CN100497393C - 用结合脑钠尿肽前体分子氨基酸41-46的单克隆抗体检测脑钠尿肽前体分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合天然脑钠尿肽前体分子(proBNP)的抗体、天然proBNP的特异性检测方法、确定天然proBNP水平与心力衰竭诊断之间相关性的方法、天然proBNP的检测试剂盒以及产生抗天然proBNP抗体的杂交瘤细胞系。

Description

用结合脑钠尿肽前体分子氨基酸41-46的单克隆抗体检测脑钠尿肽前体分子的方法
本发明涉及特异性结合总脑钠尿肽前体分子(proBNP)亚群即天然proBNP的抗体、天然proBNP的特异性检测方法、确定天然proBNP水平与心力衰竭诊断之间相关性的方法、天然proBNP的检测试剂盒以及产生抗天然proBNP抗体的杂交瘤细胞系。
心力衰竭是一个普遍现象，在西方世界尤其如此。按照Roche医学词典(Urban & Schwarzenberg，1993)，心力衰竭是在运动时或者甚至在休息时心脏无法急性或慢性地产生代谢所必需的血流，或者不能保证静脉回流(不能回流和流出)。因此削弱了心脏的泵功能。心力衰竭的原因非常复杂。其中，在此要提到的是心肌的炎性变化和变性性变化、冠状动脉灌注障碍、冠状动脉梗塞和损伤。这导致外周血流发生改变、呼吸系统障碍、肾功能障碍和电解质代谢障碍(水肿)，降低骨骼肌系统的效率。
按照纽约心脏协会(New York Heart Association，NYHA)，可在活动后，用物理实验将心力衰竭分为下列NYHA级别：I级，是指在正常体力活动后完全没有疼痛；II级，是指体力活动受到轻微限制；III级，是指体力活动受到严重限制；IV级，是指在任何体力活动都可能加重不适症状，甚至在大多数休息时间中也有不适症状。
对于使用糖苷类药、血管扩张药、ACE抑制剂和/或β-阻滞剂对心力衰竭进行有效药物治疗来说，首先，必须准确无误地鉴定和诊断出心力衰竭，有可能的话，按照严重程度将其分类，外加监控治疗过程。
在本领域，已经研究了一些血清标记作为心力衰竭早期诊断的标记候选者，例如ANP(心房钠尿肽激素)和proANP、CNP(C-钠尿肽)、肾上腺髓质素、神经肽Y、内皮缩血管肽和BNP(脑钠尿肽)。ANP和proANP在理论上均代表诊断心力衰竭的合适标记；然而，在实践上，它们不很稳定，或者在血液中仅具有短的半寿期，这些对常规诊断性测定来说是严重缺陷(Buckley，M.G.等，Clin.Sci.95(1998)235-239；Cleland，J.G.等，Heart 75(1996)410-413)。
通常引用和有意义的标记是BNP(脑钠尿肽)。最初BNP是在猪脑中被鉴定出来的。BNP是在结构和功能上均类似于ANP(心房钠尿肽)的一种心脏激素(Sudoh，T.等，Nature 332(1988)78-81)。人BNP由32个氨基酸组成，主要由心室分泌并在人体血浆中循环。使用BNP作为诊断标记，是从例如EP-A-0 542 255中得知的。BNP具有分子内二硫桥且是一种不很稳定的分析物。推测这是由于其生理功能是作为激素，所以它必须很快被分解。因此，用它作为诊断标记，在样品采集和操作过程中必须小心和特别注意(Masuta，C.等，Clin.Chem.44(1998)130；Tsuji，T.等，Clin.Chem.40(1994)672-673)。
BNP的前体分子，即proBNP，是由108个氨基酸组成。proBNP被切割成上述32个C-端氨基酸(77-108)(称为BNP)和N-端氨基酸1-76(称为N-端proBNP(或NT-proBNP))。BNP、N-端proBNP(1-76)以及其它分解产物(Hunt，P.J.，等，Biochem.Biophys.Res.Com.214(1995)1175-1183)均在血液中循环。还没有完全弄清楚是否完整前体分子(proBNP 1-108)也存在于血浆中。然而，有报道表明(Hunt，P.J.等，Peptides，第18卷，第10期(1997)，1475-1481)，在血浆中可检测到低量释放的proBNP(1-108)，但是因为在N-端非常快速的部分分解，所以一些氨基酸会不存在。
正如本领域所知的，N-端proBNP(1-76)被认为是心力衰竭的标记之一。
WO 93/24531(US 5,786,163)公开了N-端proBNP的免疫学鉴定方法以及用于该方法的抗体。在WO 93/24531中，制备了针对一种来自N-端proBNP的肽的多克隆抗体。已经表明，在竞争性试验中，所产生的抗体能结合免疫肽(氨基酸47-64)。
在WO 93/24531中所进行的竞争性试验中，标记形式的肽47-64作为示踪物，与样品中的proBNP或者未标记的肽标准品47-64竞争性结合来自兔血清的多克隆抗体。孵育48小时后，仅达到中等竞争，结果是检出下限约为250fmol/ml。在自动化实验室中，对于常规样品检验来说，该竞争性试验的长时间孵育是不可接受的。
Hunt，P.J.等，Clinical Endocrinology 47(1997)287-296，也介绍了用于检测N-端proBNP的竞争性试验。在该项测定中，在进行测定之前，需要对血浆样品进行复杂的提取；这可能导致分析物的破坏和测定误差。所用的抗血清是按照WO 93/24531的方法，通过用合成肽进行免疫而类似地生产的。Hunt等通过用N-端proBNP氨基酸1-13进行免疫，生产抗血清，并使用由氨基酸1-21所组成的肽作为标准品。对于该项试验，也需要长时间孵育。在孵育24小时后，达到的检出下限为1.3fmol/ml。
Ng，L.等在WO 00/35951中公开了用于诊断N-端proBNP的另一方法。该方法基于针对对应于人proBNP氨基酸65-76的合成肽所产生的抗体的应用。
Hughes，D.等，Clin.Sci.96(1999)373-380，报道了N-端proBNP的两种不同测定方法。在第一种测定方法中，使用由包含对应于proBNP氨基酸65-76的合成肽的免疫原所产生的多克隆抗体；而在第二种测定方法中，按类似方法产生多克隆抗体，但是对应于氨基酸37-49。按照Hughes，D等报告的数据，由proBNP氨基酸37-49相应肽所产生的并与之反应的抗体并不与完整的内源proBNP反应。根据这样的测定，无法区别患有左心室功能障碍的患者和正常对照。对于基于proBNP 65-76的测定来说，则可以清楚地区别同样的患者组。
Goetze，J.P.等，Clin.Chem.48(2002)1035-1042，介绍了用于N-端proBNP的最N-端氨基酸(1-21)的测定方法。该测定方法基于针对对应于相同的proBNP氨基酸(1-21)的合成肽所产生的多克隆抗体。
Goetze，J.P.等(参见上文)的测定方法需要完全消化样品及其中所包含的各种proBNP。据称，该测定方法也能有效降低非特异性结合。
Karl，J.等在WO 00/45176中首次公开，在夹心免疫测定中可以对N-端proBNP进行灵敏而快速地检测。在WO 00/45176中公开的优选表位介于N-端proBNP氨基酸10和50之间。
US 2003/0219734引用了这一事实：同一样品中可以存在来自proBNP(1-108)、BNP(77-108)以及N-端proBNP(1-76)的多种不同来源的BNP相关多肽。
Mair，J.等，Clin.Chem.Lab.Med.39(2001)571-588，已经总结了心钠尿肽测定对心力衰竭诊断和控制的影响。他们强调，目前市售的测定法未经标准化，即它们没有用通用标准进行标定。在一些测定法中，甚至需要提取血浆。因此，用来自不同生产商的检测试剂盒所获得的结果可能会有显著性差异。因此，来自临床研究的参考区间和决定限仅对于所用的具体测定法来说是有效的，但决不能外推到N-端proBNP的其它测定法中。
按照同一思路，Goetze，J.P.等(参见上文)和Mair，J.(Clin.Chem.48(2002)977-978)注意到，不同的N-端proBNP测定法之间的差异，无论是所得数值上还是其临床结论上，对于该标记候选者的广泛使用来说，都有重大问题。
显然，急需提供改进的N-端proBNP测定法，例如重复性更好、更标准化、更好表征或/和临床相关性更好的N-端proBNP测定法。
本发明的一个目的是开发一种更具特异性的检测方法，用于测定N-端proBNP和/或N-端proBNP临床相关片段或亚群。
如下所述的和如所附权利要求书要求保护的发明至少部分解决了本领域已知的一个或多个问题。
已经令人惊奇地发现，可以特异性检测循环中存在的所有proBNP类型(总proBNP)的一个亚群。该亚群称为天然N-端proBNP或者简称为“天然proBNP”。引人注目的是，天然proBNP亚群比起总proBNP来说具有更好的临床相关性。
在第一个实施方案中，本发明涉及特异性结合天然proBNP的分离的抗体。
本发明也涉及特异性检测天然proBNP的方法，所述方法包括下述步骤：在允许形成抗天然proBNP抗体-天然proBNP复合物的条件下，使怀疑或已知含有proBNP的样品与特异性结合天然proBNP的抗体接触，然后检测所形成的复合物。
本发明还公开了诊断心力衰竭的方法，所述方法包括检测天然proBNP并确定天然proBNP水平与心力衰竭之间的相关性。因此天然proBNP的这一相关值说明心力衰竭的存在与否或其状态。
本发明也涉及测定天然proBNP的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合天然proBNP的抗体和用于检测天然proBNP的辅助试剂。还要求保护分别由杂交瘤细胞系MAB 1.21.3所产生的单克隆抗体，所述细胞系产生抗天然proBNP的特异性单克隆抗体并且已经保藏于DSMZ。
我们在通向本发明的实验过程中，已经发现并确定人血中至少存在两个proBNP群体。其中一个proBNP群体看来在所有可用免疫学方法检测的proBNP分子中占大多数。该群体称为“总”proBNP。我们的研究已经表明，可概括为总proBNP的proBNP分子显然具有共同的中部核心结构，其范围从proBNP的约10位氨基酸至约66位氨基酸。优选通过本发明方法检测的总proBNP中包含氨基酸10-66。正如技术人员将会理解的，可通过免疫学方法，用竞争性测定或夹心测定来容易地检测出所述总proBNP。优选用夹心测定来检测总proBNP。所述夹心测定可设计成包括分别结合天然proBNP表位的C-端和N-端的抗体。然而，也可以例如使用能进行夹心测定并能与天然proBNP表位的N-端表位反应的抗体，来检测总proBNP。显而易见的是，在这样的总proBNP的竞争性测定或夹心测定中，不必使用抗天然proBNP的抗体。
术语“天然proBNP”，是指其上存在为MAB 1.21.3所识别的表位的任何proBNP分子。按照以下进一步证明的发现，该表位仅存在于所有proBNP分子的一个亚群(即“总”proBNP的一个亚群)上。我们发现并能确定，总proBNP的这一亚群称为“天然proBNP”，可用特异性结合配偶体、优选多克隆抗体和/或单克隆抗体进行检测。
称为天然proBNP的亚群必定不是均一的多肽片段。天然proBNP多肽的长度可变化。预期在用于天然proBNP的夹心免疫测定中鉴定的大多数分子代表N-端proBNP(1-76)或其片段。优选以适于测定包含氨基酸10-66的NT-proBNP片段的方式，建立天然proBNP的检测方法。天然proBNP的特性是存在为MAB 1.21.3所识别的天然proBNP表位。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合天然proBNP的抗体，其中所述特异性结合天然proBNP的抗体是这样的抗体：就患者样品中所测得的proBNP值而言，所述抗体与MAB 1.21.3的相关性为r-值至少r＝0.95或更高。
基于本发明的发现、公开内容和保藏物，技术人员将能够毫无疑问地评价抗体是特异性结合天然proBNP还是总proBNP。MAB1.21.3被认为是特异性结合天然proBNP的抗体的原型实例，而MAB18.4.34被认为是结合总proBNP的抗体的原型实例。任何proBNP的结合物，无论是什么，都可以分别评价其对天然proBNP或总proBNP的结合特异性。
“特异性结合”天然proBNP的抗体是这样的抗体：就患者样品中所测得的proBNP值而言，所述抗体与MAB 1.21.3的相关性为r-值至少r＝0.95或更高。用相关的临床样品，评价天然proBNP的结合特异性与MAB1.21.3结合特性的相关性。使用至少15个和至多25个血清样品，其天然proBNP中的NT-proBNP-水平为10ng/ml至150ng/ml。用 3000系统测定与proBNP的结合。确定测定值与用MAB 1.21.3所测得的天然proBNP值之间的相关性，通过线性回归分析进行统计学评价。优选运用MS-Excel拟合y＝ax+b型线性回归，求出相关系数r和斜率。甚至更优选所述抗体将检测出总proBNP中由MAB 1.21.3所结合的基本上相同的天然proBNP亚群，其中按照上述方法，对基本上相同亚群的结合得到的相关性为r＝0.98或更高。
可以认为，MAB 18.4.34是测定总proBNP的原型抗体。对于任何特异性结合天然proBNP的抗体(使用如上所述的相同样品和方法)来说，与MAB 18.4.34即与总proBNP的相关性通常比与MAB 1.21.3的相关性低。优选MAB 18.4.34与特异性结合proBNP的天然proBNP亚部分的抗体的相关性为r＝0.94或更低。甚至更优选该相关性为r＝0.9或更低，或者低到r＝0.8或更低。
当比较用所述方法比较所测得的绝对量时，总proBNP的检测方法当与MAB 1.21.3相比较时，总是得到约2-20倍，在大多数情况下约2-5倍的较高proBNP值。除了上述给定的相关性外，在以上方法比较中特异性结合天然proBNP的优选抗体的斜率也小于1.5。最优选斜率介于0.7和1.5之间。
优选所述特异性结合发生在结合亲和性最少为107L/mol时。对天然proBNP来说，特异性结合剂的亲和性更优选为108L/mol，或者甚至更优选为109L/mol。
如上所解释的，MAB 1.21.3的一个非常重要和优选特征是这一事实：该抗体仅结合典型临床样品中所包含的总proBNP的约5％和约50％之间的可变部分。
特异性结合天然proBNP的抗体的原型实例是由克隆MAB 1.21.3所产生的单克隆抗体，克隆MAB 1.21.3已保藏于DSMZ。MAB 1.21.3是绵羊单克隆抗体并且已按照实施例小节所述的方法来产生。通过使用对应于完全确定的proBNP序列的短合成肽，已经对由这些和其它抗体所识别的proBNP上的表位进行了鉴定、表征和作图。该方法是已知的并称为PepScan分析。
简而言之，已经合成了包含proBNP的8个连续氨基酸的69个合成肽，所述合成肽包含N-端半胱氨酸、间隔分子和生物素。每个这样的肽都从N-端至C-端向前步移1个氨基酸。因此，肽1包含氨基酸1-8，肽2包含氨基酸2-9，以此类推，肽69包含氨基酸69-76。
已经发现，MAB 1.21.3与肽35(氨基酸35-42)至42(氨基酸42-49)有明显反应，所述肽共同具有proBNP的42-46位氨基酸。因此，可推断MAB 1.21.3与基本上由proBNP氨基酸42-46所组成的表位发生反应。
正如技术人员将会理解的，表位的存在与否取决于三级结构、二级修饰、复合物的形成、可及性等。显然，MAB 1.21.3和抗天然proBNP的其它抗体在这一方面具有非常特殊的要求，并且不与典型样品中存在的大多数proBNP分子发生反应。因为短的合成PepScan肽不太可能具有三级结构或二级修饰，所以由MAB 1.21.3所识别的表位应该是未修饰的，因此认为术语“天然”是适合的。
当分别测定和比较临床样品(例如人血清)中所包含的合成proBNP(1-76)和proBNP时，基于抗天然proBNP抗体的测定和检测总proBNP的测定在反应强度上表现出显著性差异。使用合成proBNP(1-76)，可以容易地建立检测方法并标准化。使用这样的测定，测定或者在合成基质中或者补充天然样品(例如人血清)的合成proBNP(1-76)，在这两种测定中所测出的水平相同。然而，令人惊奇的是，当在这两种测定中测定天然样品(例如人血清)中所包含的proBNP时，发现了显著性差异。
分别使用与总proBNP反应的抗体(例如单克隆抗体MAB17.3.1、18.4.34或18.29.23)来进行测定，看来能检测出血清样品中存在的所有proBNP分子，即总proBNP。相比之下，基于与天然proBNP反应的抗体(例如MAB 1.21.3)仅检测到该总proBNP的一小部分。
本发明可以证明，总proBNP的天然proBNP亚群在临床上显示出与生物活性BNP非常好的相关性。当然，在测定BNP时，已经观察了对于取样和处理中获取准确BNP值的所有注意事项。对于天然proBNP的测定来说，无需特别注意的常规样品处理已证明是令人满意的。
用本发明建立的所有数据都清楚地表明，在本发明中鉴别的且与MAB 1.21.3特异性结合的表位是合适抗天然proBNP抗体的主要表位。显然，由MAB 1.21.3所识别的该天然proBNP表位可进行天然修饰或者可变成蛋白复合物的组成部分，所述修饰或复合改变了该表位，使得MAB 1.21.3在较低程度上结合或者完全不结合所述修饰的或复合的proBNP。携带所述修饰的“非天然”proBNP表位的proBNP仅在总proBNP测定中可明显检测到。
因为其内在的高度重现性，所以单克隆抗体是检测天然proBNP的优选工具。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及特异性结合天然proBNP的单克隆抗体。
正如技术人员将会理解的，可以发现其它单克隆抗体，所述抗体比起MAB 1.21.3来说在与PepScan肽39-42的反应性上可表现出微小差异。抗天然proBNP的单克隆抗体只要仅检测出总proBNP的一个亚群就没有偏离本发明的精神，其与总proBNP群体中所包含的并且为MAB1.21.3所结合的天然proBNP亚群的相关性为r-值至少r＝0.95或更高。所述相关性是用系统进行测定并如上所述进行统计学评价。甚至更优选所述单克隆抗体将检测出总proBNP中由MAB 1.21.3所结合的基本上相同的天然proBNP亚群，其中按照上述方法，对基本上相同亚群得到的相关性为r＝0.98或更高。
在一个优选的实施方案中，本发明也涉及一种制备单克隆抗体的方法，所述方法包括下述步骤：用proBNP免疫合适的非人类动物，优选小鼠、大鼠或绵羊，由此得到产生抗体的B细胞，将这些B细胞与合适的融合配偶体融合，然后对由如此获得的杂交瘤所产生的抗体对天然proBNP的反应性进行检验。优选仅选出这样的单克隆抗体并用于免疫测定：在合适的患者样品中所述单克隆抗体与MAB1.21.3的相关性为r-值至少0.95。如上所述对所述相关性进行评价。优选用合成proBNP或在原核宿主中产生的proBNP或者用至少包含proBNP氨基酸41-44的proBNP合成肽或其片段，进行免疫。其亲和力为109L/mol或更高的抗天然proBNP的绵羊单克隆抗体，代表本发明的一个优选实施方案。
现在，该MAB 1.21.3是可得到的，当然也可以制备、纯化和鉴定可用于特异性检测天然proBNP的多克隆抗体。例如，目前已经发现，可以制备、纯化抗天然proBNP的多克隆抗体(PAB)并且按照其与MAB 1.21.3的相关性进行表征。
正如技术人员将会理解的，有各种方式产生结合天然proBNP的PAB。显然，例如可以在不同的成功的免疫纯化途径中使用一种或多种合成肽作为免疫吸附剂。
抗天然proBNP的多克隆抗体只要仅检测出总proBNP的一个亚群就没有偏离本发明的精神，其与总proBNP群体中所包含的并且为MAB 1.21.3所结合的天然proBNP亚群的相关性为r-值至少r＝0.95或更高。所述相关性是用系统进行测定并如上所述进行统计学评价。甚至更优选所述多克隆抗体制备物将检测出总proBNP中为MAB 1.21.3所结合的基本上相同的天然proBNP亚群，其中按照上述方法，对基本上相同亚群的结合得到的相关性为r＝0.98或更高。
获取所述抗天然proBNP的PAB的一种方法是，用重组产生或合成产生的proBNP进行免疫，通过亲和纯化来纯化由此获得的天然proBNP的特异性抗体，如上所述通过患者样品对如此获得的多克隆抗体进行评价。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及产生多克隆抗体的方法，所述方法包括下述步骤：用proBNP免疫合适的非人类动物，由此得到多克隆抗体，然后对如此获得的抗体对天然proBNP的反应性进行检验。优选仅选出这样的多克隆抗体并用于免疫测定：在合适的患者样品中，所述多克隆抗体与MAB 1.21.3的相关性为r-值至少0.95。如上所述对所述相关性进行评价。
对于任何特异性结合天然proBNP的多克隆抗体(用相同样品和方法)来说，对MAB 18.4.34的相关性，即对总proBNP的相关性明显低于对MAB 1.21.3的相关性。因为多克隆抗体制备物通常含有不同特性的各种抗体，优选MAB 18.4.34与特异性结合总proBNP的天然proBNP亚部分的多克隆抗体的相关性为r＝0.94或更低。甚至更优选低至0.9或更低。优选特异性结合天然proBNP的多克隆抗体制备物与MAB 1.21.3的相关性为r＝0.98或更高，而与MAB 18.4.34的相关性为r＝0.94或更低，或者对于MAB 18.4.34的相关性甚至更优选为r＝0.9或更低。
优选使用合成proBNP或在原核宿主中产生的proBNP或者用至少包含proBNP氨基酸41-44的proBNP合成肽或其片段，来进行免疫，以获得抗天然proBNP的多克隆抗体。
在我们的实验过程中，已经在不同的夹心测定法中制备、分析和联合应用了大量不同的免疫学试剂并用于检测proBNP。这些不同的免疫学试剂的组合表明，大多数测定法显然都是对总proBNP进行测定。
已经发现，所研究的总proBNP测定法表现出对BNP的合理相关性，其与心力衰竭诊断的合理诊断准确性密切相关，参见例如Mair，J.参见上文。
然而，比起更好地分别区分NYHA 0级或I级患者和NYHAII级、III级或IV级患者之间的总proBNP的测定来说，现在建立了仅检测天然proBNP的测定法。这也导致对心力衰竭患者的改进的临床鉴别。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种特异性检测天然proBNP的方法，所述方法包括下述步骤：在允许形成抗天然proBNP抗体-天然proBNP复合物的条件下，使怀疑或已知含有proBNP的样品与特异性结合天然proBNP的抗体接触，然后检测所形成的复合物。优选所述特异性检测天然proBNP的方法用来区别NYHA 0级和I级与NYHA II级、III级或IV级。
“抗天然proBNP抗体-天然proBNP复合物”也简称为“抗体-天然proBNP复合物”。
术语“抗体”是指单克隆抗体或多克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或可通过基因工程获得的其它抗体，以及技术人员已知的所有抗体片段，例如F(ab′)2、Fab′或Fab片段。可以使用对天然proBNP具有合适特异性的其它结合剂，来替代抗体或抗体片段。但必须保证仅特异性结合天然proBNP，即类似于MAB 1.21.3。
正如技术人员所理解的，有许多方法使用特异性结合天然proBNP的抗体来检测天然proBNP，所有这些方法在相关教科书中都有详细介绍(参见例如Tijssen，P.，Practice and theory of enzymeimmunoassays 11(1990)Elsevier，Amsterdam或Diamandis等主编.(1996)Immunoassays，Academic Press，Boston)。
在本发明的正文中，已经通过
Figure C200480012494D0014122324QIETU
系统，分析了用于检测总proBNP或天然proBNP的许多试剂和试剂组合，其中的部分结果见各实施例小节。
在临床常规诊断中，通常使用基于不均一的免疫测定法。在本发明的一个优选实施方案中，天然proBNP的检测方法是竞争性免疫测定法。
甚至更优选的是依照夹心测定原理的免疫测定法，其中形成抗体-抗原-抗体复合物，也称为夹心法。
在本发明的一个优选实施方案中，天然proBNP的特异性检测方法是夹心免疫测定法，其中使用第一抗天然proBNP抗体和第二抗总proBNP抗体，并且其中所述第二抗proBNP抗体和第一抗天然proBNP抗体两者均在不同表位上结合天然proBNP，从而形成(第一)抗天然proBNP抗体-天然proBNP-(第二)抗proBNP抗体复合物。
正如技术人员将会理解的，也可以使用抗总proBNP抗体作为第一(捕获)抗体，而用抗天然proBNP抗体作为(示踪、检测或标记)第二抗体，建立检测天然proBNP的夹心测定法。
优选测定天然proBNP的所述夹心法包括下述步骤：
a)将样品与携带适于结合固相的基团的第一天然proBNP-特异性抗体进行混合，或者将样品与已经结合到固相上的第一天然proBNP-特异性抗体进行混合，
b)在形成第一抗体-天然proBNP-第二抗体复合物的条件下，将该溶液与抗总proBNP的第二抗体混合，所述第二抗体结合到天然proBNP表位除外的表位上，所述表位存在于天然proBNP和总proBNP上并且携带标记，
c)使所形成的免疫复合物结合到固相上，
d)将固相从液相中分离出来，
e)检测一相或两相中的标记。
在定量测定中，用确定量的天然proBNP作为标准品进行同样的测定，并且在样品测定之后进行步骤f)，即将标准测定值或标准曲线与样品测定值或曲线进行比较，外推天然proBNP的相应浓度。
对天然proBNP具有特异性的第一抗体可以直接与固相结合，或者通过特异性结合对系统间接结合。该抗体按照技术人员已知方法例如以吸附方式与固相直接结合。当结合是通过特异性结合对系统间接进行时，第一抗体是由抗天然proBNP抗体和特异性结合对系统的第一配偶体组成的缀合物。特异性结合对系统是指彼此能特异性结合的两个配偶体。这样的结合可以基于免疫结合或者基于交替的特异性结合。优选的组合分别是生物素和抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或抗生物素、半抗原和抗半抗原、抗体的Fc片段和抗该Fc片段的抗体或者糖和凝集素。优选生物素和抗生物素蛋白的组合或者生物素和链霉抗生物素蛋白的组合用作特异性结合对系统。
特异性结合对系统的第二配偶体包被在固相上。优选使用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。可以按照技术人员已知的标准方法，将特异性结合对系统的该配偶体结合到不溶性载体材料上。在此，共价结合以及吸附结合都是合适的。
由聚苯乙烯或类似塑料制成的固相试管或微量滴定板是合适的并且已用特异性结合对系统的第二配偶体进行包被。更合适的和特别优选的是颗粒状基质，例如乳胶颗粒、磁颗粒、分子筛材料和玻璃珠。也可使用纸或硝化纤维素作为载体。特别优选使用用如上所述的特异性结合对系统的第二配偶体包被的磁珠。当完成免疫反应且形成的免疫复合物结合到固相上后，可以通过例如过滤、离心或者如果是磁颗粒的情况下通过磁力，从液相中分离出这些微粒。然后，按照标准方法，检测与固相结合的标记物(或者检测残留在液相或两者中的标记物)。
与总proBNP结合的第二抗体结合天然proBNP表位除外的表位，所述表位存在于天然proBNP和总proBNP上。这两种抗体很可能同时结合天然proBNP分子上的这两种表位，因为在别的情况下则不能形成夹心复合物。
本发明的研究人员也鉴定出proBNP上的表位，所述表位非常适合于上述夹心测定。
已经产生了大量的单克隆抗体。可以确定，并非重组proBNP上鉴定的所有表位都同样适合于测定患者样品中的proBNP。
基本上分别由氨基酸13-16、27-31和64-67组成的并分别被MAB17.3.1、18.4.34和18.29.23所识别的三个表位，看来存在于绝大多数(N-端)proBNP分子上，即是总proBNP的表位。这些杂交瘤已于2003年7月5日保藏于DSMZ。由这些杂交瘤产生的抗体代表了测定总proBNP的理想工具。如果单独用于竞争性测定法或者相互或者与总proBNP反应的PAB联合用于夹心测定中时，可以容易地测定总proBNP。
已经依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，将本发明优选的杂交瘤细胞系MAB<NT-proBNP>1.21.3(＝MAK<NT-proBNP>1.21.3＝MAB 1.21.3)、MAB<NT-proBNP>17.3.1、MAB<NT-proBNP>18.4.34和MAB<NT-proBNP>18.29.23保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)，德国)：
 
细胞系 保藏号 保藏日
MAK<NT-proBNP>17.3.1 DSM ACC 2591 07.05.2003
MAK<NT-proBNP>18.4.34 DSM ACC 2592 07.05.2003
MAK<NT-proBNP>18.29.23 DSM ACC 2593 07.05.2003
MAK<NT-proBNP>1.21.3 DSM ACC 2650 27.04.2004
从所述细胞系获得的抗体是本发明的优选实施方案。
在检测天然proBNP时，优选在夹心测定中，联合使用如上所述的抗总proBNP单克隆抗体以及特异性结合天然proBNP的抗体。这样，所述夹心法得到的是仅对总proBNP的天然proBNP亚群的特异性检测结果。在用于测定天然proBNP的夹心法中，优选抗总proBNP的抗体是基本上分别结合氨基酸13-16、27-31和64-67的抗体。这些表位例如分别被MAB 17.3.1、18.4.34和18.29.23所识别。最优选使用结合氨基酸27-31的抗体，例如MAB 18.4.34，用于测定天然proBNP的夹心法中。
技术人员已知的所有生物液体都可用作天然proBNP体外特异性检测方法的样品。优选用于体外诊断的样品是体液，例如全血、血清、血浆、尿液或唾液。特别优选使用血清或血浆。
除了如上所述的用液相检测试剂的所谓湿测法之外，也可使用适于检测抗原、半抗原、肽、蛋白、抗体等的所有标准的干测法。这些干测法或例如描述于EP-A-0 186 799的测试条将除待测样品之外的所有试验成分都结合在一个载体上。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种诊断心力衰竭的方法，所述方法包括检测天然proBNP并确定天然proBNP水平与心力衰竭存在之间的相关性。正如技术人员将会理解的，天然proBNP水平也可用于判断心力衰竭不存在或其严重程度。
也优选在心力衰竭患者的随访以及在治疗监控中使用天然proBNP的判断标准。
另一个优选的实施方案涉及一种测定天然proBNP的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合天然proBNP的抗体和用于检测天然proBNP的辅助试剂。
下面提供实施例、参考文献、序列表和附图，以帮助理解本发明和所附权利要求书中给出的实质保护范围。人们知道，在不偏离本发明的精神的情况下，可以对所提出的方案进行修改。
附图说明
图1：MAB 1.21.3的表位鉴定
通过使用69个不同的得自proBNP(1-76)序列的生物素化8聚体肽，分析了MAB 1.21.3的反应性概况，每个肽都向前步移1个氨基酸，因而覆盖了proBNP(1-76)的全部序列。给出消光值，单位为mE。观察到对肽39-42的强反应性。
图2：Biacore分析中使用的仪器设置
用该图中给出的分析仪的操作方式，评价了不同的抗proBNP抗体对天然proBNP的特异性。
图3-7：MAB 1.21.3与不同单克隆抗proBNP抗体和多克隆抗proBNP抗体的相关性
在夹心测定中，使用Biacore 3000分析仪，分析了proBNP浓度约为10mg/ml和以上(通过使用MAB 1.21.3进行测定并使用合成proBNP作为标定物)的20份人血清。用MAB 1.21.3所测得的数值在X轴上给出。用所述方法比较使用的抗体所测得的相应数值在Y轴上给出。MAB 1.21.3与MAB 18.4.34、MAB 18.29.23、PAB 30-38、PAB 44-51和PAB 41-46的相关性分别见图3、4、5、6和7。
实施例1
重组N-端proBNP(1-76)的制备方法
1.重组N-端proBNP的克隆
通过基因合成，制备N-端proBNP(氨基酸序列1-76)的核苷酸序列。为了让该基因在大肠杆菌(E.coli)中获得最佳表达，使其DNA序列适于大肠杆菌中最频繁使用的密码子。用于制备该基因的寡核苷酸序列如下：
Pro5‘(SEQ ID NO：1)：
5‘CCGGATCCCACCCGCTG3‘
Prolhum(SEQ ID NO：2)：
5‘CGGGATCCCACCCGCTGGGTTCCCCGGGTTCCGCTTCCGACCTGGAAAC
CTCCGGTCTGCAGGAACAGCGTAACCACCT3‘
Pro2hum(SEQ ID NO：3)：
5‘CGGTTCCAGGGAGGTCTGTTCAACCTGCAGTTCGGACAGTTTACCCTGCA
GGTGGTTACGCTGTTCCTGC3‘
Pro3hum(SEQ ID NO：4)：
5‘CAGACCTCCCTGGAACCGCTGCAGGAATCCCCGCGTCCGACCGGTGTTT
GGAAATCCCGTGAAGTTGCTAC3‘
Pro4hum(SEQ ID NO：5)：
5‘CCCAAGCTTAACGCGGAGCACGCAGGGTGTACAGAACCATTTTACGGTG
ACCACGGATACCTTCGGTAGCAACTTCACGGGATTTCC3‘
Pro3‘(SEQ ID NO：6)：
5‘CCCAAGCTTAACGCGGAGC3‘
使用这些引物，通过PCR(聚合酶链式反应)，进行基因的制备。将扩增的基因克隆到合适的载体例如载体pUC19中，然后测序。对于在表达载体pQE8中克隆的基因来说，通过限制切割位点BamHi和Hind III，将所述基因从载体pUC19上切割下来，然后以允许表达具有N-端组氨酸-标记的蛋白的方式连接到载体pQE8上，然后转化大肠杆菌M15[pREP4]。
2.N-端proBNP在大肠杆菌中的表达
为了在大肠杆菌中表达所述基因，重组大肠杆菌克隆的过夜培养物在Luria肉汤(含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)中转染1/60并在OD550为1时用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷；1mM终浓度)诱导。诱导后，培养物于37℃再培养4小时。然后将培养物离心，将细胞沉淀收集在50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)；300mM NaCl中。通过超声消化细胞悬液后，将悬液离心，上清液上样到Ni-NTA(次氮基三乙酸)柱。用50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)；300mM NaCl；20mM咪唑进行洗涤后，用50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)；300mM NaCl；300mM咪唑洗脱组氨酸-标记的N-端proBNP。收集洗脱流分，对50mM Tris pH8.0进行透析。为了分离杂质，将透析液上样到Q-琼脂糖凝胶柱。纯化的N-端proBNP质量通过MALDI-TOF进行测定。发现该制备物(＝重组proBNP)含有proBNP 1-76和proBNP 1-66，后者很可能代表降解产物。
实施例2
NTproBNP(1-76)酰胺的合成
通过最佳化固相肽合成方案(Merrifield(1962)Fed.Proc.Fed.Amer.Soc Exp.Biol.21，412)，在ABI 433肽合成仪上，合成NTproBNP(1-76)酰胺(swissprot：检索号P16860；氨基酸27至氨基酸134)。简而言之，该肽在Rink-Linker修饰的聚苯乙烯固相上，通过重复缀合8倍过量的氨基酸而装配，所述氨基酸每个都被暂时的哌啶不稳定性Fmoc-基团和永久的酸不稳定性tBu-、BOC-、OtBu-、Trt-或Pmc-基团保护，这取决于侧链功能。为了获取氧化稳定性材料，10位甲硫氨酸被等价正亮氨酸交换。此外，为了抵抗蛋白酶降解，其C端通过使用Rink linkage而酰胺化。装配后，从固相上取下完全保护的肽，通过用三氟乙酸与合适的阳离子清除剂的混合物进行处理，释放永久保护基，最后通过制备型反相HPLC纯化分离所述肽。3次125μmol规模的合成分别得到16.0mg、17.1mg和18.0mg RP-HPLC单峰纯物质(冻干物)。其身份用MALDI质谱和ESI质谱证明[8439.4]。
实施例3
抗总proBNP或抗天然proBNP的单克隆抗体各自的制备和筛选
1.获取抗N-端proBNP的单克隆抗体
用100μg N-端proBNP抗原以及完全弗氏佐剂，腹膜内免疫Balb/c小鼠(8-12周龄)。分别使用重组的以及通过肽合成而制备的proBNP(1-76)作为免疫小鼠的抗原。6周后，再进行3次免疫，其间隔为4周。最后一次免疫后1周采血，测定试验动物血清中的抗体效价。从阳性反应小鼠的脾脏中，获取B淋巴细胞，与永久性骨髓瘤细胞系融合。按照众所周知的
Figure C200480012494D0021122627QIETU
和Millstein(Nature 256，1975，第495-497页)的方法进行融合。用常规方法例如通过市售的细胞分选仪或者通过“有限稀释”，克隆阳性杂交瘤的原代培养物。
为了产生腹水，给Balb/c小鼠腹膜内注射5 x 106个杂交瘤细胞，所述小鼠之前已经用0.5ml Pristan处理过1-2次。2-3周后，可从小鼠腹部获取腹水。可按常规方法从中分离抗体。
2.分别抗proBNP肽、合成proBNP和人血清中的proBNP的单克隆 抗体的筛选试验
为了鉴别杂交瘤细胞培养上清液中抗proBNP抗体的存在，按照三次筛选测定方式，评价上清液。
a)对合成N-端proBNP的反应性
在室温下，在搅拌时使微量滴定板(Nunc，Maxisorb)与2.5μg/ml合成NT-proBNP(作为抗原)在100μl/孔荷载缓冲液(包被缓冲液，产品目录号0726559，Scil Diagnostics，GmbH)中结合1小时。荷载后处理在PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，Oxid，Code-BR 14a)和1％ Byco C中进行30分钟。随后，用洗涤缓冲液(0.9M氯化钠溶液，0.05％吐温20)进行洗涤。在室温下，在搅拌时将100μl/孔抗体样品孵育1小时。用洗涤溶液再洗涤2次。然后在室温下，在搅拌时再与100mU/ml、100μl/孔检测抗体PAB<M-Fcy>山羊-F(ab′)2-过氧化物酶缀合物(Chemicon，产品目录号AQ127P)孵育1小时。用洗涤缓冲液再次洗涤后，用常规方法测定过氧化物酶活性(例如用，室温30分钟，用ELISA读板器读取405nm的消光值的变化，单位为mU)。
b)使用合成肽进行表位表征供表位分析用
为了进行表位分析，将荷载链霉抗生物素蛋白的微量滴定板与来自proBNP序列(1-76)的肽-生物素缀合物一起孵育。应用69个8聚体肽来扫描完整proBNP序列，所述69个8聚体肽通过每个序列向前步移1个氨基酸而获得，即分别为1-8，2-9，3-10，4-11......66-73，67-74，68-75和69-76。已经测试了另外的生物素化序列，分别包含1-10、8-18、1-21、16-30、30-38、32-43、39-50、47-57、50-63、62-70和64-76位的氨基酸。已经将各个抗原肽溶于PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，Oxid，Code-BR14a)和0.5％ Byco C中至250ng/ml。为了进行肽包被，将每种溶液各100μl分配给微量滴定板的不同孔，然后在室温下温和搅拌1小时。然后，用洗涤缓冲液(0.9M氯化钠溶液，0.05％吐温20)进行洗涤。如上a)所述进行抗体样品孵育和检测反应。因为它们与某些NT-proBNP肽有反应性，所以可以描绘出单克隆抗体或多克隆抗体所识别的表位的位置。
PepScan的一个实例如图1所示。由杂交瘤1.21.3分泌的单克隆抗体与肽39-42的反应很强烈。这对应于由proBNP氨基酸41-46(SEQID NO：11)所组成的共享表位。
c)与患者样品中proBNP的反应性
在室温下，在搅拌时微量滴定板(Nunc，Maxisorb)各孔用100μl/孔含5μg/ml PAB<人proBNP>S-IgG(IS，(1-21)或(30-38)S-IgG的荷载缓冲液(包被缓冲液，产品目录号0726 559，Scil Diagnostics，GmbH)包被1小时。荷载后处理在PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，Oxid，Code-BR14a)和1％ Byco C中进行30分钟。然后，用洗涤缓冲液(0.9M氯化钠溶液，0.05％吐温20)进行洗涤。在室温下，在搅拌时与100μl/孔用PBS缓冲液稀释的患者血浆中的天然抗原一起孵育。再次洗涤后，在室温下，在搅拌时与100μl/孔杂交瘤上清液孵育1小时。然后用洗涤溶液再洗涤2次，在室温下，在搅拌时与100mU/ml、100μl/孔的检测抗体PAB<M-Fcy>山羊-F(ab′)2-过氧化物酶缀合物(Chemicon，产品目录号AQ127P)再孵育1小时。用洗涤缓冲液再次洗涤后，用常规方法测定过氧化物酶活性(例如用室温30分钟，用ELISA读板器读取405nm的消光值的变化，单位为mU)。
仅与合成产生的N-端proBNP或与人血清中的proBNP有阳性反应的杂交瘤培养物进行进一步处理。
实施例4
抗proBNP的绵羊单克隆抗体的制备
1.获取抗N-端proBNP的绵羊单克隆抗体
用重组N-端proBNP以及完全弗氏佐剂免疫绵羊。剂量为每只动物0.1mg。在10个月内，按4周的间隔重复免疫。第一次免疫后6周和其后每月一次，获取血清样品，测定其敏感性和效价。
从免疫绵羊淋巴结获取淋巴细胞供融合用。因此，在取出淋巴结前3天，用重组N-端proBNP进行最后一次加强注射，而且是直接注射到绵羊腹股沟淋巴结中。
通过手术取出淋巴结后，在无菌条件下制备并分离出淋巴细胞。将一个淋巴结的约2 x 109细胞在液氮中贮藏，其密度为1 x 108细胞/小瓶。
为了进行融合，将一小瓶1 x 108冷冻淋巴结淋巴细胞解冻，然后与黄嘌呤胸苷敏感型骨髓瘤/杂种骨髓瘤细胞(小鼠NS1x绵羊淋巴细胞，克隆1C10，Bioventix，Inc.)按2:1的比例和融合剂聚乙二醇(PEG)进行混合。
给几个96孔板接种，每孔1-3 x 104细胞(或杂种骨髓瘤)，然后在选择性培养基中进行培养。8-10天后，通过ELISA测定检查并筛选与N-端proBNP有反应性的杂交瘤细胞。
阳性杂交瘤的原代培养物用常规方法通过市售的细胞分选仪或者通过“有限稀释”进行克隆。
2.分别抗proBNP肽、合成proBNP和人血清中的DroBNP的单克隆 抗体的筛选试验
为了鉴别杂交瘤细胞培养上清液中抗proBNP抗体的存在，按照三次筛选测定方式，评价上清液。
a)对合成N-端proBNP的反应性
在室温下，在搅拌时微量滴定板(Nunc，Maxisorb)用100μl/孔含2.5μg/ml合成NT-proBNP(作为抗原)的荷载缓冲液(包被缓冲液，产品目录号0726 559，Scil Diagnostics，GmbH)包被1小时。荷载后处理在PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，Oxid，Code-BR 14a)和1％ Byco C中中进行30分钟。随后，用洗涤缓冲液(0.9M氯化钠溶液，0.05％吐温20)进行洗涤。在室温下，在搅拌时将100μl/孔抗体样品孵育1小时。然后用洗涤溶液再洗涤2次。然后在室温下，在搅拌时再与100μl/孔按1:40000用PBS缓冲液稀释的检测抗体过氧化物酶缀合的AffiniPure驴抗绵羊IgG(Dianova，代码713-035-147)孵育1小时。用洗涤缓冲液再次洗涤后，用常规方法测定过氧化物酶活性(例如用
Figure C200480012494D0025122834QIETU
，室温30分钟，用ELISA读板器读取405nm的消光值的变化，单位为mU)。
b)使用合成肽进行表位表征供表位分析用
为了进行表位分析，将荷载链霉抗生物素蛋白的微量滴定板与来自proBNP序列(1-76)的肽-生物素缀合物一起孵育。应用69个8聚体肽来扫描完整proBNP序列，所述69个8聚体肽通过每个序列向前步移1个氨基酸而获得，即分别为1-8，2-9，3-10，4-11......66-73，67-74，68-75和69-76。已经测试了另外的生物素化序列，分别包含1-10、8-18、1-21、16-30、30-38、32-43、39-50、47-57、50-63、62-70和64-76位的氨基酸。已经将各个抗原肽溶于PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，Oxid，Code-BR 14a)和0.5％ Byco C中至250ng/ml。为了进行肽包被，将每种溶液各100μl分配给微量滴定板的不同孔，然后在室温下温和搅拌1小时。然后，用洗涤缓冲液(0.9M氯化钠溶液，0.05％吐温20)进行洗涤。如上a)所述进行抗体样品孵育和检测反应。因为它们与某些NT-proBNP肽有反应性，所以可以描绘出单克隆抗体或多克隆抗体所识别的表位的位置。
c)与患者样品中proBNP的反应性
在室温下，在搅拌时微量滴定板(Nunc，Maxisorb)各孔用100μl/孔含5μg/ml PAB<人proBNP>M-18.4.34-IgG的荷载缓冲液(包被缓冲液，产品目录号0726 559，Scil Diagnostics，GmbH)包被1小时。荷载后处理在PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，Oxid，Code-BR 14a)和1％Byco C中进行30分钟。然后，用洗涤缓冲液(0.9M氯化钠溶液，0.05％吐温20)进行洗涤。在室温下，在搅拌时与100μl/孔用PBS缓冲液稀释的患者血浆中的天然抗原一起孵育。再次洗涤后，在室温下，在搅拌时与100μl/孔杂交瘤上清液孵育1小时。然后用洗涤溶液再洗涤2次，在室温下，在搅拌时再与100mU/ml、100μl/孔按1:40000用PBS缓冲液稀释的检测抗体过氧化物酶缀合的AffiniPure驴抗绵羊IgG(Dianova，代码713-035-147)孵育1小时。用洗涤缓冲液再次洗涤后，用常规方法测定过氧化物酶活性(例如用
Figure C200480012494D0025122834QIETU
，室温30分钟，用ELISA读板器读取405nm的消光值的变化，单位为mU)。
仅与合成产生的N-端proBNP或与人血清中的proBNP有阳性反应的杂交瘤培养物进行进一步处理。
实施例5
抗N-端proBNP的多克隆抗体的制备
1.免疫
用重组N-端proBNP(参见实施例1)以及完全弗氏佐剂免疫绵羊。剂量为每只动物0.1mg。在10个月内，按4周的间隔重复免疫。第一次免疫后6周和其后每月一次，获取血清样品，测定其敏感性和效价。
2.从绵羊血清纯化多克隆抗体
从用重组N-端proBNP免疫的绵羊的原始血清开始，用
Figure C200480012494D00261
(1.5％)进行脱脂处理，脱去脂质成分。然后通过硫酸铵沉淀(2M)分离免疫球蛋白。溶解的沉淀对15mM KPO4，50mM NaCl(pH7.0)透析，在DEAE琼脂糖凝胶上进行层析。在洗脱中，获取IgG流分(＝PAB<NT-proBNP>S-IgG(DE))。
3.用干制备对总DroBNP具有特异性的多克隆抗体的亲和层析
对于特异性结合总proBNP的多克隆抗体(＝PAB<NT-proBNP>S-IgG(IS，1-21)，或简称PAB<1-21>)的亲和纯化，使用肽HPLGSPGSASDLETSGLQEQR-C((1-21)21-Cys，SEQ ID NO：7)。通过共价结合1mg肽(1-21)21-Cys与2ml马来酰亚胺活化的EAH琼脂糖凝胶4B(Amersham Biosciences，产品目录号17-0569-01)，制备亲和基质。
柱子中填充了10ml亲和基质并用50mM KPO4、150mM NaClpH7.5(PBS)进行平衡。2g PAB<NT-proBNP>S-IgG(DE)上样到该柱子。柱子用PBS和20mM KPO4、500mM NaCl、0.1％ Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠(pH7.5)洗涤。用
Figure C200480012494D00271
 Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液(Pierce，产品目录号21013)洗脱特异性结合亲和基质的IgG，并且称为PAB<1-21>。亲和基质用1M丙酸再生并在PBS/NaN3中保存。
类似方法用于产生对总proBNP具有特异性的亲和纯化的多克隆抗体PAB<NT-proBNP>S-IgG(IS，30-38)，或简称PAB<30-38>)(Karl，J.等，WO 00/45176)。
4.用于制备对天然proBNP具有特异性的多克隆抗体的亲和层析
通过顺序亲和层析，获取抗天然proBNP的多克隆抗体(＝PAB<NT-proBNP>S-IgG(IS，41-46)，或简称PAB<41-46>)。按照如上所述相同的方法，使用3个单独的肽即CEUEU-SLEPLQE((37-43)37-Cys，SEQ ID NO：8)、CEUEU-SPRPTGVW((44-51)44-Cys，SEQID NO：9)和C-EPLQESPRPTG((39-50)39-Cys，SEQ ID NO：10)(EUEU唯一功能是作为后面肽的延伸接头)，来制备3个单独的亲和基质。首先，将PAB<NT-proBNP>S-IgG(DE)上样到包含肽(37-43)37-Cys的亲和基质上，以除去主要结合NT-proBNP序列37-43的所有多克隆抗体。然后，流分上样到包含肽(44-51)44-Cys的第二亲和基质，以捕获主要结合NT-proBNP序列44-51的多克隆抗体。如上所述，洗脱并收集结合的抗体(＝PAB<44-51>)。最后，第二亲和纯化的流分流到包含肽(39-50)39-Cys的第三亲和基质上。如上所述，洗脱并收集结合的抗体。用已知称为PepScan分析的方法进行测定，从第三亲和基质上洗脱的抗体对序列41-46(＝PAB<41-46>)中的表位具有特异性，所述表位代表重叠序列37-43和44-51之间的其余表位。
实施例6
抗proBNP的单克隆抗体和多克隆抗体的Biacore分析
用Biacore 3000分析仪，通过表面等离子共振，测定抗天然NT-proBNP的单克隆抗体和多克隆抗体的特异性。所有表面等离子共振测定都于25℃、用配备有研究级CM5传感器芯片的Biacore 3000进行。运行缓冲液为HBS(10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA和0.005％ P20(＝Polysorbat)，pH7.4)。
1.配体PAB<NT-proBNP，1-21>S-IgG的固定化
采用胺偶联化学，将用作总NT-proBNP的捕获抗体的配体固定化。偶联之前，通过以20μl/min的流速注射10μl 0.1％ SDS、50mMNaOH、10mM HCl和100mM磷酸，预处理传感器芯片。用0.1M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和0.1M EDC(3-(N，N-二甲基-氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺)的1:1混合物以20μl/min的流速，活化所有流通池表面5分钟。将浓度为30μg/ml溶于10mM乙酸钠(pH5.0)的配体注射到所有4个流通池中达5min。注射5分钟1M乙醇胺(pH8.0)，封闭表面，接着注射30秒的HBSwash(100mM HEPES pH7.4，1.5M NaCl，3.4mM EDTA，0.05％ P20(＝Polysorbat)，2％ DMSO)、100mM HCl和2 x 100mM磷酸，以除去非共价结合的配体。配体密度约为16.000RU。
2.患者样品中NT-proBNP的浓度测定
为了在Biacore 3000中进行以下方法，使用图2所附程序。使用浓度为0nM、2.5nM、5nM、10nM、20nM和40nM的合成NT-proBNP(1-76)amid的20％马血清(马血清用HBS+1mg/ml羧甲基葡聚糖按1:5稀释)作为标定物。加入羧甲基葡聚糖来抑制血清成分对传感器芯片表面的非特异性结合。
具有>10ng/ml天然NT-proBNP的患者样品用也含1mg/ml羧甲基葡聚糖的HBS按1:5稀释。
将标定物和患者样品以10μl/min的流速注射到所有4个流通池中达10min，接着以100μl/min的流速进行30秒的HBS注射，以除去非特异性结合的血清成分。将已确定具有特异性的抗体，以溶于HBS的500nM浓度、以10μl/min的流速注射3min。流通池1中是抗体1，流通池2中是抗体2，以此类推。分别测定抗体的结合数据(单位：RU)，作为注射抗体前10秒的响应与注射下一个抗体或HBS前10秒的响应之间的差异。
为了计算患者样品中NT-proBNP的浓度，运用BIAevaluation软件第4.1版。对于每种抗体，用样条拟合绘制合成NT-proBNP(1-76)amid的校正曲线，并计算1:5稀释的患者样品的相应浓度。浓度乘以5得到未稀释血清中NT-proBNP的浓度。
3.抗体特异性的测定
为了测定抗体是结合人血清中的天然NT-proBNP还是总NT-proBNP，将用所研究的抗体测得的NT-proBNP浓度(y轴)对用参考抗体MAB 1.21.3测得的相应样品浓度(x轴)作图。运用MS-Excel来拟合y＝ax+b型线性回归曲线并计算相关系数r和斜率。
表1：不同抗proBNP抗体的特征
 
抗体 所识别的表位 合成proBNP 患者样品proBNP  
MAB 17.3.1 氨基酸13-16 +++ +++
MAB 18.4.34 氨基酸27-31 +++ +++
MAB 18.29.23 氨基酸62-76 +++ +++
 
MAB 1.21.3 氨基酸42-46 +++ +
PAB<1-21> 氨基酸1-21 +++ +++
PAB<44-51> 氨基酸44-51 +++ ++
PAB<41-46> 氨基酸41-46 +++ +
+++表示合成proBNP和患者样品中的proBNP都能在类似程度上很好地识别；
+表示与合成proBNP所得的值相比，与患者样品中的proBNP的反应范围为15％。
根据表1，很显然，绝大多数proBNP表位看来以相同方式存在于合成proBNP和患者样品中含有的proBNP上。这样的实例分别是MAB 17.3.1、MAB 18.4.34、MAB 28.29.13和PAB<1-21>。
然而，有一个表位看来并不以相同方式存在于合成proBNP和患者样品中含有的proBNP上。该表位基本上由氨基酸41-44组成并且被MAB 1.21.3以及PAB<41-46>所识别。看来用这些免疫试剂，仅能识别患者样品中存在的总proBNP的一个亚群。当分别用总proBNP测定法或天然proBNP测定法来检测患者样品中的proBNP时，得到明显不同的结果。总proBNP中仅该亚群看来携带天然proBNP特征性表位。
从图3-7看显而易见的是，PAB<41-46>表现出对MAB 1.21.3的非常好的相关性，而抗总proBNP的抗体，即MAB 18.4.34、MAB18.29.23和PAB 30-38表现出与MAB1.21.3的相关性低得多。有趣的是，PAB<44-51>看来反应性有些混杂，不能作为特异性结合天然proBNP的抗体，因为它对MAB 1.21.3的相关性低于r＝0.95。
实施例7
天然proBNP和总proBNP测定法的各自的临床比较
在临床研究中，分别通过用于天然proBNP和总proBNP的夹心免疫测定，分析了按照HYHA状态分类的246个患者样品。该项研究结果见下表2。
表2：患者样品中天然proBNP和总proBNP的比较性分析
 
NYHA n246 天然proBNP任意单位   NYHA X/NYHA0  总proBNP(pg/ml)   NYHAX/NYHA0 
0 119 337 1.0 638 1.0
1 32 355 1.1 717 1.1
2 62 655 1.9 1072 1.7
3 30 2947 8.7 3609 5.6
4 3 12755 38 15902 25
临床上非常重要的是区别未患有或患有极轻微疾病患者(HYHA0级和1级)以及正在患病的患者(NYHA X＝2级或更高)。从表2可见，从0/1级到2级和更高级，有显著性增加。对于所有的2级、3级和4级来说，这样的增加对天然proBNP来说比对总proBNP更加显著。这说明对于天然proBNP比起总proBNP来说具有更好的灵敏度/特异性以及临床实用性。
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<210>2
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<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>2
Figure C200480012494D00332
<210>3
<211>70
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>3
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<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>4
Figure C200480012494D00342
<210>5
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<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>5
<210>6
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<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
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Figure C200480012494D00344
<210>7
<211>21
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
Figure C200480012494D00351
<210>8
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>多肽
<220>
<221>其他特征
<222>(3)..(3)
<223>Xaa表示β-丙氨酸
<220>
<221>其他特征
<222>(5)..(5)
<223>Xaa表示β-丙氨酸
<400>8
Figure C200480012494D00352
<210>9
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>多肽
<220>
<221>其他特征
<222>(3)..(3)
<223>Xaa表示β-丙氨酸
<220>
<221>其他特征
<222>(5)..(5)
<223>Xaa表示β-丙氨酸
<400>9
Figure C200480012494D00361
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(3)..(3)
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<220>
<221>其他特征
<222>(5)..(5)
<223>Xaa表示β-丙氨酸
<400>10
Figure C200480012494D00362
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>11
Figure C200480012494D00371

Claims (10)

1.一种特异性结合天然脑钠尿肽前体分子(proBNP)的抗体，其中所述特异性结合天然proBNP的抗体是这样的抗体：就患者样品中所测得的proBNP值而言，所述抗体与MAB 1.21.3的相关性为通过线性回归分析求出的r-值至少r＝0.95或0.95以上。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求2的抗体，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞系MAB 1.21.3产生的。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是分离的多克隆抗体。
5.权利要求1-4中任一项的抗天然proBNP抗体在制备用于特异性检测天然proBNP的药物中的用途。
6.权利要求5的用途，其中所述检测是通过竞争性免疫测定进行的。
7.权利要求5的用途，其中所述检测是通过夹心免疫测定进行的，其中也使用第二抗proBNP抗体，并且其中所述第二抗proBNP抗体和抗天然proBNP抗体都结合天然proBNP，因而形成第二抗proBNP抗体-天然proBNP-抗天然proBNP抗体复合物。
8.权利要求1-4中任一项的抗天然proBNP抗体在制备用于诊断心力衰竭的药物中的用途。
9.一种测定天然proBNP的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项的抗体和检测天然proBNP的辅助试剂。
10.杂交瘤细胞系MAB1.21.3，其保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)。
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