DE602005001299T2 - Kombinationen von Markern zum Nachweis von typ 1 und 2 Diabetes - Google Patents

Kombinationen von Markern zum Nachweis von typ 1 und 2 Diabetes Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Risikostratifizierung von Patienten, die an Diabetes leiden.
  • Zurzeit werden Diabetes-Patienten allgemein als eine homogene Gruppe behandelt, die nur in Typ-1- und Typ-2-Diabetes-Patienten unterteilt ist. Tatsächlich stellen Diabetes-Patienten eine sehr heterogene Gruppe dar. Viele Patienten leiden an Komorbiditäten wie kardiovaskulärer Krankheit oder Entzündungskrankheit. Es werden individualisierte Behandlungsregime benötigt, um den Bedürfnissen dieser Patienten gerecht zu werden. Eine Voraussetzung für eine individualisierte Behandlung ist aber die verlässliche Diagnose jeglicher Komorbiditäten oder einer spezifischen oder prädominanten Manifestation, die an der Krankeitsprognose beteiligt ist oder die für Komplikationen indikativ ist, die von einer spezifischen, in einem bestimmten Patienten vorliegenden Krankheit herrühren.
  • Gegenwärtige diagnostische Werkzeuge sind für diese Zwecke unzureichend. Zum Beispiel wird eine kardiovaskuläre Krankheit von Allgemeinmedizinern häufig fehldiagnostiziert (Svendstrup Nielsen, L. et al. (2003). N-terminal pro-brain natriuretic peptide for discriminating between cardiac and non-cardiac dyspnoea. The European Journal of Heart Failure). Daher werden einfache und verlässliche diagnostische Werkzeuge gebraucht, besonders für Allgemeinmediziner und/oder Ärzte, die auf die Diabetes-Behandlung spezialisiert sind.
  • Die Verwendung von biochemischen oder molekularen Markern für die Diagnose ist als solche bekannt. Diabetes bewirkt aber eine Störung vieler Körperfunktionen und infolgedessen eine Störung der Spiegel potentieller biochemischer oder molekularer Macker. Es ist nicht bekannt, welcher/welche Marker nützliche Informationen über den physiologischen oder pathologischen Zustand eines Diabetes-Patienten hervorbringt/hervorbringen.
  • Es hat zahlreiche Versuche gegeben, zu bestimmen, ob das Brain Natriuretic Peptide (BNP) als ein biochemischer Marker in Diabetes-Patienten verwendet werden kann. Yano et al. (1999) fanden heraus, dass BNP ein Hinweis auf Nierenkomplikationen in Typ-2-Diabetes-Patienten sein kann (Yano Y., Katsuki, A., et al. (1999). Plasma brain natriuretic peptide levels in normotensive noninsulin-dependent diabetic patients with microalbuminuria. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, vol. 84(7), pp. 2353–2356). Dieses Ergebnis wurde von Isotani et al. (2000) in Frage gestellt, der mutmaßt, dass erhöhtes Plasma-BNP vielmehr ein Zeichen einer kardialen Dysfunktion ist (Isotani H., Kameoka K., et al (2000). Plasma Brain Natriuretic Peptide levels in normotensive type 2 diabetic patients without cardiac disease. Diabetes Care, vol. 23 (6), pp. 859–860). Siebenhofer et al. (2002) stellen fest, dass die Studien in normotensiven Typ-2-Diabetes-Patienten in Bezug auf die erhöhten BNP-Spiegel in Patienten mit Mikroalbuminurie unschlüssig waren. Siebenhofer et al. (2002) haben gefunden, dass NT-proBNP Spiegel in Patienten mit Albuminurie erhöht sind. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass die Rolle von NT-proBNP in Patienten mit diabetischer Nephropathie und anderen Komorbiditäten unklar war.
  • Kardiovaskuläre Komplikationen bleiben in Diabetes-Patienten häufig unbemerkt, da Diabetes-Patienten oft an Neuropathie oder einem Mangel an Schmerzempfindlichkeit leiden. Beispielsweise können Diabetes-Patienten an einer Herzkrankheit leiden, ohne das kennzeichnende Symptom Brustschmerzen wahrzunehmen. Ebenso wird Mikroangiopathie in Diabetes-Patienten häufig nicht erkannt, bevor ein irreversibler Gewebeschaden aufgetreten ist.
  • WO 2004/046722 betrifft neue Marker für vaskuläre Entzündung wie sCD40L, P1GF und BNP sowie Kombinationen davon, die als diagnostische und prognostische Werkzeuge in Patienten verwendet werden, die an kardiovaskulären Krankheiten leiden, umfassend auch eine Anzahl an Diabetes-Patienten. Die Erfindung betrifft auch die Erstellung eines individuellen Risikoprofils von negativen Ereignissen, die mit dem Fortschreiten von Arteriosklerose verbunden sind. Dieses Dokument offenbart aber nicht, dass diese Marker für die Diagnose von Diabetes-Patienten ohne eine Vorgeschichte kardiovaskulärer Komplikationen nützlich sein könnten.
  • Zusätzlich können einige Diabetes-Arzneimittel kardiotoxische Effekte haben (beispielsweise durch einen Anstieg des Blutvolumens) und sollten nur an Patienten verabreicht werden, die nicht an einer kardiovaskulären Komplikation leiden oder gefährdet sind, an einer kardiovaskulären Komplikation zu leiden.
  • Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Methoden und Mittel für die Risikostratifizierung und/oder Identifizierung von Komorbiditäten, besonders von kardiovaskulären Komplikationen in Patienten, die an Diabetes leiden, bereitzustellen.
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform wird das Problem durch ein Verfahren zur Diagnose gelöst, ob ein Diabetes-Patient an einer kardiovaskulären Komplikation leidet oder gefährdet ist, an einer kardiovaskulären Komplikation zu leiden, umfassend die Schritte
    • a) Messen, bevorzugt in vitro, des Spiegels (der Spiegel) mindestens eines kardialen Hormons in einer Probe aus dem Patienten,
    • b) Diagnostizieren der kardiovaskulären Komplikation oder des Risikos, an einer kardiovaskulären Komplikation zu leiden, durch Vergleichen des gemessenen Spiegels (der Spiegel) mit dem bekannten, mit einer kardiovaskulären Komplikation oder mit dem Risiko assoziierten Spiegel (den Spiegeln).
  • Das Verfahren kann auch den Schritt der Entnahme einer Probe, beispielsweise einer Körperflüssigkeit oder einer Gewebeprobe, aus dem Patienten umfassen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Entnahme der Probe bevorzugt von nichtmedizinischem Personal durchgeführt werden (d.h., das keine Ausbildung hat, die notwendig ist, den Beruf eines Arztes auszuüben). Dies gilt besonders, wenn die Probe Blut ist.
  • Die vorliegende Erfindung ist besonders vorteilhaft für Allgemeinmediziner, spezialisierte Ärzte und Krankenstationen, Abteilungen oder Kliniken, die auf Diabetes-Behandlung spezialisiert sind, da sie häufig keinen Zugang zu einer umfassenden kardiologischen Untersuchung durch Kardiologen haben. Die vorliegende Erfindung stellt solchen Nicht-Kardiologen Methoden und Hilfsmittel für ein einfaches und verlässliches Screening von Diabetes-Patienten auf solche Patienten, die gefährdet sind, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden, zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einfache Methoden und Hilfsmittel bereit, um in Diabetes-Patienten und sogar in Diabetes-Patienten, die an Neuropathie leiden, kardiovaskuläre Komplikationen zu erkennen, einschließlich Herzkrankheit, Mikroangiopathie, Plättchenaktivierung und Entzündung. Die Erkennung ist in frühen Phasen der Komplikationen möglich, sogar bevor ein irreversibler Schaden aufgetreten ist.
  • Die Erfindung macht sich bestimmte biochemische oder molekulare Marker zunutze. Die Begriffe „biochemischer Marker" und „molekularer Marker" sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere sind biochemische oder molekulare Marker Genexpression-Produkte, die differenziell (d.h. heraufreguliert oder herabreguliert) in Anwesenheit oder Abwesenheit eines bestimmten Zustands, einer bestimmten Krankheit oder Komplikation exprimiert werden. Gewöhnlicherweise wird ein molekularer Marker als eine Nukleinsäure (wie beispielsweise eine mRNA) definiert, wohingegen ein biochemischer Marker ein Protein oder ein Peptid ist. Der Spiegel eines geeigneten biochemischen oder molekularen Markers kann die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zustands, einer Krankheit oder der Komplikationen anzeigen und so eine Diagnose ermöglichen.
  • Diabetes gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf alle Formen des Diabetes mellitus, einschließlich Typ 1-, Typ 2- und Schwangerschaftsdiabetes. Diabetes bezieht sich besonders auf Typ 1 und Typ-2-Diabetes, ganz besonders auf Typ-2-Diabetes. Definitionen für Diabetes mellitus sind dem Fachmann bekannt, und diagnostische Kriterien sind 1985 und 1999 durch die Weltgesundheitsorganisation (WHO) sowie 1997 durch die American Diabetes Association (ADA) erstellt worden. Jeder Patient, der die Kriterien gemäß einer oder mehrerer dieser Definitionen erfüllt, wird als Diabetes-Patient betrachtet. Bevorzugt wird der Diabetes-Patient durch die WHO-Kriterien von 1999 definiert.
  • Typ-1-Diabetes ist auch als juveniler Diabetes oder Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (IDDM) bekannt. Typ-1-Diabetes kann immunologisch (Subtyp A) oder idiopathisch (Subtyp B) bedingt sein. Typ-2-Diabetes ist auch bekannt als Altersdiabetes oder nicht-Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (NIDDM). Typ-2-Diabetes kann entweder von Adipositas (Typ 2a) oder nicht von Adipositas (Typ 2b) begleitet sein. Weitere Typen der Diabetes können beispielsweise durch genetische Defekte, durch Krankheiten der exokrinen Bauchspeicheldrüse, durch Endokrinopathien und durch Einflüsse von Chemikalien oder pharmazeutischen Arzneimitteln bedingt sein.
  • Diagnostizieren gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet Bestimmen, Überwachen, Bestätigen, Unterklassifizieren und Vorhersage der relevanten Krankheit, Komplikation oder des Risikos. Bestimmen bezieht sich auf die Wahrnehmung einer Krankheit, Komplikation oder eines Risikos. Überwachen bezieht sich auf die Beobachtung einer bereits diagnostizierten Krankheit oder Komplikation, beispielsweise, um das Fortschreiten der Krankheit oder den Einfluss einer bestimmten Behandlung auf das Fortschreiten einer Krankheit oder Komplikation zu überwachen. Bestätigen bezieht sich auf das Erhärten oder das Substanziieren einer bereits unter Verwendung anderer Indikatoren oder Marker durchgeführten Diagnose. Unterklassifizieren bezieht sich auf die nähere Bestimmung einer Diagnose in verschiedene Unterklassen der diagnostizierten Krankheit, beispielsweise die Bestimmung milder oder ernster Formen der Krankheit. Vorhersage bezieht sich auf das Prognostizieren einer Krankheit oder Komplikation, bevor andere Symptome oder Marker auffällig geworden sind oder sich signifikant geändert haben.
  • Der Begriff „Patient" gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein gesundes Individuum, auf ein scheinbar gesundes Individuum oder besonders auf ein Individuum, das an Diabetes leidet. Insbesondere leidet der Patient an Typ-2-Diabetes und/oder diabetischer Nephropathie oder wird deshalb behandelt. Ganz besonders hat der Patient keine bekannte Vorgeschichte einer kardiovaskulären Komplikation und/oder er wird nicht aufgrund einer kardiovaskulären Komplikation behandelt.
  • Die vorliegende Erfindung erlaubt die Diagnose, ob ein Diabetes-Patient an einer kardiovaskulären Komplikation leidet oder gefährdet ist, an einer kardiovaskulären Komplikation zu leiden. „An einer kardiovaskulären Komplikation zu leiden" gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet auch die Verschlechterung einer bereits existierenden kardiovaskulären Komplikation.
  • „Kardiovaskuläre Komplikation" kann jede kardiovaskuläre Krankheit oder jedes kardiovaskuläre Ereignis, die/das dem Fachmann bekannt ist, sein, einschließlich kardialer Krankheit, Mikroangiopathie oder Plättchenaktivierung.
  • Die vorliegende Erfindung macht sich kardiale Hormone, Angiogenesemarker und Marker für die Plättchenaktivierung als biochemische und molekulare Marker zunutze.
  • In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass kardiale Hormone, besonders NT-proBNP, als biochemische oder molekulare Marker für eine kardiovaskuläre Komplikation, besonders für Herzkrankheit, in Diabetes-Patienten sehr indikativ sind.
  • Patienten, die an Herzkrankheit leiden, können Patienten, die an einer stabilen Angina Pectoris (SAP) leiden und Individuen mit einem akuten Koronarsyndrom (ACS) sein. ACS-Patienten können eine instabile Angina Pectoris (UAP) aufweisen oder diese Individuen können bereits einen Myokard-Infarkt (MI) erlitten haben. MI kann ein ST-Hebungsinfarkt oder ein Nicht-ST-Hebungsinfarkt sein. Das Auftreten eines MI kann von einer Dysfunktion des linken Ventrikels (LVD) gefolgt werden. Schließlich durchlaufen LVD-Patienten eine kongestive Herzinsuffizienz (CHF) mit einer Sterblichkeitsrate von ungefähr 15%.
  • Herzkrankheiten sind in ein funktionales Klassifizierungssystem gemäß der New York Heart Association (NYHA) eingeteilt worden. Patienten der Klasse I weisen keine offensichtlichen Symptome einer Herzkrankheit auf Die körperliche Aktivität ist nicht eingeschränkt, und gewöhnliche körperliche Aktivität bewirkt keine übermäßige Müdigkeit, kein übermäßiges Herzklopfen oder keine Dyspnoe (Kurzatmigkeit). Patienten der Klasse II weisen leichte Einschränkungen der körperlichen Aktivität auf. Sie sind im Ruhezustand beschwerdefrei, aber gewöhnliche körperliche Aktivität resultiert in Müdigkeit, Herzklopfen oder Dyspnoe. Patienten der Klasse III weisen eine merkliche Einschränkung der körperlichen Aktivität auf. Sie sind beschwerdefrei im Ruhezustand, aber schon geringe Aktivität bewirkt Müdigkeit, Herzklopfen oder Dyspnoe. Patienten der Klasse IV sind nicht in der Lage, jegliche körperliche Aktivität beschwerdefrei auszuüben. Sie zeigen im Ruhezustand Symptome der Herzinsuffizienz. Wenn eine körperliche Aktivität unternommen wird, wird das Unbehagen verstärkt.
  • Entsprechend können Patienten in Individuen unterteilt werden, die keine klinischen Symptome aufweisen, und in solche mit klinischen Symptomen (z.B. Dyspnoe).
  • Ein weiteres Charakteristikum von Herzkrankheiten kann die „linksventrikuläre Ejektionsfraktion" (LVEF) sein, die auch als „Ejektionsfraktion" bekannt ist. Menschen mit einem gesunden Herzen haben gewöhnlich eine unbeeinträchtigte LVEF, die allgemein als über 50% beschrieben wird. Die meisten Menschen mit einer systolischen Herzkrankheit, die symptomatisch ist, haben allgemein eine LVEF von 40% oder weniger. Als eine Folge einer beeinträchtigten LVEF können sekundäre Komplikationen auftreten, beispielsweise Lungenstauung oder Stauungslunge.
  • Herzkrankheit kann auch die Folge einer diabetischen Makroangiopathie sein. Diabetische Makroangiopathie ist der Arteriosklerose eines Nicht-Diabetes-Patienten ähnlich. Jedoch ist sie heftiger und die Manifestation ist früher und häufiger. „Herzkrankheit" gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich folglich auch auf diabetische Makroangiopathie.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich „Herzkrankhheit" auf die koronare Herzkrankheit, SAP, ACS, UAP, MI, ST-Hebungsinfarkt, Nicht-ST-Hebungsinfarkt, LVD oder CHF.
  • Ganz besonders bezieht sich „Herzkrankheit" auf ACS, UAP, MI, ST-Hebungsinfarkt, Nicht-ST-Hebungsinfarkt, LVD oder CHF.
  • Eine Herzkrankheit gemäß der vorliegenden Erfindung kann Symptome, besonders Symptome gemäß den NYHA-Klassen II–IV, ganz besonders gemäß den NYHA-Klassen III–IV hervorrufen.
  • Eine Herzkrankheit kann mit einer LVEF von 40% oder weniger verknüpft sein.
  • Eine Herzkrankheit kann entweder „kompensiert" oder „dekompensiert" sein. Kompensiert bedeutet, dass der reguläre Sauerstoffbedarf des Körpers noch befriedigt werden kann, wohingegen dekompensiert bedeutet, dass der reguläre Sauerstoffbedarf des Körpers nicht mehr befriedigt werden kann.
  • Die kardialen Hormone gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen natriuretische Peptide und Urotensin. Kardiale Hormone gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders natriuretische Peptide. Auch das Zunutzemachen von Kombinationen jeglicher kardialer Hormone oder natriuretischer Peptide als biochemische Marker wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
  • Natriuretische Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Peptide vom ANP-Typ und BNP-Typ und Varianten davon (siehe beispielsweise Bonow, R. O. (1996). New insights into the cardiac natriuretic peptides. Circulation 93: 1946–1950).
  • Peptide vom ANP-Typ umfassen prä-proANP, proANP, NT-proBNP und ANP.
  • Peptide vom BNP-Typ umfassen prä-proBNP, proBNP, NT-proBNP und BNP.
  • Das Prä-Propeptid (134 Aminosäuren im Falle von Prä-proBNP) umfasst ein kurzes Signalpeptid, das enzymatisch abgespalten wird, um das Propeptid (108 Aminosäuren im Falle von proBNP) freizusetzen. Das Propeptid wird weiter in ein N-terminales Propeptid (NT-proPeptid, 76 Aminosäuren im Falle von NT-proBNP) und das aktive Hormon (32 Aminosäuren im Falle von BNP, 28 Aminosäuren im Falle von ANP) gespalten.
  • Bevorzugte natriuretische Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind NT-proANP, ANP, NT-proBNP, BNP und Varianten davon. ANP und BNP sind die aktiven Hormone und haben eine kürzere Halbwertzeit als ihre entsprechenden inaktiven Gegenstücke, NT-proANP und NT-proBNP. Daher kann, abhängig vom Zeitverlauf, der von Interesse ist, entweder das Messen der aktiven oder der inaktiven Form vorteilhaft sein. Die am meisten bevorzugten natriuretischen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind BNP-Typ-Peptide oder Varianten davon, besonders NT-proBNP und Varianten davon.
  • Der Begriff „Varianten" in diesem Zusammenhang bezieht sich auf Peptide, die den genannten Peptiden im wesentlichen ähnlich sind. Der Begriff „im wesentlichen ähnlich" wird vom Fachmann gut verstanden. Insbesondere kann eine Variante eine Isoform oder ein Allel sein, das/die, verglichen mit der Aminosäuresequenz der gängigsten Peptid-Isoform in der humanen Population, Aminosäuren-Austausche aufweist. Ein solches im wesentlichen ähnliches Peptid hat zu der gängigsten Isoform des Peptids bevorzugt eine Sequenzähnlichkeit von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 85%, mehr bevorzugt von mindestens 90%, und noch mehr bevorzugt von mindestens 95%. Im wesentlichen ähnlich sind auch proteolytische Abbbauprodukte, die noch durch die diagnostischen Mittel oder durch Liganden, die gegen das betreffende Volllängenpeptid gerichtet sind, erkannt werden.
  • Beispiele für Varianten sind bekannt. Beispielsweise wurden Varianten von NT-proANP und NT-proBNP und Verfahren für ihre Messung beschrieben (Ala-Kopsala, M., Magga, J., Peuhkurinen, K. et al. (2004): Molecular heterogeneity has a major impact an the measurement of circulating N-terminal fragments of A-type and B-type natriuretic peptides. Clinical Chemistry, vol. 50(9), 1576–1588).
  • Der Begriff „Variante" bezieht sich auch auf ein posttranslational modifiziertes Peptid, wie beispielsweise ein glykosyliertes oder phosphoryliertes Peptid. Eine „Variante" ist auch ein Peptid, das nach der Probennahme modifiziert worden ist, zum Beispiel durch kovalentes oder nicht-kovalentes Anhängen einer Markierung, insbesondere einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung an das Peptid. Der Begriff „Variante" bedeutet auch, dass Splice-Varianten einbezogen sind.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das Messen des Spiegels eines kardialen Hormons und zusätzlich das Messen des Spiegels eines Angiogenesemarkers und/oder eines Markers für Plättchenaktivierung.
  • Angiogenesemarker und Marker für Plättchenaktivierung gehören zu der Gruppe der „Entzündungs-assoziierten Marker". Entzündungs-assoziierte Marker sind Marker, die pathophysiologische Zustände anzeigen, die mit Entzündung verknüpft sind. Entzündungs-assoziierte Marker gemäß der vorliegenden Erfindung schließen nicht CRP, hsCRP, IL-6 oder Varianten von CRP, hsCRP oder IL-6 ein.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch das zusätzliche Messen des Spiegels eines Angiogenesemarkers für die Diagnose einer kardiovaskulären Komplikation in einem Diabetes-Patienten, besonders für die Diagnose eines pathophysiologischen Zustands, der mit der Entzündung assoziiert ist, ganz besonders für die Diagnose der Mikroangiopathie.
  • Daher erlaubt die vorliegende Erfindung auch die Diagnose der „Mikroangiopathie". Mikroangiopathie ist eine häufige Folge von Diabetes und ist auch als diabetische Mikroangiopathie bekannt. Mikroangiopathie manifestiert sich häufig in der Niere und der Retina. Mikroangiopathie der Niere kann zu diabetischer Nephropathie führen, die durch Proteinurie (verstärkte Harn-Albumin-Ausscheidung), durch Bluthochdruck und durch fortschreitende, durch Glomerulosklerose bedingte Niereninsuffizienz charakterisiert ist. Mikroangiopathie der Retina kann letztendlich zu einer Proliferation der Netzhautblutgefäße, Netzhautblutungen und Blindheit führen. Eine andere Konsequenz der Mikroangiopathie ist Hypoxie der Extremitäten (typischerweise als „diabetischer Fuß" bekannt), die zu Wundbrand führen kann und die eine Amputation der Extremität erforderlich machen kann.
  • Daher erlauben Angiogenesemarker auch die Diagnose von diabetischer Nephropathie, diabetischer Schädigung der Netzhaut oder Hypoxie der Extremitäten.
  • Bevorzugte Angiogenesemarker sind P1GF (plazentaler Wachstumsfaktor), VEGF (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor), sFlt1 (lösliche fms-ähnliche Tyrosin-Kinase 1) und Varianten davon. Der am meisten bevorzugte Angiogenesemarker ist P1GF und Varianten davon. Der Begriff „Varianten" wird, wie vorstehend in dieser Spezifizierung definiert, verstanden.
  • Der Begriff „Variante" im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich auch auf Splice-Varianten. Bekannte Splice-Varianten von P1GF sind P1GF-1 (149 Aminosäuren), P1GF-2 (170 Aminosäuren) und P1GF-3 (221 Aminosäuren) (siehe beispielsweise Cai, J., Ahmad, S., Jiang, W. G., Huang, J., et al (2003). Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Sustains Angiogenesis and Bcl-2 Expression via the Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway in Endothelial Cells. Diabetes, vol. 52, pp. 2959–2968).
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch das Messen des Spiegels eines Markers für Plättchenaktivierung für die Diagnose einer kardiovaskulären Komplikation, insbesondere für die Diagnose eines pathophysiologischen Zustands, der mit Entzündung assoziiert ist, ganz besonders für die Diagnose von Plättchenaktivierung.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Diagnose von „Plättchenaktivierung". Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich „Plättchenaktivierung" auf jedes thrombotische Ereignis, einschließlich Plättchenaktivierung, Plättchenaggregation, Thrombusbildung und Thrombusausbreitung. Diese biologischen Mechanismen sind für das Risiko repräsentativ, dass eine bereits verletzlich gewordene Plaque aufbrechen wird, resultierend in einer reversiblen, vaskulären Verstopfung (UAP) oder einer irreversiblen Verstopfung (AMI), die zu einer linksventrikulären Dysfunktion (LVD), kongestiver Herzinsuffizienz (CHF) und Tod führen kann.
  • Daher erlauben Marker für Plättchenaktivierung auch die Diagnose der Plättchenaggregation, der Thrombusbildung, der Thrombusausbreitung, des Risikos, dass eine bereits verletzlich gewordene Plaque aufbrechen wird, UAP und AMI.
  • Bevorzugte Marker für Plättchenaktivierung sind sCD40L (löslicher CD40 Ligand), vWF (von Willebrand Faktor) und Varianten davon. Der am meisten bevorzugte Marker für Plättchenaktivierung ist sCD40L, und Varianten davon. Der Begriff „Varianten" wird, wie vorstehend in dieser Spezifizierung definiert, verstanden.
  • sCD40L (und dessen Varianten) kann entweder „frei" oder an Thrombozyten gebunden sein. Wenn sCD40L im Blutserum gemessen wird, werden sowohl freies auch als Thrombozyten-gebundenes sCD40L gemessen. Wenn sCDL40 im Blutplasma gemessen wird, wird nur „freies" sCD40L gemessen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Messen des Spiegels von freiem sCD40L bevorzugt.
  • Vorzugsweise werden der/die Angiogenesemarker und/oder der/die Marker für Plättchenaktivierung in Kombination mit einem kardialen Hormon gemessen. Das Messen der verschiedenen Typen der Marker kann die Bestätigung der Diagnose einer kardiovaskulären Kompliktion unterstützen und erlaubt die Unterteilung, ob die kardiovaskuläre Komplikation eine Herzkrankheit, Mikroangiopathie ist oder durch Plättchenaktivierung gekennzeichnet ist.
  • Daher erlaubt die vorliegende Erfindung und ihre verschiedenen Ausführungsformen nicht nur die Diagnose einer kardiovaskulären Komplikation, sondern auch die Subklassifizierung, ob die besagte kardiovaskuläre Komplikation überwiegend eine Herzkrankheit, Mikroangiopathie oder Plättchenaktivierung betrifft.
  • Der Fachmann weiß, dass „Herzkrankheit", „Mikroangiopathie" und „Plättchenaktivierung" nicht vollständig voneinander getrennte Störungen sind, sondern dass sie in Zusammenhang stehen. Beispielsweise kann Plättchenaktivierung letztendlich zu arterieller Verstopfung und Herzkrankheit führen. Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Diagnose des überwiegenden Charakteristikums und/oder des Stadiums oder der Schwere einer kardiovaskulären Komplikation.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch durch das Messen von einem oder mehreren Marker, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CRP, hsCRP, IL-6 oder entsprechender Varianten, Glukose, HbA1c, CML (N.sup.[Epsilon]-(carboxymethyl)lysin) und AGEs (Advanced Glycation Endproducts) begleitet werden.
  • CRP (C-Reaktives Protein), hsCRP (hoch sensitives C-Reaktives Protein), IL-6 (Interleukin-6) und deren entsprechenden Varianten zeigen allgemein das Vorhandensein einer Entzündung an. Erhöhte Spiegel dieser Marker im Blutserum sind auch für Entzündungsprozesse im kardiovaskulären System indikativ. Daher sind erhöhte Spiegel dieser Marker indikativ für das Vorhandensein oder das Risiko einer kardiovaskulären Komplikation. Folglich kann das Messen von CRP, hsCRP, IL-6 oder einer entsprechenden Variante in Kombination mit anderen Markern gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnose einer kardiovaskulären Komplikation oder des Risikos, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden, verwendet werden.
  • Erhöhte Spiegel an Glukose, HbA1c, AGEs oder CML zeigen primär an, dass der Patient eine bessere Kontrolle des Blutzuckerspiegels benötigt.
  • Die Messung des Glukosespiegels wird für die Bestimmung des gegenwärtigen Blutzuckerspiegels in einem Diabetes-Patienten routinemäßig eingesetzt.
  • Informationen über die mittel- oder langfristige Kontrolle des Blutzuckers können durch das Messen von HbA1c, CML oder AGEs erhalten werden.
  • HbA1c ist eine glykosylierte Form des Hämoglobins. Je geringer der Spiegel an HbA1c, desto besser ist der Blutzuckerspiegel des Diabetes-Patienten kontrolliert.
  • Das Glykoxidationsprodukt CML (N.sup.[Epsilon]-(carboxylmethyl)lysin) resultiert aus der langfristigen Inkubation von Proteinen mit Glukose. Ähnlich wie HbA1c zeigt ein geringer Spiegel von CML eine gute Kontrolle des Blutzuckerspiegels des Diabetes-Patienten an.
  • AGEs (Advanced Glycation Endproducts) resultieren auch aus der langfristigen Inkubation von Proteinen mit Glukose. Ähnlich wie HbA1c und CML zeigt ein niedriger Spiegel an AGEs eine gute Kontrolle des Blutzuckerspiegels im Diabetes-Patienten an. Zusätzlich wurde nahegelegt, dass erhöhte Spiegel an AGEs mit koronarer Herzkrankheit in Patienten mit Typ-2-Diabetes assoziiert sind (Kilhovd, B. K., et al. (1999). Serum levels of Advanced Glycation End Products are increased in Patients with type 2 Diabetes or Coronary Heart Disease. Diabetes Care, vol. 22(9), p. 1543–1548). Daher kann das Messen von AGEs in Kombination mit anderen Markern gemäß der vorliegenden Erfindung für die Diagnose von kardiovaskulären Komplikationen oder des Risikos, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden, verwendet werden.
  • Weiterhin können die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch durch das Messen einer oder mehrerer Marker, ausgewählt aus der Gruppe von Markern, bestehend aus Schwangerschafts-assoziiertes Plasma Protein A (PAPP-A), IL-8, IL-10, Interleukin-18 (IL-18/IL-18b), ischämisch modifiziertes Albumin (IMA), kardiales Troponin I (cTnI), kardiales Troponin T (cTnT), ICAM-1 (Interzelluläres Zelladhäsionsmolekül-1), VCAM-1 (vaskuläres Zelladhäsionsmolekul-1), Fettsäuren-bindendes Protein (FABP), E-Selektin, P-Selektin, Fibrinogen, Serum-Amyloid A (SAA), CK-MB (Kreatin-Kinase Muscle-Brain), MPO (Myeloperoxidase), LpPLA2 (Lipoprotein-assoziierte Phospholipase A2), GP-BB (Glykogen-Phosphorylase Isoenzym BB), IL1RA, TAFI (Thrombin-aktivierbarer Fibrinolyse Inhibitor), lösliches Fibrin, anti-oxLDL (Antikörper gegen oxidiertes Low-Density Protein), MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), prokoagulanter Gewebefaktor (TF), MMP-9 (Matrix-Metalloproteinase 9), Ang-2 (Angiopoietin-2), bFGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor), VLDL (Very Low Density Lipoprotein), PAI-1 (Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1), begleitet werden.
  • Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst den Schritt der Diagnose des Risikos des Patienten durch Vergleichen des gemessenen Spiegels mit bekannten Spiegeln (Referenz-Spiegeln), die im Zusammenhang mit verschiedenen Graden des Risikos in einem Patienten stehen.
  • Der Fachmann ist in der Lage, bekannte Spiegel von Markern, die im Zusammenhang mit dem „Vorhandensein" oder dem „Risiko", eine kardiovaskuläre Komplikation, insbesondere Herzkrankheit, Mikroangiopathie und/oder Plättchenaktivierung zu erleiden, zu bestimmen. Solche Spiegel können gemäß wohlbekannten Verfahren, wie beispielsweise in den Beispielen 1 und 2 oder den 1 bis 5 dargelegt, bestimmt werden. Beispielsweise kann der Median der gemessenen Spiegel in einer Patientenpopulation, vorzugsweise von Diabetes-Patienten, verwendet werden, um zwischen einem Patienten ohne einer kardiovaskulären Komplikation und einem Patienten, der an einer kardiovaskulären Komplikation leidet oder gefährdet ist, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden, zu unterscheiden. Die Auswertung der Spiegel in weiteren Patienten, beispielsweise in Kohortenstudien, kann die genauere Bestimmung der Referenz-Spiegel und die Unterscheidung zwischen verschiedenen Schweregraden der Komplikation oder verschiedenen Risikograden wie ein „sehr erhöhtes" oder „sehr stark erhöhtes" Risiko unterstützen.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Vorhandensein" auf die Wahrscheinlichkeit, dass eine kardiovaskuläre Komplikation in einem bestimmten Patienten vorliegt. Der Begriff „Risiko" bezieht sich auf die Wahrscheinlichkeit, dass eine kardiovaskuläre Komplikation in einem bestimmten Patienten in der Zukunft auftritt. „Kein Risiko" bedeutet, dass in der Zukunft scheinbar kein Risiko, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden, vorhanden ist.
  • Die Referenzspiegel, die unten angegeben sind, sollen nur als eine erste Richtlinie für die Diagnose des Risikos eines Patienten dienen. Beispielsweise ist das Risiko eines bestimmten Patienten auch von der überschüssigen Pumpleistung des Herzens des jeweiligen Patienten abhängig.
  • Weiterhin ist der Fachmann aufgrund der Beispiele, die weiter unten gezeigt sind, in der Lage, andere Referenz-Spiegel zu bestimmen.
  • Der Wert eines Referenz-Spiegels kann auch von der gewünschten Sensitivität oder Spezifität der Diagnose abhängen. Je höher die gewünschte Sensitivität, desto geringer ist die Spezifität der Diagnose und umgekehrt. Beispielsweise wird ein höherer Referenzspiegel für NT-proBNP die Spezifität erhöhen, kann aber in einen Verlust der Sensitivität der Diagnose des Vorhandenseins oder des Risikos, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden, resultieren.
  • Typischerweise steht ein Plasma-Spiegel von weniger als 33 pg/ml, insbesondere von weniger als 20 pg/ml, ganz besonders von weniger als 15 pg/ml NT-proBNP nicht im Zusammenhang mit dem Risiko, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden.
  • Typischerweise steht ein Plasma-Spiegel höher als 33 pg/ml, insbesondere höher als 125 pg/ml, ganz besonders höher als 500 pg/ml NT-proBNP im Zusammenhang mit einem Risiko, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden.
  • Je höher der gemessene Spiegel an NT-proBNP, desto höher ist das Risiko des Patienten. Beispielsweise zeigt ein Spiegel von mehr als 1000 pg/ml ein stark erhöhtes Risiko und ein Spiegel von mehr als 5000 pg/ml ein sehr stark erhöhtes Risiko an.
  • Typischerweise ist ein Plasma-Spiegel von weniger als 10 pg/ml, insbesondere weniger als 5 pg/ml P1GF nicht mit dem Risiko, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden, verbunden.
  • Typischerweise ist ein Plasma-Spiegel höher als 10 pg/ml P1GF, insbesondere höher als 15 pg/ml, ganz besonders höher als 20 pg/ml mit einem Risiko, an einer kardiovaskulären Komplikation zu leiden, verbunden.
  • Je höher der gemessene Spiegel an P1GF, desto höher ist das Risiko des Patienten. Beispielsweise zeigt ein Spiegel von mehr als 25 pg/ml ein stark erhöhtes Risiko, und ein Spiegel von mehr als 30 pg/ml ein sehr stark erhöhtes Risiko an.
  • Sobald das Vorhandensein oder das Risiko diagnostiziert worden ist, kann dies Konsequenzen für die nachfolgende Behandlung, wie unten beschrieben, haben. Insbesondere erlaubt die vorliegende Erfindung die Behandlung gemäß dem vorherrschenden Charakteristikum oder der Manifestation des Diabetes zu individualisieren. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Behandlung. „Behandlung" in diesem Zusammenhang bezieht sich auf jegliche Behandlung, die den pathophysiologischen Zustand eines Individuums ändern kann und umfasst beispielsweise die Verabreichung pharmazeutischer Arzneimittel sowie chirurgische Behandlung.
  • Wenn ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kein Risiko anzeigt, dann kann die Behandlung wie geplant fortgesetzt werden.
  • Wenn ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Risiko anzeigt, dann kann die Behandlung angepasst werden. Vorzugsweise wird die Behandlung begleitet durch weiteres Messen des Spiegels der erfindungsgemäßen Marker und durch weitere Diagnose wie Elektrokardiographie, Echokardiographie oder jeglicher anderer geeigneter Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Weiterhin kann die Anpassung der Behandlung Maßnahmen umfassen wie Restriktion der Salzaufnahme, regelmäßige moderate Bewegung, Vermeidung von nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneimitteln, Bereitstellung von Grippe- und Pneumokokken-Impfung, chirurgische Behandlungen (beispielsweise. Revaskularisation, Ballondilatation, Einsetzen eines Stents, Bypass-Operation), Verabreichung von Arzneimitteln wie Diuretika (einschließlich der gemeinsamen Verabreichung von mehr als einem Diuretikum), ACE(Angiotensin umwandelndes Enzym)-Inhibitoren, β-adrenergischen Blockern, Aldosteron-Antagonisten, Kalzium-Antagonisten (Kalziumkanal-Blockern), Angiotensin-Rezeptoren-Blockern, Digitalis und andere Maßnahmen, die dem Fachmann bekannt sind und als geeignet erachtet werden.
  • Wenn ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung anzeigt, dass die kardiovaskuläre Komplikation eine Herzkrankheit ist, dann wird der Fokus der Behandlung eine kardiale Therapie sein, insbesondere die Verabreichung von ACE-Inhibitoren und β-adrenergischen Blockern. Zusätzlich wird es wünschenswert sein, eine kardiotoxische Medikamentierung und einen Anstieg des Blutvolumens zu vermeiden. Auch eine Revaskularisationstherapie (beispielsweise PCTI (perkutane therapeutische Intervention), Ballon-Dilatation, Einsetzen eines Stents, Bypass-Operation) kann in Erwägung gezogen werden.
  • ACE-Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt. Beispiele schließen Benazepril, Captropril, Cilazapril, Enalapril, Fosinopril, Lisinopril, Moexipril, Perindopril, Quinapril, Ramipril, Spirapril und Trandolapril ein.
  • ACE-Inhibitoren können auch in der Lage sein, das Fortschreiten von diabetischer Nephropathie zu verlangsamen.
  • β-adrenergische Blocker (nicht selektiv und β1-selektiv) sind dem Fachmann bekannt. Beispiele schließen Acebutolol, Alprenolol, Atenolol, Betaxolol, Bisoprolol, Bupranolol, Carazolol, Carteolol, Carvedilol, Celiprolol, Metipranolol, Metoprolol, Nadolol, Nebivolol, Oxprenolol, Penbutolol, Pindolol, Propanolol, Sotalol, Tanilolol und Timolol ein.
  • „Kardiotoxische Medikamentierung” in diesem Zusammenhang bezieht sich besonders auf das Verabreichen von Arzneimitteln, die zu einem Anstieg des Blutvolumens führen können, beispielsweise Thiazolidinedone, zum Beispiel Glitazon, Medion, Pioglitazon, Rosiglitazon, Troglitazon.
  • Wenn ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung anzeigt, dass die kardiovaskuläre Komplikation Mikroangiopathie ist, dann wir der Fokus der Behandlung die Medikamentierung mit „lipidsenkenden" Arzneimitteln (beispielsweise Statinen) und/oder entzündungshemmenden Arzneimitteln sein. Auf die Verabreichung von Inhibitoren oder Antagonisten des Plättchen-Glykoproteins IIb/IIIa Rezeptors kann in Erwägung gezogen werden.
  • Lipidsenkende Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Beispiele schließen Fibrate (beispielsweise Bezofibrat, Clofibrat, Etofibrat, Etophyllin Clofibrat, Fenofibrat, Gemfibrozil), Nikotinsäuren- und Analoga davon, (beispielsweise Nikotinsäure, Acipimox), Statine (beispielsweise Simvastatin, Lovastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Atorvastatin, Cervicastatin), Anionenaustauscherharze (beispielsweise Colestyramin, Colestipol), Probucol und Sitosterol ein. Bevorzugte lipidsenkende Arzneimittel in dem vorliegenden Zusammenhang sind Statine.
  • Es ist wichtig, zu erwähnen, dass zahlreiche lipidsenkende Arzneimittel, besonders Statine, auch entzündungshemmende Maßnahmen bewirken, die diese lipidsenkenden Arzneimittel für die Behandlung von Mikroangiopathie oder Plättchenaktivierung noch geeigneter machen.
  • Inhibitoren oder Antagonisten des Plättchenglykoproteins-IIb/IIIa-Rezeptors sind dem Fachmann bekannt. Beispiele schliessen monoklonale oder polyklonale Antikörper, Tirofiban, Eptifibatid und desgleichen ein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Inhibitor des Glykoprotein-IIb/IIIa-Rezeptors ein Antikörper, insbesondere der unter dem Namen Abciximab bekannte Antikörper. Abciximab ist ein Fab-Fragment-Antikörper, der unter dem Namen ReoPro von Centocor Europe BV erhältlich ist.
  • Wenn ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung anzeigt, dass die kardiovaskuläre Komplikation Plättchenaktivierung ist, dann wird der Fokus der Behandlung die Medikamentierung mit Thrombozyten-Aggregationsinhibitoren und lipidsenkenden Arzneimitteln (beispielsweise Statinen) sein.
  • Thrombozyten-Aggregationsinhibitoren sind dem Fachmann bekannt und schließen jegliche Arzneimittel ein, die in der Lage sind, die Aggregation der Thrombozyten (Plättchen) zu inhibieren. Beispiele sind Inhibitoren der Cyclooxygenase, insbesondere COX-1 (beispielsweise Acetylsalicylsäure); ADP-Inhibitoren (welche das Binden von Adenosinphosphat an dessen Rezeptoren an die Thrombozyten verhindert, beispielsweise Ticlopidin oder Clopidogrel); Inhibitoren oder Antagonisten des Plättchen-Glykoproteins IIb/IIIa-Rezeptors (siehe oben); Dipyridamol; Sulfinpyrazon, Dextran 40.
  • Wenn ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung anzeigt, dass der Blutzuckerspiegel unzureichend kontrolliert ist, dann wird der Patient gemäß jeglicher Verfahren zur Blutzuckerkontrolle, die in der Technik bekannt und für geeignet erachtet werden, behandelt. Beispiele schließen das Verabreichen von Arzneimitteln, die die Aufnahme von Zucker aus dem Blut durch das Zielgewebe erhöhen, oder das Verabreichen von Arzneimitteln, die die Freisetzung von Insulin aus pankreatischen Betazellen stimulieren. Beispiele für solche wohlbekannten Arzneimittel schließen Insulin und Thiazolidinedone ein.
  • Wie zuvor erwähnt, kann sich Diabetes in verschiedenen Formen manifestieren. Manifestation bedeutet, dass die Krankheit durch eine besondere Komplikation oder ein Merkmal offensichtlich wird, beispielsweise durch kardiovaskuläre Komplikation, Herzkrankheit, Mikroangiopathie, Plättchenaktivierung, Entzündung oder unzureichende Kontrolle des Blutzuckerspiegels. Aufgrund von individuellen Unterschieden, wie genetischen Unterschieden, unterschiedlichen Lebensstilen (beispielsweise Alkohol- oder Nikotinmissbrauch, Mangel an körperlicher Bewegung) oder einer unterschiedlichen Krankheitsvorgeschichte kann sich Diabetes in jedem individuellen Patienten durch unterschiedliche Komplikationen oder Merkmale manifestieren. Beispielsweise kann ein bestimmter Patient an Herzkrankheit leiden, wohingegen ein anderer Patient an Mikroangiopathie oder diabetischer Nephropathie leidet. Als ein anderes Beispiel kann ein Patient, in dem der Blutzuckerspiegel unzureichend kontrolliert ist, aufgrund der Tatsache, dass der Patient seit langem nicht an Diabetes gelitten hat, nicht an Mikroangiopathie leiden, wohingegen ein Patient, der seit vielen Jahren an Diabetes leidet, an Mikroangiopathie leiden kann, auch wenn sein Blutzuckerspiegel relativ gut kontrolliert ist.
  • Daher kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Diagnose einer Manifestation von Diabetes, besonders der vorherrschenden Manifestation, die zu der Gruppe, bestehend aus kardiovaskulärer Komplikation, Herzkrankheit, Mikroangiopathie, Plättchenaktivierung, Entzündung und unzureichende Kontrolle des Blutzuckerspiegels gehört, umfassen.
  • Aus dem oben stehenden wird deutlich, dass die Erfindung auch ein Verfahren für die Bestimmung einer Manifestation, besonders der vorherrschenden Manifestation von Diabetes in einem Patienten, betrifft, umfassend die Schritte
    • a) messen, bevorzugt in vitro, des Spiegels (der Spiegel) von mindestens eines kardialen Hormons oder einer Variante davon, in einer Probe aus dem Patienten, und
    • b) vorzugsweise das zusätzliche Messen des Spiegels (der Spiegel) mindestens eines Angiogenese-Markers oder einer Variante davon, in einer Probe aus dem Patienten, und
    • c) vorzugsweise das zusätzliche Messen des Spiegels (der Spiegel) mindestens eines Markers für Plättchenaktivierung oder einer Variante davon, in einer Probe aus dem Patienten, und
    • d) vorzugsweise das zusätzliche Messen des Spiegels (der Spiegel) mindestens eines Markers, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CRP, hsCRP, IL-6 oder eine Variante davon, in einer Probe aus dem Patienten, und
    • e) vorzugsweise das zusätzliche Messen des Spiegels (der Spiegel) mindestens eines Markers, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glukose, HbA1c, CML und AGE, in einer Probe aus dem Patienten, und
    • f) diagnostizieren der Manifestation durch Vergleichen des gemessenen Spiegels (der Spiegel) mit einem bekannten Spiegel (mit bekannten Spiegeln), der/die mit der Manifestation im Zusammenhang steht/stehen, wobei
    • g) der Spiegel des Markers (der Marker) gemäß Schritt a) bis c) indikativ dafür ist, dass die Manifestation eine kardiovaskuläre Komplikation oder das Risiko, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden, ist, und
    • h) der Spiegel des Markers (der Marker) gemäß Schritt a) indikativ dafür ist, dass die Manifestation Herzkrankheit ist, oder das Risiko, eine Herzkrankheit zu erleiden, und
    • i) der Spiegel des Markers (der Marker) gemäß Schritt b) indikativ dafür ist, dass die Manifestation Mikroangiopathie ist oder das Risiko, eine Mikroangiopathie zu erleiden, und
    • k) der Spiegel des Markers (der Marker) gemäß Schritt c) indikativ dafür ist, dass die Manifestation Plättchenaktivierung ist, oder das Risiko, an Plättchenaktivierung zu leiden, und
    • l) der Spiegel des Markers (der Marker) gemäß d) indikativ dafür ist, dass die Manifestation Entzündung ist, oder das Risiko an einer Entzündung zu leiden, und
    • m) der Spiegel des Markers (der Marker) gemäß Schritt e) indikativ dafür ist, dass die Manifestation unzureichende Kontrolle des Blutzuckerspiegels ist.
  • Wie zuvor erwähnt, ist der Spiegel des Markers (der Marker) gemäß Schritt b) ferner indikativ dafür, dass die Manifestation diabetische Nephropathie, diabetische Netzhautschädigung, Hypoxie der Extremitäten, oder das Risiko an diabetischer Nephropathie, an diabetischer Netzhautschädigung, an Hypoxie der Extremitäten zu leiden, ist.
  • Wie zuvor erwähnt, ist der Spiegel des Markers (der Marker) gemäß Schritt c) ferner indikativ dafür, dass die Manifestation Plättchenaggregation, Thrombusbildung, Thrombenvermehrung, das Risiko, dass eine Plaque, die bereits verletzlich geworden ist, aufbrechen wird, UAP, AMI oder das Risiko an Plättchenaggregation, Thrombusbildung, Thrombenvermehrung, am Risiko, dass eine Plaque, die bereits verletzlich geworden ist, aufbrechen wird, UAP oder AMI zu leiden, ist.
  • Die Bestimmung wird umso besser sein, je mehr zusätzliche Marker gemäß der bevorzugten Schritte b) bis e) des obigen Verfahrens gemessen werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft nicht nur Verfahren zur Diagnose, sondern auch die Verwendung der Marker gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnose.
  • Diagnose gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise durch Verwendung eines diagnostischen Hilfsmittels ausgeführt. Ein diagnostisches Hilfsmittel ist jegliches Hilfsmittel, das die Messung des Spiegels, der Menge oder der Konzentration einer Substanz von Interesse, vorzugsweise eines Peptids oder eines Polypeptids von Interesse, erlaubt.
  • Peptide oder Polypeptide von Interesse gemäß der vorliegenden Erfindung sind die biochemischen Marker, wie in dieser Spezifizierung beschrieben.
  • Methoden und diagnostische Hilfsmittel, die verwendet werden können, um die Spiegel der entsprechenden Peptide zu bestimmen, sind dem Fachmann bekannt. Diese Verfahren umfassen Verfahren, die auf Mikroplatten-ELISA basiert sind, vollautomatisierte oder Roboter-Immunassays (erhältlich zum Beispiel für ElecsysTM Analysiergeräte), CBA (ein enzymatischer Kobalt-Bindungsassay, erhältlich zum Beispiel für Roche-HitachiTM Analysiergeräte) und Latex-Agglutinations-Assays (erhältlich zum Beispiel für Roche-HitachiTM Analysiergeräte).
  • Weiterhin ist der Fachmann mit verschiedenen Verfahren zur Messung des Spiegels eines Peptids oder eines Polypeptids vertraut. Der Begriff „Spiegel" bezieht sich auf die Menge oder Konzentration eines Peptids oder eines Polypeptids in einem Patienten oder in einer Probe, die dem Patient entnommen worden ist.
  • Der Begriff „Messen" gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung, vorzugsweise semi-quantitativ oder quantitativ, der Menge oder Konzentration der Nukleinsäure, des Peptids, des Polypeptids oder einer anderen Substanz von Interesse. Das Messen kann direkt oder indirekt ausgeführt werden. Indirektes Messen schließt Messen von Zellantworten, gebundenen Liganden, Markierungen oder enzymatischen Reaktionsprodukten ein.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich Menge auch auf Konzentration. Es ist offensichtlich, dass aus der Gesamtmenge einer Substanz von Interesse in einer Probe bekannter Größe die Konzentration der Substanz berechnet werden kann und umgekehrt.
  • Das Messen kann nach jedem Verfahren, das in der Technik bekannt ist, durchgeführt werden, wie beispielsweise Zellassays, enzymatische Assays oder Assays, die auf Ligandenbindung basieren. Bevorzugte Verfahren sind im Folgenden beschrieben.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Messung des Spiegels eines Peptids oder eines Polypeptids von Interesse die Schritte (a) des in Kontaktbringens eines Peptids oder eines Polypeptids mit einem geeigneten Substrat für einen angemessenen Zeitraum, (b) des Messens der Menge des Produkts.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Messung des Spiegels eines Peptids oder Polypeptids von Interesse die Schritte (a) des in Kontaktbringens eines Peptids oder Polypeptids mit einem spezifisch bindenden Liganden, (b) (optional) die Entfernung des ungebundenen Liganden, (c) des Messen der Menge des gebundenen Liganden.
  • Vorzugsweise ist das Peptid oder das Polypeptid in einer Probe, insbesondere einer Körperflüssigkeit oder einer Gewebeprobe, enthalten, und die Menge des Peptids oder des Polypeptids in der Probe wird gemessen.
  • Peptide und Polypeptide (Proteine) können in Gewebe-, Zell-, und Körperflüssigkeitsproben, das heißt vorzugsweise in vitro, gemessen werden. Vorzugsweise wird das Peptid oder das Polypeptid von Interesse in einer Körperflüssigkeitsprobe gemessen.
  • Eine Gewebeprobe gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf jede Gewebeart, die aus dem toten oder lebenden menschlichen oder tierischen Körper erhalten wird. Gewebeproben können durch jedes Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, erhalten werden, beispielsweise durch Biopsie oder durch Kürettage.
  • Körperflüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung können Blut, Blutserum, Blutplasma, Lymphflüssigkeit, zerebrale Flüssigkeit, Speichel, Glaskörperflüssigkeit und Urin einschließen. Vorzugsweise schließen Körperflüssigkeiten Blut, Blutserum, Blutplasma und Urin ein. Körperflüssigkeitsproben können durch jedes Verfahren, das in der Technik bekannt ist, erhalten werden.
  • Vorzugsweise ist die Probe Blut, Blutserum oder Blutplasma.
  • Falls notwendig, können die Proben weiter aufgearbeitet werden. Insbesondere können Nukleinsäuren, Peptide oder Polypeptide aus der Probe nach in der Technik bekannten Verfahren, einschließlich Filtration, Zentrifugation oder Extraktionsverfahren wie Chloroform/Phenolextraktion aufgereinigt werden.
  • Andere bevorzugte Verfahren zur Messung können die Messung der Menge eines Liganden, der spezifisch das Peptid oder das Polypeptid von Interesse bindet, umfassen. Binden gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst sowohl kovalentes als auch nicht-kovalentes Binden.
  • Ein Ligand gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedes Peptid, Polypeptid, jede Nukleinsäure oder andere Substanz sein, die das Peptid oder das Polypeptid von Interesse bindet. Es ist wohlbekannt, dass Peptide oder Polypeptide, wenn aus dem menschlichen oder tierischen Körper erhalten oder aufgereinigt, modifiziert sein können, beispielsweise durch Glykosylierung. Ein geeigneter Ligand gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Peptid oder das Polypeptid auch über solche Stellen binden.
  • Vorzugsweise sollte der Ligand spezifisch das Peptid oder Polypeptid, das gemessen werden soll, binden. „Spezifisch binden" gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass der Ligand nicht im wesentlichen („Kreuzreagieren” mit) andere Peptide, Polypeptide oder Substanzen, die in der untersuchten Probe vorhanden sind, binden sollte. Vorzugsweise sollte das spezifisch gebundene Protein oder die Isoform mit einer mindestens 3-fach höheren, bevorzugter mit einer mindestens 10-fach höheren und sogar noch bevorzugter mit einer mindestens 50-fach höheren Affinität als andere relevante Peptide oder Polypeptide gebunden sein.
  • Unspezifische Bindung kann tolerierbar sein, insbesondere wenn das untersuchte Peptid oder das Polypeptid noch unterschieden und eindeutig gemessen werden kann, beispielsweise durch Abtrennung aufgrund seiner Größe (beispielsweise durch Elektrophorese) oder durch dessen relativ hohen Überschuss in der Probe.
  • Das Binden des Liganden kann durch jegliche in der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Vorzugsweise ist das Verfahren semi-quantitativ oder quantitativ. Geeignete Verfahren sind im Folgenden beschrieben.
  • Erstens kann das Binden eines Liganden direkt gemessen werden, beispielsweise durch NMR oder durch Oberflächenplasmonresonanz.
  • Zweitens, wenn der Ligand auch als ein Substrat einer enzymatischen Aktivität des Peptids oder des Polypeptids von Interesse dient, kann das enzymatische Reaktionsprodukt gemessen werden (beispielsweise kann die Menge einer Protease gemessen werden; durch das Messen der Menge des gespaltenen Substrats, beispielsweise auf einem Western-Blot).
  • Vorzugsweise ist die Menge des Substrats zur Messung eines enzymatischen Reaktionsprodukts sättigend. Das Substrat kann auch vor der Reaktion mit einer detektierbaren Markierung markiert sein. Vorzugsweise wird die Probe mit dem Substrat für einen angemessenen Zeitraum in Kontakt gebracht. Ein angemessener Zeitraum bezieht sich auf die Zeit, die für die Produktion einer detektierbaren, vorzugsweise messbaren Menge des Produkts notwendig ist. Anstelle der Messung der Menge des Produktes kann die Zeit, die für das Auftreten einer bestimmten (beispielsweise detektierbaren) Menge eines Produktes notwendig ist, gemessen werden.
  • Drittens kann der Ligand an eine Markierung, die einen Nachweis und eine Messung des Liganden erlaubt, kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein.
  • Die Markierung kann durch direkte oder indirekte Verfahren durchgeführt werden. Eine direkte Markierung schließt die Bindung der Markierung direkt (kovalent oder nicht-kovalent) an den Liganden ein. Eine indirekte Markierung schließt die Bindung (kovalent oder nicht-kovalent) eines sekundären Liganden an den ersten Liganden ein. Der sekundäre Ligand sollte den ersten Liganden spezifisch binden. Der besagte sekundäre Ligand kann an eine geeignete Markierung gebunden sein und/oder das Ziel (Rezeptor) eines tertiären Liganden, der den sekundären Liganden bindet, sein. Die Verwendung eines sekundären, tertiären Liganden oder sogar eines Liganden höherer Ordnung wird häufig eingesetzt, um das Signal zu verstärken. Geeignete sekundäre Liganden oder Liganden höherer Ordnung können Antikörper, sekundäre Antikörper und das wohlbekannte Streptavidin-Biotin System (Vector Laboratories, Inc.) einschließen.
  • Der Ligand oder das Substrat können auch mit einem oder mehreren Tags, wie im Stand der Technik bekannt, „getagged" sein. Solche Tags können dann Ziele für Liganden höherer Ordnung sein. Geeignete Tags schließen Biotin, Digoxygenin, His-Tag, Glutathion-S-Transferase, FLAG, GFP, myc-Tag, Grippe-A-Virus-Hämaglutinin (HA), Maltose-bindendes Protein und dergleichen ein. Im Fall eines Peptids oder Polypeptids ist die Markierung vorzugsweise am N-Terminus und/oder C-Terminus.
  • Geeignete Markierungen sind jegliche Markierungen, die durch geeignete Nachweisverfahren nachweisbar sind. Übliche Markierungen schließen Goldpartikel, Latexperlen, Acridan-Ester, Luminol, Ruthenium, enzymatisch aktive Markierungen, radioaktive Markierungen, magnetische Markierungen („beispielsweise magnetische Perlen", einschließlich paramagnetischer und superparamagnetischer Markierungen) und fluoreszierende Markierungen ein.
  • Enzymatisch aktive Markierungen schließen beispielsweise Meerrettich-Peroxidase, alkaline Phosphatase, Beta-Galaktosidase, Luciferase und Derivate davon ein. Geeignete Substrate für die Detektion schließen Diaminobenzidin (DAB), 3,3'-5,5'-Tetramethylbenzidin, NBT-BCIP (4-Nitroblautetrazoliumchlorid und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphate, erhältlich als vorgefertigte Stammlösung von Roche Diagnostics), CDP-StarTM (Amersham Biosciences), ECFTM (Amersham Biosciences). Eine geeignete Enzym-Substrat-Kombination kann in ein gefärbtes Reaktionsprodukt, in Fluoreszenz oder Chemolumineszenz, die gemäß Verfahren, die in der Technik bekannt sind, gemessen werden können (beispielsweise durch Verwendung eines lichtsensitiven Films oder eines geeigneten Kamerasystems), resultieren. Was das Messen der enzymatischen Reaktion betrifft, gelten die oben genannten Kriterien analog.
  • Übliche Fluoreszenzmarkierungen schließen Fluoreszenzproteine (wie beispielsweise GFP und dessen Derivate) ein, Cy3, Cy5, Texas-Red, Fluoreszein und die Alexa-Farbstoffe (beispielsweise Alexa 568) ein. Weitere Fluoreszenzmarkierungen sind beispielsweise von Molecular Probes (Oregon) erhältlich. Auch ist die Verwendung von Quantenpunkten als Fluoreszenzmarkierung vorgesehen.
  • Übliche radioaktive Markierungen schließen ein: 35S, 125I, 32P, 33P und dergleichen. Eine radioaktive Markierung kann durch jedes bekannte und geeignete Verfahren, beispielsweise durch einen lichtsensitiven Film oder einen Phosphor-Imager nachgewiesen werden.
  • Geeignete Messmethoden gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen auch die Präzipitation (besonders Immunpräzipitation), Elektrochemilumineszenz (elektrogenerierte Chemilumineszenz), RIA (Radioimmunassay), ELISA (Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay), Sandwich-Enzym-Immunassays, Elektrochemilumineszenz-Sandwich-Immunassays (ECLIA), Dissoziation-verstärkter Lanthanid-Fluor-Immunassay (DELFIA), Szintillation-Proximity-Assay (SPA), Trübungsmessung, Nephelometrie, Latex-verstärkte Trübungsmessung oder Nephelometrie, Festphasen-Immunassays und Massenspektrometrie wie SELDI-TOF, MALDI-TOF oder Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS). Weitere in der Technik bekannte Verfahren (wie Gelelektrophorese, 2D-Gelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), Western Blotting), können alleine oder in Verbindung mit der Markierung oder anderen Nachweismethoden, wie oben beschrieben, verwendet werden.
  • Bevorzugte Liganden schließen Antikörper, Nukleinsäuren, Peptide oder Polypeptide und Aptamere, beispielsweise Nukleinsäure- oder Peptidaptamere ein. Verfahren für solche Liganden sind in der Technik wohlbekannt. Beispielsweise werden die Identifizierung und die Produktion geeigneter Antikörper oder Aptamere auch von gewerblichen Anbietern angeboten. Der Fachmann ist mit Verfahren zur Entwicklung von Derivaten solcher Liganden mit einer höheren Affinität oder Spezifität vertraut. Beispielsweise können Zufallsmutationen in die Nukleinsäuren, Peptide oder Polypeptide eingeführt werden. Diese Derivate können dann auf Bindung gemäß in der Technik bekannter Screening-Verfahren, beispielsweise Phage-Display, untersucht werden.
  • Der Begriff „Antikörper", wie hier verwendet, schließt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper, sowie Fragmente davon wie beispielsweise Fv-, Fab- und F(ab)2-Fragmente, die in der Lage sind, das Antigen oder Hapten zu binden, ein.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform befindet sich der Ligand, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, Peptiden, Polypeptiden, besonders bevorzugt aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, Antikörpern oder Aptameren, auf einem Array.
  • Dieser Array enthält mindestens einen zusätzlichen Liganden, der gegen ein Peptid, das Polypeptid oder eine Nukleinsäure von Interesse gerichtet sein kann. Dieser zusätzliche Ligand kann auch gegen ein Peptid, ein Polypeptid oder eine Nukleinsäure, das/die nicht von besonderem Interesse im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist, gerichtet sein. Vorzugsweise sind Liganden für mindestens 3, vorzugsweise für mindestens 5, bevorzugter für mindestens 8 Peptide oder Polypeptide von Interesse im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf dem Array enthalten.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Array" auf einen Festphasen- oder gelähnlichen Träger, auf dem mindestens zwei Verbindungen angeheftet oder in ein-, zwei- oder dreidimensionaler Anordnung gebunden sind. Solche Arrays (einschließlich „Genchips", „Proteinchips", Antikörperarrays und dergleichen) sind dem Fachmann allgemein bekannt und werden üblicherweise auf Mikroskopträgern aus Glas, speziell beschichteten Glasträgern wie Polykathion-, Nitrozellulose- oder Biotin-beschichteten Trägern, Objektträgern und Membranen wie beispielsweise Membranen, die auf Nitrozellulose oder Nylon basieren, erstellt.
  • Der Array kann einen gebundenen Liganden oder mindestens zwei Zellen, die jeweils mindestens einen Liganden exprimieren, umfassen.
  • Es ist auch vorgesehen, „Suspensionsarrays" als Arrays gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden (Nolan JP Sklar LA (2002). Suspension array technology: evolution of the flat array paradigm. Trends Biotechnology. 20(1): 9–12). In solchen Suspensionsarrays ist der Träger, beispielsweise eine Mikroperle oder eine Mikrosphäre, in der Suspension vorhanden. Der Array besteht aus verschiedenen Mikroperlen oder Mikrosphären, möglicherweise markiert, verschiedene Liganden tragend.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Arrays wie oben definiert, wobei mindestens ein Ligand zusätzlich zu anderen Liganden an das Trägermaterial gebunden ist.
  • Verfahren für die Herstellung solcher Arrays, beispielsweise basierend auf Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen, sind allgemein bekannt ( US 5,744,305 ). Solche Arrays können auch mit Substanzen oder Substanz-Bibliotheken in Kontakt gebracht werden und auf Interaktion, beispielsweise auf Binden oder auf Konfirmationsänderung, untersucht werden. Daher können Arrays, die ein Peptid oder ein Polypeptid, wie oben definiert, umfassen, für die Identifizierung von Liganden, die spezifisch diese Peptide oder Polypeptide binden, verwendet werden.
  • Abbildungsbeschriftungen:
  • 1 zeigt einen Kaplan-Meier-Plot der Zeit gegen ein erstes kardiovaskuläres Ereignis in Typ-2-Diabetes-Patienten mit Plasma-NT-proBNP-Konzentrationen bei Studienbeginn unterhalb (gestrichelte Linie) oder oberhalb des Medians in der gesamten Kohorte. P-Wert berechnet nach dem Log-Rank-Test. Prop. w/o e., Prozentsatz ohne Ereignisse; t, Zeit (Monate); NAR, gefährdete Anzahl; bel. med., Gruppe unterhalb des Medians; ab. med., Gruppe oberhalb des Medians.
  • 2 zeigt einen Kaplan-Meier-Plot der Zeit gegen Tod aufgrund einer kardiovaskulären Erkrankung oder der ersten Aufnahme aufgrund kongestiver Herzinsuffizienz in Typ-2-Diabetes-Patienten mit Plasma-NT-proBNP-Konzentrationen zu Studienbeginn unterhalb (gestrichelte Linie) oder oberhalb des Medians in der gesamten Kohorte. P-Wert mittels Log-Rank-Test berechnet. Prop. w/o e., Prozentsatz ohne Ereignisse; t, Zeit (Monate); NAR, gefährdete Anzahl; bel. Med., Gruppe unterhalb des Medians; ab. Med., Gruppe oberhalb des Medians.
  • 3 zeigt die mittleren Plasmaspiegel von NT-proBNP im Verlauf von Nachfolgeuntersuchungen in Patienten mit Plasma-NT-proBNP unterhalb (gestrichelte Linie) oder oberhalb des Medians in der Kohorte von 160 Typ-2-Diabetes-Patienten in der Steno-2-Studie. conc., Konzentration; t, Zeit (Jahre); ab. med., Gruppe oberhalb des Medians; bel. med., Gruppe unterhalb des Medians.
  • 4 zeigt Kaplan-Meier Kurven für Sterblichkeit jeglicher Ursache von Patienten mit diabetischer Nephropathie und NT-ProBNP Konzentration oberhalb versus unterhalb des Median-Wertes (110 ng/l) – Log-Rank-Test, p < 0.0001. Zum Vergleich ist die Kurve für normoalbuminurische Patienten in einer dünnen Linie gezeigt. Pro. D., Prozentsatz gestorben; t, Nachfolgeuntersuchungszeitraum (Jahre); nephrop., Nephropathie; normalb., Normoalbuminurie, NAR, gefährdete Anzahlen.
  • 5 zeigt Kaplan-Meier Kurven für kardiovaskuläre Sterblichkeit bei Patienten mit diabetischer Nephropathie und NT-proBNP-Konzentration oberhalb versus unterhalb des Medianwertes (110 ng/l) – Log-Rank-Test, p < 0.0001. Zum Vergleich ist die Kurve für normoalbuminurische Patienten in einer dünnen Linie gezeigt. Prop. CVD, Prozentsatz kardiovaskulärer Tod; t, Nachfolgeuntersuchungszeitraum (Jahre); nephrop., Nephropathie; normalb., Normoalbuminurie, NAR, gefährdete Anzahlen.
  • 6 zeigt einen Kaplan-Meier-Plot, der die Sterblichkeit jeglicher Ursache für Typ 1 diabetischer Nephropathie gemäß Plasma PIGF darstellt. Die Daten wurden im Verlauf der Steno-1-Studie wie in Beispiel 2 beschrieben erfasst. 1 – c.s., eins minus kumulatives Überleben; t, Nachfolgeuntersuchungszeitraum (Jahre).
  • 7 zeigt einen Kaplan-Meier-Plot, der die Sterblichkeit aufgrund kardiovaskulärer Erkrankung für Typ 1 diabetische Nephropathie gemäß Plasma PIGF darstellt. Die Daten wurden im Verlauf der Steno-1 Studie wie in Beispiel 2 beschrieben erfasst. 1 – c.s. CVD, eins minus kumulatives Überleben von Mortalität aufgrund kardiovaskulärer Erkrankung; t, Nachfolgeuntersuchungszeitraum (Jahre).
  • Beispiel 1
  • Aufbau der Studie
  • Der Aufbau der Studie und wesentliche Resultate der Steno-2-Studie sind bereits detailliert vorgestellt worden (Gæde, P., Vedel, P., Larsen, N. et al. (2003). Multifactorial intervention and cardiovascular disease in patients with type 2 dabetes. New England Journal of Medicine, vol. 348 (5), pp. 383: 93). Kurz zusammengefasst, wurden 160 mikroralbuminurische Typ-2-Diabetes-Patienten randomisiert und konventioneller (n = 80) oder intensivierter multifaktorieller Behandlung unterworfen, die auf zahlreiche begleitende Risikofaktoren gerichtet war. Patienten in der Intensivtherapiegruppe wurden mit schrittweise durchgeführten Eingriffen in die Lebensführung und pharmakologischen Eingriffen behandelt, die darauf gerichtet waren, die glykosylierten Haemoglobinwerte unterhalb von 6,5%, den Blutdruck unterhalb von 130/80 mm Hg, den Serum-Gesamtcholesterinspiegel im nüchternen Zustand unterhalb von 175 mg/dl, und den Serum-Triglyzeridspiegel im nüchternen Zustand unterhalb von 150 mg/dl zu halten. Empfohlene Eingriffe in die Lebensführung schlossen eine reduzierte Aufnahme von diätischem Fett, eine regelmäßige Teilnahme an leichten oder moderaten körperlichen Betätigungen, und Verzicht auf das Rauchen ein. Alle Teilnehmer in der Intensivtherapiegruppe wurden zudem angewiesen, Aspirin in geringer Dosis und einen Angiotensin-konvertierendes-Enzym-(ACE) Inhibitor, ungeachtet des Blutdruckspiegels, zu nehmen. Der durchschnittliche Nachfolgeuntersuchungszeitraum betrug 7,8 Jahre. Während des Untersuchungszeitraums hatte die intensive Gruppe für HbA1c, Serum-Gesamtcholesterin im nüchternen Zustand, LDL-Cholesterin und Triglyzeride, systolischen und diastolischen Blutdruck, und Harnalbuminausscheidungsrate (Gæde, supra) signifikant niedrigere Werte. Diese Änderungen standen mit signifikanten Reduktionen des Risikos für sowohl makrovaskuläre als auch mikrovaskuläre Erkrankungen in Zusammenhang (relative Risikoreduzierung 53% für kardiovaskuläre Erkrankungen, 61% für Fortschreiten zu Nephropathie, 58% für Fortschreiten zu Retinopathie und 63% für Fortschreiten zu autonomer Neuropathie) (Gæde, supra).
  • Alle 160 teilnehmenden Patienten wurden vom Steno-Diabetes-Center in den Jahren 1992–93 rekrutiert. Mikroalbuminurie wurde definiert als eine Harnalbuminausscheidungsrate (AER) von 30–300 mg pro 24 h in vier von sechs 24 h Urinproben. Diabetes wurde durch die WHO Kriterien von 1985 definiert. Ausschlusskriterien waren Alter älter als 65 oder jünger als 40 Jahre; eine stimulierte Serum C-Peptidkonzentration weniger als 600 pmol/l 6 min nach intravenöser Injektion von 1 mg Glukagon; pankreatische Insuffizienz oder Diabetes als Folgeerkrankung der Pankreatitis; Alkoholmissbrauch; nicht-diabetische Nierenerkrankung; Malignität oder eine lebensbedrohliche Erkrankung mit einem wahrscheinlichen Tod innerhalb von 4 Jahren. Eine Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern erhalten. Das Protokoll entsprach der Helsinki-Erklärung und wurde von der Ethikkommission des Landkreises Kopenhagen genehmigt.
  • In der vorliegenden Post-Hoc-Analyse wurden die Patienten in zwei Gruppen gemäß Plasma-NT-proBNP zu Studienbeginn unterhalb des Median- oder oberhalb des Medianspiegels der Kohorte eingeteilt.
  • Endpunkte
  • Der primäre Endpunkt während der Studie war ein kombinierter Endpunkt für kardiovaskuläre Erkrankungen, umfassend kardiovaskuläre Sterblichkeit, nicht-tödlicher Myokard-Infarkt, nicht-tödlicher Schlaganfall, perkutane koronare Eingriffe, koronarer arterieller Bypass, vaskuläre Operationen und Amputationen. Ein sekundärer Endpunkt, umfassend kardiovaskuläre Sterblichkeit und stationäre Aufnahme aufgrund kongestiver Herzinsuffizienz, wurde auch untersucht.
  • Assays
  • Alle Blutproben wurden um 0800 nach einer Nacht ohne Nahrungsaufnahme genommen. Die Patienten nahmen ihre Arzneimittel am Morgen des Tages der Blutprobennahme nicht.
  • Nachdem die Patienten für mindestens 20 Minuten im Ruhezustand in Rückenlage gewesen waren, wurden Blutproben für die Analyse von Plasma-NT-proBNP entnommen, zentrifugiert, und das Plasma wurde bis zur Analyse bei –80°C gelagert. Die NT-proBNP Plasmakonzentrationen wurden durch einen Sandwich-Immunassays mittels eines Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Deutschland) gemessen. Die analytische Spanne erstreckte sich von 5 bis 35000 pg/ml, und der Gesamtkoeffizient der Variation war < 0,061 in humanen Plasma-Mischproben. Für die Übertragung von pg/ml in pmol/l wurde mit 0,118 multipliziert. Blutproben wurden zu Studienbeginn und nach 2, 4 und 8 Jahren in der Nachfolgeuntersuchung genommen.
  • Statistik
  • Der Vergleich der Gruppen zu Studienbeginn wurde durch einfache Analyse der Varianz oder des Mann-Whitney Tests im Falle der Eignung für numerische Variablen durchgeführt. Chi-Quadrattest oder der exakte Test nach Fisher wurden verwendet, um kategorische Variablen zu vergleichen.
  • Da sich die zwei ursprünglichen Behandlungsgruppen signifikant hinsichtlich des Risikos für eine kardiovaskuläre Erkrankung unterschieden, wurde in jeder dieser Gruppen die Funktion von Plasma-NT-proBNP als ein Risikomarker für kardiovaskuläre Erkrankung separat analysiert. Dabei wurde der Median-Wert innerhalb jeder ursprünglichen Behandlungsgruppe als Grenzwert für die Gruppe unterhalb oder oberhalb des Medians sowie in einer kombinierten Gruppe verwendet.
  • Die Ereigniskurven für die Zeit bis zum ersten Ereignis in Bezug auf die primären und sekundären Endpunkte basierten auf Kaplan-Meier-Analyse, und die beiden Gruppen wurden unter Verwendung des Log-Rank-Tests verglichen. Die Hazard-Ratios mit Konfidenzintervallen von 95% wurden unter Verwendung eines Cox-Regressionsmodells berechnet. Die Ergebnisse sind sowohl unbereinigt als auch in zwei Modellen mit Bereinigung für die Risikofaktoren für kardiovaskuläre Erkrankung in Patienten mit Typ-2-Diabetes dargestellt; Modell 1 mit Bereinigung um bekannte Diabetesdauer, bekannte kardiovaskuläre Erkrankung zu Studienbeginn, Geschlecht und Alter wie zuvor berichtet, und Modell 2 mit weiteren Bereinigungen um den systolischen und den diastolischen Blutdruck, glykosyliertes Hämoglobin A1c, Serum-Gesamtcholesterin im nüchternen Zustand, HDL-Cholesterin, LDL-Cholesterin, Triglyzeride und Harnalbuminausscheidungsrate. Die Ergebnisse für die kombinierte Kohorte wurden außerdem der ursprünglichen Behandlungszuordnung angepasst. Änderungen bezüglich des Plasma-NT-proBNP Spiegels während des Zeitraumes, innerhalb dessen die zwei Behandlungsgruppen verglichen worden sind, wurden mittels Wilcoxon-Test verglichen.
  • Ergebnisse
  • Die Spanne der Nüchtern-Plasmidspiegel von NT-proBNP zu Studienbeginn war 5 (geringster nachweisbarer Wert) bis 1290 pg/ml mit einem Medianwert von 33,5 pg/ml in der gesamten Steno-2-Kohorte, wohingegen die Werte in der ursprünglichen Intensivtherapiegruppe im Bereich von 5 bis 1190 (Median 35,3) pg/ml waren und in der konventionellen Therapiegruppe im Bereich von 5 bis 1134 (Median 32,0) pg/ml waren. Die Charakteristika der zwei Gruppen bei Studienbeginn sind in Tabelle 1 gezeigt. Hohe Plasma-NT-proBNP Spiegel zu Studienbeginn hingen mit einer längeren Diabetesdauer, höherem Alter, höherem systolischen Blutdruck und beeinträchtigter Nierenfunktion zusammen. Ebenso wurde zu Studienbeginn ein höherer Prozentsatz an Patienten in der Gruppe oberhalb des Medians mit Kalzium-Antagonisten behandelt (Tabelle 1). Tabelle 1 Charakteristika bei Studienbeginn von 160 Typ-2-Diabetes-Patient gemäßen Plasma N-terminal-proBNP bei Studienbeginn unterhalb oder oberhalb des Medians in der Gesamtkohorte.
    Gruppe unterhalb des Medians N = 80 Gruppe oberhalb des Medians N = 80 p-Wert
    HbA1c (%)* 8,7 (0,2) 8,4 (0,2) 0,29
    Systolischer BP (mm Hg)* 143 (1,9) 153 (2,2) 0,002
    Diastolischer BP (mm Hg)* 86 (1,0) 85 (1,3) 0,39
    Serum Gesamtcholesterin im nüchternen Zustand (mg/dl)* 224 (4) 209 (4) 0,048
    Serum-HDL-Cholesterin im nüchternen Zustand (mg/dl)* 40 (1) 39 (1) 0,62
    Serum-Triglyzerid im nüchternen Zustand (mg/dl)† 186 (62–992) 168 (44–1993) 0,09
    Bekannte Diabetesdauer (Jahre)† 5 (0–26) 7 (0–30) 0,003
    Geschlecht (n) 59 ♂/21 ♀ 60 ♂/20 ♀ 0,96
    Raucher (n) 28 32 0,55
    Serum-Kreatinin (μmol/l)* 74 (1,5) 80 (2,1) 0,015
    Gewicht (kg)* 92,8 (1,7) 89,1 (1,8) 0,13
    Glomeruläre Filtrationsrate (ml/min/1,73 m2)* 125 (2,4) 109 (2,8) < 0,0001
    Bekannte kardiovaskuläre Erkrankung (n) 7 14 0,11
    Linksventrikulärer Massenindex* 110 (2,9) 126 (4,2) 0,001
    Alter (Jahre)* 52 (0,8) 58 (0,7) < 0,0001
    NT-proBNP (pg/ml)† 13,0 (< 5–32,8) 69,7 (33,5–1290) < 0,0001
    Harn-Albuminausscheidung (mg/24 h)† 70 (32–286) 80 (33–265) 0,11
    Harn-Natriumausscheidung (mmol/24 h)† 213 (46–577) 176 (25–449) 0,19
    Medikamentierung
    ACE-Inhibitoren (n) 13 18 0,42
    Diuretika (n) 14 25 0,07
    Beta-Blocker (n) 4 5 1,00
    Kalzium-Blocker (n) 3 13 0,02
    Behandlungszuordnung 41 intensiv 39 intensiv 0,69
    • * Mittelwert (Standardfehler), † Median (Bereich)
  • Um die Werte für Cholesterin in mmol/l zu übertragen, wurde mit 0,02586 multipliziert.
  • Um die Werte für Triglyzeride in mmol/l zu übertragen, wurde mit 0,01129 multipliziert.
  • Um die Werte für NT-proBNP in pmol/l zu übertragen, wurde mit 0,118 multipliziert.
  • Während des mittleren Nachfolgeuntersuchungszeitraums von 7,8 Jahren wurden 12 bedeutende kardiovaskuläre Ereignisse in der Gruppe mit Plasma-NT-proBNP unterhalb des Medianwertes verglichen mit 54 Ereignissen in der Gruppe oberhalb des Medianwertes beobachtet, p < 0,0001 (1). Ebenso wurde die signifikante Korrelation zwischen kardiovaskulärer Erkrankung und dem Plasma-NT-proBNP-Spiegel in jeder der beiden ursprünglichen Behandlungsgruppen der Steno-2-Studie, wie in Tabelle 1 gezeigt, beobachtet. Die Bereinigung der Risikofaktoren um kardiovaskuläre Erkrankung in Typ-2-Diabetes hat die Signifikanz der Korrelation in jeglichen Bereinigungsmodellen nicht geändert (Tabelle 2). Tabelle 2 zeigt die Harzard Ratio (95% CI) für die primären und sekundären Endpunkte in Typ-2-Diabetes-Patienten mit Plasma-NT-proBNP-Spiegeln oberhalb des Medians verglichen mit Patienten mit Plasma-Spiegeln unterhalb des Medians (Feld A) oder unter Verwendung eines Grenzwert-Spiegels von 125 pg/ml (Feld B). Modell 1 ist um die bekannte kardiovaskuläre Erkrankung zu Studienbeginn, die bekannte Dauer der Diabetes, Alter und Geschlecht bereinigt. Modell 2 ist um die Variablen in Modell 1 sowie um den systolischen und diastolischen Blutdruck, glykosyliertes Hämoglobin A1c, Serum-Lipide im nüchternen Zustand und Harnalbuminausscheidungsrate bereinigt. Tabelle 2:
    Feld A Intensive Gruppe Konventionelle Gruppe Kombinierte Gruppe
    Primärer Endpunkt
    Unbereinigt 6,1 (1,8–20,9) p = 0,004 3,1 (1,5–6,5) p = 0,002 4,4 (2,3–8,4) p < 0,0001
    Modell 1 4,7 (1,2–17,7) p = 0,022 2,3 (1,0–5,0) p = 0,038 3,3 (1,7–6,5) p = 0,001
    Modell 2 4,1 (1,0–16,7) p = 0,048 3,0 (1,2–7,6) p = 0,021 3,6 (1,7–7,5) p = 0,001
    Sekundärer Endpunkt
    Unbereinigt 7,3 (0,9–59,3) p = 0,06 3,3 (1,1–10,2) p = 0,036 5,8 (2,0–16,9) p = 0,0001
    Modell 1 4,4 (0,4–48,2) p = 0,23 3,3 (0,9–12,3) p = 0,08 4,4 (1,3–14,3) p = 0,015
    Modell 2 3,0 (0,3–32,7) p = 0,38 5,2 (1,0–26,1) p = 0,044 8,4 (2,0–36,3) p = 0,004
    Feld B Intensive Gruppe Konventionelle Gruppe Kombinierte Gruppe
    Primärer Endpunkt
    Unbereinigt 6,0 (2,3–15,3) p = 0,0002 3,4 (1,8–8,0) p = 0,001 4,7 (2,6–8,4) p < 0,001
    Modell 1 5,7 (2,0–16,3) p = 0,001 2,4 (1,0–5,6) p = 0,048 3,0 (1,6–5,7) p = 0,001
    Modell 2 7,1 (1,9–27,1) p = 0,004 2,9 (1,0–8,6) P = 0,047 3,3 (1,7–6,7) p = 0,001
    Sekundärer Endpunkt
    Unbereinigt 8,7 (2,2–34,9) p = 0,002 4,1 (1,5–11,2) p = 0,007 5,3 (2,4–12,0) p < 0,0001
    Modell 1 7,4 (1,5–37,2) p = 0,015 2,9 (0,9–9,4) p = 0,08 3,4 (1,4–8,2) p = 0,006
    Modell 2 15,1 (1,0–238,0) p = 0,054 2,4 (0,6–10,0) p = 0,24 4,5 (1,5–13,5) p = 0,007
  • Die Hazard-Ratio für den sekundären Endpunkt war auch mit dem Plasma-NT-proBNP Spiegel zu Studienbeginn signifikant korreliert, sowohl unbereinigt als auch um die klassischen Risikofaktoren bereinigt (2). Obwohl Hazard-Ratios ähnlicher Größenordnung in beiden analysierten ursprünglichen Behandlungsgruppen beobachtet wurden, schwächte die Bereinigung die Signifikanz von Plasma-NT-proBNP als Risikomarker aber ab (Tabelle 2).
  • In einem Ansatz, in dem ein Grenzwertspiegel für Plasma-NT-proBNP von 125 pg/ml angewandt wurde, änderte sich die Signifikanz und die Höhe des Risikos für die primären und die sekundären Endpunkte im Vergleich zu einem niedrigeren Grenzwertspiegel in der vorliegenden Kohorte nicht wesentlich (Tabelle 2).
  • Bei Messung zwei Jahre nach dem Start der Studie waren in der kombinierten Kohorte die Plasma-NT-proBNP-Spiegel mit 14,9 pg/ml, p < 0,0001, signifikant erhöht, und ein ähnliches Resultat wurde in der intensiven und in der konventionellen Therapiegruppe beobachtet (11,7 pg/ml, p = 0,001 beziehungsweise 18,2 pg/ml, p < 0,0001). Die Erhöhung des Median-Spiegels für Plasma-NT-proBNP setzte sich sowohl in der Gruppe unterhalb als auch oberhalb des Medians während der Nachfolgeuntersuchung, wie in 3 gezeigt, fort. Dies war auch der Fall, wenn die ursprüngliche, intensivierte Therapiegruppe und die konventionelle Therapiegruppe separat analysiert wurden.
  • Änderungen für Plasma-NTproBNP während der ersten zwei Jahre des Eingriffes waren signifikant mit dem Risiko eines kardiovaskulären Ereignisses während der übrigen Nachfolgeuntersuchungsperiode korreliert. Eine Reduzierung des Plasma-NT-proBNP Spiegels in der kombinierten Kohorte um 10 pg/ml war mit einer signifikanten Reduzierung des relativen Risikos um 1% sowohl in der intensiven, konventionellen als auch der kombinierten Kohorte, sowohl für den primären als auch für den sekundären Endpunkt, verknüpft (p < 0,001 in allen Fällen). Insgesamt reduzierten 42 Patienten den Plasma-NT-proBNP Spiegel während der ersten zwei Jahre der Nachfolgeuntersuchung mit einer mittleren Abnahme um 12 pg/ml. 18 Patienten aus der Gruppe, die bei Studienbeginn oberhalb des Medians eingeordnet wurden, erreichten nach zweijähriger Intervention den Spiegel unterhalb des Medians. Das Erreichen dieses Spiegels war jedoch, verglichen mit Patienten, die diesen Spiegel nicht erreichten, nicht mit einem reduzierten Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung verknüpft (Hazard-Ratio 0,45 (0,12–1,65, p = 0,23).
  • Die Korrelation zwischen dem Plasma-NT-proBNP Spiegel und dem Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung während der verbliebenen Nachfolgeuntersuchungsperiode blieb nach 2 Jahren für sowohl den primären als auch den sekundären Endpunkt signifikant.
  • In der vorliegenden Post-hoc Analyse der Steno-2-Studie haben wir eine signifikante und unabhängige Korrelation zwischen Plasma-NT-proBNP Spiegeln und dem zukünftigen Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung sowie für einen sekundären Endpunkt, umfassend kardiovaskuläre Sterblichkeit und stationäre Aufnahme aufgrund kongestiver Herzinsuffizienz in Patienten mit Typ-2-Diabetes und Mikroalbuminurie, gezeigt.
  • Zusammengefasst spielt Plasma-NT-proBNP in Patienten mit Typ-2-Diabetes eine Rolle als ein starker Risikomarker fix kardiovaskuläre Erkrankung und kongestive Herzinsuffizienz.
  • Beispiel 2
  • Patienten und Aufbau der Studie
  • 1993 wurden alle Typ-1-Diabetes-Patienten mit diabetischer Nephropathie (n = 242), die an der ambulanten Klinik des Steno-Diabetes Centers behandelt wurden, in denen die glomeruläre Filtrationsrate innerhalb des gleichen Jahres gemessen wurde, gebeten, an einer Fall-Kontroll-Studie teilzunehmen (Tarnow, L., Cambien, F., et al. (1995). Insertion/deletion polymorphism in the angiotension-I-converting enzyme gene is associated with coronary heart disease in IDDM patients with diabetic nephropathy. Diabetologica, vol. 38, pp. 798–803). Insgesamt wurden 199 Patienten einbezogen, die die klinischen Kriterien für diabetische Nephropathie erfüllten (persistierende Makroalbuminurie (> 300 mg/24 h) in mindestens 2 von 3 aufeinander folgenden 24-stündigen Urinproben, in Gegenwart von diabetischer Retinopathie und in Abwesenheit von anderen Nieren- oder Harntrakterkrankungen (Parvin H-H, Østerby R, Ritz E. Diabetic nephropathy. In Brenner BM, ed. The Kidney, pp 1777–818. Philadelphia: WB Saunders, 2003)). Eine Gruppe von 192 Patienten mit lang anhaltendem Typ-1-Diabetes und persistierender Normoalbuminurie diente als Kontrolle. Plasma-NT-proBNP wurde in 198 Patienten mit Nephropathie und in 188 Patienten mit Normoalbuminurie gemessen. In einem prospektiven Beobachtungsstudienaufbau wurden die Patienten bis zum 1. Februar 2003 oder bis zum Tod (n = 62) oder bis zur Auswanderung (n = 3) untersucht. Die Studie wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt, in Übereinstimmung mit der Helsinki-Erklärung, und alle Patienten gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung ab.
  • Klinische Untersuchungen und Laboruntersuchungen bei Studienbeginn
  • Die Untersuchungen wurden morgens nach einer Nacht ohne Nahrungsaufnahme durchgeführt. 24% der Patienten mit Nephropathie und 88% der Patienten mit Normoalbuminurie wurden nie antihypertensive Medikamente verschrieben. Alle übrigen Patienten wurden gebeten, ihre antihypertensive und diuretische Behandlung 8 Tage vor der Untersuchung einzustellen. Jedoch wollten nicht alle Patienten dies tun, und so haben 34% beziehungsweise 4% der Patienten in der Nephropathie- beziehungsweise in der Normoalbuminurie-Gruppe antihypertensive Medikamente am Tag der Untersuchung genommen.
  • Der arterielle Blutdruck wurde zweimal in Rückenlage nach mindestens 10 Minuten im Ruhezustand mit einer Manschette geeigneter Größe gemessen. Die Harnalbuminkonzentration wurde in 24-stündigen Urinproben mittels eines Enzym-Immunassays gemessen: (Feldt-Rasmussen B, Dinesen B, Deckert M. Enzyme immunoassay; an improved determination of urinary albumin in diabetics with incipient nephropathy. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1985; 45: 539–44). Die Kreatinin-Konzentration im Serum wurde durch die kinetische Methode nach Jaffé bestimmt. Die glomeruläre Filtrationsrate wurde in Patienten mit diabetischer Nephropathie nach einer einzelnen Injektion von 3,7 MBq 51Cr-EDTA durch Bestimmung der Radioaktivität in venösen Blutproben, die 180, 200, 220 und 240 Minuten nach der Injektion genommen worden waren, gemessen. In normoalbuminurischen Patienten wurde die glomeruläre Filtrationsrate durch die Modification of Diet in Renal Disease (MDRD)-Formel abgeschätzt (Levey AS, Bosch JP, Lewis JB, Greene T, Rogers N, Roth D et al. A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a new prediction equation. Ann. Intern. Med. 1999; 130: 461–70). Diabetische Retinopathie wurde in allen Patienten nach Pupillenerweiterung durch Fundus-Fotografie beurteilt und als nicht vorhandene, einfache oder proliferative Retinopathie eingestuft. Die Patienten wurden unter Verwendung des kardiovaskulären Fragebogens der WHO befragt. Größere kardiovaskuläre Ereignisse wurden aufgrund einer Vorgeschichte bezüglich Schlaganfall und/oder Myokard-Infarkt diagnostiziert. Raucher wurden als Personen, die täglich eine oder mehr Zigaretten/Zigarren/Pfeifen rauchen, definiert, alle anderen wurden als Nichtraucher eingestuft.
  • NT-proBNP Messungen
  • Nachdem die Patienten mindestens 20 Minuten in Rückenlage in Ruhezustand gewesen waren, wurden Blutproben für die Bestimmung von NT-proBNP genommen, zentrifugiert, und das Plasma wurde bei –80°C bis zur Analyse gelagert. Die NT-proBNP Plasma-Konzentrationen wurden durch einen Sandwich-Immunassay in einem Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) gemessen. Die Variation innerhalb des Tests ist niedriger als 3,0% und der Gesamtkoeffizient der Variation liegt im Bereich zwischen 2,2 und 5,8% für niedrige und hohe Bereiche von NT-proBNP.
  • Nachuntersuchungen
  • Alle Patienten wurden während des Sommers 2003 durch das nationale Register ausfindig gemacht. Wenn ein Patient vor dem 1. Februar 2003 verstorben war, wurde das Todesdatum vermerkt, und Informationen über die Todesursache wurden vom Totenschein erhalten. Alle Totenscheine wurden unabhängig von zwei Gutachtern bewertet, und die primäre Todesursache wurde vermerkt. Zusätzlich erhältliche Informationen von Berichten der Leichenschau wurden einbezogen. Alle Tode wurden als kardiovaskuläre Tode eingeordnet, außer wenn eine eindeutige nicht-kardiovaskuläre Ursache ausgemacht wurde (Pfeffer MA, Swedberg K, Granger CP, Held P, McMurray JJV, Michelson EL et al. Effects of candesartan an mortality and morbidity in patients with chronic heart failure: the CHARM-overall programme. Lancet 2003; 362: 759–66).
  • Statistische Analyse
  • Normalverteilte Variablen sind als Mittelwerte ±SD angegeben, wohingegen nicht normal verteilte Variablen log transformiert wurden und als Medianwerte (Bereich) angegeben wurden. Vergleiche zwischen Gruppen wurden durch einen unpaarigen Student's t-test oder ANOVA durchgeführt. Ein Chi-Quadrat wurde verwendet, um unstetige Variablen zu vergleichen. Analysen des Verhältnisses zwischen NT-proBNP bei Studienbeginn und dem Vorhandensein/Nichtvorhandensein von Nephropathie oder bedeutender kardiovaskulärer Erkrankung wurden um Geschlecht, Alter, systolischer Blutdruck und glomerulärer Filtrationsrate bereinigt. Ein zweiseitiger p-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant erachtet.
  • Alle „Zeit bis zum Tod"-Variablen wurden mit dem Log-Rank Test analysiert und in einem Kaplan-Meier-Plot entsprechend des Vorhandenseins von Nephropathie oder NT-proBNP Spiegeln oberhalb oder unterhalb des Medianwertes dargestellt. In Patienten mit Nephropathie wurden die um Kovariaten bereinigten Cox-Regressionsmodelle an die folgenden vorspezifizierten Kovariaten bei Studienbeginn angepasst: Geschlecht, Alter, glomeruläre Filtrationsrate, Rauchen, Vorgeschichte für bedeutende kardiovaskuläre Erkrankung, anhaltende hypertensive Medikamentierung zum Zeitpunkt der Blutentnahme und log10 NT-proBNP oder NT-proBNP oberhalb beziehungsweise unterhalb des Medianwertes (110 ng/l). Weitere Bereinigungen wurde nicht durchgeführt, um eine Überanpassung des Modells zu vermeiden. Die Ergebnisse sind als „Hazard-Ratios" mit Konfidenz-Intervallen von 95% ohne oder mit Bereinigung um weitere Faktoren, die die Prognose beeinflussen können, beschrieben.
  • Alle Berechnungen wurden mit einem gewerblich erhältlichen Programm durchgeführt (SPSS für Windows, Version 10.0).
  • Ergebnisse
  • Typ 1 diabetische Patienten mit und ohne diabetische Nephropathie wurden in Hinblick auf Geschlecht, Alter und Dauer der Diabetes verglichen. Im Vergleich zu Patienten mit Normoalbuminurie wiesen Patienten mit diabetischer Nephropathie erhöhten Blutdruck, erhöhtes HbA1c, erhöhtes Serum-Cholesterin und eine niedrigere glomeruläre Filtrationsrate, p < 0,0001, auf. Im Durchschnitt war die glomeruläre Filtrationsrate in Patienten mit diabetischer Nephropathie gut erhalten (Tab. 3). TABELLE 3 – Klinische Charakteristika und Laborcharakteristika von 386 Typ-1-Diabetes-Patienten mit und ohne diabetischer Nephropathie.
    Nephropathie n = 198 Normoalbuminurie N = 188 P-Wert
    Geschlecht (männlich/weiblich) 122/76 114/74 0,84
    Alter (Jahre) 41,0 (9,5) 42,5 (9,9) 0,14
    Dauer der Diabetes (Jahre) 27,7 (8,0) 26,8 (8,5) 0,26
    Retinopathie (nicht vorhanden/einfach/proliferativ) 0/137/61 66/103/19 < 0,001
    Vorgeschichte für MI 10 (5,1%) 2 (1,1%) 0,036
    Vorgeschichte für Schlaganfall 14 (7,1%) 1 (0,5 %) 0,001
    BMI (kg/m2) 24,0 (3,3) 23,7 (2,5) 0,20
    HbA1c (%) 9,6 (1,5) 8,5 (1,1) < 0,001
    Harnalbuminausscheidung (mg/24 h) 794 (16–14545) 8 (1–30) -
    S-Kreatinin (μmol/l) 103 (54–684) 76 (40–116) < 0,001
    GFR (ml/min) 74 (33) 94 (16) < 0,001
    Systolischer Blutdruck (mm Hg) 151 (23) 132 (18) < 0,001
    Diastolischer Blutdruck (mm Hg) 86 (13) 76 (10) < 0,001
    Antihypertensive Arzneimittel bei 34% 4% < 0,001
    Probenahme (%)
    S-Cholesterin (mmol/l) 5,6 (1,2) 4,8 (1,0) < 0,001
    S-HDL-Cholesterin (mmol/l) 1,46 (0,54) 1,56 (0,53) 0,07
    S-Triglyzeride (mmol/l) 1,22 (0,30 – 9,90) 0,77 (0,30 – 3,10) < 0,001
    Raucher (%) 50% 43% 0,17
  • Die Daten sind n, Mittelwerte (Standardabweichungen), Mediane (Bereich). Einige Patienten mit zuvor persistierender Albuminurie, die antihypertensive Medikamente erhalten haben, hatten eine Harnalbuminausscheidungsrate < 300 mg/24 h.
  • In Patienten mit diabetischer Nephropathie war die Plasma-NT-proBNP Konzentration erhöht 110 (5–79640) ng/l (Median (Bereich)) gegenüber 27 (5–455) ng/l in Patienten mit Normoalbuminurie, p < 0,0001. Dieser Unterschied bestand nach Bereinigung der Unterschiede in der glumerulären Filtrationsrate und um andere Kovariaten, p < 0,0001. Die NT-proBNP Konzentration war frühzeitig in diabetischer Nephropathie erhöht (40 (5–3111) ng/l), zu einem Zeitpunkt, als die glomeruläre Filtrationsrate noch im normalen Bereich (> 100 ml/min) war.
  • In der Nephropathie-Gruppe unterschied sich die Plasmakonzentration von NT-proBNP zwischen Typ-1-Diabetes Männern und Frauen (p = 0,28) nicht signifikant, aber stieg mit Alter (r = 0,42, p < 0,0001), systolischem Blutdruck (r = 0,53, p < 0,0001) an und nahm mit der glomerulären Filtrationsrate (r = –0,60, p < 0,0001) und Hämoglobin (r = –0,52, p < 0,0001) ab.
  • Zwischen NT-proBNP und entweder Blutglukose, HbA1c oder Serum-Cholesterin wurden keine Korrelationen beobachtet. Zwischen diabetischer Retinopathie und NT-proBNP wurde kein Zusammenhang gefunden. Unter Patienten mit diabetischer Nephropathie waren die zirkulierenden NT-proBNP-Konzentrationen höher in Patienten, die zum Zeitpunkt der Probennahme antihypertensive Medikamente nahmen, dieser Unterschied verschwand jedoch nach Bereinigung um die glomeruläre Filtrationsrate.
  • Zwischen geschätzter glomerulärer Filtrationsrate (Median 92 ml/min/1,73 m2 (Bereich: 45–170)) und Plasma-NT-proBNP (r = –0,22, p = 0,002) wurde für Patienten mit Normoalbuminurie wurde eine schwach inverse Korrelation gezeigt.
  • Die Prävalenz größerer kardiovaskulärer Ereignisse unterschied sich in Patienten mit und ohne diabetischer Nephropathie, 11% (95% CI: 8–14) und beziehungsweise 2% (0–4), p < 0,0001. Für Patienten mit Nephropathie war Plasma-NT-proBNP bei Studienbeginn in Patienten mit einer Vorgeschichte entweder eines nicht-tödlichen Myokard-Infarkts und/oder Schlaganfalls (671 (34–12418) ng/l, p < 0,0001) im Vergleich zu denjenigen Patienten ohne eine Vorgeschichte einer bedeutenden kardiovaskulären Erkrankung erhöht (97 (5–79640) ng/l). Nach Bereinigung um mögliche Störfaktoren bewirkte ein 10-facher Anstieg von NT-proBNP einen Anstieg des Odds-Ratios eines bedeutenden kardiovaskulären Ereignisses um 3,1 (95% CI 1,2–7,8), p = 0,02.
  • Während des Nachfolgeuntersuchungszeitraumes starben 51 (26%) Patienten mit und 11 (6%) ohne Nephropathie, p < 0,0001. Aufgrund der geringen Anzahl an Ereignissen in der normoalbuminurischen Gruppe sind weitere Analysen auf Patienten mit Nephropathie beschränkt. Innerhalb der Nephropathie-Gruppe betrug der Medianwert für Plasma-NT-proBNP 110 ng/l, und 39 (39%) der Patienten mit Werten oberhalb und 12 (12%) der Patienten mit Werten unterhalb dieses Wertes starben aufgrund jeglicher Ursache. Die unbereinigte Hazard-Ratio betrug 3,86 (95% CI 2,02–7,37), p < 0,0001; Kovariaten bereinigte Hazard-Ratio 2,28 (1,04–4,99, p = 0,04 – 4). Diese geringere Sterblichkeit war weniger kardiovaskulären Toden zuschreibbar: 31 (31%) und 7 (7%) oberhalb bzw. unterhalb des Medianspiegels für NT-proBNP (unbereinigte Hazard-Ratio 5,25 (2,31–11,92), p < 0,0001; Kovariaten bereinigt 3,81 (1,46–9,94, p = 0,006 – 5). Der Effekt von Plasma-NT-proBNP auf die Sterblichkeit jeglicher Ursache und die kardiovaskuläre Sterblichkeit blieb nach Bereinigung um Unterschiede bezüglich der glomerulären Filtrationsrate signifikant. Weiterhin war die Wechselbeziehung zwischen NT-proBNP und der glomerulären Filtrationsrate nicht signifikant. Dies deutet daher an, dass der Effekt der NT-proBNP-Konzentration auf die Sterblichkeit und kardiovaskuläre Sterblichkeit nicht vom Spiegel der glomerulären Filtrationsrate abhängig ist. Weitere Bereinigung um Serum-Cholesterin und systolischen Blutdruck änderten die Hazard-Ratios nicht substantiell, und die Ergebnisse blieben signifikant.
  • Die Gesamtsterblichkeit (Log-Rank-Test, p = 0,06) und die kardiovaskuläre (p = 0,07) und die Sterblichkeit von Patienten mit Nephropathie und einem Plasma-NT-proBNP Spiegel unterhalb 110 ng/l war von der normoalbuminurischen Gruppe statistisch nicht verschieden (2 und 3).
  • Die Anwendung des Grenzwertes von 125 ng/l NT-proBNP, der in den USA empfohlen wird, änderte die Kovariaten bereinigten Hazard-Ratios für Sterblichkeit jeglicher Ursache und kardiovaskulärer Sterblichkeit nur leicht: 2,68 (1,24 bis 5,79), p = 0,01 bzw. 4,09 (1,61 bis 10,41), p = 0,003.
  • Cox-Regressionsanalysen, die die NT-proBNP Konzentration als stetige Variable einbezogen, zeigten eine unbereinigte Hazard-Ratio für die Sterblichkeit jeglicher Ursache von 3,39 (2,38–4,82), p < 0,001, für jeden 10-fachen Anstieg von NT-proBNP; Kovariaten bereinigt 2,67 (1,62–4,42) p < 0,0001. Entsprechend war die unbereinigte Hazard-Ratio für die kardiovaskuläre Mortalität für jeden 10-fachen Anstieg von NT-proBNP 3,58 (2,40–5,36), p < 0,0001; Kovariaten bereinigt 3,32 (1,90–5,81), p < 0,0001.
  • Zusammengefasst ist erhöhtes, zirkulierendes NT-proBNP ein unabhängiger Prädiktor für die übermäßige Gesamtsterblichkeit und kardiovaskuläre Sterblichkeit aufgrund diabetischer Nephropathie. Die Messung von NT-proBNP fügt vorhandenen Verfahren diagnostische Information hinzu und kann die Anleitung der Handhabung von Typ-1-Diabetes-Patienten mit diabetischer Nephropathie unterstützen.
  • Beispiel 3:
  • Es wurde gefunden, dass P1GF in Typ-1-Diabetes-Patienten mit Nephropathie nicht mit Alter, Geschlecht, HbA1c und glomerulärer Filtrationsrate korreliert war. Die Korrelation mit der Harnalbuminausscheidung war schwach. In Typ-1-Diabetes-Patienten mit Nephropathie war P1GF mit der Sterblichkeit jeglicher Ursache und der Sterblichkeit aufgrund kardiovaskulärer Erkrankung korreliert (6 und 7).
  • Beispiel 4:
  • Tabelle 4 zeigt eine Analyse von P1GF in Patienten der Steno-2-Studie. Der allgemeine Aufbau der Studie ist in Beispiel 1 beschrieben worden. Tabelle 4: Kardiovaskuläre Erkrankung und Plasma PIGF
    Plasma P1GF Prädiktor bei Studienbeginn für jegliches CVD Ereignis (stetig) Plasma P1GF Prädiktor bei Studienbeginn für jegliches CVD Ereignis (unterhalb/oberhalb des Medians)
    Gesamte Steno-2 Kohorte Hazard-Ratio 1,073 (0,999 bis 1,152), p = 0,052 Hazard-Ratio 1,22 (0,71 bis 2,08), p = 0,48
    Intensiv-Therapie Gruppe Hazard-Ratio 1,21 (1,04 bis 1,41), p = 0,012 Hazard-Ratio 2,19 (0,79 bis 6,08), p = 0,13
    Standard-Therapie Gruppe Hazard-Ratio 1,03 (0,95 bis 1,12), p = 0,46 Hazard-Ratio 1,04 (0,53 bis 2,04), p = 0,91
  • Beispiel 5:
  • Ein 55-jähriger Diabetes-Typ-2-Patient wird bei seinem Allgemeinmediziner vorstellig. NT-proBNP (357 pg/ml), P1GF (11 pg/ml) und freies (d.h. nicht Thrombozyten-gebundenes) sCD40L (1,2 pg/ml) werden gemessen. Der Patient beklagt sich nicht über Brustschmerzen. Der NT-proBNP-Wert zeigt das Vorhandensein einer Herzkrankheit an. Der Patient wird für eine gründliche kardiale Untersuchung an einen Kardiologen überwiesen. EKG und kardiales Troponin T sind normal. Die Dosis der Rosiglitazon-Medikamentierung wird reduziert und eine Behandlung mit ACE-Inhibitoren und Diuretika wird gestartet. Im Folgenden wird NT-proBNP in zweiwöchigen Intervallen überwacht und erreicht nach zwei Monaten einen Spiegel von 117 pg/ml. Zusätzlich wird der kardiale Troponin T Spiegel regelmäßig überwacht.
  • Beispiel 6:
  • Eine 62-jährige, weibliche Diabetes Typ 2 Patientin wird bei Ihrem Diabetes-Spezialisten vorstellig. NT-proBNP (37 pg/ml), P1GF (27 pg/ml) und freies sCD40L (1,0 pg/ml) werden gemessen. NT-proBNP und P1GF zeigen die Gegenwart oder das Risiko einer kardiovaskulären Indikation mit dem vorherrschenden Charakteristikum der Mikroangiopathie an. VEGF Wird gemessen und bestätigt die Diagnose. CML und HbA1c (7,7%) werden gemessen und zeigen eine unzureichende Kontrolle des Blutzuckers an. Der Patientin wird geraten, sich regelmäßig körperlich zu betätigen und täglich ihre Extremitäten auf kleine Verletzungen oder Anzeichen auf Hypoxie zu untersuchen. Medikamentierung mit Stativen und Glitazonen wird begonnen. NT-proBNP wird in kurzen Intervallen gemessen, um zu bestimmen, ob die Behandlung mit Glitazonen einen Anstieg des Risikos einer Herzerkrankung bewirkt. P1GF, AGE CML und HbA1c werden monatlich gemessen, um den Erfolg der Behandlung zu überwachen.

Claims (10)

  1. Verfahren zur Diagnose, ob ein Diabetes-Patient, der keine bekannte Vorgeschichte zu kardiovaskulärer Komplikation hat, gefährdet ist, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden, umfassend die Schritte a) in vitro Messen des Spiegels (der Spiegel) mindestens eines Peptids vom BNP-Typ oder einer Variante davon, in einer Probe aus dem Patienten b) in vitro Messen des Spiegels (der Spiegel) von sCD40L oder einer Variante davon, in einer Probe aus dem Patienten c) Diagnostizieren des Risikos, eine kardiovaskuläre Komplikation zu erleiden durch Vergleichen des gemessenen Spiegels (der Spiegel) mit dem bekannten, mit dem Risiko assoziierten Spiegel (den Spiegeln).
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid vom BNP-Typ NT-proBNP oder eine Variante davon ist.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der Spiegel des Markers für Plättchenaktivierung indikativ für ein Risiko ist, eine Plättchenaggregation, Blutgerinnselbildung, Blutgerinnselausbreitung zu erleiden, das Risiko, dass eine bereits verletzlich gewordene Plaque aufbrechen wird, für einen reversiblen oder irreversiblen Verschluss der Blutgefäße.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Patient an Typ-2-Diabetes leidet.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Patient an diabetischer Nephropathie leidet.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei zusätzlich der Spiegel mindestens eines Angiogenese-Markers gemessen wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Angiogenese-Marker PIGF oder eine Variante davon ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Spiegel an NT-proBNP und PIGF und sCD40L oder Varianten davon gemessen werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei zusätzlich der Spiegel mindestens eines Markers gemessen wird, der aus der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus CRP, hsCRP, einer jeweiligen Variante, Glukose, HbA1c, CML und AGE besteht.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Verfahren die Diagnose einer Manifestation von Diabetes umfasst, die zu der Gruppe gehört, die aus kardiovaskulärer Komplikation, Herzkrankheit, Mikroangiopathie, Plättchenaktivierung, Entzündung und unzureichender Kontrolle des Blutzuckergehalts besteht.
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