CN87105716A - 利用不溶性免疫复合物提高抗体的生产 - Google Patents

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Abstract

公开了一种通过用不能溶解的免疫复合物免疫以提高抗体生产的方法。可使纯化之抗原或不均一性抗原混合物与多克隆或单克隆抗原结合，并使所得复合物连接于不能解的蛋白A上以形成不能溶解的免疫复合物。也公开了改善可溶性抗原之免疫原性及生产单克隆抗个体基团型抗体的方法。还公开了包含抗原及直接于Sepharose上或吸附于不能溶解之蛋白A上的抗体的不能溶解的免疫复合物，以及包含吸附于不能溶解之蛋白A上的抗体的免疫吸附剂。

Description

本申请是1986年6月20日递交的876，828号美国专利申请的部分后继申请。
本发明涉及一种利用不溶性免疫复合物提高抗各种抗原的抗体产量的方法。纯化的抗原、含其它污染抗原的富集抗原以及不均一抗原混合物均可作为抗原的来源。多克隆单特异性抗体、多克隆多特异性抗体以及单克隆抗体均可与抗原及蛋白A-Sepharose结合，以形成不能溶解的免疫复合物。以这类复合物之抗原成分诱导产生的抗体不仅效率高，而且在某些情况下，还具有超过原始抗血清或单克隆抗体的改善了的特异性。
现有技术中已使用了各种各样的方案来生产抗糖蛋白、抗糖脂及抗肿瘤相关抗原的单克隆和多克隆抗体。例如可利用完整细胞这一高免疫原性载体生产单克隆抗体。然而，这种方法在生产有用抗体中却存在着效率低的问题。此外，纯化的可溶性抗原在小鼠体内正如同一免疫原在兔和羊等其它种动物体内相反，其免疫原性是很差的。
某种抗原以不溶形式存在即可能改善可溶性抗原制剂在小鼠体内的免疫原性。例如，某些情况下对癌胚抗原作明矾淀淀即可能提高免疫原性。但为了达到预期的抗体生产水平，常常要使用佐剂。按传统方法，业已使用佐剂如弗氏佐剂与可溶性抗原制剂混合用于免疫兔或羊。然而佐剂往往在小鼠内无效;尽管可以产生可测滴度的抗体，但抗原特异性杂交瘤的产率却很低。本发明公开了一种生产抗原特异性杂交瘤有效的不能溶解的免疫原。
使用现有技术中所描述的可溶性免疫原制剂，通常还须为分离足够量的纯化抗原付出大量的劳动。大多数用可溶性抗原进行免疫的方法中，所用纯化抗原量为50-100μg。鉴于大多数细胞表面或胞浆抗原都只是以很小的量产生的，所以为制得这一剂量的抗原便须作大量的生物化学纯化工作。本发明的一个方面即在于提供一种由不均一抗原混合物中富集某给定抗原的方法，从而减少了纯化工作。本文中所用的“富集”一词是指提高有用抗原或抗体的浓度。
本发明的另一个方面是涉及生产抗同一抗原上抗原决定基的单克隆抗体，但所说的抗原决定基並不同于由用于制备免疫原的抗体鉴定的抗原决定基。前已证明了对这些抗多抗原决定基之抗体的需要。例如，业已发现在一种糖蛋白分子内可存在有一个以上的抗原决定基，而且在糖蛋白分子的不同亚群上可具有抗原决定基的不同形式的结合。因此，並不是所有抗原决定基都一定在所有糖蛋白分子上和/或在一给定的组织内有着同样的分布。特别是本发明人发现，人黑素瘤相关抗原系统中抗原异质性的程度取决于被单克隆抗体识别的抗原决定基（Morgan等，Mol.Immunology，待出版）。一种识别分散于多数黑素瘤糖蛋白分子上之抗原决定基的单克隆抗体（MAb），比识别仅存在于糖蛋白分子亚群上之抗原决定基的MAb具有较小的抗原异质性。使用抗癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体，可将CEA制剂再分为携带独特抗原决定基之分子的若干组群。这一点也已用抗Ⅱ类组织相容性抗原（HLA-DR抗原）的单克隆抗体证实。因此，生产抗已知抗原上特异抗原决定基的独特抗体，可使单克隆抗体的治疗应用-包括向靶细胞释放放射性同位素、药物或毒素得以最佳化。
如抗原纯化一样，生产抗已知抗原之特异性抗原决定基的单克隆抗体的现有工艺方法也是很复杂的。现有工艺方法学是使用经一系列步骤分离的可溶性纯化抗原进行免疫，其包括生产大量的已知单克隆抗体、纯化该抗体、将该抗体接到某种不溶性基质（如Sepharose）上使之成为不溶的，而且典型地还要以至少一种其它亲合分离方法（如凝集素亲合层析法、离子交换层析法）与单克隆抗体亲合层析法结合使用，以自不均一抗原混合物中提纯抗原等步骤。这种方法不仅费用高、花费的时间长，而且需要用大量细胞作为不纯抗原的来源。此外，在分离出来后，这种可溶性抗原制剂在小鼠体内的免疫原性亦很差。为此，本领域内需要找到一种能更为有效地並花费较少时间的生产这类单克隆抗体的方法，所说的这些抗体是针对抗原上由已有单克隆抗体所识别之抗原决定基以外的抗原决定基的。依据本发明的方法，所用抗原来源无须纯化，而且尚可提高免疫原性。
本领域中还要求有一种能生产抗那些存在其多克隆抗血清之抗原的单克隆抗体的方法。如果存在有这些多克隆抗血清，既使量很小、滴度很低或者是以多特异性形式（即含有不同特异性的许多抗体）存在，亦可以将其用于本发明生产单克隆抗体。但在许多情况下，这些抗血清的量是有限的，不足以用来作抗体亲合层析，因此在使用可溶性纯化抗原的免疫方法中是没有用的。本发明之免疫方法的另一个好处是可制得不同于用在免疫中之多克隆抗血清的、有着不同特异性的单克隆抗体。
本领域中还需要有一种能有效地生产单克隆抗个体基因型抗体的方法，该抗体可识别鼠源单克隆抗体（MAb）的抗原结合部位。已提出假设並在某些动物模型身上得以证实的是，抗个体基因型抗体起到以正或负两种方式调节免疫反应的作用。在某些情况下，可用抗个体基因型抗体替代纯化的抗原用于生产疫苗，从而不再必须对给定的抗原进行生物化学纯化。
如在某些动物模型中所显示的，用作疫苗的抗个体基因型抗体有可能用于对肿瘤的辅助治疗。由于难于生产抗其它鼠单克隆抗体的鼠源单克隆抗体而使得这个领域的应用研究进展不利。虽已成功地生产了抗人及兔抗体的鼠MAb，但大多数抗肿瘤相关抗原的MAb都是小鼠来源的。这些肿瘤特异性鼠MAb的结合位点有很差的免疫原性，而这大概是因为由Fc区域内共同序列诱导的自身耐受性所致。似乎Fc区内的种间差异可能导致抗原结合位点（个体基因型）之免疫原性的提高。本发明是使用不能溶解的免疫复合物以提高抗单克隆抗体之个体基因型抗体的产生。
本发明的另一优点在于，它提供了一种有效地产生一组针对给定抗原之多重抗原决定基的单克隆抗体的技术。该方法学有利于生产能识别抗原之免疫劣势抗原决定基（Immunorecessive    epitopes）的单克隆抗体。结果各种单克隆抗体均可结合于一种靶细胞或抗原上，从而可以以较高剂量结合毒素或放射性同位素並向靶位点的释放之。因为靶细胞的多个不同抗原决定基均可被结合，所以有较高浓度的免疫结合物释放即可改善细胞毒性或映象性质（Imaging    Property）。此外，单克隆抗体之多重性的可利用性将使各种抗原决定基（某中有的可能是某特殊靶细胞所特有的）均能中靶。这种独特的结合能力即可允许选择那些与正常细胞的抗原决定基很少有或没有交叉反应性的单克隆抗体，而这反过来又可允许使用较高剂量的免疫结合物。
本发明公开了一种提高抗体生产的方法，其包括将抗体吸附于不能溶解的蛋白A上，从而形成一种免疫吸附剂;使抗原与该免疫吸附剂结合，形成一种不能溶解的免疫复合物;用该不溶性免疫复合物免疫动物並由被免疫的动物体内收集抗血清。
本发明的一个相关方面公开了一种改善可溶性抗原之免疫原性，因而提高特异性单克隆抗体生产的方法，其包括使抗体吸附于不能溶解的蛋白A上，以形成一种免疫吸附剂;使可溶性抗原与该免疫吸附剂结合，以形成一种不能溶解的免疫复合物;使得自被免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成能够产生抗该可溶性抗原之单克隆抗体的杂交瘤;培养杂交瘤以产生单克隆抗体並收集作为杂交瘤之产物的单克隆抗体。
本发明的再一个方面公开了一种生产对抗原决定基-其不同于被已有单克隆抗体识别者-特异之单克隆抗体的方法，其包括：将抗多价抗原之第一抗原决定基的已有单克隆抗体吸附在不溶性蛋白A上，以形成一种免疫吸附剂;使该免疫吸附剂与抗原结合，形成一种其中第一抗原决定基是被已有单克隆抗体掩敝了的不溶性免疫复合物;用该不溶性免疫复合物免疫动物;使得自被免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成能够产生抗特殊抗原决定基之第二单克隆抗体的杂交瘤;培养该杂交瘤以产生对特殊抗原决定基特异的第二单克隆抗体並收集作为杂交瘤之产物的第二单克隆抗体。
本发明的再一个方面公开了一种生产单克隆抗个体基因型抗体的方法，其包括：使第一抗体吸附在不能溶解的蛋白A上以形成一种免疫吸附剂;用该免疫吸附剂免疫动物;使得自被免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成能够产生对第一抗体之抗原决定基特异的单克隆抗体的杂交瘤;培养该杂交瘤以产生这种单克隆抗体並收集作为杂交瘤之产物的单克隆抗体。
本发明也公开了用作免疫原的不溶性免疫复合物以及用于生产单克隆抗个体基因型抗体的免疫吸附剂。此外还公开了多种可结合于肿瘤相关抗原之多抗原决定基的单克隆抗体。
本发明的再一个方面是涉及能够结合不被抗体9.2.27识别的、人黑素瘤相关糖蛋白之抗原决定基的单克隆抗体，並包括能够生产这些抗体的连续的杂交细胞系。
参阅以下的描述及附图将会进一步明瞭本发明的这些及其它一些方面。
图1显示在ELISA法检测中，单克隆抗体与α-2巨球蛋白之三种不同来源的结合。这三种来源是：（1）得自培养的黑素瘤的α-2巨球蛋白;（2）自正常人血清纯化的α-2巨球蛋白;（C）自牛血清分离的牛α-2巨球蛋白。
图2显示抗α-2巨球蛋白之单克隆抗体的流动细胞计数结果。上面各组显示与单克隆抗体保温的CEM（人T细胞）或FMX（人黑素瘤）细胞，这些单克隆抗体分别是可与α-2巨球蛋白（α-2M）或中间纤丝抗原（抗IFA）反应的，並且上述细胞是染有FITC羊抗小鼠免疫球蛋白的。下面各组显示在与α-2M或抗IFA混育前用溶血卵磷脂预通透处理的FMX和CEM细胞。抗IFA是细胞内、非细胞表面抗原的阳性对照物。
图3显示被试抗（A）蛋白多糖阳性和（B）蛋白多糖阴性A375黑素瘤细胞之黑素瘤反应性单克隆抗体的流动细胞计数结果。
本发明的提高抗体生产的方法包括了现有技术中的抗原纯化步骤，同时能增加抗原反应性杂交瘤的数目（超过了用现有方法学获得的抗原反应性杂交瘤数目），从而提高了产生抗某预期抗原之单克隆和多克隆抗体的总效率。
为了完成本发明，必须确定抗原混合物内预期抗原的相对量。为此，须用二碘水杨酸锂、丁醇、等渗尿素、非离子去污剂或离子去污剂等试剂进行细胞表面提取，以制得可溶性提取物。例如，常常使用非去污剂提取法制备外周膜蛋白。以可溶性提取物为抗原的富集源，提取物制剂的1%（W/W）或1%以上为靶抗原。但亦可使用富集了较少靶抗原的提取物制剂。
之后分析提取物制剂的蛋白含量。将溶于磷酸盐缓冲盐的水100ng至10μg蛋白以100μl体积加至聚乙烯微滴定板内。干燥过夜后，使用ELISA方法，根据多克隆抗血清或单克隆抗体对固相靶抗原的结合来检测预期抗原的存在。为了进行比较，可使用得自非抗原携带细胞的相似提取物。抗原的量可以以稀释各孔内靶蛋白的滴度来表示。在确认提取物制剂中存在有预期抗原之后，即可对固相抗原滴定抗体或抗体源。应基于有最高滴度、可在适当种动物体内生产和/或能够结合于蛋白A-Sepharose的鼠免疫球蛋白亚类等要求来选择用于制备免疫原的抗血清或单克隆抗体。
用于形成不溶性免疫复合物的典型蛋白浓度是：每20μl蛋白A-Sepharose（装填体积）加20μl多克隆抗血清。或者是，加5-50μg    MAb免疫球蛋白便可与同样体积的蛋白A-Sepharose形成不溶性复合物。通过吸附形成免疫吸附剂，即在室温下一端上一端下地来回转动2小时，之后用磷酸盐缓冲盐水洗。或者亦可使预期的抗体直接连接到CNBr-Sepharose上制成免疫吸附剂。
之后用该免疫吸附剂吸附抗原提取物。为了尽可能地减少提取物蛋白对免疫吸附剂的非特异性粘附，可用正常免疫球蛋白-蛋白A-Sepharose预吸附提取物。正常免疫球蛋白可由兔或羊血清中制得，或者得自与用以吸收特异抗原者为同一亚类的非特异性小鼠单克隆抗体。预吸附是经下列三个步骤完成的：（1）将非特异性免疫吸附剂与提取物制剂在室温下保温2小时;（2）将提取物制剂移到一等分部份的新鲜非特异性免疫吸附剂内再保温2小时;（3）将上清液移入第三个等分部份的非特异性免疫吸附剂内，于4℃保温过夜。使非特异性结合成分如此反复消耗之后，再用抗特异性抗原的抗血清或MAb滴定该抗原制剂，並分成若干等份冷冻，以备进一步制剂不溶性免疫复合物。
用4-叠氮基水杨酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-ASA）处理，使抗体与蛋白A交联，从而提高不溶性免疫复合物的体内稳定性（Tae等，Anal.Biochem.121：286，1982）。另外，用NHS-ASA处理亦可使抗体与抗原交联。交联可防止在血清中解离，从而提高免疫复合物的体内保留时间。
通过ELISA法分析给定抗原的相对富集量，並在此基础上估计加入不能溶解之抗体中的总蛋白量。据此，如果抗原制剂是一种纯化的抗原，则每份免疫吸附剂和每次免疫可使用250ng或更少些的纯抗原。如果合适抗原只占制剂的1%，则一般使用5-10μg抗原制剂。如果用作抗原来源的可溶性提取物是含有浓度不到1%之给定抗原的异质性抗原混合物，则用于吸附到不能溶解之抗体上的提取物应为10μg或更多些。于4℃保温2-14小时后，用PBS洗此不能溶解的免疫复合物並注射到BALB/C小鼠的腹腔内。
如果要作脾脏内免疫，应在用27号针头进行脾内注射之前，在-Dounce装置内将免疫吸附剂匀浆，使之成为较小的Sepharose颗粒。虽然腹腔内免疫法是每周一次连续3-6周，但脾脏内免疫一般只作一次，且所用抗原制剂的量一般是5-10μg。对于腹腔内和脾脏内免疫，均在未次免疫后3-7天收获脾细胞，並用标准技术制备杂交瘤细胞。用ELISA法，针对用于免疫的原始靶抗原混合物，以及已知不含有用抗原的靶抗原混合物来筛选杂交瘤细胞。
不能溶解的免疫复合物亦可改善可溶性抗原的免疫原性，从而可生产出原先不能得到的高湾度抗血清或特异性单克隆抗体。另外，当通过使抗原结合于某种已知的单克隆抗体以将抗原掺入到不能溶解的免疫复合物中时，即可使被该单克隆抗体识别的抗原决定基得以有效地掩盖起来。
用存在于不能溶解的免疫复合物中带有一被掩敝的抗原决定基的抗原免疫，可更为有效地生产出针对抗原上未被掩敝之抗原决定基的第二代单克隆抗体。该项技术可用于产生针对非肿瘤相关抗原之肿瘤相关抗原决定基的单克隆抗体。也可用识别给定抗原之不同抗原决定基的单克隆抗体来鉴别致癌基因和原致癌基因产物（Proto-Oncogene    products）。
为生产单克隆抗个体基因型抗体，须将人或小鼠单克隆抗体吸附于蛋白A-Sephrose上。洗掉所得免疫吸附剂上未结合的抗体，之后用以免疫啮齿动物。可借助以下两种方法之一来筛选由被免疫的脾细胞与骨髓瘤细胞融合所产生的杂交瘤细胞。如果是用吸附于蛋白A-Sepharose上的不能溶解的鼠抗体免疫大鼠，便使用抗大鼠过氧化物酶连接试剂，通过间接ELISA法筛选杂交瘤细胞。如果是免疫小鼠，则通过用假定抗个体基因型抗体抑制酶标记的特异性抗体（个体基因型）对靶细胞（抗原）的结合来筛选杂交瘤细胞。
使用不能溶解的免疫复合物免疫原能获得成功将归因于多种因素。第一是将给定的抗原吸附于特异性抗体所获得的相对富集量。但这一点並不提示使用多克隆抗血清作为免疫抗体之来源对于实验成功是合情合理的。使用多克隆抗血清时，不可能期望以这种方法制得大量富集的给定抗原。这一成功的第二个因素可能是在Sepharose上不能溶解的蛋白A的辅助作用，它在提高B细胞分化和增殖能力上可能起作用。可溶性蛋白A是一种已知的小鼠B细胞的有丝分裂原和细胞分化剂。蛋白A可起到次级增殖信号的作用並引起靶抗原预致敏之B细胞的克隆扩增。使用这些免疫原获得成功的第三个因素在于，免疫复合物可能是调解免疫应答的天然方式。许多研究表明，抗原-抗体复合物趋向于淋巴结的滤泡区域並优先结合于Fc受体。被巨噬细胞浓集並进而呈献出来可导致B淋巴样细胞致敏，从而提高了免疫应答能力。可以期望由于与宿主的免疫球蛋白竞争结合蛋白A，而使不能溶解的免疫复合物得以在体内逐步地释放。
实施例1
使用单特异性多克隆抗血清产生单克隆抗体
业已证明α-2巨球蛋白（α2m）是由人黑素瘤细胞合成的並分泌到废培养基内的（Morgan，JNCI21：557，1984）。可使用正常血清α2m免疫产生的单一特异性多克隆抗血清鉴定这种分子。结果证明黑素瘤细胞α2m与血清α2m有大致相同的分子量，並有相同的亚单位组成。在未报导的研究中发现，使用针对血清α2m的多克隆抗血清与含有黑素瘤细胞α2m之废培养基制成的不溶性复合物，制得了抗黑素瘤细胞α-2巨球蛋白的单克隆抗体。图1中显示了这些抗α2m MAb的特异性。所示数据得自于三组抗体。第一组与得自正常血清、黑素瘤细胞废培养基以及牛血清的α-2巨球蛋白反应。第二组MAb只识别黑素瘤废培养基和正常血清中的人α-2巨球蛋白。第三组抗体只与黑素瘤细胞α2m反应，而不识别正常人或牛血清α2m。这些结果证明能够利用单一特异性多克隆免疫复合物提高单克隆抗体生产，而且表明所产生的单克隆抗体可能是对抗原的肿瘤细胞形式而不是对其正常血清相对物有选择性，尽管该肿瘤细胞形式与正常血清抗原在分子量及亚单位组成上十分相似。
进一步通过流动细胞计数法来定性抗α2m单克隆抗体的特异性。将合成α2m的人黑素瘤细胞系与抗α2m MAb一同保温。为了检定α2m是被合成的，而不是在细胞表面上表达的，须在与MAb保温前用溶血卵磷脂预通透FMX细胞。用缺乏α2m的完整的並经预通透的人T细胞（CEM）作为阴性对照。以抗中间纤丝MAb作为通透后接近细胞内抗原的阳性对照。图2证明了抗α2m MAb只同细胞内α2m结合，此表明α2m不是在FMX细胞的表面上表达的。CEM细胞一直是非反应性的，证明对培养基中牛α2m的内吞作用並没有干扰检测结果。
实施例2
使用异质性抗原制剂中的多特异性多克隆抗体产生抗转化生长因子的单克隆抗体
α转化生长因子（αTGF）在控制肿瘤生长，特别是在内分泌生长调节中可能起重要作用，而抗αTGF单克隆抗体是很难产生的（尽管可以制得合成肽-其代表了这种肽生长因子之所有或部分氨基酸序列）。用反相HPLC法自黑素瘤病人的尿中分离αTGF，並用αTGF制剂滴定用完整黑素瘤细胞免疫所产生的多特异性免抗血清。该抗血清对αTGF制剂（经用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测证明其含有大约20%αTGF和80%其它污染的尿蛋白）展示一低滴定度（1∶4）。使这一抗血清-抗原制剂结合于蛋白A-Sepharose上，並经六周免疫制得单克隆抗体。表1中显示了得自这些融合过程的杂交瘤克隆的实例。
表1
与α-转化生长因子起反应的单克隆抗体
反应性样式＊克隆的百分数
TGF+、EGF+23
TGF-、EGF+69
TGF+、EGF-8
＊用固相ELISA法检测单克隆抗体与黑素瘤病人之尿αTGF和纯化之人EGF的结合能力。
在对尿αTGF反应中产生的大多数单克隆抗体均与人表皮生长因子（EGF）制剂以及αTGF反应。某些用尿αTGF免疫产生的单克隆抗体优先与EGF反应，但不与来自αTGF之C末端的17氨基酸肽反应。有一种单克隆抗体表现了对αTGF的特异性但不与人EGF反应。这些结果表明，非免疫原性肽生长因子如αTGF，可通过形成免疫复合物使之不能溶解而成为有免疫原性的。
实施例3
产生抗人IgM的单克隆抗个体基因型抗体
可将抗存在于B细胞表面上之人IgM的单克隆抗个体基因型抗体作为治疗剂用于治疗某些形式的B细胞淋巴瘤。为了加速这些抗体的产生，並为了只使用小量的、有时是有限的IgM免疫原，而试验了脾脏内免疫的方法。用可溶性人IgM作脾脏内注射，其並不是一种产生杂交瘤的有效免疫原。然而，如表2中所示，当通过鼠抗人IgM单克隆抗体形成人IgM与蛋白A-Sepharose的复合物时，IgM即成为有免疫原性的，致使有大约1%的克隆是针对人IgM骨髓瘤蛋白之抗原结合部位的。
所有融合均是用小鼠骨髓瘤细胞系8.653，並以脾细胞∶骨髓瘤细胞＝4∶1的融合比率完成的。融合后将细胞分配到96孔平板内，以使每个孔接种的细胞数为大约2×106个细胞。
a，只加人IgM（个体基因型）免疫球蛋白。
b，与蛋白A-Sepharose复合的人IgM（个体基因型）免疫球蛋白。
c，通过小鼠单克隆抗人IgM桥与蛋白A-Sepharose复合的人IgM（个体基因型）免疫球蛋白。
d，用固相ELISA法检测含抗个体基因型杂交瘤之各孔与5份IgM病变蛋白的储集物或与用于免疫之IgM的结合情况。
之后检测这些抗IgM个体基因型单克隆抗体的特异性。检测了鼠单克隆抗体与人IgM病变蛋白及个体IgM制剂的结合。表3表明这些单克隆抗体只结合自体IgM，而没有结合其它的IgM制剂，从而显示了相似的抗个体基因型特异性。
Figure 87105716_IMG2
Figure 87105716_IMG3
＊用固相ELISA法检测由指出的病人IgM免疫所产生的抗个体基因型抗体与一系列IgM病变蛋白的结合。结果以OD405值表示。
a，抗个体基因型单克隆抗体名称。
b，同型免疫球蛋白和抗个体基因型单克隆抗体亚类。
c，数据下划横线者为阳性ELISA结果。
d，人IgM骨髓瘤蛋白的储集物;Meloy-5供体，Cappel-12供体。
e.正常人血清。
实施例4
产生抗可识别人黑素瘤细胞肿瘤相关抗原之单克隆抗体的鼠单克隆抗个体基因型抗体
识别人黑素瘤相关抗原（为250Kd糖蛋白/蛋白聚糖复合物，也称为“蛋白聚糖抗原”）的抗体9.2。27可用于击中病人体内的人黑素瘤靶细胞（Schroff等，JNCI74：299，1985;Oldham等，J.Clin.Oncol.2：1235，1984）。由9.2.27识别的抗原代表了一项困难的生物化学纯化工作，这是因为它需要使用以CsCI梯度离心与抗体亲合层析相结合的选择性提取技术。目前只能以小量地分离得到这种抗原，其不足以用于免疫程序。由于抗原量不足，也限制了250Kd组分作为疫苗的潜在应用。然而，如能产生出可识别MAb9.2.27的单克隆抗个体基因型抗体，便可为临床提供一种代用疫苗。已在大鼠和小鼠身上试验了许多免疫方法学，以确定可诱导抗鼠单克隆抗体之鼠单抗隆抗个体基因型抗体的最佳方法。这些方法包括了使用可溶性MAb与弗氏佐剂的传统免疫程序。也有人通过以MAb与白蛋白载体相联接制得免疫原，使之越过种属屏障（进入大鼠和仓鼠）以提高免疫原性。但这些方法学在产生抗个体基因型抗体方面均未获得成功。
依据本发明的方法，使用联在蛋白A-Sepharose上不能溶解的MAb9.2.27，可成功地在大鼠体内产生出抗个体基因型抗体。结果示于表4。
Figure 87105716_IMG4
ND：未作。
结果表明大鼠单克隆抗体同免疫原性MAb9.2.27结合，而不与小鼠单克隆抗体的同一亚类或其它亚类结合。因而通过制成免疫复合物使小鼠单克隆抗体成为不溶性的，可有助于降低小鼠或大鼠对小鼠单克隆抗体的自身耐受性。
实施例5
产生抗人黑素瘤相关蛋白聚糖抗原之各个抗原决定基的多单克隆抗体
在所设计的免疫方法中，使用了不能溶解的免疫复合物，以产生大量抗人黑素瘤相关蛋白聚糖抗原的单克隆抗体。
为产生抗蛋白聚糖抗原的抗体而使用了三种类型的免疫原。第一种是完整细胞。所用的细胞系包括生长于含10%胎牛血清之DMEM（J.R.Scientific，Woodland，CA）中的A375M/M、SK MEL-28和SK MEL-31，以及生长于无血清培养基（含5mg/升胰岛素和铁传递蛋白及5μg/升硒的Ischove氏培养基）中的A375M/M。使用10×106个细胞皮下注射，每周注射一次连续三周。第二种免疫原是由黑素瘤细胞（如吸附于小扁豆凝集素或麦胚凝集素-Sepharose 4B上之FMX或SK MEL-28（Morgan等，Hybridoma3：233，1984））的提取物制得的。使用的第三种类型免疫原是不能溶解的免疫复合物（如与蛋白-Sepharose结合的9.2.27和黑素瘤NP-40提取物的复合物（Giardina等，J.Immunol.待出版））。第二和第三种类型的免疫原每周注射一次，融合前连续注射六周。第四种免疫方法包括以完整细胞负荷剂量与免疫复合物结合使用，其中给小鼠先注射一次完整细胞，之后用不溶性免疫复合物连续注射五周。
以免疫的脾细胞与Ag8.653。NS-1骨髓瘤细胞（脾细胞∶骨髓细胞＝10∶1）融合而产生杂交瘤细胞。首先使用两步骤间接过氧化物酶法（Woodhouse等，J.Natl.Canc.Inst.74：383，1985）检测骨髓瘤与黑素瘤细胞、B细胞和T细胞的结合能力。骨髓瘤对黑素瘤细胞的结合为阳性的，但对B和T细胞的结合为阴性的，之后用流动血细胞计数法筛分之。
简单地说，即将B和T细胞的单细胞悬液，以及A375M/M蛋白聚糖阳性和A3751°蛋白聚糖阴性黑素瘤细胞的单细胞悬液与单克隆抗体（浓度为每1×106细胞1μg抗体）一同温育。之后用异硫氰酸荧光素偶联的羊抗小鼠抗体（Iago Inc.，Burlingame，CA）检测结合的单克隆抗体。使用标准化的荧光素颗粒（Becton Dickinson，Mountain View，CA），在EpicsC细胞荧光照相图（Coulter Diagnostics，Hialeah，FL）上计算游离的荧光素当量（Fluorescein Equivalents），以分析靶细胞结合。图3显示了用MAb9.2.27和四种与蛋白聚糖阳性细胞（图3A）反应但不与蛋白聚糖阴性细胞（图3B）结合的黑素瘤阳性单克隆抗体进行实验所得到的结果。
之后用间接ELISA分析法（Morgan和Mclntyre，Canc.Res.43：3155，1983）检测与蛋白聚糖阳性黑素瘤细胞系反应，但不与正常或抗原阴性细胞系反应的单克隆抗体。该分析法是使用骨髓瘤细胞的NP40提取物完成的。有许多假定的抗蛋白聚糖单抗隆抗体可以以相似于MAb9.2.27的方式与骨髓瘤细胞提取物反应，而有些则並不与之发生作用。
之后使用人黑素瘤、皮肤和肾组织样品，以免疫过氧化物酶染色法进一步检定产生相似于MAb9.2.27之ELISA图型的单克隆抗体。后两种正常组织代表了所有已知与9.2.27有交叉反应性的正常组织。强烈着染黑素瘤样品、皮肤表层内基底细胞和肾组织内收集管的单克隆被认为是假定的抗蛋白聚糖抗体（“9.2.27样抗体”），並对其作进一步的试验研究。
进行双决定因素ELISA试验判定对蛋白聚糖的反应活性。以两种方式作双决定因素ELISA（double determinant ELISA）试验。第一种方式是使用MAb9.2.27F（ab）′2作俘获抗体，同时加入抗原的标准源SK MEL-28NP40提取物，之后再加假定之抗蛋白聚糖抗体的上清液。温育后用生物素抗小鼠Fc特异性试剂检测结合的单克隆抗体。在第二种方式的试验中，提取物中的抗原被固相抗体-包括MAbs9.2.27、NR-Ml-02、NR-Ml-03、NR-Ml-04和NR-Ml-05所俘获。以不同的联合形式将已经生物素基化的同样抗体用于检测结合的抗原。在这些条件下，识别同一抗原决定基的抗体没有发生显色反应，而识别特定抗原决定基的抗体则出现了很强的显色反应。由这一试验可以推定，每种抗体只有一个单一的抗原决定基存在于抗原上，该抗原则已通过被同一抗体俘获和检测而得以确定。
可用免疫沉淀法和SDS-PAGE法来进一步估计有这一水平之反应活性的抗体，以进一步证实其对蛋白聚糖的反应活性。为进行更详细地评价，试验选用了五种抗蛋白聚糖抗体。
表5中总结了融合数及假定之抗蛋白聚糖抗体的数目。
表5
对融合及检测结果的总结
假定之抗蛋白
免疫原类型    融合数目    筛选之杂交瘤的数目    聚糖MAb的数目
凝集素/提取物    7    1.619    1
完整细胞    7    1.767    4
免疫复合物    5    1.261    0
完整细胞加    2    1.302    67
免疫复合物
完整细胞免疫法产生出相对很少的假定的抗蛋白聚糖抗体。然而，将使用完整细胞致敏加上继后用不能溶解的MAb9.2.27和蛋白聚糖抗原的免疫复合物作加强免疫，则可大量产生假定的抗蛋白聚糖抗体。选用了五种假定的抗蛋白聚糖单克隆抗体作进一步分析。表6中列出了这些抗体及产生这些抗体的细胞系。
各命名的细胞系已寄存在A.T.C.C.（Rockville，Maryland），並在表中指出了各自的登记号。
表6
单克隆抗体及杂交瘤细胞系命名
单克隆抗体    杂交瘤细胞系    ATCC登记号
NR-Ml-02    NR-Ml-02A1923    HB-9352
NR-Ml-03    NR-Ml-03A221S    HB-9349
NR-Ml-04    NR-Ml-04A1993    HB-9351
NR-Ml-05    NR-Ml-05A2106    HB-9350
NR-Ml-06    NR-Ml-06A3-27    HB-9348
表7中给出了检测这些抗体之反应活性的结果。
Figure 87105716_IMG6
就抗蛋白聚糖单克隆抗体进行了更详细的免疫过氧化物酶法分析。其反应活性的模式类同于MAb9.2.27，其包括对有代表性的黑素瘤部分的高密度而且均匀的着染，同时所有经抗体染色的细胞均为肿瘤细胞而证实的低度抗原异质性。实验中还发现平滑肌和内皮细胞与所有抗体都有反应活性。
还在ELISA和流动细胞计数法中分别使用双决定因素及附加分析法，进行了抗蛋白聚糖单克隆抗体的抗原决定基比较。表8所示的结果表明，MAbs9.2.27、NR-Ml-03和NR-Ml-05在用于俘获和检测时，並没有给出阳性信号，此提示它们各识别一种特定的抗原决定基。反之，MAbs    NR-Ml-02和NR-Ml-04当以任何方式结合使用时均没有给出阳性信号，因而它们可能是识别同一抗原决定基的。
Figure 87105716_IMG7
这一假设已用流动细胞计数法测定附加的细胞表面结合得以进一步证实。通过测定各种抗体的荧光强度，在表9中显示出各识别不同抗原决定基之抗体的结合，其荧光强度为单用两种抗体减去对照抗体之荧光强度理论总合的100%或更多。NR-Ml-04和NR-Ml-02只给出预期值的一半，此表明这些抗体可识别同一抗原决定基。筛选了61种其它抗蛋白聚糖单克隆抗体，以试验它们对四个被9.2.27、NR-Ml-03、NR-Ml-05和MR-Ml-02/NR-Ml-04识别的决定基的“叠加性”。被试的61种抗体中没有一种能识别出如MAb9.2.27（即用于免疫复合物免疫法的抗体）所识别的同一抗原决定基。61种抗体中有10种显示可识别由NR-Ml-02和NR-Ml-04识别的同一决定基，而只有3种抗体可识别由NR-Ml-03或NR-Ml-05识别的同一决定基。有48种抗体未能识别由五种已定性的抗体所鉴别出的抗原决定基。
Figure 87105716_IMG8
之后使用THP-1（一种表达鼠和人IgG之Fc受体的连续的单核细胞系）估计有代表性的抗蛋白聚糖单克隆抗体之Fc介导的结合，结果如表10所示。因为THP-1细胞系不能表达IgG1的受体，所以IgG-1抗蛋白聚糖单克隆抗体（NR-Ml-02和NR-Ml-04）的结合是在本底水平。值得注意的是，IgG-2b    NR-Ml-05抗体也没有结合，而IgG-2a抗体，即NR-Ml-03和9.2.27则结合得极好。
表10
以流动细胞计数法检测Fc受体结合
抗体    同型抗体    荧光素当量    试验：对照比例
Secondary    Alone    …    37，000    1.0
NR-Ml-02    IgG1    43，000    1.2
NR-Ml-04    IgG1    61，000    1.6
NR-Ml-05    IgG2b    55，000    1.5
NR-Ml-03    IgG2a    186，000    5.0
9.2.27    IgG2a    196，000    5.3
由上述内容可以看出，虽然为阐述清楚起见文中描述了本发明的特定实施方案及实施例，但在不违背本发明之实质和范围的前提下，是可以作各种改动的。因此除本发明待批权利要求的内容外，本发明将不受限制。

Claims (13)

1、一种提高抗体生产的方法，其包括如下步骤：
使抗体吸附于不能溶解的蛋白A上，以形成一种免疫吸附剂；
使抗原与所说的免疫吸附剂结合，形成一种不能溶解的免疫复合物；
用所说的不能溶解的免疫复合物免疫动物；並且
由所说的被免疫动物体内收集抗血清。
2、一种改善可溶性抗原的免疫原性，从而提高特异性单克隆抗体之生产的方法，其包括如下步骤：
使抗体吸附于不能溶解的蛋白A上，以形成一种免疫吸附剂;
使所说的可溶性抗原与所说的免疫吸附剂结合，以形成一种不能溶解的免疫复合物;
用所说的不能溶解的免疫复合物免疫动物;
使得自被免疫之动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成能产生抗所说可溶性抗原之单克隆抗体的杂交瘤;
培养所说的杂交瘤以产生所说的单克隆抗体;並且
收集作为所说杂交瘤之产物的所说的单克隆抗体。
3、一种生产对不同于由已有单克隆抗体识别之抗原决定基特异的单克隆抗体的方法，其包括如下步骤：
使抗多价抗原之第一抗原决定基的第一单克隆抗体吸附在不能溶解的蛋白A上，以形成一种免疫吸附剂;
使所说的免疫吸附剂与所说的抗原结合，形成一种不能溶解的免疫复合物，其中所说的第一抗原决定基是被所说的第一单克隆抗体掩敝的;
用所说的不能溶解的免疫复合物免疫动物;
使得自所说之被免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成能够产生抗所说第二抗原决定基之第二单克隆抗体的杂交瘤;
培养所说的杂交瘤以产生所说的第二单克隆抗体;並且
收集作为所说的杂交瘤的产物的所说的第二单克隆抗体。
4、细胞系NR-Ml-02A1923。
5、细胞系NR-Ml-03A2215。
6、细胞系NR-Ml-04A1993。
7、细胞系NR-Ml-05A2106。
8、细胞系NR-Ml-06A3026。
9、一种生产单克隆抗个体基因型抗体的方法，其包括如下步骤：
使第一抗体吸附在不能溶解的蛋白A上，以形成一种免疫吸附剂;
用所说的免疫吸附剂免疫动物;
使得自所说被免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成能产生抗所说第一抗体之某抗原决定基的单克隆抗体的杂交瘤;
培养所说的杂交瘤以产生所说的单克隆抗体;並且
收集作为所说杂交瘤之产物的所说单克隆抗体。
10、一种用作免疫原的不能溶解的免疫复合物，其包含：
吸附于不能溶解之蛋白A上的抗体，以及被所说抗体识别並与之结合的抗原。
11、一种用于生产单克隆抗个体基因型抗体的免疫吸附剂，其包含：
吸附于不能溶解之蛋白A上的抗体。
12、一种用作免疫原的不能溶解的免疫复合物，其包含：
直接同Sepharose相联接的抗体，以及可被所说的抗体识别並与之结合的抗原。
13、由权利要求4、5、6、7和8的细胞系生产的单克隆抗体。
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