CN111487222B - 一种检测bnp的spr芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高特异性和高灵敏性SPR芯片的制备方法。它包括以下步骤：(1)制备特异性适体修饰的金纳米颗粒；(2)制备抗体功能化修饰的磁纳米颗粒；(3)制备适体修饰的SPR芯片。本发明使用灵敏的SPR技术检测极微量的目标物BNP，该方法利用抗体功能化修饰的磁纳米颗粒结合BNP，高特异适体修饰的金纳米颗粒进行高特异性筛选，起到双重选择的效果，同时通过级联缀合能形成大的复合物，从而连接在SPR芯片上，导致SPR角度的显著增大，能检测低至pg级的微量BNP；本发明同时结合特异性抗体和适体，改善了传统的抗原抗体法所出现的假阳性问题，检测时间短，操作方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测BNP的SPR芯片的制备方法，属于BNP检测技术领域。
背景技术
脑尿钠肽(BNP)是由心肌细胞分泌的由32个氨基酸组成的一种短肽，已作为标准的分子生物标志物在慢性心力衰竭(HF)的诊断和预后中提供重要生理病理信息。临床上以BNP 100pg/ml作为临界值的隐形预测值达到90％，可以减少74％的临床不确定性；而BNP超过400pg/ml提示患者存在心力衰竭的可能性达到95％。由于BNP的含量低至pg级别和生物样本的复杂性，因此与其他心血管生物标志物相比，BNP的检测更具挑战性。另外，BNP具有20分钟的短的半衰期，这意味着需要高特异性的快速灵敏的对其进行检测。这可能也是迄今为止所报道的检测真实样本的BNP传感器数量有限的原因。目前已经开发了一些检测BNP的方法，包括试剂盒和荧光免疫测定等。试剂盒操作方便，但是在检测中容易出现假阳性的结果；荧光免疫法检测较为准确，但操作较为复杂，且灵敏度不高。因此限制了进一步的应用。
表面等离子共振技术(SPR)是一种灵敏检测芯片上配位体与目标生物分子相互作用的领先技术，其应用SPR原理检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况，广泛应用于各个领域。该技术检测过程方便快捷，灵敏度高，应用范围非常广泛，且可进行实时动态检测,这种方法成为生物分子相互作用研究中的既定工具，并且它被用于快速和灵敏地检测化学和生物分析物。表面等离子共振生物传感器(surface plasmonresonancebiosensor)，即SPR芯片，是基于生物分子在识别并形成复合物过程中，引起界面折射率变化与一定波长的入射光在界面形成的反射光衰减程度存在直接的相关性的原理而研制的一种光学检测仪器。而适体修饰的SPR芯片能够与目标物BNP结合，利用激光在SPR芯片上的折射率会发生改变，由此利用SPR的光学变化来灵敏的检测BNP。
然而，对于在更加复杂的样本如血清中准确检测低至pg级别的BNP来说,常规的SPR方法应用受限。为了更好的增强SPR的响应以增大目标分子所产生的光学信号，将等离子体纳米结构与SPR相结合是一种吸引人的技术创新。
近些年来，纳米材料技术迅速发展并被广泛应用于多个领域。纳米材料本身具有表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等优良特性，使其在发展新型高灵敏度、高稳定性、低成本生物传感器领域成为国内外研究热点。在各种类型的纳米粒子中，金纳米颗粒具有大的比表面积，高的表面自由能，可在颗粒表面固定大量的生物识别分子；近年来，磁性纳米粒子因具有利用外部静磁场有效分离复杂介质中分析物的能力引起了越来越多的关注，并逐渐应用于快速分离真实样本如血清或血液中的目标物。
基于抗原抗体相互作用的酶联免疫吸附测定(ELISA)技术自开发以来在各分析领域应用广泛，取代了放射免疫测定，适用于各种测试，并且比放射免疫测定法更安全。然而，单纯依赖于抗体结合抗原来检测目标物具有一定缺点。除了不同批次抗体之间的差异外，还容易在检测中出现假阳性的结果。这些问题需要采用各种方法来改进单纯的ELISA方法，在不同选择中，探针模块化的适体与特异性的抗体相结合代替靶捕获剂是理想的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供一种检测BNP的SPR芯片的制备方法，它解决了目前通过SPR传感器检测BNP时，由于目标物体积小，检测不够灵敏，以及传统抗原抗体法容易出现假阳性的问题。
本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：
一种检测BNP的SPR芯片的制备方法，它包括以下步骤：
(1)制备特异性适体修饰的金纳米颗粒：将BNP适体修饰在金纳米颗粒上；
(2)制备抗体功能化修饰的磁纳米颗粒：将BNP抗体修饰在磁纳米颗粒上；
(3)制备适体修饰的SPR芯片：将BNP适体修饰在整个SPR芯片的金片上；
(4)SPR光学检测BNP：
a.向待测BNP溶液中加入过量的抗体功能化修饰的磁纳米颗粒，抗体功能化修饰的磁纳米颗粒通过BNP抗体与BNP溶液中的目标物BNP抗原完全结合；
b.再向上述混合液中加入过量的特异性适体修饰的金纳米颗粒，特异性适体修饰的金纳米颗粒上的BNP适体进一步结合目标物BNP抗原的另一个位点，特异性适体修饰的金纳米颗粒、抗体功能化修饰的磁纳米颗粒与BNP抗原三者形成一个大的复合物；
c.通过外部磁场进行磁分离，去除混合液中未结合的特异性适体修饰的金纳米颗粒，剩余复合物重悬于等量的磷酸缓冲盐溶液PBS中；
d.将重悬后的混合液加入适体修饰的SPR芯片上进行特异性反应，反应时间10分钟，复合物中的金纳米颗粒上的BNP适体和SPR芯片上的互补链结合，将复合物链接到SPR芯片表面，之后用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗，通过SPR仪器在SPR芯片上进行检测，得到检测结果。
作为优选实例，所述特异性适体修饰的金纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
a.选取粒径为20nm左右的金纳米颗粒；
b.将质量浓度为0.05％的氯金酸溶液加入到装有回流冷凝装置的圆底烧瓶中，加热并快速搅拌，当氯金酸溶液沸腾20～30分钟后，一次性快速加入约3.5mL质量浓度为5％的柠檬酸三钠溶液，再持续加热150分钟，当溶液颜色逐渐变为酒红色之后，使其冷却至室温，用高速离心机对上述反应物进行离心(转速10000rpm，时间20～30min)，除去上清液，然后加入等体积的磷酸缓冲盐溶液PBS进行复溶，得到BNP适体溶液，于4℃储存备用；
c.向990μL金纳米颗粒中加入10μLBNP适体溶液修饰，得到金纳米颗粒的修饰溶液，取上述金纳米颗粒溶液,用高速离心机进行离心(转速10000rpm，时间10～20min)，除去上清液，然后加入等体积的磷酸缓冲盐溶液PBS进行复溶，即可得到特异性适体修饰的金纳米颗粒。
作为优选实例，所述抗体功能化修饰的磁纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
a.在体积为1mL、浓度为1mg/mL的磁纳米颗粒溶液，加入体积为10ul、浓度为1mg/ml的BNP抗体；
b.用磷酸缓冲盐溶液PBS洗三次后,磁纳米颗粒与特异性的BNP抗体的体积比控制为(90～110):1，反应时间为20～30分钟；
c.通过外部磁场对磁纳米颗粒进行磁分离，去除未结合的BNP抗体，弃上清液，磁纳米颗粒重悬于磷酸缓冲盐溶液PBS中，即得到抗体功能化的磁纳米颗粒。
作为优选实例，所述适体修饰的SPR芯片制备方法，包括以下步骤：
a.将SPR芯片的金片用水虎鱼洗液(98％H2SO4:30％H2O2＝3:1)浸泡30秒，之后用超纯水彻底清洗，氮气吹干备用；
b.取100-200μL浓度为1μM的BNP适体溶液加到金片上，光反应30-50分钟，通过金-巯键将BNP适体的互补链修饰到SPR芯片表面，反应完成后，用超纯水清洗金片，氮气吹干，即得到适体修饰的SPR芯片。
本发明的有益效果是：
(1)本发明使用灵敏的SPR技术检测极微量的目标物BNP，该方法利用抗体功能化修饰的磁纳米颗粒结合BNP，高特异适体修饰的金纳米颗粒进行高特异性筛选，起到双重选择的效果，同时通过级联缀合能形成大的复合物，从而连接在SPR芯片上，导致SPR角度的显著增大，能检测低至pg级的微量BNP；
(2)本发明同时结合特异性抗体和适体，改善了传统的抗原抗体法所出现的假阳性问题，检测时间短，操作方便；
(3)本发明利用功能化的磁纳米颗粒，能很容易的从复杂样本中分离目标物BNP，大大简化了预处理步骤。
附图说明
图1为实施例1中不同浓度的BNP溶液在SPR仪上的检测后的标准曲线图。
具体实施方式
为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面进一步阐述本发明。
实施例1
一种检测BNP的SPR芯片的制备方法，它包括以下步骤：
(1)制备特异性适体修饰的金纳米颗粒：将BNP适体修饰在金纳米颗粒上；
(2)制备抗体功能化修饰的磁纳米颗粒：将BNP抗体修饰在磁纳米颗粒上；
(3)制备适体修饰的SPR芯片：将BNP适体修饰在整个SPR芯片的金片上；
(4)SPR光学检测BNP：
a.向待测BNP溶液中加入过量的抗体功能化修饰的磁纳米颗粒，抗体功能化修饰的磁纳米颗粒通过BNP抗体与BNP溶液中的目标物BNP抗原完全结合；
b.再向上述混合液中加入过量的特异性适体修饰的金纳米颗粒，特异性适体修饰的金纳米颗粒上的BNP适体进一步结合目标物BNP抗原的另一个位点，特异性适体修饰的金纳米颗粒、抗体功能化修饰的磁纳米颗粒与BNP抗原三者形成一个大的复合物；
c.通过外部磁场进行磁分离，去除混合液中未结合的特异性适体修饰的金纳米颗粒，剩余复合物重悬于等量的磷酸缓冲盐溶液PBS中；
d.将重悬后的混合液加入适体修饰的SPR芯片上进行特异性反应，反应时间10分钟，复合物中的金纳米颗粒上的BNP适体和SPR芯片上的互补链结合，将复合物链接到SPR芯片表面，之后用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗，通过SPR仪器在SPR芯片上进行检测，得到检测结果。
特异性适体修饰的金纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
a.选取粒径为20nm左右的金纳米颗粒；
b.将质量浓度为0.05％的氯金酸溶液加入到装有回流冷凝装置的圆底烧瓶中，加热并快速搅拌，当氯金酸溶液沸腾20～30分钟后，一次性快速加入约3.5mL质量浓度为5％的柠檬酸三钠溶液，再持续加热150分钟，当溶液颜色逐渐变为酒红色之后，使其冷却至室温，用高速离心机对上述反应物进行离心(转速10000rpm，时间20～30min)，除去上清液，然后加入等体积的磷酸缓冲盐溶液PBS进行复溶，得到BNP适体溶液，于4℃储存备用；
c.向990μL金纳米颗粒中加入10μLBNP适体溶液修饰，得到金纳米颗粒的修饰溶液，取上述金纳米颗粒溶液,用高速离心机进行离心(转速10000rpm，时间10～20min)，除去上清液，然后加入等体积的磷酸缓冲盐溶液PBS进行复溶，即可得到特异性适体修饰的金纳米颗粒。
抗体功能化修饰的磁纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
a.在体积为1mL、浓度为1mg/mL的磁纳米颗粒溶液，加入体积为10ul、浓度为1mg/ml的BNP抗体；
b.用磷酸缓冲盐溶液PBS洗三次后,磁纳米颗粒与特异性的BNP抗体的体积比控制为(90～110):1，反应时间为20～30分钟；
c.通过外部磁场对磁纳米颗粒进行磁分离，去除未结合的BNP抗体，弃上清液，磁纳米颗粒重悬于磷酸缓冲盐溶液PBS中，即得到抗体功能化的磁纳米颗粒。
适体修饰的SPR芯片制备方法，包括以下步骤：
a.将SPR芯片的金片用水虎鱼洗液(98％H2SO4:30％H2O2＝3:1)浸泡30秒，之后用超纯水彻底清洗，氮气吹干备用；
b.取100-200μL浓度为1μM的BNP适体溶液加到金片上，光反应30-50分钟，通过金-巯键将BNP适体的互补链修饰到SPR芯片表面，反应完成后，用超纯水清洗金片，氮气吹干，即得到适体修饰的SPR芯片。
工作原理：首先，通过化学方法将BNP抗体修饰在磁纳米颗粒上，用以结合溶液中的目标物BNP抗原，由于磁纳米颗粒的磁性，可通过外部磁铁进行磁分离去除未结合的BNP抗原；然后加入修饰有BNP适体的金纳米颗粒，BNP适体可以进一步结合BNP抗原的另一个位点，起到双重结合BNP的作用，通过磁分离，去除混合液中未结合的特异性适体修饰的金纳米颗粒，因此避免出现假阳性的问题，这种级联缀合的方式可以形成一个大的复合物。通过金-巯键将BNP适体的互补链修饰到SPR芯片表面，目的是后续用于和BNP适体结合，即复合物中金纳米颗粒上的BNP适体可以和SPR芯片上的互补链结合，将复合物加入到SPR芯片表面，由于芯片上结合了大的复合物，因此激光在SPR芯片上的折射率会发生改变，由此利用SPR的光学变化来灵敏的检测BNP。
在检测样品目标物BNP浓度之前，先制作SPR角的变化(ΔSPR Angle，单位m°)随BNP溶液浓度变化的标准曲线。以后根据待测样品检测的SPR角的变化，与标准曲线对比，得到BNP浓度的检测结果。
标准曲线制作的具体步骤如下：
按照一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法的四个步骤，分别采用多份不同浓度的BNP溶液进行检测，标准曲线的BNP溶液浓度分别为：100fg/ml，1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml，400pg/ml，1ng/ml，10ng/ml。
测试条件：使用SPR仪，以10-20min作为孵育时间，在室温条件下进行不同浓度BNP作用下的SPR测定。
如图1所示，随着BNP溶液浓度的增大，形成的大的复合物造成的SPR角的变化也越大。能够更加灵敏的检测到低浓度的BNP的含量。
本方法不仅能通过检测BNP浓度，还能检测BNP类似的疾病标志物。例如：心血管疾病生物标志物，诊断心衰公认的标志物除了B型利钠肽(BNP)，还包括N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)、可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)。检测心肌受损的特异性和敏感性均高的标志物是心肌肌钙蛋白T或I(CTnT或CTnI)、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶CK-MB。反映炎症标志物有高敏C反应蛋白(hs-CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)。急性冠状动脉综合症和急性心梗生物标志物生长分化因子15(GDF15)、心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)等。心功能不全(HF)生物标志物有骨桥蛋白(OPN)、生长分化因子15(GDF15)等。动脉粥样硬化生物标志物有脂蛋白磷脂酶A(LP-PLA)、载脂蛋白A1(ApoA1)、D-二聚体(D-Dimer)等。脂质风险生物标志物有低密度脂蛋白LDL、脂蛋白相关磷脂酶A2(LP-PLA2)等。它们都具有共同的特点，即这些标志物均具有不同的2个位点用来实现标志物的检测，制备、筛选一个抗体和一个适体进行配对，分别结合心血管疾病生物标志物的不同2个位点用来实现标志物的检测。因此，本方法除了能够BNP标志物，还能够检测同类标志物。
本发明使用灵敏的SPR技术检测极微量的目标物BNP，该方法利用抗体功能化修饰的磁纳米颗粒结合BNP，高特异适体修饰的金纳米颗粒进行高特异性筛选，起到双重选择的效果，同时通过级联缀合能形成大的复合物，从而连接在SPR芯片上，导致SPR角度的显著增大，能检测低至pg级的微量BNP；本发明同时结合特异性抗体和适体，改善了传统的抗原抗体法所出现的假阳性问题，检测时间短，操作方便；本发明利用功能化的磁纳米颗粒，能很容易的从复杂样本中分离目标物BNP，大大简化了预处理步骤。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本发明要求保护的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (1)
1.一种检测BNP的SPR芯片的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)制备特异性适体修饰的金纳米颗粒：将BNP适体修饰在金纳米颗粒上，具体包括：
a.选取粒径为20nm左右的金纳米颗粒；
b.将质量浓度为0.05％的氯金酸溶液加入到装有回流冷凝装置的圆底烧瓶中，加热并快速搅拌，当氯金酸溶液沸腾20～30分钟后，一次性快速加入约3.5mL质量浓度为5％的柠檬酸三钠溶液，再持续加热150分钟，当溶液颜色逐渐变为酒红色之后，使其冷却至室温，用高速离心机对上述反应物进行离心，转速10000rpm，时间20～30min，除去上清液，然后加入等体积的磷酸缓冲盐溶液PBS进行复溶，得到BNP适体溶液，于4℃储存备用；
c.向990μL金纳米颗粒中加入10μLBNP适体溶液修饰，得到金纳米颗粒的修饰溶液，取上述金纳米颗粒溶液,用高速离心机进行离心，转速10000rpm，时间10～20min，除去上清液，然后加入等体积的磷酸缓冲盐溶液PBS进行复溶，即可得到特异性适体修饰的金纳米颗粒；
(2)制备抗体功能化修饰的磁纳米颗粒：将BNP抗体修饰在磁纳米颗粒上，具体包括：
a.在体积为1mL、浓度为1mg/mL的磁纳米颗粒溶液，加入体积为10ul、浓度为1mg/ml的BNP抗体；
b.用磷酸缓冲盐溶液PBS洗三次后,磁纳米颗粒与特异性的BNP抗体的体积比控制为90～110:1，反应时间为20～30分钟；
c.通过外部磁场对磁纳米颗粒进行磁分离，去除未结合的BNP抗体，弃上清液，磁纳米颗粒重悬于磷酸缓冲盐溶液PBS中，即得到抗体功能化的磁纳米颗粒；
(3)制备适体修饰的SPR芯片：将BNP适体修饰在整个SPR芯片的金片上，具体包括：
a.将SPR芯片的金片用水虎鱼洗液，浸泡30秒，之后用超纯水彻底清洗，氮气吹干备用；
b.取100-200μL浓度为1μM的BNP适体溶液加到金片上，光反应30-50分钟，通过金-巯键将BNP适体的互补链修饰到SPR芯片表面，反应完成后，用超纯水清洗金片，氮气吹干，即得到适体修饰的SPR芯片。
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