ES2242955T3 - Produccion de la proteina de la capside del virus del papiloma humano y particulas de tipo viral. - Google Patents
Produccion de la proteina de la capside del virus del papiloma humano y particulas de tipo viral.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODOS PARA EXPRESAR LA SECUENCIA QUE CODIFICA LA PROTEINA DE CAPSIDA DE PAPILOMAVIRUS EN UNA CELULA QUE USA UN SISTEMA DE EXPRESION BAJO CONDICIONES QUE FACILITAN LA EXPRESION DE LA PROTEINA EN LA CELULA. EN OTRO ASPECTO DE LA INVENCION, SE HA DESCUBIERTO QUE SUS PARTICULAS DE VIRUS SIMILAR ((VLPS) FRAGMENTOS CAPSOMEROS O PARTES SE FORMAN A PARTIR DE LA PROTEINA DE CAPSIDA DE PAPILOMAVIRUS. TAMBIEN SE HA DESCUBIERTO QUE LAS PARTICULAS DE VIRUS SIMILAR COMPRENDEN CARACTERISTICAS ANTIGENICAS SIMILARES A LA DE LAS PARTICULAS DE PAPILOMAVIRUS INFECCIOSAS NATIVAS. EN UNA REALIZACION DE LA INVENCION, SE PREVE UN METODO PARA EXPRESAR LA PROTEINA DE CAPSIDA MAYOR L1 DE PAPILOMAVIRUS HUMANO DE TIPO 6 (HPV-6) Y DE TIPO 11 (HPV-11) EN CELULAS DE INSECTOS SF-9 QUE USAN EL SISTEMA DE EXPRESION DE BACULOVIRUS, Y LA PRODUCCION DE PARTICULAS DE VIRUS SIMILAR DE TIPO 6 (HPV-6), TIPO 11 (HPV-11), DE TIPO 16 (HPV-16) Y DE TIPO 18 (HPV-18).
Description
Producción de la proteína de la cápside del virus
del papiloma humano y partículas de tipo viral.
La presente solicitud es una continuación, en
parte de la Solicitud de Patente U.S. Nº de Serie 08/028.517,
registrada el 9 de marzo de 1993, ahora pendiente; y la Solicitud de
Patente U.S. Nº de Serie, "a asignar", registrada el 7 de marzo
de 1994, ahora pendiente.
El Gobierno de los Estados Unidos puede tener
algunos derechos en esta invención, de acuerdo con las
adjudicaciones AI-82509, AI-35159 y
CA-11198 del Public Health Service de los National
Institutes of Health.
La presente invención se refiere, en general, al
virus del papiloma (PV). Más concretamente, la invención tiene que
ver con un método para expresar la secuencia codificadora para la
proteína de la cápside del virus del papiloma humano tipo 6
(HPV-6) y tipo 11 (HPV-11),
utilizando el sistema de expresión de baculovirus, la producción de
partículas similares (VLPs) al virus HPV y el empleo de estas VLPs
en la producción de anticuerpos que reconozcan epítopos en el HPV, y
para el desarrollo de vacunas para el HPV, y para el desarrollo de
pruebas serológicas para la detección de la infección por HPV.
La familia Papovaviridae constituye un
grupo de virus de ADN que inducen infecciones líticas y tumores
benignos o malignos. Estructuralmente, todos son viriones
icosaédricos desnudos con 72 capsómeros, y contienen ADN circular
doble hélice. Los virus incluidos en la familia son: (1) virus del
papiloma humanos y animales, (2) virus del polioma del ratón, (3)
virus vacuolizante símico, y (4) virus BK y JC humanos.
Los virus del papiloma humanos (HPV) infectan los
epitelios cutáneo, genital, oral y respiratorio de una manera
tejido-específica. La infección con HPV ha estado
asociada fielmente con el desarrollo de lesiones benignas y
malignidades (Reichman y col., Papillomaviruses, 1990, págs.
1.191-1.200; y Mandell y col., Principles and
Practice of Infectious Diseases, 3rd Edition, Churchill
Livingstone, Nueva York, N.Y.). Por ejemplo, el HPV tipo 1
(HPV-1) está presente en verrugas plantares, el HPV
tipo 6 u 11 (HPV-6 o HPV-11) en
condylomata acuminata (verrugas anogenitales), mientras que
el HPV tipos 16 ó 18 (HPV-16 o
HPV-18) son frecuentes en lesiones premalignas y
malignas del epitelio escamoso del cérvix (ver Crum y col., "Human
papillomavirus infection and cervical neoplasia: New perspectives,
"1984, Int. J. Gynecol. Pathol., vol. 3, págs.
376-388; zur Hausen, Genital Papillomavirus
Infections, 1985, págs. 83-90; Rigby y col.,
Viruses and Cancer, Cambridge University Press, Cambridge,
UK; y Koutsky y col., "Epidemiology of genital human
papillomavirus infection", 1988, Epidemiol. Rev., vol. 10,
págs. 122-163).
Sin embargo, las dificultades para propagar el
HPV in vitro ha conducido al desarrollo de enfoques
alternativos para la producción de antígenos para estudios
inmunológicos. Por ejemplo, Bonnez y col., "The
PstI-XhoII restriction fragment of the
HPV-6b L1 ORF lacks immunological specificity as
determined by sera from HPV 6 condyloma acuminatum patients and
controls", 1990, UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., New Series,
vol. 124, págs. 77-80; Jenison y col.,
"Identification of immunoreactive antigens of human papillomavirus
type 6b by using Escherichia coli-expressed fusion
proteins", 1988, J. Virol., vol. 62, págs.
2.115-2.123; Li y col., "Identification of
the human papillomavirus type 6b L1 open reading frame protein in
condylomas and corresponding antibodies in human sera", 1987,
J. Virol., vol. 61, págs. 2.684-2.690; Steele
y col., "Humoral assays of human sera to disrupted and
nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1", 1990,
Virology, vol. 174, págs. 388-398; y Strike y
col., "Expression in Escherichia coli of seven DNA segments
comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human
papillomavirus type 6b and the location of the ``common
antigen''", 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs.
543-555, han expresado secuencias codificadoras para
la proteína de cápside recombinante en sistemas procariotas, y
utilizadas en análisis Western blot de sueros obtenidos a partir de
individuos con infección por HPV del tracto genital. Los resultados
de estos estudios han sugerido que los anticuerpos para epítopos
desnaturalizados, esto es, lineales, de proteínas de la cápside del
HPV pueden ser detectados en los sueros de algunos individuos
infectados.
También se han utilizado partículas de virus
completos para detectar anticuerpos en sueros humanos, incluyendo
anticuerpos dirigidos contra epítopos conformacionales. Estos
estudios han sido difíciles de conducir porque la mayoría de las
lesiones inducidas por HPV de origen natural producen pocas
partículas. Sin embargo, se pueden obtener partículas de virus
completos en cantidades suficientes, para conducir ensayos
inmunológicos, a partir de verrugas plantares inducidas por HPV tipo
1 (Kienzler y col., "Humoral and cell-mediated
immunity to human papillomavirus type 1 (HPV-1) in
human warts", 1983, Br. J. Dermatol., vol. 108, págs.
65-672; Pfister y col., "Seroepidemiological
studies of human papilloma virus (HPV-1)
infections", 1978, Int. J. Cancer, vol. 21, págs.
161-165; y Steele y col., "Humoral assays of human
sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus
type 1", 1990, Virology, vol. 174, págs.
388-398) y xenoinjertos en ratón atímico con
HPV-11 inducido experimentalmente (Kreider y col.,
"Laboratory production in vivo of infectious human
papillomavirus type 11", 1987, J. Virol., vol. 61, págs.
590-593; y Kreider y col., "Morphological
transformation in vivo of human uterine cervix with
papillomavirus from condylomata acuminata", 1985,
Nature, vol. 317, págs. 639-641). Más
concretamente, la Patente U.S. Nº 5.071.757 según Kreider y col.,
revela un método para propagar viriones infecciosos de
HPV-11 en el laboratorio utilizando un sistema de
modelos de xenoinjerto en ratón atímico. Aunque este sistema sea
capaz de producir cantidades de virus infeccioso que se pudieran
utilizar para el desarrollo de una prueba serológica para la
infección genital por HPV, este sistema es muy caro e incómodo.
Además, únicamente un tipo de HPV genital ha sido propagado hasta
aquí en este sistema, limitando de este modo su utilidad. Además, el
virus infeccioso producido utilizando este sistema representa un
riesgo biológico y, por lo tanto, sería difícil de utilizar en una
formulación para vacuna.
Zhou y col., en "Expression of vaccinia
recombinant HPV 16 L1 and L2 ORF proteins in epithelial cells is
sufficient for assembly of HPV virion-like
particles", 1992, Virology, vol. 185, págs.
251-257, han informado de la formación de partículas
similares al virus HPV 16, en núcleos de células
CV-1, después de la infección con un vector de
expresión recombinante doble de L1/L2 del virus vaccinia
HPV-16. Sin embargo, los autores no fueron capaces
de producir VLPs con un vector expresando únicamente L1. Además, las
VLPs producidas carecían de una simetría bien definida, y eran más
variables en tamaño y más pequeñas, solamente unos
35-40 nm de diámetro, que los viriones de HPV (55
nm) o las VLPs de la presente invención (VLPs de
HPV-11 producidas por baculovirus, unos 50 nm de
diámetro).
La Patente U.S. Nº 5.045.447 según Minson revela
un método para escrutar sobrenadantes de cultivos de hibridomas para
anticuerpos monoclonales con especificidades deseadas. El método de
Minson está ejemplificado por la producción de anticuerpos para la
proteína L1 del virus del papiloma humano tipo 16
(HPV-16), utilizando esta proteína como antígeno
diana en ratones. Sin embargo, Minson fracasa para revelar la
expresión de la proteína L1 o producción de partículas similares al
virus HPV (VLPs).
La Patente U.S. Nº 4.777.239 según Schoolnik y
col. revela secuencias peptídicas cortas derivadas de varios de los
marcos de lectura abiertos de la región temprana del virus del
papiloma, que obtienen anticuerpos tipo-específicos
para el virus del papiloma. Sin embargo, los inventores no tienen
éxito para revelar cualquier secuencia dirigida hacia el marco de
lectura abierto tardío principal, L1.
La Patente U.S. Nº 5.057.411 según Lancaster y
col. revela una secuencia polinucleotídica de unos 30 nucleótidos
del marco de lectura abierto de la proteína L1 de la cápside del
virus del papiloma, que los inventores afirman que codifica un
epítopo tipo-específico del virus del papiloma. Sin
embargo, los inventores no revelan animales infectados que produzcan
anticuerpos que reconozcan esta secuencia. En lugar de eso,
sintetizaron una versión de la secuencia (un péptido de 10
aminoácidos, o decapéptido) del virus del papiloma tipo 1 bovino
(BPV-1), después inmunizaron conejos y ensayaron la
capacidad del antisuero para reaccionar con tejido de fibropapiloma
inducido con BPV-1 o BPV-2. El
antisuero peptídico reacciona únicamente con el tejido de
BPV-1 y no con el de BPV-2. Después,
los inventores concluyeron que el péptido contenía un determinante
antigénico que era tipo-específico, y por lo tanto,
todas las secuencias codificadoras para L1 del virus del papiloma
contienen un epítopo tipo-específico en este punto.
Esta es una especulación teórica por parte de los inventores, que no
dan datos de soporte para esta hipótesis. Además, se cree, en
general, que las secuencias de aminoácidos reveladas (10
aminoácidos) no son capaces de adoptar estructuras antigénicas de
orden superior, esto es, epítopos conformacionales que posean una
estructura tridimensional tal como las producidas mediante el método
descrito aquí.
Otro problema asociado con las infecciones por el
virus del papiloma es la necesidad de modalidades terapéuticas y
profilácticas alternativas. Una de tales modalidades, que ha
recibido un pequeño estudio reciente, sería las vacunas para el
virus del papiloma. En 1944, Biberstein trató a pacientes con
condiloma acuminado con una vacuna autógena obtenida a partir de las
verrugas de los pacientes (Biberstein, "Immunization therapy of
warts", Arch. Dermatol Syphilol, 1944, vol. 50,
págs. 12-22). Después de eso, Powell y col.
desarrollaron la técnica típicamente utilizada hoy día para preparar
vacunas autógenas para verrugas, para el tratamiento del condiloma
acuminado (Powell y col., "Treatment of condylomata
acuminata by autogenous vaccine", 1970, South Med. J.,
vol. 63, págs. 202-205). Únicamente un estudio doble
ciego, controlado con placebo, ha intentado evaluar la eficacia de
la vacuna autógena (Malison y col., "Autogenous vaccine therapy
for condyloma acuminatum: A double-blind controlled
study", 1982, Br. J. Vener. Dis., vol. 58, págs.
62-65). Los autores concluyeron que la vacunación
autógena no fue eficaz en el tratamiento del condylomata
acuminata, aunque esta interpretación puede ser errónea. El
pequeño número de pacientes estudiados imposibilitó sacar
conclusiones negativas válidas. En todo caso, las vacunas autógenas,
como se describieron luego, tienen varias desventajas. En primer
lugar, el paciente necesita tener verrugas relativamente grandes (2
g a 5 g) para preparar la vacuna. En segundo lugar, el médico
general necesita acceso al equipo del laboratorio y habilidad cada
vez que se trata un nuevo paciente. De este modo, la preparación de
la vacuna es muy cara, tediosa, y no posible en casos que impliquen
una masa de lesión relativamente pequeña.
Desafortunadamente, los métodos tradicionales de
propagación del virus no han sido todavía adaptados al estudio de
virus del papiloma, y los métodos alternativos anteriormente
descritos fracasan para producir viriones infecciosos en cualquier
cantidad significativa para estudios inmunológicos. También, la
propagación in vivo del HPV-11 en un sistema
de ratón atímico no es muy práctica debido a que es caro, de mucha
mano de obra, y al mismo tiempo limitado al HPV-11.
Por consiguiente, se necesita un método alternativo para producir
epítopos de cápside del HPV para su uso en estudios inmunológicos y
producción de vacunas.
La presente invención está dirigida hacia un
método para expresar la secuencia codificadora para la proteína de
la cápside del virus del papiloma (PV) en una célula, comprendiendo
el transfectar la célula con un vector de expresión conteniendo la
secuencia codificadora para la proteína de la cápside del virus del
papiloma, bajo condiciones que faciliten la expresión de la proteína
en la célula.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
una partícula(s) similar a virus (VLPs), fragmento(s),
capsóme-
ro(s), o porción(s) del mismo, formados a partir de la proteína de la cápside del virus del papiloma. Se ha descubierto que la partícula(s) similar al virus consta de una característica(s) similar a la de partículas del virus del papiloma infeccioso nativo.
ro(s), o porción(s) del mismo, formados a partir de la proteína de la cápside del virus del papiloma. Se ha descubierto que la partícula(s) similar al virus consta de una característica(s) similar a la de partículas del virus del papiloma infeccioso nativo.
En una forma de realización preferida de la
invención, se proporciona un método para expresar la secuencia
codificadora para la proteína L1 de la cápside del virus del
papiloma humano tipo 6 (HPV-6) y tipo 11
(HPV-11) en células de insecto Sf-9,
utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Las secuencias
codificadoras para HPV-6 y HPV-11
fueron clonadas, utilizando técnicas estándar en la técnica, dentro
de un vector de transferencia de baculovirus. El vector de
transferencia de baculovirus resultante fue utilizado para
cotransfectar células de insecto Sf-9 con el virus
de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV),
formando un baculovirus recombinante (Ac6L1 o Ac11L1) que fue
recuperado. Después, las células de insecto Sf-9
fueron infectadas con Ac6L1 o Ac11L1 bajo condiciones que
facilitasen la expresión de la proteína en las células. Se descubrió
que la proteína L1 formaba partículas similares a virus (VLPs). Las
VLPs fueron identificadas mediante microscopía electrónica de
fracciones en bandas de sacarosa teñidas negativamente, obtenidas a
partir de células Sf-9 infectadas con el baculovirus
recombinante Ac11L1. Se descubrió además que las VLPs poseían
características inmunológicas y morfológicas similares a las de
viriones de HPV-11 nativos, como se definió mediante
antisueros de conejo.
La partícula(s) similar a virus, producida
según la invención, puede ser utilizada en ensayos diagnósticos,
puede jugar un papel en la identificación y caracterización de un
receptor celular del HPV, y puede ser utilizada para el desarrollo
de vacunas (terapéuticas y profilácticas). Se comprende que el
método de la invención descrito aquí para la producción de
HPV-11 y HPV-6 se puede utilizar
para producir reactivos inmunológicos similares de otros virus del
papiloma animales y/o humanos. Además, las VLPs producidas según la
invención proporcionarán abundantes reactivos con los que llevar a
cabo estudios inmunológicos de virus del papiloma, y para
desarrollar vacunas contra los virus del papiloma.
La Fig. 1A muestra gel de
poliacrilamida-SDS, teñido con azul Coomassie, de
lisados celulares Sf-9 infectados con AcNPV salvaje
y Ac11L1 recombinante.
La Fig. 1B muestra un Western blot de lisados
celulares Sf-9 infectados con AcNPV salvaje y Ac11L1
recombinante, investigados con antisuero policlonal de conejo
específico para el epítopo común de L1 del HPV.
La Fig. 2 muestra una micrografía electrónica de
partículas similares al virus HPV-11, recuperadas
por centrifugación en densidad de sacarosa a partir de células
Sf-9 infectadas con Ac11L1. Las VLPs mostradas son
de aproximadamente 52 nm de diámetro (escalado mediante patrones de
amplificación) y poseen simetría icosaédrica, coherentes con
observaciones publicadas con respecto a las características
morfológicas de viriones del papiloma de origen natural.
La Fig. 3 muestra comparaciones de Western blot e
inmunodot blot de las inmunorreactividades de antisueros de conejo
con L1 recombinante. En el panel A, el lisado de células de insecto
de L1 recombinante fue analizado mediante Western blot bajo
condiciones desnaturalizantes. En el panel B, se aplicaron lisados
de células de insecto de L1 (L1) no recombinante (+) o recombinante
a una membrana de transferencia bajo condiciones no
desnaturalizantes. Las tiras A fueron investigadas con un antisuero
policlonal de conejo específico para el epítopo común de L1 del HPV;
las tiras B fueron investigadas con un antisuero policlonal de
conejo específico para la secuencia de aminoácidos
amino-terminal de L1 del HPV; las tiras C fueron
investigadas con un antisuero policlonal de conejo para las
partículas virales completas.
La Fig. 4 muestra un ensayo Western blot
utilizando lisados de células de insecto de L1 recombinante. Las
tiras A-X corresponden a diferentes anticuerpos
primarios utilizados (las tiras A y B fueron hechas reaccionar con
antisueros preinmunes y postinmunes de conejo
anti-partículas virales completas, respectivamente;
la tira C fue hecha reaccionar con antisuero postinmune de conejo
anti-epítopo común de L1 desnaturalizado; las tiras
D-O fueron hechas reaccionar con sueros de pacientes
con condiloma acuminado; las tiras P-X fueron hechas
reaccionar con sueros de
control).
control).
La Fig. 5 muestra un ensayo inmunodot blot
utilizando lisados celulares de insecto. Las letras de arriba de las
tiras corresponden a diferentes anticuerpos primarios utilizados,
los cuales fueron los mismos descritos en la Fig. 4.
La Fig. 6 es una micrografía electrónica de VLPs
del HPV tipo 6, producidas mediante la construcción y expresión de
un baculovirus recombinante de L1 del HPV-6
(Ac6L1).
La Fig. 7 es una micrografía electrónica de VLPs
del HPV tipo 6, producidas mediante la construcción y expresión de
un baculovirus recombinante de L1 del HPV-6
(Ac6L1).
La Fig. 8 muestra la serorreactividad de
pacientes con condiloma acuminado hacia VLPs de L1 del
HPV-11.
La Fig. 9 muestra la correlación entre las
serorreactividades hacia viriones y VLPs del
HPV-11.
La Fig. 10(a) muestra un Western blot
(panel izquierdo) de las proteínas L1 del HPV-11
(Tira 2) y L1 del HPV-16 (Tira 3). Los marcadores
moleculares de referencia están a la izquierda, la flecha indica las
posiciones aproximadas de las proteínas L1 recombinantes del
HPV-11 y HPV-16.
La Fig. 10(b) es un inmunodot blot (panel
derecho) donde la Tira 1: AcNPV (muestra infectada con baculovirus
salvaje); Tira 2: Ac11L1 (muestra infectada con Ac11L1
recombinante); Tira 3: Ac16L1 (muestra infectada con Ac16L1
recombinante).
La Fig. 11 muestra la detección con
SDS-PAGE y Western inmunoblot de L1 recombinante del
HPV-11 en el sobrenadante del cultivo de células
Sf-9 infectadas con Ac11L1 [Panel A:
SDS-PAGE (teñido con Coomassie); Panel B: Western
blot utilizando el suero de antígenos comunes PVL1; Tira 1: gránulo
a alta velocidad del sobrenadante de cultivo celular infectado con
AcNPV; Tira 2: gránulo a alta velocidad del sobrenadante de cultivo
celular Sf-9 infectado con Ac11L1; los marcadores de
peso molecular (M_{r}) están a la izquierda; la flecha a la
derecha representa la posición de L1 recombinante de 55 kD de
M_{r}).
La Fig. 12 muestra un análisis microscópico
electrónico de preparaciones de VLPs brutas y purificadas con ClCs
(A - VLPs granuladas a partir de sobrenadante del cultivo sin
células Sf-9 infectadas con Ac11L1; B - VLPs
purificadas con ClCs, barra = 50 nm).
La Fig. 13 muestra un análisis inmunodot blot de
VLPs recombinantes purificadas y viriones completos de
HPV-11 (Tira 1: sueros preinmunes, tira 2: sueros
postinmunes; A - Conejo R-366, inmunizado con
viriones completos de HPV-11 purificados; B - Conejo
R-399, inmunizado con VLPs de HPV-11
purificadas; Antígenos: VLP (partículas similares a virus de L1 del
HPV-11); WVP (partículas virales completas de
HPV-11)].
La Fig. 14 muestra un análisis dotplot de los
diámetros medios geométricos (GMD) de xenoinjertos.
La Fig. 15 muestra un inmunoensayo Western blot
de preparaciones de VLPs purificadas de HPV-11,
HPV-16 y HPV-18 (Tira A: VLPs de L1
del HPV-11; tira B, VLPs de L1 del
HPV-16; tira C, VLPs de L1 del HPV-
18).
18).
La Fig. 16 (A-C) muestra una
micrografía electrónica de VLPs purificadas con cloruro de cesio,
obtenidas del HPV tipos 11, 16 y 18. Las VLPs fueron purificadas
como se describe en la especificación, y teñidas negativamente con
ácido fosfotúngstico al 2%. A) VLPs de L1 del
HPV-11; B) VLPs de L1 del HPV-16; C)
VLPs de L1 del HPV-18; las barras corresponden a 100
nm.
La Fig. 17 muestra las inmunorreactividades de
antisueros postinmunes de conejo de VLPs, con preparaciones de VLPs
homólogas y heterólogas. Antígenos: VLPs de L1 del
HPV-11, barras blancas; VLPs de L1 del
HPV-16, barras punteadas; VLPs de L1 del
HPV-18, barras negras. Antisueros: A) antisuero de
conejo anti-antígeno común PVL1; B) antisuero de
conejo de viriones completos de HPV-11; C, D) de dos
conejos inmunizados con VLPs de L1 del HPV-11; E, F)
de dos conejos inmunizados con VLPs de L1 del
HPV-16; G, H) de dos conejos inmunizados con VLPs de
L1 del HPV-18.
La presente invención está dirigida hacia un
método para expresar la secuencia codificadora para la proteína de
la cápside del virus del papiloma en una célula, utilizando el
sistema de expresión de baculovirus bajo condiciones que faciliten
la expresión de la proteína en la célula. En otro aspecto de la
invención, se ha descubierto que una partícula(s)
similar a virus (VLPs), fragmento(s), capsómero(s), o porción del mismo, se forma a partir de la proteína de la cápside del virus del papiloma. Se ha descubierto además que la partícula(s) similar al virus consta de características antigénicas similares a las de partículas infecciosas nativas de virus del papiloma.
similar a virus (VLPs), fragmento(s), capsómero(s), o porción del mismo, se forma a partir de la proteína de la cápside del virus del papiloma. Se ha descubierto además que la partícula(s) similar al virus consta de características antigénicas similares a las de partículas infecciosas nativas de virus del papiloma.
Como se utiliza aquí, "partícula(s)
similar a virus (VLPs)" se refiere a una partícula(s)
similar al virus, fragmen-
to(s), capsómero o porción(s) del mismo, producidos a partir de la secuencia codificadora de la proteína del cápside de virus del papiloma, y comprendiendo una característica(s) antigénica similar a la de partículas infecciosas de virus del papiloma. Como se utiliza aquí, "característica(s) antigénica(s)" se refiere a (1) la capacidad de la partícula(s) similar a virus a reaccionar cruzadamente con partículas salvajes (partículas infecciosas nativas del virus del mismo tipo de HPV) como se determina mediante antisueros generados en animales y/o humanos por inmunización con VLPs o virus infeccioso; y/o (2) la capacidad para reconocer o detectar anticuerpos en sueros humanos de personas conocidas por estar infectadas con un virus homólogo.
to(s), capsómero o porción(s) del mismo, producidos a partir de la secuencia codificadora de la proteína del cápside de virus del papiloma, y comprendiendo una característica(s) antigénica similar a la de partículas infecciosas de virus del papiloma. Como se utiliza aquí, "característica(s) antigénica(s)" se refiere a (1) la capacidad de la partícula(s) similar a virus a reaccionar cruzadamente con partículas salvajes (partículas infecciosas nativas del virus del mismo tipo de HPV) como se determina mediante antisueros generados en animales y/o humanos por inmunización con VLPs o virus infeccioso; y/o (2) la capacidad para reconocer o detectar anticuerpos en sueros humanos de personas conocidas por estar infectadas con un virus homólogo.
Como se utiliza aquí, "secuencia codificadora
para la proteína L1" o "secuencia codificadora para la proteína
L1 de la cápside" se refiere al marco de lectura abierto que
codifica para la proteína L1 en el virus del papiloma. Cuando se
expresa, la secuencia codificadora para la proteína L1 produce una
proteína, o complejo proteico, o agregado, que posee características
inmunológicas y morfológicas similares a las de viriones nativos de
virus del papiloma. La secuencia codificadora para L1 utilizada en
la invención puede ser aislada y purificada a partir de ADN genómico
de virus del papiloma, o sintetizada utilizando técnicas clásicas de
ingeniería genética.
\newpage
Como se utiliza aquí, el término
"transfectar" se refiere a cualquier medio para introducir un
virus, plásmido o vector dentro de una célula. Ejemplos de tales
medios incluyen la infección, precipitación con fosfato cálcico, y
electroporación.
En una forma de realización preferida de la
invención, se proporciona un método para expresar la secuencia
codificadora para la proteína L1 de la cápside del virus del
papiloma humano tipo 11 (HPV-11), o del virus del
papiloma humano tipo 6 (HPV-6), en células de
insecto Sf-9, utilizando el sistema de expresión de
baculovirus. Se comprende que las secuencias codificadoras para las
proteínas de la cápside de estos tipos de HPV sean utilizadas
únicamente con fines de ilustración, y que se puede utilizar
cualquier secuencia codificadora para la proteína L1 de la cápside
para cualquier tipo de virus del papiloma animal o humano, sin
desviarse del ámbito de aplicación pretendido de la invención. Tales
tipos de HPV incluyen, sin limitación, los tipos 16, 18, 31, 33, 35
del HPV (Gissman y col., Cancer Cells, 1987, vol. 5, pág.
275, cuya revelación está incorporada por este medio mediante
referencia); y aquellos tipos de HPV revelados en la publicación PCT
nº WO 92/16636 según Boursnell y col., cuya revelación está
incorporada por este medio mediante referencia.
El sistema de expresión preferido utilizado en el
método de la invención es el sistema de expresión de baculovirus,
sin embargo, se entiende que se pueda emplear aquí cualquier otro
tipo de sistema(s) de expresión siempre que el
sistema(s) pueda expresar la secuencia codificadora para la
proteína L1. Ejemplos de tales sistemas incluyen, sin limitación,
cualquier sistema(s) procariota y/o eucariota abarcando
adenovirus, SV40, E. coli, células CHO, virus vaccinia,
virus de insectos, levadura, virus bacteriófago o virus modificados,
plásmidos de ADN, vectores y otros. La célula huésped para la
expresión de la secuencia codificadora para L1 depende del sistema
de expresión utilizado. Ejemplos de células huésped apropiadas
incluyen, sin limitación, bacterias (procariotas), microorganismos
tales como levadura, células mamíferas (eucariotas) y células de
insecto. Cuando se utiliza el sistema de expresión de baculovirus,
se prefieren células de insecto tales como las Sf-9
o Sf-21.
En otro aspecto de la invención, se descubrió que
la proteína L1 produce partículas similares a virus (VLPs),
fragmento(s), capsómero(s) o porción(s) del
mismo, formados a partir de proteína de la cápside del virus del
papiloma. Se ha descubierto que la partícula(s) similar a
virus consta de una característica(s) antigénica similar a la
de partículas infecciosas nativas del virus del papiloma. Más
concretamente, estas VLPs contienen un determinante antigénico que
es específicamente identificado por anticuerpos presentes en sueros
obtenidos de pacientes infectados con HPV genital. Por ejemplo, la
reacción de extractos de células de insecto conteniendo VLPs, con
antisueros dirigidos contra epítopos desnaturalizados o no
desnaturalizados de la cápside, como se dedujo por las
inmunorreactividades en ensayos Western blot e inmunodot blot,
sugirió que los epítopos conformacionales presentes en viriones
infecciosos nativos de HPV-11 también estaban
presentes en las VLPs de HPV-11, producidas por
baculovirus, de la presente invención. Los ensayos inmunodot blot
que utilizan sueros humanos obtenidos de individuos con condiloma
acuminado confirmado por biopsia, se correlacionan fielmente con los
resultados previamente obtenidos en ensayos ELISA basados en
partículas virales completas de HPV-11, como se
describió por Bonnez y col., "Use of human papillomavirus type 11
virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with
condylomata acuminata", 1991, J. Gen. Virol., vol.
72, págs. 1.343-1.347, cuya revelación está
incorporada por este medio mediante referencia.
Estas similitudes morfológicas e inmunológicas
hacia los viriones nativos de HPV-11 sugieren que
las VLPs recombinantes, producidas en el sistema de baculovirus,
serán útiles en estudios de seroepidemiología y de patogénesis de no
únicamente la infección genital por HPV, sino para cualquier virus
del papiloma y para el desarrollo de vacunas. La L1 tiene la
capacidad intrínseca de autoensamblaje. De este modo, no son
necesarias otras proteínas del virus del papiloma para la formación
de VLPs en el sistema de baculovirus. Esto respalda la contienda de
que se pueden producir VLPs para todos los tipos de virus del
papiloma según el método descrito aquí.
Las VLPs de la invención pueden ser utilizadas
para producir anticuerpos en sujetos para los que se desea
protección contra la infección por HPV, eso es, vacunas, o para
intensificar la respuesta inmunológica hacia una infección por HPV
ya presente. Las VLPs de la invención pueden ser inyectadas en
especies animales para obtener antisueros útiles en diagnosis.
Además de antisueros policlonales, se pueden obtener anticuerpos
monoclonales utilizando los métodos de Kohler y Milstein, o por
modificación de los mismos, o inmortalizando células del bazo o
productoras de anticuerpos, a partir de animales inyectados para
obtener clones productores de anticuerpos, esto es,
hibridomas.
hibridomas.
Los anticuerpos obtenidos se pueden utilizar para
diagnosis de la infección por HPV en biopsias de cérvix o frotis de
Papanicolau, y para valorar los niveles de enfermedad en humanos u
otros sujetos. En particular, la diagnosis utilizando los
anticuerpos de la invención permite supervisar la evolución de la
enfermedad. Los anticuerpos se pueden utilizar en análisis de suero
para detectar el virus, así como para supervisar el progreso de la
terapia con agentes antivirales u otros terapéuticos dirigidos para
el control de la infección o carcinoma. Los anticuerpos también se
pueden utilizar como terapia pasiva, teniendo en cuenta las
variaciones de las especies.
Las VLPs de la invención pueden ser utilizadas en
inmunoensayos para detectar la presencia de anticuerpos producidos
contra el HPV en el suero de pacientes sospechosos de abrigar
infecciones por HPV, o para titular los sueros de pacientes siendo
tratados con una vacuna anti-HPV.
Las VLPs de la invención pueden ser directamente
administradas a un huésped para inducir la formación de anticuerpos
neutralizantes (Bonnez y col., 1992, citado aquí en otra parte; y
Rose y col., en prensa, citado aquí en otra parte, cuyas menciones
están incorporadas por este medio mediante referencia), para otorgar
inmunidad protectora contra el HPV o, si el paciente está ya
infectado, estimular la propia respuesta inmunológica del paciente.
Para todas las aplicaciones, las VLPs son administradas en forma
inmunogénica. Opcionalmente, las VLPs pueden estar conjugadas con un
material soporte que le confiera inmunogenicidad, siendo el
material, preferentemente, antigénicamente neutro. Dependiendo del
uso requerido, las VLPs de la invención tienen la capacidad de
servir como vacunas tipo-específicas o de amplio
rango y como diagnósticos.
Las VLPs que sean para administrar como vacunas
pueden ser formuladas según métodos convencionales y/o futuros para
tal administración al sujeto a proteger, y se pueden mezclar con
adyuvantes convencionales. El péptido expresado se puede utilizar
como inmunógeno en formulaciones de vacunas subunidad, las cuales
pueden ser multivalentes. La formulación de vacunas multivalentes
puede comprender VLPs cada una codificando una proteína L1 diferente
de distintos HPVs. El producto puede ser purificado con el fin de
formulación de vacunas a partir de cualquier sistema vector/huésped
que exprese la proteína heteróloga. Las VLPs purificadas deberían
ser ajustadas a una concentración apropiada, formuladas con algún
adyuvante de vacunas apropiado, y envasada para su uso. Los
adyuvantes adecuados abarcan, pero no se limitan a: geles minerales,
por ejemplo, hidróxido de aluminio; sustancias tensoactivas tales
como lisolecitina, polioles Pluronic; polianiones; péptidos;
emulsiones oleosas; y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales
como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) y
Cornebacterium parvum. El inmunógeno también puede ser
incorporado en liposomas, o conjugado con polisacáridos y/u otros
polímeros para su uso en una formulación de vacunas. Se pueden
utilizar muchos métodos para introducir las formulaciones de vacunas
descritas anteriormente; estos abarcan, pero no se limitan a, vías
oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa,
subcutánea e intranasal. Si son utilizadas directamente como
reactivos diagnósticos, son purificadas utilizando métodos
convencionales y envasadas conforme a tal empleo. Si son utilizadas
para producir anticuerpos con fines diagnósticos, se pueden utilizar
animales de ensayo apropiados para preparar los antisueros
adecuados. Los huéspedes apropiados abarcan ratones, ratas, conejos,
cobayas, o incluso mamíferos más grandes tales como ovejas. Los
anticuerpos pueden ser utilizados terapéuticamente con tal que sean
compatibles con el huésped a tratar. Para esta aplicación, se
prefieren anticuerpos monoclonales que tengan las características
apropiadas de las
especies.
especies.
Los Ejemplos siguientes se proporcionan para
ilustrar adicionalmente la presente invención.
Se obtuvo ADN genómico de HPV-11
a partir de partículas de virus que fueron purificadas de
xenoinjertos en ratón atímico inducidos experimentalmente, como se
describió por Rose y col., "Expression of the
full-length products of the HPV-6b
and HPV-11 L2 open reading frames by recombinant
baculovirus, and antigenic comparisons with HPV-11
whole virus particles", 1990, J. Gen. Virol., vol. 71,
págs. 2.725-2.729, cuya revelación está incorporada
mediante referencia. La secuencia codificadora para L1 fue clonada
mediante amplificación por PCR de ADN genómico purificado,
utilizando cebadores diseñados para introducir sitios de las enzimas
de restricción Bg/II y EcoRI en los extremos 5' y 3',
respectivamente. Las secuencias de los cebadores directo e inverso
fueron, respectivamente, 5'-CGC AGA TCT
ATG TGG CGG CCT AGC-3' y
5'-CAT ATG AAT TCC CAC AAC ACA CTG ACA
CAC-3'. Los sitios de restricción (subrayados)
fueron introducidos proximales al supuesto codon de inicio de L1
(texto en negrita), y aproximadamente 30 nucleótidos por debajo del
supuesto codon de parada de L1, mediante mutagénesis dirigida con
cebadores. La amplificación fue realizada, esencialmente, como se
describe por Bonnez y col., "Antibody-mediated
neutralization of human papillomavirus type 11
(HPV-11) infection in the nude mouse: Detection of
HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction",
1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380,
cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia,
utilizando 500 ng de cada cebador y 2 unidades de Taq ADN
polimerasa (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus Corp.,
Norwalk, CT). Después de la amplificación, el producto PCR fue
digerido con Bg/II y EcoRI. El producto de digestión de 1.539 pares
de bases (pb), que contenía el marco de lectura abierto (ORF)
completa de L1 de HPV-11, fue purificado mediante
electroforesis en gel de agarosa como se describe por Rose y col.,
"Expression of the full-length products of the
HPV-6b and HPV-11 L2 open reading
frames by recombinant baculovirus, and antigenic comparisons with
HPV-11 whole virus particles", 1990, J. Gen.
Virol., vol. 71, págs. 2.725-2.729, cuya
revelación está incorporada por este medio mediante referencia, y
clonado dentro de los sitios correspondientes de un vector de
transferencia de baculovirus, pVL-1392 (M.D.
Summers, Texas A&M University, College Station, TX). La
construcción resultante, pVL11L1, fue utilizada para cotransfectar
células Sf-9 con ADN genómico del virus de la
polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) según los
métodos de Summers y col., A Manual of Methods for Baculovirus
Vectors and Insect Cell Culture Procedures, 1987, Texas A&M
University, College Station, Texas, cuya revelación está incorporada
por este medio mediante referencia. Los baculovirus recombinantes
fueron recuperados mediante examen visual y selección de las placas
con oclusión negativa (occ-), y fueron sometidos a dos rondas
adicionales de purificación en placa según los métodos de Summers y
col., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell
Culture Procedures, 1987, Texas A&M University, College
Station, Texas, cuya revelación está incorporada por este medio
mediante referencia. La expresión de la proteína, a partir de
soluciones madre de virus aislados, fue determinada mediante Western
blot.
Se cultivaron células Sf-9
infectadas en matraces con 150 cm^{2} de cultivo tisular, y se
prepararon para el ensayo analítico SDS-PAGE y
Western blot. Las células infectadas con L1 recombinante o no
recombinante fueron recolectadas de los matraces mediante
resuspensión con una pipeta Pasteur, e igual número de células
infectadas con L1 salvaje o recombinante fueron centrifugadas a
500xg, durante 10 minutos a 4ºC. Se extrajeron los sobrenadantes y
los gránulos de células fueron transferidos a hielo, resuspendidos
inmediatamente en 1 ml de tampón de lisis [Tris 30 mM, pH 7'6;
Cl_{2}Mg 10 mM; Cl_{2}Ca 1 mM; fluoruro de fenilmetilsulfonilo
1 mM (PMSF); leupeptina (10 \mug/ml); 1% de NP-40]
y dejados estar a temperatura ambiente durante 15 minutos, con
agitación con remolino periódica. Después de la centrifugación a
500xg durante 2 minutos a 4ºC, se extrajo la fracción soluble en
NP-40 contenida en el sobrenadante, y se diluyó 1:1
con tampón de muestra Laemmli 2x, como se describió por Laemmli,
"Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of the bacteriofage T4", 1970, Nature, vol. 277, págs.
680-685, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia, y se calentó a 95ºC durante 3 minutos. El
gránulo insoluble en NP-40 (conteniendo materia
nuclear) fue lavado una vez con PBS frío (PMSF 1 mM; 10 \mug/ml de
leupeptina) y solubilizado mediante ebullición y agitación con
remolino en tampón Laemmli 1x. Las muestras fueron sometidas a
electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida al
10%, seguido por tinción con azul Coomassie (Fig. 1, panel A) o
transferencia (Fig. 1, panel B) a una membrana
Immobilon-P (Millipore Corp., New Bedford, MA) como
se describió por Rose y col., "Expression of the
full-length products of the HPV-6b
and HPV-11 L2 open reading frames by recombinant
baculovirus, and antigenic comparisons with HPV-11
whole virus particles", 1990, J. Gen. Virol., vol. 71,
págs. 2.725-2.729, cuya revelación está incorporada
por este medio mediante referencia.
Estos ensayos fueron realizados utilizando
diluciones de soluciones madre de sobrenadante clarificadas (alta
velocidad), preparadas a partir de extractos de células de insecto
infectadas con AcNPV o Ac11L1. Los cultivos de la suspensión (100
ml) de células Sf-9, infectadas con AcNPV o Ac11L1 a
una multiplicidad aproximada de infección de 10 unidades formadoras
de placa por célula, fueron incubados a 27ºC durante 72 horas.
Después, se centrifugaron los cultivos a 1.000xg durante 10 minutos
a 4ºC, y los gránulos de células fueron resuspendidos en 20 ml de
tampón de homogenización (tampón de lisis con ClNa 1M), y
homogeneizados con 50 golpes en un homogenizador Dounce en
hielo.
Los homogenados fueron transferidos a tubos Corex
fríos de 30 ml, con tapa de rosca, y centrifugados a 3.000 xg
durante 10 minutos a 4ºC. Las fracciones de sobrenadante de baja
velocidad fueron transferidas después a un tubo limpio y
centrifugadas a 100.000xg durante 30 minutos a 4ºC. Se midieron las
concentraciones de proteína total de las fracciones de sobrenadante
de alta velocidad, mediante absorción espectrofotométrica a 280 nm,
según el procedimiento de Stoscheck, "Quantitation of
proteins", 1990, en Methods in Enzymology, vol. 182, pág.
54, Academic Press Inc., Nueva York, cuya revelación está
incorporada por este medio mediante referencia, y ajustas hasta
equivalencia con tampón de homogenización reciente (concentraciones
de proteína aproximadamente iguales a 30 mg/ml). Se añadió glicerol
hasta el 10%(v/v), y las soluciones madre repartidas en partes
iguales y almacenadas a -20ºC.
Se utilizaron los ensayos Western blot e
inmunodot blot para determinar las especificidades de los
anticuerpos contra epítopos lineales y conformacionales en
antisueros de conejo y sueros humanos. Los ensayos Western blot
(Fig. 3, panel A, y Fig. 4) se realizaron utilizando 2 \mul
(aproximadamente 60 \mug de proteína total) de solución madre de
L1 recombinante diluida 1:100 con tampón de muestra Laemmli 1x, el
cual contiene reactivos para desnaturalización de proteínas como se
describió por Laemmli, "Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of the bacteriofage T4", 1990,
Nature, vol. 277, págs. 680-695, cuya
revelación está incorporada por este medio mediante referencia, y
calentados a 95ºC durante 3 minutos. La muestra desnaturalizada fue
cargada en un único pocillo de muestras de 100 mm de ancho, sometida
a electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al
10%, y transferidas a una membrana Immobilon-P.
Después de bloquear con una solución de BSA al 2% (Kirkegaard and
Perry Labs Inc., Gaithersburg, MD) durante 2 horas a 37ºC, se rebanó
la membrana en tiras de 24'4 mm de ancho, conteniendo cada una
aproximadamente 2'5 \mug de proteína total. Después de eso, las
tiras fueron investigadas con antisueros (Fig. 3, panel A, y Fig.
4).
Para análisis inmunodot blot, las soluciones
madre de L1 recombinante o no recombinante fueron diluidas 1:1.000
con PBS frío (Cl_{2}Ca 1 mM), y se transfirieron alícuotas de 100
\mul (conteniendo aproximadamente 3'0 \mug de proteína total)
sobre una membrana Immobilon-P. De la preparación de
las muestras para inmunodot blot se suprimieron los reactivos de
desnaturalización de proteínas para conservar la conformación nativa
de la L1 recombinante. El bloqueo, las soluciones diluyentes de
anticuerpos primarios y secundarios, los lavados, y el sustrato
utilizado son como se describió por Strike y col., "Expression in
Escherichia coli of seven DNA segments comprising the
complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type
6b and the location of the ``common antigen''", 1989, J. Gen.
Virol, vol. 70, págs. 543-555, cuya revelación
está incorporada por este medio mediante referencia. Las
incubaciones de los anticuerpos primarios se realizaron durante la
noche a 4ºC, las incubaciones de los anticuerpos secundarios se
hicieron a temperatura ambiente durante 90 minutos. Todas las
soluciones para los inmunodot blots, excepto la solución de
sustrato, contenían Cl_{2}Ca a 1 mM. Las diluciones de anticuerpos
primarios fueron 1:2.000 para antisueros de conejo, y 1:1.000 para
sueros humanos. Los anticuerpos unidos específicamente fueron
detectados con conjugados anti-IgG de conejo
(Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) o humana
(TAGO Immunodiagnostics, Burlingame,
CA) con fosfatasa alcalina, purificados por afinidad, utilizados a diluciones de 1:2.000 y 1:5.000, respectivamente, utilizando BCIP/NBT (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.) como sustrato. Las reacciones de los inmunodot blots fueron valoradas mediante comparación visual de las intensidades de los puntos de la L1 recombinante o no recombinante. Una reacción fue considerada positiva si la intensidad de color del punto de la L1 recombinante era mayor que la intensidad de color del punto de control no recombinante presente en la misma tira.
CA) con fosfatasa alcalina, purificados por afinidad, utilizados a diluciones de 1:2.000 y 1:5.000, respectivamente, utilizando BCIP/NBT (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.) como sustrato. Las reacciones de los inmunodot blots fueron valoradas mediante comparación visual de las intensidades de los puntos de la L1 recombinante o no recombinante. Una reacción fue considerada positiva si la intensidad de color del punto de la L1 recombinante era mayor que la intensidad de color del punto de control no recombinante presente en la misma tira.
El antisuero para L1 desnaturalizada utilizado
fue descrito anteriormente como anti-pEX480 por
Strike y col., "Expression in Escherichia coli of seven DNA
segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of
human papillomavirus type 6b and the location of the ``common
antigen''", 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs.
543-555, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia. Este antisuero fue obtenido por
inmunización de conejos con una proteína de fusión expresada
bacterialmente, purificada en gel, que contenía una secuencia de 160
aminoácidos derivada de la región media del marco de lectura
abierto, de L1 de HPV-6b, fusionado al
carboxi-terminal de la betagalactosidasa, como se
describió por Stanley y col., "Construction of a new family of
high efficiency bacterial expresión vectors: Identification of cDNA
clones coding for human liver proteins", 1984, EMBO. J.,
vol. 3, págs. 1.429-1.434; y Strike y col.,
"Expression in Escherichia coli of seven DNA segments
comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human
papillomavirus type 6b and the location of the ``common
antigen''", 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs.
543-555, cuyas revelaciones están incorporadas por
este medio mediante referencia. Esta secuencia contiene el antígeno
común de L1 de virus del papiloma, como se describió por Strike y
col., "Expression in Escherichia coli of seven DNA segments
comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human
papillomavirus type 6b and the location of the ``common
antigen''", 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs.
543-555, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia. El antisuero de conejo para partículas
virales completas utilizado fue como se describió por Bonnez y col.,
"Antibody-mediated neutralization of human
papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the
nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the
polymerase chain reaction", 1992, J. Inf. Dis., vol. 165,
págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia, y producido por inmunización de
conejos con viriones HPV-11 no desnaturalizados
purificados, los cuales fueron obtenidos a partir de xenoinjertos de
prepucio en ratón atímico según Bonnez y col.,
"Antibody-mediated neutralization of human
papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the
nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the
polymerase chain reaction", 1992, J. Inf. Dis., vol. 165,
págs. 376-380; y Kreider y col., "Laboratory
production in vivo of infectious human papillomavirus type
11", 1987, J. Virol., vol. 61, págs.
590-593, cuyas revelaciones están incorporadas por
este medio mediante referencia. Los sueros de los pacientes fueron
obtenidos de individuos con condiloma acuminado confirmado por
biopsia. Las muestras de suero previamente descubiertas positivas
mediante ELISA basado en partículas virales completas de
HPV-11, como se describió por Bonnez y col., "Use
of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect
specific antibodies in humans with condylomata acuminata",
1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs.
1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia, fueron utilizados para maximizar la
capacidad para detectar anticuerpos dirigidos contra VLPs. Los
sueros de control se obtuvieron de monjas que no profesaban ningún
contacto sexual en mucho tiempo. Estos sueros fueron negativos para
anticuerpos para HPV-11, como se determinó por el
ELISA basado en partículas de HPV-11 descrito por
Bonnez y col., "Use of human papillomavirus type 11 virions in an
ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata
acuminata", 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs.
1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia.
Se purificaron VLPs recombinantes directamente
del sobrenadante, de cultivos sin células, de cultivos en suspensión
de células Sf-9 infectadas con Ac11L1, mediante una
serie de etapas de centrifugación a baja y alta velocidad. Las
células Sf-9 infectadas fueron granuladas a partir
de un cultivo en suspensión de 200 ml a baja velocidad (1.000xg), y
se centrifugó nuevamente el sobrenadante sin células a alta
velocidad (100.000xg) durante 90 minutos a 4ºC. El gránulo de alta
velocidad fue resuspendido en tampón A (Tris 50 mm, pH 8'0; ClNa 1M;
Cl_{2}Mg 10 mM, Cl_{2}Ca 10 mM; fluoruro de fenilmetilsulfonilo
1 mM (PMSF) 2 mM; 10 \mug/ml de leupeptina), se añadieron 5'2 g de
ClCs sólido, y se ajustó el volumen final a un total de 13 ml con
tampón A reciente (0'4 g/ml de concentración final). Después de
centrifugación (100.000xg, 22 horas, 10ºC), la única banda obtenida
fue extraída y diluida con 12 ml de tampón A reciente (sin CLCC) y
centrifugada nuevamente (100.000xg, 90 minutos, 4ºC) para granular
VLPs purificadas. Las VLPS purificadas mediante centrifugación en
gradiente en densidad de sacarosa fueron identificadas por
microscopía electrónica después de tinción con ácido fosfotúngstico
tamponado neutro al 2% (Figs. 2, 6, y 7).
El análisis SDS-PAGE de las
proteínas totales de células Sf-9, a partir de
células de insecto infectadas con el virus recombinante Ac11L1,
demostró una nueva proteína de 55 kD, vista por tinción con azul
Coomassie, en células infectadas con Ac11L1 (Fig. 1A, tira 3). Con
referencia a las Figuras 1 (A y B), la Fig. 1A muestra gel de
poliacrilamida-SDS, teñido con azul Coomassie, de
lisados de células Sf-9 infectadas con AcNPV salvaje
y Ac11L1 recombinante; y la Fig. 1B muestra un Western blot de
lisados de células Sf-9 infectadas con AcNPV salvaje
y Ac11L1 recombinante, investigados con un antisuero policlonal de
conejo específico para el epítopo común de L1 de HPV. Los lisados de
células Sf-9 infectadas con L1 no recombinante
(tiras 1, 2) y recombinante (tiras 3, 4) fueron fraccionados en
fracciones insolubles (tiras 1, 3) y solubles (tiras 2, 4), y
sometidas a electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%. A la
izquierda se exponen los marcadores moleculares de referencia, y la
flecha a la derecha indica la posición aproximada de la L1
recombinante (aproximadamente 55 kD de M_{r}) Esta proteína no
está presente en lisados de AcNPV salvaje, y coemigra con una
proteína que es inmunorreactiva (Fig. 1B, tiras 3 y 4) con un
antisuero de conejo preparado contra el antígeno común lineal de L1
de HPV, como se describió por Strike y col., "Expression in
Escherichia coli of seven DNA segments comprising the
complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type
6b and the location of the ``common antigen''", 1989, J. Gen.
Virol, vol. 70, págs. 543-555, cuya revelación
está incorporada aquí mediante referencia. También se detectaron
bandas inmunorreactivas a L1 de M_{r} inferior, y pueden derivar
de la degradación del producto L1 completo (Fig. 1B, tiras 3 y 4).
Aunque la porción predominante de L1 producida en este sistema
apareció en la fracción insoluble en NP-40,
aproximadamente el 25-30% estaba presente en la
fracción soluble en NP-40 (Fig. 1B, tira 4). La
acumulación máxima de L1 ocurrió a las 72 horas postinfección.
Las micrografías electrónicas de preparaciones
teñidas negativamente de VLPs en las bandas de sacarosa (Figs. 2, 6,
y 7) mostraron diferentes VLPs. La Fig. 2 muestra partículas
similares a la cápside del HPV-11, que estaban
presentes en el 50-60% de la superficie de
separación del gradiente de densidad de sacarosa. La Fig. 6 muestra
partículas similares a la cápside del HPV tipo 6b
(HPV-6b) que resultaron de la expresión de la
secuencia codificadora para L1 de HPV-6b en el
sistema de baculovirus, y que fueron purificadas exactamente de la
misma manera. La Fig. 7 demuestra que este método es también
apropiado para la producción de VLPs de HPV tipo 16
(HPV-16), en la expresión de la secuencia
codificadora para L1 de HPV-16. Las Figs. 12 y 16
demuestran que también se pueden purificar VLPs mediante
centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio. Los
diámetros de partícula, determinados por medición directa de las
VLPs en la Fig. 2, fueron aproximadamente de 52 nm. Esta medición es
coherente con el diámetro de viriones asilados de virus del papiloma
descritos por Klug y col., "Structure of viruses of the
papilloma-polyoma type I: Human wart virus",
1965, J. Mol. Biol., vol. 11, págs. 403-423,
cuya revelación está incorporada por este medio mediante
referencia.
Se estudiaron las propiedades inmunológicas de la
proteína L1 recombinante utilizando antisueros de conejo que
reaccionaban con epítopos de la proteína L1 nativa o
desnaturalizada. Antisuero pEX480 de conejo, dirigido contra el
antígeno común del virus del papiloma, reaccionó bien con L1
recombinante desnaturaliza en ensayos Western blot, pero no
reaccionaron con la misma preparación de antígenos mediante
inmunodot blot, un tipo de inmunoensayo en el antígeno se coloca en
la membrana de transferencia bajo condiciones no desnaturalizantes
(Fig. 3, comparar las tiras A). A diferencia del modelo de
reactividad exhibida por el anti-pEX480, el
anticuerpo policlonal de conejo producido contra partículas virales
completas de HPV-11 no reaccionó con L1 recombinante
mediante Western blot, pero reaccionó intensamente con L1
recombinante en el ensayo inmunodot blot (Fig. 3, comparar las tiras
C). Esta reactividad era específica como se demostró por la carencia
de reactividad en el suero postinmune contra la preparación de
control no recombinante nativa (Fig. 3, panel B, tira C). En estos
inmunoensayos se incluyó el antisuero pEX215 de conejo para permitir
la comparación de las cantidades relativas de L1 presentes en los
dos tipos de inmunoensayos. El nivel de inmunorreactividad del
antisuero pEX215 con L1 recombinante en ambos formatos es
groseramente equivalente (Fig. 3 tiras B), indicando que las
cantidades de L1 presentes son aproximadamente iguales. Además, la
observación de que este antisuero es capaz de reaccionar con L1 en
ambos formatos sugiere que el epítopo(s)
amino-terminal de L1 inmunorreactiva lineal,
reconocido por el antisuero pEX215, no está obscurecido por la
adopción de una conformación de L1 de orden superior.
Para determinar la prevalencia de anticuerpos en
sueros humanos dirigidos contra epítopos lineales frente a
conformacionales, se evaluaron sueros obtenidos de individuos con
condiloma acuminado, confirmado por biopsia, en ensayos Western blot
e inmunodot blot utilizando VLPs como antígeno. Ninguno de los
sueros de los pacientes o de control fueron inmunorreactivos con L1
recombinante desnaturalizada por Western blot [Fig. 4, tiras
D-O (pacientes) y P-X (controles)].
A la inversa, 11 de 12 sueros de pacientes (Fig. 5, las tiras
D-O fueron leídas como positivas, con la excepción
de la tira H) y 0 de 9 sueros de control (Fig. 5, tiras
P-X) fueron inmunorreactivas con L1 recombinante por
inmunodot blot, una diferencia estadísticamente muy significativa (p
= 7 x 10^{-5}; test exacto de Fisher). Este resultado se
correlaciona bien con resultados obtenidos previamente utilizando
los mismos sueros en un ELISA basado en partículas de
HVP-11, como se describió por Bonnez y col., "Use
of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect
specific antibodies in humans with condylomata acuminata",
1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs.
1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia.
Las VLPS purificadas por ClCs fueron
cuantificadas mediante un espectrofotómetro (A_{280}), y diluidas
hasta una concentración de 8 ng/ul en PBS frío. Se cargaron
alícuotas (100 \mul) de PBS o solución diluida de VLPs (800 ng de
proteína total) en pocillos, y las placas se dejaron estar a 4ºC
durante la noche. Las placas fueron bloqueadas, durante 2 horas a
temperatura ambiente, con una solución de BSA al 1%, seguido por la
adición de antisueros, por duplicado, a una dilución de 1:100. Los
antisueros primarios reaccionaron a temperatura ambiente durante 90
minutos. Se lavaron las placas cuatro veces y se añadió anticuerpo
secundario (conjugado de cabra anti-IgG
humana/fosfatasa alcalina) (TAGO, 1:5.000), y se dejó estar las
placas a temperatura ambiente durante 90 minutos. Se añadió sustrato
a cada pocillo, y se leyó la absorbancia a 405 nm. Se calculó la
absorbancia específica restando la absorbancia del PBS a la
absorbancia de las VLPs para cada replicado, y tomando el valor
medio de absorbancia.
Los resultados obtenidos utilizando VLPs (Fig. 8)
fueron equivalentes a los resultados anteriormente reportados en un
ensayo ELISA de los mismos sueros (de pacientes con PRR), el cual
utilizaba partículas virales completas de HVP-11
como antígeno (50%). En la Fig. 9 (r^{2} = 0'75) se da la buena
correlación con los resultados de un ELISA previo basado en
partículas virales completas.
Se infectaron cultivos en suspensión de
Sf-9(100 ml) con baculovirus recombinantes
AcNPV (control no recombinante), Ac11L1, o Ac16L1 como se describió
anteriormente por Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67,
págs. 1.936-1.944, cuya revelación está incorporada
por este medio mediante referencia, y se incubaron 72 horas a 27ºC.
Con referencia a la Figura 11, se prepararon las muestras, se
sometieron a electroforesis, y se transfirieron como se describió
anteriormente por Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67,
págs. 1.936-1.944; y Rose y col., 1990, J. Gen.
Virol., vol. 71, págs. 2.725-2.729, cuyas
revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia.
Las VLPs estaban presentes en ambas preparaciones de muestras, como
se verificó mediante microscopía electrónica (datos o mostrados).
Las concentraciones de proteína total de las muestras fueron
equilibradas antes de su utilización por el espectrofotómetro
(A_{280}).
Con referencia a la Figura 10(a), las
muestras (20 \mug de proteína total/ tira) fueron sometidas a
electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al
10% y analizadas por Western blot durante la noche, como se
describió anteriormente por Bonnez y col., 1992, J. Inf.
Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación
está incorporada por este medio mediante referencia. La membrana de
nitrocelulosa fue investigada con antisuero R5-409
de conejo, utilizado a una dilución de 1:1.000 como se describió por
Christensen y col., 1991, Virus Research, vol. 21, págs.
169-179, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia. Como se muestra en la Fig. 10(a)
(panel izquierdo), se detectaron las proteínas L1 recombinante de
HPV-11 (tira 2) y L1 recombinante de
HPV-16 (tira 3), en cantidades aproximadamente
iguales, mediante antisuero R5-409
anti-epítopo común de L1 de virus del papiloma. La
secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína L1 del
HPV-6 es cinco aminoácidos más larga que la
secuencia pronosticada de la proteína L1 del HPV-11,
lo cual es coherente con la ligeramente más lenta velocidad de
migración exhibida por la proteína recombinante L1 del
HPV-16.
Con referencia a la Figura 10(b), las
muestras fueron diluidas (diluciones en serie dos veces, hechas con
PBS) y aplicadas a nitrocelulosa bajo condiciones no
desnaturalizantes, empezando con una concentración de proteína total
de 25 \mug (inferior), y terminando con una concentración de
proteína total de 25 ng (superior). Se utilizó antisuero
R-366 de conejo a una dilución de 1:1.000. En el
panel derecho, (esto es, el inmunodot blot) el antisuero para
partículas virales completas detectó la preparación de VLPs de L1
recombinante de HPV-11 por encima de un rango de
dilución de 1.000 veces. Sin embargo, este mismo antisuero
hiperinmune de conejo no fue inmunorreactivo con la preparación de
VLPs de L1 recombinante de HPV-16, incluso a una
concentración superior de antígeno (25 \mug) que la utilizada para
análisis por Western blot (20 \mug).
El antisuero hiperinmune de conejo, neutralizador
de viriones nativos de HPV-11, no reaccionó
cruzadamente con proteína L1 de HPV-16 nativa,
sugiriendo que el epítopo(s) conformacional de la cápside del
HPV-11, que es reconocido por este antisuero, es
inmunológicamente diferente de los epítopos conformacionales
presentes en la preparación de VLPs de HPV-16.
Se detectaron VLPs en, y purificadas directamente
de, el medio sobrenadante de un cultivo en suspensión (200 ml) de
células Sf-9 infectadas con Ac11L1. Las células
fueron granuladas a baja velocidad (1.000xg), y después se
centrifugó el sobrenadante sin células a alta velocidad (100.000xg).
Se eliminaron las células mediante centrifugación a baja velocidad
(1.000xg), y se prepararon VLPs a partir de los sobrenadantes de los
cultivos como se describió anteriormente en Rose y col. en "Human
papillomavirus type 11 (HPV-11)
virus-like particles (VLPs) induce the formation of
neutralizing antibodies", 1993 (sometido a consideración para
publicación), cuya revelación está incorporada por este medio
mediante referencia. El panel A es un gel de
poliacrilamida-SDS al 10% teñido con azul Coomassie.
El panel B es un Western inmunoblot de un gel cargado idénticamente,
investigado con un antisuero de conejo específico para el antígeno
común de HPV como se describió por Strike y col., 1989, J. Gen.
Virol., vol. 70, págs. 543-555, cuya revelación
está incorporada por este medio mediante referencia, utilizado a una
dilución de 1:1.000. Los exámenes de los gránulos de alta velocidad,
obtenidos de sobrenadantes de cultivos de células
Sf-9 infectadas con L1 recombinante o no
recombinante, indicaron la presencia de VLPs en la fracción de
sobrenadante infectado con L1 recombinante. El gránulo de alta
velocidad de L1 recombinante resuspendido fue purificado mediante
centrifugación de equilibrio en gradiente de densidad, como se
describió previamente en Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis.,
vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está
incorporada por este medio mediante referencia. La única banda
obtenida mediante este método fue extraída con una aguja estéril de
calibre 18, diluida con tampón A reciente (Tris 50 mM, pH 8'0; ClNa
1M; Cl_{2}Mg 10 mM; Cl_{2}Ca 10 mM; fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 2 mM (PMSF); 10 \mug/ml de leupeptina) hasta
un volumen de 12 ml, y centrifugada nuevamente a 100.000xg durante
90 minutos a 4ºC. Después de la resuspensión del gránulo en 0'5 ml
de tampón A reciente (50% de glicerol), el análisis microscópico
electrónico de una porción de la muestra, teñida negativamente con
ácido fosfotúngstico al 2%, confirmó la presencia de VLPs íntegras
de HPV (Fig. 12).
Como se describió anteriormente, las VLPs
recombinantes fueron inmunorreactivas con anticuerpos dirigidos
contra partículas virales completas de HPV-11 (ver
Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs.
1.936-1.944, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia). En este estudio, los solicitantes
inmunizaron conejos con VLPs purificadas y ensayaron los sueros
post-inmunes por su inmunorreactividad con viriones
completos. Conejos blancos New Zealand fueron inmunizados
intramuscularmente, en dos sitios, con una emulsión 1:1 de VLPs
purificadas (\sim 20 \mug de proteína) en adyuvante completo de
Freund (0'25 ml por sitio). Después de 30 días se dieron estímulos
con una emulsión de VLPs preparada en adyuvante incompleto de
Freund, y se recolectaron sueros inmunes 14 días después. Los sueros
fueron hechos reaccionar con viriones de HPV-11
nativos o VLPs recombinantes en un inmunoensayo dot blot como se
describió previamente en Rose y col., 1993, J. Virol., vol.
67, págs. 1.936-1.944, cuya revelación está
incorporada por este medio mediante referencia. La reactividad
cruzada inmunológica de anticuerpos anti-VLPs con
viriones completos, como se muestra en la Figura 13, demuestra que
las VLPs son inmunogénicas, y parecen replicar fielmente el perfil
antigénico de viriones de HPV-11 infecciosos. Con
referencia a la Figura 13, se aplicaron preparaciones de muestras
purificadas, no desnaturalizadas, a nitrocelulosa como se describió
por Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs.
1.936-1.944, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia.
La preparación de la suspensión viral Hershey de
HPV-11 para infección (originalmente proporcionada
por John Kreider, Department of Pathology and Microbiology and
Immunology, The Milton S. Hershey Medical Center, Hershey, PA) ha
sido descrita por Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol.
165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada
por este medio mediante referencia. En cuatro experimentos en
paralelo, se incubaron 450 \mul de la suspensión viral infectadora
(lote 4/90) a 37ºC, durante 1 hora, con 50 \mul (dilución final
1:10) de suero preinmune anti-HPV-11
(grupo 1), suero postinmune
anti-HPV-11 (grupo 2), suero
preinmune anti-VLPs (grupo 3), o suero postinmune
anti-VLPs (grupo 4). Los grupos 1 y 2 fueron
controles de neutralización que se han descrito anteriormente por
Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs.
376-380, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia, y los grupos 3 y 4 fueron los grupos de
ensayo. La preparación de prepucios humanos cortados por
circuncisión rutinaria también ha sido descrita por Bonnez y col.,
1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs.
1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia. Los prepucios se cortaron en
cuadrados de 1x1 mm, y se congelaron sobre una placa fría en nieve
carbónica y guardaron algunos fragmentos pequeños de cada prepucio
utilizado. Los restantes fragmentos fueron divididos por igual en
cuatro grupos, y se añadió cada grupo a una de las cuatro mezclas de
suspensión viral-suero al final del periodo de
incubación. Las mezclas fueron incubadas durante 1 hora a 37ºC. Para
cada grupo experimental, se puso un fragmento de prepucio bajo la
cápsula renal de cada riñón de 3 ratones nu/nu
atímicos hembra de 4-6 semanas de edad, emparejados
por camadas, en un fondo genético Balb/c (Taconic Farms, Germantown,
NY). Se replicó el experimento en un día diferente, con diferente
prepucio. De este modo, se implantaron un total de 12 injertos para
cada grupo experimental. Los animales fueron sacrificados 12 semanas
después de la inserción, en cuyo momento se extrajeron y procesaron
los injertos (ver Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol.
165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada
por este medio mediante referencia). Con referencia a la Figura 14,
se prepararon injertos para su análisis como se describió aquí, y se
infectaron con lisado viral que fue pretratado con sueros de conejo
(1) preinmunes y (2) postinmunes de partículas virales completas de
HPV-11, o sueros de conejo (3) preinmunes y (4)
postinmunes de partículas similares a virus de L1 de
HVP-11. Los círculos rellenos corresponden al primer
experimento replicado, los círculos rasos al segundo experimento
replicado. Las barras horizontales indican el DGM medio. Para
comparación de los tamaños de los injertos, se calculó el diámetro
geométrico medio (DGM) tomando la raíz cúbica del producto de la
longitud, el ancho, y la altura de los injertos recuperados.
En el momento de la eutanasia, se perdió un
injerto de cada uno de los grupos de control de neutralización pre y
postinmune tratados anti-HPV-11. De
este modo, el número de injertos disponibles para análisis en cada
uno de estos grupos era 11 (Fig. 14). Los DGM medios [intervalo]
(mm) de los injertos en los grupos de control pre y postinmune
fueron, respectivamente, 2'9 [1'0, 4'9] y 1'3 [1'0, 2'6]. La
diferencia, 1'6 mm, fue estadísticamente significativa (P = 0'004,
test U de Mann-Whitney). Los 12 injertos implantados
estaban disponibles para análisis en ambos grupos pre y postinmune
tratados con anticuerpo anti-VLPs (Fig. 4). Los DGM
medios [intervalo] (en mm) de los injertos fueron, respectivamente,
2'3 [1'3, 4'2] y 1'0 [1'0, 1'8]. La diferencia en tamaño, 1'3 mm,
fue estadísticamente significativa (p < 10^{-4}). Aunque la
diferencia en los tamaños de los injertos entre el primer y el
segundo experimento no fue estadísticamente significativa (P = 0'62)
en el grupo preinmune, fue significativa (P = 0'007) en el grupo
postinmune. Por lo tanto, los solicitantes compararon las
diferencias en los tamaños de injerto entre los grupos preinmune y
postinmune tratados con anticuerpo anti-VLPs, dentro
de cada experimento replicado. Ambos fueron estadísticamente
significativos (P = 0'002 y P = 0'04, respectivamente, para el
primer y segundo replicado).
Se han descrito la fuente de ADN genómico del
HPV-11 (Bonnez y col., 1991, J. Gen. Virol.,
vol. 72, págs. 1.343-1.347, cuya revelación está
incorporada por este medio mediante referencia) y la construcción
del baculovirus recombinante Ac11L1 (Rose y col., 1993, J.
Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944, cuya
revelación está incorporada por este medio mediante referencia). La
secuencia genómica del HPV-16 fue recobrada a partir
de una lesión CIN III, y se utilizaron métodos de clonación estándar
para construir el baculovirus Ac16L1 (Chesters y McCance, datos no
publicados). Se amplificó la secuencia de L1 del
HPV-18 mediante reacción en cadena de la polimerasa
a partir del prototipo de HPV-18 (suministrado por
H. zur Hausen), y utilizada para construir el baculovirus Ac18L1
mediante el mismo procedimiento utilizado para la construcción del
AC11L1 (Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs.
1.936-1.944, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia).
Se purificaron VLPs recombinantes como se
describió por Rose y col., 1993, "Human papillomavirus type 11
(HPV-11) virus-like particles (VLPs)
induce the formation of neutralizing antibodies and detect genital
HPV-specific antibodies in human sera", en
prensa, cuya revelación está incorporada por este medio mediante
referencia. Se extrajeron las bandas simples conteniendo VLPs de
HPV-11, de HPV-16 o de
HPV-18 a partir de gradientes de densidad de ClCs
mediante jeringa, se diluyeron con tampón A [salino tamponado con
fosfato (PBS); Cl_{2}Mg 1 mM; Cl_{2}Ca 1 mM; fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF)] hasta 12 ml, y sedimentaron a
100.000xg durante 90 minutos a 4ºC. Los gránulos fueron
resuspendidos en 200 \mul de tampón A conteniendo 50% de glicerol,
se cuantificaron mediante espectrofotometría (280 nm), y se
almacenaron a -20ºC. Se analizaron las proteínas L1 recombinantes
por SDS-PAGE e inmunoensayo Western blot, como se
describió anteriormente (Rose y col., 1993, J. Virol., vol.
67, págs. 1.936-1.944, cuya revelación está
incorporada por este medio mediante referencia). Las muestras
conteniendo 5 \mug de VLPs de HPV-11, de
HPV-16 o de HPV-18 purificas fueron
sometidas a electroforesis, transferidas a una membrana, e
investigadas con antisuero de conejo anti-antígeno
común de L1 de virus del papiloma (anti-PVL1), como
se describió anteriormente (Strike y col., 1989, J. Gen.
Virol., vol. 70, págs. 543-555; y Rose y col.,
1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944,
cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante
referencia). Las capacidades predictivas de codificación de los
marcos de lectura abiertos (ORFs) de L1 de HPV-11,
de HPV-16 y de HPV-18 son 501
aminoácidos (Dartmann y col., 1986, Virology, vol. 151, págs.
124-130, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia), 505 aminoácidos (Seedorf y col., 1985,
Virology, vol. 145, págs. 181-185, cuya
revelación está incorporada por este medio mediante referencia), y
507 aminoácidos (Cole y col., J. Mol. Biol., vol. 193, págs.
599-608, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia), respectivamente, y una banda
inmunorreactiva a L1 del tamaño esperado (\sim 55 kD de M_{r})
apareció en cada una de las tres preparaciones de muestras ensayadas
por inmunoensayo Western blot (Fig. 15). También se detectaron
proteínas inmunorreactivas a L1 de inferior peso molecular, mediante
inmunoensayo Western blot de las preparaciones de VLPs purificadas
con ClCs (Fig. 15), y es probable que sean productos de degradación
de proteínas L1 completas, ya que las cantidades relativas de estas
proteínas variaban en análisis posteriores (datos no mostrados). Sin
embargo, las principales bandas inmunorreactivas a L1 de \sim 55
kD de M_{r} no variaron en cada una de las muestras, tampoco en
sus movilidades o en sus cantidades relativas (datos no mostrados).
La microscopía electrónica de muestras purificadas (teñidas
negativamente con ácido fosfotúngstico al 2%) confirmó la formación
de VLPs en preparaciones de VLPs de HPV-11 (Fig.
16A), HPV-16 (Fig. 16B), y HPV-18
(Fig. 16C).
Se prepararon sueros inmunes de VLPs de L1 de
HPV-11, HPV-16, y
HPV-18, inmunizando intramuscularmente dos conejos
blancos New Zealand, en dos sitios, con cada una de las
preparaciones de VLPs (esto es, fueron inmunizados seis conejos),
utilizando métodos descritos anteriormente (Bonnez y col., 1992,
J. Infect. Dis., vol. 165, págs. 376-380;
Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs.
1.936-1.944, cuyas revelaciones están incorporadas
por este medio mediante referencia). Anticuerpo de conejo
anti-antígeno común de PVL1 (Strike y col., 1989,
J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555, cuya
revelación está incorporada por este medio mediante referencia),
virión completo de HPV-11 (Bonnez y col., 1992,
J. Infect. Dis., vol. 165, págs. 376-380,
cuya revelación está incorporada por este medio mediante
referencia), y antisueros para VLPs de HPV-11,
HPV-16 y HPV-18 fueron ensayados con
ELISA frente a las tres preparaciones de VLPs recombinantes (Fig.
17). Para este ELISA, las VLPs purificadas fueron diluidas hasta una
concentración de 10 ng/\mul en PBS, y se dispensaron alícuotas
conteniendo aproximadamente 1 \mug de antígeno, o PBS únicamente,
en filas alternas de placas ELISA de 96 pocillos. Las condiciones
del ensayo fueron exactamente como se describió anteriormente [Rose
y col., 1993, "Human papillomavirus type 11
(HPV-11) virus-like particles (VLPs)
induce the formation of neutralizing antibodies and detect genital
HPV-specific antibodies in human sera", en
prensa, cuya revelación está incorporada por este medio mediante
referencia], excepto que los antisueros primarios fueron
preabsorbidos con lisado de células Sf-9 infectadas
con baculovirus no recombinante (AcNPV), diluido en solución
bloqueante (2% v/v) antes de ensayar. Todos los antisueros fueron
ensayados por duplicado, en numerosas ocasiones, a diluciones
oscilando desde 1:1.000 hasta 1:128.000. Los valores de absorbancia,
para todos los antisueros de conejo anti-VLPs
mostrados en la Figura 17, fueron obtenidos a la dilución óptima de
estos antisueros de 1:16.000. Los valores de absorbancia, para los
antisueros de conejo anti-antígeno común de PVL1 y
virión completo de HPV-11, fueron obtenidos a una
dilución menor (1:1.000). Los valores de absorbancia específica
fueron determinados restando los valores de control (pocillos con
PBS) de los valores experimentales (pocillos conteniendo antígeno)
para cada replicado, y se determinaron los valores de absorbancia
medios (405 nm).
Se ensayaron VLPs en un inmunoensayo ELISA para
valorar su capacidad para detectar anticuerpos específicos en sueros
de pacientes, y los resultados se compararon con los resultados
previamente obtenidos utilizando los mismos sueros en un
inmunoensayo ELISA de viriones completos de HPV-11
(Bonnez y col., 1993, J. Med. Virol., vol. 39,
340-344, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia). El antígeno fue diluido en salino
tamponado con fosfato (PBS) para dar una cantidad equivalente a la
cantidad utilizada en el ELISA de viriones completos anterior
(Bonnez y col., 1993, J. Med. Virol., vol. 39,
340-344, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia), y la solución de antígeno o PBS sin
ningún antígeno fue repartida en partes iguales en filas alternas de
placas de 96 pocillos. Después de revestir durante 16 horas a 4ºC,
se aspiraron estas soluciones y se bloquearon los pocillos con
solución diluyente/bloqueante (Kirkegaard and Perry Laboratories
Inc., Gaithersburg, MD) a temperatura ambiente durante 2 horas. Un
total de 59 sueros humanos (43 pacientes, 16 controles), ensayados
previamente mediante ELISA para partículas virales completas de
HPV-11 (Bonnez y col., 1993, J. Med. Virol.,
vol. 39, 340-344, cuya revelación está incorporada
por este medio mediante referencia), fueron diluidos 1:100 en
solución diluyente/bloqueante y se añadieron alícuotas de 100 \mul
a los pocillos tratados con sólo PBS o con solución de antígeno (dos
replicados por muestra de suero). Las placas fueron incubadas a
temperatura ambiente durante 90 minutos, y lavadas después cuatro
veces (solución de lavado, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.,
Gaithersburg, MD). Se añadió conjugado de anti-IgG
humana/fosfatasa alcalina (alícuotas de 100 \mul, diluido 1:5.000,
TAGO, Burlingame, CA) a cada pocillo, y se incubaron las placas a
temperatura ambiente durante 90 minutos. Las placas fueron lavadas
cuatro veces y desarrolladas con sustrato de fosfatasa alcalina
(fosfato de p-nitrofenilo en tampón de
dietanolamina). Se calculó la absorbancia específica a 405 nm para
cada muestra de suero, restando el valor obtenido del pocillo
tratado con PBS del valor obtenido del pocillo conteniendo antígeno
para cada replicado, y se calcularon las diferencias medias de los
replicados. En el ELISA para viriones completos discutido aquí en
otra parte, se analizó sueros de 42 pacientes (y sueros de 20
controles) por los cambios en los niveles de anticuerpo contra la
cápside durante el transcurso del tratamiento (Bonnez y col., 1993,
J. Med. Virol., vol. 39, 340-344, cuya
revelación está incorporada por este medio mediante referencia).
Todos los sueros ensayados en el presente estudio ELISA fueron
reunidos en el artículo dentro del estudio previo. Uno de los sueros
de pacientes analizados en el estudio previo fue excluido
posteriormente por razones relacionadas con la consecuencia del
tratamiento y no por los resultados del inmunoensayo. Sin embargo,
debido a que el valor de absorbancia de este suero estaba
disponible, el suero fue incluido en el presente ensayo, lo que
aumentó a 43 el número de sueros de pacientes analizados en el
presente estudio ELISA. El número de sueros de control analizados
fue reducido de 20 a 16 por consideraciones logísticas que tienen
que ver con el ensayo.
La seroactividad media [intervalo] de los 16
sueros de control, expresada como valor de D.O., fue 0'005 [-0'029,
0'025], comparada con 0'024 [-0'063, 0'512] para los 43 sueros de
pacientes, una diferencia estadísticamente significativa (P = 0'01,
test U de Mann-Whitney). Utilizando el valor de D.O.
máximo en el grupo de control como corte, la sensibilidad del ensayo
fue del 49% (P = 2 x 10^{-4}, test exacto de Fisher). Por lo
tanto, el ELISA para VLPs de HPV-11 fue capaz de
discriminar entre pacientes con condiloma acuminado y los
controles. Además, había una excelente correlación ("Pearson
Product-Moment", r = 0'87; P < 10^{-6})
entre las seroactividades de las muestras con el ELISA para VLPs de
HPV-11 y el ELISA para viriones de
HPV-11 cuando se incluyeron todos los sueros, o
cuando únicamente se consideraron los 21 sueros positivos mediante
ELISA para VLPs de HPV-11 (r = 0'87; P <
10^{-6}).
Las observaciones inmunológicas sugieren que la
L1 recombinante adopta una conformación nativa. El antisuero de
conejo producido contra el antígeno común de L1 desnaturalizada fue
inmunorreactivo únicamente con L1 recombinante desnaturalizada (esto
es, mediante Western blot), mientras que el antisuero de conejo
producido contra partículas virales completas no desnaturalizadas
reaccionó únicamente con L1 recombinante no desnaturalizada (esto
es, mediante inmunodot blot). Además, los sueros humanos de
pacientes con condiloma acuminado, que fueron reactivos con viriones
de HPV-11 en un ELISA según Bonnez y col., "Use of
human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific
antibodies in humans with condylomata acuminata", 1991,
J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347,
también reaccionaron con L1 recombinante de HPV-11
no desnaturalizada (Figs. 4, 8 y 9). Por lo tanto, parece que los
epítopos conformacionales de las VLPs de la invención son similares
a los presentes en viriones de HPV-11 nativos, los
cuales son reconocidos por el sistema inmunológico humano durante la
infección natural. Varios estudios de serología del virus del
papiloma demuestran que las especificidades de los anticuerpos
contra los epítopos conformacionales son buenos indicadores de la
infección por virus del papiloma (Bonnez y col., "Use of human
papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific
antibodies in humans with condylomata acuminata", 1991,
J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347;
Bonnez y col., "Evolution of the antibody response to human
papillomavirus type 11 (HPV-11) in patients with
condyloma acuminatum according to treatment response", 1991,
J. Med. Virol., en prensa; Bonnez y col.,
"Antibody-mediated neutralization of human
papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the
nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the
polymerase chain reaction", 1992, J. Inf. Dis., vol. 165,
págs. 376-380; Christensen y col., "Detection of
human serum antibodies that neutralize infectious human
papillomavirus type 11 virions", 1992, J. Gen. Virol.,
vol. 73, págs. 1.261-1.267; Kienzler y col.,
"Humoral and cell-mediated immunity to human
papillomavirus type 1 (HPV-1) in human warts",
1983, Br. J. Dermatol., vol. 108, págs.
665-672; y Steele y col., "Humoral assays of human
sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus
type 1", 1990, Virology, vol. 174, págs.
388-398, cuyas revelaciones están incorporadas por
este medio mediante referencia). Estas especificidades pueden jugar
también un papel significativo en la patogénesis viral. Por ejemplo,
un antisuero de conejo dirigido contra partículas de
HPV-11 completas neutraliza la infectividad por
HPV-11 (Bonnez y col.,
"Antibody-mediated neutralization of human
papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the
nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the
polymerase chain reaction", 1992, J. Inf. Dis., vol. 165,
págs. 376-380; y Christensen y col.,
"Antibody-mediated neutralization in vivo
of infectious papillomavirus", 1990, J. Virol., vol. 64,
págs. 3.151-3.156) Además, Christensen y col.,
"Detection of human serum antibodies that neutralize infectious
human papillomavirus type 11 virions", 1992, J. Gen.
Virol., vol. 73, págs. 1.261-1.267, utilizando
sueros humanos, informaron de una correlación entre anticuerpo
anti-viriones de HPV-11 completos y
la actividad neutralizadora de los sueros. La detección de tales
anticuerpos con las VLPs de L1 recombinante de la presente invención
puede tener trascendencia diagnóstica y funcional.
Cuando se tiene en cuenta la construcción del
baculovirus recombinante, algunos de los baculovirus recombinantes
construidos tempranamente por los solicitantes tenían la secuencia
codificadora para L1 correcta, pero no estuvieron produciendo
niveles detectables de proteínas L1. Esto originó que los
solicitantes revisaran en las regiones 3' no traducidas del
HPV-11 y varias otras secuencias codificadoras para
L1 de HPV. Se determinó que una secuencia señal pentanucleotídica de
la degradación de ARNm, AUUUA (Shaw G. y Kamen R., "A conserved AU
sequence from the 3' untranslated region of GM-CSF
mRNA mediates selective mRNA degradation", Cell, 1986,
vol. 46, págs. 659-67: Cole MD. y Mango SE.,
"cis-acting determinants of c-myc
mRNA stability", 1990, Enzyme, vol. 44, págs.
167-80; Shyu AB y col., "Two distinct
destabilizing elements in the c-fos message trigger
deadenylation as a first step in rapid mRNA decay", Genes
& Development, 1991, vol. 5, págs. 221-31;
Savant-Bhonsale S. y Cleveland DW., "Evidence for
instability of mRNAs containing AUUUA motifs mediated through
translation-dependent assembly of a : 20S
degradation complex", Genes & Development, 1992, vol.
6, págs. 1.927-37, cuyas revelaciones están
incorporadas por este medio mediante referencia), estaba dentro de
los 30 nucleótidos del codon de parada de la secuencia codificadora
para L1 de HPV-11 y, además, los otros tipos de HPV
considerados tenían también la secuencia AUUUA en la proximidad del
codon de parada de L1. Si esta secuencia fuese eliminada, o
introducida una mutación, podría incrementarse el nivel de expresión
de la proteína L1. Por lo tanto, se diseñarían también los cebadores
PCR para amplificar la secuencia codificadora para L1 a partir de
ADN genómico de HPV-11, los cuales no solamente
incorporarían sitios de la enzima de restricción para clonación,
sino también mutarían la secuencia pentanucleotídica AUUUA, 30
nucleótidos por debajo del codon de parada de L1. El aumento a
escala de este clon produjo niveles de proteína L1 sumamente altos.
Los informes que utilizan el sistema BEVS han dado niveles de
producción de proteína recombinante en el intervalo de
300-500 mg/litro de cultivo celular. En la presente
invención, los niveles de producción de proteína L1 recombinante
fueron mucho mayores, aproximadamente 600-800
mg/litro, debido posiblemente a la eliminación de la secuencia señal
de la degradación de L1 en la región 3' no traducida.
Estos resultados demuestran que, bajo condiciones
experimentales similares, sueros postinmunes de conejos inmunizados
con VLPs de HPV-11 pueden bloquear la infección por
HPV-11 de tejido humano, tan eficazmente como sueros
obtenidos de conejos inmunizados con viriones completos de
HPV-11. El bloqueo, que no se observó con los sueros
preinmunes respectivos, estaba asociado con la ausencia de expresión
genética viral temprana. Por lo tanto, el efecto fue coherente con
la neutralización viral clásica, esto es, la prevención de
penetración del virus o decapsidación (Dimmock, 1993,
Neutralization of Animal Viruses, Berlín:
Springer-Verlag, cuya revelación está incorporada
por este medio mediante referencia).
Para proporcionar la confirmación de la
neutralización del HPV-11 mediante análisis de
expresión genética viral, se analizaron todos los injertos para la
presencia del transcripto de ARNm de HPV-11
ensamblado con E1^E4 (datos no mostrados), como se describió
anteriormente en Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165,
págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia. El ARNm E1^E4 fue detectado en 10/12
(83%) y en 0/12 (0%) de los injertos de los grupos pretratados con
sueros pre o postinmunes de VLPs, respectivamente (p <
10^{-4}). De manera similar, para los grupos de control
pretratados con sueros pre o postinmunes
anti-viriones completos, el ARNm E1^E4 fue detectado
en 8/11 (73%) y en 0/11 (0%) injertos, respectivamente (p =
10^{-3}). Estos resultados indican que el tratamiento del inóculo
viral con el suero postinmune de VLPs está asociado con una acusada
inhibición del crecimiento del injerto y expresión genética viral,
efectos que son coherentes con la inmunoneutralización. De este
modo, las VLPs recombinantes pueden inducir una respuesta de
neutralización similar en magnitud a la respuesta obtenida por la
inmunización con virus infeccioso.
Las VLPs de L1-L2 del
HPV-16 descritas por Zhou y col., 1991,
Virology, vol. 185, págs. 251-257, cuya
revelación está incorporada por este medio mediante referencia,
fueron variables en tamaño y menores (35-40 nm de
diámetro) que los viriones de HPV (50-55) o las VLPs
de HPV-11 producidas por baculovirus
(50-55 nm; Rose y col, en prensa, 1993, cuya
revelación está incorporada por este medio mediante referencia).
Estas características morfológicas son bastante diferentes de las de
las VLPs descritas en la presente invención. Además, utilizando el
método de la invención, la proteína L1 de HPV sola es suficiente
para la formación de partículas cuyas características biofísicas y
propiedades antigénicas reflejen fielmente las de los viriones
nativos de HPV.
Utilizando un enfoque similar, Kirnbauer y col.
informaron de la inhibición de la transformación in vitro,
mediada por BPV-1, de células C127 de ratón mediante
anticuerpos anti-VLPs de BPV-1
(Kirnbauer y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.
89, págs. 12.180-12.184, cuya revelación está
incorporada por este medio mediante referencia). Los resultados
obtenidos en ese sistema respaldan los resultados informados en la
presente invención, en la que los solicitantes han demostrado la
neutralización utilizando un HPV genital y su tejido diana normal.
Aunque la concordancia de resultados del ensayo
BPV-1/células C127 y el sistema de xenoinjertos de
piel fetal bovina en ratón atímico ha sido reportada como se
describió previamente por Ghim y col., 1993, Int. J. Cancer,
vol. 49, págs. 285-289, cuya revelación está
incorporada por este medio mediante referencia, el sistema
fibroblástico BPV-1/C127 de ratón es no productivo
y, por lo tanto, la neutralización puede ser únicamente inferida a
partir de la ausencia de focos transformados in vitro.
Además, el BPV-1 no infecta naturalmente a ratones,
y el mecanismo por el que consigue entrar dentro de células C127
puede diferir del mecanismo involucrado en el proceso de la
infección natural. Por contraste, el modelo de ratón atímico
utilizado en el presente estudio confía en la infección por un HPV
genital de su tejido diana natural, como se describió previamente
por Kreider y col., 1985, Nature, vol. 317, págs.
639-641, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia, el injerto infectado es mantenido in
vivo, y la transformación morfológica e histológica del injerto
infectado está acompañada por la producción de viriones infecciosos
(ver Kreider y col., 1987, J. Virol., vol. 61, págs.
590-593, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia). La inhibición del crecimiento del
injerto mediada por anticuerpos, como se describió previamente por
Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs.
376-380; Christensen y col., J. Virol., vol.
64, págs. 3.151-3.156; Christensen y col., 1991,
Virus Research, vol. 21, págs. 169-179;
Christensen y col., 1990, J. Virol., vol. 64, págs.
5.678-5.681; y Christensen y col., 1992, J. Gen.
Virol., vol. 73, págs. 1.261-1.267, cuyas
revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia,
y la evidencia inmunocitoquímica y biológica molecular de la
inhibición de la expresión genética viral ha sido bien documentada,
como se describió previamente por Bonnez y col., 1991, J. Gen.
Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347; y Bonnez y
col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs.
376-380, cuyas revelaciones están incorporadas por
este medio mediante referencia. Por lo tanto, las observaciones
hechas en el sistema de ratón atímico pueden reflejar más
exactamente los sucesos que ocurren en la infección natural.
Los anticuerpos neutralizantes para
HPV-11 han sido identificados en humanos con
condiloma acuminado, como se describió anteriormente por Christensen
y col., 1992, J. Gen. Virol., vol. 73, págs.
1.261-1.267, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia, pero se desconoce su significado
biológico. Si la neutralización prueba ser un mecanismo efector
inmunológico protector contra infecciones por virus del papiloma
in vivo, entonces la inmunización con VLPs recombinantes
puede proporcionar inmunidad protectora a individuos en peligro de
infección. Los resultados de los solicitantes sugieren que la
magnitud de la actividad de neutralización de los anticuerpos para
VLPs de HPV-11 es similar a la de anticuerpos
específicos para viriones infecciosos de HPV-11. Por
lo tanto, parece que las VLPs son buenas candidatas para vacunas.
Sin embargo, no se conoce todavía el grado de reactividad cruzada de
los determinantes conformacionales de la cápside entre diferentes
tipos de HPV, y puede ser bajo como se describió anteriormente por
Gissmann y col., 1977, Virology, vol. 76, págs.
569-580; Gross y col., 1983, Oncogenic
Viruses, Pergamon Press, Nueva York; Hagensee y col., 1993,
J. Virol., vol. 67, págs. 315-322; Howley y
col., "Papillomavirinae and their replication", cap. 58, págs.
1.625-1.650, en B. N. Fields y D. M. Knipe (ed.),
Virology, 2ª ed., Vol. 2, Raven Press, Nueva York (1990);
Kirnbauer y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 89,
págs. 12.180-12.184; Kreider y col., 1987, J.
Virol., vol. 61, págs. 590-593; Kreider y col.,
1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641; y Orth
y col., 1977, J. Virol., vol. 24, págs.
108-120, cuyas revelaciones están incorporadas por
este medio mediante referencia. La caracterización detallada del
potencial de las VLPs recombinantes para su uso como inmunógenos,
para la prevención de la enfermedad genital por HPV, requerirá
estudios complementarios que impliquen VLPs obtenidas de otros tipos
de HPV genital. Será de importancia particular el determinar si los
anticuerpos para VLPs de HPV genital heterólogas sean capaces de
neutralizar la infección por HPV.
Con referencia a la Figura 17, los antisueros
para partículas virales completas de HPV-11 (B) y
para VLPs de HPV-11 (C, D) reaccionaron intensamente
con VLPs de HPV-11, pero ninguno de estos antisueros
reaccionaron con las preparaciones de VLPs de HPV-16
o de HPV-18. De manera similar, los antisueros de
conejo para VLPs de L1 de HPV-16 (E, F) y de
HPV-18 (G, H) reaccionaron únicamente con VLPs
homotípicas. Las especificidades de estas reacciones fueron
verificadas en experimentos de preabsorción, en los que la
inmunorreactividad de cada antisuero de conejo para VLPs fue
abrogada mediante preabsorción con VLPs homotípicas, pero no
heterotípicas (datos no mostrados). Ninguno de los sueros preinmunes
de conejo reaccionó con alguna de las preparaciones de VLPs (datos
no mostrados). El antisuero anti-antígeno común de
PVL1, que reaccionó bien con proteínas L1 recombinantes mediante
Western inmunoblot (Fig. 15), reaccionó únicamente un poco con
preparaciones de VLPs nativas en el ELISA (Fig. 17A). Esta
observación sugiere que los epítopos normalmente reconocidos por
este antisuero están enmascarados bajo las condiciones del ensayo
ELISA, y que las proteínas L1 examinadas en este ensayo están, en su
mayor parte, desnaturalizadas.
La presente invención ha demostrado que los
epítopos de VLPs de L1 de HPV-11, 16, y 18 son
antigénicamente distintos. Aunque las proteínas L2 de la cápside no
estaban presentes en estas preparaciones de VLPs, es probable que la
diferencia antigénica observada entre los tipos de HPV también se
aplique a viriones. La L2 representa aproximadamente el 10% del
contenido de proteína total de las partículas de HPV (Doorbar y
col., 1987, J. Virol., vol. 61, 2.793-2.799,
cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia)
y, aunque su localización exacta en la partícula no ha sido
determinada (Baker y col., 1991, Biophysical J., vol. 60,
págs. 1.445-1.456, cuya revelación está incorporada
por este medio mediante referencia), estudios recientes han sugerido
que puede ser necesaria para la encapsidación del ADN (Zhou y col.,
1993, J. Gen. Virol., vol. 74, págs. 763-768,
cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia)
y que un dominio presente en la relativamente conservada porción
amino-terminal de la secuencia de aminoácidos de L2
de HPV-16 media la unión no especifica al ADN (Zhou
y col., 1994, J. Virol., vol. 68, págs.
619-625, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia). Aunque el resto de la secuencia de
aminoácidos de L2 es muy heterogénea entre los virus del papiloma
(Danos y col., 1990, J. Invest. Dermatology, vol. 83, págs.
7-11, cuya revelación está incorporada por este
medio mediante referencia), no está nada claro si los anticuerpos
específicos para L2 reaccionan con viriones intactos (Komly y col.,
1986, J. Virol., vol. 60, págs. 813-816; y
Hagansee y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs.
351-322, cuyas revelaciones están incorporadas por
este medio mediante referencia). De este modo, no se espera que la
proteína L2 altere sustancialmente los resultados del presente
estudio.
Estudios previos han indicado que se pueden
distinguir entre sí los diferentes tipos de HPV, utilizando técnicas
serológicas. Por ejemplo, se descubrió que los anticuerpos reactivos
con viriones de verrugas plantares eran mucho más comunes en sueros
de pacientes con verrugas plantares que en sueros de pacientes con
verrugas comunes, planas, anogenitales, o laríngeas (Pfister &
zur Hausen, 1978, Int. J. Cancer, vol. 21, págs.
161-165; Kienzler y col., 1983, Brit. J.
Dermatilogy, vol. 108, págs. 665-672; y Viac y
col., 1990, J. Med. Virol., vol. 32, págs.
18-21, cuyas revelaciones están incorporadas por
este medio mediante referencia). Anisimova y col., 1990, también
demostraron directamente, mediante microscopía inmunoelectrónica,
que el HPV-1 y el HPV-2 son
antigénicamente distintos. Sin embargo, también parece que los otros
tipos de HPV son antigénicamente afines. Por ejemplo, la detección
de anticuerpos que reconocen específicamente viriones de
HPV-11, en sueros de pacientes con infección por
HPV-6 documentada, fue reportada anteriormente
(Bonnez y col., 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs.
1.343-1.347; y Bonnez y col., 1992, Virol.,
vol. 188, págs. 384-387, cuyas revelaciones están
incorporadas por este medio mediante referencia). Debido a la
carencia de viriones de HPV disponibles a partir de la mayoría de
los tipos de HPV, las VLPs son actualmente la mejor herramienta
disponible para explorar la relación antigénica entre los HPVs. Las
diferencias antigénicas entre los tipos de HPV son apropiadas para
reflejar la diversidad genética dentro de la secuencia codificadora
para L1. Chan y col. construyeron un árbol filogenético del virus
del papiloma que está basado en la divergencia genética dentro de
una región definida de la secuencia de aminoácidos de L1 del virus
del papiloma (Chan y col., 1992, J. Virol., vol. 66, págs.
5.714-5.725, cuya revelación está incorporada por
este medio mediante referencia). Su trabajo muestra la relativamente
cercana relación evolutiva entre el HPV-6 y el
HPV-11, que es coherente con la reactividad cruzada
potencial entre las cápsides del HPV-6 y del 11. Por
otra parte, el HPV-16 y el HPV-18,
que han divergido extensamente en sus secuencias de L1, se cuenta
con que tengan una pequeña reactividad cruzada antigénica entre sí o
con el HPV-11. Esos pronósticos son coherentes con
los resultados de la presente invención.
Se desconoce la conexión biológica de la
variabilidad antigénica de la cápside del HPV, pero la diversidad de
la proteína de la cápside podría responder de la especificidad
tisular del virus del papiloma. La disponibilidad de VLPs
recombinantes a partir de diversos virus del papiloma puede probar
la utilidad en la identificación de supuestos receptores celulares
específicos del huésped y del tejido. Además, Las VLPs deberían
jugar un importante papel en la delineación de las características
antigénicas de los HPVs, y en la dirección de los estudios de
respuestas inmunológicas hacia estos virus.
La presente invención ha sido descrita con algún
detalle vía ilustración y ejemplo con fines de claridad de
comprensión, sin embargo, será obvio que se pueden practicar algunos
cambios y modificaciones dentro del campo de aplicación de las
reivindicaciones adjuntadas.
Claims (14)
1. Una partícula, o capsómero, purificada
recombinante similar a virus del papiloma humano, que consta de
proteína L1 de la cápside del virus del papiloma humano 16
(HPV-16) expresada a partir de una secuencia
codificadora para la proteína L1 que produce una proteína o complejo
proteico, que posee características inmunológicas y morfológicas
similares a las del virus del papiloma nativo, en donde dicha
partícula o capsómero es capaz de reconocer anticuerpos en sueros
humanos de personas conocidas por estar infectadas con el
HPV-16.
2. Una partícula similar a virus según la
Reivindicación 1, la cual tiene un diámetro coherente con el
diámetro de viriones aislados del virus del papiloma.
3. Una partícula o capsómero similar a virus
según la Reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha secuencia
codificadora para la proteína L1 se expresa en una célula utilizando
un sistema de expresión de baculovirus.
4. Una partícula o capsómero similar a virus
según alguna de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo una
proteína L1 de la cápside.
5. Una partícula o capsómero similar a virus de
alguna de las reivindicaciones precedentes, para su uso como
vacuna.
6. Una vacuna constando de una partícula o
capsómero similar a virus de alguna de las reivindicaciones
precedentes.
7. Una vacuna según la Reivindicación 6, la cual
es una vacuna multivalente constando de una partícula, similar a
virus, de diferentes virus del papiloma humano.
8. Una vacuna según la Reivindicación 7, o
comprendiendo además un adyuvante.
9. El empleo de una partícula o capsómero similar
a virus según alguna de las Reivindicaciones 1 a 4, en la
fabricación de una vacuna para otorgar inmunidad protectora contra
el virus del papiloma humano o, si el paciente está ya infectado,
estimular la propia respuesta inmunológica del paciente.
10. Un método para producir una partícula o
capsómero similar a virus del papiloma humano según la
Reivindicación 1, el método comprendiendo el transfectar una célula
con un vector de expresión recombinante conteniendo la secuencia
codificadora para la proteína L1 de la cápside del
HPV-16, bajo condiciones que faciliten la expresión
de dicha proteína de la cápside, de ese modo produciendo dichas
partículas similares a virus.
11. Un método según la Reivindicación 10, en
donde el vector de expresión recombinante es un sistema de expresión
de baculovirus.
12. Un método según la Reivindicación 11, en
donde la célula es una célula de insecto.
13. Un método según la Reivindicación 10, en
donde dicha transfección se lleva a cabo mediante infección.
14. Un método según alguna de las
Reivindicaciones 10 a 13, el método comprendiendo:
clonar la secuencia codificadora para la proteína
L1 de la cápside del HPV-16 dentro de un vector de
transferencia de baculovirus;
cotransfectar células de insecto con dicho vector
de transferencia de baculovirus y ADN genómico del virus de la
polihedrosis nuclear Autographa californica;
recuperar baculovirus recombinantes; e
infectar células de insecto con dicho baculovirus
recombinante, bajo condiciones que faciliten la expresión de dicha
proteína, produciendo de ese modo partículas similares a virus.
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Families Citing this family (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE122007000019I1 (de) | 1991-07-19 | 2007-07-26 | Univ Queensland | Impfstoffen gegen Papillomavirus |
| US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
| US6153201A (en) * | 1993-03-09 | 2000-11-28 | University Of Rochester | Oral immunization with papillomavirus virus-like particles |
| AUPM358894A0 (en) * | 1994-01-31 | 1994-02-24 | Csl Limited | Modified papilloma virus l2 protein and vlps formed therefrom |
| DE4415743C2 (de) * | 1994-05-04 | 1996-10-10 | Deutsches Krebsforsch | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen |
| US5888516A (en) * | 1994-05-16 | 1999-03-30 | Merck & Co. Inc. | Recombinant papillomavirus vaccines |
| AUPM566794A0 (en) * | 1994-05-17 | 1994-06-09 | University Of Queensland, The | Process and product |
| AU2003235191B2 (en) * | 1994-10-07 | 2006-09-21 | Loyola University Of Chicago | Papilloma virus-like particles, fusion proteins as well as processes for their production |
| WO1996011272A2 (de) * | 1994-10-07 | 1996-04-18 | Medigene Gesellschaft Für Molekularbiologische Diagnostik, Theraphie Und Technologie Mbh | Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung |
| AR004464A1 (es) * | 1994-11-14 | 1998-12-16 | Merck Sharp & Dohme | Un metodo para producir una proteina de capside de papilomavirus |
| WO1996026277A1 (en) * | 1995-02-24 | 1996-08-29 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation |
| US5840306A (en) * | 1995-03-22 | 1998-11-24 | Merck & Co., Inc. | DNA encoding human papillomavirus type 18 |
| US5820870A (en) * | 1995-03-22 | 1998-10-13 | Merck & Co., Inc. | Recombinant human papillomavirus type 18 vaccine |
| IL117459A (en) * | 1995-03-22 | 2005-11-20 | Merck & Co Inc | Dna encoding human papillomavirus type 18 |
| US5821087A (en) * | 1995-03-30 | 1998-10-13 | Merck & Co., Inc. | Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA |
| IL117591A0 (en) * | 1995-03-30 | 1996-07-23 | Merck & Co Inc | Synthetic DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein |
| JP2000501285A (ja) * | 1995-11-15 | 2000-02-08 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | 合成ｈｐｖ１１ウイルス様粒子 |
| DE19543553B4 (de) * | 1995-11-22 | 2009-04-09 | Deutsches Primatenzentrum Gmbh | VP-Antigene des JC-Virus |
| US6908615B1 (en) | 1996-03-18 | 2005-06-21 | Merck & Co., Inc. | DNA encoding human papilloma virus type 18 |
| FR2749323B1 (fr) * | 1996-06-04 | 1998-07-10 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Pseudo-particules virales utiles en tant que vecteur de delivrance d'acide nucleique |
| CA2267639C (en) * | 1996-10-04 | 2005-11-22 | Merck & Co., Inc. | Synthetic hpv16 virus-like particles |
| DE69727830T2 (de) * | 1996-12-09 | 2004-10-07 | Merck & Co Inc | Synthetische hpv-16 virusähnliche partikel |
| US6228368B1 (en) * | 1997-10-06 | 2001-05-08 | Loyola University Of Chicago | Papilloma virus capsomere formulations and method of use |
| US7182947B2 (en) | 1998-02-20 | 2007-02-27 | Medigene Ag | Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs |
| US7494658B2 (en) | 1998-02-20 | 2009-02-24 | Medigene Ag | Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs |
| CA2229955C (en) | 1998-02-20 | 2003-12-09 | Medigene Gmbh | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
| US20020039584A1 (en) | 1998-02-20 | 2002-04-04 | Medigene Ag | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
| US6926897B1 (en) | 1998-03-24 | 2005-08-09 | Medigene Aktiengesellschaft | Medicament for the avoidance or treatment of papillomavirus-specific tumour |
| US6692752B1 (en) | 1999-09-08 | 2004-02-17 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Methods of treating human females susceptible to HSV infection |
| DE19925199A1 (de) | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Medigene Ag | Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| DE19925235A1 (de) | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Medigene Ag | Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| JP4746819B2 (ja) * | 2000-09-18 | 2011-08-10 | メディミューン，エルエルシー | ワクチンの免疫原性を測定する試験管内検定 |
| GB0109297D0 (en) | 2001-04-12 | 2001-05-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| WO2003103570A2 (en) | 2001-08-01 | 2003-12-18 | University Of Rochester | Transcutaneous immunization against papillomavirus with papillomavirus virus-like particles |
| GB0206360D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| EP1648931B1 (en) | 2003-07-21 | 2011-02-09 | Transgene S.A. | Multifunctional cytokines |
| WO2006113209A1 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for producing an enhanced immune response to a human papillomavirus immunogen |
| WO2006065166A1 (fr) * | 2005-07-26 | 2006-06-22 | Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostyu 'rusgen' | Composition de traitement et de prevention de l'infection de l'humain par le papillomavirus sur la base de la proteine l1 et des peptides de la proteine e7 |
| TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
| US8778351B2 (en) | 2006-08-30 | 2014-07-15 | University Of Rochester | Combined human papillomavirus VLP/gene delivery system and use thereof as a vaccine for prophylaxis and immunotherapy of infectious diseases and tumors |
| SI2484375T1 (en) | 2006-09-26 | 2018-08-31 | Infectious Disease Research Institute | A vaccine composition comprising a synthetic adjuvant |
| US20090181078A1 (en) | 2006-09-26 | 2009-07-16 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| MX362698B (es) | 2007-03-02 | 2019-02-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Metodo novedoso y composiciones. |
| BRPI0815818A2 (pt) | 2007-04-29 | 2016-08-02 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Entpr Co Ltd | proteína l1 truncada do papiloma vírus humano tipo 18 |
| DK2154147T3 (en) * | 2007-04-29 | 2015-12-07 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Entpr Co Ltd | Truncated L1 protein of human papillomavirus 16 |
| DK2910566T5 (en) | 2007-05-29 | 2016-11-07 | Univ Xiamen | Truncated L1 protein of human papillomavirus 11 |
| WO2008145021A1 (en) * | 2007-05-29 | 2008-12-04 | Xiamen University | A truncated l1 protein of human papillomavirus 6 |
| WO2009092113A2 (en) * | 2008-01-19 | 2009-07-23 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for the delivery of vaccines to disrupted epithelium |
| BRPI0909547A2 (pt) | 2008-05-26 | 2019-03-06 | Cadila Healthcare Ltd. | vacina combinada de sarampo - hpv, vetor e hospedero |
| GB0815872D0 (en) | 2008-09-01 | 2008-10-08 | Pasteur Institut | Novel method and compositions |
| GB0820822D0 (en) | 2008-11-13 | 2008-12-24 | Inst Catala D Oncologia | Novel product and processes |
| WO2010112533A1 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-07 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Enhanced production of papillomavirus-like particles with a modified baculovirus expression system |
| WO2010141861A1 (en) | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants |
| WO2011026111A1 (en) | 2009-08-31 | 2011-03-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Oral delivery of a vaccine to the large intestine to induce mucosal immunity |
| WO2011127360A1 (en) | 2010-04-08 | 2011-10-13 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | B-cell antigen presenting cell assay |
| NZ616304A (en) | 2011-04-08 | 2016-01-29 | Immune Design Corp | Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses |
| EP3563834A1 (en) | 2012-02-07 | 2019-11-06 | Infectious Disease Research Institute | Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same |
| BR112014023092A8 (pt) | 2012-03-18 | 2017-07-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composição imunogênica, método para a prevenção de infecção ou doença por hpv em um indivíduo, e, kit |
| AU2013262691B2 (en) | 2012-05-16 | 2018-12-20 | Immune Design Corp. | Vaccines for HSV-2 |
| US9657076B2 (en) | 2012-10-23 | 2017-05-23 | Emory University | GM-CSF and IL-4 conjugates, compositions, and methods related thereto |
| AU2014253791B2 (en) | 2013-04-18 | 2019-05-02 | Immune Design Corp. | GLA monotherapy for use in cancer treatment |
| US9463198B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-10-11 | Infectious Disease Research Institute | Compositions and methods for reducing or preventing metastasis |
| EA201691348A1 (ru) | 2013-12-31 | 2016-11-30 | Инфекшес Дизиз Рисерч Инститьют | Однофлаконные вакцинные составы |
| KR20180115276A (ko) | 2016-02-22 | 2018-10-22 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 생체 분자의 고정화 방법 |
| JP7195147B2 (ja) | 2016-05-16 | 2022-12-23 | アクセス ツー アドバンスト ヘルス インスティチュート | Ｐｅｇ化リポソームおよび使用方法 |
| KR102392974B1 (ko) | 2016-05-16 | 2022-05-02 | 인펙셔스 디지즈 리서치 인스티튜트 (아이디알아이) | Tlr 작용제를 함유하는 제제 및 사용 방법 |
| AU2017273650B2 (en) | 2016-06-01 | 2022-08-18 | Access To Advanced Health Institute | Nanoalum particles containing a sizing agent |
| CN111315362A (zh) | 2017-06-15 | 2020-06-19 | 传染病研究所 | 纳米结构脂质载剂和稳定乳剂以及其用途 |
| WO2019051149A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Infectious Disease Research Institute | LIPOSOMAL FORMULATIONS COMPRISING SAPONIN AND METHODS OF USE |
| MX2021014363A (es) | 2019-05-25 | 2022-02-21 | Infectious Disease Res Inst | Composicion y metodo para secar por pulverizacion una emulsion de vacuna adyuvante. |
| US20230310323A1 (en) | 2020-09-04 | 2023-10-05 | Access To Advanced Health Institute | Co-lyophilized rna and nanostructured lipid carrier |
| CA3210363A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-18 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hpv vaccine manufacture |
| WO2024052882A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Access To Advanced Health Institute | Immunogenic vaccine composition incorporating a saponin |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4956288A (en) * | 1988-04-22 | 1990-09-11 | Biogen, Inc. | Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA |
| NZ232913A (en) * | 1989-03-15 | 1992-08-26 | Gist Brocades Nv | Il-3 produced recombinantly and purified to homogeneity; vectors and pharmaceutical preparations |
| DE122007000019I1 (de) * | 1991-07-19 | 2007-07-26 | Univ Queensland | Impfstoffen gegen Papillomavirus |
-
1994
- 1994-03-08 AT AT94912186T patent/ATE296111T1/de active
- 1994-03-08 DE DE201112100018 patent/DE122011100018I1/de active Pending
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2006
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2011
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| EP0692028B1 (en) | Pharmaceuticals based on papillomaviruses | |
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| US20020197264A1 (en) | Protecting against canine oral papillomavirus (COPV) | |
| US8062642B1 (en) | Production of papillomavirus capsid protein and virus-like particles | |
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| Rose | Production and characterization of human papillomavirus (HPV) virus-like particles (VLPs): novel diagnostic reagents and vaccine candidates for genital HPV disease | |
| Embers | Immunogenicity and Cellular Protein Associations of the Papillomavirus Minor Capsid Protein |