DE602004013135T2

DE602004013135T2 - Verfahren für die Diagnose von schwerkranken Patienten

Info

Publication number: DE602004013135T2
Application number: DE602004013135T
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr. Bergmann; Joachim Dr. Struck; Nils G. Morgenthaler
Original assignee: BRAHMS GmbH
Current assignee: BRAHMS GmbH
Priority date: 2004-07-22
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2024-08-14
Also published as: EP1619505B1; ATE392623T1; ES2300681T3; EP1619505A3; EP1619505A2; DE602004013135D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue diagnostische Verfahren, die für die Diagnose einer Gruppe von schweren lebensbedrohenden Erkrankungen nützlich sind. Die Erfindung kann auch als eine angesehen werden, die das Gebiet der Intensivmedizin betrifft.
Genauer beruht die Erfindung auf dem überraschenden Befund, dass die physiologische Freisetzung von zwei unterschiedlichen Typen von vasoaktiven Peptiden, nämlich von Peptiden der Adrenomedullin- und Endothelin-Familien, für die bereits beschrieben wurde, dass sie in potentiell lebensbedrohenden Krankheitszuständen wie z. B. Sepsis und anderen schweren Krankheitszuständen erhöht gefunden werden können, dann, wenn sie in Kombination betrachtet werden, neue und hochrelevante Informationen zum aktuellen Status eines kritisch kranken Patienten und zu seiner Prognose liefern. Ein festgestelltes Ungleichgewicht der Peptide der genannten Familien, und zwar wenigstens dann, wenn diese mit Hilfe von geeigneten Verfahren bestimmt werden, die eine Information über die Freisetzung der genannten Peptide liefern und weniger über ihr aktuelles Niveau in einer Körperflüssigkeit, oberhalb bestimmter kritischer Schwellenkonzentrations-Niveaus in der Zirkulation des Patienten ermöglicht es einem Arzt, zu intervenieren und das Gleichgewicht wieder herzustellen, so dass der Patient die Chance erhält, sich von einer akuten Krise zu erholen, die ansonsten zu seinem Tod führen würde.
Erkrankungen, für die angenommen wird, dass für sie die Erfindung von hohem diagnostischem und therapeutischem Wert ist, umfassen Sepsis, SIRS, den septischen Schock, MOF (multiple organ failure; Multiorganversagen), schwere systemische oder lokale Infektionen, insbesondere bakterielle Infektionen, Peritonitis, Pankreatitis, lokale und/oder systemische Entzündung, Meningitis, Trauma, Aortariss-Aneurysmus, Intoxikation, Endotoxämie, Anurie, Niereninsuffizienz, arteriellen Hochdruck, pulmonalen Hochdruck, Arteriosklerose, verschiedene Krebstypen, beispielsweise Dickdarmkrebs, Stauungsherzinsuffizienz, Herzkreislauferkrankungen, Coronararterienerkrankung, Ischämie, antiarrhythmische Effekte, Nieren- und/oder Herzversagen, Organschäden und Erkrankungen, die wachstumsbezogen sind, sowie weitere.
Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass hohe Niveaus von vasoaktiven Peptiden der Endothelin-Familie, die dadurch bestimmt werden können, dass man Peptide misst, die eine hohe physiologische Freisetzung der potenten Vasokonstriktoren wie Endothelin-1 anzeigen, bei kritisch kranken Patienten mit hohen Niveaus an Adrenomedullin einen vorteilhaften, potentiell lebensrettenden Effekt ausüben können. In der wissenschaftlichen Literatur, in der sich gelegentlich Spekulationen bezüglich eines antagonistischen Verhaltens von Adrenomedullin- und Endothelin-Peptiden finden, werden hohe Konzentrationen der Vasokonstriktoren der Endothelin-Familie regelmäßig als gefährlich und unerwünscht angesehen. Hohe Anteile an Adrenomedullin werden, im Gegensatz dazu, als positiv angesehen. Ein Beispiel für derartige Spekulationen findet sich in der Veröffentlichung von Takayuki Shindo et al., Hypotension and Resistance to Lipopolysaccharide-Induced Shock in Transgenic Mice Overexpressing Adrenomedullin in Their Vasculature, In: Circulation, 2000; 101: 2309–2316.
In einer Veröffentlichung von Zheng H et al., Oktober 2001, zugänglich über Database Medline, US National Library of Medicine (NLM) XP002352776 Database accession No. NLM 11773814, wurden die Ergebnisse der Messung von Veränderungen der Konzentrationen der vasoaktiven Peptide ADM bzw. ET in Verbrennungspatienten verfolgt, indem man beide Peptide unter Verwendung von RIA-Assays vermaß, die für die beiden vasoaktiven Peptide als solche spezifisch sind.
Was gefunden wurde war, dass die Konzentrationen sowohl von ADM als auch von ET positiv mit der Größe der Verbrennungen der Patienten korrelierte. Die Konzentrationen erreichten einen Spitzenwert bei 6 Stunden nach der Verbrennung (ET) und 12 Stunden nach der Verbrennung (ADM) und kehrten danach allmählich auf normal zurück. Das Verhältnis von ET zu ADM "ist nahezu normal" während der kritischsten Anfangszeit der Verbrennung (6 Stunden nach der Verbrennung). Danach nimmt ET etwas früher ab als ADM, was zu einer moderaten Abnahme des Verhältnisses ET/ADM führt.
Alle Patienten, die in die Untersuchung einbezogen wurde, wurden geheilt. Am Ende der Veröffentlichung suggerieren die Autoren die Verwendung von exogenem ADM als neues Therapeutikum, da sie zu der Schlußfolgerung gekommen sind, dass ADM "eine wichtige Rolle bei der Prävention und Heilung von kompliziertem Schock spielt".
In der Veröffentlichung Fei Yu-xing et al., veröffentlicht in Zhonghua Xinxueguanbing Zazhi, Vol. 31, Nr. 8, August 2003 (2203-08), Seiten 600–602, XP008053669 ISSN: 0253-3758 werden die Konzentrationen des pro-ADM-Fragments PAMP sowie anderer vasoaktiver Peptide in Patienten mit Herzversagen (HF) bestimmt, und es wurde gefunden, dass die Konzentration von PAMP erhöht war. Die Autoren ziehen den üblichen Schluss, dass die "Erhöhen des Plasmaspiegels von PAMP eine schützende Rolle für Patienten mit HF spielen kann".
Die Anmelder haben die Bildung oder Freisetzung von Peptiden der Adrenomedullin- und Endothelin-Familien in kritisch kranken Patienten bestimmt unter Verwendung neuer Assays, die Prohormon(Propeptid)-Immunreaktivitäten messen, die Informationen zur physiologischen Freisetzung von beiden Typen von Peptiden liefern und weniger zu den aktuellen Niveaus der "reifen" Peptide in der Zirkulation, und sie haben gefunden, dass unter bestimmten Umständen, die weiter unten in den Beispielen in Verbindung mit den Ergebnissen von Messungen von Seren von kritisch erkrankten Patienten erklärt werden, eine dramatische Verminderung der messbaren Endothelin-Bildung dann, wenn gleichzeitig die Niveaus des freigesetzten Adrenomedullins kritisch hoch sind, dem Tod derartiger Patienten vorausgeht.
Auf der Basis der genannten Befunde haben die Anmelder einen Krankheitszustand definiert, der als "low endothelin syndrome" (nachfolgend kurz LES) oder "Endothelin-Mangelsyndrom" bezeichnet wird, der gekennzeichnet ist durch eine lebensbedrohende Veränderung der Freisetzungsphase von Endothelin (spezieller von "Endothelin-r" oder "END-r, wie es weiter unten definiert wird) in Relation zur Freisetzung von Adrenomedullin (spezieller "Adrenomedullin-r" oder "ADM-r", wie es weiter unten definiert wird). Das genannte Syndrom ist charakterisiert durch eine hohe systemische Freisetzungsrate des Vasodilatators Adrenomedullin und, gleichzeitig, durch eine unzureichende Freisetzungsrate des Vasokonstriktors Endothelin (END-r). Die Folge eines derartigen Mißverhältnisses ist eine unkontrollierbare Vasodilatation und eine unzureichende Versorgung von einem oder mehreren Organen mit Blut, d. h. ein einzelnes oder multiples Organversagen.
In der vorliegenden Anmeldung steht das Suffix "-r", das in Begriffen wie END-r oder ADM-r verwendet wird, für "released" (freigesetzt). Es bedeutet, dass der fragliche Parameter nicht die aktuelle, mehr oder weniger momentane oder vorübergehende messbare Serum- oder Plasmakonzentration des biologisch aktiven Biomoleküls (reifen Peptids) ist, sondern dass er stattdessen dessen kumulative Freisetzung über einen längeren Zeitraum widerspiegelt. Sie kann beispielsweise direkt gemessen werden durch Messung eines Peptidfragments, das aus dem physiologischen Vorläuferpeptid (pre-pro- oder pro-Peptid oder -Hormon) paralell zur Bildung des aktiven Biomoleküls gebildet wird, wobei dieses Fragment jedoch eine beträchtlich längere Halbwerts-Lebensdauer in der Zirkulation (eine beträchtlich langsamere Abbaurate oder Clearance-Rate) als das aktive Biomolekül aufweist. Assays zur Messung von ADM-r werden beschrieben in der früheren gleichzeitig anhängigen Anmeldung PCT/EP04/00806 "Bestimmung eines midregionalen Proadrenomedullin-Teilpeptis in biologischen Flüssigkeiten zu diagnostischen Zwecken sowie Immunoassays für die Durchführung einer solchen Bestimmung". Assays zur Messung von END-r werden beschrieben in der älteren gleichzeitig anhängigen Anmeldung der Anmelder EP 04003295.5 "Verfahren zur Bestimmung der Bildung von Endothelinen zu Zwecken der medizinischen Diagnostik, sowie Antikörper und Kits für die Durchführung eines solchen Verfahrens". Die Beispiele 1 bis 6 der vorliegenden Erfindung können als Auszüge aus den beiden Anmeldungen angesehen werden, damit für die vorliegende Anmeldung eine nachbearbeitbare Offenbarung gewährleistet ist.
Sowohl die messbare Adrenomedullin- als auch Endothelin-Bildung oder -Freisetzung (ADM-r und END-r) sind Teil der relevanten Kombinationsmessungen gemäß der vorliegenden Erfindung. Als relevanter Parameter kann ein "Verhältnis" von beiden definiert werden. Es wird nachfolgend in näheren Einzelheiten erklärt.
Die Erfindung betrifft gemäß einem ihrer Aspekte die Verwendung des "Verhältnisses" von ADM-r/END-r, insbesondere ein Verhältnis pro-Adrenomedullin (pro-ADM)/pro-Endothelin (pro-END) oder von Fragmenten oder Kombinationen davon, für die Diagnose des Endothelinmangelsyndroms (LES) in kritisch erkrankten Patienten, die von einer der Erkrankungen/Krankheitszustände betroffen sind, die oben aufgelistet werden. Spezieller betrifft die Erfindung die Messung des genannten Verhältnisses für die Verlaufskontrolle und Prognose einer solchen Erkrankung, zur Bewertung des Mortalitätsrisikos allein und/oder in Kombination mit einem entsprechenden Computerprogramm.
Gemäß einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung außerdem die Berücksichtigung klinischer und/oder anderer Informationen zur Bewertung eines derartigen Risikos.
LES kann die Gruppe von Erkrankungen umfassen, wie sie oben erwähnt werden, ohne darauf beschränkt zu sein.
ADM-r und END-r werden normalerweise dadurch gemessen, dass man in geeigneten Körperflüssigkeiten, insbesondere in der Zirkulation (Serum, Plasma, Vollblut) ein relativ beständiges Fragment ihrer physiologischen Vorläuferpeptide (pre-pro- oder pro-Peptide oder -Hormone) bestimmt. Was gemessen wird, kann daher auch als pro-Peptid-Immunreaktivität angesehen werden (pro-Hormon-Immunreaktivität). Die Begriffe pro-ADM und pro-END beziehen sich auf eine solche messbare Immunreaktivität und sollen auch Aminosäuresequenzen erfassen, die eine wenigstens 75%ige Homologie, vorzugsweise wenigstens 80%ige Homologie, stärker bevorzugt wenigstens 90%ige Homologie zu pro-ADM oder pro-END, ihren Fragmenten oder Vorläufern aufweisen.
Der Begriff Diagnose umfasst ebenfalls Prognose, Frühprognose und Verlaufskontrolle.
Die Befunde der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Verwendung von Endothelin-Formen mit Vasokonstriktor-Aktivität, insbesondere von END-1 und/oder big-END, sowie ggf. von END-Agonisten (Molekülen, die an den END-Rezeptor binden und dort die gleichen oder ähnliche Wirkungen auslösen wie das vasoaktive Endothelin) und/oder von ADM-Antagonisten (Molekülen, die an den ADM-Rezeptor binden und dort die Wirkungen des vasoaktiven Adrenomedullins blockieren) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von LES und/oder Erkrankungen, die die oben erwähnten einschließen. LES kann als akute Stoffwechselstörung angesehen werden, an der ein Ungleichgewicht von bestimmten potenten Effektormolekülen beteiligt ist. Indem man einem Patienten das aktive physiologische Molekül zur Wiederherstellung des erforderlichen Gleichgewichts zuführt, ähnlich der Verabreichung von Insulin an einen Diabetes-Patienten, können die schädlichen Konsequenzen eines Fehlens des genannten aktiven physiologischen Moleküls ausgeglichen werden. Die an LES-beteiligten Moleküle sind Adrenomedullin (ADM) und Endothelin (END). Bei Sepsis-Patienten sind die Freisetzungsraten von Endothelin und Adrenomedullin über normal erhöht, und zwar in Abhängigkeit von der Schwere der Erkrankung (1 und 2). In einem sehr schweren Stadium der Sepsis, das dem Tod vorausgeht, wurde gemäß der vorliegenden Erfindung überraschend gefunden, dass die Konzentration an Endothelin dramatisch abnimmt (3 und 4). Das führte angesichts der anhaltend hohen Konzentrationen von ADM in der Folge zu einem dramatischen Absinken des Blutdrucks. Dieses dramatische Absinken des Blutdrucks, das durch das Fehlen von Endothelin bewirkt wird (LES), führt häufig zum Tod des Patienten, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
Im Hinblick auf das publizierte Wissen, das Adrenomedullin und Endothelin betrifft, wird Bezug genommen auf die beiden oben erwähnten älteren Anmeldungen. Zusätzlich wird auch Bezug genommen auf die früheste Patentanmeldung der Anmelder, die für die Bestimmung von pro-ADM und pro-END bei Sepsis relevant ist und die veröffentlicht wurde u. a. als WO 00/22439 . Nachfolgend werden die wichtigsten Fakten zusammengefasst.
Adrenomedullin (ADM) wurde erstmals 1993 als neues hypotensives Peptid mit 52 Aminosäuren beschrieben, das aus einem Phänochromozytom isoliert worden war. Im gleichen Jahr wurde das Vorläufer-Protein pre-pro-Adrenomedullin (pre-pro-ADM) beschrieben, das 185 Aminosäuren enthielt. Das Vorläuferprotein enthält eine Signalsequenz von 21 Aminosäuren an seinem N-Terminus. ADM umfasst die Positionen 95–146 der Aminosäuresequenz des pre-pro-ADM und ist ein Spaltprodukt davon. Ein weiteres Spaltprodukt ist PAMP, ein Peptid mit 20 Aminosäuren, die die Positionen 22–41 umfassen, die den 21 Aminosäuren des Signalpeptids folgen.
Bisher ist bekannt, dass ADM und PAMP den Blutdruck beeinflussen. ADM ist ein potenter Vasodilatator, wobei angenommen wird, dass die hypotensive Wirkung im C-terminalen Teil von ADM lokalisiert ist. Peptidsequenzen am N-Terminus zeigen dagegen hypertensive Wirkungen. Es wurde ferner gezeigt, dass auch PAMP eine hypotensive Wirkung aufweist, obwohl der Wirkungsmechanismus unterschiedlich zu sein scheint.
In Verbindung mit der Diskussion von therapeutischen Aspekten umfasst der Begriff "Endothelin" (END) im Allgemeinen Endothelin-Formen mit Vasokonstriktor-Aktivität, insbesondere Endothelin-1 (END-1) und seinen Vorläufer big-Endothelin, kann jedoch auch verwandte Moleküle, wie z. B. Endothelin-2 (END-2) oder Endothelin-3 (END-3) sowie deren Vorläufer umfassen.
In Verbindung mit analytischen Bestimmungen bedeutet "Endothelin" im Allgemeinen END-r, wie es oben definiert wird. Die Absolutwerte für messbare Konzentrationen sowie Verhältnisse von messbaren Konzentrationen werden natürlich z. B. durch die tatsächlich gemessene molekulare Spezies beeinflusst, durch die Einheiten, in denen die Messung ausgedrückt wird, sowie durch die Eichung des verwendeten Assays. Die absoluten numerischen Werte, die in der vorliegenden Anmeldung angegeben werden, sind nur für die hierin beschriebenen Assay-Designs relevant. Da sie möglicherweise angepasst werden müssen, wenn beispielsweise ein anderer Analyt gemessen wird oder die Einzelheiten seiner Bestimmung verändert werden, ist es praktisch nicht sinnvoll, die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung in absoluten numerischen Werten auszudrücken. Indem man der Lehre der vorliegenden Anmeldung folgt, einschließlich der beschriebenen Bewertung der Messergebnisse, kann ein Fachmann leicht diejenigen Zahlenwerte und Verhältnisse bestimmen, die für irgendein modifiziertes Bestimmungsverfahren einschlägig sind.
Endothelin-1 umfasst 21 Aminosäuren und ist der wirksamste bekannte Vasokonstriktor. Es existieren 3 Isoformen von END: Endothelin-1 (END-1), Endothelin-2 (END-2) und Endothelin-3 (END-3). END-1 liegt in den höchsten Konzentrationen vor und ist am wirksamsten. Endothelin-1 wird in den Endothelzellen synthetisiert, in der Lunge, im Herzen, der Niere und im Gehirn. Das primäre Translationsprodukt des humanen Endothelin-1-Gens ist pre-pro-Endothelin-1, das 212 Aminosäuren umfasst. Im Zuge seiner Sekretion entfernt die Signalpeptidase die kurze n-terminale Signalsequenz, die 17 Aminosäuren umfasst. Das resultierende pro-Endothelin wird anschließend zu einem weiterhin biologisch inaktiven big-Endothelin prozessiert, das 38 Aminosäuren umfasst, und zwar durch die Protease Furin, die in der Zirkulation angetroffen wird. Das reife biologische aktive Endothelin-1 wird aus big-Endothelin durch das Endothelin-konvertierende Enzym gebildet. Endothelin übt seine biologische Wirkung dadurch aus, dass es an spezifische Rezeptoren bindet, die auf Muskelzellen, Myocyten und Fibroblasten lokalisiert sind. Diese Bindung führt zum Ausfluss von Calcium, zur Aktivierung von Phospholipase C und zur Inhibierung von Na/K-ATPase. Neben der vasokonstriktorischen Wirkung reguliert Endothelin auch das Wachstum.
Die Konzentration von ADM im Blutkreislauf und in anderen biologischen Fluiden ist bei einer Vielzahl von Erkrankungen signifikant erhöht, wie beispielsweise bei Stauungsherzinsuffizienz, Myocardinfarkt, Nierenerkrankungen, hohem Blutdruck, Diabetes mellitus, während der akuten Phase eines Schocks, bei Sepsis, septischem Schock, Multiorganversagen. PAMP-Konzentrationen sind bei einigen der oben erwähnten Erkrankungen/Krankheitszustände ebenfalls erhöht, wobei das Plasma-Niveau relativ zu ADM jedoch vermindert ist. Es ist bekannt, dass bei Sepsis und septischem Schock ungewöhnlich hohe ADM-Konzentrationen beobachtet werden. Dieser Befund steht in Beziehung zu den hämodynamischen Veränderungen, die für den Verlauf der Erkrankung in Sepsis-Patienten und anderen schweren Erkrankungen wie SIRS typisch sind.
Erhöhte Plasmakonzentrationen von Endothelin-1 und big-Endothelin wurden für verschiedene Erkrankungen gezeigt, die kardiovaskuläre Erkrankungen umfassen, die ihrerseits umfassen pulmonalem Hochdruck, Artheriosklerose, Stauungsherzinsuffizienz, Herzinfarkt, Sepsis, septischen Schock und Krebs.
Ein Hauptgrund für die Mortalität aufgrund von Sepsis ist das sogenannte Multiorganversagen, das durch eine systemische Vasodilatation bewirkt wird, die ein Absinken des Blutdrucks und einen Verlust der Prioritätsversorgung von einzelnen Organen und Geweben beinhaltet. Es wird angenommen, dass Endothelin eine Rolle beim Schweregrad einer Sepsis und eine Rolle bei der Mortalidät bei Sepsis spielt.
Analytische/diagnostische Aspekte der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß einem ihrer Aspekte die Diagnose von LES und/oder assoziierten Erkrankungen, die die oben genannten umfassen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf die parallele Bestimmung der Niveaus von END-r und ADM-r, spezieller von pro-END und pro-ADM und/oder deren Fragmenten. Die kombinierte Messung ermöglicht die Berechnung eines Verhältnisses und/oder eines Algorithmus sowie die Verwendung eines derartigen abgeleiteten Verhältnisses und/oder Algorithmus für die Diagnose, die Vorhersage, die Prognose des Schwereverlaufs und des Mortalitätsrisikos bei LES und/oder den oben erwähnten Erkrankungen (1 und 2).
Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass beide Werte für pro-ADM und pro-End in Patienten im Verlauf der Erkrankung ansteigen, wobei die Werte für pro-ADM stärker ansteigen als die für pro-END, was zu einem Anstieg des Gesamtverhältnisses pro-ADM/pro-END bis zu einem Tag vor dem Tod führt.
Stärker bemerkenswert sinkt jedoch die Konzentration von Endothelin am Todestag dramatisch ab. Folglich steigt das Verhältnis und/oder der Algorithmus von pro-ADM/pro-END dramatisch an (3 und 4).
Die Bestimmung von ADM, spezieller ADM-r sowie von END, spezieller END-r, liefert daher eine Information über den Gesundheitszustand eines kritisch erkrankten Patienten, insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung einer lebensbedrohlichen Krise, die eine Intervention nötig macht. Das wird vollständiger unter Bezugnahme auf die nachfolgenden analytischen Befunde und die in Tabelle 1 (vgl. Beispiel 8) gezeigten Ergebnisse sowie die Figuren erläutert:
Es wurden 149 Patienten wurden in einer Studie erfasst, die auf eine Intensivstation (ICU) aufgenommen wurden und während ihres Aufenthalts auf der ICU eine Sepsis entwickelten.
An jedem Tag ihres Aufenthalts auf der ICU (3–29 Tage) wurde EDTA-Plasma der Patienten gewonnen. Das Plasma wurde bei –20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Pro-ADM- und pro-END-Werte wurden unter Verwendung eines Assays mit beschichteten Teströhrchen bestimmt, wie sie in den früheren anhängigen Patentanmeldungen des Anmelders beschrieben werden, die bereits oben erwähnt wurden. Für die Assays wurden synthetisierte Peptide dazu verwendet, Antigene herzustellen, und zur Produktion von Antikörpern gegen die unterschiedlichen Peptide in Tiere injiziert, wie bereits beschrieben wurde. Gemäß einer bevorzugten Ausfüh rungsform waren die Peptide an das Trägerprotein "keyhole limpet hemocyanin" unter Verwendung von MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) gebunden und zur Immunisierung von Schafen verwendet worden.
Spezieller wurden Aminosequenzen von Teilpeptiden 83–94 [SSPDAARIRVKR = Sequenz ID 2] und 69–86 [RPQDMKGASRSPEDSSPD = Sequenz ID 3] von pre-pro-ADM 1–185 [Sequenz ID 1] synthetisiert sowie Teilpeptide 168–181 [RSSEEHLRQTRSET = Sequenz ID 6] und 200–212 [SRERYVTHNRAHW = Sequenz ID 7] von pre-pro-END 1–212 [Sequenz ID 5]. Diese Sequenzen finden sich in pre-pro-ADM 1–185 und in pre-pro-END 1–212. An jedes Peptid wurde ein Amino-terminaler Cysteinrest angefügt. Die Peptide wurden mit einem Hämocyanin konjugiert, und es wurden in Schafen Antikörper gegen die oben erwähnten Peptide produziert, wie bereits früher beschrieben wurde. Polyklonale Antikörper wurden gegen die oben erwähnten Peptide erzeugt. Die Antikörper wurden gereinigt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wurde das erreicht durch eine ligandenspezifische Affinitätschromatographie unter Kopplung der Peptide über den aminoterminalen Cysteinrest an SulfoLink-Gel von Pierce (Boston, USA) gemäß den Verfahren von Pierce. Die Antikörper wurden ferner mit einem Marker versehen, um ihren Nachweis zu ermöglichen. Der verwendete Marker ist vorzugsweise ein Lumineszenzmarker und noch stärker bevorzugt ein Chemilumineszenzmarker, wie bereits früher beschrieben wurde.
Verfahren zum Nachweis der Bindung des Antikörpers an das entsprechende Molekül sind dem Fachmann bekannt und umfassen Sandwich-Immunoassays, Radio-Immunoassays, ELISA- oder Point-of-care-Tests. Vorzugsweise wird die Bindung des Antikörpers an das Zielmolekül mittels Chemilumineszenz detektiert.
Die Detektion und die Bestimmung der Konzentration von pro-ADM und pro-END kann in verschiedenen Körperflüssigkeiten, Geweben und anderen Biomaterialien durchgeführt werden, wird jedoch vorzugsweise in Serum oder Plasma durchgeführt. Sie kann in verschiedenen Stadien aller Arten und Erkrankungen erfolgen, wie sie beispielhaft oben angeführt wurden, die zu LES, Sepsis, septischem Schock, SIRS und verwandten schweren Krankheitszuständen führen können.
Die Erfindung nutzt ferner die signifikante Veränderung von Vorläufer-Proteinkonzentrationen in Körperflüssigkeiten, Gewebe und anderen Biomaterialien bei der Krankheit oder Gesundheitsstörung, insbesondere in einem schweren Krankheitsstadium, der von LES als akute Komplikation begleitet wird.
ADM-r, wenn es wie hierin beschrieben gemessen wird, liegt im Plasma von gesunden Individuen in Konzentrationen von < 1 nmol/l (Median 0,7) vor. Kritisch erkrankte Personen, die eine Sepsis überlebten, zeigten eine signifikant erhöhte ADM-r-Konzentration (Median 3,1). Der Median von sterbenden Patienten ist gegenüber der Gruppe überlebender Patienten signifikant erhöht (Median 11,8/17,1/17,7; 2 Tage vor dem Ableben/1 Tag vor dem Ableben/am Todestag, 1).
Die Konzentration von END-r als potentieller Antagonist von ADM nimmt, wenn sie wie hierin beschrieben, gemessen wird, von einem Median von 0,035 nmol/l Plasma auf 0,054 nmol/l in überlebenden Patienten zu. Die Konzentration steigt in sterbenden Patienten weiter auf 0,096 und 0,133 nmol/l zwei Tage vor dem Ableben bzw. einen Tag vor dem Ableben an. Überraschenderweise nimmt jedoch die Konzentration an END-r am Todestag dramatisch ab (Median 0,064 nmol/l, 2).
Diese Befunde können mit der Prognose bezüglich des Überlebens in einem schweren Stadium von LES oder anderen Erkrankungen korreliert werden, die die oben erwähnten umfassen, indem man die Konzentration von ADM-r und END-r bestimmt und, als zusätzlichen Parameter, ein Verhältnis der oben erwähnten Proteine und/oder einen Algorithmus davon bildet.
Zuerst wurde die Konzentration von ADM-r allein dazu verwendet, die Überlebungsprognose zu bestimmen (Tabelle 1 und 1). Spalte 2 (Spezifität) zeigt die Zahl überlebender Patienten mit einer Konzentration von weniger als 17 nmol/l Serum/Plasma von ADM-r, d. h. 117 von 126 Patienten hatten eine Konzentration von weniger als 17 nmol/l, 102 Patienten eine Konzentration von weniger als 8 nmol/l. Somit zeigt AMD-r eine Spezifität von 93% bezüglich des Überlebens bei einem Cut off-Wert von 17 nmol/l sowie von 81% bei einem Cut off-Wert von 8 nmol/l.
Die Sensitivität bezüglich der Mortalität wird auf folgende Weise bestimmt. 23 Patienten starben während ihres Aufenthalts auf der ICU. Bei einem Cut off-Wert von 17 nmol/l von ADM-r zeigten sechs Patienten (26% = Sensitivität der Mortalität) Konzentrationen über 17 nmol/l zwei Tage vor dem Ableben, 12 Patienten (52%) einen Tag vor dem Tod und 13 Patienten (57%) am Todestag. Bei einem Cut off-Wert von 8 nmol/l zeigten 19 (83%) von 23 Patienten Konzentrationen über 8 nmol/l ADM-r zwei Tage vor dem Ableben, 21 Patienten (91%) einen Tag vor dem Ableben und 19 Patienten (83%) am Todestag (Tabelle 1; vergleiche Beispiel 8).
Somit werden bei einem Cut off-Wert von 8 nmol/l ADM-r (d. h. bei einem Ausschluss von Patienten mit einer Konzentration unter 8 nmol/l ADM-r) die meisten derjenigen Patienten erfasst, die während ihres Aufenthalts auf der ICU starben.
Es wurde ferner von den Erfindern festgestellt, dass das Verhältnis von ADM-r/END-r gemäß der vorliegenden Erfindung einen zusätzlichen Parameter von hoher Validität im Zusammenhang mit der Prognose septischer Patienten in ICUs bildet.
Überraschenderweise steigt dieses Verhältnis während des Verlaufs der Krankheit an, und noch überraschender steigt es am Todestag dramatisch an. Gemäß diesen Ergebnissen werden die Spezifität und Sensitivität eines Überlebens bzw. der Mortalidät bei LES und verschiedenen anderer Erkrankungen angezeigt, die die oben erwähnten umfassen, sowie die Prognose der Schwere der Krankheit und das Mortalidätsrisiko.
Die gemessenen Verhältnisse von AMD-r/END-r sind in Tabelle 1 und 3 gezeigt. Das ADM-r/END-r-Verhältnis weist bei gesunden Personen einen Maximalwert von etwa 50 auf (Median 20). Der Median von überlebenden Patienten in einer ICU steigt auf 56 an. Ein signifikanter weiterer Anstieg kann zwei Tage (Median 135) und einen Tag (Median 129) vor dem Ableben beobachtet werden, und ein überraschend dramatischer Anstieg am Todestag bei einem Median von 336. Die Prognose beträgt bei einer Spezifität von 76% (Tabelle 1, d. h. die erfassten Patienten weisen eine Konzentration von ADM-r von weniger als 43 nmol/l auf) 91% zwei Tage vor dem Ableben, 96% einen Tag vor dem Ableben und 87% am Todestag (Tabelle 1 und 3). Bei einer höheren Spezifität von 93% (d. h. die erfassten Patienten haben eine Konzentration von ADM-r von weniger als 18 nmol/l) ist eine Prognose erst am Todestag möglich, und zwar mit einer Sensitivität von 61% (Tabelle 1).
Aus den Ergebnissen kann überraschenderweise abgeleitet werden, dass die Lebensbedrohung bei LES nur bei hohen ADM-Konzentrationen vorhanden ist, da ein hohes Vasodilatationspotential erreicht werden muss. Hohe Konzentrationen an ADM werden nur toleriert, wenn sie durch die entsprechende END-Konzentration ausgeglichen werden.
Für eine weitere Analyse der Ergebnisse wurden die Patienten noch weiter selektiert:

1. gemäß den AMD-r-Konzentrationen (> 8 nmol/l) und
2. gemäß dem Verhältnis ADM-r/END-r (4).

Es wurde gezeigt, dass ein hoher Anteil an überlebenden Patienten mit einer ADM-r-Konzentration > 8 nmol/l an einem Tag ihres Aufenthalts in der ICU, N = 24, ein Verhältnis von weniger als 90 (N = 15) aufwiesen, und somit war ihr Überleben sichergestellt. Gemäß dieser Annahme würden jedoch auch die sterbenden Patienten mit einer hohen Wahrscheinlichkeit 2 Tage vor ihrem Tod erfasst werden (Sensitivität 87% zwei Tage vor dem Ableben/91% einen Tag vor dem Ableben/78% am Todestag). Wenn man die Summe der Patienten berücksichtigt, die von der Studie erfasst wurden (126 überlebende Patienten), ist die Spezifität überraschenderweise sehr hoch und beträgt 93%.
Die sequentielle Analyse von ADM-r, END-r und des Verhältnisses und/oder Algorithmus ADM-r/END-r zeigt bei einer vergleichbar hohen Spezifität (93%) überraschenderweise eine höhere Sensitivität für die Prognose (87%/91%/78%) als die Analyse von ADM-r allein (26%/52%/57%) oder des Verhältnisses allein (0/0/61) (Werte 2 Tage vor dem Ableben/1 Tag vor dem Ableben/Todestag). Die Erfindung betrifft folglich die Bestimmung, frühe Bestimmung, Schweregradbestimmung, Verlaufskontrolle und Prognose der Erkrankungen/Gesundheitsstörungen, die oben erwähnt wurden, wobei man das genannte Verhältnis oder den bestimmten Algorithmus verwendet.
In diesem Kontext sieht die Erfindung die Verwendung eines Computerprogramms vor, um die Daten zu nutzen, die aus dem Verhältnis erhalten werden, und zwar für den Nachweis, den frühen Nachweis, die Bestimmung des Schweregrads, die Verlaufskontrolle und Prognose von LES und/oder den oben erwähnten Erkrankungen.
Um die Messungen durchzuführen, wie sie oben erwähnt werden, können Assays für ADM-r und END-r, wie sie in den früheren anhängigen Patentanmeldungen des Anmelders beschrieben werden, die oben erwähnt wurden, sowie die entsprechenden Kits mit Vorteil verwendet werden.
Von der Erfindung ableitbare therapeutische Gesichtspunkte
Im Gegensatz zum Stand der Technik offenbart die Erfindung den überraschenden Befund, das erhöhte Konzentration von Endothelin (insbesondere bei einer Bestimmung als END-r) für einen Patienten vorteilhaft sind, der stark erhöhte Konzentrationen von ADM-r aufweist, wie sie typischerweise bei Patienten in schweren Krankheitszuständen, zum Beispiel Sepsis und den verwandten Erkrankungen, die oben erwähnt wurden, gefunden werden. Mit anderen Worten zeigen die Ergebnisse, dass hohe Niveaus an END-r es einem Patienten ermöglichen, hohe, anderweitig tödliche ADM-r-Niveaus zu tolerieren, die für Krankheitszustände wie Sepsis typisch sind, so dass der Tod vermieden werden kann. Kurz gesagt, scheinen hohe ADM-Niveaus durch physiologische END-Niveaus ausreichender Größe ausbalanciert werden zu können.
Eine messbare Abnahme von END-r, oder Serum-END, in einem derartigen kritisch erkrankten Patienten stellt ein klares klinisches Zeichen dar, das ein hohes Todesrisiko für den Patienten mit hohen ADM-r-Niveaus anzeigt. Die beobachtete scharfe Abnahme an messbarem END-r bzw. END kann interpretiert werden als Anzeichen einer Erschöpfung der zellulären Reservoirs von END-Vorläufern unter dem physiologischen Stress eines Krankheitszustandes wie Sepsis oder als Unfähigkeit der physiologischen molekularen Maschinerie, die END und dessen Vorläufer produziert, mit der parallelen anhaltenden Produktion von ADM mitzuhalten und/oder die sich fortsetzende vasodilatatorische Wirkung von hohen ADM-Konzentrationen auszubalancieren.
Demgemäß wird die Verabreichung von vasokonstriktorischen Endothelin-Formen, insbesondere von END-1 und/oder big-END, an kritisch erkrankte Patienten mit hohen gemessenen Niveaus an ADM-r zur externen Ergänzung des aktiven END in derartigen Patienten vorgeschlagen. "Vasokonstriktorische Endothelin-Formen" sollen direkt wirkende Endothelin-Formen wie END-1 einschließen, sowie Vorläufer wie big-END, die als solche nicht aktiv sind, jedoch leicht in eine aktive Form umgewandelt werden können, wenn sie in den Kreislauf eines menschlichen Patienten eingeführt werden.
Der Verabreichung von Endothelin kann in einer klinischen Umgebung wie zum Beispiel in ICUs (intensive care units; Intensivstation) eine Analyse der aktuellen Konzentrationen von ADM-r, END-r sowie eine Bestimmung des oben diskutierten "Verhältnisses" vorausgehen. Eine derartige vorausgehende Messung und Analyse ist jedoch nicht als unverzichtbare Voraussetzung für die Verabreichung von Endothelin zu betrachten.
In einer Umgebung des Gesundheitswesens, zum Beispiel in einer ICU, kann nicht genug Zeit zur Verfügung stehen, auf die Ergebnisse der Messungen von Biomolekülen, zum Beispiel ADM-r und END-r zu warten, bevor eine Entscheidung bezüglich einer therapeutischen Intervention getroffen werden kann. Es ist daher vorgesehen, aktives Endothelin kritisch erkrankten Patienten in Reaktion auf charakteristische Veränderungen anderer physiologischer Parameter zu verabreichen, die für das zugrundeliegende Endothelin-Mangelsyndrom (LES) kennzeichnend sind. Derartige Parameter können sein die Messung von physiologischen Variablen wie Blutdruck, Körpertemperatur, Pulsfrequenz und ähnliche Parameter, wie sie zur Überwachung des Status eines Sepsis-Patienten verwendet werden. In Kenntnis der vorteilhaften Wirkung einer Verabreichung von Endothelin kann eine derartige Verabreichung auf der Basis rein empirischer klinischer Daten erfolgen.
Es ist jedoch möglich, Endothelin auch nach Maßgabe einer quantitativen oder halbquantitativen Messung von ADM-r allein zu verabreichen, d. h. dann, wenn das ADM-Niveau kri tisch hoch wird. Im Hinblick auf das Erfordernis, eine schnelle Entscheidung zu treffen, kann es vorzuziehen sein, die Bestimmung von ADM-r in ICUs mit POC (point-of care)-Messvorrichtungen vorzunehmen, d. h. mit Vorrichtungen vom immunchromatographischen Typ oder Vorrichtungen mit elektrochemischen Sonden, die Schnellablesungen für die Konzentration von Interesse liefern, um wenigstens eine halbquantitative Ablesung zu erhalten, die eine Bewertung der aktuellen Niveaus von ADM-r in einem Patienten ermöglicht und es ermöglicht, eine Entscheidung bezüglich der intravenösen Verabreichung von Endothelin zu treffen. Geeignete POC-Messvorrichtungen sind dem Fachmann gut bekannt. Ein Beispiel für ein geeignetes Design ist die Schnelltestvorrichtung PCT-Q^®, die von der B. R. A. H. M. S Aktiengesellschaft für die rasche POC-Bestimmung von Procalcitonin (PCT) beispielsweise in einer Klinikumgebung erhältlich ist.
Es ist ferner möglich, Endothelin an Patienten zu verabreichen, die kontinuierlich auf die Konzentration(en) von einem oder mehreren der relevanten Biomoleküle oder auf andere relevante klinische Parametern überwacht werden.
Wie bereits früher ausgeführt, bedeutet in einem therapeutischen Kontext "Endothelin" Endothelin-Formen mit Vasokonstriktor-Aktivität, insbesondere Endothelin-1 (END-1) und seinen Vorläufer big-Endothelin, wobei der Begriff jedoch auch auf verwandte Moleküle einer ähnlichen Aktivität erstreckt werden kann, wie beispielsweise Endothelin-2 (END-2) oder Endothelin-3 (END-3) und deren Vorläufer.
Die Verabreichung des aktivsten, direkt wirkenden END-1 wird derzeit als bevorzugt in einer Intensivstationssituation angesehen. Vorzugsweise ist eine derartige Verabreichung eine intravenöse Verabreichung durch Infusion oder Injektion, unter Verwendung einer flüssigen Formulierung (Lösung oder Dispersion), die eine geeignete Konzentration von END-1 gemeinsam mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern usw. ent hält. Eine derartige flüssige Formulierung (ein Arzneimittel) kann alle pharmazeutisch annehmbaren und nützlichen Hilfsstoffe, Stabilisatoren und anderen Bestandteile enthalten, die für einen derartigen Verabreichungstyp geeignet sind sowie dafür, einen stabilen Zustand in der verabreichten Formulierung für die Zeit der Infusion zu gewährleisten.
Es ist ferner möglich, langsamer wirkende Formen zu Endothelinen zu verabreichen oder mit zu verabreichen, beispielsweise Mischungen von rasch wirkenden und langsamer wirkenden Formen. Langsamer wirkende Formen, beispielsweise in der Form von big-END, können ein gleichmäßigeres pharmakokinetisches Profil liefern sowie eine längere Wirkung von Endothelinen. Derartige Formen können stärker für eine Injektion geeignet sein, während direkt wirkende Formen für eine Verabreichung durch Infusion bevorzugt sind.
Es ist ferner möglich, anstelle von, oder zusammen mit, vasokonstriktorischen Endothelinen Endothelin-Agonisten zu verabreichen, um spezielle Effekte zu erreichen, zum Beispiel ein vorteilhaftes pharmakokinetisches Profil oder um den Patienten in Situationen zu unterstützen, wenn die kritischste akute Phase überlebt wurde.
Da außerdem der lebensbedrohende Einfluss für den Patienten nicht der Mangel an Endothelin per se ist, sondern die vasodilatatorische Wirkung von hohen Konzentrationen von ADM (ADM-r), ist es ebenfalls möglich, anstelle von Endothelin und/oder Endothelin-Agonisten, oder in Kombination damit, Adrenomedullin-Antagonisten zu verwenden, d. h. Moleküle, die die vasodilatierende Wirkung von Adrenomedulin verhindern oder abschwächen, z. B. durch Blockieren seiner relevanten Rezeptoren, oder Substanzen, die das Binden von Adrenomedullin an seine Rezeptoren verhindern (z. b. spezifische Binder wie beispielsweise Antikörper, die an Adrenomedullin binden und dessen Rezeptorbindungsstellen blockieren; "immunologische Neutralisierung"). Eine derartige Verwendung, oder eine kombinierte Verwendung, einschließlich einer nachfolgenden oder vorausgehenden separaten Verwendung, kann in bestimmten Fällen erwünscht sein, um beispielsweise den therapeutischen Erfolg zu verbessern, oder um unerwünschte physiologische Stress- oder Neben-Wirkungen zu vermeiden.
Die Erfindung ermöglicht die Verwendung von Endothelin-Formen mit Vasokonstriktorwirkung, spezieller von END-1 und/oder big-END, sowie von END-Agonisten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von LES und anderer Krankheitszustände und Erkrankungen, die die oben erwähnten umfassen. Insbesondere werden Endothelin-1, big-Endothelin und/oder irgendwelche Endothelin-1-Rezeptor-Agonisten als Wirkstoffe dazu verwendet, Arzneimittel zu ihrer Verabreichung an einen kritisch erkrankten Patienten herzustellen. Vorzugsweise liegt das Medikament in einer flüssigen Formulierung für eine intravenöse Verabreichung durch Infusion vor, beispielsweise mittels eines Katheters, oder durch Injektion.
In der verfügbaren wissenschaftlichen Literatur scheinen keinerlei Vorschläge zu existieren, vasokonstriktorisches Endothelin für medizinische Zwecke zu verwenden. Die vorgeschlagene Verwendung kann daher anscheinend als erste medizinische Verwendung angesehen werden.
In Medikamenten, wie sie oben diskutiert werden, kann das erwähnte aktive END verwendet werden, wie auf dem Fachgebiet üblich ist, in flüssigen Formulierungen, die geeignete Konzentrationen von zum Beispiel geeigneten Trägern, Stabilisatoren, Nährmitteln, Elektrolyten, gelösten Salzen, Osmosemitteln zur Gewährleistung isotonischer Bedingungen, Puffern und/oder Lösemitteln oder anderen Adjuvanzien und Hilfsstoffen enthalten, die für eine Verabreichung in einem Patienten geeignet sind.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Konzentration von ADM-r in Plasma von 40 gesunden Kontrollpersonen, 126 überlebenden Patienten in einer ICU und von 23 Patienten zwei Tage und einen Tag vor ihrem Ableben sowie am Todestag.
2 zeigt die Konzentration von END-r in Plasma von 40 gesunden Kontrollpersonen, 126 überlebenden Patienten in einer ICU sowie 23 Patienten zwei Tage und einen Tag vor ihrem Ableben sowie am Todestag.
3 zeigt das Verhältnis ADM-r/END-r in Plasma von 40 gesunden Kontrollpersonen, 126 überlebenden Patienten in einer ICU und 23 Patienten zwei Tage und einen Tag vor dem Ableben und am Todestag.
4 zeigt das Verhältnis von ADM-r/END-r, wobei nur Patienten mit einer ADM-r-Konzentration > 8 nmol/l in Plasma berücksichtigt wurden; 24 davon sind überlebende Patienten einer ICU, und 20 sind weitere Patienten zwei Tage und einen Tag vor dem Ableben und am Todestag.
Beispiel 1 – Peptid-Synthese
Ein N-terminaler Cystein-Rest wurde synthetisierten Peptiden aus humanem pro-ADM und pro-END hinzugefügt. Sie wurden unter Anwendung einer Massenspektrometrie gereinigt und ihre Qualität wurde unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC kontrolliert und sie wurden in Teilmengen lyophilisiert (Jerini AG, Berlin, Deutschland), und zwar nach Standardprozeduren, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiel 2 – Konjugation und Immunisation
Peptide mit den Sequenzen mit IDs 1–4 wurden an das Trägerprotein KLH (keyhole limpet hemocyanin) mittels MBS (Malei midobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) entsprechend den Protokollen für "NHS-Ester-Maleimid crosslinkers" von PIERCE, Rockford, IL, USA, konjugiert. Es wurden Schafe immunisiert, indem sie 100 μg Konjugat erhielten (μg entsprechend dem Peptidgehalt des Konjugats). Beginnend im Monat 4 nach der Immunisierung wurden alle vier Wochen 700 ml Blut von einem jeden Schaf genommen, und Antiserum wurde durch Zentrifugieren gewonnen. Die Konjugation, die Immunisierungen und die Produktion von Antiseren wurde vorgenommen durch MicroPharm, Carmerthenshire, UK.
Beispiel 3 – Reinigung von Antikörpern
Die polyklonalen Antikörper aus dem Schaf wurden unter Anwendung einer Liganden-spezifischen Affinitätsreinigung gereinigt. Für diese Stufen wurden die Cys(0)-Peptide mit SulfoLink-Gel verknüpft, das geliefert wird von Pierce (Boston, USA). Die Bindung erfolgte gemäß dem Protokoll von Pierce. Pro 5 ml Gel wurden 5 mg Peptid zugesetzt.
Kurz zusammengefasst wurden Kolonnen dreimal mit 10 ml Elutionspuffer (50 mM Citronensäure, pH 2,2) und Bindepuffer (100 mM Natriumphosphat, 0,1% Tween, pH 6,8) gewaschen. 100 ml Schaf-Antiserum wurden filtriert unter Verwendung eines Filterdurchmessers von 0,2 μm und dem Kolonnenmaterial zugesetzt. Das Gel wurde mit 10 ml Bindepuffer quantitativ eluiert. Das Material wurde über Nacht bei Raumtemperatur mittels leichter Rotation inkubiert. Das Material wurde auf leere Kolonnen überführt (NAP 25, Pharmacia, geleert). Die Eluate wurden verworfen. Anschließend wurden die Kolonnen mit 250 ml Protein-freiem Bindepuffer gewaschen (Proteingehalt des gewaschenen Eluats < 0,02 A280 nm). Den gewaschenen Kolonnen wurde Elutionspuffer zugesetzt, und es wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Der Proteingehalt einer jeden Fraktion wurde nach der BCA-Methode bestimmt (gemäß dem Protokoll von PIERCE, Rockford, IL, USA). Fraktionen mit einem Proteingehalt von > 0,8 mg/ml wurden zusammengegeben.
Beispiel 4 – Markieren
500 μl von Affinitäts-gereinigten Antikörpern, die gegen die Peptide der Sequenz IDs 1–4 erzeugt worden waren, wurden umgepuffert in 1 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) über eine NAP-5 Gelfiltrationskolonne (Pharmacia) gemäß dem Protokoll von Pharmacia.
Zur Markierung mit einem Chemilumineszenzmarker wurden 10 μl MA70-Akridinium-NHS-Ester (1 mg/ml; Hoechst Behring) zu 67 μl Antikörperlösung zugesetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde umgepuffert in 1 ml Lösemittel A (50 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,4) in einer NAP-5 Gel-Filtrationskolonne gemäß den Protokollen von Pharmacia, wobei die Teilchen mit einem niedrigen Molekulargewicht eluiert wurden. Zur Eluierung von ungebundenen Markern wurde eine Gel-Filtrations-HPLC durchgeführt (Kolonne: Waters Protein Pak SW300). Die Probe wurde zugesetzt und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute in Lösemittel A chromatographiert. Die Probe wurde bei einer Wellenlänge von 280 und 368 nm gemessen, um den Grad der Markierung zu bestimmen. Das Absorptionsverhältnis 368/280 nm hatte einen Spitzenwert von 1,0. Die Fraktionen, die monomere Antikörper enthielten, wurden gesammelt (Retentionszeit 8–10 Minuten) und in 3 ml 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5% Rinderserumsalbumin, 0,1% Natriumazid, pH 7,4 aufgenommen.
Der markierte Antikörper wurde in einem Sandwich-Assay verwendet sowie in verschiedenen Assays wie beispielsweise SPALT-Assays.
Beispiel 5 – Kopplung
Für einen Sandwich-Assay wurden die gereinigten Antikörper gegen die Peptide der Sequenzen IDs 1–4 an bestrahlten Polystyrolröhrchen (Greiner, Deutschland) immobilisiert. Für diese Prozedur wurden die Antikörperlösungen auf eine Proteinkonzentration von 6,7 μg/ml mit 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,8 verdünnt. 300 μl der verdünnten Proteinlösung pro Röhrchen wurden pipettiert. Letztere wurden 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und die Lösung wurde entfernt. Dann wurden 4,2 ml einer 10 mM Natriumphosphat, 2% Karion FP, 0,3% Rinderserumsalbumin, pH 6,5 Lösung zu jedem Röhrchen zugegeben. Nach 20 Stunden wurde die Lösung entfernt, und die Röhrchen wurden in einem Vakuumtrockner getrocknet. Die Prozedur kann auch als inverser Sandwich-Assay durchgeführt werden nach den Prozeduren, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiel 6 – Sandwich-Immunoassay
Es wurde der folgende Assay-Puffer verwendet: 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5% Rinderserumsalbumin, 0,1% unspezifizierte Schaf-IgG, 0,1% Natriumazid, pH 7,4.
Der Proteingehalt von EDTA-Plasma von gesunden Personen und Patienten mit verschiedenen Erkrankungen, die oben erwähnt wurden, wurde bestimmt.
In die Röhrchen, die den immobilisierten Antikörper enthielten, wurde EDTA-Plasma von Patienten pipettiert (10 μl ADM und 50 μl END-r). 200 μl PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung), 0.1% Rinderserumsalbumin wurden jedem Röhrchen zugesetzt und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Nach einem 3-malignem Waschen mit 4 ml PBS wurden 200 μl Acridiniumester-markierter polyklonaler Schafantikörper zugesetzt (Affinitäts-gereinigt, erzeugt gegen das Peptid 83–94 [Sequenz ID 2] sowie 69–86 [Sequenz ID 3] von pre-pro-ADM 1–185 sowie gegen das Teilpeptid 168–181 [RSSEEHLRQTRSET = Sequenz ID 6] bzw. 200–212 [SRERYVTHNRAHW = Sequenz ID 7] von pre-pro-END 1–212, jeweils 20 ng in PBS, 0,1% Rinderserumsalbumin. Nach einer weiterer Inkubation von 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden ungebundene markierte Antikörper durch 5-malignes Waschen mit jeweils 2 ml PBS entfernt. An das Röhrchen gebundener markierter Antikörper wurde quantifiziert durch Messen der Lumineszenz in einem Luminometer (Berthold LB 952T/16).
Die individuellen gemessenen Werte wurden gemäß einer üblichen Eichkurve quantifiziert, die erstellt worden war unter Verwendung definierter Verdünnungen von synthetisiertem pre-pro-ADM 45–92 und pre-pro-END 169–212 als Standardlösungen.
Beispiel 7 – Messungen
Konzentrationen von ADM-r und END-r in gesunden Personen und im Zustand der Krankheit
In die Untersuchung wurden 149 Patienten aufgenommen, die sich aus unterschiedlichen Gründen auf der Intensivstation befanden und die während ihres Aufenthalts auf der Intensivstation eine Sepsis entwickelten (Kriterien:
www.talessin.de/scripte/medizin/sepsis1.html). Jeden Tag während ihres Aufenthalts auf der Intensivstation (3–29 Tage) wurde EDTA-Plasma der Patienten gewonnen und bei –20°C zur weiteren Verwendung gelagert.
ADM-r ist im Plasma von gesunden Individuen in Konzentrationen von < 1 nmol/l vorhanden (Median 0,7). Kritisch erkrankte Personen, die eine Sepsis überlebten, zeigen eine signifikant erhöhte ADM-r Konzentration (Median 3,1). Der Median von sterbenden Patienten ist im Verglich mit der Gruppe überlebender Patienten signifikant erhöht (Median 11,8/17,1/17,7; 2 Tage vor dem Ableben/einen Tag vor dem Ableben/am Todestag; 1).
Die Konzentration von END-r (pro-END) als potentieller Antagonist von ADM nimmt zu von einem Median von 0,035 nmol/l Plasma auf 0,054 nmol/l bei überlebenden Patienten. Die Konzentration steigt weiter auf 0,096 und 0,133 nmol/l zwei Tage vor dem Ableben bzw. einen Tag vor dem Ableben. Überraschenderweise sinkt die Konzentration von END-r am Todestag dramatisch (Median 0,064 nmol/l, 2).
Beispiel 8 – Auswertungen
ADM-r und die Prognose betreffend die Schwere einer Erkrankung/Gesundheitsstörung
Die Konzentration von ADM-r wurde dazu verwendet, die Überlebensprognose zu bestimmen (Tabelle 1 und 1). Spalte 2 von Tabelle 1 (Spezifität) zeigt die Zahl von überlebenden Patienten mit einer Konzentration von weniger als 17 nmol/l Plasma an ADM-r, d. h. 117 von 126 Patienten weisen eine Konzentration von weniger als 17 nmol/l auf, 102 Patienten eine Konzentration von weniger als 8 nmol/l. Somit zeigt ADM-r eine Spezifität von 93% für das Überleben bei einem Cut off von 17 nmol/l und von 81% bei einem Cut off von 8 nmol/l. Die Sensitivität der Mortalität wurde auf folgende Weise bestimmt: 23 Patienten starben während ihres Aufenthalts auf der ICU. Bei einem Cut off-Wert von 17 nmol/l ADM-r zeigten sechs Patienten (26% = Mortalitätssensitivität) Konzentrationen über 17 nmol/l zwei Tage vor dem Ableben, 12 Patienten (52%) einen Tag vor dem Ableben und 13 Patienten (57%) am Todestag. Bei einem Cut off-Wert von 8 nmol/l zeigten 19 (83%) von 23 Patienten Konzentrationen über 8 nmol/l ADM-r zwei Tage vor dem Ableben, 21 Patienten (91%) einen Tag vor dem Ableben und 19 Patienten (83%) am Todestag (Tabelle 1).

Somit schließt ein Cut off-Wert von 8 nmol/l ADM-r, d. h. unter Ausschluss derjenigen Patienten mit einer Konzentration unter 8 nmol/l ADM-r, die meisten derjenigen Patienten ein, die während ihres Aufenthalts auf der ICU verstarben. Tabelle 1:

	Spezifität	Sensitivität
	Überlebende n = 126	2. Tag vor dem Tod n = 23	Letzter Tag vor dem Tod n = 23	Todestag n = 23
ADM-r

Cut off 17 nmol/l	117	6	12	13
Cut off 8 nmol/l	102	19	21	19

Verhältnis ADM-r/END-r

Cut off 215	117	0	0	14
Cut off 90	96	21	22	20

Ratio ADM-r/END-r

ADM-r > 8 nmol/l Cut off 90	117	20	21	18

	Spezifität	Sensitivität
	Überlebende	2. Tag vor dem Tod	Letzter Tag vor dem Tod	Todestag

ADM-r

Cut off 17 nmol/l	93%	26%	52%	57%
Cut off 8 nmol/l	81%	83%	91%	83%

Verhältnis ADM-r/END-r
Cut off 215	93%	0%	0%	61%
Cut off 90	76%	91%	96%	87%

Verhältnis ADM-r/END-r

ADM-r > 8 nmol/l Cut off 90	93%	87%	91%	78%

Beispiel 9 – Verhältnis
Verhältnis ADM-r/END-r
Das Verhältnis von ADM-r/END-r ist in Tabelle 1 und in 3 gezeigt. Das ADM-r/END-r-Verhältnis weist in gesunden Personen einen Maximalwert von etwa 50 auf (Median 20). Der Median von überlebenden Patienten auf der ICU steigt an auf 56. Ein signifikanterer weiterer Anstieg kann zwei Tage (Median 135) und einen Tag (Median 129) vor dem Ableben beobachtet werden, und ein überraschend dramatischer Anstieg am Todestag bei einem Median von 336. Die Prognose bei einer Spezifität von 76% (Tabelle 1, d. h. die erfassten Patienten weisen eine Konzentration von ADM-r von weniger als 43 nmol/l auf) beträgt 91% zwei Tage vor dem Ableben, 96% einen Tag vor dem Ableben und 87% am Todestag (Tabelle 1 und 3). Bei einer höheren Spezifität von 93%, d. h. die erfassten Patienten weisen eine Konzentration von ADM-r von weniger als 18 nmol/l auf, ist eine Prognose nur am Todestag mit einer Sensitivität von 61% möglich (Tabelle 1).
Beispiel 10
Verhältnis ADM-r/END-r unter Erfassung nur von Patienten mit einer Konzentration von ADM-r über 8 nmol/l
Somit wurden die Patienten gemäß ihrer ADM-Konzentration (> 8 nmol/l) und gemäß dem Verhältnis von ADM-r/END-r weiter selektiert (4).
Es wurde gezeigt, dass ein hoher Anteil an überlebenden Patienten mit einer ADM-Konzentration > 8 nmol/l an einem Tag ihres Aufenthalts in der ICU, N = 24, ein Verhältnis von weniger als 90 (N = 15) aufwiesen, somit war ihr Überleben sichergestellt. Entsprechend dieser Vermutung wurden jedoch auch die sterbenden Patienten mit einer hohen Wahrscheinlichkeit 2 Tage vor ihrem Tod erfasst (Sensitivität 87% zwei Tage vor dem Ableben/91% einen Tag vor dem Ableben/78% am Todestag). Berücksichtigt man die Summe an Patienten, die an der Untersuchung teilnahmen (126 überlebende Patienten), ist die Spezifität überraschend hoch und beträgt 93%.
Somit zeigt die aufeinanderfolgende Analyse von ADM-r, END-r und dem Verhältnis oder Algorithmus von ADM-r/END-r bei einer gleichmäßig hohen Spezifität (93%) überraschenderweise eine höhere Sensitivität für die Prognose (87%/91%/78%) als die Analyse von ADM (26%/52%/57%) oder des Verhältnisses (0/0/61) allein (Werte 2 Tage vor dem Tod/ein Tag vor dem Tod/Todestag).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In vitro-Verfahren für die Diagnose der möglichen Entwicklung oder des Vorliegens einer lebensbedrohenden Krise, die sich als Endothelin-Mangel äußert ("low endothelin syndrome" oder "LES"), bei einem kritisch erkrankten Patienten, das umfasst – Bestimmen in vitro in einer Probe einer Körperflüssigkeit des Patienten der Konzentration von einem oder mehreren physiologisch auftretenden Pro-Adrenomedullin (pro-ADM)-Fragmenten, deren Bildung die Bildung des aktiven Adrenomedullins begleitet und die dieses nicht umfassen, – begleitendes Bestimmen in vitro in der genannten Körperflüssigkeit des Patienten der Konzentration von einem oder mehreren physiologisch auftretenden Pro-Endothelin(pro-END)-Fragmenten, deren Bildung die Bildung des aktiven Endothelins begleitet und die dieses nicht umfassen, – Verwendung der gemessenen Konzentration zur Berechnung eines Verhältnisses pro-ADM/pro-END, – Verwendung des berechneten Verhältnisses, gegebenenfalls in Kombination mit der gemessenen Konzentration von pro-ADM allein, zur Feststellung der Entwicklung oder des Vorliegens des genannten lebensbedrohenden Schockzustands, der sich als Endothelin-Mangel äußert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte Verhältnis im Zuge der Ermittlung des Mortalitätsrisikos verwendet wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei die Körperflüssigkeit Plasma, Serum, Blut, Liquor oder Urin ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Patient ein Patient in einer Intensivstation (ICU) ist, der auf die ICU mit einer Diagnose von einem oder mehreren von Sepsis, SIRS, septischem Schock, multiplem Organversagen, lokalen oder systemischen Infektionen, bakteriellen Infektionen, Herzkrankheit, Peritonitis, Pankreatitis, lokaler und/oder systemischer Inflammation, Meningitis, Trauma, einem geplatzten Aorta-Aneurysma, einer Vergiftung, einer Endotoxämie, einer Anurie, einer Niereninsuffizienz, arteriellem Hochdruck, pulmonärem Hochdruck, Arteriosklerose, Krebs, Stauungsherzinsuffizienz, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Koronararterien-Erkrankung, Ischämie, antiarrhythmischen Effekten, Krebs einschließlich Enddarmkrebs, Nieren- und/oder Herzversagen, einer Organverletzung eingeliefert wurde.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das pro-ADM-Molekül und/oder das pro-END-Molekül unter Verwendung eines selektiven immundiagnostischen Assays bestimmt werden, der ein physiologisch auftretendes Fragment erkennt, das das reife vasoaktive ADM bzw. END nicht umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei in den Assays zur Bestimmung von pro-ADM- und pro-END Kombinationen von selektiven Antikörpern verwendet werden, und wobei wenigstens einer der Antikörper, der spezifisch an das physiologisch auftretende Fragment bindet, an eine feste Phase immobilisiert ist, und wenigstens ein zweiter Antikörper, der spezifisch an einen anderen Teil des gleichen Fragments bindet, zum Nachweis des Fragments, das an die feste Phase gebunden ist, verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der zweite Antikörper, der für den Nachweis verwendet wird, mit einem lumineszierenden Marker markiert ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das bestimmte pro-ADM-Fragment ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs 2 oder 3 ist, und das bestimmte pro-END-Fragment ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs 6 oder 7 ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die Bestimmung von Pro-Adrenomedullin oder seines physiologisch auftretenden Fragments als halbquantitative Bestimmung unter Verwendung einer immunchromatographischen POC-Messvorrichtung durchgeführt wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, wobei zur Berechnung des Verhältnisses, zur Verwendung des Verhältnisses zu diagnostischen und prognostischen Zwecken und zur Einteilung der Patienten in Bewertungsgruppen Algorithmen bzw. geeignete Computerprogramme verwendet werden.