BRPI0410261B1 - ANTICORPO MONOCLONAL QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO proBNP, MÉTODOS PARA DETECÇÃO ESPECÍFICA DE proBNP IN VITRO E PARA DIAGNÓSTICO DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA IN VITRO, KIT PARA MEDIÇÃO DE proBNP, E LINHAGEM CELULAR DE HIBRIDOMA MAB 1.21.3 - Google Patents
ANTICORPO MONOCLONAL QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO proBNP, MÉTODOS PARA DETECÇÃO ESPECÍFICA DE proBNP IN VITRO E PARA DIAGNÓSTICO DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA IN VITRO, KIT PARA MEDIÇÃO DE proBNP, E LINHAGEM CELULAR DE HIBRIDOMA MAB 1.21.3 Download PDFInfo
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Abstract
"método de detecção de probnp natural". a presente invenção refere-se a anticorpos que especificamente se ligam ao probnp natural, a um método para detecção específica de probnp natural, um método de correlacionar o nível de probnp natural ao diagnóstico de colapso cardíaco, um kit para detecção de probnp natural e a uma linha celular de hibridoma que produz um anticorpo para o probnp natural.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO MONOCLONAL QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO proBNP, MÉTODOS PARA DETECÇÃO ESPECÍFICA DE proBNP IN VITRO E PARA DIAGNÓSTICO DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA IN VITRO, KIT PARA MEDIÇÃO DE proBNP, E LINHAGEM CELULAR DE HIBRIDOMA MAB 1.21.3".
[001] A presente invenção se refere a anticorpos que especificamente se ligam a uma subpopulação de proBNP natural, denominado proBNP total, a um método para detecção específica de proBNP natural, um método de correlacionar o nível de proBNP natural ao diagnóstico de insuficiência cardíaca, um kit para detecção de proBNP natural e a uma linhagem celular de hibridoma que produz um anticorpo ao proBNP natural.
[002] A insuficiência cardíaca é um fenômeno amplamente difundido, especialmente no mundo ocidental. De acordo com o dicionário médico da Roche (Urban & Schwarzenberg, 1993), a insuficiência cardíaca é uma incapacidade aguda ou crônica do coração em gerar o fluxo sangüíneo necessário ao metabolismo durante uma situação de movimento ou mesmo em situação de repouso, para garantir o refluxo venoso (colapso de desenvolvimento retardado e colapso precipitado). Assim, a função de bombeamento do coração é fraca. As causas da insuficiência cardíaca são bastante complexas. Dentre outras, modificações inflamatórias e degenerativas do músculo cardíaco, distúrbio de perfusão coronária, infarto e danos na coronária, devem ser aqui mencionados. Isso leva a modificações da corrente sangüínea periférica, distúrbios do sistema respiratório, da função renal e do metabolismo do eletrólito (edema) e a um reduzido desempenho do sistema muscular do esqueleto humano.
[003] De acordo com a Associação do Coração de N. York (NYHA), a insuficiência cardíaca é dividida nas seguintes classes de NYHA usando testes físicos após esforços: "I" significa completamente livre da dor após esforço físico normal; "II" significa baixa limitação de resistência física; "III" significa forte limitação da resistência física ; "IV" significa que com cada atividade física os sintomas de insuficiência aumentam, na maioria das vezes também existem quando em repouso.
[004] Para um tratamento medicinal efetivo da insuficiência cardíaca por meio de glicosídeos, vasodilatadores, inibidores de ACE e/ou bloqueadores β, em primeiro lugar, é necessário exata e corretamente identificar e diagnosticar a insuficiência cardíaca, classificando o mesmo, se possível, de acordo com o grau de gravidade e, adicionalmente, monitorar o curso do tratamento.
[005] No estado da técnica, alguns marcadores de soro são discutidos como candidatos marcadores para um primeiro diagnóstico da insuficiência cardíaca, como, por exemplo, ANP (hormônio do peptídeo natriurético atrial) e proANP, CNP (peptídeo C-natriurético), adreno-medulin, neuropeptídeo Y, endotelina e BNP (peptídeo natriurético do cérebro). O ANP e proANP, teoricamente, podem representar adequados marcadores ao diagnóstico da insuficiência cardíaca; na prática, entretanto, eles não são muito estáveis ou apresentam apenas um curto tempo de meia vida no sangue, o que representa um sério inconveniente às medições de diagnóstico rotineiras (Buckley M.G. e outros, Clin. Sci., 95 (1998), 235-239; Cleland J.G. e outros, Heart, 75 (1996), 410-413).
[006] Um marcador frequentemente citado e de grande signifi-cância é o BNP (peptídeo natriurético do cérebro). Originalmente, o BNP foi identificado no cérebro de porcos. Tal marcador é um hormônio cardíaco que se assemelha estruturalmente e funcionalmente ao ANP (peptídeo natriurético atrial) (Sudoh T. e outros, Nature, 332 (1988), 78-81). O BNP humano, que consiste em 32 aminoácidos, é principalmente secretado pelos ventrículos do coração e circula no plasma do sangue humano. O uso do BNP como um marcador de diagnóstico é conhecido, por exemplo, do documento de patente EP-A-0 542 255. O BNP apresenta uma ponte de dissulfeto intramolecular e não é um analisado muito estável. Isso se deve presumivelmente a sua função fisiológica como hormônio, que deve ser rompida rapidamente. Portanto, seu uso como marcador de diagnóstico requer cuidado e especial atenção na coleta e processamento da amostra (Masuta C. e outros, Clin. Chem., 44 (1998), 130; Tsuji T. e outros, Clin. Chem., 40 (1994), 672-673).
[007] A molécula precursora de BNP, isto é, proBNP, consiste em 108 aminoácidos. O proBNP é clivado nos acima mencionados 32 aminoácidos C-terminais (77-108), chamados de BNP, nos aminoáci-dos 1-76 do N-terminal , chamados de proBNP N-terminal (ou NT-proBNP). O BNP, proBNP N-terminal (1-76) assim como produtos adicionais de ruptura (Hunt P.J. e outros, Biochem. Biophys. Res. Com., 214 (1995), 1175-1183) circulam no sangue. Ainda não está completamente solucionado se a completa molécula precursora (proBNP, 1108) também ocorre no plasma. No entanto, é descrito (Hunt P.J. e outros, Peptides, Vol. 18, No. 10 (1997), 1475-1481) que uma baixa liberação de proBNP (1-108) é detectável no plasma, mas que devido à ruptura parcial bastante rápida na extremidade N-terminal, alguns aminoácidos são ausentes.
[008] Conforme é conhecido do estado da técnica, o proBNP N-terminal (1-76) é considerado um marcador de insuficiência cardíaca.
[009] O documento de patente WO 93/24531 (US 5.786.163) descreve um método imunológico de identificação do proBNP N-terminal e os anticorpos usados ao mesmo. No documento de patente WO 93/24531, são produzidos anticorpos policlonais contra um único derivado de peptídeo de proBNP N-terminal. É mostrado que os anti corpos produzidos se ligam ao peptídeo de imunização (aminoácidos 47-64) no formato de teste competitivo.
[0010] No teste competitivo executado no documento de patente WO 93/24531 o peptídeo 47-64 em uma forma marcada compete como um traçador com o proBNP em uma amostra do peptídeo não-marcado padrão 47-64, para ligação a anticorpos policlonais de soro de coelho. Uma competição apenas moderada é obtida após 48 horas de incubação, resultando em um limite mais baixo de detecção de aproximadamente 250 fmol/mL. Os longos tempos de incubação desse teste competitivo não são aceitáveis às medições rotineiras das amostras em laboratórios automatizados.
[0011] Hunt P.J. e outros, Clinical Endocrinology, 47 (1997), 287296, também descrevem um teste competitivo à detecção de proBNP N-terminal. Neste ensaio, se faz necessária uma complexa extração da amostra do plasma antes da medição poder ser realizada; isso pode levar à destruição do analisado e a medições errôneas. O anti-soro usado é produzido de modo análogo ao descrito no documento WO 93/24531, através de imunização com um peptídeo sintético. Hunt e outros produzem o anti-soro mediante imunização com os aminoáci-dos proBNP 1-13 do N-terminal, sendo usado como padrão um peptí-deo consistindo de aminoácidos 1-21. Para esse teste, são também necessários longos tempos de incubação. Após um período de incubação de 24 horas, se obtém um limite mais baixo de detecção, de 1,3 fmol/mL.
[0012] Ng L. e outros, documento de patente WO 00/35951, descrevem um método adicional ao diagnóstico de proBNP N-terminal. Esse método se baseia no uso de anticorpos levantados contra um peptídeo sintético correspondente aos aminoácidos 65 a 76 do proBNP humano.
[0013] Hughes D. e outros, Clin. Sci., 96 (1999), 373-380, relatam dois diferentes ensaios ao proBNP N-terminal. Em um primeiro ensaio, é utilizado um anticorpo policlonal gerado com um imunógeno compreendendo um peptídeo sintético correspondente aos aminoácidos 65-76 do proBNP, enquanto no segundo ensaio, o anticorpo policlonal foi gerado em analogia, mas, em tal caso, aos aminoácidos 37-49. De acordo com os dados produzidos por Hughes D. e outros, um anticorpo gerado e reativo com o peptídeo correspondente aos aminoácidos 37-49 do proBNP não reage com o proBNP endógeno intacto. Um ensaio baseado em tais dados não discrimina pacientes com disfunção ventricular esquerda de controles normais. Com o ensaio baseado no proBNP 65-76, os mesmos grupos de pacientes podem ser claramente discriminados.
[0014] Goetze J.P. e outros, Clin. Chem., 48 (2002), 1035-1042, descrevem um ensaio à maioria dos aminoácidos N-terminais (1-21) do proBNP N-terminal. Este ensaio é baseado em um anticorpo poli-clonal levantado contra um peptídeo sintético correspondente aos mesmos aminoácidos (1-21) do proBNP.
[0015] O ensaio de Goetze J.P. e outros, supramencionado, requer uma completa digestão da amostra e os diversos proBNP compreendidos na mesma. Se observa que este ensaio também foi dito como eficiente na redução da ligação não-específica.
[0016] Karl J. e outros, documento de patente WO 00/45176, pela primeira vez mostra que é possível uma sensível e rápida detecção do proBNP N-terminal em um imunoensaio tipo sanduíche. Os epítopos preferidos, conforme descrito no documento WO 00/45176 se encontram entre os aminoácidos 10 e 50 do proBNP N-terminal.
[0017] O documento de patente US 2003/0219734 se refere ao fato de que uma pluralidade de diferentes polipetídeos correlacionados ao BNP derivados de proBNP (1-108), BNP (77-108), assim como, do proBNP N-terminal (1-76), podem estar presentes em uma amostra.
[0018] Mair J. e outros, Clin. Chem. Lab. Med., 39 (2001), 571588, resumiram o impacto da determinação do peptídeo natriurético cardíaco em relação à diagnose e administração da insuficiência cardíaca. Esses autores expressam que os ensaios comerciais disponíveis atualmente não são padronizados, isto é, não foram ajustados contra padrões comuns. Em alguns ensaios, até mesmo uma extração de plasma se faz necessária. Consequentemente, os resultados obtidos com ensaios de diferentes fabricantes podem diferir acentuada-mente. Portanto, os intervalos de referência e os limites de decisão derivados de estudos clínicos são apenas válidos ao particular ensaio usado e não devem ser extrapolados aoutros ensaios do proBNP N-terminal.
[0019] Seguindo estas mesmas linhas de Goetze J.P. e outros, supramencionados, e Mair, J. Clin. Chem., 48 (2002), 977-978, observa-se que as discrepâncias entre os diferentes ensaios do proBNP N-terminal com relação aos valores obtidos, assim como, com relação às suas implicações clínicas, representam um problema crucial ao uso amplamente difundido de seu candidato marcador.
[0020] Obviamente, existe uma grande necessidade de se proporcionar aperfeiçoados, ensaios mais por exemplo, mais reproduzíveis, melhor padronizados, melhor caracterizados e/ou mais clinicamente relevantes para proBNP N-terminal.
[0021] Constituiu uma tarefa à presente invenção desenvolver um ensaio mais específico à medição de proBNP N-terminal e/ou para um fragmento clinicamente relevante ou subpopulação de proBNP N-terminal.
[0022] A invenção, conforme descrita abaixo e reivindicada nas reivindicações anexas, pelo menos, parcialmente, soluciona um ou mais dos problemas conhecidos na técnica.
[0023] Foi agora surpreendentemente descoberto que é possível detectar de forma específica uma subpopulação de todas as espécies de proBNP (proBNP total) presentes na circulação. Essa subpopulação é chamada de proBNP natural N-terminal ou simplesmente "proBNP natural". De forma surpreendente, parece que a subpopulação de proBNP natural é clinicamente mais relevante quando comparado ao proBNP total.
[0024] Em uma primeira modalidade, a presente invenção se refere a um anticorpo isolado que se liga especificamente ao proBNP natural.
[0025] A invenção também se refere a um método para detecção específica de proBNP natural, compreendendo as etapas de contatar uma amostra suspeita ou conhecida de conter proBNP com um anticorpo que especificamente se liga ao proBNP natural, sob condições que permitem a formação de um anticorpo ao proBNP natu-ral/complexo e detectar o complexo formado.
[0026] A invenção divulga ainda um método de diagnóstico de insuficiência cardíaca, compreendendo a detecção de proBNP natural e correlacionando o nível de proBNP natural aa insuficiência cardíaca. Esse valor correlacionado de proBNP natural é indicativo à ausência, presença ou situação da insuficiência cardíaca.
[0027] A invenção também se refere a um kit para medição de proBNP natural, compreendendo um anticorpo que especificamente se liga ao proBNP natural e a reagentes auxiliares à detecção do proBNP natural. São também reivindicados os anticorpos monoclonais, conforme produzido pela linhagem celular de hibridoma MAB 1.21.3, produzindo um específico anticorpo monoclonal ao proBNP natural que foi depositado no DSMZ.
[0028] Durante o curso dos experimentos realizados pelos presentes inventores, a implementação da presente invenção descobriu e estabeleceu que pelo menos duas populações de proBNP existem no sangue humano. Uma população de proBNP parece representar a maioria de todas as moléculas de proBNP que podem ser detectadas pelos métodos imunológicos. Essa população é denominada de proBNP "total". As pesquisas dos presentes inventores demonstraram que as moléculas de proBNP que podem ser resumidas como proBNP total, aparentemente apresentam uma estrutura de núcleo central em comum, que varia da posição do aminoácido de cerca de 10 à posição do aminoácido de cerca de 66 do proBNP. Preferencialmente, o proBNP total detectado por um método de acordo com a presente invenção compreende os aminoácidos 10 até 66. Como o versado na técnica poderá observar, este proBNP total pode ser facilmente detectado pelos procedimentos imunológicos, tanto no formato de ensaio competitivo, como no formato de ensaio tipo sanduíche. Preferencialmente, um ensaio tipo sanduíche é utilizado para detectar o proBNP total. Tal ensaio tipo sanduíche pode ser designado para compreender anticorpos que se ligam aos terminais C e N do epítopo de proBNP natural, respectivamente. Entretanto, é também possível, por exemplo, detectar o proBNP total usando anticorpos capazes de formação de sanduíche e de serem reativos com os epítopos N-terminais em relação aos epítopos de proBNP natural. Obviamente, em tal determinação competitiva ou determinação de sanduíche do proBNP total, não deve ser usado um anticorpo ao proBNP natural.
[0029] O termo "proBNP natural" indica qualquer molécula de proBNP na qual o epítopo reconhecido por MAB 1.21.3 está presente. De acordo com as descobertas demonstradas posteriormente, esse epíto-po está somente presente em uma subpopulação de todas as moléculas de proBNP (isto é, uma subpopulação do proBNP "total"). Foi descoberto e estabelecido pelos presentes inventores que essa subpopu-lação de proBNP total, denominada de "proBNP natural" é detectável por meio de componentes de ligação específicos, preferencialmente, por anticorpos policlonais e/ou monoclonais.
[0030] A subpopulação denominada de proBNP não necessariamente deve ser um fragmento de polipetídeo uniforme. A extensão do(s) polipeptídeo(s) de proBNP natural pode variar. A maioria das moléculas reconhecidas em um imunoensaio de sanduíche ao proBNP natural são esperadas de representar o proBNP (1-76) N-terminal ou fragmentos dos mesmos. Preferencialmente, um ensaio ao proBNP natural é montado de um modo apropriado para medição dos fragmentos de NT-proBNP, compreendendo aminoácidos 10 a 66. A propriedade característica do proBNP natural é a presença de um epítopo de proBNP natural reconhecido por MAB 1.21.3.
[0031] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um anticorpo que especificamente se liga ao proBNP natural, em que o dito anticorpo que se liga especificamente ao proBNP natural é um anticorpo que em termos dos valores ao proBNP como determinado nas amostras do paciente, se correlaciona com um valor r de pelo menos r = 0,95 ou acima desse valor ao MAB 1.21.3.
[0032] Com base nessas descobertas, divulgação e depósito da presente invenção, o versado na técnica não terá qualquer problema em examinar se um anticorpo é específico de ligação ao proBNP natural ou ao proBNP total. O MAB 1.21.3 é considerado um exemplo de protótipo de um anticorpo que se liga especificamente ao proBNP, enquanto o MAB 18.4.34 é considerado um exemplo protótipo de um anticorpo que se liga especificamente ao proBNP total. Qualquer agente de ligação ao proBNP, entretanto, pode ser agora examinado quanto a sua especificidade de ligação ao proBNP natural ou total, respectivamente.
[0033] Um anticorpo que "se liga especificamente" ao proBNP natural é um anticorpo que em termos de valores ao proBNP, conforme determinado em amostras de pacientes, se correlaciona com um valor de r de pelo menos r = 0,95 ou acima desse valor ào MAB 1.21.3. A especificidade de ligação ao proBNP natural é examinada em relação às propriedades de ligação do MAB 1.21.3 usando importantes amostras clínicas. Pelo menos 15 e no máximo 25 amostras de soro com um nível de NT-proBNP de 10 ng/mL a 150 ng/mL do proBNP natural são utilizadas. A ligação ao proBNP é determinada através do sistema Biacore® 3000. Os valores medidos são correlacionados aos valores de proBNP natural quando medidos usando MAB 1.21.3 e o exame estatístico é realizado mediante análise de regressão linear. Uma regressão linear do tipo y = ax + b é preferencialmente adaptada usando MS-Excel e o coeficiente de correlação r e a inclinação são calculados. Ainda de modo mais preferido, tal anticorpo irá detectar essencialmente a mesma subpopulação de proBNP natural do proBNP total quando ligado por MAB 1.21.3, em que uma ligação substancialmente à mesma subpopulação resulta em uma correlação de r = 0,98 ou valor superior, de acordo com os procedimentos indicados acima.
[0034] O MAB 18.4.34 pode ser considerado um anticorpo protótipo para medição do proBNP total. Para qualquer anticorpo que se liga especificamente ao proBNP natural (usando as mesmas amostras e procedimentos conforme descrito acima) a correlação ao MAB 18.4.34, isto é, ao proBNP total, tipicamente será inferior se comparada à correlação com relação ao MAB 1.21.3. Preferencialmente, a correlação ao MAB 18.4.34 para um anticorpo que se liga especificamente à subfra-ção de proBNP natural de proBNP será r = 0,94 ou valor inferior. Ainda mais preferido será o valor de r = 0,9 ou inferior a este ou, ainda, tão baixo quanto r = 0,8 ou inferior a este.
[0035] Quando se compara quantidades absolutas medidas em tais métodos de comparação, os ensaios que detectam o proBNP total, consistentemente, produzem 2 a 20 vezes, na maioria dos casos, cerca de 2 a 5 vezes, valores mais altos de proBNP, se comparado aos valores ao MAB 1.21.3. Além da correlação especificada acima, um preferido anticorpo que especificamente se liga ao proBNP natural, no método de comparação acima, irá também mostrar uma inclinação de menos de 1,5. Mais preferencialmente, a inclinação será entre 0,7 e 1,5.
[0036] A ligação específica ocorre preferencialmente com uma afinidade de ligação de pelo menos 107 L/mol. O agente de ligação específica mais preferido apresenta uma afinidade de 108 L/mol ou, ainda mais preferencialmente, de 109 L/mol ao proBNP natural.
[0037] Conforme explicado acima, uma característica importante e preferida do MAB 1.21.3 é o fato de que apenas uma fração variável entre cerca de 5% e cerca de 50% do proBNP total, quando compreendida em uma típica amostra clínica, é ligada por esse anticorpo.
[0038] Um exemplo protótipo de um anticorpo que se liga especificamente ao proBNP natural é o anticorpo monoclonal produzido pelo clone MAB 1.21.3, o qual foi depositado com o DSMZMAB 1.21.3 em um anticorpo monoclonal de ovelha e foi produzido conforme descrito na seção dos Exemplos. O epítopo no proBNP reconhecido por este e outros anticorpos, foi identificado, caracterizado e mapeado mediante uso de peptídeos sintéticos curtos correspondentes a sequências bem-definidas de proBNP. Esse método é conhecido e referido como análise de PepScan.
[0039] Em resumo, 69 peptídeos sintéticos compreendendo 8 ami-noácidos consecutivos de proBNP foram sintetizados compreendendo uma cisteína N-terminal, uma molécula espaçadora e biotina. Cada um desses peptídeos foi desviado por um aminoácido do N-terminal ao C-terminal. O peptídeo 1, dessa forma, compreende os aminoácidos (aas) 1 a 8, o peptídeo 2 os aas de aas 2 a 9, etc., e o peptídeo 69 os aas 69 a 76.
[0040] O MAB 1.21.3 foi descoberto com significativo poder de re ação com os peptídeos número 39 (aminoácidos 38-46) ao 42 (aas 4249), os quais apresentam as posições de aminoácido 42 a 46 do proBNP em comum. Portanto, pode se concluir que o MAB 1.21.3 reage com um epítopo que substancialmente consiste em aminoácidos 42 a 46 de proBNP.
[0041] Conforme pode ser observado por alguém versado na técnica, a presença ou ausência de um epítopo pode depender da estrutura terciária, de modificações secundárias, da formação do complexo, da acessibilidade, etc. Obviamente, o MAB 1.21.3 e outros anticorpos ao proBNP natural possuem exigências bastante específicas nesse contexto e não reagem com a maioria de moléculas de proBNP presentes em uma amostra típica. Uma vez que os peptídeos sintéticos curtos da análise de PepScan são improváveis de apresentar uma estrutura terciária ou modificações secundárias, o epítopo reconhecido por MAB 1.21.3 não deve ser modificado e, portanto, a terminologia "natural" tem sido considerada apropriada.
[0042] Um ensaio que se baseia em um anticorpo ao proBNP natural e um ensaio que mede o proBNP total exibem acentuadas diferenças na intensidade de reação, uma vez que o proBNP sintético (176) e o proBNP, quando compreendidos em uma amostra clínica, como o soro humano, respectivamente, são medidos e comparados. O uso de procedimentos de detecção do proBNP sintético (1-76) pode ser facilmente estabelecido e padronizado. O emprego de tal ensaio de proBNP sintético (1-76) em uma matriz sintética ou suplementado a uma amostra natural, como o soro humano, é medido nos mesmos níveis em ambos os ensaios. Entretanto, de forma surpreendente, são encontradas diferenças acentuadas, uma vez que o proBNP quando compreendido em uma amostra natural, como o soro humano, é medido em ambos desses ensaios.
[0043] Um ensaio que utiliza um anticorpo (ou anticorpos, respec tivamente) reativos ao proBNP total, como o anticorpo monoclonal MAB 17.3.1, 18.4.34 ou 18.29.23, respectivamente, parece detectar todas as moléculas de proBNP presentes em uma amostra de soro, isto é, o proBNP total. Ao contrário, um ensaio baseado em um anticorpo reativo com proBNP natural, por exemplo, MAB 1.21.3, detecta apenas uma fração desse proBNP total.
[0044] Pode ser demonstrado pela presente invenção que a sub-população de proBNP natural do proBNP total clinicamente mostra uma correlação bastante satisfatória ao BNP biologicamente ativo. Logicamente, na medição do BNP, foram observadas todas as precauções aobtenção de valores corretos de BNP com relação à amostragem e manipulação. Para medição de proBNP natural, um processamento rotineiro de amostra, sem precauções específicas, provou ser satisfatório.
[0045] Todos os dados estabelecidos pela presente invenção indicaram claramente que o epítopo identificado na presente invenção e especificamente ligado pelo MAB 1.21.3 é um epítopo principal àpro-priados anticorpos ao proBNP natural. Obviamente, esse epítopo de proBNP natural reconhecido pelo MAB 1.21.3 pode se submeter a uma modificação natural ou pode tomar parte de um complexo de proteína que modifica esse epítopo com o efeito resultante de que MAB 1.21.3 se liga a tal proBNP modificado ou complexado em um menor grau ou em grau nenhum. O proBNP que carrega tal epítopo de proBNP "não-natural" modificado é apenas significativamente medido em ensaios ao proBNP total.
[0046] Devido a sua intrínseca alta reprodutibilidade, os anticorpos monoclonais são ferramentas preferidas para detectar o proBNP natural. Portanto, em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um anticorpo monoclonal que especificamente se liga ao proBNP natural.
[0047] Conforme pode ser observado por alguém versado na técnica, outros anticorpos monoclonais podem ser encontrados, que, se comparados ao MAB 1.21.3, podem mostrar um padrão ligeiramente diferente com relação à reatividade aos peptídeos de PepScan números 39 a 42. Um anticorpo monoclonal ao proBNP natural não irá se afastar do espírito da presente invenção na medida em que somente uma subpopulação de proBNP total é detectada, que se correlaciona com um valor de r de pelo menos r = 0,95 ou um valor acima deste à subpopulação de proBNP natural compreendida na população de proBNP total, ligado por MAB 1.21.3. Tal correlação é determinada usando o sistema Biacore® e o exame estatístico conforme descrito acima. De modo ainda mais preferido, tal anticorpo monoclonal irá detectar substancialmente a mesma subpopulação de proBNP natural do proBNP total, conforme ligado por MAB 1.21.3, em que a mesma subpopulação substancialmente resulta em uma correlação de r = 0,98 ou superior a este, de acordo com os procedimentos acima.
[0048] Em uma modalidade preferida, a presente invenção também se refere a um método de produzir um anticorpo monoclonal, o método compreendendo as etapas de imunizar um apropriado animal não-humano com proBNP, preferencialmente, um camundongo, um rato ou uma ovelha, obtendo células B que produzem anticorpos das mesmas, fundindo essas células B com apropriados componentes de fusão e testando os anticorpos produzidos pelos hibridomas assim obtidos para reatividade ao proBNP natural. Preferencialmente, somente tais anticorpos monoclonais são selecionados e usados em um imuno-ensaio, que em adequadas amostras de paciente se correlaciona ao MAB 1.21.3 com um valor de r de pelo menos 0,95. Tal correlação é examinada conforme descrito acima. Preferencialmente, a imunização é realizada com proBNP sintético ou com um proBNP produzido em um hospedeiro procariótico ou com um peptídeo sintético ou fragmen tos de proBNP compreendendo pelo menos os aminoácidos 41 a 44 do proBNP. Anticorpos monoclonais de ovelha a proBNP natural com uma afinidade de 109 L/mol ou acima disso, representam uma modalidade preferida, de acordo com a presente invenção.
[0049] Agora, que o MAB 1.23.1 é disponível, logicamente, é também possível se produzir, purificar e identificar anticorpos policlonais que podem ser usados na detecção específica do proBNP natural. Foi encontrado, por exemplo, que um anticorpo policlonal (PAB) ao proBNP natural pode agora ser gerado, purificado e caracterizado por meio de sua correlação ao MAB 1.21.3.
[0050] Conforme pode ser observado por alguém versado na técnica, existem diversas maneiras de se produzir um PAB que se liga ao proBNP. Obviamente, será possível, por exemplo, se usar um ou mais peptídeos sintéticos como um imunoabsorvente em diversas rotas bem-sucedidas de imunopurificação.
[0051] Os anticorpos policlonais ao proBNP natural não irão se afastar do espírito da presente invenção na medida em que somente uma subpopulação de proBNP total é detectada, que se correlaciona com um valor de r de pelo menos r = 0,95 ou um valor acima deste à subpopulação de proBNP natural compreendida na população de proBNP total, ligado por MAB 1.21.3. Tal correlação é determinada usando o sistema Biacore® e o exame estatístico conforme descrito acima. De modo ainda mais preferido, tal preparação de anticorpo policlonal irá detectar substancialmente a mesma subpopulação de proBNP natural do proBNP total, conforme ligado por MAB 1.21.3, em que a mesma subpopulação substancialmente resulta em uma correlação de r = 0,98 ou superior a este, de acordo com os procedimentos acima.
[0052] Uma maneira de se obter tal PAB ao proBNP natural é imunizar com proBNP produzido de forma recombinante ou de forma sintética, para purificar os anticorpos específicos de proBNP natural dos mesmos, mediante purificação por afinidade e examinar o anticorpo policlonal assim obtido através das amostras do paciente, conforme descrito acima.
[0053] Portanto, em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um método de produzir anticorpos policlonais, o método compreendendo as etapas de imunizar um apropriado animal não-humano com proBNP, obtendo anticorpos policlonais do mesmo e testando os anticorpos assim obtidos quanto à reatividade ao proBNP natural. Preferencialmente, somente tais anticorpos policlonais são selecionados e usados em um imunoensaio, que em adequadas amostras de paciente se correlaciona ao MAB 1.21.3 com um valor de r de pelo menos 0,95. Tal correlação é examinada conforme descrito acima.
[0054] Para qualquer anticorpo policlonal que especificamente se liga ao proBNP natural (usando as mesmas amostras e procedimentos), a correlação ao MAB 18.4.34, isto é, ao proBNP total, será significativamente inferior quando comparada à correlação ao MAB 1.21.3. Uma vez que as preparações de anticorpo policlonal podem sempre conter anticorpos individuais com diferentes propriedades, preferencialmente, a correlação ao MAB 18.4.34 para um anticorpo policlonal que especificamente se liga à subfração de proBNP natural do proBNP total será r = 0,94 ou um valor inferior a este. Mais ainda preferido será quando o valor for tão baixo quanto 0,9 ou inferior a este. Preferencialmente, as preparações de anticorpo policlonal que especificamente se ligam ao proBNP natural irão se correlacionar ao MAB 1.21.3 com um valor de r = 0,98 ou superior a este e ao MAB 18.4.34 com um valor de r = 0,94 ou inferior a este ou, ainda mais preferencialmente, com um valor de r = 0,9 ou inferior a este com relação à correlação ao MAB 18.4.34.
[0055] Preferencialmente, a imunização aobtenção de anticorpos policlonais ao proBNP natural é executada com proBNP sintético ou com um proBNP produzido em um hospedeiro procariótico ou com um peptídeo sintético ou fragmentos do proBNP, ambos, pelo menos compreendendo os aminoácidos 41 a 44 do proBNP.
[0056] No curso dos experimentos dos presentes inventores, uma grande variedade de reagentes imunológicos foi produzida, analisada, combinada em diversos formatos de ensaios sanduíche e usada na detecção do proBNP. Essas diversas combinações de reagentes imu-nológicos revelou que a maioria dos ensaios parece medir o proBNP total.
[0057] Os ensaios de proBNP total pesquisados foram encontrados como exibindo uma razoável correlação ao BNP, o que proporciona mais ainda uma razoável precisão de diagnóstico ao diagnóstico de insuficiência cardíaca, conforme, por exemplo, Mair J., supramencio-nado.
[0058] Entretanto, pode agora ser estabelecido que um ensaio que somente detecta o proBNP natural, quando comparado a um ensaio que detecta o proBNP total, melhor se diferencia entre os pacientes na classe NYHA 0 ou I e nos pacientes nas classes do NYHA II, III ou IV, respectivamente. Isso também leva a uma aperfeiçoada discriminação clínica de pacientes com colapso cardíaco.
[0059] Portanto, em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um método para detecção específica de proBNP natural, compreendendo as etapas de contatar uma amostra suspeita ou conhecida de conter proBNP com um anticorpo que especificamente se liga ao proBNP natural sob condições que permitem a formação de um anticorpo ao proBNP natural - complexo de proBNP natural e detecta o complexo formado. Preferencialmente, o referido método para detecção específica de proBNP natural é usado para diferenciar os estágios de NYHA 0 e I dos estágios de NYHA II, III ou IV.
[0060] O termo "anticorpo ao proBNP natural - complexo de pro- BNP natural" pode ser simplesmente chamado de "anticorpo - complexo de proBNP natural".
[0061] O termo "anticorpo" se refere a anticorpos mono- ou poli-clonais, quiméricos ou humanizados ou a outros anticorpos que podem ser obtidos por engenharia genética, assim como, a todos os fragmentos de anticorpo conhecidos àlguém versado na técnica, tais como, fragmentos de F(ab')2, Fab' ou Fab.
[0062] Outros agentes de ligação com apropriada especificidade ao proBNP natural podem ser usados para substituir anticorpos ou fragmentos de anticorpos. Apenas a específica ligação ao proBNP natural, em analogia ao MAB 1.21.3 deve ser garantida.
[0063] Conforme pode ser observado por alguém versado na técnica, existem numerosas maneiras de se detectar um proBNP natural que utiliza um anticorpo que especificamente se liga ao mesmo, as quais são todas descritas em detalhes em livros textos relevantes (por exemplo, citados por Tijssen P., "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", 11 (1990) Elsevier, Amsterdm; ou Diamandis e outros, Eds. (1996), Immunoassay, Academic Press, Boston).
[0064] No contexto da presente invenção, diversos reagentes e combinações de reagentes para detecção de proBNP total ou proBNP natural foram analisados pelo sistema Biacore®, cujos resultados são apresentados na seção de Exemplos.
[0065] Em diagnósticos clínicos de rotina, são usados, frequentemente, métodos baseados em um formato de imunoensaio heterogêneo. Em uma modalidade preferida de acordo com a presente invenção, o método para detecção de proBNP natural é um imunoensaio competitivo.
[0066] Ainda mais preferidos são os imunoensaios de acordo com o princípio de ensaio tipo sanduíche, em que um anticorpo - antígeno - complexo de anticorpo, também chamado um sanduíche, é formado.
[0067] Em uma modalidade preferida de acordo com a presente invenção, o método para detecção específica de proBNP natural se constitui em um imunoensaio de sanduíche, em que são usados um primeiro anticorpo ao proBNP natural e um segundo anticorpo ao proBNP total e em que o dito segundo anticorpo ao proBNP e primeiro anticorpo ao proBNP natural se ligam ao proBNP natural em diferentes epítopos, formando, assim, um (primeiro) anticorpo proBNP antinatural - proBNP natural - segundo complexo anticorpo anti-proBNP.
[0068] Conforme pode ser observado por alguém versado na técnica, pode ser também estabelecido um ensaio de sanduíche para detecção de proBNP natural usando o anticorpo ao proBNP total como um primeiro anticorpo (captura) e o anticorpo proBNP antinatural como um segundo anticorpo (traçador, detecção ou marcado).
[0069] Preferencialmente, tal método de sanduíche para determinação de proBNP natural compreende as seguintes etapas: a) mistura da amostra com o primeiro anticorpo específico de proBNP natural que é portador de um grupo adequado para ligação a uma fase sólida ou mistura da amostra com o primeiro anticorpo específico de proBNP natural que já está ligado a uma fase sólida. b) mistura dessa solução com o segundo anticorpo ao proBNP total, ligante-se a um epítopo exterior ao epítopo do proBNP natural, que está presente nos proBNP natural e proBNP total, sendo portador de uma marcação sob condições em que se forma um complexo de um primeiro anticorpo - proBNP natural - segundo anticorpo; c) ligação do complexo imune formado a uma fase sólida; d) separação da fase sólida da fase líquida; e) detecção da marcação em uma ou ambas as fases.
[0070] Em uma determinação quantitativa, a mesma medição é realizada com uma quantidade definida de proBNP natural como padrão e após a determinação da amostra, se realiza uma etapa (f), isto é, os valores de medição do padrão ou da curva padrão são comparados aos valores obtidos com a amostra e a correspondente concentração de proBNP natural é extrapolada.
[0071] O primeiro anticorpo específico ao proBNP natural pode ser ligado diretamente à fase sólida ou, indiretamente, através de um específico sistema emparelhado de ligação. A ligação direta desse anticorpo à fase sólida segue métodos conhecidos aos especialistas da técnica, por exemplo, de um modo adsortivo. Se a ligação for indireta através de um específico sistema casado de ligação, o primeiro anticorpo é um conjugado consistindo de um anticorpo contra proBNP natural e um primeiro componente do específico sistema casado de ligação. Um específico sistema casado de ligação significa dois componentes que podem reagir especificamente entre si. Essa ligação pode ser baseada em uma ligação imunológica ou em uma alternativa ligação específica. As combinações preferidas são biotina e avidina, es-treptavidina ou antibiotina, respectivamente, hapteno e anti-hapteno, fragmento Fc de um anticorpo e anticorpos contra esse fragmento Fc ou carboidrato e lectina. Preferencialmente, uma combinação de biotina e avidina ou de biotina e estreptavidina é usada como um específico sistema casado de ligação.
[0072] O segundo componente do específico sistema casado de ligação é revestido a uma fase sólida. Preferencialmente, são usados a estreptavidina ou a avidina. A ligação desse componente do específico sistema casado de ligação a um material de veículo insolúvel pode ser realizada de acordo com procedimentos padronizados conhecidos por versados na técnica. Aqui, uma ligação covalente, assim como, uma ligação adsortiva, é adequada.
[0073] Como fase sólida, tubos de teste ou placas de microtitula-ção feitas de poliestireno ou de plásticos similares são adequados, sendo revestidos com o segundo componente do específico sistema casado de ligação. Ainda adequadas e particularmente preferidas são as substâncias particuladas, tais como, as partículas de látex, partículas magnéticas, materiais de peneiras moleculares e corpúsculos de vidro. Papel ou nitrocelulose também podem ser usados como veículos. O uso de contas magnéticas revestidas com o segundo componente do específico sistema casado de ligação, conforme descrito acima, é particularmente preferido. Após se completar a reação imunológica e a ligação do complexo imunológico formado à fase sólida, essas micropartículas podem ser separadas da fase líquida, por exemplo, através de filtração, centrifugação ou, no caso de partículas magnéticas, através de um ímã. A detecção da marcação ligada à fase sólida (ou da marcação restante na fase líquida ou em ambas) é depois executada de acordo com procedimentos padronizados.
[0074] O segundo anticorpo que se liga ao proBNP total, se liga a um epítopo exterior ao epítopo de proBNP natural que está presente nos proBNP natural e proBNP total. A simultânea ligação de ambos os anticorpos a esses dois epítopos na molécula de proBNP natural deve ser possível, pelo fato de que, de outro modo, nenhum complexo do tipo sanduíche teria se formado.
[0075] Os pesquisadores da presente invenção também identificaram epítopos no proBNP que são bastante apropriados ao ensaio tipo sanduíche descrito acima.
[0076] Um grande número de anticorpos monoclonais foi gerado. Pode ser colocado que nem todos os epítopos reconhecidos no proBNP recombinante são igualmente apropriados para medir o proBNP em uma amostra de paciente.
[0077] Três epítopos consistindo essencialmente dos aminoácidos 13-16, 27-31 e 64-67, respectivamente, reconhecidos pelos MABs 17.3.1, 18.4.34 e 18.29.23, respectivamente, parecem estar presentes na grande maioria de moléculas de proBNP (terminal N), isto é, são epítopos do proBNP total. Estes hibridomas foram depositados com o DSMZ em 07/05/03. Os anticorpos produzidos por esses hibridomas representam ferramentas ideais para medição do proBNP total. Se usados sozinhos em um formato de ensaio competitivo ou em combinação entre si ou um PAB reagindo com proBNP total em um ensaio tipo sanduíche, o proBNP total pode ser facilmente medido.
[0078] As linhagens celulares de hibridoma preferidas de acordo com a invenção, MAB<NT-proBNP>1.21.3 (=MAK<NT-proBNP> 1.21.3 = MAB 1.21.3), MAB<NT-proBNP>17.3.1, MAB<NT-proBNP>18.4.34 e MAB<NT-proBNP>18.29.23 foram depositadas, conforme estipulado pelo Tratado de Budapeste, com o reconhecimento internacional do depósito de microorganismos para fins de procedimento de patente, através do Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) Alemanha: [0079] Os anticorpos obtidos das ditas linhagens celulares são as modalidades preferidas da presente invenção.
[0080] Na detecção do proBNP natural, preferencialmente, um anticorpo monoclonal ao proBNP total, conforme descrito acima, é usado em um ensaio tipo sanduíche em combinação com um anticorpo que especificamente se liga ao proBNP natural. Tal ensaio tipo sanduíche resulta depois em um ensaio que especificamente detecta apenas a subpopulação de proBNP natural do proBNP total. Os anticorpos preferidos ao proBNP total em tal ensaio sanduíche para medição do proBNP natural são anticorpos que se ligam substancialmente aos ami- noácidos 13-16, 27-31 e 64-67, respectivamente. Esses epítopos, por exemplo, são reconhecidos pelos MABs 17.3.1, 18.4.34 e 18.29.23, respectivamente. Mais preferencialmente, um anticorpo que se liga aos aminoácidos 27 a 31, como o MAB 18.4.34 é usado em tal ensaio sanduíche ao proBNP natural.
[0081] Todos os líquidos biológicos conhecidos para um especialista na técnica podem ser usados como uma amostra em um método para detecção específica de proBNP natural in vitro. As amostras preferidas para diagnóstico in vitro são os fluidos do corpo, como, sangue, soro, plasma, urina ou saliva. O uso de soro ou plasma, respectivamente, é particularmente preferido.
[0082] Além dos assim chamados testes úmidos, conforme descrito acima, com reagentes de teste em uma fase líquida, todos os formatos de teste seco padronizados à detecção de antígenos, hapte-nos, peptídeos, proteínas, anticorpos, etc., podem também ser usados. Esses testes secos ou tiras de teste, como, por exemplo, descrito no documento de patente EP-A-0 186 799, combinam todos os componentes do teste em um único veículo, exceto a amostra a ser analisada.
[0083] Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um método para diagnóstico de insuficiência cardíaca, compreendendo a detecção de proBNP natural e correlacionando o nível de proBNP natural à presença de insuficiência cardíaca. Como pode ser observado por aqueles versados na técnica, o nível de proBNP natural pode também ser usado para confirmar a ausência ou a gravidade da insuficiência cardíaca.
[0084] É também preferido se utilizar uma medição do proBNP natural no acompanhamento de pacientes com insuficiência cardíaca e no monitoramento do tratamento.
[0085] Uma adicional modalidade preferida se refere a um kit para medição do proBNP natural, compreendendo um anticorpo que especificamente se liga ao proBNP natural e reagentes auxiliares para detecção do proBNP natural.
[0086] Os exemplos, referências, listagem de sequências e figuras são fornecidos àuxiliar o entendimento da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é estabelecido nas reivindicações anexas. Deverá ser entendido que poderão ser feitas modificações nos procedimentos apresentados sem que seja afastado o espírito da presente invenção. Descrição das Figuras Figura 1: Identificação do epítopo ao MAB 1.21.3 [0087] O perfil de reatividade do MAB 1.21.3 foi analisado mediante uso de 69 diferentes peptídeos 8-mer biotinilados, derivados da sequência de proBNP (1-76), cada qual sendo modificado por um amino-ácido, assim, cobrindo a sequência completa de proBNP (1-76). A extinção é dada em unidades mE. Uma forte reatividade foi encontrada aos peptídeos de números 39 a 42.
Figura 2: Instrumentos usados na análise Biacore [0088] A especificidade do proBNP natural dos diversos anticorpos ao proBNP foi examinada usando o modo de operação do analisador Biacore® 3000, conforme disposto na presente figura.
[0089] Programa à determinação de NT-proBNP em 20 amostras de paciente com 8 anticorpos diferentes escrito em Biacore e para ser executado com versão 4.1 do software de controle BIACORE. DEFINE APROG Sandwich PARAM %apo %anr %aco %bnr %bco %c1po %c1nr %c1co %c2po %c2nr %c2co %c3po %c3nr %c3co %c4po %c4nr %c4co KEYWORD anr %anr KEYWORD aco %aco KEYWORD bnr %bnr KEYWORD bco %bco KEYWORD clnr %c1nr KEYWORD clco %c1co KEYWORD c2nr %c2nr KEYWORD c2co %c2co KEYWORD c3nr %c3nr KEYWORD c3co %c3co KEYWORD c4nr %c4nr KEYWORD c4co %c4co CAPTION Sandwich: AG: %anr %aco mit %bnr %bco, AB: %c1nr, %c2nr, %c3nr, %c4nr FLOW 10 -f FLOWPATH 1,2,3,4 DIPNEEDLE r2e1 * QUICKINJECT %apo 100 !calibrator/human serum -0:10 RPOINT -b BL_start FLOW 100 * QUICKINJECT r2f6 50 !HBS FLOW 10 -f FLOWPATH 1 DIPNEEDLE r2e2 * QUICKINJECT %c1po 30 !AB1/5 -0:10 RPOINT -b AG FLOWPATH 2 DIPNEEDLE r2e3 * QUICKINJECT %c2po 30 !AB2/6 -0:10 RPOINT -b AB1 FLOWPATH 3 DIPNEEDLE r2e4 * QUICKINJECT %c3po 30 !AB3/7 -0:10 RPOINT -b AB2 FLOWPATH 4 DIPNEEDLE r2e5 * QUICKINJECT %c4po 30 !AB4/8 -0:10 RPOINT -b AB3 FLOWPATH 1,2,3,4 FLOW 100 * QUICKINJECT r2f7 50 !HBS -0:10 RPOINT -b AB4 FLOW 20 * QUICKINJECT r2e10 5 !HBSwash * QUICKINJECT r2f3 10 !100 mM HCl * QUICKINJECT r2f4 10 !100 mM phosphoric acid * QUICKINJECT r2f5 10 !100 mM phosphoric acid EXTRACLEAN
3:30 RPOINT BL_end !baseline after regen.cycle END DEFINE APROG Regen CAPTION regeneration cycle FLOW 20 FLOWPATH 1,2,3,4 * QUICKINJECT r2e10 5 !HBSwash -0:10 RPOINT -b BL_start * QUICKINJECT r2f3 10 !100 mM HCl * QUICKINJECT r2f4 10 !100 mM phosphoric acid * QUICKINJECT r2f5 10 !100 mM phosphoric acid 3:30 RPOINT BL_end !baseline after regen.cycle END
DEFINE LOOP AG LPARAM %apo %anr %aco %bnr %bco TIMES 1 ! %apo %anr %aco %bnr %bco r2a1 NT-proBNP 40nM HoSer/CMD 20%/1mg/mL
r2a2 NT-proBNP 20nM HoSer/CMD 20%/1mg/mL
r2a3 NT-proBNP 10nM HoSer/CMD 20%/1mg/mL
r2a4 NT-proBNP 5nM HoSer/CMD 20%/1mg/mL
r2a5 NT-proBNP 2.5nM HoSer/CMD 20%/1mg/mL
r2a6 NT-proBNP 0nM HoSer/CMD 20%/1mg/mL
r2b1 HuSer1 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2b2 HuSer2 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2b3 HuSer3 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2b4 HuSer4 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2b5 HuSer5 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2b6 HuSer6 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2b7 HuSer7 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2b8 HuSer8 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2b9 HuSer9 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2b10 HuSer10 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c1 HuSer11 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c2 HuSer12 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c3 HuSer13 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c4 HuSer14 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c5 HuSer15 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c6 HuSer16 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c7 HuSer17 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c8 HuSer18 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c9 HuSer19 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
r2c10 HuSer20 1:5 HBS/CMD 1mg/mL
END
DEFINE LOOP AB LPARAM %c1po %c1nr %c1co %c2po %c2nr %c2co %c3po %c3nr %c3co %c4po %c4nr %c4co TIMES 1 rlal AB1 500nM r1a2 AB2 500nM r1a3 AB3 500nM r1a4 AB4 500nM
r1b1 AB5 500nM r1b2 AB6 500nM r1b3 AB7 500nM r1b4 AB8 500nM
END
MAIN RACK 2 Thermo_a RACK 1 Thermo_c detection 1,2,3,4 LOOP AB ORDER APROG Regen unclog LOOP AG ORDER APROG Sandwich %apo %anr %aco %bnr %bco %c1po %c1nr %c1co %c2po %c2nr %c2co %c3po %c3nr %c3co %c4po %c4nr %c4co ENDLOOP
ENDLOOP APROG Regen APPEND continue END
Figuras 2 a 6: Correlação do MAB 1.21.3 a diversos anticorpos mono- e policlonais anti-proBNP
[0090] 20 soros humanos com uma concentração de proBNP de cerca de 10 mg/mL e acima (conforme determinado através do uso de MAB 1.21.3 e proBNP sintético como calibrador) foram analisados em um ensaio tipo sanduíche usando o analisador Biacore® 3000. Os valores medidos com o MAB 1.21.3 são fornecidos no eixo dos X. Os correspondentes valores determinados com o anticorpo usado no método comparativo são fornecidos no eixo dos Y. As correlações de MAB 1.21.3 a MAB 18.4.34, MAB 18.29.23, PAB 30-38, PAB 44-51 e PAB 41-46 são apresentadas nas figuras 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente.
Exemplo 1 Método de produção de proBNP N-terminal recombinante(1-76) 1. Clonagem do proBNP N-terminal recombinante [0091] A sequência de nucleotídeos do proBNP N-terminal (sequência de aminoácidos 1-76) foi produzida por meio de síntese genética. Para se obter uma expressão ótima do gene em E. coli, a sequência de DNA foi adequada aos códons mais frequentemente usados em E. coli. As sequências dos oligonucleotídeos usadas à produção do gene são as seguintes: [0092] A produção do gene foi realizada com esses iniciadores, usando PCR (reação em cadeia da polimerase). O gene amplificado foi clonado em um vetor adequado, como, por exemplo, o vetor pUC19 e depois sequenciado. À clonagem do gene no vetor de expressão pQE8, o gene foi cortado do vetor pUC19 através de pontos de corte de restrição Bam Hi e Hind III e depois ligado ao vetor pQE8, permitindo uma expressão de proteínas com Tag de Histidina N-terminal e transformado em E. coli M15 [pREP4]. 2. Expressão do proBNP N-terminal em E. coli [0093] Para expressão do gene em E. coli, uma cultura durante a noite de um clone recombinante de E. coli foi transfectada 1/60 em um caldo de Luria (com 100 mg/mL de ampicilina e 50 mg/mL de canamici-na) e induzida em um OD 550 de 1 com IPTG (isopropiltiogalactosida; concentração final de 1 mM). Após a indução, as culturas foram ainda incubadas por 4 horas sob a temperatura de 37°C. Depois as culturas foram centrifugadas e o pélete de célula foi coletado com tampão só dio-fosfato 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM. Após a decomposição da suspensão celular via ultrassom, a suspensão foi centrifugada e o so-brenadante aplicado em uma coluna de triacetato de nitrila (Ni-NTA). Depois de uma etapa de lavagem com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0; NaCl 300 mM; imidazol 20 mM, o proBNP N-terminal marcado com histidina foi eluído com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0; NaCl 300 mM; imidazol 300 mM. As frações eluídas foram coletadas e dialisadas contra Tris 50 mM, pH 8,0. Para separar as impurezas, a diálise foi aplicada a uma coluna de Q-sefarose. A massa do proBNP N-terminal purificada foi determinada através de MALDI-TOF. Essa preparação (igual ao proBNP recombinante) foi encontrada contendo proBNP (1-76) e proBNP (1-66), este último, mais provavelmente, representando um produto de degradação.
Exemplo 2 Síntese de NTproBNP (1-76)amida [0094] NT-proBNP(1-76)amida (protocolo suíço: no. de acesso P16860; aminoácidos 27 a 134) foi sintetizado mediante um protocolo de síntese otimizado de peptídeo de fase sólida (Merrifield (1962) Fed. Proc. Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., 21, 412), em um sintetizador de pep-tídeo ABI 433. Em resumo, o peptídeo foi montado em uma fase sólida de poliestireno modificado por Rink-Linker, repetidamente conjugando um excesso de oito vezes de aminoácidos, cada qual protegido por grupos temporários de piperidina instável Fmoc- e grupos permanentes de ácidos instáveis tBu-, BOC-, OtBu-, Trt- ou Pmc, dependendo da função da cadeia lateral. Para se obter um material oxidante estável, a metionina na posição 10 foi trocada pelo equivalente aminoácido de norleucina. Além disso, para estabilizar contra a degradação pro-teolítica, o C-terminal foi amidado mediante uso da ligação de Rink. Após a montagem, o peptídeo totalmente protegido foi removido da fase sólida e os grupos de proteção permanentes foram liberados me diante tratamento com ácido trifluoroacético em uma mistura de sequestradores de cátions adequados e finalmente isolado através de purificação por HPLC preparatória de fase reversa. Três sínteses em escala de 125 mmol produziram 16,0, 17,1 e 18,0 mg de material puro de pico único purificado por RP-HPLC (liofilizado), respectivamente. A identidade foi provada por espectroscopia de massa MALDI- e ESI [8439.4].
Exemplo 3 Produção e seleção de anticorpos monoclonais contra proBNP total ou natural, respectivamente 1. Obtenção de anticorpos monoclonais contra proBNP N-terminal [0095] Camundongos da espécie Balb/c, de 8-12 semanas, são submetidos à imunização intraperitoneal com um 100 mg de um antí-geno proBNP N-terminal, com adjuvante de Freund completo. ProBNP (1-76) produzido de forma recombinante, assim como sinteticamente por meio de síntese de peptídeo, foi usado como antígeno em camun-dongos. Após 6 semanas, três adicionais imunizações foram executadas em intervalos de 4 semanas. Uma semana depois da última imunização, o sangue foi tomado e a titulação do anticorpo foi determinada no soro dos animais de teste. Do baço de camundongos que reagiram positivamente, são obtidos linfócitos B e submetidos à fusão com uma linhagem celular permanente de mieloma. A fusão é realizada de acordo com o método bem conhecido de Kohler e Millstein (Nature, 256, 1975, páginas 45-497). As culturas primárias dos hibridomas positivos são clonadas de uma maneira usual, por exemplo, mediante uso de um separador de célula comercialmente disponível ou mediante "diluição limitativa".
[0096] À produção de ascite, 5 x 106 células de hibridoma são injetadas pela via intraperitoneal em camundongos da espécie Balb/c, que haviam sido tratados anteriormente 1-2 vezes com 0,5 ml de Pristan.
Depois de 2-3 semanas, ascite líquida pode ser obtida da região intraperitoneal dos camundongos. A partir disto, os anticorpos podem ser isolados da maneira usual. 2. Teste de Seleção ànticorpos monoclonais contra peptídeos proBNP, proBNP sintéticos e proBNP no soro humano, respectivamente [0097] Para identificar a presença de anticorpos contra proBNP na cultura sobrenadante das células de hibridoma, os sobrenadantes foram avaliados de acordo com três seleções de formato de ensaios: a) Reatividade com ProBNP N-terminal sintético Placas de microtitulação (Nunc, Maxisorb) são ligadas com 2,5 mg/mL de NT-proBNP sintético como um antígeno em 100 ml/cavidade de um tampão de carga (Coating Buffer, Catálogo No. 0726559, Scil Diagnos-tics, GmbH), durante 1 hora sob a temperatura ambiente e sob agitação. O pós-carregamento é realizado em tampão PBS (solução salina de fosfato tamponada, Oxid, Code B 14a) e Byco C 1% por 30 minutos. Em seguida, se efetua a lavagem com um tampão de lavagem (solução de cloreto de sódio a 0,9mM, Tween 20 a 0,05%). A incubação da amostra de anticorpo é realizada com 100 ml/cavidade durante 1 hora, sob temperatura ambiente e sob agitação. Uma etapa adicional de lavagem com uma solução de lavagem ocorre duas vezes depois. Em seguida, se realiza uma incubação adicional com a detecção do anticorpo PAB<M-Fcy>, conjugado de peroxidase de cabra-F(ab')2 (Chemicon, Catálogo No. AQ127P), 100 mU/mL, 100 ml/cavidade, durante 1 hora, sob temperatura ambiente e agitação. Após uma etapa adicional de lavagem com tampão de lavagem, a atividade da peroxidase é estabelecida da maneira usual (por exemplo, com ABTS®, por 30 minutos à temperatura ambiente, onde a diferença de extinção é lida em um, em 405 nm, por meio de um leitor de ELISA). b) Caracterização do epítopo usando peptídeos sintéticos ànálise do epítopo [0098] Análise do epítopo, placas de microtitulação carregadas de estreptavidina são incubadas com conjugados de peptídeo-biotina, derivados da sequência de ptoBNP (1-76). A sequência completa de proBNP foi examinada mediante aplicação de peptídeos 69 de 8 mer, modificados através da sequência nas etapas únicas de aminoácidos, isto é, 1-8, 2-9, 3-10, 4-11 até 66-73, 67-74, 68-75 e 69-76, respectivamente. Sequências adicionais biotiniladas foram testadas compreendendo as posições de aminoácido 1-10, 8-18, 1-21, 16-30, 30-38, 32-43, 39-50, 47-57, 50-63, 62-70 e 64-76, respectivamente. Os peptí-deos antigênicos individuais foram dissolvidos em 250 ng/mL de tampão PBS (solução salina de fosfato tamponada, Oxid, Code-BR 14a) com Byco C 0,5%. Para revestimento do peptídeo, 100 ml de cada solução foram distribuídos em cavidades distintas de placas de microtitu-lação, que foram depois suavemente agitadas por 1 hora sob temperatura ambiente. Em seguida, foi realizada a lavagem com um tampão de lavagem (solução de cloreto de sódio a 0,9 mM, Tween 20 a 0,05%). A incubação da amostra do anticorpo e a reação de detecção são executados conforme descrito em (a). Devido a sua reatividade com certos peptídeos NT-proBNP, a posição do epítopo reconhecida por um anticorpo mono- ou policlonal pode ser delineada.
[0099] Um exemplo de uma análise de PepScan é mostrada na figura 1. O anticorpo monoclonal secretado pelo hibridoma 1.21.3 reage de forma intensa com os peptídeos de números 39 a 42. Isso corresponde a um epítopo compartilhado consistindo dos aminoácidos 41 a 46 (SEQ ID NO: 11) do proBNP. c) Reatividade com proBNP em uma amostra de paciente [00100] Cavidades de placas de microtitulação (Nunc, Maxisorb) são revestidos com 5 mg/mL de PAB<proBNP humano>S-IgG (IS (121) ou (30-38)-S-IgG em 100 ml/cavidade de um tampão de carga (Co- ating Buffer, Catálogo No. 0726559, Scil Diagnostics, GmbH), durante 1 hora, sob a temperatura ambiente e sob agitação. O pós-carregamento é realizado em tampão de PBS (solução salina de fosfato tamponada, Oxid, Code-BR 14a) e Byco C 1% por 30 minutos. Em seguida, se efetua a lavagem com um tampão de lavagem (solução de cloreto de sódio a 0,9mM, Tween 20 a 0,05%). A incubação com antí-geno natural em plasma de paciente diluído com tampão de PBS é realizada com 100 ml/cavidade, durante 1 hora, à temperatura ambiente e sob agitação. Após uma adicional etapa de lavagem, a incubação do sobrenadante de hibridoma é realizada com 100 ml/cavidade, durante 1 hora, à temperatura ambiente e sob agitação. Em seguida, uma etapa de lavagem é realizada por duas vezes e uma adicional incubação com a detecção do anticorpo PAB<M-Fcy>, conjugado de peroxidase de cabra-F(ab')2 (Chemicon, Catálogo No. AQ127P), 100 mU/mL, 100 ml/cavidade, durante 1 hora, sob temperatura ambiente e agitação. Após uma adicional etapa de lavagem com tampão de lavagem, a atividade da peroxidase é estabelecida da maneira usual (por exemplo, com ABTS®, por 30 minutos à temperatura ambiente, onde a diferença de extinção é lida em mU, em 405 nm, por meio de um leitor de ELISA).
[00101] Apenas aquelas culturas de hibridoma que reagiram positivamente com proBNP N-terminal produzido sinteticamente ou com proBNP no soro humano, foram posteriormente processadas.
Exemplo 4 Produção de anticorpos monoclonais de ovelha contra BNP 1. Obtenção de anticorpos monoclonais de ovelha contra proBNP N-terminal [00102] As ovelhas foram imunizadas com proBNP N-terminal re-combinante em um adjuvante de Freund completo. A dose foi de 0,1 mg por animal. As imunizações foram repetidas em intervalos de 4 semanas em um período de 10 meses. Depois de 6 semanas da primeira imunização e depois de um mês, as amostras de soro foram obtidas e testadas quanto à sensibilidade e titulação.
[00103] Os linfócitos para fusões foram obtidos a partir de nodos linfáticos de ovelha imunizada. Assim, três dias antes da remoção do nodo linfático, foi feita uma injeção de reforço final com proBNP N-terminal, diretamente em um nodo linfático inguinal de ovelha.
[00104] Após a remoção cirúrgica do nodo linfático, os linfócitos foram preparados e isolados sob condições estéreis. Cerca de 2 x 109 células de um nodo linfático serão armazenadas em nitrogênio líquido com uma densidade de 1 x 108 células/frasco.
[00105] Para realização de fusões, um frasco de 1 x 108 linfócitos de nodo linfático congelado foi descongelado e misturado com células de mieloma/heteromieloma sensíveis à hipoxantina e timidina (camun-dongo NS1 x linfócitos de ovelha, clone 1 C 10, Bioventix, Inc.), em uma proporção de 2:1, com agente de fusão de polietilenoglicol (PEG). [00106] Diversas placas de 96 cavidades foram semeadas com 1-3 x 104 células (ou heteromielomas) por cavidade e cultivadas em um meio de seleção. Depois de 8-10 dias, o exame e seleção de células de hibridoma quanto à reatividade com proBNP N-terminal foram realizados por meio do ensaio ELISA.
[00107] As culturas primárias dos hibridomas positivos foram clona-das da maneira usual mediante uso de um separador de célula comercialmente disponível ou mediante "diluição limitativa". 2. Teste de Seleção ànticorpos monoclonais contra peptídeos proBNP, proBNP sintéticos e proBNP no soro humano, respectivamente [00108] Para identificar a presença de anticorpos contra proBNP na cultura sobrenadante das células de hibridoma, os sobrenadantes foram avaliados de acordo com três seleções de formato de ensaios a) Reatividade com ProBNP N-terminal sintético Placas de microtitulação (Nunc, Maxisorb) são ligadas com 2,5 mg/mL de NT-proBNP sintético como um antígeno em 100 ml/cavidade de um tampão de carga (Coating Buffer, Catálogo N° 0726559, Scil Diagnos-tics, GmbH), durante 1 hora sob a temperatura ambiente e sob agitação. O pós-carregamento é realizado em tampão PBS (solução salina de fosfato tamponada, Oxid, Code B 14a) e Byco C 1% por 30 minutos. Em seguida, se efetua a lavagem com um tampão de lavagem (solução de cloreto de sódio a 0,9mM, Tween 20 a 0,05%). A incubação da amostra de anticorpo é realizada com 100 ml/cavidade durante 1 hora, sob temperatura ambiente e sob agitação. Uma etapa adicional de lavagem com uma solução de lavagem ocorre duas vezes depois. Em seguida, se realiza uma incubação adicional com a detecção do anticorpo IgG anti-ovelha AffinitiPure de asno, conjugado com peroxidase (Dianova, Número de Código 713-035-147), diluído de 1:40000 em tampão de PBS, 100 ml/cavidade, durante 1 hora, sob temperatura ambiente e agitação. Após uma adicional etapa de lavagem com tampão de lavagem, a atividade da peroxidase é estabelecida da maneira usual (por exemplo, com ABTS®, por 30 minutos à temperatura ambiente, onde a diferença de extinção é lida em mU, em 405 nm, por meio de um leitor de ELISA). b) Caracterização do epítopo usando peptídeos sintéticos ànálise do epítopo [00109] Análise do epítopo, placas de microtitulação carregadas de estreptavidina são incubadas com conjugados de peptídeo-biotina, derivados da sequência de ptoBNP (1-76). A sequência completa de proBNP foi examinada mediante aplicação de peptídeos 69 de 8 mer, modificados através da sequência nas etapas únicas de aminoácidos, isto é, 1-8, 2-9, 3-10, 4-11 até 66-73, 67-74, 68-75 e 69-76, respectivamente. Sequências adicionais biotiniladas foram testadas compre endendo as posições de aminoácido 1-10, 8-18, 1-21, 16-30, 30-38, 32-43, 39-50, 47-57, 50-63, 62-70 e 64-76, respectivamente. Os peptí-deos antigênicos individuais foram dissolvidos em 250 ng/mL de tampão PBS (solução salina de fosfato tamponada, Oxid, Code-BR 14a) com Byco C 0,5%. Para revestimento do peptídeo, 100 ml de cada solução foram distribuídos em cavidades distintos de placas de microtitu-lação, que foram depois suavemente agitadas por 1 hora sob temperatura ambiente. Em seguida, foi realizada a lavagem com um tampão de lavagem (solução de cloreto de sódio a 0,9 mM, Tween 20 a 0,05%). A incubação da amostra do anticorpo e a reação de detecção são executados conforme descrito em (a). Devido a sua reatividade com certos peptídeos NT-proBNP, a posição do epítopo reconhecida por um anticorpo mono- ou policlonal pode ser delineada. c) Reatividade com proBNP em uma amostra de paciente [00110] Cavidades de placas de microtitulação (Nunc, Maxisorb) são revestidos com 5 mg/mL de MAB<proBNP humano>M-18.4.34-IgG em 100 ml/cavidade de um tampão de carga (Coating Buffer, Catálogo No. 0726559, Scil Diagnostics, GmbH), durante 1 hora, sob a temperatura ambiente e sob agitação. O pós-carregamento é realizado em tampão PBS (solução salina de fosfato tamponada, Oxid, Code-BR 14a) e Byco C 1% por 30 minutos. Em seguida, se efetua a lavagem com um tampão de lavagem (solução de cloreto de sódio a 0,9mM, Tween 20 a 0,05%). A incubação com antígeno natural em plasma de paciente diluído com tampão PBS é realizada com 100 ml/cavidade, durante 1 hora, à temperatura ambiente e sob agitação. Após uma etapa adicional de lavagem, a incubação do sobrenadante de hibrido-ma é realizada com 100 ml/cavidade, durante 1 hora, à temperatura ambiente e sob agitação. Em seguida, uma etapa de lavagem é realizada por duas vezes e uma adicional incubação com a detecção do anticorpo IgG anti-ovelha AffinitiPure de asno, conjugado com peroxi- dase (Dianova, Número de Código 713-035-147), diluído de 1:40000 em tampão de PBS, com 100 mU/mL, 100 ml/cavidade, durante 1 hora, sob temperatura ambiente e agitação. Após uma etapa adicional de lavagem com tampão de lavagem, a atividade da peroxidase é estabelecida da maneira usual (por exemplo, com ABTS®, por 30 minutos à temperatura ambiente, onde a diferença de extinção é lida em um, em 405 nm, por meio de um leitor de ELISA).
[00111] Apenas aquelas culturas de hibridoma que reagiram positivamente com proBNP N-terminal produzido sinteticamente ou com proBNP no soro humano, foram posteriormente processadas.
Exemplo 5 Produção de anticorpos policlonais contra proBNP N-terminal 1. Imunização [00112] As ovelhas foram imunizadas com proBNP N-terminal re-combinante (ver Exemplo 1) em um adjuvante de Freund completo. A dose foi de 0,1 mg por animal. As imunizações foram repetidas em intervalos de 4 semanas em um período de 10 meses. Depois de 6 semanas da primeira imunização e depois de um mês, as amostras de soro foram obtidas e testadas quanto à sensibilidade e titulação. 2. Purificação dos anticorpos policlonais de soro de ovelha [00113] Partindo do soro bruto de uma ovelha imunizada com proBNP N-terminal recombinante, os componentes de lipídios foram removidos através de deslipidação com Aerosil® (1,5%). Após isso, as imunoglobulinas foram separadas mediante precipitação de sulfato de amônia (2M). O precipitado dissolvido foi dialisado contra KPO4 15 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0 e cromatografado em DEAE sefarose. A fração de IgG (=PAB<NT-proBNP>S-IgG(DE) foi obtida em todo o fluxo. 3. Cromatografia de afinidade para produção de anticorpos policlonais específicos para proBNP total [00114] À purificação por afinidade de anticorpos policlonais que se ligam especificamente ao proBNP total (= PAB<NT-proBNP>S-IgG (IS-1-21) ou resumidamente PAB<1-21>), foi usado o peptídeo HPL-GSPGSASDLETSGLQEQR-C (1-21)21-cys, SEQ ID NO: 7). A matriz de afinidade foi produzida mediante ligação covalente de 1 mg do pep-tídeo (1-21)21-Cys a 2 ml de EAH-Sefarose 4B ativada por maleimida (Amersham Bioscience, Produto No. 17-0569-01).
[00115] Com 10 ml da matriz de afinidade, uma coluna foi empaco-tada e neutralizada com KPO4 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (PBS). Em seguida, 2 g de PAB<NT-proBNP>S-IgG(DE) foram aplicadas à coluna. A coluna foi lavada com PBS e KPO4 20 mM, NaCl 500 mM, Triton X-100 0,1%, ácido Na-dessoxicólico 0,5%, pH 7,5. O IgG especificamente ligado pela matriz de afinidade foi eluído com tampão de eluição de Ag/Ab ImmunoPure® Gentle (pierce, Produto No. 21013), sendo referido como asPAB<1-21>. A matriz de afinidade foi regenerada com ácido propiônico 1M e conservada em PBS/NaN3.
[00116] Um procedimento similar foi aplicado para gerar anticorpos policlonais purificados por afinidade PAB<NT-proBNP>S-IgG(IS, 3038) ou, resumidamente, PAB<30-38>), específicos para proBNP total (Karl J. e outros, documento de patente WO 00/45176). 4. Cromatografia por afinidade à produção de anticorpos policlo-nais específicos para proBNP natural [00117] O anticorpo policlonal ao proBNP natural (= PAB<NT-proBNP>S-IgG (IS-41-46) ou resumidamente PAB<41-46>), foi obtido por meio de cromatografia por afinidade sequencial, Da mesma maneira que a descrita acima, foram usados 3 peptídeos individuais (CEUEU-SLEPLQE ((37-43)37-Cys, SEQ ID NO: 8); CEUEU-SPRPTGVW ((44-51)44-Cys, SEQ ID NO: 9); e C-EPLQESPRPTG ((39-50)39-Cys, SEQ ID NO: 10) (EUEU simplesmente funciona como um ligador prolongado ao peptídeo que vem atrás) à produção de três matrizes de afinidade individuais. PAB<NT-proBNP>S-IgG(DE) foi pri meiro aplicado à matriz de afinidade compreendendo o peptídeo (37-43)37-Cys para remover todo o anticorpo policlonal que se liga principalmente à sequência 37-43 de NT-proBNP. O fluxo inteiro foi depois aplicado à segunda matriz de afinidade compreendendo o peptídeo (44-51)44-Cys, para capturar os anticorpos policlonais que se ligam principalmente à sequência 44-51 de NT-proBNP. Os anticorpos ligados foram eluídos e coletados conforme descrito acima (=PAB<44-51>). Finalmente, o fluxo através da segunda purificação por afinidade foi passado sobre a terceira matriz de afinidade compreendendo o peptídeo (39-50)39-Cys. Os anticorpos ligados foram eluídos e coletados conforme descrito acima. Conforme determinado pelo método conhecido e referenciado como análise de PepScan, os anticorpos eluídos da terceira matriz de afinidade são específicos aos epítopos na sequência 41-46 (=PAB<41-46>), que representam os epítopos restantes da sequência de sobreposição entre 37-43 e 44-51.
Exemplo 6 Análise de Biacore de anticorpos monoclonais e policlonais ao proBNP
[00118] A especificidade de anticorpos monoclonais e policlonais ao proBNP natural foi determinada por meio de ressonância de plasmon de superfície, usando um analisador Biacore 3000. Todas as medições de ressonância de plasmon de superfície foram realizadas sob a temperatura de 25°C usando o analisador Biacore 3000 equipado com um chip sensor CM5 de grau de pesquisa. O tampão de processamento foi HBS (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM e Polissorbato 20 (P20) 0,005%, em pH de 7,4).
1. Imobilização do ligante PAB<NT-proBNP, 1-21>S-IgG
[00119] O ligante que foi usado como anticorpo de captura ao NT-proBNP total foi imobilizado usando química de acoplamento de amina. Antes do acoplamento, o chip sensor foi pré-condicionado para uma vazão de 20 μΙ/min, através de injeções de 10 μΙ de SDS a 0,1%, NaOH 50 mM, HCl 10 mM e ácido fosfórico 100 mM. As superfícies de todas as células do fluxo foram ativadas por 5 minutos com uma mistura 1:1 de N-hidroxissucinimida (NHS) 0,1M, e 3-(N,N-dimetilamino)propil-N-etilcarbodiimida (EDC) 0,1M, a uma vazão de 20 ml/min. O ligante em uma concentração de 30 ml/mL em acetato de sódio 10 mM, pH de 5,0, foi injetado em todas as 4 células de fluxo durante 5 minutos. As superfícies foram bloqueadas com uma injeção de 5 minutos de etanolamina 1M, pH de 8,0, seguido de 30 injeções de uma solução de lavagem HBS (Hepes 100 mM, pH 7,4, NaCl 1,5M, EDTA 3,4M, Polissorbato 20 (P20) 0,05%, DMSO 2%), HCl 100 mM e 2 x ácido fosfórico 100 mM, para remover o ligante ligado de modo não-covalente. A densidade do ligante foi de cerca de 16.000 RU. 2. Medições de concentração de NT-proBNP em amostras de paciente [00120] Para executar o método seguinte através do Biacore 3000, foi utilizado o programa apresentado na figura 2. NT-proBNP(1-76)amid em concentrações de 0, 2,5, 5, 10, 20 e 40 nM em soro de cavalo a 20% (soro de cavalo diluído a 1:5 com HBS + 1 mg/mL de carboximetildextrano) foi usado como calibrador. A adição de carboxi-metildextrano foi usada para suprimir a ligação não-específica dos componentes do soro à superfície do chip sensor.
[00121] Amostras de paciente com >10 ng/mL de NT-proBNP natural foram diluídas a 1:5 com HBS também contendo 1 mg/mL de car-boximetildextrano.
[00122] O calibrador e as amostras de paciente foram injetadas a uma vazão de 10 ml/min durante 10 minutos em todas as quatro células de fluxo, seguido de uma injeção de HBS por 30 segundos a uma vazão de 100 ml/min para remover os componentes de soro não especificamente ligados. O anticorpo cuja especificidade tinha de ser de terminada foi injetado em uma concentração de 500 nM em HBS por 3 minutos, a uma vazão de 10 ml/min. O anticorpo 1 foi injetado na célula de fluxo 1, anticorpo 2 na célula de fluxo 2, etc. Os dados da ligação dos anticorpos em RU foram determinados como a diferença entre a resposta 10 segundos antes da injeção de um anticorpo e a resposta 10 segundos antes da injeção do anticorpo seguinte ou HBS, respectivamente.
[00123] Ao cálculo das concentrações de NT-proBNP em amostras de paciente foi usado o programa BIAevaluation, versão 4.1. Para cada anticorpo foi gerada uma curva de calibração de NT-proBNP(1-76)amida sintético, usando uma tira flexível de traçar curvas e as correspondentes concentrações de amostras de paciente diluídas de 1:5 foram calculadas. As concentrações foram multiplicadas por 5 para se obter as concentrações de NT-proBNP nos soros diluídos. 3. Determinação da especificidade de um anticorpo [00124] A fim de determinar se um anticorpo se liga ao NT-proBNP natural ou total no soro humano, as concentrações de NT-proBNP determinadas com o anticorpo em questão (eixo dos Y) foram plotadas contra as concentrações da correspondente amostra determinada com o anticorpo de referência MAB 1.21.3 (eixo dos X). Uma curva de regressão linear do tipo y = ax + b foi adotada, usando o programa MS-Excel e o coeficiente de correlação "r" e a inclinação foram calculados. Tabela 1 - Características dos diversos anticorpos anti-proBNP (+++) indica que o proBNP sintético e o proBNP em uma amostra de paciente são reconhecidos de forma bastante satisfatória e, por similar extensão, (+) indica uma reação na faixa de 15% com o proBNP em uma amostra de paciente, quando comparado ao valor obtido com proBNP sintético.
[00125] Da Tabela 1, é facilmente evidente que a grande maioria dos epítopos proBNP parecem estar presentes da mesma maneira no proBNP sintético e no proBNP compreendidos em uma amostra de paciente. Isto é exemplificado por MAB 17.3.1, MAB 18.4.34, MAB 28.29.13 e PAB<1-21>, respectivamente.
[00126] Um epítopo, entretanto, parece não estar presente no proBNP sintético e proBNP quando compreendido em uma amostra de paciente da mesma maneira. Esse epítopo consiste substancialmente dos aminoácidos 41-44 e é reconhecido por MAB 1.21.3, assim como, por PAB <41-46>. Parece que usando esses reagentes imunológicos, apenas uma subpopulação do proBNP total presente em uma amostra de paciente é reconhecida.
[00127] Isso leva a resultados acentuadamente diferentes quando se mede o proBNP em uma amostra de paciente com um ensaio para proBNP total ou um ensaio para proBNP natural, respectivamente. Apenas essa subpopulação do proBNP total parece ser portadora de uma característica de epítopo do proBNP natural.
[00128] Com é óbvio das figuras 3 a 7, que PAB<41-46> mostra uma correlação bastante satisfatória ao MAB 1.21.3, enquanto que os anticorpos de proBNP total, isto é, MAB 18.4.34, MAB 18.19.23 e PAB 30-38 mostram uma correlação muito mais baixa relativamente ao MAB 1.21.3. De forma interessante, PAB <44-51> parece ser de reati- vidade mista e não se classifica como um anticorpo que especificamente se liga ao proBNP natural, pelo fato de se correlacionar a um valor de r menor que 0,95 relativamente ao MAB 1.21.3.
Exemplo 7 Comparação clínica de ensaios para proBNP natural e total, respectivamente [00129] Em um estudo clínico, 246 amostras de pacientes classificadas de acordo com o seu status de NYHA, foram analisadas por meio de imunoensaios tipo sanduíche ao proBNP natural e proBNP total, respectivamente. Os resultados desse estudo são fornecidos na Tabela 2.
Tabela 2: Análise comparativa de proBNP natural e proBNP total em amostras de paciente [00130] Um fato clinicamente bastante importante é a diferenciação de pacientes sem nenhuma ou com uma doença em uma forma muito branda (classes de NYHA 0 e 1) comparado a pacientes com progressão de doença (NYHA X = classes 2 ou mais). Conforme pode ser visto da Tabela 2, ocorre um significativo aumento da classe 0/1 à classe 2 e classes mais altas. Esse aumento às classes 2, 3 e 4 é mais pronunciado ao proBNP natural, comparado ao proBNP total. Isso se traduz em um melhor perfil de sensibilidade/especificidade e utilidade clínica ao proBNP natural, quando se comào proBNP total.
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Claims (7)
1. Anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao proBNP, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo que se liga a um epítopo consistindo nos aminoácidos 42-46, do NT-proBNP, e, em termos de valores ao proBNP, como determinados em amostras de paciente utilizando o dito anticorpo, se correlaciona com um valor de r de pelo menos r = 0,95 ou acima dos valores para proBNP, como determinado nas ditas amostras utilizando o anticorpo monoclonal MAB 1.21.3, produzido pela linhagem celular de hibridoma depositada sob número de acesso DSM ACC2650 no DSMZ e sendo que o dito valor de r é determinado por análise de regressão linear, em que é MAB 1.21.3 produzido pela linhagem celular de hibridoma depositada sob número de acesso DSM ACC2650 no DSMZ.
2. Método para detecção específica de proBNP in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de contatar uma amostra suspeita ou conhecida de conter proBNP com um anticorpo para proBNP, como definido na reivindicação 1, sob condições que permitem a formação de um complexo anticorpo para proBNP-proBNP e detecção do complexo formado.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita detecção é executada por meio de um imuno-ensaio competitivo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita detecção é executada por meio de um imuno-ensaio tipo sanduíche, sendo que é também usado um segundo anticorpo para proBNP e sendo que o dito segundo anticorpo para proBNP e o anticorpo para proBNP, como definido na reivindicação 1, ambos se ligam a mesma sub-população de proBNP, formando assim, um segundo complexo de anticorpo anti-proBNP-proBNP-anticorpo anti-proBNP.
5. Método para diagnóstico de insuficiência cardíaca in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção específica de proBNP utilizando um anticorpo, como definido na reivindicação 1, e correlacionando o nível de proBNP à insuficiência cardíaca.
6. Kit para medição de proBNP, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo, como definido na reivindicação 1, e reagentes auxiliares para detecção do proBNP.
7. Linhagem celular de hibridoma MAB 1.21.3, caracterizada pelo fato de que foi depositada no DSMZ sob número de acesso DSM ACC2650.
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