animais foram sacrificados 12 semanas após o enxerto, altura em que os enxertos foram removidos e processados. (Ver Bonnez et al., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380). Em relação à Figura 14, foram preparados enxertos para análise tal como descrito aqui e infectados com lisado virai que foi pré-tratado com soros de coelho de partículas virais inteiras de hpv-11 (1) pré- e (2) pós-imunes, ou soros de coelho de partículas semelhantes a vírus de HPV-11L1 (3) pré- e (2) pós-imunes. Os círculos a cheio correspondem à primeira experiência em replicado, os círculos vazios à segunda experiência em replicado. As barras horizontais indicam a MGD mediana. Para comparação do tamanho do enxerto, a média geométrica do diâmetro (MGD) foi calculada tomando a raiz cúbica do produto do comprimento, largura e altura dos enxertos recuperados.
No momento da eutanásia, faltava um enxerto de cada um dos grupos de controlo de neutralização tratados com anti-HPV-11 pré- e pós-imunes. Assim, o número de enxertos disponível para análise em cada um destes grupos foi de 11 (Fig. 14) . As MGD (mm) medianas [variação] dos enxertos nos grupos de controlo pré- e pós-imunes foram respectivamente 30 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 2,9 [1,0, 4,9] e 13 [1,0, 2,6]. A diferença, 1,6 mm, foi estatisticamente significativa (P = 0,004, teste U de Mann-Whitney). Todos os 12 enxertos implantados estavam disponíveis para análise em ambos os grupos tratados com anticorpo anti-VLP pré- e pós-imunes (Fig. 4) . As MGD (em mm) medianas [variação] dos enxertos foram respectivamente 2,3 [1,3, 4,2] e 1,0 [1,0, 1,8]. A diferença de tamanho, 1,3 mm, foi estatisticamente significativa (p < 1CT4) . Embora a diferença no tamanho dos enxertos entre a primeira e a segunda experiência não fosse estatisticamente significativa (P = 0,62) no grupo pré-imune, foi significativa (P = 0,007) no grupo pós-imune. Por isso, os requerentes compararam as diferenças nos tamanhos dos enxertos entre os grupos tratados com anticorpo anti-VLP pré- e pós-imunes dentro de cada experiência em replicado. Ambas foram estatisticamente significativas (P = 0,002 e P = 0,04, respectivamente para a primeira e segunda réplica).
EXEMPLO X
Fonte dos ADN Virais A fonte do ADN genómico de HPV-11 (Bonnez et al., 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1343-1347) e a construção do baculovirus recombinante AcllLl (Rose et al., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1936-1944) foram descritas. A sequência genómica de hpv-16 foi recuperada a partir de uma lesão CIN III e foram utilizados métodos de clonagem padrão para construir o baculovirus Acl6Ll (Chesters e McCance, dados não publicados). A sequência de Ll de HPV-18 foi amplificada através de reacção em cadeia da polimerase a partir do protótipo de HPV-18 (proporcionado por H. zur Hausen) e utilizada para construir o baculovirus Acl8Ll através do mesmo procedimento utilizado para a construção de AcllLl (Rose et al., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1936-1944).
EXEMPLO XI
Purificação de VLP Recombinantes
As VLP recombinantes foram purificadas tal como descrito por Rose et al., 1993, "Human papillomavirus type 11 (HPV-11) 31 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ virus-like particles (VLP) induce the formation of neutralizing antibodies and detect genital HPV-specific antibodies in human sera", no prelo. Bandas únicas contendo VLP de HPV-11, HPV-16 ou HPV-18 foram removidas a partir de gradientes de densidade de CsCl através de seringa, diluidas com tampão A (solução salina tamponada com fosfato (PBS); MgCl2 1 mM; CaCl2 1 mM; fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM) até 12 ml, e sedimentadas a 100000 xg durante 90 minutos a 4°C. Os sedimentos foram ressuspensos em 200 μΐ de tampão A contendo glicerol a 50%, quantificados por espectrofotometria (280 nm) e armazenados a 20°C. As proteínas Ll recombinantes foram analisadas através de imunoensaios de SDS-PAGE e "Western blot" tal como anteriormente descrito (Rose et ai., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1936-1944). As amostras contendo 5 μρ de VLP de HPV-11, -16 ou -18 purificadas foram sujeitas a electroforese, transferidas para membrana e sondadas com anti-soro de coelho anti-antigénio comum de Ll do virus de papiloma (anti-PVLl) tal como anteriormente descrito (Strike et ai., 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555; e Rose et ai., 1993, J. Virol., 1993, vol. 67, págs. 1936-1944). As capacidades de codificação previstas dos enquadramentos de leitura abertos (ORF) da Ll de HPV-11, -16 e -18 são de 501 aminoácidos (Dartmann et ai., 1986, Virology, vol. 151, págs. 124-130), 505 aminoácidos (Seedorf et ai., 1985, Virology, vol. 145, págs. 181-185) e 507 aminoácidos (Cole et ai., 1987, J. Mol. Biol., vol. 193, págs. 599-608), respectivamente, e apareceu uma banda imunorreactiva para Ll do tamanho esperado (Mr -55 kD) em cada uma das três preparações de amostra testadas através de imunoensaio de "Western blot" (Fig. 15) . Foram também detectadas proteínas imunorreactivas para Ll de menor peso molecular através de imunoensaio "Western blot" das preparações de VLP purificadas por CsCl (Fig. 15) e é provável que sejam produtos de degradação das proteínas Ll inteiras, uma vez que as quantidades relativas destas proteínas variaram em análises subsequente (dados não mostrados). No entanto, as principais bandas imunorreactivas para Ll de Mr =55 kD em cada uma das amostras não variaram, nem na sua mobilidade nem nas quantidades relativas (dados não mostrados). A microscopia electrónica de amostras purificadas (coradas negativamente com ácido fosfotúngstico a 2%) confirmou a formação de VLP nas 32 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ preparações de VLP de HPV-11 (Fig. 16A), HPV-16 (Fig. 16B) e HPV-18 (Fig. 16C).
EXEMPLO XII
Preparação de Soros Imunes de Coelho para vlp e Condições do
ELISA
Soros imunes de coelho para vlp de Ll de hpv-11, hpv-16 e HPV-18 foram preparados através da imunização de dois coelhos brancos da Nova Zelândia intramuscularmente em dois locais com cada uma das preparações de VLP (i.e., foram imunizados seis coelhos), utilizando métodos anteriormente descritos (Rose et al., 1992, J. Infect. Dis.r 165, págs. 376-380; Rose et al., J. Virol., vol. 67, págs. 1936-1944). Os anti-soros de coelho anti-antigénio comum de PVLl (Strike et al., 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555), anti-virião inteiro de HPV-11 (Bonnez et al., 1992, J. Infect. Dis., vol. 165, págs. 376-380) e anti-VLP de hpv-11, -16 e -18 foram testados com ELISA contra as três preparações de VLP recombinantes (Fig. 17). Para este ELISA, as VLP purificadas foram diluidas até uma concentração de 10 ng/μΐ em PBS e foram dispensadas aliquotas contendo aproximadamente 1 μρ de antigénio ou só PBS em filas alternadas de placas de ELISA de 96 poços. As condições do ensaio foram exactamente tal como anteriormente descrito (Rose et al., 1993, "Human papillomavirus type 11 (HPV-11) virus-like particles (VLP) induce the formation of neutralizing antibodies and detect genital HPV-specific antibodies in human sera", no prelo), excepto que os anti-soros foram pré-absorvidos com lisado de células Sf-9 infectadas com baculovírus não recombinante (AcNPV) diluído em solução de bloqueio (2% v/v) antes dos testes. Todos os anti-soros foram testados em duplicado, em numerosas ocasiões, a diluições variando de 1:1000 a 1:128000. Os valores de absorvância para todos os anti-soros de coelho anti-VLP mostrados na Figura 17 foram obtidos à diluição óptima para estes anti-soros de 1:16000. Os valores de absorvância para os anti-soros de coelho anti-antigénio comum de PVLl e de virião inteiro de HPV-11 foram obtidos a uma diluição menor (1:1000). Os valores específicos de absorvância foram determinados subtraindo os valores dos controlos (poços de PBS) dos valores experimentais 33 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ (poços contendo antigénio) para cada replicado, e foram determinados valores médios de absorvância.
EXEMPLO XIII
ELISA DE VLP
As VLP foram testadas em imunoensaio ELISA para avaliar a sua capacidade para detectar anticorpos específicos em soro de doentes e os resultados foram comparados com resultados obtidos anteriormente utilizando os mesmos soros num imunoensaio ELISA de virião inteiro de HPV-11 (Bonnez et al., 1993, J. Med. Virol., vol. 39, 340-344). O antigénio foi diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para dar uma quantidade equivalente à utilizada no ELISA de virião inteiro anterior (Bonnez et al., 1993, J. Med. Virol., vol. 39, 340-344) e a solução de antigénio ou PBS sem qualquer antigénio foi dividida em aliquotas para filas alternadas de placas de 96 poços. Após revestimento durante 16 horas a 4°C, estas soluções foram aspiradas e os poços foram bloqueados com solução diluente/de bloqueio (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) à temperatura ambiente durante 2 horas. Um total de 59 soros humanos (43 doentes, 16 controlos) previamente testados através de ELISA de partículas virais inteiras de HPV-11 (Bonnez et al., 1993, J. Med. Virol., vol. 39, 340-344) foi diluído 1:100 em solução diluente/de bloqueio e foram adicionadas aliquotas de 100 μΐ aos poços tratados com PBS sozinho ou com solução de antigénio (dois replicados por amostra de soro). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 90 minutos e depois lavadas quatro vezes (solução de lavagem, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Foi adicionado a cada poço conjugado anti-IgG humana-fosfatase alcalina (aliquotas de 100 μΐ, diluído 1:5000, TAGO, Burlingame, CA) e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 90 minutos. As placas foram lavadas quatro vezes e reveladas com substrato de fosfatase alcalina (p-nitrofenil-fosfatase em tampão dietanolamina). A absorvância específica a 405 nm para cada amostra de soro foi calculada subtraindo o valor obtido do poço tratado com PBS do valor obtido do poço contendo antigénio para cada replicado e foram calculadas as diferenças médias dos replicados. No ELISA de virião inteiro aqui 34 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ discutido noutro sitio, foi analisado o soro de 42 doentes (e 20 soros de controlo) quanto a alterações nos niveis de anticorpo da cápside durante o curso do tratamento (Bonnez et al., J. Med. virol., vol. 39, 340-344). Todos os soros testados no presente estudo de ELISA foram recolhidos à entrada no estudo anterior. Um dos soros de doentes analisados no estudo anterior foi subsequentemente excluído por razões relacionadas com o resultado do tratamento e não com os resultados do imunoensaio. No entanto, como o valor da absorvância deste soro estava disponível, o soro foi incluído no presente ensaio, o que aumentou o número de soros de doentes analisados no presente estudo de ELISA para 43. O número de soros de controlo analisados foi reduzido de 20 para 16 por considerações logísticas próprias do ensaio. A reactividade sérica mediana [variação] dos 16 soros de controlo, expressa como valor de DO, foi de 0,005 [-0,029, 0, 025], em comparação com 0, 024 [-0, 063, 0,512] para o soro dos 43 doentes, uma diferença estatisticamente significativa (P = 0,01, teste U de Mann-Whitney). Utilizando o maior valor de DO no grupo de controlo como limiar, a sensibilidade do ensaio foi de 49% (P = 2xl0”4; teste exacto de Fisher) . Por isso, o ELISA de VLP de HPV-11 foi capaz de discriminar entre doentes com condiloma acuminado e controlos. Adicionalmente, houve uma excelente correlação (momento do produto de Pearson r=0,87; P < IO”6) entre as reactividades sérica das amostras com o ELISA de VLP de hpv-11 e o ELISA do virião de HPV-11 quando foram incluídos todos os soros ou quando foram considerados apenas 21 soros positivos através de ELISA de VLP de HPV-11 (r=0,87; P < 10”6) .
RESULTADOS
As observações imunológicas sugerem que LI recombinante adopta uma conformação nativa. O anti-soro de coelho criado contra o antigénio comum de Ll desnaturada foi imunorreactivo apenas com Ll recombinante desnaturada (i.e., através de "Western blot"), enquanto que o anti-soro de coelho criado contra partículas virais inteiras não desnaturadas reagiu apenas com Ll recombinante não desnaturada (i.e., através de "immunodotblot"). Para além disso, soros humanos de doentes de condiloma acuminado que foram reactivos com viriões de HPV-11 35 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ num ELISA de acordo com Bonnez et al., "Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata", 1991, J. Gen. virol. 72, págs. 1343-1347, também reagiram com Ll recombinante de HPV-11 não desnaturada (Fig. 4, 8 e 9) . Por isso, parece que os epitopos conformacionais das VLP do presente invento são semelhantes aos presentes em viriões de HPV-11 nativos, que são reconhecidos pelo sistema imunitário humano durante uma infecção natural. Vários estudos de serologia de virus de papiloma demonstram que as especificidades conformacionais do anticorpo e epitopo são bons indicadores de infecção por virus de papiloma (Bonnez et al., "Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata", 1991, J. Gen. Virol., 72, págs. 1343-1347; Bonnez et al., "Evolution of the antibody response to human papillomavirus type 11 (HPV-11) in patients with condyloma acuminatum according to treatment response", 1991, J. Med. virol., no prelo; Bonnez et al., "Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction", 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380; Christensen et al., "Detection of human serum antibodies that neutralize infectious human papillomavirus type 11 virions", 1992; J. Gen. Virol., vol. 73, págs. 1261-1267; Kienzler et al., "Humoral and cell-mediated immunity to human papillomavirus type 1 (HPV-1) in human warts", 1983, Br. J. Dermatol., vol. 108, págs. 665-672; e Steele et al., "Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papilomavirus type 1", 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398). Estas especificidades podem também ter um papel significativo na patogénese virai. Por exemplo, um anti-soro de coelho dirigido contra partículas inteiras de HPV-11 neutraliza a infecciosidade de HPV-11 (Bonnez et al., "Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction", 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380; e Christensen et al., "Antibody-mediated neutralization in vivo of infectious papillomavirus", 1990; J. Virol., vol. 64, págs. 3151-3156). Para além disso, Christensen et al., "Detection of human serum antibodies that neutralize infectious human papillomavirus type 11 virions", 36 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 1992, J. Gen. Virol., vol. 73, págs. 1261-1267, utilizando soros humanos relatou uma correlação entre anticorpo anti-virião inteiro de HPV-11 e a actividade neutralizante do soro. A detecção de tais anticorpos com as vlp de Ll recombinante do presente invento pode ter significância funcional e em diagnóstico.
Quando se tem em conta a construção dos baculovirus recombinantes, alguns dos baculovirus recombinantes iniciais construídos pelos requerentes tinham a sequência de codificação de Ll correcta, mas não produziam níveis detectáveis de proteínas Ll. Isto fez com que os requerentes olhassem para as regiões 3' não traduzidas das sequências de codificação de Ll de HPV-11 e vários outros HPV. Foi determinado que uma sequência sinal pentanucleotídica de degradação do ARNm, AUUUA (Shaw G. e Kamen R., "A conserved AU sequence from the 3' untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation", Cell, 1986, vol. 46, págs. 659-67; Cole M.D. e Mango S.E., "cis-acting determinants of c-myc mRNA stability", 1990, Enzyme, vol. 44, págs. 167-80; Shyu A.B. et al., "Two distinct destabilizing elements in the c-fos message trigger deadenylation as a first step in rapid mRNA decay", Genes & Development, 1991, vol. 5, págs. 221-31; Savant-Bhonsale S. e Cleveland D.W., "Evidence for instability of mRNAs containing AUUUA motifs mediated through translation-dependent assembly of a: 20S degradation complex", Genes & Development, 1992, vol. 6, págs. 1927-37) estava a 30 nucleótidos do codão de terminação da sequência de codificação de Ll de HPV-11 e, adicionalmente, os outros tipos de HPV observados tinham também a sequência AUUUA na vizinhança do codão de terminação de Ll. Se esta sequência fosse removida, ou se fosse introduzida uma mutação, então o nível de expressão da proteína Ll podia ser aumentado. Por isso, foram desenhados iniciadores de PCR para amplificar a sequência de codificação de Ll a partir do ADN genómico de HPV-11 que não só incorporavam locais de enzimas de restrição para clonagem, como também mutavam a sequência pentanucleotídica AUUUA 30 nucleótidos a jusante do codão de terminação de Ll. A amplificação deste clone produziu níveis extremamente elevados de proteína Ll. Relatórios utilizando o sistema BEVS deram níveis de produção de proteína recombinante no intervalo de 300-500 mg/litro de cultura celular. No presente invento, os 37 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ níveis de produção de proteína Ll recombinante foram muito maiores, cerca de 600-800 mg/litro, possivelmente devido à remoção da sequência sinal de degradação de Ll na região 3' não traduzida.
Estes resultados mostram que, sob condições experimentais semelhantes, soros pós-imunes de coelhos imunizados com VLP de HPV-11 podem bloquear infecção por HPV-11 de tecido humano tão eficazmente como soros obtidos de coelhos imunizados com viriões inteiros de HPV-11. O bloqueio, que não foi observado com os respectivos soros pré-imunes, foi associado à ausência de expressão de genes virais iniciais. Por isso, o efeito foi consistente com a neutralização virai clássica, i.e., o impedimento da penetração do vírus ou descapsidação (Dimmock, 1993, "Neutralization of Animal Viruses", Berlim: Springer-Verlag).
Para proporcionar uma confirmação da neutralização de HPV-11 através de análise da expressão de genes virais, todos os enxertos foram analisados quanto à presença do transcrito de ARNm processado em Ε1ΛΕ4 de HPV-11 (dados não mostrados), tal como anteriormente descrito por Bonnez et al., 1992, J.
Inf. Dís., vol. 165, págs. 376-380. O ARNm Ε1ΛΕ4 foi detectado em 10/12 (83%) e 0/12 (0%) dos enxertos dos grupos pré-tratados com soros de VLP pró- ou pós-imunes, respectivamente (p< 10~4) . Semelhantemente, para os grupos de controlo pré-tratados com soros anti-virião inteiro pré- ou pós-imumes, o ARN Ε1ΛΕ4 foi detectado em 8/11 (73%) e 0/11 (0%) dos enxertos, respectivamente (p = 10~3) . Estes resultados indicam que o tratamento do inoculo virai com soro de VLP pós-imune está associado a uma marcada inibição do crescimento do enxerto e da expressão de genes virais, efeitos que são consistentes com neutralização imunitária. Assim, as VLP recombinantes podem induzir uma resposta de neutralização semelhante em magnitude à resposta obtida através de imunização com vírus infeccioso.
As VLP de L1-L2 de HPV-16 descritas por Zhou et al., 1991, Virology, vol. 185, págs. 251-257, foram de tamanho variável e menores (35-40 nm de diâmetro) que os viriões de HPV (50-55) ou as VLP de HPV-11 produzidas por baculovírus (50-55 nm; Rose et ai., no prelo, 1993). Estas características 38 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ morfológicas são bastante diferentes das das VLP descritas no presente invento. Para além disso, utilizando o método do presente invento, a proteína Li de HPV sozinha é suficiente para a formação de partículas cujas características biofísicas e propriedades antigénicas reflectem intimamente as dos viriões de HPV nativos.
Utilizando uma abordagem semelhante, Kirnbauer et al. relataram a inibição de transformação mediada por bpv-1 de células C127 de ratinho in vitro através de anticorpos anti-VLP de BPV-1 (Kirnbauer et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 89, págs. 12180-12184). Os resultados obtidos nesse sistema apoiam os resultados relatados no presente invento, no qual os requerentes demonstraram neutralização utilizando um HPV genital e o seu tecido alvo normal. Embora tenha sido relatada uma concordância de resultados do ensaio de BPV-l/células C127 e o sistema de xenoenxerto de pele fetal bovina em ratinho atímico tal como anteriormente descrito por Ghim et al., 1993, Int. J. Câncer, vol. 49, págs. 285-289, o sistema de BPV-l/fibroblastos C127 de ratinho não é produtivo e por isso a neutralização pode apenas ser inferida a partir da ausência de focos transformados in vitro. Adicionalmente, BPV-1 não infecta naturalmente ratinhos e o mecanismo através do qual consegue entrar nas células C127 pode diferir do mecanismos envolvido no processo de infecção natural. Em contraste, o modelo de ratinho atímico utilizado no presente estudo assenta na infecção por um HPV genital do seu tecido alvo natural tal como anteriormente descrito por Kreider et al., 1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641, o enxerto infectado é mantido in vivo e a transformação morfológica e histológica do enxerto infectado é acompanhada pela produção de viriões infecciosos (ver Kreider et al., 1987, j. virol., vol. 61, págs. 590-593). A inibição de crescimento do enxerto mediada por anticorpos tal como anteriormente descrita por Bonnez et al., 1992, j. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380; Christensen et al., 1990, J. Virol., vol. 64, págs. 3151-3156; Christensen et al., 1991, Virus Research, vol. 21, págs. 169— 179; Christensen et al., 1990, J. Virol., vol. 64, págs. 5678— 5681; e Christensen et al., 1992, J. Gen. Virol., vol. 73, págs. 1261-1267, e as provas imunocitoquímicas e de biologia molecular da inibição da expressão de genes virais foi bem documentada, tal como anteriormente descrito por Bonnez et 39 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ al., 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1343-1347; e Bonnez et al., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380. Por isso, as observações feitas no sistema de ratinho atimico podem reflectir com maior precisão os acontecimentos que ocorrem na infecção natural.
Anticorpos neutralizantes para HPV-11 foram identificados em humanos com condiloma acuminado tal como anteriormente descrito por Christensen et al., 1992, J. Gen. Virol., vol. 73, págs. 1261-1267, mas a sua significância biológica é desconhecida. Se se provar que a neutralização é um mecanismo efector imunológico protector contra infecções por virus de papiloma in vivo, então a imunização com VLP recombinantes pode proporcionar imunidade protectora a indivíduos em risco de infecção. Os requerentes sugerem que a magnitude da actividade de neutralização dos anticorpos de VLP de HPV-11 é semelhante à dos anticorpos específicos para viriões infecciosos de HPV-11. Por isso, as VLP parecem ser bons candidatos a vacinas. No entanto, o grau de reactividade cruzada dos determinantes conformacionais da cápside entre os diferentes tipos de HPV ainda não é conhecido e pode ser baixo tal como anteriormente descrito por Gissmann et al., 1977, Virology, vol. 76, págs. 569-580; Gross et al., 1983, "Oncogenic Viruses", Pergamon Press, New York; Hagensee et al., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 315-322; Howley et al., "Papillomavirinae and their replication", Cap. 58, págs. 1625-1650, em b.n. Fields and d.m. Knipe (ed.), "virology", 2a Ed, Vol. 2, Raven Press, New York (1990); Kirnbauer et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 89, págs. 12180-12184; Kreider et al., 1987, j. Virol., vol. 61, págs. 590-593;
Kreider et al., 1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641; e Orth et al., 1977, J. Virol., vol. 24, págs. 108-120. A caracterização completa do potencial das VLP recombinantes para utilização como imunogénios para a prevenção de doença por HPV genital vai requerer mais estudos envolvendo VLP derivadas de outros tipos de HPV genital. Será de particular importância determinar se anticorpos para VLP de HPV genital heterólogas serão capazes de neutralizar infecção por HPV.
Em relação à Figura 17, as partículas virais inteiras de HPV-11 (B) e os anti-soros de VLP de HPV-11 (C, D) reagiram fortemente com as VLP de HPV-11, mas nenhum destes anti-soros 40 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ reagiu com as preparações de VLP de HPV-16 ou HPV-18. Semelhantemente, os anti-soros de coelho de VLP de Ll de HPV-16 (E, F) e HPV-18 (G,H) reagiram apenas com VLP homotipicas. As especificidades destas reacções foram verificadas em experiências de pré-absorção, nas quais a imunorreactividade de cada anti-soro de VLP de coelho foi anulada através de pré-absorção com VLP homotipicas, mas não com as heterotipicas (dados não mostrados). Nenhum dos soros pré-imunes de coelho reagiu com qualquer uma das preparações de VLP (dados não mostrados). O anti-soro do antigénio comum anti-PVLl, que reagiu bem com proteínas Ll recombinantes através de "Western immunoblot" (Fig. 15), reagiu apenas ligeiramente com preparações de VLP nativas no ELISA (Fig. 17A) . Esta observação sugere que os epítopos normalmente reconhecidos por este anti-soro são mascarados sob as condições do ensaio ELISA e que as proteínas Ll testadas neste ensaio são predominantemente não desnaturadas. 0 presente invento mostrou que os epítopos das VLP de Ll de HPV-11, -16 e -18 são antigenicamente distintos. Embora as proteínas da cápside L2 não estivessem presentes nestas preparações de VLP, é provável que a diferença antigénica observada entre os tipos de HPV também se aplique aos viriões. L2 representa aproximadamente 10% do teor proteico total das partículas de HPV (Doorbar et al., 1987, J. Virol., vol. 61, 2793-2799) e, embora não tenha sido determinada a sua localização exacta na partícula (Baker et al., 1991, Biophysical J., vol. 60, págs. 1445-1456), estudos recentes sugeriram que pode ser necessária para a encapsidação do ADN (Zhou et al., 1993, J. Gen. Virol., vol. 74, págs. 763-768) e que um domínio presente na porção amino-terminal relativamente conservada da sequência de aminoácidos de L2 de HPV-16 medeia a ligação não específica ao ADN (Zhou et al., 1994, J. Virol., vol. 68, págs. 619-625). Embora o restante da sequência de aminoácidos de L2 seja muito heterogéneo entre os vírus de papiloma (Danos et al., 1990, J. Invest. Dermatology, vol. 83, págs. 7-11), não é claro se os anticorpos específicos de L2 reagem com viriões intactos (Komly et al., 1986, J. Virol., vol. 60, págs. 813-816; e Hagansee et al., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 315-322). Assim, não se espera que a proteína L2 altere substancialmente os resultados do presente estudo. 41 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ
Estudos anteriores indicaram que diferentes tipos de HPV podem ser distinguidos uns dos outros utilizando técnicas serológicas. Por exemplo, foram encontrados muito mais vulgarmente anticorpos reactivos com viriões de verrugas plantares em soros de doentes com verrugas plantares que em soros de doentes com verrugas vulgares, achatadas, anogenitais ou laringicas (Pfister e zur Hausen, 1978, Int. J. Câncer, vol. 21, págs. 161-165; Kienzler et al.r 1983, Brit. J.
Dermatol., vol. 108, págs. 665-672; e viac et al., 1990, J. Med. Virol., vol. 32, págs. 18-21). Anisimova et al., 1990, também mostraram directamente através de microscopia imunoelectrónica que HPV-1 e HPV-2 são antigenicamente distintos. No entanto, parece também que outros tipos de HPV são antigenicamente aparentados. Por exemplo, foi anteriormente relatada a detecção de anticorpos que reconhecem especificamente viriões de HPV-11 no soro de doentes com infecção por HPV-6 documentada (Bonnez et al., 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1343-1347; e Bonnez et al., 1992, Virol., vol. 188, págs. 384-387). Devido à falta de viriões de HPV disponíveis na maioria dos tipos de HPV, as VLP são actualmente a melhor ferramenta disponível para explorar o parentesco antigénico entre HPV. É provável que as diferenças antigénicas entre os tipos de HPV reflictam diversidade genética dentro da sequência de codificação de Ll. Chan et al. construíram uma árvore filogenética de vírus de papiloma que se baseia na divergência genética dentro de uma região definida da sequência de aminoácidos de Ll do vírus de papiloma (Chan et al., 1992, J. Virol., vol. 66, págs. 5714-5725). O seu trabalho mostra a relação evolutiva relativamente próxima entre HPV-6 e HPV-11, o que é consistente com uma potencial reactividade cruzada entre as cápsides de HPV-6 e -11. Por outro lado, espera-se que HPV-16 e HPV-18, que divergiram extensamente nas suas sequências de Ll, tenham pouca reactividade cruzada antigénica um com o outro ou com HPV-11. Estas previsões são consistentes com os resultados do presente invento. A importância biológica da variabilidade antigénica da cápside de HPV é desconhecida, mas a diversidade da proteína da cápside pode contribuir para a especificidade tecidual do vírus de papiloma. A disponibilidade de VLP recombinantes de vários vírus de papiloma pode vir a ser útil na identificação 42 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ de putativos receptores celulares específicos do hospedeiro e do tecido. Adicionalmente, as VLP devem ter um papel importante no delineamento das características antigénicas dos HPV e na condução de estudos de respostas imunitárias a estes vírus.
Lisboa, 2011-04-04
Claims (18)
- ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Partícula semelhante a vírus ou capsómero de vírus de papiloma humano, recombinantes, purificados, que compreendem a proteína de cápside Ll de vírus de papiloma humano do tipo genital expressa a partir de uma sequência de codificação da proteína Ll que produz uma proteína ou um complexo proteico que possui características imunológicas e morfológicas semelhantes às do vírus de papiloma nativo, em que os referidos partícula ou capsómero são capazes de reconhecer anticorpos em soros humanos de pessoas que se sabe estarem infectadas com vírus homólogos, e em que o vírus de papiloma humano é qualquer um entre HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-35.
- 2. Partícula semelhante a vírus de acordo com a reivindicação 1 que tem um diâmetro consistente com o diâmetro de viriões de vírus de papiloma isolados.
- 3. Partícula semelhante a vírus ou capsómero de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em que a referida sequência de codificação da proteína Ll é expressa numa célula utilizando um sistema de expressão de baculovírus.
- 4. Partícula semelhante a vírus ou capsómero de acordo com a reivindicação 1 em que o vírus de papiloma humano é HPV-18.
- 5. Partícula semelhante a vírus ou capsómero de acordo com a reivindicação 1 em que o vírus de papiloma humano é HPV-31.
- 6. Partícula semelhante a vírus ou capsómero de acordo com a reivindicação 1 em que o vírus de papiloma humano é HPV-33.
- 7. Partícula semelhante a vírus ou capsómero de acordo com a reivindicação 1 em que o vírus de papiloma humano é HPV-35.
- 8. Partícula semelhante a vírus ou capsómero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores consistindo numa proteína de cápside Ll. ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 2/3
- 9. Partícula semelhante a vírus ou capsómero de acordo com qualquer das reivindicações anteriores para utilização como vacina.
- 10. Vacina compreendendo uma partícula semelhante a vírus ou capsómero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
- 11. Vacina de acordo com a reivindicação 10 que é uma vacina multivalente compreendendo uma partícula semelhante a vírus de diferentes vírus de papiloma humano.
- 12. Vacina de acordo com as reivindicações 10 ou 11 compreendendo ainda um adjuvante.
- 13. Utilização de uma partícula semelhante a vírus ou capsómero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 no fabrico de uma vacina para conferir imunidade protectora contra o vírus de papiloma humano ou, se o doente estiver já infectado, para reforçar a resposta imunitária do próprio doente.
- 14. Método in vitro de produção de uma partícula semelhante a vírus ou capsómero de vírus de papiloma humano de acordo com a reivindicação 1, o método compreendendo a transfecção de uma célula com um vector de expressão recombinante contendo uma sequência de codificação da proteína de cápside Ll de HPV do tipo genital sob condições que facilitam a expressão da referida proteína de cápside, produzindo desse modo as referidas partículas semelhantes a vírus ou capsómeros.
- 15. Método de acordo com a reivindicação 14 em que o vector de expressão recombinante é um sistema de expressão de baculovírus.
- 16. Método de acordo com a reivindicação 15 em que a célula é uma célula de insecto.
- 17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a referida transfecção é realizada por infecção. ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 3/3
- 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, o método compreendendo: a clonagem da sequência de codificação da proteína de cápside Ll de HPV do tipo genital num vector de transferência de baculovírus; a co-transfecção de células de insecto com o referido vector de transferência de baculovírus e ADN genómico do vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica; a recuperação dos baculovírus recombinantes; e a infecção de células de insecto com o referido baculovírus recombinante sob condições que facilitam a expressão da referida proteína, produzindo desse modo partículas semelhantes a vírus. Lisboa, 2011-04-04 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 1/15ι- ι immr FIG.1B FIG.1A ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 2/15FIG.2 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 3/15 Α ABC 97- 69- L1 -46— Β 4 j» L1 ABC 30- FIG.3A FIG. 3Β ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 4/15X £ > 3; ι~ ωcc ΟItS®ο\;5/15FIG.5 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 6/15FIG.6 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 7/15EP 1 618 888/PT 8/15 SERO-REACTIVIDADE DE DOENTES DE CONDILOMA ACUMINADO A VLP DE Ll DE HPV-11 DOFíG.8 \ \ -L W / EP 1 618 888/PT 9/15 CORRELAÇÃO ENTRE AS SERQ-REACTIVIDADES A VIRIÕES E VLP DE Ll DE HPV-11 SERO—REACTIVIDADE A VLP DE Ll DE HPV-11FIG.9 ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 10/15ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 11/15FIG.UA F1G.11B ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 12/15 FIG.12AFIG.12B A Β 12 12 FIG.13A VLP ► WVP*- FIG:13R ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 13/15 5 è -1- 4 - E 3 ~-Θ- - g 1 α 0 Σ o 2 0 - (XI 1 0 -d&T. FIG A 8 C 300- 95- 69- W0J_L 3 k 14 30- FIG.15 21- ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 14/15FIG.16A FIG.16B FIG.16C ΕΡ 1 618 888/ΡΤ 15/15X οLLUJQ < ΟLl. UDο *4-<
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