ES2248791T3 - Proteina de capsidas del virus del papiloma hpv1 recombinantes que se autoensamblan. - Google Patents
Proteina de capsidas del virus del papiloma hpv1 recombinantes que se autoensamblan.Info
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Abstract
SE PRESENTAN PROTEINAS CAPSIDAS DE PAPILOMAVIRUS RECOMBINANTE QUE SON CAPACES DE AUTO-CONGREGACION EN ESTRUCTURAS CAPSOMERAS Y CAPSIDOS VIRICOS QUE COMPRENDEN EPITOPES ANTIGENICOS CONFORMACIONALES. LAS ESTRUCTURAS DE CAPSOMEROS Y CAPSIDOS VIRICOS, QUE CONSTAN DE PROTEINAS CAPSIDAS QUE EXPRESAN PRODUCTOS DE PAPILOMAVIRUS L1 CONFORMACIONAL DE BOVINO, MONO O HUMANO QUE CODIFICAN LA SECUENCIA DE PROTEINAS, SE PUEDEN PREPARAR COMO VACUNAS PARA INDUCIR LA RESPUESTA A ANTICUERPOS QUE NEUTRALIZAN EL ELEVADO TITULO EN ANIMALES VERTEBRADOS. LAS PROTEINAS DE CAPSIDAS DE AUTO-CONGREGACION PUEDEN TAMBIEN USARSE COMO ELEMENTOS DE PROCEDIMIENTOS DE INMUNOENSAYO DIAGNOSTICO PARA INFECCIONES DE PAPILOMAVIRUS.
Description
Proteínas de cápsidas del virus del papiloma
HPV16 recombinantes que se autoensamblan.
La presente invención se refiere a proteínas
víricas recombinantes de HPV16. Se refiere particularmente a
proteínas víricas recombinantes de HPV16 que son adecuadas para uso
en el diagnóstico, en la profilaxis y en la terapia de infecciones
víricas por HPV16.
Los virus del papiloma infectan a los epitelios
de una amplia variedad de especies de animales, incluyendo los seres
humanos, induciendo generalmente tumores epiteliales y
fibroepiteliales benignos, o verrugas, en el sitio de la infección.
Cada especie de vertebrados es infectada por un grupo distinto de
virus del papiloma, comprendiendo cada grupo de virus del papiloma
varios tipos de virus del papiloma. Por ejemplo, se han aislado más
de 60 genotipos diferentes de virus del papiloma humano (HPV). Los
virus del papiloma son agentes infecciosos muy específicos de cada
especie; por ejemplo, un virus del papiloma bovino no puede inducir
papilomas en una especie heteróloga, tal como en los seres humanos.
Los tipos de virus del papiloma también parecen ser muy específicos
como inmunógenos por cuanto una inmunidad neutralizante de la
infección contra un tipo de virus del papiloma habitualmente no
confiere inmunidad frente a otro tipo, incluso cuando los tipos
infectan una especie homóloga.
En los seres humanos, los condilomas acuminados,
que están provocados por virus del papiloma humano, representan una
enfermedad de transmisión sexual. Los condilomas acuminados son muy
habituales, y la infección asintomática o latente por HPV es
incluso más habitual que la infección sintomática. Algunas lesiones
benignas en seres humanos, particularmente aquellas que se producen
debidas a ciertos tipos de virus del papiloma, sufren una evolución
neoplásica. Por esa razón, se considera que la infección por uno de
los tipos de virus del papiloma asociados con neoplasias es uno de
los factores de riesgo más importantes en el desarrollo del cáncer
de cuello uterino, el segundo cáncer más habitual de las mujeres
mundialmente (zur Hausen, H., 1991; Schiffman, M. 1992). Se han
encontrado varios genotipos de HPV diferentes en cáncer de cuello
uterino, siendo el HPV16 el tipo más habitual que se ha aislado del
50% de los cánceres de cuello uterino.
Los estudios inmunológicos que demuestran la
producción de anticuerpos neutralizantes contra antígenos del virus
del papiloma indican que las infecciones por virus del papiloma, y
las neoplasias asociadas con estas infecciones, en animales
vertebrados, se podrían prevenir mediante inmunización. Sin embargo,
el desarrollo de vacunas eficaces contra el virus del papiloma se
ha visto impedido por un número de dificultades.
En primer lugar, no ha sido posible generar in
vitro las grandes reservas de virus infeccioso requeridas para
determinar las características estructurales e inmunógenas del
virus del papiloma que son fundamentales para el desarrollo de
vacunas eficaces. Las células cultivadas expresan oncoproteínas del
virus del papiloma y otras proteínas no estructurales, y éstas se
han estudiado in vitro intensamente; pero la expresión de
las proteínas víricas estructurales, L1 y L2 (y el ensamblaje
subsiguiente del virus infeccioso) se produce sólo en capas
terminalmente diferenciadas de tejidos epiteliales infectados. Por
lo tanto, la caracterización de los genes, de las proteínas y de la
estructura víricos se ha recabado necesariamente a partir de
estudios del virus cosechado a partir de papilomas. En particular,
la estructura del virus del papiloma y la inmunidad relacionada se
han llevado a cabo en el sistema del virus del papiloma bovino,
debido a que se pueden aislar grandes cantidades de virus infeccioso
a partir de verrugas del virus del papiloma bovino (BPV).
La información derivada de los estudios de la
estructura del virus del papiloma, hasta la fecha, indica que todos
los virus del papiloma tienen estructuras icosaédricas de
5-60 nm no envueltas (Crawford, L., et al.,
1963), que consisten en una proteína de cápsida principal L1
conservada y en una proteína de cápsida secundaria L2, menos
conservada (Baker, C., 1987). No hay ninguna relación de secuencias
entre las dos proteínas. La función y la localización de L2 en la
cápsida no está clara; sin embargo, los datos inmunológicos
sugieren que la mayoría de L2 es interna a L1.
Recientemente, los análisis microscópicos
citoelectrónicos de alta resolución de viriones de BPV1 y HPV1 han
determinado que los dos virus tienen una estructura muy similar,
con 72 capsómeros pentaméricos, estando cada capsómero compuesto
presumiblemente de cinco moléculas de L1, formando una corteza
viriónica con simetría T = 7 (Baker, T., 1991). La localización de
la proteína de la cápsida secundaria L2 en el virión no se ha
determinado, y no es seguro si son necesarias L2 u otras proteínas
víricas para el ensamblaje de la cápsida. Superficialmente, la
estructura del virus del papiloma se asemeja a la del virión de 45
nm del polioma, que tiene la misma simetría y número de capsómeros
(Liddington, R., et al., 1991); sin embargo, el sistema de
contacto intercapsomérico para las especies del virus del polioma y
del virus del papiloma son diferentes, y las proteínas de la
cápsida principal y secundaria del virus del polioma no están
genéticamente relacionadas con L1 y L2.
Los estudios del virus del papiloma bovino se
facilitan mediante un ensayo de capacidad infecciosa de
transformación focal cuantitativa desarrollado para BPV que no está
disponible para HPV (Dvoretzky, I., et al., 1980), y también
se ha obtenido por lo tanto una comprensión de la inmunidad al
virus del papiloma a partir del sistema del virus del papiloma
bovino. Estudios limitados usando virus del papiloma bovino intacto
demostraron que la inoculación no cutánea de virus de BPV infeccioso
o inactivado con formalina fue eficaz como una vacuna para prevenir
la infección por BPV experimental en terneros (Olson, C., et
al., 1960; Jarrett, W., et al., 1990).
Desafortunadamente, los viriones del BPV no se pueden usar para
desarrollar vacunas frente al virus del papiloma que infecta a
otras especies, o incluso vacunas frente a otros tipos de bóvidos,
debido a la gran especificidad de estos virus, así como a la
preocupación por el potencial oncogénico de partículas víricas
intactas.
Una conclusión significativa de los estudios de
la inmunidad contra el virus del papiloma es que la capacidad de los
anticuerpos para neutralizar el virus del papiloma parece que está
relacionada con su capacidad para reaccionar con epítopos
conformacionalmente dependientes, específicos del tipo, sobre la
superficie del virión. Por ejemplo, los antisueros de conejo
producidos contra viriones infecciosos de BPV1 inhiben la
transformación focal de las células C127 (Doretzky, I., et
al., 1980), así como la transformación de injertos de piel
bovina fetal, mientras que los antisueros producidos contra
viriones desnaturalizados no la inhiben (Ghim S., et al.,
1991).
Por el contrario, los sueros neutralizantes
generados frente a L1 y L2 de BPV derivadas de forma bacteriana
(Pilacinski, W. et al., 1984; Jin, X., et al., 1989),
y contra L1 y L2 de virus del papiloma de conejo de cola de algodón
(CRPV) sintetizadas in vitro (Christensen, N., et
al., 1991; Lin, Y-L, et al., 1992),
ninguna de los cuales tiene las características estructurales de
los viriones nativos, tuvieron títulos bajos, y el uso de péptidos
de fusión de L1 de HPV recombinantes, expresados en E. coli
para detectar reactividad inmunitaria celular, sólo tuvo un éxito
limitado (Höpfl, R. et al., 1991). Los resultados en el
sistema del BPV son consistentes con los del sistema del HPV, en el
que los anticuerpos monoclonales que neutralizaron la infección por
HPV11 en un ensayo de xenoinjerto de ratón reconocieron viriones de
HPV11 nativos pero no desnaturalizados (Christensen, N., et
al., 1990).
Existen intentos aislados para producir cápsidas
del virus del papiloma in vitro. Zhou, J. et al.
(1991) y (1992) produjeron partículas similares a virus clonando
genes de L1 y L2 del HPV, y genes de L1 y L2 del HPV en combinación
con genes de E3/E4 del HPV en un vector del virus de la vacuna, e
infectando células CV-1 de mamífero con el virus de
la vacuna recombinante. Estos estudios fueron interpretados por
Zhou para establecer que la expresión de las proteínas L1 y
L2 del HPV 16 en células epiteliales es necesaria y
suficiente para permitir el ensamblaje de partículas de tipo
viriónico. Las células infectadas con virus de la vacuna doblemente
recombinante, que expresaron proteínas de L1 y L2, mostraron
pequeñas (40 nm) partículas similares a virus en el núcleo, que
parecieron ser colecciones de capsómeros del HPV ensambladas de
forma incompleta. La expresión de la proteína de L1 sola, o de la
proteína L2 sola, no produjo partículas semejantes a virus; las
células doblemente infectadas con virus de la vacuna recombinante
que contiene genes de L1 y L2 tampoco produjeron partículas. No se
dio a conocer actividad neutralizante alguna.
Ghim et al., (1992) dio a conocer que
cuando L1 procedente de HPV1, un tipo de virus no genital asociado
principalmente con verrugas en las manos y en los pies, se expresó
en células de mamíferos, la proteína de L1 contenía epítopos
conformacionales encontrados en viriones intactos. Ghim no determinó
si se produjeron partículas, ni se evaluó si la proteína de L1 pudo
inducir anticuerpos neutralizantes. Incluso de forma más reciente,
Hagansee, et al. (1993) dio a conocer que cuando L1
procedente de HPV1 se expresó en células humanas, se autoensambló
en partículas semejantes a virus. No se realizaron estudios de
anticuerpos neutralizantes.
Los estudios en otros sistemas víricos, por
ejemplo parvovirus, indican que el ensamblaje solo de la cápsida
puede no conferir inmunogenicidad. El parvovirus VP2, por sí mismo,
fue capaz de autoensamblarse cuando se expresó en células de
insectos, pero sólo las partículas que contienen tanto VP1 como VP2
fueron capaces de inducir anticuerpos neutralizantes (Kajigaya, S.,
et al., 1991).
Sería ventajoso desarrollar métodos para producir
reactivos renovables contra el virus del papiloma de cualquier
especie y tipo seleccionados, en cultivo celular. También sería
beneficioso producir tales reactivos para el virus del papiloma que
tengan las propiedades que confieren inmunidad de las partículas del
virus nativo conformadas, que se pudieran usar como una vacuna
subunitaria.
Por lo tanto, el objetivo de la invención
consiste en proporcionar estas proteínas conformadas recombinantes
del virus del papiloma, así como métodos para su producción y
uso.
La invención está dirigida al diagnóstico y
prevención de infecciones por HPV16, y a sus secuelas benignas y
malignas, proporcionando proteínas recombinantes de la cápsida del
HPV16 que se autoensamblan para formar estructuras capsoméricas que
comprenden epítopos conformacionales que son altamente específicos y
altamente inmunógenos. Por lo tanto, según la invención, se
proporciona una estructura capsomérica del HPV16 aislada, que
comprende la proteína de la cápsida L1, caracterizada porque la
estructura capsomérica es capaz de inducir anticuerpos
neutralizantes del HPV16 que tienen un título de por lo menos
10^{3}, y porque el autoensamblaje de una estructura capsomérica
que consiste en L1 sola es por lo menos 100 veces más eficaz que el
autoensamblaje de una estructura capsomérica que consiste en L2, y
porque la proteína L1 tiene His en la posición 202. La estructura
capsomérica puede comprender además una proteína de la cápsida L2.
En una estructura capsomérica preferida, la proteína de la cápsida
L1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 2.
En consecuencia, la invención proporciona una
vacuna que comprende una estructura capsomérica tal como se ha
descrito aquí anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona una
estructura capsomérica tal como se ha descrito anteriormente, para
uso como una vacuna contra HPV16.
La invención también proporciona el uso de una
estructura capsomérica tal como se ha descrito anteriormente, para
la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al
tratamiento de una infección por HPV16.
Según otro aspecto, la invención proporciona un
ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica
una proteína de la cápsida L1 del HPV16 que es capaz de formar una
estructura capsomérica de HPV16, caracterizado porque la estructura
capsomérica es capaz de inducir anticuerpos neutralizantes del HPV16
que tienen un título de por lo menos 10^{3}, y porque el
autoensamblaje de una estructura capsomérica que consiste en L1
sola es por lo menos 100 veces más eficaz que el autoensamblaje de
una estructura capsomérica que consiste en L2, y porque la proteína
L1 tiene His en la posición 202.
En una realización preferida, la secuencia
nucleotídica es SEC ID nº: 2.
La invención también proporciona un vector de
baculovirus que comprende un ácido nucleico como se describe aquí
anteriormente bajo control funcional de un promotor de dicho vector.
El vector puede comprender además una secuencia codificante de L2
del HPV16 bajo control funcional de un promotor de dicho
vector.
La invención proporciona además una célula de
insecto transfectada con el vector de baculovirus como se describe
anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona un
constructo genético que comprende el ácido nucleico tal como se ha
descrito anteriormente, bajo control funcional de un promotor para
uso como una vacuna.
La invención incluye por lo tanto el uso de un
constructo genético que comprende un ácido nucleico tal como se ha
descrito anteriormente, bajo control funcional de un promotor, para
la preparación de una vacuna para la prevención o tratamiento de la
infección por HPV16.
En un aspecto adicional, la invención proporciona
un método para detectar inmunidad humoral a infección por virus del
papiloma en una persona, que comprende:
- (a)
- proporcionar una cantidad eficaz, detectora de anticuerpos, de una estructura capsomérica del HPV16 como se describe aquí anteriormente;
- (b)
- poner en contacto la estructura capsomérica con una muestra de fluido corporal procedente de una persona que se va a examinar de la infección por virus del papiloma, y permitir que los anticuerpos del virus del papiloma contenidos en dicha muestra se unan a aquélla, formando complejos de antígeno-anticuerpo;
- (c)
- separar los complejos de las sustancias no unidas;
- (d)
- poner en contacto los complejos de (c) con un agente de unión a inmunoglobulina marcado de forma detectable, que se une a dichos complejos; y
- (e)
- determinar la presencia de dichos anticuerpos del virus del papiloma en dicha muestra mediante el agente de unión a inmunoglobulina marcado, que se une a dichos complejos.
La invención incluye además un método para
detectar el virus del papiloma en una muestra procedente de una
persona que se sospecha que está infectada con dicho virus, que
comprende:
- (a)
- poner en contacto dicha muestra con anticuerpos específicos del virus del papiloma producidos frente a una estructura capsomérica del HPV16 como se describe aquí anteriormente, teniendo dichos anticuerpos una marca que produce una señal detectable, o estando unidos a un reactivo marcado de forma detectable;
- (b)
- permitir que el virus del papiloma contenido en dicha muestra se una a aquéllos para formar complejos de antígeno-anticuerpo; y
- (c)
- determinar la presencia de dicho virus del papiloma en dicha muestra mediante dicha marca detectable.
La invención también proporciona un kit de
diagnóstico para detectar una infección por virus del papiloma, que
comprende una estructura capsomérica del HPV16 como se describe
aquí anteriormente, individualmente o en combinación, junto con
materiales para llevar a cabo un ensayo para determinar la inmunidad
humoral frente al virus del papiloma o al propio virus del
papiloma, en un recipiente de embalaje unitario.
En otro aspecto, la invención incluye el uso de
una estructura capsomérica del HPV16 como se describe aquí
anteriormente como un reactivo de diagnóstico in vitro en un
ensayo de unión, opcionalmente en un kit de diagnóstico, para la
detección de anticuerpos neutralizantes que confieren inmunidad
frente al virus del papiloma.
La invención también incluye el uso de
anticuerpos específicos del virus del papiloma producidos frente a
una estructura capsomérica del HPV16 como se describe aquí
anteriormente como un reactivo de diagnóstico in vitro en un
ensayo de unión, opcionalmente en un kit de diagnóstico, para la
detección de proteínas de la cápsida del virus del papiloma.
Según la invención, se proporciona un constructo
genético, que comprende una secuencia codificante conformacional de
L1 del HPV16, insertado en un vector de transferencia de
baculovirus, y expresado de forma operativa por un promotor de ese
vector. La secuencia codificante conformacional de L1 del virus del
papiloma se puede aislar a partir de un gen del HPV16 de tipo
natural. En una realización particularmente preferida, la secuencia
codificante conformacional de L1 del HPV16 es SEC ID nº: 2. El
constructo genético puede comprender además una secuencia
codificante de L2 del virus del papiloma.
Se propone aquí un método para producir una
proteína recombinante de la cápsida del HPV16, ensamblada en una
estructura capsomérica o en una porción de la misma, que comprende
las etapas de (1) clonar un gen del HPV16 que codifica una proteína
capsídica conformacional L1 en un vector de transferencia, en el que
el marco de lectura abierta de dicho gen está bajo el control del
promotor de dicho vector; (2) transferir el vector recombinante en
una célula hospedante, en el que el gen clonado del virus del
papiloma expresa la proteína de la cápsida del virus del papiloma; y
(3) aislar estructuras capsoméricas, que comprenden la proteína de
la cápsida del virus del papiloma, a partir de la célula hospedante.
En una realización preferida, el gen clonado del virus del papiloma
consiste esencialmente en la secuencia codificante de L1
conformacional, y la proteína expresada se ensambla en estructuras
capsoméricas que consisten esencialmente en una proteína de la
cápsida de L1. En otra realización preferida, la etapa de clonación
del método comprende además la clonación de un gen del virus del
papiloma que codifica la proteína de la cápsida de L2, con lo que
dichas proteínas de L1 y de L2 se coexpresan en la célula
hospedante, y en la que las estructuras capsómericas aisladas
comprenden proteínas de las cápsidas de L1 y de L2; con la
condición de que dicho vector de transferencia no sea un virus de la
vacuna cuando dicha célula hospedante es una célula de mamífero. La
secuencia codificante de L1 conformacional se puede clonar a partir
de un virus del papiloma HPV16 de tipo natural. En una realización
particularmente preferida, la secuencia codificante de L1
conformacional es SEC ID nº: 2. También en una realización
preferida, la célula hospedante en la que se transfecta el
constructo genético es una célula de insecto. También se prefieren
realizaciones en las que el vector de transferencia es un vector de
transferencia a base de baculovirus, y el gen del virus del papiloma
está bajo el control de un promotor que es activo en células de
insectos. En consecuencia, en esta realización, el ADN del
baculovirus recombinante se transfecta en células de insecto
Sf-9, preferiblemente se cotransfectan con ADN de
baculovirus de tipo natural en células de insecto
Sf-9.
Sf-9.
En una realización alternativa del método
propuesto, el vector de transferencia es un vector de transferencia
de levadura, y el vector recombinante se transfecta en células de
levadura.
Mediante el método propuesto, se puede producir
una estructura capsomérica de un virus, o una porción de la misma,
que consiste esencialmente en una proteína de la cápsida de L1 del
HPV16. Como alternativa, la estructura capsomérica del virus puede
consistir esencialmente en proteínas de las cápsidas de L1 y de L2
del virus del papiloma, producidas por el método propuesto. La
estructura capsomérica del virus comprende la proteína de la
cápsida de L1 del virus del papiloma, que es el producto de
expresión de un ADN de L1 del HPV16 clonado en un virus de tipo
natural.
Las cápsidas víricas o estructuras capsoméricas
de la invención, o porciones o fragmentos de las mismas, pueden
consistir esencialmente en la proteína de la cápsida de L1 del
HPV16. Estas cápsidas o estructuras capsoméricas, o sus fragmentos,
pueden consistir esencialmente en la proteína de la cápsida de L1
del virus del papiloma HPV16 de tipo natural.
Las estructuras de la cápsida del virus según
cualquiera de los métodos descritos aquí anteriormente comprenden
proteínas de la cápsida que tienen epítopos conformacionales
inmunógenos capaces de inducir anticuerpos neutralizantes frente al
virus del papiloma natural. La proteína de la cápsida de L1 del
virus del papiloma puede ser el producto de expresión de un gen de
L1 del HPV16 de tipo natural. En una realización particularmente
preferida, el gen de L1 del HPV16 comprende la secuencia SEC ID nº:
2.
Según aún otro aspecto de la invención, se
proporciona una dosis unitaria de una vacuna, que comprende un
péptido que tiene epítopos conformacionales de una proteína de la
cápsida de L1 del HPV16, o una proteína L1 y proteínas de la
cápsida de L2, en una concentración inmunógena eficaz suficiente
para inducir un título de anticuerpos neutralizantes del virus del
papiloma de por lo menos alrededor de 10^{3} cuando se administra
según un calendario de dosificación inmunizante. La vacuna puede
comprender una proteína de la cápsida de L1 que es una proteína de
L1 del HPV16 de tipo natural.
El uso del marco de lectura abierta (ORF) de L1
de un genoma del virus del papiloma HPV16 de tipo natural, según los
métodos de la invención, facilita particularmente la producción de
cantidades preparativas de partículas semejantes al virus en una
escala adecuada para uso como vacuna.
Según aún otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para prevenir o tratar la infección por virus
del papiloma en una persona, que comprende la administración de una
estructura capsomérica del virus del papiloma, o un fragmento de la
misma, según la invención, a una persona, según un régimen productor
de inmunidad. La estructura capsomérica del virus del papiloma
comprende la proteína de la cápsida de L1 del HPV16 de tipo
natural.
La invención proporciona además un método para
prevenir o tratar infección por virus del papiloma en una persona,
que comprende la administración de la estructura capsomérica del
virus del papiloma de la invención, o un producto de vacuna que
comprende la estructura capsomérica, a una persona, según un régimen
productor de inmunidad. La vacuna del virus del papiloma comprende
la proteína de la cápsida de L1 del HPV16 de tipo natural.
También está dentro del alcance de la invención
un método para inmunizar a una persona frente a infección por virus
del papiloma, que comprende administrar a la persona un constructo
genético recombinante de la invención que comprende una secuencia
codificante de L1 del virus del papiloma conformacional, y permitir
que dicha secuencia codificante se exprese en las células o tejidos
de dicha persona, con lo que se induce una respuesta inmunitaria
eficaz, neutralizante, frente al virus del papiloma. La secuencia
codificante de L1 del virus del papiloma conformacional deriva de
virus del papiloma humano HPV16. El virus del papiloma humano HPV16
es un virus del papiloma de tipo natural.
Según aún otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para detectar inmunidad humoral frente a
infección por virus del papiloma en una persona, que comprende las
etapas de: (a) proporcionar una cantidad eficaz detectora de
anticuerpos de un péptido de la cápsida del virus del papiloma que
tiene por lo menos un epítopo conformacional de una estructura
capsomérica del virus del papiloma; (b) poner en contacto el
péptido de la etapa (a) con una muestra de fluido corporal
procedente de una persona que se va a examinar de infección por
virus del papiloma, y permitir que los anticuerpos del virus del
papiloma contenidos en dicha muestra se unan a la misma, formando
complejos de antígeno-anticuerpo; (c) separar dichos
complejos de las sustancias no unidas; (d) poner en contacto los
complejos de la etapa (c) con un agente de unión a inmunoglobulina
marcado de forma detectable; y (e) detectar los anticuerpos
antivirus del papiloma en dicha muestra por medio del agente de
unión a inmunoglobulina marcado que se une a dichos complejos. El
péptido consiste esencialmente en el producto de expresión de un
virus del papiloma humano HPV16. El péptido puede consistir
esencialmente en el producto de expresión de un gen del virus del
papiloma humano HPV16 de tipo natural, por ejemplo, el péptido puede
consistir esencialmente en el producto de expresión de SEC ID nº:
2.
Según aún otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para detectar HPV16 en una muestra procedente
de una persona que se sospecha que se ha infectado con dicho virus,
que comprende poner en contacto la muestra con anticuerpos que
tienen una especificidad por uno o más epítopos conformacionales de
la cápsida de dicho virus del papiloma, en el que los anticuerpos
tienen una marca productora de una señal detectable, o están unidos
a un reactivo marcado de forma detectable; permitir que los
anticuerpos se unan al virus del papiloma; y determinar la presencia
del virus del papiloma presente en la muestra por medio de la marca
detectable.
Según aún otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para determinar una respuesta inmunitaria
celular a HPV16 en una persona que se sospecha que se ha infectado
con el virus, que comprende poner en contacto células
inmunocompetentes de dicha persona con una proteína de la cápsida de
L1 del HPV16 de tipo natural recombinante, o proteínas
recombinantes combinadas de las cápsidas de L1 y L2 según la
invención; y evaluar la inmunidad celular frente al virus del
papiloma por medio de la respuesta proliferativa de dichas células a
la proteína de la cápsida. En una realización preferida de este
aspecto de la invención, la proteína recombinante del virus del
papiloma se introduce en la piel de la persona.
Según aún otro aspecto de la invención, se
proporciona un kit de diagnóstico de la infección por HPV16, que
comprende estructuras capsoméricas que consisten esencialmente en
proteína de la cápsida de L1 del HPV16, o estructuras capsoméricas
que comprenden proteína de L1 del virus del papiloma y proteínas de
la cápsida de L2, o anticuerpos frente a cualquiera de estas
estructuras capsoméricas, individualmente o en combinación, junto
con materiales para llevar a cabo un ensayo para determinar la
inmunidad humoral o celular frente al virus del papiloma, en un
recipiente de embalaje unitario.
Se ha descubierto que el gen que codifica la
proteína de la cápsida principal de L1 de BPV o HPV16, tras la
introducción en células hospedantes por medio de un vector de
transferencia apropiado, puede expresar L1 en cantidades elevadas, y
que la L1 recombinante tiene la capacidad intrínseca para
autoensamblarse en estructuras capsoméricas vacías que se asemejan
mucho a aquellas de un virión intacto.
Además, la proteína de la cápsida de L1
recombinante autoensamblada de la invención, contrariamente a la
proteína de L1 extraída de bacterias recombinantes, o de viriones
desnaturalizados, tiene la eficacia de las partículas intactas del
virus del papiloma en la capacidad para inducir cantidades elevadas
de antisuero neutralizante que puede proteger frente a la infección
por virus del papiloma. El nivel elevado de inmunogenicidad de las
proteínas de la cápsida de la invención implica propiedades de
unión fuerte a anticuerpos que hacen que sean agentes sensibles en
ensayos de cribado serológico para detectar y medir anticuerpos
frente a epítopos viriónicos conformacionales. Su inmunogenicidad
también indica que las proteínas de la cápsida de la invención
también se pueden usar como vacunas altamente eficaces o inmunógenos
para provocar anticuerpos neutralizantes para proteger a un animal
hospedante frente a la infección por virus del papiloma. Estas
observaciones se publicaron recientemente en Kimbauer, et
al., (1992).
En la actualidad se ha descubierto que la
proteína de la cápsida de L1, expresada por genomas del HPV16 de
tipo natural aislados de lesiones benignas del virus del papiloma,
cuando se expresan en el sistema de baculovirus descrito, se
autoensamblarán con una eficacia hasta ahora desconocida y
comparable a la de la proteína de la cápsida de L1 del virus del
papiloma bovino.
La fuente de ADN de L1 de HPV16, como se describe
en estudios publicados, por ejemplo por Zhou et al. (1991),
fue el clon prototipo, número de acceso GenBank K02718, que se
había aislado de un carcinoma de cuello uterino (Seedorf, et
al., 1985). Se ha encontrado que L1 procedente del genoma del
HPV16 de tipo natural, que difiere del genoma prototipo en una
única mutación puntual, se autoensamblará en partículas semejantes
a virus con una eficacia similar a la observada con L1 del BPV o
L1/L2 del BPV. Comparado con el autoensamblaje observado cuando se
usa L1 procedente del genoma prototipo del HPV con L2, la L1
procedente de un genoma de tipo natural se autoensambla por lo
menos 100 veces de forma más eficaz.
Para proporcionar una idea genética de la
eficacia de autoensamblaje de diferentes productos de expresión de
L1 del HPV16, se secuenciaron los marcos de lectura abierta de los
genes de L1 del HPV16 aislados tanto de lesiones benignas como de
lesiones asociadas con displasia o carcinoma.
El análisis detectó dos errores en la secuencia
publicada de la secuencia de L1 publicada de la cepa prototipo,
según lo siguiente:
- (1)
- debería haber una inserción de tres nucleótidos (ATC) entre nt 6901 y 6902, lo que da como resultado la inserción de una serina en la proteína de L1; y
- (2)
- debería haber una supresión en la secuencia prototipo publicada de tres nucleótidos (GAT), que consiste en nt 6951-6953, que suprime un aspartato de la secuencia de la proteína de L1. La secuencia nucleotídica corregida del genoma prototipo de L1 del HPV16, que consiste en nt 5637-7153, es la de SEC ID nº: 1, enumerada aquí.
La numeración de las bases nucleotídicas en las
Secuencias ID Nos. 1 y 2 se cataloga como 1, y la numeración de las
bases nucleotídicas de la secuencia del HPV publicada, esto es, de
nt 5367-7153, corresponde a las del listado de
secuencias de 1-1517. Los sitios citados en la
secuencia original se pueden identificar fácilmente así por la
persona experta en la técnica.
Se secuenciaron otros tres genomas de L1 del
HPV16, el clon 16PAT, y los clones 114/16/2 y 114/16/11, y esas
secuencias se compararon con la del prototipo corregido.
El clon 16PAT, amablemente proporcionado por
Dennis McCance en la University of Rochester School of Medicine, y
clonado a partir de una lesión displásica (pretumoral) del cuello
uterino, expresa un L1 que no se autoensambla eficazmente.
Los clones 114/16/2 y 114/16/11, amablemente
proporcionados por Matthias Dürst del German Cancer Research Center
en Heidelburg, se clonaron ambos a partir de lesiones no tumorales,
y ambos expresaron la proteína de L1 que se autoensambló
eficazmente.
El clon 16PAT, aislado de lesiones
displásicas infectadas por virus del papiloma, y el
prototipo HPV16, aislado de carcinoma tumoral de cuello
uterino, codifican ambos Histidina en nt 6240-6242,
mientras que los clones 2 y 11, aislados de lesiones benignas
infectadas por virus del papiloma (al igual que aislados de muchos
otros virus del papiloma) codifican Aspartato en este sitio.
Parece que esta única diferencia de aminoácidos
entre la especie prototipo de HPV16 asociado con neoplasia, y la
especie HPV16 procedente de lesiones benignas, da cuenta de la
diferencia en la eficacia de autoensamblaje. Es probable que entre
los tipos del HPV estrechamente relacionados, sea necesario un
aspartato en este lugar para el autoensamblaje eficaz, y que la
sustitución de aspartato por histidina dificulta esta capacidad en
la proteína de la cápsida. La dificultad en el ensamblaje de la
cápsida en virus asociados con neoplasias, asociada con la pérdida
de los epítopos conformacionales requeridos para la producción de
anticuerpos neutralizantes, también puede estar ligada a una menor
inmunogenicidad que permitiría que el virus del papiloma escapase
del control inmunitario.
En consecuencia, los genes de L1 del HPV16, que
expresan la proteína de la cápsida que se autoensambla eficazmente,
se pueden obtener mediante
- (1)
- aislamiento del marco de lectura abierta de L1 del HPV16 de tipo natural procedente de lesiones benignas de infección por virus del papiloma; o
- (2)
- llevando a cabo una mutación específica del sitio en la secuencia prototipo en nt 6240-6242 para codificar Aspartato.
El método de la invención proporciona un medio
para preparar partículas recombinantes de la cápsida para HPV16. Se
pueden preparar partículas que consisten en la proteína de la
cápsida L1 o L2 sola, o que consiste en ambas proteínas de la
cápsida de L1 y L2 juntas. Las partículas de proteínas de la cápsida
L1/L2 están más relacionadas estrechamente con la composición de
viriones del virus del papiloma natural, pero L2 no parece que sea
tan importante como L1 confiriendo inmunidad, probablemente debido a
que la mayoría de L2 es interna con respecto a L1 en la estructura
de la cápsida. Aunque L1 se puede autoensamblar por sí misma, en
ausencia de L2, las partículas de proteínas de la cápsida de L1/L2
autoensambladas están más estrechamente relacionadas con la
composición de viriones del virus del papiloma nativo. En
consecuencia, las partículas que comprenden L1 sola son más simples,
mientras que las que comprenden L1/L2 pueden tener incluso una
estructura más auténtica. Tanto las partículas L1 como L1/L2
autoensambladas inducen anticuerpos neutralizantes de título
elevado, y por lo tanto pueden ser adecuadas para la producción de
vacunas. Se prefieren particularmente partículas que comprenden
proteína de la cápsida de L1 expresada por un genoma del HPV16 de
tipo natural, ya sea L1 sola o L1/L2 juntas.
La producción de las partículas capsídicas L1
recombinante, o L1/L2 combinadas, se lleva a cabo clonando el gen L1
o genes de L1 y L2 en un vector adecuado, y expresando las
correspondientes secuencias codificantes conformacionales para
estas proteínas en una célula eucariota transformada por el vector.
Se cree que la capacidad para formar una estructura semejante a una
cápsida está íntimamente relacionada con la capacidad de la proteína
capsídica para generar anticuerpo neutralizante con título elevado,
y que a fin de producir una proteína capsídica que sea capaz de
autoensamblarse en estructuras capsídicas que tengan epítopos
conformacionales, se debe expresar sustancialmente toda la secuencia
codificante de la proteína capsídica. En consecuencia, se clona
sustancialmente toda la secuencia codificante de la proteína
capsídica. El gen se expresa preferiblemente en un sistema celular
eucariota. Las células de insectos son las células hospedantes
preferidas; sin embargo, también son adecuadas las células de
levaduras como células hospedantes, si se usan vectores de
expresión de levaduras apropiados. También se pueden usar células de
mamíferos transfectadas de forma similar usando vectores de
expresión de mamíferos apropiados, para producir la proteína
capsídica ensamblada; sin embargo, las células cultivadas de
mamíferos son menos ventajosas debido a que son más propensas que
las células que no sean de mamíferos para encubrir virus ocultos
que pueden ser infecciosos para los mamíferos.
Según un protocolo preferido, se usa un sistema
de baculovirus. El gen a clonar, sustancialmente toda la secuencia
codificante para la proteína capsídica L1 del virus del papiloma
bovino (BPV1) o del virus del papiloma humano (HPV16), o de L1 y L2
del virus del papiloma humano HPV16, se inserta en un vector de
transferencia de baculovirus que contiene secuencias flanqueantes de
baculovirus para formar un constructo génico, y el ADN recombinante
se cotransfecta con ADN de baculovirus de tipo natural en células
de insecto Sf-9 como se describe en el Ejemplo 1,
para generar virus recombinante que, en la infección, puede
expresar en grandes cantidades el gen insertado. La producción real
de proteína se realiza infectando células recientes de insectos con
el baculovirus recombinante; en consecuencia, la proteína capsídica
L1 y las proteínas capsídicas L1 y L2 se expresan en células de
insectos que se han infectado con baculovirus recombinante como se
describe en el Ejemplo 2.
En el procedimiento del Ejemplo 1, el gen de L1
completo de BPV1 se amplificó mediante reacción en cadena de
polimerasa (PCR; Saiki, R., et al., 1987), y se clonó en un
vector de baculovirus a base de AcMNPV (virus de la polihedrosis
nuclear de Autographa californica) (Summers, M. et
al., 1987). El marco de lectura abierta de L1 se puso bajo el
control del promotor de la polihedrina del baculovirus. Después de
la cotransfección del clon de L1 con el ADN del baculovirus de tipo
natural (tn) en células Sf-9 de insectos (número de
acceso ATCC CRL 1711), y tras la purificación de los clones
recombinantes en placas, se generó virus recombinante con un título
elevado. Los extractos procedentes de células infectadas con virus
recombinantes de AcMNPV tn o BPV1 L1 (AcBPV-L1)
(Ejemplo 2) se analizaron mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida. Después de teñir con azul de Coomassie, se detectó
una única proteína del tamaño predicho, 55 kilodaltons, en
extractos procedentes de los cultivos infectados con el virus de
AcBPV1-L1. La identidad de esta proteína como BPV L1
se verificó mediante inmunotransferencia, usando un anticuerpo
monoclonal específico de BPV L1 (Nakai, Y., et al., 1986).
De este modo, se demostró la expresión de L1 de BPV por medio del
virus recombinante mediante análisis de SDS-PAGE de
lisados procedentes de células de insectos infectadas.
Para ensayar la hipótesis de que la L1 del virus
del papiloma tiene la capacidad para autoensamblarse en partículas
semejantes a virus cuando se sobreexpresa en células heterólogas, se
examinaron microfotografías electrónicas de secciones delgadas
procedentes de células infectadas con AcBPV-L1, para
determinar la presencia de estructuras semejantes al virus del
papiloma. Las células infectadas con el virus recombinante de BPV
contenían muchas estructuras circulares de aproximadamente 50 nm
que estaban localizadas preferentemente en el núcleo; estas
estructuras no tenían células infectadas con baculovirus de tipo
natural. Estos resultados sugieren que se había producido el
autoensamblaje de L1 en partículas semejantes a virus, puesto que
el ensamblaje in vivo del virión del virus del papiloma tiene
lugar en el núcleo, y se ha informado que el diámetro de los
viriones es de 55 nm.
Tras la expresión de la proteína capsídica
conformada en la célula hospedante, las partículas del virus se
purifican a partir de lisados de células infectadas, como se
describe en el Ejemplo 4. Para obtener una prueba adicional de que
la proteína de L1 se había autoensamblado, se aislaron por medio de
centrifugación en gradiente partículas semejantes a virus
procedentes de las células de insectos infectadas. Se demostró
mediante microscopía electrónica la conformación de las proteínas
recombinantes purificadas de la cápsida de L1 del BPV y de L1 del
HPV16, comparadas con los viriones auténticos del BPV.
Se separaron estructuras de masa molecular
elevada, a partir de lisados de células infectadas con L1
recombinante o de tipo natural, mediante centrifugación a través de
una almohadilla de sacarosa al 40%, y el material en peletes se
sometió a centrifugación mediante gradiente de densidad con CsCl.
Las fracciones se recogieron y se ensayaron para determinar la
reactividad al anticuerpo monoclonal específico de L1 de BPV,
mediante inmunotransferencia.
Las fracciones positivas para L1, procedentes del
gradiente, se adsorbieron sobre rejillas de película de carbono, se
tiñeron con acetato de uranilo al 1%, y se examinaron mediante
microscopía electrónica de transmisión. En la microscopía
electrónica, las fracciones positivas contenían numerosas
estructuras circulares que mostraron un conjunto regular de
capsómeros. Consistente con los informes previos de la densidad de
viriones del BPV vacíos (Larsen, P., et al., 1987), la
densidad de la fracción de CsCl que contiene el pico de las
partículas semejantes a virus fue aproximadamente 130 gm/ml. La
mayoría tenía aproximadamente 50 nm de diámetro, aunque también se
observaron círculos más pequeños y estructuras parcialmente
ensambladas. En la microscopía electrónica, las partículas más
grandes fueron muy similares en tamaño y en estructura subunitaria
con respecto a los viriones infecciosos del BPV que se habían
teñido y fotografiado simultáneamente. Estas partículas no se
observaron en preparaciones de células infectadas falsamente o
infectadas con AcMNPV tn. Estos resultados indican que la L1 del BPV
tiene la capacidad intrínseca para ensamblarse en partículas
semejantes a virus en ausencia de L2 o de otras proteínas del virus
del papiloma. Además, para el ensamblaje de la cápsida del virus
del papiloma, no se requieren factores específicos limitados a
células epiteliales que se diferencian o células de mamíferos.
Para determinar si la capacidad de autoensamblaje
en células de insectos es una característica general de L1 del virus
del papiloma, también se expresó la L1 de HPV16, el tipo de HPV más
detectado a menudo en cánceres genitales humanos, vía un baculovirus
recombinante análogo. Una proteína del tamaño esperado de 58 kd se
expresó en grandes cantidades en células de insectos infectadas con
el virus recombinante de HPV16-L1, según se demostró
mediante SDS-PAGE. Esta proteína reaccionó
fuertemente con un anticuerpo monoclonal
antiHPV16-L1, al llevar a cabo la
inmunotransferencia. El anticuerpo monoclonal también tiñó
ligeramente otras cinco bandas que abarcan un peso molecular
aparente desde aproximadamente 28 kd hasta aproximadamente 48 kd. El
anticuerpo también reaccionó débilmente con la L1 del BPV, y de
este modo este anticuerpo tiñó ligeramente la proteína de 55 kd de
L1 del BPV en el mismo ensayo de inmunotransferencia. Después de la
purificación en gradiente de CsCl, las fracciones inmunorreactivas
se examinaron mediante microscopía electrónica, y se encontró que
contenían partículas de 50 nm semejantes al virus del papiloma,
mediante microscopía electrónica. Aunque se observaron unas pocas
partículas completamente ensambladas en el sistema humano en
comparación con las preparaciones de L1 del BPV, posiblemente debido
a niveles más bajos de expresión o a un mayor grado de degradación
de L1 del HPV16 observado en SDS-PAGE, los
resultados indican de forma concluyente que la L1 del HPV16, y
presumiblemente las proteínas de L1 de otros tipos, tiene la
capacidad intrínseca de ensamblarse en estructuras de tipo
viriónico. También se han llevado a cabo, como se describe en los
Ejemplos, preparaciones de partículas capsídicas recombinantes del
virus del papiloma para el mono Rhesus PV.
Las vacunas subunitarias, basadas en proteínas de
la cápsida principal autoensambladas, sintetizadas en células
heterólogas, han demostrado ser eficaces previniendo infecciones
por varios virus patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis B
humana (Stevens, C., et al., 1987).
Los estudios que demuestran que el BPV infeccioso
o inactivado con formalina es eficaz como una vacuna, mientras que
las células transformadas con el BPV son ineficaces, sugieren que
las proteínas capsídicas víricas, más que provocar productos
génicos iniciales, provocan la respuesta inmunitaria. Otros datos en
la bibliografía científica indican que la proteína L1 extraída de
bacterias tuvo un éxito parcial en la provocación de una respuesta
inmunitaria, a pesar de los bajos títulos de anticuerpos
neutralizantes. En consecuencia, la L1 del BPV, que se expresó y se
ensambló en partículas semejantes a virus en células de insectos, se
estudió para determinar su capacidad para inducir antisueros
neutralizantes en conejos. Se ensayaron dos tipos de preparaciones:
extractos de células completas de células Sf-9
infectadas con L1 recombinante o de tipo natural, y partículas
parcialmente purificadas aisladas mediante centrifugación
diferencial y precipitación con sulfato de amonio. Tras una
inoculación primaria, los conejos recibieron dos inoculaciones
bisemanales de recuerdo.
Los sueros de los conejos se ensayaron para
determinar la capacidad para inhibir la infección por BPV de células
C127 de ratón, según se mide mediante una reducción en el número de
focos inducidos por una cantidad estándar de virus del BPV. Se
realizó un ensayo representativo en el que se comparó los títulos de
antisueros neutralizantes inducidos en animales inoculados con L1
recombinante de BPV con antisueros frente a viriones intactos y
desnaturalizados del BPV. Los sueros inmunitarios generados por
inoculación con L1 derivada de baculovirus fueron capaces de
reducir la infecciosidad del virus del BPV en un 50% a una dilución
de por lo menos 1:11.000 (un título de 11.000; Tabla 1), mientras
que los sueros preinmunitarios procedentes de los mismos conejos no
inhibieron la transformación focal a una dilución de 1:20, la menor
dilución ensayada. Tanto las preparaciones brutas como las
partículas parcialmente purificadas fueron eficaces induciendo
antisueros neutralizantes con título elevado, siendo 290.000 el
título más elevado medido. Éste fue el mismo que el título
neutralizante del antisuero testigo positivo producido frente a
viriones infecciosos del BPV. En comparación, el título más elevado
generado en un estudio previo que usa L1 derivada de bacterias fue
36 (Pilancinski, W., et al., 1984). El suero procedente del
conejo inoculado con el extracto de las células infectadas con
baculovirus de tipo natural fue incapaz de inhibir la infecciosidad
a una dilución de 1:20, indicando que la actividad neutralizante
fue específica de L1. La destrucción de las partículas L1
parcialmente purificadas, hirviendo en SDS al 1%, suprimió la
capacidad de la preparación para inducir partículas neutralizantes
(Tabla 1). La demostración de que L1 se puede autoensamblar en
partículas semejantes a viriones, que provocan títulos de
antisueros neutralizantes de por lo menos tres órdenes de magnitud
más elevados que los previos en antígenos producidos in
vitro, sugiere que las proteínas de la cápsida de L1
recombinantes tienen el potencial para inducir una protección eficaz
a largo plazo frente al virus del papiloma transmitido de forma
natural. A la vista de estos resultados, parece que las partículas
de L1 ensambladas en células de insectos imitan a virus infecciosos
en la presentación de epítopos inmunodominantes conformacionalmente
dependientes. Estos resultados también establecen que no se requiere
L2 para la generación de anticuerpos neutralizantes con título
elevado. La inmunogenicidad neutralizante débil, dada a conocer, de
L1 derivada de bacterias puede ser debida a que no asume una
conformación apropiada, o a que no se ha ensamblado en estructuras
semejantes a viriones. También, se han detectado múltiples variantes
electroforéticas de L1 en viriones (Larsen, P., et al.,
1987). Algunas de estas especies modificadas, que probablemente
están ausentes en la L1 derivada de bacterias, pueden facilitar la
generación de anticuerpos neutralizantes.
La capacidad de las proteínas capsídicas de L1 (o
L2) recombinantes del virus del papiloma, tales como las descritas
aquí, para inducir antisuero neutralizante de título elevado, las
hacen adecuadas para uso como vacunas para la profilaxis frente a
papilomatosis comunicable. Los ejemplos de poblaciones en riesgo que
se podrían beneficiar de la inmunización son manadas bovinas, que
son susceptibles a verrugas de papiloma; todos los seres humanos
para los tipos no genitales de infección por HPV; y seres humanos
sexualmente activos para tipos de infección por HPV genital.
La vacunación terapéutica puede ser útil para
lesiones productivas del virus del papiloma, que habitualmente
expresan proteínas de la cápsida de L1 (y de L2). Tales lesiones se
producen de forma más probable en infecciones benignas, tales como
verrugas o papilomatosis laríngea. La papilomatosis laríngea en
neonatos se contrae habitualmente por el recién nacido durante el
paso a través de la vía del parto, en la que el virus del papiloma
infeccioso está presente en secreciones vaginales. La vacunación
terapéutica de mujeres gestantes infectadas, frente al virus del
papiloma, puede inducir un anticuerpo IgG neutralizante capaz de
pasar a través de la barrera placentaria y en el interior de la
circulación del feto para proporcionar una inmunidad profiláctica
pasiva en el bebé frente a este tipo de infección por virus del
papiloma. Se proporcionan mecanismos adicionales protectores del
bebé mediante IgA materna, que se segrega en el fluido vaginal y en
la leche materna. Jarrett (1991) demuestra que existe cierta
eficacia terapéutica para L2 en el tratamiento de verrugas inducidas
por BPV. Los tumores neoplásicos típicamente no expresan L1 o L2, y
la eficacia de la vacunación con L1 o L2 recombinantes, en
condiciones tales como cáncer de cuello uterino, es incierta.
La inmunidad protectora frente a una enfermedad
tanto benigna como maligna por virus del papiloma se puede inducir
administrando una cantidad eficaz de la proteína de la cápsida de
L1 recombinante a una persona que tenga un riesgo de padecer
infección por virus del papiloma. Se puede administrar una vacuna,
que comprende la proteína capsídica, directamente, ya sea de forma
parenteral o local, según protocolos de inmunización
convencionales. En una realización alternativa, la secuencia
codificante conformacional de L1 se puede clonar en un vector de
transferencia, por ejemplo, un vector del virus del bosque Semliki
(que produce una infección transitoria suave), y el virus
recombinante se introduce en las células o tejidos del receptor, en
el que entonces se expresa la proteína capsídica inmunizante.
También se puede usar el virus de la vacuna como un vehículo para
el gen.
Los estudios serológicos publicados de respuesta
inmunitaria humana a proteínas viriónicas del virus del papiloma han
utilizado principalmente proteínas capsídicas L1 y L2 derivadas de
bacterias, y los resultados no se han correlacionado bien con otras
medidas de infección por HPV (Jenison, S., et al., 1990). Los
estudios de inmunidad frente a virus del papiloma BPV descritos
anteriormente indican que las proteínas viriónicas del virus del
papiloma, extraídas de bacterias, no presentan los epítopos
conformacionalmente dependientes que parece que son específicos del
tipo y reconocidos por la mayoría de los anticuerpos neutralizantes.
Comparado con tales ensayos que reconocen principalmente epítopos
lineales, es probable que un ensayo serológico que use partículas
de L1 autoensambladas sea una medida más exacta del grado de
inmunidad antiviriónica del HPV en la población de seres humanos.
Por lo tanto, las proteínas de la cápsida L1 recombinantes
descritas aquí, que presentan epítopos conformacionales, se pueden
usar como reactivos de diagnóstico altamente específicos para
detectar un anticuerpo neutralizante que confiera inmunidad frente
al virus del papiloma, en ensayos de unión de varios tipos. Los
procedimientos se pueden llevar a cabo generalmente como ensayos en
fase sólida o en disolución, que proporcionan un medio para detectar
anticuerpos en fluidos corporales que se unen específicamente a la
proteína capsídica en pares de antígeno-anticuerpo.
Los ejemplos de procedimientos conocidos por los expertos en la
técnica para evaluar los anticuerpos circulantes son ensayos en
fase de disolución, tales como radioinmunoensayos de anticuerpo
doble o inmunoensayos enzimáticos, o ensayos en fase sólida tales
como radioinmunoensayo en tiras basado en transferencia Western o un
ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), como se describe en
la Patente U.S. nº 4.520.113 de Gallo et al., o ensayos
inmunocromatográficos como se describe en la Patente U.S. nº
5.039.607 de Skold et al. Un método ELISA preferido para la
detección de anticuerpos es el descrito en Harlow, E. y Lane, D. en
Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, NY, 1988,
p. 563-578.
Las proteínas capsídicas L1 o L1/L2
recombinantes, descritas aquí, también se pueden usar para medir
inmunidad celular frente al virus del papiloma, mediante ensayos
in vivo o in vitro, por ejemplo, respuestas
proliferativas de células T inducidas por antígenos, como se
describe por Bradley, L., 1980, y particularmente respuestas
celulares a antígenos víricos, como se describe en la Patente U.S.
nº 5.081.029 de Starling. La inmunidad celular frente al virus del
papiloma también se puede determinar mediante el ensayo de piel de
hipersensibilidad retrasada in vivo, como se describe por
Stites, D., 1980; o en un método preferido, según Höpfl, R., et
al., 1991, mediante inyección intradérmica de proteínas de
fusión de L1 recombinantes del HPV.
Las proteínas capsídicas de la invención también
se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos
policlonales o monoclonales, según métodos bien conocidos en la
técnica. Estos anticuerpos específicos del virus del papiloma,
particularmente en combinación con segundos anticuerpos marcados,
específicos para una clase o especie de anticuerpos, se pueden usar
en diagnóstico según diversos procedimientos de ensayos
convencionales, tales como inmunohistoquímica, para detectar la
presencia de proteínas capsídicas en muestras de tejido corporal o
de fluidos corporales.
Las manipulaciones genéticas descritas más abajo
se describen en términos de su aplicación general a la preparación
de elementos de la unidad reguladora genética de la invención.
Ocasionalmente, el procedimiento puede no ser aplicable como se
describe a cada molécula recombinante incluida en el alcance
descrito. Las situaciones para las que ocurre esto se reconocerán
fácilmente por los expertos en la técnica. En tales casos, se
pueden realizar con éxito operaciones mediante modificaciones
convencionales conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo
mediante elección de una enzima de restricción alternativa
apropiada, cambiando a reactivos convencionales alternativos, o
mediante modificación habitual de las condiciones de reacción. Como
alternativa, otros procedimientos descritos aquí o convencionales
de otro modo serán aplicables a la preparación de las moléculas
recombinantes correspondientes de la invención. En todos los métodos
preparativos, todos los materiales de partida son conocidos o se
pueden preparar fácilmente a partir de materiales de partida
conocidos. En los siguientes ejemplos, todas las temperaturas se
dan en grados Celsius; excepto que se indique de otro modo, todas
las partes y porcentajes son en
peso.
peso.
Sin elaboración adicional, se cree que el experto
en la técnica puede, usando la descripción anterior, utilizar la
invención en su grado más completo. Por lo tanto, las siguientes
realizaciones preferidas se han de entender como meramente
ilustrativas y no limitantes del resto de la descripción de ninguna
manera.
Los marcos de lectura abierta (ORF) de L1, o de
L1 y L2, de longitud total, se amplificaron mediante PCR usando los
prototipos clonados de ADN de BPV1 (Chen, E., et al., 1982),
número de acceso GenBank X02346, o ADN de HPV16 (Seedorf, K., et
al., 1985), número de acceso GenBank K02718; o ADN de HPV16 de
tipo natural (SEC ID nº: 2), como moldes. Los sitios de restricción
únicos se incorporaron en los cebadores oligonucleotídicos
(subrayados).
Secuencia del cebador de BPV1-L1
SEC ID nº: 3):
- 5'-CCGCTGAATTCAATATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAGAAGCTGTAT-3' (sentido);
y SEC ID nº: 4):
- 5'-GCGGTGGTACCGTGCAGTTGACTTACCTTCTGTTTTACATTTACAGA-3' (antisentido);
Secuencia del cebador de HPV16-L1
SEC ID nº: 5):
- 5'-CCGCTAGATCTAATATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCC-3' (sentido);
y SEC ID nº: 6):
- 5'-GCGGTAGATCTACACTAATTCAACATACATACAATACTTACAGC-3' (antisentido).
Las secuencias codificantes de L1 comienzan en el
primer codón de metionina (negrita) para BPV1, y en la segunda
metionina para HPV16. Se clonó BPV1-L1 como un
5'-EcoRI a un fragmento de 3'-KpnI,
y se clonó HPV16-L1 como un 5'-BgIII
a un fragmento de 3'-BgIII en el sitio de clonación
múltiple en dirección 5' del promotor de la polihedrina del vector
pEV mod de transferencia de baculovirus a base de AcMNPV (Wang, X.,
et al. 1991), y se verificó secuenciando a través de la
función AcMNPV/L1. Se cotransfectó una cantidad de 2 \mug de
plásmido recombinante purificado con CsCl con 1 \mug de ADN de
AcMNPV de tipo natural (Invitrogen, San Diego, California) en
células Sf-9 (ATCC) usando lipofectina (Gibco/BRL,
Gaithersburg, Maryland) (Hartig, P., et al., 1991) y los
baculovirus recombinantes purificados en placas descritos (Summers,
M., et al., 1987).
\newpage
Las células Sf-9 se infectaron de
forma simulada (simuladamente) o se infectaron a una multiplicidad
de infección de 10 con virus recombinante AcMNPV tn (tn) o con
AcBPV-L1 (B-L1),
AcHPV16-L1 (16-L1), o
AcHPV16-L1 (16-L1) y
AcHPV16-L2 (16-L2). Después de 72
horas, las células se destruyeron hirviendo en tampón de Laemmli, y
los lisados se sometieron a SDS-PAGE en geles al
10%. Las proteínas se tiñeron con azul de Coomassie al 0,25%, o se
inmunotransfirieron y se sondaron con mAb AU-1
antiBPV L1 (Nakai, Y., et al., 1986), o mAb
CAMVIR-1 anti-HPV16L1 (McLean, C.,
et al., 1990) y anti-IgG de ratón Fab marcado
con ^{125}I (Amersham). P designa proteína de polihedrina. El mAb
antiBPV L1 reconoció a la proteína esperada de 55 kd. El mAb
anti-HPV16L1 tiñó fuertemente a la proteína de 58 kd
esperada, así como tiñó ligeramente cinco bandas de menor peso
molecular, como se explica anteriormente. También como se explica
anteriormente, este anti-HPV16L1 reaccionó
ligeramente de forma cruzada con la proteína de BPV L1.
Los ratones se inmunizaron mediante inyección
subcutánea con lisados de células Sf-9 completas (3
x 10^{7} células) preparados mediante un ciclo de
congelación/descongelación y homogeneización con un homogeneizador
Dounce 20x (conejo nº 1, 2 y 8), o con 200 \mug de proteína L1
parcialmente purificada mediante centrifugación diferencial y
precipitación con sulfato de amonio al 35% (nº 3, 4, 6 y 7), en
adyuvante completo de Freund, y después se revacunaron dos veces a
intervalos de dos semanas, usando las mismas preparaciones en
adyuvante incompleto de Freund.
Se infectaron 500 ml de células
Sf-9 (2 x 10^{6}/ml) con baculovirus
recombinantes de AcBPV-L1 o
AcHPV16-L1 o AcHPV16-L1/L2
(16-L1/L2). Después de 72 h, las células cosechadas
se sometieron a ultrasonidos en PBS, durante 60 s. Después de
aclarar a baja velocidad, los lisados se sometieron a centrifugación
a 110.000 g durante 2,5 h a través de una almohadilla de sacarosa
al 40% (peso/volumen)/PBS (SW-28). Los peletes
resuspendidos se centrifugaron hasta equilibrio a 141.000 g durante
20 h a temperatura ambiente en un gradiente de CsCl al
10-40% (peso/peso)/PBS. Las fracciones se cosecharon
del fondo y se analizaron mediante SDS-PAGE. Las
fracciones inmunorreactivas se dializaron frente a PBS, se
concentraron mediante ultrafiltración con un Centricon 30
(Millipore), y (para HPV16-L1) se peletizaron
mediante centrifugación durante 10 minutos a 30 psi (0,2068 MPa) en
un rotor A-100 en una centrífuga Airfuge (Beckman).
Los viriones de BPV1 (Fig. 2B) se purificaron a partir de una
verruga bovina (proporcionada amablemente por A.B. Jenson), como se
describe (Cowsert, L., et al., 1987). Las partículas
purificadas se adsorbieron a rejillas de TEM revestidas con carbón,
se tiñeron con acetato de uranilo al 1%, y se examinaron con un
microscopio electrónico EM 400T de Philips, a un aumento de 36.000x.
Los resultados se obtuvieron mediante microscopía electrónica, y se
exponen anteriormente.
Las diluciones en serie de sueros obtenidos 3
semanas después de la segunda revacunación se incubaron con
aproximadamente 500 unidades formadoras de focos de virus de BPV1
durante 30 minutos, el virus se absorbió a células C127 durante 1
hora, y las células se cultivaron durante 3 semanas (Dvoretzky, I.,
et al., 1980). Los focos se tiñeron con azul de metileno al
0,5%/carbolfucsina al 0,25%/metanol. Los resultados se obtuvieron
evaluando el número de focos; estos resultados se discuten más
abajo. El anti-AcBPV-L1 se obtuvo a
partir del conejo número 1, y el anti-AcMNPV tn del
conejo nº 8 (Tabla 1). Como patrón, se usaron sueros preinmunitarios
a una dilución de 1:400. El
anti-AcBPV-L1, a una dilución de
1:400 o de 1:600, eliminó sustancialmente los focos, mientras que el
anti-AcMNPV tn, a una dilución de 1:400 o de 1:600,
parece que produjo un aumento en el número de focos. El control
negativo del suero de conejo normal, denominado "nrs", a una
dilución de 1:00, se usó como un patrón para el
anti-virión de BPV-1, que parece que
elimina sustancialmente los focos a una dilución de 1:400 o de
1:600. El anti-virión de BPV-1 se
produjo frente a viriones nativos de BPV, en un estudio previo
(Nakai, Y., et al., 1986). Finalmente, Dako es el antisuero
de conejo comercialmente disponible (Dako Corp., Santa Bárbara,
California) producido frente a viriones desnaturalizados de BPV.
Este suero produjo un gran número de focos, aparentemente mayor que
un control no Ab. Como control negativo, un ensayo sin virus no
produjo sustancialmente ningún foco.
Los ensayos se llevaron a cabo como en el Ejemplo
5. Los conejos n^{os} 1, 2 y 8 se inocularon con lisados de
células enteras Sf-9 brutos, y los conejos n^{os}
3, 4, 6 y 7, con proteína L1 parcialmente purificada (Tabla 1). Los
conejos n^{os} 6 y 7 se inmunizaron con preparaciones de proteína
L1 que se habían desnaturalizado al hervirlas en SDS al 1%. Para
cada conejo, se ensayaron por lo menos dos tomas de sangre,
recogidas 3-6 semanas después de la segunda
revacunación, y se encontró que tenían el mismo título. El título
de los sueros preinmunitarios, para cada uno de los conejos, fue
menor que 20, la menor dilución ensayada.
| Antígeno | Conejo | Título de neutralización del suero frente a BPV1* |
| AcBPV-L1 | 1 | 11.000 |
| '' | 2 | 97.000 |
| '' | 3 | 290.000 |
| '' | 4 | 97.000 |
| Viriones de BPV1\dagger | 5 | 290.000 |
| AcBPV-L1/SDS | 6 | <2 |
| '' | 7 | <2 |
| ACMNPV tn | 8 | <20 |
| *Recíproco de la dilución que provocó una reducción del foco del 50% | ||
| \dagger proporcionado por A.B. Jenson (Nakai, Y., et al., 1986) |
Patente U.S. nº 5.081.029 de Starling et
al.
Patente U.S. nº 5.039.607 de Skold et
al.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: The Government of the United States, as represented by the Secretary of Health and Human Services
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS DE CÁPSIDAS DEL VIRUS DEL PAPILOMA HPV16 RECOMBINANTES QUE SE AUTOENSAMBLAN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: KNOBBE, MARTENS, OLSON & BEAR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 620, Newport Center Drive, Sexta Planta
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Newport Beach
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92660
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/941.371
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 03 DE SEPTIEMBRE DE 1992
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/032.869
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 DE MARZO DE 1993
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 714-760-0404
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: 714-760-9502
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1517 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus del papiloma humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HPV16
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1517
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1517 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 1..1517
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus del papiloma bovino
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: BPV1 N
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCTGAATT CAATATGGCG TTGTGGCAAC AAGGCCAGAA GCTGTAT
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: BPV1 Y
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGTGGTAC CGTGCAGTTG ACTTACCTTC TGTTTTACAT TTACAGA
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: HPV16 N
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCTAGATC TTAATATGTCT CTTTGGCTGC CTAGTGAGGC C
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: HPV16 Y
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGTAGATC TACACTAATT CAACATACAT ACAATACTTA CAGC
\hfill44
Claims (18)
1. Estructura capsomérica de HPV16 aislada, que
comprende una proteína capsídica L1, caracterizada porque la
estructura capsomérica es capaz de inducir anticuerpos
neutralizantes de HPV16 que tienen un título de por lo menos
10^{3}, y porque el autoensamblaje de una estructura capsomérica
que consiste en L1 sola es por lo menos 100 veces más eficaz que el
autoensamblaje de una estructura capsomérica que consiste en L2, y
la proteína L1 tiene His en la posición 202.
2. Estructura capsomérica según la reivindicación
1, que comprende además una proteína capsídica L2.
3. Estructura capsomérica según la reivindicación
1 ó 2, en la que la proteína capsídica L1 tiene la misma secuencia
de aminoácidos que la SEC ID nº: 2.
4. Vacuna que comprende una estructura
capsomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Estructura capsomérica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, para uso como una vacuna contra HPV16.
6. Uso de una estructura capsomérica según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de un
medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de una
infección por HPV16.
7. Ácido nucleico que comprende una secuencia
nucleotídica que codifica una proteína capsídica L1 de HPV16 que es
capaz de formar una estructura capsomérica de HPV16,
caracterizado porque la estructura capsomérica es capaz de
inducir anticuerpos neutralizantes de HPV16 que tienen un título de
por lo menos 10^{3}, y porque el autoensamblaje de una estructura
capsomérica que consiste en L1 sola es por lo menos 100 veces más
eficaz que el autoensamblaje de una estructura capsomérica que
consiste en L2, y porque la proteína L1 tiene His en la posición
202.
8. Ácido nucleico según la reivindicación 7, en
el que la secuencia nucleotídica es la SEC ID nº: 2.
9. Vector de baculovirus que comprende un ácido
nucleico según la reivindicación 7 u 8, bajo control funcional de un
promotor de dicho vector.
10. Vector según la reivindicación 9, que
comprende además una secuencia codificante de L2 de HPV16, bajo
control funcional de un promotor de dicho vector.
11. Célula de insecto transfectada con un vector
según la reivindicación 9.
12. Constructo genético que comprende el ácido
nucleico según la reivindicación 7 u 8, bajo control funcional de un
promotor, destinado a ser utilizado como una vacuna.
13. Uso de un constructo genético que comprende
el ácido nucleico según la reivindicación 7 u 8 bajo control
funcional de un promotor, para la preparación de una vacuna
destinada a la prevención o al tratamiento de una infección por
HPV16.
14. Método para detectar inmunidad humoral frente
a infección por virus del papiloma en un sujeto, que comprende:
- (a)
- proporcionar una cantidad eficaz detectora de anticuerpos de una estructura capsomérica de HPV16 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;
- (b)
- poner en contacto a la estructura capsomérica con una muestra de fluido corporal procedente de un sujeto que se va a examinar para determinar una infección por virus del papiloma, y permitir que los anticuerpos contra el virus del papiloma, contenidos en dicha muestra, se unan a ella, formando complejos de antígeno-anticuerpo;
- (c)
- separar los complejos de las sustancias no unidas;
- (d)
- poner en contacto los complejos de (c) con un agente de unión a inmunoglobulina, marcado de forma detectable, que se une a dichos complejos; y
- (e)
- determinar la presencia de dichos anticuerpos anti-virus del papiloma en dicha muestra por medio de un agente marcado de unión a inmunoglobulina, que se une a dichos complejos.
15. Método para detectar el virus del papiloma en
una muestra procedente de un sujeto sospechoso de ser infectado con
dicho virus, que comprende:
- (a)
- poner en contacto dicha muestra con anticuerpos específicos del virus del papiloma producidos frente a una estructura capsomérica de HPV16 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, teniendo dichos anticuerpos una marca productora de una señal detectable, o estando unidos a un reactivo marcado de forma detectable;
- (b)
- permitir que el virus del papiloma contenido en dicha muestra se una a los mismos para formar complejos de antígeno-anticuerpo; y
- (c)
- determinar la presencia de dicho virus del papiloma en dicha muestra por medio de dicha marca detectable.
16. Kit de diagnóstico para la detección de una
infección por el virus del papiloma, que comprende estructuras
capsoméricas de HPV16 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3, individualmente o en combinación, junto con materiales para
llevar a cabo un ensayo para determinar la inmunidad humoral frente
al virus del papiloma o al propio virus del papiloma, en un
recipiente de embalaje unitario.
17. Uso de una estructura capsomérica de HPV16
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como un reactivo de
diagnóstico in vitro en un ensayo de unión, opcionalmente en
un kit de diagnóstico, para la detección de anticuerpos
neutralizantes que confieren inmunidad contra el virus del
papiloma.
18. Uso de anticuerpos específicos del virus del
papiloma producidos frente a una estructura capsomérica de HPV16
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como un reactivo de
diagnóstico in vitro en un ensayo de unión, opcionalmente en
un kit de diagnóstico, para la detección de proteínas capsídicas del
virus del papiloma.
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