CN1195069C - 人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法，其方法为：①制备免疫原：以人工合成的FSH β多肽片段为免疫原，将其滴在硝酸纤维素膜上；②免疫：将硝酸纤维膜埋入待免疫的小鼠脾内，间隔两周后加强免疫，第三次免疫起每次免疫间隔3周至1个月；③筛选：用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；④细胞融合、筛选及克隆化；⑤单克隆抗体的提取与纯化；⑥腹水制备；人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法是一种应用单克隆抗体制备技术，以人工合成的多肽——人卵泡刺激素的一个组成单位，β亚基的氨基酸片段——为免疫原制备得到灵敏性高、特异性强、实用性好的鼠源性抗人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体。
Description
一、技术领域
本发明是一种应用单克隆抗体制备技术，以人工合成的多肽——人卵泡刺激素的一个组成单位，β亚基的氨基酸片段——为免疫原，制备得到灵敏性高、特异性强、实用性好的鼠源性抗人卵泡刺激素(FSH)β单克隆抗体。
二、背景技术
目前国内尚无商品化的FSHβ单抗，给科研及临床应用带来了一些不便。
卵泡刺激素(FSH)是由脑垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素，由α和β两个非共价结合的多肽亚单位组成。FSH与人类的生殖生育功能密切相关，是雌性卵泡发生、雄性精子产生足够活率和活力及支持细胞生长的基础。通过测定FSH的分泌水平可以对下丘脑-垂体-性腺轴的功能做出评价，因此FSH是重要的内分泌及生殖生物标记物之一。
FSHβ亚单位的氨基酸序列与其他糖蛋白激素不同，具有独特的生物学和免疫学活性，其所呈现的活性形式是由β亚单位所决定的。
三、技术内容
1、技术问题本发明的目的是提供一种节省抗原用量、免疫效果好、针对已知表位特异性强的人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法。
2、技术方案本发明的人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法为：①制备免疫原：以人工合成的FSHβ多肽片段为免疫原，其氨基酸序列51-60，将其滴在硝酸纤维素膜上；②免疫：按常规外科操作将硝酸纤维膜埋入待免疫的小鼠脾内，间隔两周后加强免疫，腹腔注射抗原肽与福氏不完全佐剂混合液，第三次免疫起每次间隔3周至一个月；③筛选：用酶联免疫吸附法(ELISA)筛选免疫鼠血清；④细胞融合、筛选及克隆化：选抗血清效价最高的鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合，经三次亚克隆获得稳定分泌抗FSHβ的单克隆抗体细胞株；⑤单克隆抗体的提取与纯化：将以上的细胞株体外扩大培养后，定期收集上清液；⑥腹水制备：将扩大培养后的细胞株打入老龄鼠腹腔以生产大量腹水，经提取、纯化后即可得到FSHβ亚基单克隆抗体。在免疫原的制备中，在每一个2mm×2mm的硝酸纤维素膜上滴入10-20μg的免疫原，抗原肽与福氏不完全佐剂混合液的混合比例为1∶1，该混合液对鼠腹腔的注入量为0.5-1.5毫升，在单克隆抗体的提取与纯化中，每3天收集1次上清液，以盐析法纯化，在腹水制备中，将扩大培养后的细胞株打入鼠腔的杂交瘤细胞数为105-107个左右，7-10天后收集腹水。
3、技术效果本发明一改以往直接用FSHβ全长做免疫原、直接对小鼠腹腔或脾脏进行注射的免疫方式，以人工合成的FSHβ亚基(51-60)片段(简称FSHβ)作免疫原，采用不与大分子载体蛋白偶联、脾内直接包埋小分子抗原的免疫方法，制备抗人FSHβ单克隆抗体，最大限度的节省了抗原用量，免疫效果好，针对已知表位特异性强。并通过对所得抗体特性的初步分析及鉴定，为特异、灵敏的尿液FSH酶免疫测定方法的进一步建立与应用提供了实验依据。
四、附图说明
图1是免疫球蛋白类别及亚类测定结果。
其中“+”表示试条测定结果的有效性；“A”表示IgA型；“M”表示IgM型；“G1”表示IgG1型；“2a”表示Ig2a型；“2b”表示Ig2b型；“G3”表示IgG3型；“λ”表示轻链为λ型；“κ”表示轻链为κ型。
图2是蛋白免疫印记(Western Blot)分析结果。
其中“KDr”表示分子量；“M”表示标记过的已知分子量；“1”、“2”均表示人血清中IgG相关蛋白。
五、具体实施方式
1 材料 BALB/C纯系小鼠，雌性，8周龄。SP2/0骨髓瘤细胞株、RPMI1640培养基、新生小牛血清、次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶(HAT)、次黄嘌呤-胸腺嘧啶(HT)、聚乙二醇(PEG4000)，(以上均由南京医科大学分子生物研究所提供)。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠免疫球蛋白(武汉博士德生物制品公司)。
氨基酸序列为“YTRDLVYKNP”的FSHβ合成肽(由中国科学院上海生物化学研究所合成)，经毛细电泳纯化，产品符合卫生部生物制品标准。小鼠单抗亚型测定试剂盒(购自美国罗氏公司)。预染的高分子质量蛋白质(Marker)(购自Biolab公司)。黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)放免检测试剂盒(购自中国原子能科学研究院同位素研究所)。
2 方法
2.1免疫原制备 10μg(5μl，2μg/μl)抗原滴在2mm×2mm的硝酸纤维素膜(NC)上，晾干。
2.2免疫 脾内植入免疫，小鼠氯胺酮麻醉，四肢固定后脾区拔毛，酒精消毒，左腋中线肋边缘下作5mm切口，入腹牵出脾脏下缘，切开脾包膜，填入已吸附抗原之NC膜，压迫止血，切口全层一针缝合。
免疫方案首次免疫采用脾内植入；间隔2周后加强免疫，腹腔注射抗原肽与福氏不完全佐剂混合液(1∶1)1ml；第3次免疫起每次间隔3周至一个月。
2.3 ELISA筛选 用含0.2％戊二醛的磷酸缓冲液(PH5.8)处理酶标板4h，加20μg/ml抗原溶液37℃包被3h，100mmol/L赖氨酸磷酸缓冲液(PH8.0)37℃封闭1h，PBST冲洗3遍，4℃保持。用时每包被孔加稀释血清或杂交瘤细胞培养上清100μl，37℃孵育30min，冲洗一遍，加1∶5000的酶标二抗，37℃孵育15min，最后加底物-联苯胺(TMB)、底物-双氧水(H2O2)室温显色10-15min，以SP2/0骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照。
2.4细胞融合、筛选及克隆化融合前3天，对血清效价最高的小鼠眶下静脉注射无佐剂抗原100μg，按常规方法，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞(5∶1)融合，HAT选择培养，用上述ELISA法筛选，阳性孔经3次有限稀释克隆化。
2.5单克隆抗体的提取与纯化经过克隆的杂交瘤细胞扩大培养后，每隔3天收集1次上清液，1000r/min离心10min，上清液经硫酸氨分级沉淀法纯化后-20℃冻存。
2.6腹水制备在每只BALB/C小鼠腹腔内注入0.5ml液体石蜡，10天后同法每只注入已培养的杂交瘤细胞106个，10天后小鼠腹部明显隆起，手触有波动感，用16号针头采集腹水。1500r/min离心30min，收集上清，-20℃冻存。
2.7 McAb初步鉴定
2.7.1效价测定 用间接ELISA法检测杂交瘤培养上清及诱生腹水抗体免疫学效价。包被抗原为合成的FSHβ短肽(51-60)，酶标记物为羊抗鼠HRP酶标二抗，酶底物为TMB-H2O2。
2.7.2 McAb类型鉴定 按罗氏(Roche)公司小鼠免疫球蛋白亚类测定试剂盒说明操作。
2.7.3单克隆抗体特异性测定
2.7.3.1蛋白免疫印记(Western Blot)分析 首先进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，再电转至PVDF膜上，一、二抗结合后，二氨基联苯胺(DAB)显色。
2.7.3.2交叉反应试验 选择了3种可能与FSH有交叉反应的抗原：TSH、LH、hCG。将不同稀释度的杂交瘤细胞株分泌的单抗与人血清4℃孵育过夜，并用PBS与人血清孵育做对照，用放免方法测孵育后两组样品中以上3种抗原含量的差异。FSHβ(51-61)20μg/ml包板，作为阳性对照。无关抗原20μg/ml包板作为阴性对照。
结果：
1杂交瘤细胞系的建立与克隆 免疫小鼠血清ELISA效价均达1∶104以上，取脾细胞与SP2/0细胞融合后HAT培养基培养，一周左右部分孔见细胞克隆性生长，两周后细胞生长超过孔底面积1/3，融合成功率为72％，特异性抗体阳性率为27.6％，经3次克隆化后保留一株最佳杂交瘤细胞株F1C。
2 FSHβ单抗的鉴定
2.1效价 用间接ELISA法检测F1C腹水型单抗及细胞培养上清中单抗效价分别为1∶1.6×104、1∶16。
单克隆抗体F1c梯度稀释后ELISA测定OD值如下：
F1C
杂交瘤细胞培养上清 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 Control
0.389 0.376 0.283 0.129 0.088
腹 水 1∶400 1∶800 1∶16000 1∶32000
0.280 0.204 0.184 0.144
注：阳性标准：检测孔OD值/对照组OD值＞2.1
2.2免疫球蛋白(Ig)类别及亚型测定经鉴定，所得细胞株F1c分泌的免疫球蛋白为IgM，轻链类型为κ(见图1)。
2.3特异性
2.3.1 Western Blot鉴定F1C可与人血清中的FSH在分子量30KD附近发生特异性结合(见图2)。
2.3.2交叉反应分析 人血清加入单抗组和加入PBS组相比，前述3种抗原不同浓度各组间含量差异见表2，FSHβ(51-61)20μg/ml包板ELISA实验阳性，无关抗原20μg/ml包板ELISA实验阴性。
FSHβ亚基单抗F1C与3种激素的交叉反应方差分析如下：
PBS孵育组激 不同稀释度单抗孵育组激素含量(mIU/ml)
激 素
n F P
素 含量 1∶2 1：5 1∶10
(mIU/ml)
240.403 268.193 241.848 223.530
0.03 0.99
HCG 6 (74.148-105 (105.821-10 (78.294-99 (60.746-10
5 1
7.559) 79.143) 2.873) 28.907)
9.340 8.492 9.231 8.519
0.03 0.99
LH 8 (2.445-20.0 (1.992-16.6 (2.322-20. (2.282-18.
1 2
08) 04) 068) 127)
2.247± 2.645± 1.33 0.29
TSH 5 2.351±0.359 2.926±0.541
0.442 0.889 4 8
注：HCG、LH表示为几何均数(最大值、最小值)，TSH表示为均数±标准差
2.4稳定性 F1C杂交瘤细胞连续培养两个月，其分泌抗体的能力没有明显的变化；经冻存复苏后，杂交瘤细胞长势良好，并能稳定地分泌单克隆抗体。
Claims (5)
1、一种人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法，其特征在于其方法为：
1.1制备免疫原：以人工合成的FSHβ多肽片段为免疫原，其氨基酸序列为YTRDLVYKNP，将其滴在硝酸纤维素膜上；
1.2免疫：按常规外科操作将硝酸纤维膜埋入待免疫的小鼠脾内，间隔两周后加强免疫，腹腔注射抗原肽与福氏不完全佐剂混合液，第三次免疫起每次免疫间隔3周至1个月；
1.3筛选：用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；
1.4细胞融合、筛选及克隆化：选抗血清效价最高的鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合，经三次亚克隆获得稳定分泌抗FSHβ的单克隆抗体细胞株；
1.5单克隆抗体的提取与纯化：将以上的细胞株体外扩大培养后，定期收集上清液以盐析法纯化；
1.6腹水制备：将扩大培养后的细胞株打入老龄鼠腹腔以生产大量腹水，经提取、纯化后即可得到FSHβ亚基单克隆抗体。
2、根据权利要求1所述的人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法，其特征在于在免疫原的制备中，在每一个2mm×2mm的硝酸纤维素膜上滴入10-20μg的免疫原。
3、根据权利要求1或2所述的人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法，其特征在于抗原肽与福氏不完全佐剂混合液的混合比例为1∶1，该混合液对鼠腹腔的注入量为0.5-1.5毫升。
4、根据权利要求1或2所述的人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法，其特征在于在单克隆抗体的提取与纯化中，每3天收集1次上清液。
5、根据权利要求1或2所述的人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备方法，其特征在于在腹水制备中，将扩大培养后的细胞株打入鼠腔的杂交瘤细胞数为105-107个。
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