一种单克隆抗体,能生产该抗体的细胞系及该抗体的用途
本发明涉及一种用于对具有分子量约为20,000的人生长激素进行测定的单克隆抗体;一种能生产该单克隆抗体的细胞系和一种借助于该单克隆抗体对具有分子量约为20,000的人生长激素进行的灵敏的免疫测定方法。
众所周知,在人体中存在两种主要的人生长激素(有时称为“hGH’);具有分子量约为22,000(称为“22k hGH”)和约为20,000(称为“20k hGH”)的肽激素。22k hGH是一种具有191个氨基酸的蛋白质,而20k hGH是一种具有176个氨基酸的蛋白质。
20k hGH和22k hGH两者原本都是由一个单个基因编码的蛋白质,所以他们的氨基酸序列非常相似,所不同的是20k hGH的结构是在22k hGH的N-末端缺失了第32位到第46位的15个氨基酸。
众所周知,一位正常分泌的成年人,早晨的hGH水平低于约5纳克/毫升的基础水平。
过去的研究表明人体中存在的22k hGH远远高于20k hGH;具体地说,20k hGH能够达到总hGHs的5到20%。
血液的hGHs水平变化恒定而且大,即,在一天中有明显变化并在运动或睡觉时增高。然而,通过测定从人脑垂体提取的hGHs已经得到如上所述的20khGH和22k hGH的定量比例。所以,在人体天然分泌动力学中他们之间的定量比例仍然未知并且是否在一个短时间内变化也是未知的。
作为一种药物,22k hGH已经市售,并且比20k hGH研究更深入。
最近报道了20k hGH的生物学活性;它的生长促进活性与22k hGH相当,在异常葡萄糖耐药性方面其诱导性更低并且是更不可致糖尿病的(Lewis,U.J.等人,Endocriniol.Japan,
34,73-85(1987))。这表明当一种人生长激素用作药物时,20k hGH比22k hGH具有更小的不利药物反应的危险性。所以,作为对具有生长激素缺陷成人的替代疗法的一种药物,20k hGH的用途越来越受到关注(HisaoSeno,Igaku No Ayumi,
165,247-251(1993))。
然而,在本发明人最近首先建立制备方法之前还没有生产大量纯净20khGH的成功例子,所以,还没有得到足够量和纯化的20k hGH用于实施各种研究。所以20k hGH还没有应用于临床。另外,由于还没有研制出检测20k hGH的灵敏的免疫测定方法,一个长时间内还难于决定20k hGH和22k hGH的活性和分子结构之间的关系。过去对20k hGH的研究主要处在利用少量从活体提取的20k hGH进行的分子或细胞水平上,并且还没有20k hGH的临床研究。
下文将描述hGHs的测定方法。现有几种已知的人血液或尿中的hGHs的测定方法可解释hGHs的生物学作用(例如,Hashida和Ishikawa等人,Clinica.Chimica.Acta,
162,229-235(1987))。
对于作为一种药物开发hGHs,在临床试验中测定精确的分泌动力学包括人体中hGHs的一个基线血液水平是必要的。另外,要求测定方法灵敏而没有误差。
由于22k hGH已经应用于临床,存在有能够测定早晨22k hGH的基线血液水平(低于5纳克/毫升)的免疫测定方法。
例如,对于22k hGH,在日本专利待公开No.273496/88(JP-A 63-273496)中已经公开了利用一种特异于22k hGH的抗体的免疫测定方法。该专利说明书叙述了它与20k hGH的交叉反应性为15%,然而,由于没有说明用于该方法的标准20k hGH的纯度水平,上述百分比可能是十分可疑的。
另一方面,以前所有的20k hGH的免疫测定的例子是在运动负荷下的一个较高的20k hGH分泌值(1纳克/毫升)测定的。由于没有足够的交叉反应性和灵敏性任何以前的测定方法只在细胞水平调查人20k hGH,即,不具有一个足够的灵敏度来测定它的基线血液水平。
已知的20k hGH的免疫测定如下。
有一种测定方法,其中一个20k hGH的值是通过从与所有hGHs反应的抗体的测定值中减去与22k hGH特异性反应的一个抗体的测定值得到的(Eur.J.Appl.Physiol.,
62,130-134(1991))。作者假定除了22k hGH以外,hGHs将含有20k hGH。近来已经发现了hGH的几种变体,它们类似于20k hGH,作为总hGHs与一种抗体反应,因此,作者可能把变异体当作20k hGH进行测定,所以20k hGH的测定值肯定是十分不精确的。
Mario Mellado等人已经公开了一种特异于20k hGH的单克隆抗体(临床内分泌学和代谢杂志,
81,1613-1618(1996)),他们描述了与22k hGH的交叉反应性低于1%,没有给出一个在人体液中确定20k hGH的具体例子。正如后面讨论的,利用这篇文章的单克隆抗体在理论上阐明20k hGH在人体中的分泌动力学是不可能的。
所以,还没有灵敏的免疫测定方法,能够测定20k hGH的分泌动力学。测定20k hGH的分泌动力学意味着在一个相当低的接近它的基线血液水平上能够精确测定20k hGH。对于22k hGH的免疫测定,在接近它的基线血液水平的相当低水平上进行精确测定的情况是相似的。然而,对于20k hGH,存在交叉反应性和灵敏性的内在问题,但对于22k hGH却没有。所以,与22k hGH的免疫测定不同,提供一个20k hGH的灵敏的免疫测定是困难的。
交叉反应性是当与一种抗体反应的表位也与另一个抗体反应时观察到的现象。在22k hGH的免疫测定中应该考虑到交叉反应性。然而,由于下面的原因,它不是显著的问题:首先,血液中含有的22k hGH比20k hGH高许多(5到20倍)。其次,正如上面所述,22k hGH有一个含有15个氨基酸的独特序列。所以,如果可以制备一种能够识别该独特序列作为表位的单克隆抗体,那么可以容易地制备一种可以与22k hGH特异地反应并且是足够灵敏的单克隆抗体。
在另一方面,对于20k hGH的免疫测定,由于下面的原因,解决交叉反应性和灵敏性的问题是困难的。
首先,在血液中,20k hGH比22k hGH少得多(1/5到1/20)。这显然意味着一个20k hGH的灵敏的免疫测定需要具有比22k hGH的一个灵敏的免疫测定高10倍的灵敏性。进一步,与22k hGH的交叉反应性显著影响测定的精确度。
其次,20k hGH与22k hGH的不同在于它不具有一个独特的氨基酸序列。无论如何,在22k hGH的15个氨基酸缺失的末端之间的连接片段,即,在N-末端的第31位苯丙氨酸和第32位天冬酰胺(22k hGH的N-末端第47位氨基酸)相互邻接的序列,可以认为是20k hGH的一个独特氨基酸序列。Lewis等人已经用一种与清蛋白偶联的含有一个该氨基酸序列的邻近区域(一个20k hGH的N-末端的第28到第38位的氨基酸序列)的多肽免疫接种一种动物并试图制备一种识别该多肽为一个表位的单克隆抗体,但是没有成功(Lewis U.J.et al,Endocrinol Japan,Vol.34,pp.73-85(1987))。
第三,为了制备与22k hGH较少交叉反应但是足够灵敏的一种单克隆抗体,分离大量生产单克隆抗体的细胞然后从中筛选生产所需要的单克隆抗体的细胞是必要的。此外,在这种情况下,应该充分地免疫接种用于制备生产抗体的细胞的动物,这需要大量纯20k hGH。
目前,还不能通过商业途径获得20k hGH并几乎没有制备的方法。在这样一种情况下,得到适于免疫接种动物的量的20k hGH是困难的。在本发明之前,用20k hGH适当免疫接种一种动物制备生产抗体的细胞是困难的。因而,得到生产所需要单克隆抗体的细胞是十分困难的。
所以,与一种特异于22k hGH的单克隆抗体不同,得到一种特异于20k hGH的单克隆抗体是困难的,所以利用单克隆抗体建立20k hGH的灵敏免疫测定方法是困难的。
下面将基于上面Mellado等人描述的方法来叙述在20k hGH的灵敏免疫测定中的交叉反应性和灵敏性的问题。
Mellado等人描述与20k hGH反应的单克隆抗体具有低于1%的与22khGH的交叉反应性。如果利用一种具有1%的交叉反应性的单克隆抗体对一个含有5纳克/毫升的22k hGH和250pg/毫升的20k hGH的样品进行免疫测定,测量值将是5000pg/毫升×0.01+250pg/毫升=300pg/毫升,与真正值相比误差为20%,这表明确定一个基线血液水平是不可行的。
另外,Mellado等人描述免疫测定的测量灵敏度为4纳克/毫升。由于一个正常成年人血液中20k hGH的一个最高水平约为1纳克/毫升,所以Mellado等人描述的免疫测定不能测定20k hGH的基线血液水平。换句话说,该方法不能解释人血液中20k hGH的分泌动力学。
正如上述所述,Mellado等人还没有解决上面在20k hGH的免疫测定中的交叉反应性和灵敏性问题。所以,Mellado等人叙述的单克隆抗体及其免疫测定不能用于作为药物开发20k hGH的临床研究。
为了解决这些问题,本发明应当提供20k hGH的一种灵敏的免疫测定方法,它可用于研制作为药物的20k hGH,能确定20k hGH的基线血液水平,并能使我们解释20k hGH的分泌动力学。
所以,本发明的一个目的是提供一种与20k hGH特异反应但与22k hGH基本上不反应的单克隆抗体和它的制备方法;一种能够生产该抗体的细胞系;和一种利用该抗体能精确和直接定量人血液中20k hGH的20k hGH的免疫测定方法。
本发明人已经计划制备所需要的单克隆抗体,进行下面的改进以解决上面问题。
首先,制备了大量的纯20k hGH,并给一种动物重复地给药以便充分地免疫接种。其次,作为筛选程序,我们用一个液体系统中的“夹心”免疫测定代替先前在一个固体系统中的免疫测定。由于这些改进,我们已经成功地制备了一种与20k hGH特异反应但与22k hGH基本上不反应的单克隆抗体,进一步,我们已经建立了一种能够利用该单克隆抗体在一个接近它的基线血液水平的水平上特异确定20k hGH的灵敏测定方法以完成本发明。
本发明提供了一种与20khGH特异反应但与22khGH基本上不反应的单克隆抗体;一种生产该单克隆抗体的细胞系;和利用该单克隆抗体进行的20khGH的免疫测定。
本发明提供了一种生产与20k hGH特异反应但与22k hGH基本上不反应的单克隆抗体的细胞系。本发明还提供了一种与20k hGH特异反应但与22khGH基本上不反应的单克隆抗体,和制备该单克隆抗体的方法。进一步,本发明提供了一种利用本发明的单克隆抗体进行的免疫测定。
本发明的单克隆抗体与现有技术中的那些相比,与22k hGH的交叉反应性显著降低并且与20k hGH有高亲和性。所以,由于能够进行曾经是不可行的20k hGH的基线血液水平的测定,利用本发明的单克隆抗体的免疫测定可能是解释20k hGH的分泌动力学的有效途径。由于20k hGH将用作象治疗生长损伤的一种药物,所以本发明的免疫测定可用于开发20k hGH作为药物。
图1显示在一个“夹心”免疫测定中20 khGH和22 khGH与MTC6A单克隆抗体的反应性。
下面将对本发明作详细描述。
与本发明的单克隆抗体反应的激素20k hGH,是一个含有176个氨基酸的蛋白质,它们包括那些起源于人脑垂体和人血液的;和通过基因重组技术生产的那些。有两种类型的已知20k hGH,其中N-末端的第14位氨基酸是丝氨酸或蛋氨酸,并且两者都可以用于本发明。
与本发明的单克隆抗体不反应的激素22k hGH,是一种含有191个氨基酸的蛋白质,它们包括那些起源于人脑垂体和人血液的;和通过基因重组技术生产的那些。
本发明的单克隆抗体与20k hGH特异反应,但与22k hGH基本上不反应。
为达到本发明的目的,一种与20k hGH特异反应但与22k hGH基本上不反应的单克隆抗体具有与22k hGH的特别低的交叉反应性并且在测定20k hGH时它与22k hGH的反应性产生的误差可忽略,即在后面说明的一个“夹心”免疫测定中它的交叉反应性低于0.1%,优选地低于0.03%。
本发明的单克隆抗体的球蛋白类型不受限制,只要与20k hGH特异反应而与22k hGH基本上不反应,例如,IgG,IgM,IgA,IgE和IgD。
从生产该抗体的一个细胞系可以制备本发明的单克隆抗体。
生产本发明的单克隆抗体的细胞系不受限制,只要它能生产一种与20khGH特异反应而与22k hGH基本上不反应的单克隆抗体,并且例如,可以通过将产生抗-20k hGH抗体的一种细胞与一种骨髓瘤细胞株进行细胞融合得到的杂交瘤来获得该细胞系。这样一个杂交瘤包括MTC6A菌株(FERMBP-5913)。
具体地说,生产与20k hGH特异反应而与22k hGH基本上不反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,可以由下面的细胞融合技术制备。
可以用于制备本发明的细胞株的方法的产生抗体的细胞包括脾细胞,淋巴结细胞和B-淋巴细胞。可能用到的抗原包括从脑垂体提取或由基因重组技术生产的20k hGH。被免疫接种的动物可以是一种象小鼠和大鼠的哺乳动物。可以用常规方法用抗原给动物给药。例如,用一种象完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂与用20k hGH作为抗原制备一种悬浮液或乳剂并且给动物施用几次,例如,通过静脉注射,皮下注射,皮内注射,或腹膜注射进行免疫接种。从免疫接种的动物中取出象脾细胞的抗体产生细胞,然后根据已知方法(G.Kohler等人,自然学,256,495(1975))将它与骨髓瘤细胞融合以提供本发明的杂交瘤细胞。
对于小鼠,可以用于细胞融合的骨髓瘤细胞株包括P3X63Ag8,P3U1和Sp2/0菌株。如聚乙二醇和Sendai病毒的融合催速剂可以用于细胞融合,如常规方法可将次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基用于细胞融合后的杂交瘤的筛选。
用例如,限制稀释方法,将细胞融合制备的杂交瘤克隆,然后通过用20khGH和22k hGH的免疫测定(即,JenotropineTM(Sumitomo Pharm.))进行筛选以提供生产与20k hGH特异反应而与22k hGH基本上不反应的单克隆抗体的细胞系。
通过(1)把与人生长激素特异反应的抗体(称为“抗-hGH抗体”)与一个不溶载体偶联形成一个hGH-抗体偶联的不溶载体,(2)把hGH-抗体偶联的不溶载体与20k hGH反应形成一个抗-hGH抗体-20k hGH偶联产物,(3)把该偶联产物与上面杂交瘤的培养基中的单克隆抗体反应形成一个抗-hGH抗体-20k hGH-20k hGH单克隆抗体的复合物,(4)把该复合物与一个酶标记的抗体偶联形成一个抗-hGH抗体-20k hGH-20k hGH单克隆抗体-酶标记抗体的复合物,和(5)利用上面具有酶标记抗体的复合物确定标记该抗体的酶的活性以筛选杂交瘤细胞,从而完成本发明的细胞株的筛选。
下面将详细叙述利用免疫测定的筛选。
第一步,把一个抗-hGH抗体偶联到一个不溶载体上形成抗-hGH-抗体偶联的不溶载体。不溶载体可以包括微滴板,塑料珠,玻璃珠和磁性微颗粒。抗-hGH抗体与20k hGH和22k hGH都反应,可以是单克隆或多克隆的。通过亲和层析纯化的抗-hGH兔多克隆抗体是优选的,具体地说是F(ab’)2片段或Fab’片段以减少非特异吸附。通过已知的化学偶联方法可以把抗体与这些不溶载体偶联,但可以通过物理吸附适当地偶联。具体地说,把抗-hGH抗体溶解于碳酸盐或磷酸盐缓冲液中,在溶液中加入上面的不溶载体,在0℃到室温保留混合物至少一小时,然后用如Tris-Hcl缓冲液或含有吐温20(聚氧化乙烯-三梨醇-单月桂酸酯)和叠氮化钠的磷酸盐缓冲液洗涤该混合物以除去未偶联的抗体。
第二步,把第一步中制备的抗-hGH-抗体偶联的不溶载体与适当量的20khGH反应,形成一个抗-hGH抗体-20k hGH偶联产物,其中20k hGH与抗体偶联不溶载体特异偶联。
第三步,根据上面的方法在上面第二步中制备的偶联产物中加入杂交瘤的培养基以便和培养基中的单克隆抗体反应,从而在抗-hGH-抗体偶联不溶载体上产生一个抗-hGH抗体-20k hGH-抗-20k hGH单克隆抗体的夹心复合物。
第四步,把上面第三步中制备的夹心复合物与抗免疫接种的动物的抗体的一种酶标记抗体(称为“酶标记抗体”)反应,确定夹心复合物中抗-20k hGH单克隆抗体的量。用于免疫测定的抗免疫接种的动物的抗体的一种抗体可以是单克隆或多克隆的,特别是一种由亲和层析纯化的多克隆抗体。标记酶包括辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,葡葡糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。可以用任何已知的方法,用这些酶的任何一种对抗免疫接种的动物的抗体的抗体进行标记,例如用高碘酸氧化酶的糖链形成一个醛基基团,然后,例如把抗-hGH抗体的一个氨基酸与之偶联;在酶中引入一个适当的基团如顺丁烯二酰亚胺基团和硫化吡啶基团并把引入基团与抗-hGH抗体的Fab’片段中的巯基基团偶联。
第五步,定量测定第四步中制备的夹心复合物的酶活性,其中该复合物结合了酶标记抗体。
酶活性依赖于杂交瘤的培养基中与20k hGH反应的单克隆抗体的量。可以通过加入一种如酶底物的物质来确定活性。
当然,上述免疫测定的筛选可以是下面程序;把抗免疫接种的动物抗体的抗体与不溶载体偶联形成偶联于抗免疫接种的动物抗体的抗体上的不溶载体,把偶联产物与杂交瘤的培养基中的单克隆抗体反应,然后与适当量的20khGH反应,并利用免疫测定检测已经与杂交瘤培养基中的单克隆抗体反应的20k hGH以选择出产生与20k hGH强烈反应的抗体的杂交瘤细胞,由于具有利用上面免疫测定的筛选过程相当的效果,这也在本发明范围之内。
通过用常规的细胞培养或腹水形成技术培养杂交瘤细胞并从得到的培养上清液或腹水中纯化单克隆抗体,从而用由此得到的杂交瘤细胞制备本发明所需要的单克隆抗体。
可采用常规的方法从培养上清液或腹水中纯化单克隆抗体;例如,硫酸铵分级分离,凝胶过滤,离子交换层析,亲和层析或任何合适的以上方法的组合。
利用一种单克隆抗体进行的本发明的20k hGH的免疫测定方法利用了该单克隆抗体;例如,酶免疫测定,放射免疫测定,荧光免疫测定和发光免疫测定,优选的是酶免度测定。优选的酶免疫测定就是所谓的“夹心”免疫测定,其中单克隆抗体与一个不溶载体偶联形成一个单克隆抗体偶联的不溶载体,它用于测定方法。
基于“夹心”免疫测定,叙述本发明的测定过程。
在步骤(1)中,本发明的单克隆抗体与一个不溶载体偶联形成一个单克隆抗体偶联的不溶载体,然后与含有人生长激素的测试溶液反应形成一种偶联产物,该产物中只有20k hGH与单克隆抗体偶联的不溶载体偶联。不溶载体可以包括微滴板,塑料珠,玻璃珠和磁性微颗粒。通过一个已知的化学偶联过程可以把单克隆抗体与这些不溶载体偶联,但可以用物理吸附适当地偶联。具体地说,把本发明的单克隆抗体溶解于象碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液中,在溶液中加入上面的不溶载体,在0℃到室温保留混合物至少一小时,然后用如Tris-Hcl缓冲液与含有吐温20(聚氧化乙烯-三梨醇-单月桂酸酯)和叠氮化钠的磷酸盐缓冲液洗涤该混合物以除去未偶联的抗体。然后,把所得到的单克隆抗体偶联的不溶载体与含有人生长激素的测试溶液反应以便与测试溶液中的20k hGH偶联。
在步骤(2)中,将步骤(1)中制备的偶联产物与酶标记的抗-hGH抗体(称为“抗-hGH酶-标记抗体”)反应,在单克隆抗体偶联的不溶载体上形成本发明的抗-20k hGH-单克隆抗体-20k hGH-抗-hGH酶标记抗体的“夹心”复合物。
用于抗-hGH酶标记抗体的抗-hGH抗体可以是仅与20k hGH反应并识别不被上面20k hGH单克隆抗体识别的表位的一种抗体,或者是与20k hGH和22k hGH都反应的抗体,同样可以是单克隆或多克隆的。特别是,一个优选的抗-hGH抗体可以是一个由亲和层析纯化的抗-hGH兔多克隆抗体;具体地说,F(ab’)2片段和Fab’片段是符合需要的。
标记酶包括辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。
通过已知的方法如用高碘酸氧化酶的糖链形成随后与如抗-hGH抗体的一个氨基酸偶联的醛基,可以用任何这些酶将抗-hGH抗体或该抗体的F(ab’)2片段或Fab’片段进行标记;在酶中引入一个适当的基团象顺丁烯二酰亚胺基团和硫化吡啶基团并把引入的基团与抗-hGH抗体的Fab’片段中的巯基基团偶联。
在步骤(3)中,对在步骤(2)中制备的“夹心”复合物的酶活性进行定量测定。由于酶活性依赖于最初已经反应的20k hGH的量,所以只有测试溶液中的20k hGH可以被定量测定。通过加入如酶底物的物质可以确定酶活性。也可以利用抗-hGH生物素标记抗体代替抗-hGH酶标记抗体在单克隆抗体偶联不溶载体上形成本发明的抗-20k hGH单克隆抗体20k hGH-抗-hGH生物素标记抗体的“夹心”复合物,把复合物与酶标记抗生物素蛋白或酶标记的链霉抗生物素蛋白反应,形成本发明的抗-20k hGH单克隆抗体-20k hGH-抗-hGH生物素标记抗体-酶标记抗生物素蛋白或酶标记链霉抗生物素蛋白的“夹心”复合物,然后确定“夹心”复合物中的酶活性来确定其活性。
在上面的“夹心”免疫测定中,当然可以将本发明的抗-20k hGH单克隆抗体和抗-hGH酶标记抗体的顺序替换来确定活性。由于这样的程序具有与上面“夹心”免疫测定相当的效果,它可以在本发明的范围内。
在本发明的免疫测定中,作为测定对照的样品可以包括人血液,人尿,以及这些已经进行了如稀释,纯化和pH调节的处理。
用于研制本发明的免疫测定的校正曲线的标准20k hGH可以是由基因重组技术制备的20k hGH。
上面本发明的免疫测定可以特异地确定20k hGH。本发明的免疫测定特别灵敏,最大测量灵敏度为0.001纳克/毫升。所以,本发明的免疫测定可以仅在它的人基线血液水平范围附近直接且精确地定量测定20k hGH。
实施例
通过下面的实施例将具体地解释本发明,但不以此限制本发明。
实施例1:抗-20k hGH单克隆抗体的制备
(1)免疫接种
用基因重组技术(JP-A 6-269292)制备的纯20k hGH作为抗原接种Balb/c小鼠(5周龄,雌性)总共免疫五次。在第一次免疫接种中,腹膜内注射给药100微克与完全弗氏佐剂(Difco)混合的20k hGH。然后,以两星期的间歇以50微克与不完全弗氏佐剂(Difco)混合的20k hGH给药三次。在最后的免疫接种中,在第4次免疫接种两星期后,在尾部静脉注射50微克的20k hGH的生理盐水溶液,再过三天之后,将免疫接种鼠的脾细胞用于细胞融合。
(2)用细胞融合技术制备产生抗体的杂交瘤细胞
以约5∶1到10∶1的比例将免疫接种脾细胞和鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8混合,然后,用50%(w/v)的聚乙二醇溶液(GIBCO,平均分子量:4000)作为融合催速剂以常规技术融合细胞。
以1×106细胞/毫升的脾细胞的水平,在包括含有20%的胎牛血清(GIBCO)和次黄嘌呤,氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)的IMDM培养基中悬浮融合细胞。把悬浮液的等分试样(0.1毫升)加入一个96孔的微滴板(Comi纳克)。在一个CO2温育箱中(37℃,5%CO2)培养融合细胞,以3-5天的间歇替换一半培养基。这样,有选择地培养了在HAT培养基中增殖的杂交瘤细胞。
(3)筛选
通过免疫测定筛选其中观察到集落的孔,确定在其上清液中是否含有抗20k hGH的抗体。在一个96孔的微滴板(Greiner)中加入溶于0.1M碳酸盐缓冲液中的抗-hGH兔多克隆抗体(10微克/毫升)的等分试样(50微升),然后在4℃保留过夜以待凝固。用洗液(含有0.02%叠氮化钠和0.05%吐温20的10mMTris-HCl缓冲液(pH:8.0))洗涤平板,然后在平板中加入封闭液1(含有0.5%牛血清白蛋白的PBS)的等分试样(100微升)进行封闭。在除去封闭液1后,在96孔的48个孔和另外48个孔中分别加入溶于封闭液1中的20k hGH(10纳克/毫升)的等分试样(50微升)和溶于封闭液1中的22k hGH(商标名:Genotropin;Sumitomo Pharm.)(10纳克/毫升)的等分试样(50微升),然后在室温振摇2小时。在用洗液洗涤平板后,在20k hGH孔和22k hGH孔中加入上面(2)的观察到集落的孔的上清液的等分试样(50微升),然后在室温振摇2小时。在洗涤之后,在孔中加入用封闭液1稀释500倍的碱性磷酸酶标记的抗-鼠Igs抗体(DAKO)的等分试样(100微升),然后在室温振摇2小时。在用洗液洗涤之后,在孔中加入一个底物溶液(含有0.6%对-硝基苯磷酸和0.5mM氯化镁的9.6%二乙醇铵缓冲液(pH9.6))的等分试样(50微升),然后在室温振摇30分钟。在反应溶液中,加入3N氢氧化钠的等分试样(50微升)淬灭反应,用免疫读数器(Nippon Intermed)测定405纳米处的吸光值,以便筛选与20k hGH比与22k hGH反应更强烈的集落用于克隆。
(4)杂交瘤的克隆
通过有限的稀释将产生与20k hGH比与22k hGH反应更强烈的抗体的杂交瘤细胞克隆三次,以便提供一个杂交瘤MTC6A菌株,它产生与20k hGH特异反应而与22k hGH基本上不反应的抗体。根据微生物寄存的布达佩斯条约,MTC6A菌株已经于1996年5月30日保藏于1-1-1,Higashi,Tsukuba,Ibaragi,日本,国际贸易和工业部的工业科学和技术机构的国家生物科学和人类技术研究所,保藏号为FERM BP-5913。
(5)确定杂交瘤产生的单克隆抗体的亚类
用一个确定鼠单克隆抗体同型的测试纸(ISO Strip;Berli纳克er Mannheim)确定所获得的杂交瘤MTC6A菌株产生的抗-20k hGH单克隆抗体的亚类。MTC6A菌株生产的抗-20k hGH单克隆抗体的亚类:重链为IgG1,轻链为k。
(6)制备单克隆抗体
培养MTC6A菌株并增殖,对一个2周前已经用异十八烷处理的Balb/c小鼠腹膜接种1×107细胞。10到14天后,从鼠的腹腔中取出腹水。利用蛋白质A(BIO RAD),通过亲和层析纯化收集的腹水得到MTC6A单克隆抗体,即本发明的20k hGH单克隆抗体。
参考实施例1:制备抗-hGH兔多克隆抗体和抗-hGH标记抗体
(1)免疫接种
首先,把100微克基因重组(JP-A 6-269292)制备的纯20k hGH与完全弗氏佐剂(Difco)混合并在兔子背部的几个点以混合物给药免疫接种。然后,以同样的方法,2星期的间隔,总共重复免疫接种该动物5次。
(2)纯化抗血清
对从上面(1)中免疫接种的兔子中得到的兔抗血清进行硫酸钠分级分离(18%饱和度),并使之通过用17.5mM磷酸缓冲液(pH6.3)平衡过的DEAE-纤维素(DE-52;Whattman)。收集不吸附馏份得到一个抗-hGH兔多克隆抗体IgG馏份。
(3)制备抗-hGH标记抗体
用0.1M的含有0.1M氯化钠的柠檬酸缓冲液(pH4.5)将上面(2)中得到的抗-hGH兔多克隆抗体IgG馏份透析,用1N盐酸调节pH到3.7,在抗-hGH兔多克隆抗体IgG馏份中加入3%胃蛋白酶,在37℃消化3.5小时。通过用1M Tris溶液调节pH到7.5-8.0淬灭反应。用含有2mM四乙酸乙二铵二钠和0.1M氯化钠的0.05M的磷酸缓冲液(pH6.5)平衡过的S-200SF柱(Pharmacia)凝胶过滤混合物,收集对应于一个起始洗脱峰的馏份。
在收集馏份中加入1/50量的0.2M的2-巯基乙胺溶液,并在37℃反应混合物90分钟。然后,用含有2mM四乙酸乙二铵二钠和0.1M的氯化钠的0.05M磷酸缓冲液(pH6.5)平衡过的Sephadex G-25柱(Pharmacia)凝胶过滤该混合物,收集对应于一个起始洗脱峰的馏份(Fab’馏份)。
独立地,把5mg辣根起源的过氧化物酶(TOYOBO Co.,Ltd.;称为“POD”溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中。在混合物中加入溶于50微升二甲基甲酰铵中的4.0mg N-琥珀酰亚铵-4-(马来酰亚铵甲基)-环己烷-1-羧酸盐,并在30℃保留混合物60分钟。用含有2mM四乙酸乙二铵二钠和0.1M的氯化钠的0.05M磷酸缓冲液(pH6.5)平衡过的Sephadex G-25柱(Pharmacia)凝胶过滤混合物,收集对应于一个起始洗脱峰的馏份(偶联二硫代吡啶基的POD馏份)。
在上面Fab’馏份中加入等摩尔量的偶联硫代吡啶基POD馏份,在4℃保留混合物过夜。用含有0.1M氯化钠的0.1M磷酸缓冲液(pH6.5)平衡过的S-200SF柱凝胶过滤混合物,收集对应于一个起始洗脱峰的馏份(POD-标记的抗-hGH Fab’馏份)。把牛血清白蛋白作为稳定剂以0.1%的水平处理该馏份,在4℃储存直到使用。
实施例2:MTC6A单克隆抗体的抗原特异性
用免疫测定方法评估按照实施例1得到的MTC6A单克隆抗体的抗原特异性。所用的抗原是基因重组(JP-A 6-269292)生产的纯化20k hGH,和其类似肽激素物,人催乳素(称为“hPRL”;UCB BIOPRODUCTS)和人纤毛体马莫调理素(称为“hCS”;CHEMICON)。在一个96孔微滴板(Greiner)上以适当的浓度(0到5000纳克/毫升)固化每种抗原,然后与MTC6A单克隆抗体的溶液反应以进行估计。结果是,本发明的MTC6A单克隆抗体与hPRL或hCS,hGH的类似肽激素不反应。结果概括在表1。
表1:MTC6A单克隆抗体的抗原特异性
抗原 |
反应性 |
20k hGH |
+ |
hPRL |
- |
hCS |
- |
+:反应
-:不反应
实施例3:在“夹心”免疫测定中MTC6A单克隆抗体
与20k hGH和22k hGH的反应性
对按照实施例1得到的MTC6A单克隆抗体与20k hGH和22k hGH的反应性进行评估。用PBS稀释MTC6A单克隆抗体到10微克/毫升,在一个96孔的微滴板(Greiner)中加入该溶液的等分试样(50微升),在4℃保留微滴板过夜。用洗液(含有0.05%吐温20的10mM Tris-HCl缓冲液(pH:8.0))洗涤平板,并用封闭液2(4倍稀释的溶于PBS中的Block Ace(Yukijirushi))进行封闭。除去封闭液2后,在96孔的48个孔和另外48个孔中分别加入溶于封闭液2中的适当浓度(0-2纳克/毫升)的20k hGH的等分试样(100微升)和溶于封闭液2中的适当浓度(0-30纳克/毫升)的22k hGH(Genotropin;SumitomoPharm.)的等分试样(100微升),然后在室温振摇2小时。在用上面提到的洗液洗涤平板后,在孔中加入在抗体稀释剂(在PBS中稀释10倍的BlockAce(Yukijirushi))中稀释500倍的参考实施例1的POD标记的抗-hGH抗体Fab’馏份的等分式样(100微升),然后在室温振摇微板2小时。在洗涤后,在孔中加入底物溶液(含有65微克/毫升四甲基联苯胺的0.04%的过氧化氢)的等分试样(50微升),在室温振摇平板30分钟。在反应溶液中,加入1N硫酸的等分试样(50微升)淬灭反应,并用免疫读数器(Nippon Intermed)测定450纳米的吸光值。结果表示在图1。MTC6A单克隆抗体与即使在高于普通血液水平的30纳克/毫升的22k hGH也不反应,但与20k hGH即使在10pg/毫升时也进行反应。所以,估计它的交叉反应性可能是0.03%。
实施例4:用MTC6A单克隆抗体确定人血液中20k hGH
用MTC6A单克隆抗体确定人血液中的20k hGH。用PBS稀释MTC6A单克隆抗体到10微克/毫升,在一个96孔的微滴板(Greiner)中加入该稀释液的等分试样(50微升),在4℃保留平板过夜。在用洗液(含有0.05%吐温20的10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0))洗涤平板后,用封闭液2(用PBS稀释4倍的Block Ace(Yukijirushi))进行封闭。除去封闭液2后,在平板中加入通过将人血清与封闭液2或含有500或1000pg标准20k hGH的封闭液2以9∶1的比例混合制备的一种测试液的等分式样(100微升),在室温振摇平板2小时。在用洗液洗涤后,在平板中加入用抗体稀释剂(用PBS稀释10倍的BlockAce(Yukijirushi)稀释500倍的参考实施例1的POD标记抗-hGH抗体Fab’部分的稀释液的等分试样(100微升),然后在室温振摇微滴板2小时。洗涤之后,在平板中加入底物溶液(含有0.67mg/毫升1,2-苯二铵(DAKO)的0.1%柠檬酸-磷酸缓冲液(pH5.0)的等分式样(100微升),在室温振摇平板30分钟。在反应溶液中,加入1N硫酸的等分试样(100微升)淬灭反应,用免疫读数器(Nippon Intermed)测定490纳米的吸光值,与校正曲线比较确定20k hGH的水平。标准曲线已经通过利用封闭液2稀释的标准20k hGH代替上面的测试液如上所述进行测定得到。表2显示了测定中校正曲线和变异系数的值,表3显示了测试液的测定值和所加的20k hGH的回收率。
表2:20k hGH的校正曲线
20k hGH(pg/毫升) |
0 10 100 500 1000 |
平均测定值(A490) |
0.048 0.080 0.379 1.804 3.100 |
变化系数(%) |
7.4 6.5 4.9 4.1 11.1 |
表3:加入的20khGH的回收率
|
加入的20k hGH的量 |
0pg/毫升 |
50pg/毫升 |
100pg/毫升 |
血清1A490计算值回收率 |
0.484129pg/毫升100% |
0.663177pg/毫升96% |
0.804217pg/毫升88% |
血清2A490计算值回收率 |
1.522421pg/毫升100% |
1.681466pg/毫升90% |
1.856516pg/毫升95% |
血清3A390计算值回收率 |
1.285353pg/毫升100% |
1.457402pg/毫升98% |
1.649457pg/毫升104% |