LT5414B - Monokloninių antikūnų gavimo būdas, hibridomos, gautos šiuo būdu ir rekombinantinės chimerinės į virusus panašios dalelės su įterptais kitų baltymų fragmentais kaip imunogenai hibridomų gavimui šiuo būdu - Google Patents
Monokloninių antikūnų gavimo būdas, hibridomos, gautos šiuo būdu ir rekombinantinės chimerinės į virusus panašios dalelės su įterptais kitų baltymų fragmentais kaip imunogenai hibridomų gavimui šiuo būdu Download PDFInfo
- Publication number
- LT5414B LT5414B LT2005043A LT2005043A LT5414B LT 5414 B LT5414 B LT 5414B LT 2005043 A LT2005043 A LT 2005043A LT 2005043 A LT2005043 A LT 2005043A LT 5414 B LT5414 B LT 5414B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- protein
- hybridoma
- hybridomas
- monoclonal antibodies
- particles
- Prior art date
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 96
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims description 30
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 claims description 29
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 29
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 29
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 21
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 8
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 24
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 2
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 28
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 26
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 25
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 6
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 101100385565 Arabidopsis thaliana CTF7 gene Proteins 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 101150010030 ECO1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000829333 Mesocricetus auratus polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022492 Mucin-7 Human genes 0.000 description 1
- 101710134550 Mucin-7 Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 108700010901 hantavirus proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
- C12N2710/22022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Išradimas apibūdina monokloninių antikūnų gavimo būdą, panaudojant rekombinantinius chimerinius virusų baltymus, kurie formuoja į virusus panašias daleles. Minėti virusų baltymai yra naudojami kaip nešėjai peptidams arba epitopams, prieš kuriuos siekiama gauti monokloninius antikūnus. Pasiūlyti chimeriniai virusiniai baltymai tam tikrose vietose turi įterptus kitų baltymų fragmentus (epitopus), kurie yra eksponuoti į virusą panašių dalelių paviršiuje. Minėti chimeriniai baltymai yra labiau imunogeniški ir efektyviau skatina monokloninių antikūnų susidarymą, nei anksčiau aprašyti imunogenai. Išradimas priklauso biotechnologijos sričiai ir gali būti panaudotas hibridomų technologijoje monokloninių antikūnų prieš norimus epitopus gavimui.@Išradime apibūdintos gautos šiuo būdu naujos hibridomos.
Description
Šis išradimas priskirtinas baltymų biotechnologijos sričiai, konkrečiai, monokloninių antikūnų gavimo būdui. Būdas gali būti naudojamas hibridomų technologijoje naujų monokloninių antikūnų prieš norimus epitopus gavimui.
Norint gauti monokloninius antikūnus (MA) prieš bet kokį antigeną, paprastai naudojami žinomi, anksčiau aprašyti būdai, kuriuose:
- imunizacijai naudojami rekombinantiniai baltymai; arba
- naudojami sintetiniai antigenai; arba
- naudojami natyvūs baltymai, išskirti iš ląstelių, audinių ir pan; arba
- naudojami ląstelių lizatai (homogenatai); arba
- naudojamos eukariotinės ląstelės; arba
- naudojami virusai, bakterijos.
Hibridomų technologijoje monokloninių antikūnų gavimui reikalingi stiprūs imunogenai, kurie aktyvuoja B ir T ląsteles, sukelia IgG klasės antikūnų susidarymą. Imunogenai yra medžiagos, kurios sukelia imuninį atsaką. Yra žinoma, kad stiprūs imunogenai yra didelės molekulinės masės baltymai. Nedidelės molekulinės masės peptidai (iki 50 aminorūgščių ilgio) nėra imunogenai. Siekiant gauti monokloninius antikūnus prieš peptidus, pastarieji turi būti prijungiami prie baltymo-nešėjo.
Yra aprašyti įvairūs baltymai-nešėjai, naudojami hibridomų technologijoje: jaučio serumo albuminas (BSA), moliuskų hemacianinas (KLH), tuberkulino derivatai (PPD) ir kiti [Bhatnagar PK, Papas E, Blum HE, et ai., Acad Sci USA. 1982 Jul;79(14):4400-4; Bashir I, Sikora K, Foster CS. Virchovvs Arch. 1998 Mar;432(3):279-87].
Žinomi įvairūs būdai, kuriais peptidai prijungiami prie baltymo-nešėjo. Peptidas gali būti prijungimas prie baltymo-nešėjo, naudojant įvairius cheminius agentus. Pavyzdžiui, žinomas prijungimas, naudojant glutaro aldehidą, karbodiimidą ir kitus cheminius agentus [Huhle G, Harenberg J, Malsch R, Heene DL. Semin Thromb Hemost. 1994;20(2): 193204.] Gali būti naudojamas fotocheminis prijungimas [Jurzak M, Boer R, Fritzsch G, Kojro E, Fahrenholz F.. Eur J Biochem. 1990 May 31; 190(1):45-52. ]. Alternatyviniai būdai yra sintetinių peptidų, sudarytų iš B ir T ląstelių epitopų, kūrimas [Fitzmaurice CJ, Brown LE, Mclnerney TL, Jackson DC.. Vaccine. 1996 Apr; 14(6):553-60].
Visų šių metodų trūkumas - tai, kad peptidas (arba epitopas) gali būti „paslėptas“ baltymo-nešėjo struktūroje, todėl tuo atveju jis negali stimuliuoti imuninės sistemos ląstelių, būtent, B ląstelių, kurios gamina antikūnus ir kurios reikalingos hibridomų gavimui.
Kitas šių metodų trūkumas yra tas, kad sunku gauti hibridomas, gaminančias antikūnus prieš peptidą, o ne prieš baltymą-nešėją. Baltymas-nešėjas yra žymiai didesnis už prijungtą peptidą, todėl jis turi daugiau B ląstelių epitopų ir efektyviau stimuliuoja B ląsteles, nei peptidas. Todėl net ir tuo atveju, jeigu peptidas yra prieinamas B ląstelėms, paprastai gaunama žymiai daugiau hibridomų, kurios gamina antikūnus prieš baltymą10 nešėją, o ne prieš peptidą.
Nė vienu iš aprašytų atvejų monokloninių antikūnų prieš peptidus gavimui nebuvo panaudoti rekombinantiniai chimeriniai virusų baltymai, pavyzdžiui, mielėse ekspresuoti virusiniai baltymai, tam tikrose molekulės vietose turintys įterptus kito baltymo fragmentus (epitopus) ir formuojantys į virusus panašias daleles.
Yra žinoma, kad galima žiurkėno poliomos viruso pagrindinio kapsidės baltymo ekspresija mielėse, o taip pat į virusus panašių dalelių (VPD) su įterptais hantaviruso nukleokapsidės baltymo fragmentais savybės [Gedvilaitė A., Frommel C., Sasnauskas K., et ai., Virology. 2000, v. 273, n. 1, p. 21-35] Patento EP 1030923 (publ. 2000) aprašyme nurodoma, kad žiurkėno poliomos viruso pagrindinis kapsidės baltymas formuoja į virusus panašias daleles, kurios galėtų būti panaudojamos medicinoje ir veterinarijoje genų terapijai, vakcinų gamybai bei diagnostikai. Tačiau nebuvo aprašytas šių rekombinantinių baltymų panaudojimas norimo specifiškumo monokloninių antikūnų kūrimui.
Literatūroje yra aprašytos hibridomų linijos HM02, HM03, G47, BCP7-10, PR81, gaminančios MA prieš žmogaus muciną. Hibridomos HM02 ir HM03 skiriasi tuo, kad: 1) jos gautos, naudojant imunizacijai muciną, išgrynintą iš skreplių, 2) jos gamina IgM klasės antikūnus prieš muciną [Shin CY, Lee WJ, Kim DJ et ai, Hybridoma. 1999; 18(5):457-463]. Hibridoma G47 skiriasi tuo, kad ji gauta, naudojant imunizacijai muciną. išgrynintą iš žarnyno audinio [Gold DV, Cardillo TM Hybrid Hybridomics. 2001 ;20(5-6):343-350]. Hibridomos BCP7-10 buvo gautos, naudojant imunizacijai peptidą, atitinkantį baltymo MUC1 seką PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP, chemiškai prijungtą prie baltymo-nešėjo [Xing PX, Prenzoska J, Quelch K, McKenzie IF, Cancer Res. 1992 15;52(8):2310-2317]. Hibridoma PR81, gaminanti IgGl subtipo MA prieš žmogaus muriną, buvo gauta, atlikus imunizaciją vėžinio audinio homogenatu [Paknejad M, Rasaee MJ, Tehrani FK et ai, Hybrid Hybridomics. 2003;22(3): 153-158], Aprašytos kitos hibridomų linijos, gaminančios MA prieš hantavirusų nukleokapsidės baltymą: ECO2, ECO1, BDO1, C16D11, F23A1, C24B4, E5/G6, DCO3. Hibridomos ECO2, ECO1 ir BDO1 buvo gautos, naudojant imunizacijai inaktyvuotus Hcintacin, R22 ir Puumala kamienų hantavirusus [Ruo SL, Sanchez A, Eilioti LH Arch Virol. 1991 ;119(12):1-11]. Hibridomos C16D11, F23A1, C24B4, E5/G6 buvo gautos, naudojant imunizacijai rekombinantinį pilno ilgio hantaviruso nukleokapsidės baltymą [Yoshimatsu,
K., J. Arikawa, M. Tamura et ai, J. Gen. Virol. 1996, 77:695-704]. Nustatyta, kad hibridoma E5/G6 gamina MA, specifiškus hantaviruso nukleokapsidės sekai tarp 165 ir 173 aminorūgščių [Okumura M, Yoshimatsu K, Araki K, Arch Virol. 2004; 149(12):24272434], Hibridoma DC03 buvo gauta, naudojant imunizacijai rekombinantinį SEO kamieno hantavirusų pilno ilgio nukleokapsidės baltymą, ekspresuotą bakuloviruso ekspresijos sistemoje [Morii M, Yoshimatsu K, Arikawa et ai, J Clin Microbiol. 1998;36(9):2514-2521]. Aprašytieji analogai skiriasi tuo, kad imunizacijai buvo naudojami arba pilno ilgio rekombinantiniai hantavirusų nukleokapsidės baltymai, arba virusai, bet ne VPD, turinčios įterptą hanatviruso nukleokapsidės fragmentą.
Šio išradimo uždavinys buvo gauti monokloninius antikūnus prieš tam tikrą norimą aminorūgščių seką - epitopąarba baltymo fragmentą.
Išradimo autorių atlikti tyrimai parodė, kad chimeriniai rekombinantiniai virusiniai baltymai, formuojantys į virusus panašias daleles (VPD), gali būti panaudoti imunogenais hibridomų technologijoje naujų monokloninių antikūnų prieš įterptuosius fragmentus gavimui.
Kaip parodė atlikti tyrimai, šiame išradime siūlomi imunogenai efektyviau skatina monokloninių antikūnų susidarymą ir pranoksta analogus iš kitų šaltinių.
Išradime atskleistas monokloninių antikūnų gavimo būdas apima specialios linijos pelių imunizaciją, imunizacijos pakartojimą bent vieną kartą, pelių blužnies ląstelių hibridizaciją, hibridinių klonų dauginimą ir auginimą ir skiriasi tuo, kad imunizaciją atlieka, injekuojant pelėms rekombinantinių chimerinių virusų baltymų su įterptais kito baltymo fragmentais, galinčių formuoti į virusus panašias daleles, tirpalą Minėti chimeriniai baltymai yra labiau imunogeniški ir efektyviau skatina monokloninių antikūnų susidarymą, nei anksčiau aprašyti imunogenai.
Be to, konkrečios paskirties monokloninių antikūnų gavimui naudoja į virusus panašias daleles, turinčias baltymų, prieš kuriuos siekiama gauti monokloninius antikūnus, įterptus fragmentus nustatytose į virusą panašios dalelės struktūros vietose, kuriose epitopai yra eksponuoti į virusą panašių dalelių paviršiuje.
Išradime aprašytu būdu buvo gautos naujos hibridomos, produkuojančios monokloninius antikūnus prieš Mucl peptidą (9 aminorūgščių seką STAPPVHNV) ir prieš hantavirusų nukleokapsidės baltymo fragmentą (N-galinę 120 aminorūgščių seką).
Naujos hibridomos pavadintos 12G2, 12G2, 7A5, 5E11, 5C5, 2E6. Jos deponuotos Biotechnologijos instituto (Vilnius) Imunologijos laboratorijoje; joms suteikti deponavimo numeriai: M0501, M0502, HN0501, HN0502, HN0503, HN0504, atitinkamai.
Naujoms hibridomoms gauti buvo naudojamas žiurkėno poliomos viruso pagrindinis kapsidės baltymas, turintis įterptus kitų baltymų fragmentus (epitopus) ir formuojantis į virusus panašias daleles (VPD), atliekant standartines, anksčiau aprašytas procedūras, būtent:
1) atliekant imunizaciją - VPD buvo suleidžamos BALB/c linijos pelėms po oda.
Prieš injekciją VPD tirpalas buvo lygiu tūriu sumaišytas su pilnu Freund‘o adjuvantu;
2) atliekant pakartotinę imunizaciją - po 4 savaičių pelėms dar kartą buvo suleidžiama tokia pati dozę po oda, prieš tai VPD tirpalą sumaišius su nepilnu
Freund‘o adjuvantu;
3) dar po 4 savaičių buvo suleidžiama tokia pat dozė VPD be adjuvanto. Imunizacijų metu keletą kartų tikrinama, ar imunizuotų pelių kraujo serume atsirado antikūnų prieš įterptąjį fragmentą (epitopą). Patikrinimui buvo naudojami žinomi metodai imunofermentinė analizė (IFA).
4) praėjus 4-5 savaitėms po pirmosios imunizacijos, buvo nustatoma, ar serume atsirado specifinių antikūnų. Specifinių antikūnų atsiradimas liudija apie VPD kaip imunogeno efektyvumą, t.y. kad VPD efektyviai stimuliavo B ląsteles, specifiškas įterptajam fragamentui (epitopui);
5) po 3 imunizacijų buvo atliekama blužnies ląstelių hibridizaciją suliejant jas su vėžinėmis ląstelėmis, būtent, mieloma Sp2/0, suliejimo agentu buvo naudotas polietilengilikolis (PEG) (Sigma, JAV). Ši ir kitos procedūros buvo atliekamos pagal anksčiau aprašytą procedūrą naudojamą hibridomų gavimui [Kohler,
Milstein, Nature 1975;256:495-497],
6) gavus hibridinių ląstelių klonus (hibridomas), buvo tikrinamas jų specifiškumas, t.y., kokius antikūnus jie gamina. Tam buvo naudojamas IFA metodas. Šio tikrinimo tikslas buvo nustatyti, ar hibridomos gamina antikūnus prieš įterptąjį fragmentą
7) buvo įvertinama, kaip efektyviai įterptasis fragmentas VPD sudėtyje stimuliavo B ląsteles, iš kurių buvo gautos hibridomos. Gautos hibridomos buvo charakterizuojamos pagal įvairius požymius:
- nustatant jų gaminamų monokloninių antikūnų (MA) ižo tipą
- ištyriant MA specifiškumą IFA ir imunoblotingo metodais, kt.
8) identifikavus hibridomas, kurios gamina reikalingo specifiškumo antikūnus, jos buvo klonuojamos, padauginomos ir užšaldomos tolesniam saugojimui;
9) hibridomų gaminami antikūnai buvo charakterizuojami anksčiau aprašytais būdais
- IFA bei imunoblotingu.
Taigi, rekombmantiniai chimeriniai baltymai, turintys įterptus kitų baltymų fragmentus arba epitopus, buvo panaudoti pelių BALB/c imunizacijai. Po to imunizuotų pelių blužnies ląstelės buvo sulietos su mielomos ląstelėmis ir gautos hibridomos, gaminančios monokloninius antikūnus prieš įterptąsias aminorūgščių sekas. Chimerinių baltymą formuojančių į virusus panašias daleles, struktūroje esančios įterptosios sekos yra eksponuojamos baltymo paviršiuje ir todėl efektyviai skatino antikūnų susidarymą.
Aprašytu būdu buvo gautos ir ištirtos naujos hibridomos, kurios deponuotos Biotechnologijos instituto (Vilnius) Imunologijos laboratorijoje:
1) Hibridoma 12B2, deponavimo numeris M0501, kuri gamina IgGl poklasio (izotipo) MA prieš Mucl epitopą (9 aminorūgščių seką STAPPVHNV);
2) Hibridoma 12G2, deponavimo numeris M0502, kuri gamina IgGl poklasio MA prieš Muc 1 epitopą (9 aminorūgščių seką STAPPVHNV);
3) Hibridoma 7A5, deponavimo numeris HN0501, kuri gamina IgGl poklasio MA prieš hantaviruso nukleokapsidės baltymą (N-galinę 120 aminorūgščių seką);
4) Hibridoma 5E11, deponavimo numeris HN0502, kuri gamina IgGl poklasio MA prieš hantaviruso nukleokapsidės baltymą (N-galinę 120 aminorūgščių seką);
5) Hibridoma 5C5, deponavimo numeris HN0503, kuri gamina IgG2a poklasio MA prieš hantaviruso nukleokapsidės baltymą (N-galinę 120 aminorūgščių seką);
6) Hibridoma 2E6, deponavimo numeris HN0504, kuri gamina IgG2b poklasio MA prieš hantaviruso nukleokapsidės baltymą (N-galinę 120 aminorūgščių seką).
Hibridomas 12B2, 14G2, 7A5, 5E11, 5C5 ir 2E6 apibūdina šie požymiai.
Morfologiniai požymiai. Hibridomos yra sferinės formos, lygiais kraštais, turi stambų branduolį. Dauginasi suspensijoje, pasižymi silpna adhezija ant stiklo arba plastiko paviršiaus.
Ląstelių kultūros kilmė. Hibridomos gautos, suliejus imunizuotų BALB/c linijos pelių (Mus.musculus) blužnies ląsteles su pelės (Mus.musculus) mielomos ląstelių linija Sp2/0. Ląstelių kultūros požymiai. Hibridomų kultivavimo sąlygos standartinės: augimo terpė Dubecco modifikuota Eagl’o terpė (DMEM) su 2mM L-glutamino, 200 ųg/mL gentamicino ir 10% embrionininio veršiuko serumo. Hibridomos auginamos stiklo arba plastiko induose, skirtuose ląstelių kultūroms. Ląstelės persėjamos kas 3-4 dienos, peršėjimo dozė - 50-100 tūkstančių ląstelių mililitre terpės. Hibridomos auginamos inkubatoriuje, kurio atmosferoje yra 5% CO2, esant 37°C temperatūrai. Ilgalaikiam saugojimui hibridomos užšaldomos embrioniniame serume su 10% DMSO ir laikomos skystame azote. Užšaldymo sąlygos: ΙχΙΟ6 - 2x106 ląstelių mililitre, temperatūros režimas - 1°C per minutę iki -70°C. Po paros ampulės su ląstelėmis perkeliamos į skystą azotą. Kultūrų atgaivinimui ampulės atšildomos 37°C temperatūros vandens vonioje. Ląstelių gyvybingumas po atšildymo - 70-80%.
Kontaminacija. Bakterijų ir grybelių hibridomų kultūrose nerasta, mikoplazmos testas neigiamas.
Hibridomų produktyvumas. MA sekrecijos lygis augimo terpėje - 10-30 pg/ml. MA produkcija išlieka iki 15 pasažų (ląstelių kultūros peršėjimų).
Produktų charakteristika. Hibridomos 2B12 ir 14G2 gamina IgG klasės, IgGl poklasio MA, specifiškus Mucl epitopui (Mucl epitopas yra žmogaus baltymo - mucino 7 fragmentas). Hibridomos 7A5, 5E11, 5C5 ir 2E6 gamina IgG klasės MA, specifiškus hantaviruso nukleokapsidės baltymui.
Šios hibridomos skiriasi nuo kitų anksčiau aprašytų analogų tuo, kad jų gavimui (t.y., 5 imunizacijai), buvo panaudotos VPD su konkrečių peptidų įterptais fragmentais (epitopais).
Hibridomos 12B2 ir 14G2 skiriasi nuo kitų aprašytų analogų - hibridomų, gaminančių MA prieš muciną- pagal tą požymį, kad imunizacijai buvo naudojamos VPD, turinčios įterptą Mucl epitopą (9 aminorūgščių seką STAPPVHNV). Žinomi žinomi ankščiau aprašyti analogai buvo gauti, naudojant arba sintetinius peptidus, chemiškai prijungtus prie baltymo-nešėjo, arba pilno ilgio mucino baltymą, arba ląstelių homogenatą.
Be to, nuo analogų HM02 ir HM03 hibridomos 12B2 ir 14G2 skiriasi pagal gaminamų imunoglobulinų izotipą.
Hibridomos 7A5, 5E11, 5C5 ir 2E6 skiriasi nuo kitų aprašytų analogų - hibridomų, gaminančių MA prieš hantavirusų nukleokapsidės baltymą - pagal tą požymį, kad imunizacijai buvo naudojamos VPD, turinčios įterptą hantaviruso nukleokapsidės fragmentą: N-galinę 120 aminorūgščių (a.r) seką:
MSDLTDIQEDITRHEQQLWARQKLKDAEKAVEMYPDDVNKNTLQARQQTVSALEDKLADFKRR
MADAVSRKKMDTKPTDPTGIEPDDHLKERSSLRYGNVLDVNAIDIEEPSGQTADWY.
Aukščiau aprašytieji analogai skiriasi nuo hibridomų 7A5, 5E11, 5C5, 2E6 tuo, kad imunizacijai buvo naudojami arba pilno ilgio rekombinantiniai hantavirusų nukleokapsidės baltymai, arba virusai, bet ne VPD, turinčios įterptą hantaviruso nukleokapsidės fragmentą. Analogo hibridoma E5/G6 dar skiriasi tuo, kad ji gamina kito specifiškumo MA (atpažįstančius aminorūgščių seką 165-173), nei hibridomos 7A5,
5E11, 5C5, 2E6 (atpažįstančius aminorūgščių seką 1-120).
Naujų monokloninių antikūnų gavimo būdą ir naujų hibridomų savybes iliustruoja informacija, pateikta 1-4 pavyzdžiuose, 1-2 lentelėse ir Fig. 1-3.
Fig atkartoja imunoblotingo vaizdą, gautą su rekombinantiniais baltymais VP1 ir VPl/Muc, naudojant hibridomų 2B12 ir 14G2 gaminamus MA.
Fig.2 iliustruoja chimerinio baltymo VP1/VR120 imunogeniškumą.
Fig.3 iliustruoja hibridomų 7A5, 5E11, 5C5 ir 2E6 gaminamų MA funkcinį aktyvumąsugebėjimą atpažinti pilno ilgio hantaviruso nukleokapsidės baltymą.
Naujų monokloninių antikūnų gavimo būdas, jų savybės detaliau aprašomi toliau pateiktuose pavyzdžiuose.
1 pavyzdys
Chimerinio baltymo, turinčio įterptą Mucl epitopą, panaudojimas monokloninių antikūnų prieš Mucl epitopą gavimui
BALB/c linijos pelės buvo imunizuojamos mielėse ekspresuotu išgrynintu rekombinantiniu chimeriniu baltymu: žiurkėno poliomos viruso pagrindiniu kapsidės baltymu VP1 (HaPyV-VPl), turinčiu įterptus Mucl epitopus 1 ir 4 pozicijose (VPl/Muc). HaPyV-VPl (VP1) baltymo ekspresija mielėse ir jo savybės buvo aprašytos anksčiau [Gedvilaitė A., Frommel C., Sasnauskas K., et ak, Virology. 2000, v. 273, n. 1, p. 21-35]. Pelės imunizuojamos, suleidžiant 50 pg VPl/Muc antigeno su pilnu Freund‘o adjuvantu po oda. Praėjus 4 savaitėms po pirmosios imunizacijos, tuo pat būdu pelės buvo imunizuojamos pakartotinai, suleidžiant 50 pg VPl/Muc antigeno su nepilnu Freund‘o adjuvantu. Dar po 4 savaičių pelės imunizuojamos, suleidžiant 50 pg VPl/Muc antigeno be adjuvanto Imunizacijų metu tikrinamas Mucl epitopui specifiškų antikūnų titras imunofermentinės analizės (IFA) metodu. Praėjus 3 dienoms po paskutinės imunizacijos, atliekama hibridizacija.
Hibridizacijai buvo naudojamos imunizuotos pelės blužnies ląstelės ir pelių mielomos ląstelės Sp 2/0, neturinčios fermento hipoksantin-guanin-fosforiboziltransferazės, neaugančios selektyvioje hipoksantino-aminopterino-timidino (HAT) terpėje (10'4M hipoksantino, 1,6 χ 10‘5M timidino, 4 χ 10'7M aminopterino) ir negaminančios imunoglobulinų ar jų grandinių. Prieš hibridizaciją ląstelės turi būti logaritminėje augimo fazėje. Hibridizacija atliekama, 2 minutes veikiant ląsteles 50% polietilenglikolio (PEG4000) tirpalu Dubecco modifikuotoje Eagl’o terpėje (DMEM) su 10% dimetilsulfoksido (DMSO). Mielomos ir blužnies ląstelių santykis hibridizacijos metu - 1:5. Po hibridizacijos ląstelės buvo atplaunamos beserumine DMEM terpe, suspenduojamos selektyvioje HAT terpėje ir išsėjamos į plokšteles (po 5χ105 ląstelių į šulinėlį).
Hibridiniai klonai pasirodo 5-10 dieną po hibridizacijos. Testuojant terpę netiesioginės IFA metodu, nustatoma, ar klonai gamina antikūnus prieš VPl/Muc. Kas 4-5 dienos pakeičiama pusė ląstelių augimo terpės. Pirmą kartą HAT terpė keičiama į hipoksantinotimidino (HT) terpę, turinčią 10'4 M hipoksantino ir 1,6 χ 10‘4 M timidino. Vėliau HT terpė palaipsniui keičiama į įprastą augimo terpę. Hibridiniai klonai, gaminantys antikūnus prieš VPl/Muc, buvo klonuojami ribinio praskiedimo metodu. Klonai pasirodo po 4-7 dienų. Jie testuojami netiesioginės imunofermentinės analizės (IFA) metodu. Atrinkti klonai padauginami ir toliau auginami kultūroje arba užšaldomi ir saugomi skystame azote.
Buvo gauti 7 hibridomų klonai, produkuojantys monokloninius antikūnus (MA) prieš chimerinį baltymą VPl/Muc. Buvo nustatyta, kad 2 iš jų yra specifiški Mucl peptidui, 5 specifiški HaPyV-VPl (baltymui-nešėjui).
Hibridomos, produkuojančios MA prieš Mucl peptidą, buvo pavadintos 12B2 ir 14G2.
Joms suteikti atititnkami deponavimo numeriai: 12B2 - M05101, 14G2 - M0502.
Kontrolinė grupė BALB/c pelių buvo imunizuojama sintetiniu Mucl peptidu, chemiškai prijungtu prie jaučio serumo albumino (BSA/Muc), naudojant gliutaro aldehidą. Pelės buvo imunizuojamos pagal aukščiau aprašytą schemą. Imunizacijų metu tikrinamas Mucl specifiškų antikūnų titras.
Buvo nustatyta, kad BSA/Muc nesukėlė jokio imuninio atsako prieš Mucl peptidą. Todėl šių pelių blužnies ląstelės nebuvo naudojamos hibridizacijai ir monokloninių antikūnų gavimui.
pavyzdys.
Monokloninių antikūnų, gautų prieš Mucl epitopą, specifiškumo ir izotipų nustatymas.
Hibridomų 12B2 ir 14G2 gaminamų antikūnų specifiškumas buvo nustatomas imunofermentinės analizės bei imunoblotingo metodais. Imunoglobulinų izotipai buvo nustatomi imunofermentinės analizės metodu, naudojant izotipų nustatymo rinkinį [Sigma, JAV] .
Šiais metodais buvo nustatyta, kad gautieji monokloniniai antikūnai yra IgG ižo tipo, IgGl subtipo ir atpažįsta chimerinį baltymą VPl/Muc bei sintetinį peptidą Mucl, bet nereaguoja su VP1 (baltymu-nešėju). Tai rodo, kad jie yra specifiški Mucl epitopui. Gauti rezultatai yra pateikti 1 lentelėje ir Fig. 1.
MA specifiškumą iliustruoja 1 lentelė, kurioje pateikiami duomenys apie hibridomų 2B12 ir 14G2 gaminamų MA specifiškumą ir poklasius:
lentelė
| Hibridomų klonas | Subtipas (poklasė) | Reakcija su: | ||
| HaPyV-VPl | VPl/Muc | Sintetiniu peptidu Mucl | ||
| 12B2 | IgGl | - | + | + |
| 14G2 | IgGl | - | + | + |
Fig. 1 atkartoja imunoblotingo vaizdą gautą su rekombinantiniais baltymais VP1 ir VPl/Muc, naudojant hibridomų 2B12 ir 14G2 gaminamus MA. Palyginimui pateikiamas imunoblotingo vaizdas, gautas su tais pačiais baltymais, naudojant MA prieš baltymą VP1. Virš imunoblotingo vaizdo nurodyti MA pavadinimai:
12B2 - prieš baltymą VP 1/Muc;
14G2 - prieš baltymą VPl/Muc;
9F11 - prieš baltymą VP 1,
6D11 - prieš baltymą VP 1.
takelis - baltymas VP1; 2 takelis - baltymas VPl/Muc.
Kaip parodyta imunoblotingo metodu (Fig.1), hibridomų 12B2 ir 14G2 gaminami MA specifiškai jungiasi prie baltymo VP 1/Muc 1, bet nereaguoja su baltymu VP1. Kontrolei buvo naudojami MA 9F11 ir 6D11, kurie yra specifiški baltymui VP1. Jie jungiasi prie abiejų šių antigenų: VP1 ir VPl/Muc.
pavyzdys.
Chimerinio baltymo, turinčio įterptą hantaviruso nukleokapsidės baltymo fragmentą, panaudojimas monokloninių antikūnų prieš hantaviruso nukleokapsidės baltymą gavimui
BALB/c linijos pelės imunizuojamos mielėse ekspresuotais išgrynintais rekombinantiniais chimeriniais baltymais: HaPyV-VPl, turinčiais įterptą 120 aminorūgščių ilgio hantaviruso Vranica nukleokapsidės baltymo fragmentą arba 1, arba 4 pozicijoje (VP1/VR120). Šių baltymų ekspresija mielėse ir jų savybės buvo aprašytos anksčiau [A.Gedvilaite, A.Žvirbliene, J.Staniulis et ai, Virai Immunol. 2004, 17(1):5168],
Pelės BALB/c buvo imunizuojamos 3 kartus, po to buvo atliekama hibridizacija. Visos procedūros atliekamos panašiai, kaip aprašyta 1 pavyzdyje, tik naudojamas ne VPl/Muc baltymas, o VP1/VR120 baltymas. Imunizacijų metu imunizuotų pelių kraujo serume IFA metodu tikrinamas specifinių antikūnų titras (lygis), t.y., nustatoma, ar susidaro IgG klasės antikūnai prieš įterptąjį hantaviruso nukleokapsidės (HN) baltymo fragmentą.
Fig.2 iliustruoja chimerinio baltymo VP1/VR120 imunogeniškumą. Pateikiami IgG klasės antikūnų titrai imunizuotų pelių kraujo serume po 3-osios imunizacijos. Titrai buvo nustatyti IFA metodu, naudojant šiuos antigenus:
-VP1/VR120;
2- VP1;
3- hantaviruso nukleokapsidės baltymas.
Buvo nustatyta, kad antikūnų prieš HN titras yra žymiai aukštesnis, nei prieš baltymą VP1 (Fig. 2).
Atlikus hibridizaciją buvo gauti 4 hibridomų klonai, gaminantys MA prieš chimerinį baltymą VP1/VR120. Buvo nustatyta, kad visi jie reaguoja su VP1/VR120, bet nereaguoja su VP1 (baltymu-nešėju). Tai rodo, kad visos gautos hibridomos yra specifiškos HN baltymo fragmentui, įterptam į chimerinį baltymą VP1/VR120.
Taigi, galima teigti, kad HN fragmento įterpimas į VPD struktūrą žymiai padidino šio fragmento imunogeniškumą. Aukštas antikūnų prieš HN titras imunizuotų pelių kraujo serume rodo, kad įterptasis 120 aminorūgščių ilgio fragmentas yra chimerinio baltymo paviršiuje ir todėl geriau aktyvuoja B ląsteles, nei baltymas-nešėjas VP1. Hibridomų technologija yra paremta tuo, kad gaunami ir atrenkami B ląstelių ir vėžinių ląstelių hibridai. Taigi, kuo efektyviau antigenas aktyvuoja B ląsteles, tuo daugiau gaunama hibridomų, gaminančių MA prieš tą antigeną. Tuo galima paaiškinti, kad buvo gautos vien hibridomos, gaminančios MA prieš įterptąjį HN fragmentą bet ne prieš VP1 (baltymą-nešėją). Šie rezultatai rodo, kad baltymo fragmento įterpimas į VPD yra pranašesnis hibridomų gavimo būdas, nei anksčiau aprašytieji būdai, pavyzdžiui, peptidų prijungimas prie baltymų-nešėjų cheminiais metodais.
Hibridomos, produkuojančios monokloninius antikūnus prieš HN, buvo pavadintos 7A5, 5E11, 5C5, 2E6. Joms suteikti atitinkami deponavimo numeriai: HN0501, HN0502, HN0503, HN0504.
4 pavyzdys.
Monokloninių antikūnų, gautų prieš HN, specifiškumo ir izotipų nustatymas.
Gautų hibridomų produkuojamų antikūnų specifiškumas ištiriamas imunofermentinės analizės bei imunoblotingo metodais, naudojant rekombinantinius hantavirusų baltymus.
Imunoglobulinų izotipai nustatomi imunofermentinės analizės metodu, kaip aprašyta 2 pavyzdyje. Šiais metodais buvo nustatyta, kad visi gautieji MA yra IgG izotipo, IgGl, IgG2a ir IgG2b poklasių .
lentelėje pateikiami duomenys apie hibridomų 7A5, 5E11, 5C5 ir 2E6 gaminamų MA 5 specifiškumą ir poklasius.
lentelė
| Hibridomų klonas | Subtipas (poklasė) | Reakcija su: | ||
| HaPyV-VP1 | HN | VP1/VR120 | ||
| 7A5 | IgGl | - | + | + |
| 5E11 | IgGl | - | + | + |
| 5C5 | lgG2a | - | + | + |
| 2E6 | lgG2b | - | + |
Fig.3 iliustruoja hibridomų 7A5, 5E11, 5C5 ir 2E6 gaminamų MA funkcinį aktyvumąsugebėjimą atpažinti pilno ilgio hantaviruso nukleokapsidės baltymą. Pateikiamas imunoblotingo vaizdas, gautas, naudojant hibridomos 7A5 gaminamus MA.
- 9 takeliai - skirtingų hantavirusų nukleokapsidės baltymai.
Imunoblotingo metodu buvo nustatyta, kad visi MA atpažįsta chimerinį baltymą VP1/VR120 ir įvairių hanatvirusų nukleokapsidės baltymus, ekspresuotus mielėse. Tai rodo, kad jie yra funkciškai aktyvūs ir reaguoja su pilno ilgio HN baltymais. Todėl šie
MA galėtų būti taikomi HN baltymų nustatymui biotechnologijoje arba diagnostikoje.
Tokiu būdu:
1) Kai imunizacijai ir hibridomų gavimui buvo naudojamos VPD su trumpu įterptu fragmentu (Muc 1 epitopas - 9 a.r. ilgio) - gautos 2 hibridomos, gaminančias MA prieš šį • 20 epitopą ir 5 hibridomas, gaminančias MA prieš HaPyV-VPl (baltymą nešėją). T.y., prieš įterptąjį fragmentą gauta daugiau hibridomų, nei buvo pagrindo tikėtis iš Mucl epitopo ir VP1 nešėjo dydžių santykio (Mucl epitopas - 9 a.r., VP1 - apie 380 a.r.);
2) Kai imunizacijai ir hibridomų gavimui buvo naudojamos VPD su ilgesniu įterptu fragmentu (HN - 120 a.r ilgio) - gautos vien tik hibridomos prieš šį įterptąjį fragmentą bet negauta nei vienos hibridomos prieš VP1 nešėją. T.y., prieš įterptąjį fragmentą (kaip ir pirmuoju atveju) gauta daugiau hibridomų, nei galima buvo tikėtis iš Mucl epitopo ir VP1 nešėjo dydžių santykio (HN fragmentas - 120 a.r., VP1 - apie 380 a.r.).
Claims (5)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS:1. Monokloninių antikūnų gavimo būdas, apimantis specialios linijos pelių imunizaciją imunizacijos pakartojimą bent vieną kartą pelių blužnies ląstelių hibridizaciją hibridinių ’ 5 klonų dauginimą ir auginimą besiskiriantis tuo, kad imunizaciją atlieka, injekuojant pelėms rekombinantinių chimerinių virusų baltymų su įterptais kito baltymo fragmentais, galinčių formuoti į virusus panašias daleles, tirpalą.
- 2. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad konkrečios paskirties monokloninių 10 antikūnų gavimui naudoja į virusus panašias daleles, turinčias baltymų, prieš kuriuos siekiama gauti monokloninius antikūnus, fragmentus, įterptus nustatytose į virusą panašios dalelės struktūros vietose.
- 3. Hibridoma 12B2, deponavimo numeris M0501, gaminanti MA prieš Mucl epitopą (9 15 aminorūgščių seką STAPPVHNV), gauta būdu, aprašytu 1-2 punktuose.
- 4. Hibridoma 14G2, deponavimo numeris M0502, gaminananti MA prieš Mucl epitopą (9 aminorūgščių seką STAPPVHNV), gauta būdu, aprašytu 1-2 punktuose.20 5. Hibridoma 7A5, deponavimo numeris HN0501, gaminanti MA prieš hantaviruso nukleokapsidės baltymą (N-galinę 120 aminorūgščių seką) gauta būdu, aprašytu 1-2 punktuose.6. Hibridoma 5E11, deponavimo numeris HN0502, gaminanti MA prieš hantaviruso ’ 25 nukleokapsidės baltymą (N-galinę 120 aminorūgščių seką), gauta būdu, aprašytu 1-2 punktuose.7. Hibridoma 5C5, deponavimo numeris HN0503, gaminanti MA prieš hantaviruso nukleokapsidės baltymą (N-galinę 120 aminorūgščių seką), gauta būdu, aprašytu 1-230 punktuose.8. Hibridoma 2E6, deponavimo numeris HN0504, gaminanti MA prieš hantaviruso nukleokapsidės baltymą (N-galinę 120 aminorūgščių seką), gauta būdu, aprašytu 1-2 punktuose.
- 5 9. Rekombinantinių chimerinių į virusus panašių dalelių su įterptais kitų baltymų fragmentais panaudojimas kaip imunogenų hibridomų pagal 3-8 punktus gavimui.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2005043A LT5414B (lt) | 2005-04-13 | 2005-04-13 | Monokloninių antikūnų gavimo būdas, hibridomos, gautos šiuo būdu ir rekombinantinės chimerinės į virusus panašios dalelės su įterptais kitų baltymų fragmentais kaip imunogenai hibridomų gavimui šiuo būdu |
| PCT/EP2006/003420 WO2006108658A2 (en) | 2005-04-13 | 2006-04-13 | Process for the production of monoclonal antibodies using chimeric vlps |
| US11/871,215 US7919314B2 (en) | 2005-04-13 | 2007-10-12 | Process for the production of monoclonal antibodies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2005043A LT5414B (lt) | 2005-04-13 | 2005-04-13 | Monokloninių antikūnų gavimo būdas, hibridomos, gautos šiuo būdu ir rekombinantinės chimerinės į virusus panašios dalelės su įterptais kitų baltymų fragmentais kaip imunogenai hibridomų gavimui šiuo būdu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2005043A LT2005043A (lt) | 2006-10-25 |
| LT5414B true LT5414B (lt) | 2007-04-25 |
Family
ID=37026585
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2005043A LT5414B (lt) | 2005-04-13 | 2005-04-13 | Monokloninių antikūnų gavimo būdas, hibridomos, gautos šiuo būdu ir rekombinantinės chimerinės į virusus panašios dalelės su įterptais kitų baltymų fragmentais kaip imunogenai hibridomų gavimui šiuo būdu |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7919314B2 (lt) |
| LT (1) | LT5414B (lt) |
| WO (1) | WO2006108658A2 (lt) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8512711B2 (en) | 2006-10-04 | 2013-08-20 | The University Of Queensland | VLP based vaccine delivery system |
| US8518405B2 (en) * | 2009-10-08 | 2013-08-27 | The University Of North Carolina At Charlotte | Tumor specific antibodies and uses therefor |
| US9845362B2 (en) | 2010-10-08 | 2017-12-19 | The University Of North Carolina At Charlotte | Compositions comprising chimeric antigen receptors, T cells comprising the same, and methods of using the same |
| US11554181B2 (en) | 2014-09-05 | 2023-01-17 | The University Of North Carolina At Charlotte | Tumor specific antibody conjugates and uses therefor |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1030923A2 (de) | 1997-11-13 | 2000-08-30 | Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin | Verfahren zur gewinnung von virusähnlichen partikeln auf der basis von polyomaviren |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4722840A (en) * | 1984-09-12 | 1988-02-02 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
| DE3788807T2 (de) | 1986-11-01 | 1994-06-30 | British Bio Technology | Fusionsproteine und -partikel. |
| US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
| CA2145063A1 (en) * | 1992-09-22 | 1994-03-31 | Cambridge Genetics Limited | Recombinant viruses displaying a nonviral polypeptide on their external surface |
| US6150508A (en) * | 1996-03-25 | 2000-11-21 | Northwest Biotherapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen |
| AU770802B2 (en) * | 1998-10-21 | 2004-03-04 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Virus-like particles for the induction of autoantibodies |
| DE60234375D1 (de) * | 2001-09-14 | 2009-12-24 | Cytos Biotechnology Ag | VERPACKUNG VON IMMUNSTIMULIERENDEM CpG IN VIRUSÄHNLICHEN PARTIKELN: HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNG |
| WO2003106616A2 (en) * | 2002-06-12 | 2003-12-24 | Gavish-Galilee Bio Applications Ltd | MEMBRANE-ANCHORED β2 MICROGLOBULIN COVALENTLY LINKED TO MHC CLASS I PEPTIDE EPITOPES |
| US20090123471A1 (en) * | 2004-10-29 | 2009-05-14 | Cytos Biotechnology Ag | T-Cadherin antigen arrays and uses thereof |
-
2005
- 2005-04-13 LT LT2005043A patent/LT5414B/lt not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-04-13 WO PCT/EP2006/003420 patent/WO2006108658A2/en not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-10-12 US US11/871,215 patent/US7919314B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1030923A2 (de) | 1997-11-13 | 2000-08-30 | Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin | Verfahren zur gewinnung von virusähnlichen partikeln auf der basis von polyomaviren |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GEDVILAITE A. ET AL.: "Formation of immunogenic virus-like particles by inserting epitopes into surface-exposed regions of hamster polyomavirus major capsid protein.", VIROLIOGY, 2000, pages 21 - 35, XP004435974, DOI: doi:10.1006/viro.2000.0392 |
| SHIN CY ET AL.: "Production and characterization of monoclonal antibodies against human airway mucins.", HYBRIDOMA, 1999, pages 457 - 463, XP009073311 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7919314B2 (en) | 2011-04-05 |
| WO2006108658A3 (en) | 2009-09-11 |
| US20090269371A1 (en) | 2009-10-29 |
| WO2006108658A2 (en) | 2006-10-19 |
| LT2005043A (lt) | 2006-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1930346B1 (en) | Antibody produced using ostrich and method for production thereof | |
| TWI445547B (zh) | 登革熱病毒胜肽疫苗及其製備與使用方法 | |
| FI105452B (fi) | Idiotyyppirokotuksen valmistus B-solulymfoomaa vastaan | |
| RU2744274C1 (ru) | Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 | |
| CN87105716A (zh) | 利用不溶性免疫复合物提高抗体的生产 | |
| CN102316898A (zh) | 抗cd147抗体、方法和用途 | |
| SK1152003A3 (en) | Dual specificity antibodies and methods of making and using | |
| WO2022027702A1 (zh) | 一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白多聚体纳米疫苗 | |
| RU2009114682A (ru) | Способ генерирования активных антител к антигену устойчивости, антитела, полученные этим способом, и их применения | |
| CN104072613A (zh) | 与hGM-CSF结合的单克隆抗体及包含它的药物组合物 | |
| JP5187883B2 (ja) | 抗原ペプチドおよびその利用 | |
| CN106573985A (zh) | 抗vasa抗体及其生产方法和用途 | |
| JPH08501925A (ja) | 糖蛋白ｐに対するモノクローナル抗体 | |
| LT5414B (lt) | Monokloninių antikūnų gavimo būdas, hibridomos, gautos šiuo būdu ir rekombinantinės chimerinės į virusus panašios dalelės su įterptais kitų baltymų fragmentais kaip imunogenai hibridomų gavimui šiuo būdu | |
| WO2014139425A1 (zh) | 一种抗Blys的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物 | |
| KR101495019B1 (ko) | 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자 | |
| WO2022105872A1 (zh) | 抗tigit抗体或其抗原结合片段 | |
| US20230348902A1 (en) | Methods and compositions for making antibody libraries and antibodies isolated from the same | |
| CN109651509A (zh) | 抗cd20的人源化单抗及其制剂 | |
| CN109593134B (zh) | 抗cd20的人源化单克隆抗体及其制剂 | |
| CN1142505A (zh) | 诱导对表皮生长因子受体的免疫应答的抗独特型抗体 | |
| WO2015165368A1 (zh) | 抗her2中和活性单克隆抗体及其应用 | |
| WO1990001066A1 (en) | Porcine polyclonal and monoclonal antibodies | |
| TWI276686B (en) | Hybridoma cell line producing monoclonal antibodies against foot-and-mouth disease virus and the monoclonal antibodies therefrom | |
| WO2023046057A1 (zh) | 抗SARS-CoV-2 L452R刺突蛋白的单克隆抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20140413 |