JP2000501285A

JP2000501285A - 合成ｈｐｖ１１ウイルス様粒子

Info

Publication number: JP2000501285A
Application number: JP9519092A
Authority: JP
Inventors: ルドメアラー，ステイーブン; ビーニンケイサ，ダイアナ; マーク，ジヨージ・イー，ザ・サード
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-11-15
Filing date: 1996-11-12
Publication date: 2000-02-08
Also published as: CA2237224C; EP0863982A4; EP0863982B1; DE69631380T2; WO1997018301A1; ES2213185T3; DE69631380D1; EP0863982A1; ATE258222T1; CA2237224A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトパピローマウイルス感染のキャラクタリゼーションに有用な一連の合成ウイルス様粒子及びその合成ウイルス様粒子を用いるアッセイである。合成ウイルス様粒子は、ＨＰＶ６：４；ＨＰＶ６：５；ＨＰＶ１１：Ｇ１３１Ｓ；ＨＰＶ１１：Δ１３２；ＨＰＶ１１Ｙ２４６Ｆ；ＨＰＶ１１：Ｎ２７８Ｇ；ＨＰＶ１１：Ｓ３４６Ｔ；ＨＰＶ６：２；ＨＰＶ６：４Δ１３２；及びＨＰＶ６：４，Ｓ１３１Ｇと命名した構築物から産生される。

Description

【発明の詳細な説明】合成ＨＰＶ１１ウイルス様粒子発明の分野本発明は、ヒトパピローマウイルス感染のキャラクタリゼーションに有用な一連の合成ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びその合成ウイルス様粒子を用いるアッセイである。発明の背景パピローマウイルス感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビ、ウシを含む種々の動物で起こる。パピローマウイルスは上皮細胞に感染し、一般的に感染部位に良性上皮腫瘍又は良性線維上皮腫瘍を誘起する。パピローマウイルスは種特異的感染体であり、ヒトパピローマウイルスは非ヒト動物に感染できない。パピローマウイルスは感染する宿主に基づき異なる群に分類できる。更に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、ＤＮＡ配列相同性に基づき６０を超える型に分類される（総説として、Papillomaviruses and Human Cancer,H.Pfister編, CRC Press,Inc.，1990 を参照されたい）。パピローマウイルスの一つの型の感染に対する中和免疫は別の型のパピローマウイルスに対して免疫を与えないという点で、パピローマウイルスの型は型特異的免疫原であるように考えられる。ヒトにおいて、異なるＨＰＶ型は別の病気を引起こす。ＨＰＶ１、２、３、４、７、１０、２６〜２９型は、正常のヒト及び免疫低下ヒトの両方に良性イボを引起こす。ＨＰＶ５、８、９、１２、１４、１５、１７、１９〜２５、３６、４６〜５０型は、免疫低下のヒトに偏平性病変を引起こす。ＨＰＶ６、１１、３４、３９、４１〜４４、５１〜５５型は、性器粘膜又は呼吸器粘膜の非悪性コンジローマを引起こす。ＨＰＶ１６、１８型は、性器粘膜の上皮異形成を引起こし、その場所での侵入性の子宮癌、膣癌、外陰部癌、肛門癌の大部分に関連している。ＨＰＶ６とＨＰＶ１１は、全てのンジローマ（性器いぼ）と喉頭乳頭腫の９０％以上に対する原因体である。ＨＰＶ６型の最も豊富な亜型はＨＰＶ６ａである。動物での免疫学研究によると、パピローマウイルス抗原に対する中和抗体の産生は、同一型のウイルスの感染を予防する。有効なパピローマウイルスワクチンの開発は、パピローマウイルスのインビトロ培養に関する困難性により遅れている。有効なＨＰＶワクチンの開発は、適当な動物モデルが無いために特に遅れている。抗体によるパピローマウイルスの中和は、型特異的であり、ウイルス表面のエピトープのコンフォメーションによるように考えられる。パピローマウイルスは小さく（５０−６０ｎｍ）、エンベロープを有せず、正二十面体のＤＮＡウイルスであって、最大８個の初期遺伝子と２個の後期遺伝子をコードする。このウイルスゲノムの読取り枠（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２と命名されている（“Ｅ”は初期(early)、“Ｌ”は後期(late)を指す）。Ｌ１とＬ２はウイルスキャプシドタンパク質をコードする。初期（Ｅ）遺伝子は、ウイルス複製と細胞の形質転換などの機能に関連している。Ｌ１タンパク質は主要キャプシドタンパク質であり、分子量５５−６０ｋＤａを有する。Ｌ２タンパク質は少量のキャプシドタンパク質であり、推測分子量５５−６０ｋＤａを有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定すると見掛けの分子量７５−１００ｋＤａを有する。免疫学的データによると、Ｌ２タンパク質の大部分はＬ１タンパク質より内側にあることが示唆される。Ｌ２タンパク質は異なるパピローマウイルス間で高度に保存され、特にＣ末端の１０個の塩基性アミノ酸はそうである。Ｌ１のＯＲＦは異なるパピローマウイルスの間で高度に保存されている。Ｌ１遺伝子とＬ２遺伝子は、動物でパピローマウイルス感染の予防と治療のためのワクチンを製造するために用いられている。Zhouら(1991;1992)は、ＨＰＶ１６型のＬ１遺伝子とＬ２遺伝子をワクシニアウイルスベクターにクローン化し、組換えべクターをＣＶ−１哺乳動物細胞に感染させ、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生させた。細菌由来組換えウシパピローマウイルスＬ１及びＬ２が製造された。組換え細菌タンパク質に対する中和血清は、恐らくは天然タンパク質と細菌由来タンパク質のコンフォメーションの違いによって低レベルでしか天然ウイルスと交差反応しなかった。ＨＰＶ６Ｌ１、ＨＰＶ１１Ｌ１、ＨＰＶ１６Ｌ１、ＨＰＶ１８Ｌ１、ＨＰＶ３１Ｌ１、又はＨＰＶ１６Ｌ２のＯＲＦを発現する組換えバキュロウイルスを用いて、昆虫Ｓｆ９細胞に感染させ、Ｌ１及びＬ２タンパク質が製造された。ウエスタンブロット分析によると、バキュロウイルス由来Ｌ１及びＬ２タンパク質はＨＰＶ１６に対する抗体と反応した。 Carterら(1991)は、サッカロマイセス・セレビシエの組換え株によるＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質とＨＰＶ１６Ｌ２タンパク質の産生を示した。Carterらはまた、ＨＰＶ６ｂＬ１タンパク質とＬ２タンパク質の産生を示した。ＨＰＶ６ｂＬ１タンパク質は完全長のＬ１タンパク質ではなかった。組換えタンパク質は細胞内産物としても分泌産物としても産生された。組換えＬ１タンパク質とＬ２タンパク質の分子量は天然タンパク質と同様であった。該タンパク質が細胞内で発現された場合、変性剤を用いずに細胞を溶解させたときに、該タンパク質の大部分は不溶性であることが知見された。この不溶性のためにタンパク質の精製が容易になりうるが、タンパク質の天然のエピトープの分析を妨げうる。酵母から分泌された組換えタンパク質は酵母由来炭水化物を含むことが知見された。これらのＮ結合オリゴ糖の存在によって天然のエピトープを覆い隠しうる。更に、分泌組換えタンパク質は、分泌用リーダー配列を保持するといった他の修飾も含みうる。本発明は、天然のパピローマウイルスタンパク質の免疫付与という性質を有する組換えパピローマウイルスタンパク質の製造及びそれらの製造方法と使用に関する。本発明は、ヒトパピローマウイルス感染のキャラクタリゼーションに有用な一連の合成ウイルス様粒子及び合成ウイルス様粒子を用いるアッセイである。本発明は、中和抗体との結合に必要なＨＰＶ１１Ｌ１に特異的な残基の同定も包含する。本発明は更に、中和抗体との結合に共に必要且つ十分なＨＰＶ１１Ｌ１に特異的な２個の残基の同定も包含する。ＨＰＶ１１Ｌ１は，ＨＰＶ６Ｌ１とは３８個のアミノ酸の違いと１個の残基挿入だけが異なる。これらの２種のタンパク質間の強い相同性にも関らず、ＨＰＶ１１ＶＬＰに特異的な一連の中和モノクローナル抗体が産生された。本発明者らは、これらのアミノ酸の位置のどれが中和モノクローナル抗体の結合に重要であるかを決定した。このことは以下のようにして行った。即ち、これらの位置におけるＨＰＶ１１アミノ酸残基の代わりにＨＰＶ６ｂアミノ酸残基への置換を含むＨＰＶ１１クローンのファミリーに対するモノクローナル抗体の結合を評価し、これらの極めて重要な位置でＨＰＶ１１配列と一致するようにＨＰＶ６ｂに変異を導入した。本発明者らは、中和抗体はたった２個の置換によってＨＰＶ６ｂＶＬＰに結合し、両方の置換が結合に必須であることを示した。この研究によって、中和抗体に結合する最小ユニットが明確にされる。ＨＰＶ１１に対する一連の中和モノクローナル抗体はNeilChristiansen（ペンシルバニア州立大学，Hershey，PA）から入手した。一連のモノクローナル抗体はＨＰＶ１１特異的でＶＬＰ依存性である。全てのモノクローナル抗体に重複位置があるけれども、どのアミノ酸残基が個々の抗体の結合に影響を与えるかという点で、抗体は互いに区別できうる。これらの残基は集合的に、ＨＰＶ１１を中和することが知られている抗体のエピトープを規定する。原則として、これらの選択位置だけでのＨＰＶ６Ｌ１の変異によって、これらのＨＰＶ１１特異的中和抗体へ結合できるようになる。変異ＨＰＶ６ＶＬＰを用いて、ＨＰＶ１１を中和するエピトープに対するモノクローナル抗体を製造できる。このことは、製造されたＨＰＶ１１ＶＬＰが中和エピトープを含むことを証明するリリースアッセイの基礎である。この問題は、過去及び本発明者らの知見まで解決されなかったが、本発明者の知見はコンフォメーション依存性エピトープの移入の最初の証明である。克服しなければならない２つの困難が存在した。第１に、エピトープはコンフォメーション的であり、エピトープマッピング、ペプチドフラグメントへの結合という通常の方法は利用できなかった。ウイルス構造に似せたウイルス様粒子の生成を容易にするように、試験Ｌ１タンパク質を発現させることが必要であった。第２に、マッピングに必要な多数のＬ１クローンのために、試験ウイルスコートタンパク質を発現させる容易な方法の考案が必要であった。中和エピトープを知らないで、市販できるＶＬＰの製造を可能とすることは難しいであろう。変異ＶＬＰの一つの使用は、ＨＰＶ１１リリースアッセイにおける試薬としてである。これらの研究で規定された位置でＨＰＶ１１に一致するように、ＨＰＶ６Ｌ１に変異を導入する。これらの変異ＨＰＶ６ＶＬＰに対するＨＰＶ１１中和モノクローナル抗体の結合が証明されよう。これらの変異ＨＰＶ６ＶＰＬは、ＨＰＶ１１中和モノクローナル抗体への結合のための製造されたＨＰＶ１１ＶＬＰを用いる競合結合アッセイで使用できる。モノクローナル抗体に結合することが証明されたＨＰＶ６変異体だけが、真の物質と競合する。あるいは、変異ＨＰＶ６上の中和エピトープに対し、モノクローナル抗体を製造できる。製造されたＨＰＶ１１ワクチンは、これらの抗体に結合することが証明されよう。発明の概要本発明は、ヒトパピローマウイルス感染のキャラクタリゼーションに有用な一連の合成ウイルス様粒子及びその合成粒子を用いるアッセイである。合成ウイルス様粒子は、ＨＰＶ６：４、ＨＰＶ６：５、ＨＰＶ１１：Ｇ１３１Ｓ、ＨＰＶ１１：Δ１３２、ＨＰＶ１１Ｙ２４６Ｆ、ＨＰＶ１１：Ｎ２７８Ｇ、ＨＰＶ１１：Ｓ３４６Ｔ、ＨＰＶ６：２、ＨＰＶ６：４Δ１３２、及びＨＰＶ６：４，Ｓ１３１Ｇと命名した構築物から製造される。図面の簡単な説明図１は、型特異性を有するＶＬＰが一過性トランスフェクションで産生されることを示す。Ｓｆ９細胞は、Baculogold^TMＤＮＡ、及びｐＶＬ１３９３：ＣＲＰＶもしくはｐＶＬ１３９３：ＨＰＶ１１で同時トランスフェクションされた。細胞を６日後回収し、抽出液を調製し、ＥＬＩＳＡを、本文に記載したように行った。カラム１，ＣＲＰＶＶＬＰ；カラム２，ＨＰＶ１１ＶＬＰ；カラム３，ＳＦ９抽出液；カラム４，バキュロウイルスＤＮＡ；カラム５，ｐＶＬ１３９３：ＣＲＰＶ；カラム６，ｐＶＬ１３９３：ＨＰＶ１１。Ａ．一次抗体はＣＲＰＶ．５Ａ腹水の１０^-5希釈である。Ｂ．一次抗体はＨ１１．Ｆ１腹水の１０^-5希釈である。図２は、一過性トランスフェクションによって産生される免疫原物質は変性に感受性であることを示す。Ｓｆ９細胞を、ｐＶＬ１３９３：ＨＰＶ１１とBaculo Gold^TMＤＮＡで同時トランスフェクションし、細胞を６日後回収し、抽出液を本文に記載したように調製した。抽出液の一部を０．１Ｍ炭酸ナトリウム，ｐＨ１０．５中に希釈して、変性させ、室温で１時間インキュベートした。次に、これらの抽出液をミクロタイタープレートに被覆し、乾燥させた。非処理抽出液をミクロタイタープレートに被覆し、４℃で一晩インキュベートした。Ｈ１１．Ｆ１腹水又はＨ６．Ｃ６腹水の１０^-5希釈を用い、方法の項に記載してあるようにＥＬＩＳＡを行った。カラム１，Ｓｆ９抽出液；カラム２，ｐＶＬ１３９３抽出液。Ａ，抽出液は非変性；Ｂ，抽出液は炭酸緩衝液処理。図３は、ＨＰＶ１１とＨＰＶ６のＬ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。これらの配列はまたＥＭＢＬジーンバンクでも利用できる。図４は、クローンＨＰＶ６：２（位置１３１での置換、位置１３２を作出するチロシン挿入）から製造されるＶＬＰは抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１、Ｈ１１．Ｇ５と結合することを示す。対照的に、位置１３１（ＨＰＶ６：４，Ｇ１３１Ｓ）又は位置１３２（ＨＰＶ６：４Δ１３２）で復帰変異したＨＰＶ６：４から製造されたＶＬＰは、３個の他の極めて重要な残基置換が存在するのにも関らず、これらの抗体に結合しない。抗体Ｈ１１Ｂ２、Ｈ１１Ｆ１、Ｈ１１Ｇ５は異種移植系での中和モノクローナル抗体である。Ｈ６Ｃ６で、実施例４で記載したＬ１産生の総レベルが測定される。ＥＬＩＳＡは実施例３で記載のように行った。発明の詳細な説明本発明は、ヒトパピローマウイルス感染のキャラクタリゼーションに有用な一連の合成ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及びその合成ウイルス様粒子を用いるアッセイであり、そのアッセイは組換えＤＮＡ技術によって製造されたＶＬＰをモニターし、確認するために使用できる。合成ウイルス様粒子は、ＨＰＶ６：４、ＨＰＶ６：５、ＨＰＶ１１：Ｇ１３１Ｓ、ＨＰＶ１１：Δ１３２、ＨＰＶ１１Ｙ２４６Ｆ、ＨＰＶ１１：Ｎ２７８Ｇ、ＨＰＶ１１：Ｓ３４６Ｔ、ＨＰＶ６：２；ＨＰＶ６：４Δ１３２、及びＨＰＶ６：４Ｓ１３１Ｇと命名した構築物から製造される。パピローマウイルス感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビ、ウシを含む種々の動物で起る。パピローマウイルスは上皮細胞に感染し、一般的に感染部位で良性上皮腫瘍又は腺維上皮腫瘍を引起す。パピローマウイルスは、感染する宿主に基づき異なる群に分類されうる。更に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）はＤＮＡ配列相同性に基づき６０を超える型に分類される（総説として、Papillomaviruses and Human Cancer，H.Pfister 編，CRCPress，Inc.，1990 を参照されたい）。パピローマウイルスの一つの型の感染に対する中和免疫は別の型のパピローマウイルスに対して免疫を与えないという点で、パピローマウイルスの型は型特異的免疫原であるように考えられる。ヒトにおいて、異なるＨＰＶ型は別の病気を引起こす。ＨＰＶ１、２、３、４、７、１０、２６〜２９型は、正常のヒト及び免疫低下ヒトの両方に良性イボを引起こす。ＨＰＶ５、８、９、１２、１４、１５、１７、１９〜２５、３６、４６〜５０型は、免疫低下のヒトに偏平性病変を引起こす。ＨＰＶ６、１１、３４、３９、４１〜４４、５１〜５５型は、性器粘膜及び呼吸器粘膜の非悪性コンジローマを引起こす。ＨＰＶ１６、１８型は、性器系の上皮異形成を引起こし、その場所での侵入性の子宮癌、膣癌、外陰部癌、肛門癌の大部分に関連している。ＨＰＶ６とＨＰＶ１１は、性器いぼと喉頭乳頭腫の大部分を引起す。動物での免疫学研究によると、パピローマウイルスキャプシドタンパク質に対する中和抗体の産生は、同一型のウイルスの感染を予防する。有効なパピローマウイルスワクチンの開発は、パピローマウイルスのインビトロ培養に関する困難性により遅れている。有効なＨＰＶワクチンの開発は、適当な動物モデルが無いために特に遅れている。抗体によるパピローマウイルスの中和は、型特異的であり、ウイルス表面のエピトープのコンフォメーションによるように考えられる。パピローマウイルスは小さく（５０−６０ｎｍ）、エンベロープを有せず、正二十面体のＤＮＡウイルスであって、最大８個の初期遺伝子と２個の後期遺伝子をコードする。このウイルスゲノムの読取り枠（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２と命名されている（“Ｅ”は初期(early)、“Ｌ”は後期( late)を指す）。Ｌ１とＬ２はウイルスキャプシドタンパク質をコードする。初期（Ｅ）遺伝子は、ウイルス複製と形質転換などの機能に関連している。Ｌ１タンパク質は主要キャプシドタンパク質であり、分子量５５−６０ｋＤａを有する。Ｌ２タンパク質は少量のキャプシドタンパク質であり、推測分子量５５−６０ｋＤａを有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定すると見掛けの分子量７５−１００ｋＤａを有する。サッカロマイセス・セレビシエの組換え株によるＨＰＶ１６Ｌ１、ＨＰＶ１６Ｌ２、ＨＰＶ６型Ｌ１タンパク質の産生が報告された。組換え酵母を培養して、任意の種と型のパピローマウイルスタンパク質を大量に産生させる方法の開発は有用であろう。天然タンパク質のコンフォメーションなどの天然タンパク質の免疫付与性を有するパピローマウイルスタンパク質を大量に産生させることも有用であろう。この後者の目標を達成するために、知られている性質（ＶＬＰ依存性、交差反応性など）を有する抗体の結合に対するＬ１遺伝子の多数の変異の効果を分析することは必要であろう。機能性残基のための天然又は工学的ペプチド配列の実験的調査は、それらの相対的機能性力価をアッセイするために、多数の配列変異体の発現に基本的に依存する。得られたタンパク質発現レベルは、自己集合性ウイルス構造タンパク質の場合に特に決定的である。何故ならば自己集合の効率はしばしば濃度依存性であるからである。ウイルス自己集合を研究するために、昆虫バキュロウイルス発現ベクター系が広く使用されてきたが、昆虫バキュロウイルス発現ベクター系には、有用量の自己集合粒子を産生するために、プラーク精製した組換えウイルスストックの前もっての単離と増殖が一般的に必要である。綿尾ウサギパピローマウイルスとヒト１１型パピローマウイルスのＬ１コートタンパク質の分析レベルの発現の幾つかの可能性を試験するうちに、本発明者らは、バキュロウイルストランスファーベクターとウイルスＤＮＡによる昆虫細胞の短時間の一過性同時トランスフェクションからでさえ、プラーク精製ストックから以前に得られた粒子とは免疫学的に区別できない自己集合粒子が得られることを見出した。Ｓｆ９細胞をプラスミド／ウイルスＤＮＡで同時転換すると６日以内に、１００ｍｍプレート当り少なくとも１〜２μｇの自己集合Ｌ１粒子を証明することができた。このレベルの発現で機能性をアッセイするのには十分過ぎ、比較される哺乳動物細胞一過性発現系に対し幾つかの利点を有する。ＨＰＶ感染における中和エピトープを明確にするために、本発明者らにとって、ヒトパピローマウイルス亜型の抗原型特異性を与えるアミノ酸残基を同定する必要がある（Christensen,N.D.ら、1990，Monoclonal antibody-mediatedneutra lization of infectious human papillomavirus type 11.J.Virol．64，1936-19 44）。型特異的エピトープの多数がコンフォメーション依存性であり、ＶＬＰ自己集合が起きてのみ検出される。幾つかの動物とヒトパピローマウイルスのＬ１構造コートタンパク質は、組換えバキュロウイルス株により昆虫細胞で発現されると、効率的に自己集合することが示された（Christensen,N.D.ら、1994，Asse mbled baculovirus-expressed human papillomavirus type 11 L1 capsid prote invirus-like particles are recognized neutralizing monoclonal antibodies and induce high titers of neutralizing antibodies ．J.Gen.Virol．75，2271-2276）。組換えファージの産生に必要な時間と労力により、部位指向性突然変異誘発によって産生される多数のＶＬＰ変異体をスクリーニングするこの方法の使用が妨げられる。しかし、バキュロウイルス系で発現される場合、プラスミドとウイルスＤＮＡによる昆虫細胞の最初のトランスフェクションの５〜７日以内に、組換えタンパク質は分泌産物としてμｇ／ｍＬの量が検出できることを本発明者らは以前に観察した。この観察に基づき、一過性発現でＶＬＰに自己集合できるように十分量のパピローマウイルスＬ１タンパク質が蓄積するかどうかを、特にBaculogold^TM(Pharmingen，San Diego，CA)系などのより効率的バキュロウイルストランスフェクション系を使用した場合に本発明者らは試験した。迅速６日一過性トエランスフェクションプロトコルを用いて、ＶＬＰに適切に自己集合した、多数のパピローマウイルス型のＬ１コートタンパク質が産生された。ＣＲＰＶ又はＨＰＶ１１Ｌ１遺伝子構築物により一過性にトランスフェクトされた細胞からの抽出液は、ＣＲＰＶ又はＨＰＶ１１ＶＬＰに対し産生された型特異的且つＶＬＰ依存性のモノクローナル抗体によって認識される免疫原物質を含んでいた。一過性に発現された物質は他の型の特異的抗体とは交差反応せず、認識はアルカリ変性に感受性であり、ＶＬＰ形成の忠実性を更に示していた。ＨＰＶ１１の中和エピトープをマップするために、配列がＨＰＶ６ｂ配列とは異なる残基でＨＰＶ１１に個々に変異を起こした。ＨＰＶ６ｂ配列と一致するようにその位置で変異を起こした（挿入の効果を分析するために、位置１３２のチロシンを欠失させた）。上記Ｓｆ９一過性発現系を用いて、これらの変異ＨＰＶ１１Ｌ１遺伝子を発現させ、ＨＰＶ１１に特異的なモノクローナル抗体による結合を分析した。本発明を更に明確にするために、以下の実施例を記載するが、本発明を以下の実施例という特定の例に本発明を限定するものではない。実施例１試験発現構築物の作製報告されたＬ１配列から設計したプライマーによるＰＣＲを用いて、臨床分離株からＨＰＶ１１Ｌ１構造遺伝子をクローン化した。次に、Ｌ１遺伝子を、変異誘発用にＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ (Pharmacia)及びＳｆ９細胞での発現用にｐＶＬ１３９３(Stratagene)の両方にサブクローン化した。 Amersham Scultor インビトロ変異誘発キットを用いて、変異をＬ１遺伝子に導入した。所望の変異が導入されたことは、配列決定によって確認し、変異遺伝子を、Ｓｆ９細胞における発現用ｐＶＬ１３９３にサブクローン化した。ＨＰＶ６Ｌ１構造遺伝子を、変異誘発用にｐＡｌｔ−１(Promega)及びＳｆ９細胞での発現用にｐＶＬ１３９３(Stratagene)の両方にサブクローン化した。 Altered SitesIIインビトロ変異誘発システム(Promega)を用いて、変異を起こし、配列決定によって確認し、Ｓｆ９細胞における発現用にｐＶＬ１３９３にサブクローン化した。ＨＰＶ６とＨＰＶ１１のＬ１遺伝子の配列を報告された配列で確認した［（Da rtmann,K.ら、1993，EMBO J．2:2341;EMBLGeneBank受託番号＃Ｍ１４１１９（ＨＰＶ１１Ｌ１）及び受託番号＃Ｘ００２０３（ＨＰＶ６ＢＬ１）］。実施例２ＳＦ９細胞におけるＬ１ＶＬＰの一過性発現 BaculoGold トランスフェクションキット(Pharmingen)を用いてＳｆ９細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは基本的に製造業者の指示のように行ったが、以下の改変を行った。即ち、８×１０⁸個のＳｆ９細胞を、１００ｍＭディッシュ中で、BaculoGold ＤＮＡ４μｇと試験ＤＮＡ６μｇでトランスフェクトした。細胞を６日後回収し、ＶＬＰ産生をアッセイした。実施例３ＳＦ９抽出液の調製及びＥＬＩＳＡアッセイトランスフェクション６日後、掻き取り、次いで低速遠心によって細胞を回収した。細胞を溶解緩衝液（１ＭＮａＣｌ，０．２ＭＴｒｉｓｐＨ７．６）３００μＬに再懸濁し、Ｆａｌｃｏｎ１２５９チューブ中でＰＴ−ＤＡ１２０５／２−Ａプローブを備えたポリトロンＰＴ１２００Ｂを用いて、氷上３０秒間ホモジナイズした。サンプルを２５００ｒｐｍで３分間遠心し、ペレット残渣を得た。チューブを更に溶解緩衝液１５０μＬで洗浄し、上清を１．５ｍＬ微量遠心チューブに集め、Eppendorf微量遠心機(Brinkman)で５分間再遠心した。上清を集め、使用するまで４℃で保存した。典型的にはＥＬＩＳＡアッセイを同日行った。抽出液５μＬを、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水；２０ｍＭＮａＰＯ₄，ｐＨ７．０，１５０ｍＭＮａＣｌ）中１％ＢＳＡ５０μＬ中に希釈し、ポリスチレンプレートに入れた。プレートを４℃で一晩インキュベートした。抽出液を除去し、プレートをＰＢＳ中の５％粉乳でブロックした。以下の全ての洗浄工程をＰＢＳ中１％ＢＳＡで行った。プレートを１次抗体と室温で１時間インキュベートした。１次抗体、即ちＨＰＶ１１ＶＬＰに対して作出されたモノクローナル抗体はNeilChristensen 博士（ペンシルバニア州立大学）から腹水ストックとして得た。使用前にそれらを１％ＢＳＡＰＢＳで１０⁵倍希釈した。洗浄後、プレートを、２次抗体と１時間インキュベートした。２次抗体、即ちペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）をKirkegaard & Perry Laboratoriers,Inc.から購入し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中で、１０³倍希釈して使用した。最終洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼアッセイを行い、４０５ｎｍの吸光度を測定した。実施例４ＨＰＶ１１研究ＨＰＶ１１特異的中和エピトープのために極めて重要な残基をマップするために、２種の条件を利用する。第１に、ＨＰＶ１１Ｌ１に特異的で、ＶＬＰで存在するときにＬ１だけを認識する一連のモノクローナル抗体を用いた。実施例３で記載したアッセイ条件は、これらの抗体が密接に関連するＨＰＶ６ｂＬ１ＶＬＰと交差反応性を示さないようなものである。これらの５種の抗体のうち、４種は、Kr eider異種移植系（Kreiderら、1987，J.Virol．61:590-593）でＨＰＶ１１を中和することが示された。ＨＰＶ６とＨＰＶ１１のＬ１は、パピローマウイルスファミリー内で最も密接に関連するＬ１タンパク質である。ＨＰＶ６Ｌ１の長さは５００アミノ酸残基である。ＨＰＶ１１Ｌ１は５０１残基である。ＨＰＶ１１の余分のアミノ酸が位置１３２にあるように、それらを並べることができる。このアラインメントで、３９個の位置を除いた（挿入を含む）全てで、それらのアミノ酸配列は同一である（９２．４％）。本発明者らは、モノクローナル抗体の１１型特異性はこの３９個の残基の差異にあるにちがいないと推察した。１１型残基を６型に体系的に変化させることにより、１１型反応に極めて重要な残基は、１１型特異的モノクローナル抗体による結合アフィニティを無くすことによって示されるであろう。天然で６型にある残基に、残基を変異させるので、ＶＬＰ形成に影響を与えるような置換の可能性は小さいであろう。特定の残基の結合への影響を知る為に、ＨＰＶ１１及び対応するＨＰＶ１１変異体の両方を一過性発現系で発現させた。一連のＨＰＶ１１特異的モノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡを行い、２つの間で結果を比較した。Ｌ１産生はモノクローナル抗体Ｈ６．Ｃ６．で規格化した。Ｈ６．Ｃ６．抗体は、エピトープが直鎖状であり、ＶＬＰ形成とは無関係なＨＰＶ１１と交差反応性を有する。従って、Ｌ１産生を測定する。結果を二重規格化する。第１に、試験抗体とＨ６．Ｃ６．の吸光度比を、試験位置で計算する。同一比がＨＰＶ１１で測定され、試験位置での比に割り算される。ほぼ１の２種の比は、ＨＰＶ１１に比較して試験クローンへの抗体結合に検出できる差異はないことを意味する。１未満の２種の比は、試験抗体は野生型より試験クローンに少なくしか結合しないことを意味する。理論では、１超の比は、抗体はＨＰＶ１１よりも試験クローンにより結合することを意味する。実際には、これは観察されなかった。０．１〜０．２の範囲の比は本質的にバックグラウンドであり、変異ＶＬＰへの抗体結合を検出できないことを意味する。ＨＰＶ６とは異なるＨＰＶ１１Ｌ１の位置に個々に、ＨＰＶ６の対応する残基に一致するように変異を起こさせた。組換え体発現バキュロウイルスによって、クローンをＳｆ９細胞で発現させ、一連のＨＰＶ１１特異的モノクローナル抗体による結合への影響を測定した（表１）。カラム２で“より少ない結合”と記載した残基は、１種以上のモノクローナル抗体の結合に決定的と考えられる位置である。カラム１で“結合保持”と記載した残基は、いずれのモノクローナル抗体との結合に決定的でないと判断される。カラム“結合喪失”の下に表１で記載したＬ１変異体をコードするクローンはＨＰＶ１１：Ｇ１３Ｓ、ＨＰＶ１１：Ｙ１３２Δ、ＨＰＶ１１：Ｙ２４６Ｆ、ＨＰＶ１１：Ｎ２７８Ｇ、ＨＰＶ：Ｓ３４６Ｔと命名する。あるいは、“ＨＰＶ” という接頭語は省いてもよい。結合に影響する４個の残基は互いにかなり離れており、全長は直鎖状配列にそって２００個を超す残基を包含する。位置は抗体の結合に異なる影響を与える。たった３個以下の位置が単一抗体の結合に影響を与える。位置２４６だけでも５種全ての抗体の結合に影響を与える。全ての場合に、検出可能な結合がある程度観察される。このことは，ＶＬＰ形成は影響されないことを示す。位置２７８での変化による結合への影響は最小であるようであり、疑わしいが、この時点で含まれる。何故ならば、僅かの減少は再現性があるからである。ＶＬＰ規格化アフィニティ比によって測定された結合への影響は表２に示す。表３は、これらの研究から導かれる、ＨＰＶ１１モノクローナル抗体の結合コンフィギュレーションを示す。 ^★（規格化アフィニティ比＝位置Ｘ(A₄₀₅H11.Y/A₄₀₅H.6.C6)/HPV11(A₄₀₅H11.Y/A₄₀₅H6.C6) 実施例５ストリッピングアッセイＨＰＶ１１ＶＬＰの産生をモニターし、ＨＰＶ１１ＶＬＰが重要な中和エピトープを含むことを確認するために、以下の競合ＥＬＩＳＡを用いる。ＨＰＶ６ＶＬＰではなく、ＨＰＶ６変異体ＶＬＰは、ＨＰＶ１１ＶＬＰへの結合において、モノクローナル抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１、Ｈ１１．Ｇ５と競合する。このことは、中和エピトープへの特異的且つ競合的結合を示すことによって、ＶＬＰ上の中和エピトープの存在を示す。アッセイは以下のように行う。１．９６ウエルＥＬＩＳＡプレートの各ウエル当り試験バッチＨＰＶ１１ＶＬＰ１０−１００ｎｇを添加する。サンプル５０μＬを入れる。４℃で一晩インキュベートする。２．ウエルから上清を除去する。室温で１時間、ＰＢＳ中５％粉乳でブロックする。３．ＥＬＩＳＡ緩衝液で濯ぐ。４．モノクローナル抗体Ｈ１１．Ｆ１の希釈液を調製する。Ａ．一セットの、ＨＰＶ６変異ＶＬＰの増加していく量を有する希釈液の調製。Ｂ．ＨＰＶ６ＶＬＰの増加していく量を有する二重セットの希釈液の調製。Ｃ．ＶＬＰを加えない希釈液の調製。５．ＥＬＩＳＡプレートのウエルへ抗体サンプル５０μＬを添加する。６．抗体を除去し、ＥＬＩＳＡ緩衝液で３回洗浄する。７．適当な希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）５０μＬを添加する。室温で１時間インキュベートする。８．ＥＬＩＳＡ緩衝液で３回洗浄する。アルカリ性ホスファターゼによる発色及び４０５ｎｍでの測定。９．ＨＰＶ６ＶＬＰではなく、ＨＰＶ６変異体ＶＬＰと強く競合する４０５ｎｍの強いシグナルは、試験バッチのＨＰＶ１１ＶＬＰ上の中和エピトープの存在を示す。実施例６中和のモニターＨＰＶ６変異体ＶＬＰを用いて、試験バッチのポリクローナル血清の中和活性のキャラクタリゼーションを行う。一バッチのポリクローナル血清を、例えば試験バッチのＨＰＶ１１ＶＬＰで作出する。あるいは、それは、中和能力というキャラクタリゼーションが所望されるヒトサンプルである。ポリクローナル血清を、ＨＰＶ６ＶＬＰで予めきれいにする。このことにより、ＶＬＰ依存性及び非依存性の両方の交差反応性抗体を除去する。ＨＰＶ１１中和エピトープは１１型特異的であり、それに対して作出された抗体は、ＨＰＶ６ＶＬＰとのプレ−インキュベーションでも除去されない。しかし、変異ＨＰＶ６粒子はこれらの抗体と結合し、このような結合の観察は、例えば標準的ＥＬＩＳＡでの観察は、試験血清サンプル中の中和抗体の存在を示す。ポリクローナル血清の試験サンプルを以下の方法によりきれいにする。１．全ＶＬＰ結合抗体を評価する。抗ＨＰＶ１１モノクローナル抗体（幾つかが利用できる）を用いるサンドイッチ形式で、ＥＬＩＳＡプレートにＶＬＰを固定化する。結合するポリクローナル抗体の量は、標準として既知濃度の第２の抗ＨＰＶ１１抗体を用いて評価する。あるいは、ボリクローナルのＩｇＧ濃度を測定し、全部が抗ＨＰＶ１１であると仮定する。２．ＨＰＶ６ＶＬＰを、工程１で測定したように、ポリクローナル血清中のＨＰＶ１１抗体量に１０倍μｇ過剰で血清のアリコートに加える。３．混合液を室温で一晩インキュベートし、高速遠心（３００，０００ｇ）を５時間行い、ＶＬＰ−抗体複合体をペレットにする。４．この方法をもう２回繰返す。５．きれいにされた血清をサンドイッチＥＬＩＳＡでの結合に関して試験する。ＨＰＶ６ＶＬＰ及びＨＰＶ６変異体ＶＬＰ（中和モノクローナルに結合する）を、ＨＰＶ６モノクローナル抗体で固定化する。きれいにされたポリクローナル血清は、ＨＰＶ６ＶＬＰに最小の結合しか示さないはずである。ＨＰＶ６変異体ＶＬＰに対する強いシグナルは、ＨＰＶ１１の主要中和ドメインへの結合を示し、ポリクローナル血清は中和抗体を含むことを示す。異種移植中和活性を用いて、試験血清サンプル中の中和能力を示すために、第２のアッセイを確立できる（Christensenら、1990，J.Viol．64:1936-1944;Chri stensenら、1994，J．Gen.Viol．75:2271-2276）。１．上記プロトコルに基づき、但しＨＰＶ６ＶＬＰの代わりにＨＰＶ６変異体ＶＬＰに置換えて、ＨＰＶ６変異体ＶＬＰに対しきれいにされた血清を作製する。２．一連のポリクローナル血清の希釈液を作製して、異種移植中和アッセイで分析し、血清の中和力価を測定する。３．ＨＰＶ６変異体を含まない血清及びＨＰＶ６を含まない血清を並行してそれぞれのセットの希釈液を作製し、異種移植で力価を測定する。４．ＨＰＶ６ＶＬＰではなく、ＨＰＶ６変異体ＶＬＰを用いてきれいにすることによって大きく除去される、異種移植アッセイでの中和活性の存在によって、生物アッセイによるＨＰＶ１１中和エピトープに対する血清中の抗体の存在が示される。実施例７Ｓｆ９細胞におけるＶＬＰの一過性発現報告されたＬ１配列（８，１７）に基づき設計したプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、臨床株からＨＰＶ１１Ｌ１構造遺伝子をクローン化した。ＣＲＰＶＬ１構造遺伝子は、ウイルスゲノムＤＮＡからＰＣＲによってクローン化した。Ｓｆ９細胞で発現させるために、Ｌ１遺伝子をｐＶＬ１３９３(Stratagene)にサブクローン化した。 BaculoGold トランスフェクションキット(Pharmingen，SanDiego,CA)を用い、Ｓｆ９細胞に同時トランスフェクトした。製造業者の指示に従い、但し以下の改変を行い、トランスフェクションを行った。即ち、８×１０⁹Ｓｆ９細胞を、１００ｍｍディシュ中で、BaculoGold ウイルスＤＮＡ４μｇと試験プラスミドＤＮＡ６μｇでトランスフェクトした。特記していなければ、６日後細胞を回収し、ウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡアッセイ（下記）によりＶＬＰ産生をアッセイした。実施例８Ｓｆ９抽出液の調製及びＥＬＩＳＡアッセイトランスフェクション６日後、細胞を回収した。プレートを掻き取り、細胞を再懸濁し、低速遠心で細胞を集めた。溶解緩衝液（１ＭＮａＣｌ，０．２ＭＴｒｉｓｐＨ７．６）３００μＬ中に細胞を再懸濁し、ファルコン２０５９チューブ中で、ＰＴ−ＤＡ１２０５／２−Ａプローブ(Brinkman)を備えたポリトロンＰＴ１２００Ｂで、３０秒間氷上でホモジナイズした。ＧＰＲ遠心機(Beckm an Instruments,Inc.Palo Alto,CA)で、３分間２５００ｒｐｍでサンプルを遠心し、ペレット残渣を得た。更なる溶解緩衝液１５０μＬでチューブを洗浄し、上清を１．５ｍＬ微量遠心チューブに集め、エッペンドルフ微量遠心チューブ(Bri nkman)で５分間再遠心した。ＥＬＩＳＡアッセイを同日に始めた。抽出液５μＬを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中１％ＢＳＡ５０μＬ中に希釈し、９６ウエルイミュロン２マイクロタイタープレート(Dynatech Labora tories,Inc.)に分注し、４℃で一晩インキュベートした。抽出液を除去し、プレートを５％粉乳／ＰＢＳでブロックした。以下の全ての洗浄工程を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで行った。プレートを、室温で１時間１次抗体でインキュベートした。１次抗体、即ちモノクローナル抗体ＣＲＰＶ．５Ａ及びＨ１１．Ｆ１を、Neil Christensen博士から腹水ストックとして得た。それらは、それぞれＣＲＰＶとＨＰＶ１１ＶＬＰを認識するＶＬＰ依存性且つ型特異的抗体である。使用前に、それらを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１０５倍希釈した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄後、プレートを１時間２次抗体、即ちＰＢＳ中１％ＢＳＡで１０³希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇ）(Kirkegaard & PerryLabor atories，Inc.)とインキュベートした。最終洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼアッセイを行い、吸光度を４０５ｎｍで測定した。実施例９ＨＰＶ６へのＨＰＶ１１中和エピトープの移入実施例４の研究に基づき、ＨＰＶ１１Ｌ１配列に一致するようにアミノ酸残基１３１、２４５、２７７でＨＰＶ６Ｌ１遺伝子に変異を導入した。更に、残基１３１の後ろにチロシンを挿入し、変異ＨＰＶ６Ｌ１遺伝子の長さを１残基増し、５０１アミノ酸とした。このクローンをＨＰＶ６：４と命名する。これらの４個の変異は全てＨＰＶ１１Ｌ１配列に一致するが、ＨＰＶ１１特異的中和抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１、Ｈ１１．Ｇ５による結合を容易にするであろう。このことは、以下の表に示すように事実そのとおりである。ＨＰＶ６及び変異体への相対的アフィニティ値このことにより、４個のアミノ酸残基１３１、１３２、２４５、２７７は中和抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１、Ｈ１１．Ｇ５への結合部位特異性を規定することが確認される。抗体Ｈ１１．Ｈ３は、位置３４６での結合感受性によって及び位置１３１での結合感受性の欠如によって他の３個の中和抗体とは区別できる。このことにより、この抗体の結合はＣ末端方向に移動するが、まだ他の３個の中和モノクローナル抗体の結合部位と重複している。更に、上記ＨＰＶ６変異体クローンに変異を起こし、位置３４５で更なる変化を加え、位置３４６でのＨＰＶ１１の配列に一致させた。このクローンをＨＰＶ６：５と命名する。それは、Ｈ１１．Ｈ３を含む中和抗体４種全てに結合すると予測される。データを以下の表に示す。ＨＰＶ６及び変異体への相対的アフィニティ値予測されるように、このクローンは、中和抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１、Ｈ１１．Ｇ５と結合できるＶＬＰを産生し、この観察が確認される。予期に反して、このクローンは抗体Ｈ１１．Ｈ３に結合せず、Ｈ１１．Ｈ３への結合のために、位置３４５における更なる変化も必要であることを示す。実施例１０中和モノクローナル抗体Ｈ１１．Ｈ３による結合抗体Ｈ１１．Ｈ３の結合を更に研究するために、ＨＰＶ６Ｌ１遺伝子の残基４３８に変異を起こし、ＨＰＶ１１Ｌ１の残基４３９に一致させた。クローンＨＰＶ６：４ｂ（１３２、２４５、２７７、３４５での変異を有する）及びＨＰＶ６：５の両方に変異を加える。これにより、クローンＨＰＶ５ｂ（１３２、２４５、２７７、３４５、４３５）及びＨＰＶ６：６が産生される。クローンＨＰＶ６：５ｂは抗体Ｈ１１．Ｈ３と結合し、クローンＨＰＶ６：６は抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１、Ｈ１１．Ｇ５、Ｈ１１．Ｈ３と結合する。これらのクローンは、請求項２と３、及び実施例７と８に記載のアッセイにおいて、獲得できる感受性を示した。実施例１１中和モノクローナル抗体の結合を更に研究するために、本発明者らは、４個の個々の位置でクローンＨＰＶ６：４に復帰変異を起こし、残基１３１と１３２でのみ復帰変異により結合喪失が起ることを示した。これらの２個の変異だけを有する更なるＨＰＶ６Ｌ１クローンの産生により、ＨＰＶ６：２はこれらの２個の変化だけで、ＨＰＶ１１中和モノクローナル抗体との結合に十分であることを示した。このように、これらの研究をまとめると、中和抗体のための最小エピトープが明確になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ビーニンケイサ，ダイアナアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者マーク，ジヨージ・イー，ザ・サードアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の構築物ａ）ＨＰＶ６：４；ｂ）ＨＰＶ６：５；ｃ）ＨＰＶ１１：Ｇ１３１Ｓ；ｄ）ＨＰＶ１１：Δ１３２；ｅ）ＨＰＶ１１Ｙ２４６Ｆ；ｆ）ＨＰＶ１１：Ｎ２７８Ｇ；ｇ）ＨＰＶ１１：Ｓ３４６Ｔ；ｈ）ＨＰＶ６：２；ｉ）ＨＰＶ６：４Δ１３２；及びｊ）ＨＰＶ６：４，Ｓ１３１Ｇ；のいずれかから産生される合成ウイルス様粒子。２．組換えＶＬＰのキャラクタリゼーション方法であって、ａ）試験バッチＨＰＶ１１ＶＬＰのサンプルをＥＬＩＳＡプレートに入れること；ｂ）サンプルをインキュベートすること；ｃ）サンプルをブロックすること；ｄ）サンプルを濯ぐこと；ｅ）（１）一セットの、ＨＰＶ６変異体ＶＬＰの増加していく量を有する希釈液を調製すること；（２）ＨＰＶ６ＶＬＰの増加していく量を有する二重セットの希釈液を調製すること；（３）ＶＬＰを加えない別の一セットの希釈液を調製すること；によってモノクローナル抗体Ｈ１１．Ｆ１を希釈し、抗体サンプルを調製すること；ｆ）ＥＬＩＳＡプレートに抗体サンプルを加え、混合物を調製すること；ｇ）混合物をインキュベートすること；ｈ）混合物を洗浄すること；ｉ）ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）を加えること；ｊ）サンプルをインキュベートすること；ｋ）サンプルを洗浄すること；ｌ）アルカリ性ホスファターゼアッセイで発色させ、４０５ｎｍで測定すること；を特徴とする該方法。