Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines
diagnostischen Markers für
den Nachweis von ischämischen
Herzschädigungen,
insbesondere der latenten und chronischen Formen, vorzugsweise durch
die diagnostische Bedeutung des Markers für Patienten mit Verdacht auf
Myokardischämie, den
Einsatz des Markers in der Diagnostik zur Verifizierung von ischämischen
Herzschädigungen,
insbesondere einer latenten Myokardischämie, sowie eines Testkits zum
Nachweis des Markers.
Beschreibung
der Erfindung
Die
Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von ischämischen
Herzschädigungen,
insbesondere der latenten und chronischen Formen, durch serologischen
Nachweis der Myosin-Leichtkette I (Myosin Light Chain 1, MLC 1)
als diagnostischen Marker im Blut betroffener Patienten sowie ein
Enzymimmunoassay zum Nachweis von MLC 1.
Der
Enzymimmunoassay zur Bestimmung von MLC I im Blut für die Diagnose
von ischämischen
Herzschädigungen,
insbesondere der latenten und chronischen Formen, umfasst in separater
Verpackung wenigstens:
- a) einen festen Träger mit
daran gebundenen Antikörpern,
die sensitiv und spezifisch MLC I binden;
- b) MLC I als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Markers;
- c) mindestens einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe
des MLC I;
- d) einen Puffer zum Verdünnen
der zu untersuchenden Probe;
- e) einen Waschpuffer;
- f) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an MLC I bindet;
- g) und ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar
markierten Konjugats erlaubt.
Bei
den Antikörpern,
die an den festen Träger
gebunden sind, handelt es sich bevorzugt um monoklonale Antikörper.
Als
feste Träger
werden vorwiegend Mikrotiterplatten eingesetzt und als detektierbar
markiertes Konjugat ein konjugierter Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler
Antikörper,
der an das MLC I bindet.
Geeignet
für die
Erfindung sind insbesondere immunologische Standarverfahren zum
Nachweis von Analyten aus Testlösungen,
vorzugsweise wenn sie als Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
realisiert werden.
Im
Folgenden wird der ELISA näher
beschrieben.
Optimierung
der Komponenten und Bedingungen
Monoklonale
Antikörper,
die spezifisch an MLC 1 binden, wurden mit Meerrettichperoxidase
(horseradish peroxidase, HRP) unter Anwendung der Perjodat-Methode konjugiert.
Anschließend
wurden verschiedene Kombinationen von Antikörpern getestet. Sowohl die
Antikörper,
die an die Mikrotiterplatte gebunden wurden als auch die konjugierten
Antikörper
wurden variiert. Es zeigte sich, dass die Kombination eines monoklonalen
Antikörpers
für die
Plattenbeschichtung mit einem HRP-conjugierten monoklonalen Antikörper die
besten Ergebnisse liefert.
Des
weiteren erfolgte die Optimierung der Konzentration der Beschichtungsantikörper, der
Konjugatverdünnung,
der Pufferbestandteile, der Inkubationszeiten und -temperaturen,
sowie der Stabilität
der Reagenzien und Bestandteile des Testkits nach bekannten Methoden.
Testdurchführung:
- 1. 100 μl
der Standardlösungen,
der Kontrollen und der Proben, die 1:4 mit Probenpuffer verdünnt wurden, werden
in die entsprechenden Vertiefungen pipettiert.
- 2. Die MTP wird 2h bei Raumtemperatur (ca: 25°C) inkubiert
und dabei mit Hilfe eines orbitalen MTP-Schüttlers bei ca. 300 rpm geschüttelt.
- 3. Die Vertiefungen werden 3 × mit je 350 μl Waschpuffer
gewaschen.
- 4. Es erfolgt die Hinzugabe von 100 μl Konjugatlösung.
- 5. Die MTP wird 1 h bei Raumtemperatur (ca. 25°C) inkubiert
und dabei mit Hilfe eines orbitalen MTP-Schüttlers bei ca. 300 rpm geschüttelt.
- 6. Die Vertiefungen werden 3 × mit je 350 μl Waschpuffer
gewaschen.
- 7. 100 μl
der Substratlösung
wird in jede Vertiefung pipettiert.
- 8. Die MTP wird 15 min bei Raumtemperatur (ca. 25°C) inkubiert.
- 9. Die Farbentwicklung wird durch Hinzugabe von 100 μl Stoplösung gestoppt.
- 10. Die optische Dichte wird mit einem Photometer bei einer
Wellenlänge
von 450 nm gemessen.
Intratestvarianz
Zwei
Serumproben mit unterschiedlichen MLC I-Konzentrationen wurden mit
einer Untersuchung (8fach-Bestimmung) gemessen. Die Varianz der
8 Ergebnisse je derselben Probe lag bei allen Konzentrationen unter
5,0%.
Intertestvarianz
Zwei
Serumproben mit unterschiedlichen MLC I-Konzentrationen wurden mit
3 Untersuchung gemessen. Die Varianz der 3 Ergebnisse je derselben
Probe lag bei allen Konzentrationen unter 6%.
Wiederfindungsrate
MLC
I wurde in verschiedenen Konzentrationen zu zwei Seren gegeben und
untersucht.
Die
Wiederfindungsrate des hinzugegebenen MLC I in den Serum Proben
lag zwischen 86.8% und 106,0%.
Linearität
Serumproben
mit verschiedenen Konzentrationen wurden verdünnt und gemessen. Die Wiederfindungsrate
der Proben lag zwischen 97.5% und 117.2%.
Ausführungsbeispiel 1
Es
wurden 22 Patienten mit szintigrafisch nachgewiesener Herzschädigung mit
21 Patienten verglichen, bei denen eine Herzschädigung mit Hilfe von Thallium-Szintigrafie
sowie Belastungs-EKG ausgeschlossen wurde:
Ausführungsbeispiel 2
Methoden
Patienten:
Es
wurde eine Gruppe von 80 Probanden getestet. Die Gruppe bestand
aus drei Untergruppen. Die erste Gruppe bestand aus asymptomatischen
Patienten mit einem hohen Risiko einer latenten Myokardischämie (Personen
mit zahlreichen Risikofaktoren und einem Risiko nach der Framingham-Studie
Algorithmus über
20%/10 Jahre oder Algorithmus über
5%/10 Jahre, n = 47). Die zweite Untergruppe bestand aus symptomatischen
Personen mit einer stabilen Form von CAD (CCS I – CCS II, n = 21). Die dritte
Gruppe setzte sich aus gesunden Freiwilligen (Mitarbeiter des Sternberk-Hospitals, n = 12)
zusammen.
Keine
der Testpersonen zeigte Anzeichen von Herzinsuffizienz, akutem Koronarsyndrom,
Nierenschädigungen
oder entzündlichen
Erkrankungen.
Echokardiografie und Belastungstests:
Alle
Probanden wurden echokardiografisch getestet (Berechnung der linksventrikulären Ejektionsfraktion – LVEF – nach Simpson),
gefolgt von einer Untersuchung per Fahrrad-Ergometrie. Die Ergometrie wurde entsprechend
der Empfehlung der Tschechischen Kardiologischen Gesellschaft (Chaloupka,
2000) durchgeführt.
Die anfängliche
Belastung betrug 50 W, minütlich
um 25 W erhöht,
bis der Proband eine maximale Belastung verspürt.
Innerhalb
von 30 Tagen nach der Fahrrad-Ergometrie wurde bei allen Probanden
eine SPECT durchgeführt.
SPECT:
Belastungstests:
Physische Belastung wurde erzielt durch ein Fahrrad-Ergometer. Nach
Erreichen von 85% der maximalen aeroben Kapazität oder, wenn die Belastbarkeit
durch Angina Pectoris, ischämische
Veränderungen
auf dem ECG, schwere Arrhythmie, niedrigen Blutdruck u. s. w. eingeschränkt war,
wurden Radiopharmaka verabreicht. Falls der Patient physisch nicht
belastbar war, wurde pharmakolische Belastung mit Dipyridamol (0.56
mg/kg Körpergewicht
während
4 Min) erzeugt.
Gated
SPECT: Der Gated SPECT wurde 15 Minuten nach Verabreichung von 740
MBq 99mTc-MIBI bei höchster Belastung erreicht.
Bei heterogener Perfusion wurde die Ruheuntersuchung an einem anderen
Tag durchgeführt
(gated SPECT 1 Stunde nach Verabreichung von 99mTc-MIBI).
8-frame gating wurde benutzt, um Daten auf einer Doppeltdetektions-Szintillationskamera
Siemens e.cam (Siemens Medical Solutions, Erlangen, Deutschland)
ausgerüstet
mit enem parallellen Kollimators vom LEHR Typus, Rotationswinkel
180°, insgesamt
64 Projektionen in einer 64 × 64
Matrix von der rechten anterioren schrägen Projektion von 45° bis zur linken
posterioren schrägen
Projektion von 45°,
zu sammeln.
Bewertung
der SPECT-Befunde: Tomografische Abschnitte myokardialer Perfusionen
wurden visuell bewertet und in normale Befunde und Stress bedingte
Perfusionsstörungen
klassifiziert. Die quantitative Analyse der Perfusion wurde in Form
einer Polar Map dargestellt. Additive Belastungspunkte (Summation
stress score, SSS) der myokardialen Perfusion, nach der Belastung
und im EF Ruhezustand wurden mittels eines automatischen quantitativen
Programms 4D-MSPECT (University of Michigan, Ann Arbor, USA) erhalten.
Die
SPECT-Ergebnisse wurden zur Erstellung der CAD-Diagnose verwendet.
Koronare Angiographie:
Bei
Personen mit typischen CAD-Befunden oder unklaren Befunden wurde
eine frei zu wählende
Koronarographie durch die Femoralis mit einer 6 oder 7F Instrumentation
durchgeführt.
Obliteration der koronaren Arterie und Stenose wurden durch einen
Invasivkardiologen bewertet, der nicht über die anderen Risiken des
Patienten informiert war. Als angiographisch positiver Befund wurde
betrachtet, wenn mindestens eine Stenose das Lumen einer konoraren
Hauptarterie oder einer ihrer Verzweigungen um über 60% verengte.
Laboruntersuchung und
Blutentnahme:
Die
Untersuchung des biologischen Materials wurde an venösen Serumproben
und EDTA-Blut durchgeführt. Es
wurden alle Parameter außer
MLC-1 innerhalb von 120 Minuten nach Entnahme bestimmt.
Bei
allen Patienten wurden folgende Laboruntersuchungen des venösen Blutes
durchgeführt:
- a) direkt vor der Ergometrie: CRP (Advia 1650,
immunoturbidimetry), Hb, Htc (MaxM Coulter), Laktat (Advia 1650),
MLC-1 (ELISA line Marc + Max), cTnI (Immulite Turbo, LEIA)
- b) bei maximaler Belastung: Hb, Htc, Laktat, MLC-1
- c) 30 min nachdem der Belastungspegel den Höhepunkt erreicht hatte: MLC-1,
Laktat
- d) 60 min nachdem der Belastungspegel den Höhepunkt erreicht hatte: MLC-1,
Laktat
Bei
allen Probanden wurden Veränderungen
des Blutvolumens (Abschätzung
des dynamischen Verhalten von Htc, Hb incl. der Berechnung der metabolischen
MLC-1 Veränderungen)
(10).
Um
die Dynamik von MLC-1 zu bewerten, wurde die gesamte Gruppe entsprechend
den SPECT-Resultaten in Untergruppen aufgeteilt (Personen mit Anzeichen
für Myokardischämie bei
der SPECT-Untersuchung). Patienten mit positivem SPECT-Befund wurden
mit Patienten mit positivem Ergometrie-Befund, unabhängig vom
SPECT-Befund, verglichen.
Die
Einteilung in die o. g. Gruppen wurde, unter Berücksichtung des Vorhandenseins
einer Myokardischämie
unter Belastung, auch für
das Einzeichnen der ROC-Kurve zur diagnostischen Validität von MLC-1 verwendet.
Laborbestimmung von MLC-1
Die
Entnahme für
MLC-1 erfolgte aus peripherem venösem Blut, die Bestimmung erfolgte
aus dem Serum. Nach der Entnahme wurde jede Probe 60 Minuten lang
bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert
(10 min, 1100 g bei 4°C)
und bei –80°C eingefroren.
MLC-1
wurde 3 Monate nach der Entnahme bestimmt, nachdem die Proben wieder
auf Zimmertemperatur (25°C)
erwärmt
worden waren. Alle Proben wurden zweimal untersucht.
Die
ventrikuläre
Form von MLC-1 (vMLC-1) wurde mit der ELISA-Methode (Biovendor Inc)
in Sandwich-Anordnung bestimmt. Es wurde eine Kombination zweier
muriner monoklonaler Antikörper
zur Bestimmung benutzt. Basis-analytische Charakteristik der Methode:
Variationskoeffizient in einer Reihe < 5%, Variationskoeffizient zwischen
Reihen < 8% im
Eichspektrum/Breite/, analytische Empfindlichkeit 0.3 mg/l, funktionale
Empfindlichkeit 0.5 mg/l, Messbereich 0.3–40 mg/l. Analytische Spezifität: 10% Kreuzreaktivität gegen MLC-2
und 20% gegen MLC Skelettmuskulatur.
Statistische Datenverarbeitung
Die
Daten wurden mit Hilfe der Medcalc Software bearbeitet. Zugehörige Inhalte
wurden, wenn nicht anders angezeigt, durch Mittelwert ± Standartabweichung
und Median ausgedrückt.
Die MLC-1-Konzentration in den Untergruppen wurde per Varianzanalyse
(ANOVA, Kruskal-Wallis entsprechend dem Verteilungstyp) und ROC-Analyse
verglichen. Mit dem Spearmann Korrelationskoeffizienten wurden die
Konzentration von MLC-1 sowie andere Werte gegenseitig ins Verhältnis gesetzt.
Kategorie-Daten wurden mittels x2-Test verglichen.
Als statistisch bedeutsam wurde ein Wert von p < 0.05 betrachtet. Normalwerte wurden
mit x2-Test bestimmt.
Ergebnisse
Tabelle
1 stellt den statistischen Verlauf der gesamten Gruppe dar. Sie
zeigt eine abnorme Verteilung der meisten Parameter.
Tabelle
1: Statistik der gesamten Gruppe
Normalwerte nach Chi-Quadrat-Test
Die
Diagnosestellung einer Myokardischämie per SPECT unterschied sich
nicht wesentlich zur Diagnosestellung einer CAD per Fahrradergometrie
(Chi Quadrat, p = 0.06).
Die
MLC-1-Konzentrationen in den anfänglich
bestimmten Untergruppen (A, B, C) ergab bei keiner Entnahme wesentliche
Unterschiede.
Nach
Aufteilung in 2 Untergruppen entsprechend SPECT auf das Vorhandensein
einer Ischämie,
unterschieden sich nur die MLC-1 Konzentrationen wesentlich bei
allen 4 Entnahmen (median in mg/l; 2.5 vs 0 in Entnahme 1; 2.4 vs
0 in Entnahme 2; 2.3 vs 0 in Entnahme 3; 2.3 vs 0 in Entnahme 4).
Da die Bewertungsrichtlinien für
SPECT den SSS-Index
umfassen, wird dort kein wesentlicher Unterschied festgestellt (Tabelle 2). Tabelle
2: Kruskal-Wallis Statistik, Unterschiede zwischen den unterteilten
Untergruppen
- „0":
- unterhalb der Meßgenauigkeit
von 0,3
- „NS":
- nicht signifikant,
p > 0,05
Bei
der Bestimmung von bedeutenden Veränderungen der Parameter wurden,
selbst bei Berücksichtigung
der Veränderung
des Blutvolumens, keine erwähnenswerten
Unterschiede zwischen den einzelnen MLC-1-Konzentrationen unter
Belastung festgestellt.
Tabelle
3: Signifikante Korrelationen von MLC-1 an der Grundlinie
Korrelations-Koeffizient
nach Spearmann
Eine
Betrachtung der Korrelation zeigte eine signifikante Verbindung
(Spearmann) zwischen MLC-1 vor der Ergometrie und dem SSS-Wert (0.33,
p = 0.025). Dies beweist die Signifikanz einer ischämischen
Beteiligung bei SPECT sowie einer negativen Korrelation zwischen
der Laktatkonzentration vor der Belastung und dem MLC-1-Wert (–0.25, p
= 0.049). Sehr enge Korrelationen wurden während Belastung zwischen MLC-1
festgestellt (0.92–0.97,
p < 0.0001). Weder
unter normalen Bedingungen noch unter Belastung wurden zwischen
MLC-1 und den anderen gemessenen Parametern weitere bedeutende Korrelationen
beobachtet. Besonders interessant sind die festgestellten Serum-Kreatinin-Werte,
LVEF, Belastungs-EF und Ruhe-EF, die entsprechend früherer Ergebnisse
anderer Studien zu erwarten waren.
In
Anbetracht der bedeutenden Veränderungen
der MLC-1-Werte während
wiederholter Entnahmen, wurde die Validität von MLC-1 zur Diagnose von
Myokardischämie,
festgestellt per SPECT, unter Normalbedingungen getestet.
1 zeigt
eine 91%ige Sensitivität
und 98%ige Spezifität
bei der Diagnose einer Myokardischämie für MLC-1 über seiner in 2 dargestellten
Bestimmbarkeitsgrenze (AUC 0.94; 95% CI 0.86–0.98; LR + 36.3; PPV+ in der
Gruppe mit einer Prävalenz
von 44.4% 96.7% und NPV – 93%)
auf.
Diskussion
Myosin
ist ein kontraktiles Protein, bestehend aus zwei schweren Ketten
(MW 200 kD) und zwei Leichtketten. Leichtketten werden mit MLC-1
(MW 25 kD) und MLC-2 (MW 19 kD) bezeichnet. Im Organismus gibt es
verschiedene Arten von MLC (z. B. MLC der Skelettmuskulatur – sMLC,
MLC der Ventrikel – vMLC,
Atrial-MLC – aMLC).
Eine gestörte
Integrität
der Kardiomyocyten (z. B. Myokardnekrose) führt zu einer Freisetzung von
vMLC-1 aus dem Myocardium in den Kreislauf. Schon 3–6 Stunden
nach dem Ereignis steigt der MLC-Wert an und der Höchstwert
wird am 1. bis 5. Tag nach Beginn der Nekrose erreicht (schwere
Ketten erscheinen 2–10
Tage nach Einsetzen der Nekrose im Kreislauf und ihr Höchstwert
wird nach 5–6
Tagen erreicht). Ein erhöhter
MLC-Wert bleibt eine Woche lang im Kreislauf bestehen. Da MLC über die
Nieren ausgeschieden wird, zeigen Probanden mit Nierenfunktionsstörungen höhere MLC-Werte
und die Dynamik der Veränderungen
sind nach einer Myokardnekrose beeinträchtigt. Wegen der hohen Sensivität und Spezifität (MLC-1
kommt im Herzen meist als vMLC-1 vor) wird MLC als Marker für Myokardnekrose
angesehen. Leider wird von einer unbefriedigenden Qualität der Test-Kits
berichtet.
Obwohl
MLC-1 hauptsächlich
im ventrikulären
Myocardium vorkommt, ist es nicht myokard-spezifisch (es kommt auch
im Skelettmuskel vor) (2, 4, 7). Ein erhöhter MLC-1-Wert wurde auch in anderen Fällen myokardialer
Beteiligung beschrieben, zusätzlich
zur ischämischen
Nekrose (Myokarditis). (1).
In
mehreren in letzter Zeit erschienen Veröffentlichungen wurde beschrieben,
dass ein erhöhter MLC-1-Wert
die Diagnose bestätigt
und dass die MLC-1-Konzentration sogar eine Abschätzung erlaubt,
inwieweit eine Ausbreitung des nektrotischen Herdes kurz bzw. langfristig
erfolgt. (Dies gilt sogar mit höherer
Validität
als bei der Troponin-Konzentration)
(3, 6, 7).
In
letzter Zeit wurde eine hohe diagnostische Validität von MLC-1
zur Diagnose minimaler myokardialer Ereignisse erwiesen (2, 3, 6).
Der Nachteil der meisten Test-Kits ist ihre niedrige myokardiale
Spezifität
(3).
Mehrere
Veröffentlichungen
beschreiben einen erhöhten
MLC-1-Wert bei stabilisierten Patienten mit kardialer Dysfunktion
(NYHA III); entsprechend der MLC-1-Konzentration konnte die Sterblichkeit
dieser Patienten vorhergesagt werden (2, 4, 5, 7). Einer der Gründe für einen
erhöhten
MLC-1-Wert im Blutkreislauf bei diesen Patienten könnte eine
Entartung der Myofibrillen mit anschließendem Freiwerden ihrer Bestandteile
in den Blutkreislauf sein, die oft mit einer kardialen Dysfunktion
einhergeht. Diese strukturellen Veränderungen können die Dysfunktion der Ventrikel
verstärken
und den Füllungsdruck
des Herzens erhöhen.
(5). Ein anderer Grund könnte
eine erhöhte
MLC-1 Genexpression sein, die auf übermäßige Belastung der Kardiomyocyten
zurückzuführen ist.
Ein solches Ereignis könnte
einen erhöhten
Proteinausstoß in
die Herzmuskelzellen und in den Blutkreislauf verursachen Es bleibt
die Frage offen, ob solch eine Freisetzung in Zusammenhang mit geschädigten Strukturen
der Kardiomyocyten steht, d. h., ob eine Stukturschädigung Voraussetzung
ist.
Eine
erhöhte
Sterblichkeit von Patienten mit erhöhten MLC-1-Werten könnte auf
eine myozytären Streß, beeinträchtigte
Integrität
der myozytären
Membran oder Strukturschädigungen
der Kardiomyocaten hinweisen, die in Zusammenhang mit der Freisetzung
von intrazellulären
Proteinen in den Blutkreislauf stehen. Es ist auffallend, dass dieses
Phänomen
bei klinisch stabilisierten Patienten beobachtet wird (2).
MLC-1
ist auch ein Substrat der Kaspase-3, die nach Auslösen der
apoptotischen Kaskade aktiviert wird. Aktivierte Kaspase-3 spaltet
vMLC-1, wodurch das biologische wirksame vMLC-1 zerstört, was
zu einer reduzierten Kontraktilität des Myokardiums führt. Eine
direkte Spaltung der vMLC-1 durch Kaspase-3 kann durch Veränderung
der quervernetzenden Kontakte zwischen Actin- und Myosinmolekülen eine
Einschränkung
der myokardialen Funktion verursachen. So ist es möglich, dass
die Aktivierung der Apoptose im Herz zu einer kontraktilen Dysfunktion
bereits vor dem Zelltod führt.
(4, 6).
Die
Ergebnisse unterstützen
die Hypothese, dass bei exzessiver Belastung der Kardiomyocyten MLC-1
in den Blutkreislauf freigesetzt wird. Solch eine Belastung kann
eine transitorische oder latente Myokardischämie sein. Es ist fast sicher,
dass Apoptose (die Beziehung zu MLC-1 wurde oben beschrieben) eine wichtige
Rolle bei der Pathogenese von CAD spielt.
Es
kann geschlossen werden, dass diese Ergebnisse einzigartig sind
in Bezug auf eine hohe diagnostische Validität einer einzigen Messung von
MLC-1 zur Diagnose einer latenten Myokardischämie. Das bedeutet, dass eine
latente Ischämie
mit einer über
90%igen Spezifität
und Sensivität
auf der Basis einer MLC-1-Untersuchung festgestellt werden kann.
Dies kann unter technischen, ökonomischen
und medizinischen Aspekten von entscheidender Bedeutung sein.
Das
vorangehende Ausführungsbeispiel
war zum Teil überlappend
mit einer größer angelegten
Studie (s. nachfolgendes Ausführungsbeispiel
2a), aus der in diesem Zusammenhang beispielhaft noch weitere vorteilhafte
Merkmale der Erfindung ersichtlich werden.
Ausführungsbeispiel 2a)
Zusammenfassung der Studie:
Bewertet
wurde eine Gruppe von 176 Hochrisikoprobanden, die nach dem Ergebnis
einer Myokard-SPECT (Single-Photon-Emmissionscomputertomographie)
in zwei Untergruppen eingeteilt wurden: Personen mit und Personen
ohne Myokardischämie.
Bei allen Probanden wurden ein Belastungstest und eine Myokard-SPECT
(99mTc-MIBI) durchgeführt. Anschließend wurden
die Probanden, die relevante SPECT-Ergebnisse gezeigt hatten, einer elektiven
Koronarangiographie unterzogen. Bei allen Probanden wurden mehrmals die
Labormarker im Venenblut untersucht: a) unmittelbar vor dem Belastungstest:
C-reaktives Protein (CRP), Hämoglobin
(Hb), Hämatokrit
(Htk), Laktat, MLC-1; b) auf dem subjektiven Maximum: Hb, Htk, Laktat,
MLC-1; c) 30 min nach Erreichen der Maximalbelastung: MLC-1 und
d) 60 min nach der Maximalbelastung: MLC-1. Die ROC zur diagnostischen
Wirksamkeit der MLC-1 wurde unter dem Gesichtspunkt des Auftretens
einer Myokardischämie
unter Belastung erstellt.
Ergebnisse:
Die Patienten wurden je nachdem, ob ihr SPECT-Ergebnis positiv oder
negativ war, in Untergruppen eingeteilt (positiv, n = 37/negativ,
n = 139). Die Untergruppen unterschieden sich hinsichtlich ihrer MLC-1-Konzentrationen
in allen 4 Blutproben (Median in mg/l; 3,1 gegenüber 0,5 bei Blutprobe 1; 3,1
gegenüber
1,1 bei Blutprobe 2; 2,9 gegenüber
0,5 bei Blutprobe 3; 3,4 gegenüber
0,5 bei Blutprobe 4) sowie bezüglich
ihrer Geschlechterverteilung (ein positives SPECT-Ergebnis trat
häufiger
bei Männern
auf). Die MLC-1-Werte änderten
sich weder während
des Belastungstests noch 60 Minuten danach, d. h. unter Berücksichtigung
der Blutvolumenänderungen
während
des Belastungstests waren keine Veränderungen zu verzeichnen. Es
wurde eine signifikante positive Korrelation zwischen MLC-1 und
SSS (0,27, p = 0,01), SDS (c = 0,26; p = 0,02) sowie der Defektfläche des
linken Ventrikels (c = 0,27, p = 0,01) festgestellt. Zwischen den MLC-1-Konzentrationen
vor Belastung und der maximalen Herzfrequenz (c = –0,23; p
= 0,01) wurde eine negative Korrelation erkannt.
Eine
erhöhte
MLC-1 von über
2,2 mg/l ergab 64% Sensitivität
und 88% Spezifizität
für das
diagnostizierte Auftreten einer Myokardischämie (Fläche unter der Kurve (AUC) 0,81;
95% Konfidenzintervall (CI) 0,72–0,88; positives Testergebnis
(LR+) 5,9; positiver Prädiktorwert
(PPV+) 68% und negativer Prädiktorwert (NPV-)
87%).
Schlussfolgerung:
Wie gezeigt wurde, besitzen nachweisbare MLC-1 einen hohen diagnostischen Aussagewert
für die
Diagnose einer latenten Myokardischämie. Es wird geschlussfolgert,
dass sich mit Hilfe dieser Bestimmung die Zahl der Untersuchungen
mit Belastungstests sowie SPECT senken lassen kann.
Studie im Detail:
Methoden
Untersuchungsgruppe
Untersucht
wurde eine Gruppe aus 176 Probanden, davon 84 Männer und 92 Frauen. Dabei handelte es
sich um Personen mit einem hohen Risiko für das Bestehen einer latenten
Myokardischämie
(Individuen mit zahlreichen Risikofaktoren und einem Risiko von > 20%/10 Jahre nach
dem Framingham-Algorithmus bzw. > 5%/10
Jahre nach dem Cardioscore-Algorithmus) oder um asymptomatische
Patienten, deren Anamnese eine ischämische Herzkrankheit (ICHS)
aufwies.
Keines
der untersuchten Individuen zeigte Symptome eines Herzversagens
oder akuten Koronarsyndroms (Anamnese, klinische Untersuchung, Herz-
und Lungen-RTG, EKG, Konzentration des Herztroponins-I (cTn-I) und
des N-terminalen Propeptids des natriuretischen Peptids vom Typ
B (NT-proBNP), wurde wegen einer manifesten Nephropathie vorgestellt
(als Ausscheidungskriterium galt ein Kreatininwert im Serum von > 150 μmol/l) oder
wies Symptome einer signifikanten akuten Entzündung auf (beurteilt mittels
klinischer Untersuchung, Anamnese, CRP-Wert und Leukozyten, wobei
als Ausscheidungskriterien ein CRP-Wert im Serum von > 30 mg/l und/oder eine
Leukozytenzahl im Blut von > 109/l
festgelegt wurden).
Alle
Patienten unterzeichneten ein informiertes Einverständnis mit
der ärztlichen
Untersuchung, das in der Klinik für Nuklearmedizin des Fakultätskrankenhauses
(FN) Olomouc hinterlegt ist.
Belastungstest:
Alle
Probanden unterzogen sich einem Fahrradergometer-Belastungstest.
Dieser wurde nach den Empfehlungen der Tschechischen Kardiologischen
Gesellschaft durchgeführt.
Die Eingangsbelastung betrug 1 Minute bei 50 W, anschließend wurde
die Belastung jeweils nach einer Minute um 10 W erhöht, bis
sich das subjektive Gefühl
der Erschöpfung
einstellte.
Nach
dem Belastungstest fand innerhalb von 30 Tagen eine Perfusionsszintigraphie
des Myokards mittels Single-Photon-Emmissionscomputertomographie
(SPECT) statt.
Myokard-SPECT:
Belastungstests:
Die physische Belastung wurde auf einem Fahrradergometer herbeigeführt, das
Radiopharmakum wurde bei Überschreiten
von 85% der maximalen aeroben Kapazität appliziert oder wenn die Belastung
durch eine ausgeprägtere
Angina pectoris, ischämische
Veränderungen
im EKG, schwerwiegendere Arythmien, ein Absinken des Blutdrucks
usw. begrenzt wurde. Bei dem angewendeten Ansatz wurde von den geltenden
internationalen und tschechischen Empfehlungen ausgegangen [10,
11].
Gated
SPECT: Die Gated-SPECT-Untersuchung (synchronisierte Aufnahme von
EKG und SPECT) erfolgte 15 min nach der Applikation von 740 MBq
99mTc-MIBI auf dem Höhepunkt
der Belastung, bei Befund einer Perfusionsheterogenität ergänzt durch
eine Untersuchung in Ruhe am nächsten
Tag (Gated SPECT 1 Stunde nach der Applikation von 99mTc-MIBI).
Die Aufnahme der Daten per 8-Frame-Gating erfolgte mit der Doppelkopf-Szintilationskamera
e.cam von Siemens (Siemens Medical Solutions, Erlangen, Deutschland), ausgestattet
mit parallelen LEHR-Kollimatoren (Kollimatoren mit geringem Energiebedarf
und hoher Auflösung),
Rotationswinkel 180°,
insgesamt 64 Projektionen mit einer Matrix von 64 × 64 von
45° Schrägprojektion vorn
rechts bis 45° Schrägprojektion
hinten links.
Auswertung
des SPECT-Befunds: Die tomographischen Schnitte der Myokardperfusion
wurden optisch ausgewertet und entweder als Normalbefund oder eine
durch Perfusionsdefekte bedingte Belastung klassifiziert. Die quantitative
Analyse der Perfusion erfolgte anhand von Polarmaps.
Von
den Parametern wurde der summarische Stress-Score (SSS, Summed Stress
Score) ausgewertet, der den Umfang des Perfusionsdefekts nach Belastung
repräsentiert.
Je höher
der SSS-Wert ist, desto schlechter ist die Patientenprognose, und
zwar unabhängig
davon, ob der Defekt manifest (Narbe) oder reversibel (Ischämie) ist
[15]. Werte von < 3
gelten als normal, Werte zwischen 4 und 8 zeugen von einem mäßigen Defekt,
Werte zwischen 9 und 13 von einem mittelschweren Defekt und Werte
von > 13 von einem
schweren Defekt.
Des
Weiteren wurde der summarische Differenzscore (SDS, Summed Difference
Score) ausgewertet, welcher definiert ist als Differenz zwischen
dem Belastungsscore und dem Ruhescore. Hierbei geht es um eine Art "Summe" der Ischämie; die
Werte gelten bei einem SDS von > 2
als positiv.
Eine
weiterer Kennwert, die in die Bewertung einging, war der Prozentsatz
der Defektfläche
der linken Kammer (LK); Werte von < 10%
gelten als kleiner Defekt, Werte zwischen 10 und 20% als mittlerer
Defekt und Werte von > 20%
als großer
Defekt (dies hängt
selbstverständlich
davon ab, ob ein oder mehr Einzugsgebiete der Gefäße betroffen
sind).
Ebenso
wurde als Bewertungskennwerte das Bestehen einer transienten ischämischen
Dilatation (TID, Transient Ischemic Dilatation) herangezogen, das
bei Werten von > 1,17
als positiv gilt. Gleichzeitig wurde die Ejektionsfraktion der linken
Kammer auf dem Höhepunkt
der Belastung und nach Beruhigung (bei der Gated-SPECT-Untersuchung) ausgewertet.
Sank die Ejektionsfraktion der linken Kammer nach der Belastung um
mehr als 5%, wurde der Befund als transiente Dilatation der linken
Kammer nach Belastung gewertet, welche ein Symptom für eine Betäubung der
linken Kammer nach Belastung darstellt [15-18, 20-23].
Ermittelt
wurden die angegebenen Daten mit 4D-MSPECT, einer Software zur automatischen
Quantifizierung (University of Michigan, Ann Arbor, USA) [16]. Die
SPECT-Ergebnisse wurden als maßgebend
für die ICHS-Diagnostik
bewertet. [15, 16, 21, 22]
Definition der latenten
Myokardischämie
Für den Bedarf
der vorliegenden Arbeit wurde die latente Myokardischämie als
Positivität
der Myokard-SPECT zum Nachweis einer Ischämie (SSS > 3) bei negativem EKG-Befund und Abwesenheit
von ICHS-Symptomen definiert [15].
Laboruntersuchung und
Blutentnahmetechnik:
Zur
Untersuchung des biologischen Materials wurden Venenproben von nichtgerinnendem
Blut (zur Serumgewinnung) und Blut mit einer Lösung des Salzes der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTE)
als Antikoagulans (zur Untersuchung des Blutbildes und Plasmagewinnung)
verwendet. Sämtliche
Parameter außer MLC-1
wurden innerhalb von 120 min ab der Blutentnahme ermittelt.
Bei
allen Probanden wurden folgende Laboruntersuchungen mit Venenblut
durchgeführt:
- a) unmittelbar nach dem Belastungstest: C-reaktives
Protein (CRP – Analysegerät Advia
1650, Immunoturbidimetrie, Hersteller des Systems Diasys), Hämoglobin
(Hb, Analysegerät
MaxM Coulter, Hersteller des Systems Beckman Coulter), Hämatokrit
(Htk, Analysegerät
MaxM Coulter, Hersteller des Systems Beckman Coulter), Laktat (Analysegerät Advia
1650, enzymatische Bestimmung, Hersteller des Systems Biovendor),
MLC-1 (ELISA-Linie Marc + Max, ELISA, Hersteller des Systems Biovendor),
cTnI (Immulite Turbo, LEIA, Hersteller des Systems DPC); für den Bedarf
der Studie (Ausschlusskriterien) wurden zudem das Kreatinin (Analysegerät Advia
1650, enzymatische Bestimmung, Hersteller des Systems Biovendor)
und die Leukozytenzahl (Analysegerät MaxM Coulter, Hersteller
des Systems Beckman Coulter) ermittelt
- b) bei Erreichen des subjektiven Maximums: Hb, Htk, Laktat,
MLC-1
- c) 30 min nach Belastungsende: MLC-1
- d) 60 min nach Belastungsende: MLC-1
Bei
allen Probanden wurden die Blutvolumenänderungen berücksichtigt
(Schätzung
nach der Htk-, Hb-Dynamik mit Berechnung der metabolischen MLC-1-Änderungen)
[12].
Laborbestimmung der MLC-1
Zur
Bestimmung der MLC-1 wurde peripheres Venenblut entnommen, wobei
das Serum verwendet wurde. Die Blutprobe wurde nach der Entnahme
60 min bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Anschließend wurde sie zentrifugiert
(10 min bei 1100 g und 4°C)
und bei einer Temperatur von -80°C
eingefroren.
Die
MLC-1-Bestimmung fand innerhalb von 3 Monaten ab der Entnahme des
Materials, und zwar nach dessen Temperierung auf Zimmertemperatur
(25°C) statt.
Alle Proben wurden zweimal untersucht.
Es
wurde die ventrikuläre
Form der MLC-1 (vMLC-1) mittels ELISA-Technik (Biovendor GmbH) im Sandwichaufbau
bestimmt. Zur Bestimmung wurde eine Kombination aus monoklonalen
Mäuse-
und Hühnerantikörpern verwendet.
Analytische Grundmerkmale der Methoden: Variationskoeffizient (CV)
im Serum < 5%, CV
zwischen Seren < 8%
im Kalibrierspektrum, analytische Sensitivität 0,3 mg/l, funktionelle Sensitivität 0,5 mg/l,
Messtoleranz 0,3-40 mg/l. Analytische Spezifizität: 10% Kreuzreaktivität gegenüber MLC-2
und 20% gegenüber
den MLC der Skelettmuskulatur (Beipackzettel des Herstellers).
Zur
Bewertung der MLC-1-Konzentrationen wurde die gesamte Gruppe nach
ihren SPECT-Ergebnissen in Untergruppen eingeteilt (Personen mit
Symptomen einer Myokardischämie
bei der SPECT gegenüber Personen
ohne Ischämiesymptome).
Die Gruppe der Patienten mit positivem SPECT-Befund (SSS > 3) wurde aus den gleichen
Gründen
noch einmal in Patienten mit einer manifesten und Patienten mit
einer reversiblen Ischämieform
unterteilt [15, 17].
Die
Unterteilung in die genannten Untergruppen wurde auch bei der Erstellung
der ROC-Kurve zur diagnostischen Wirksamkeit der MLC-1-Bestimmung
unter dem Gesichtspunkt des Auftretens einer Myokardischämie bei
Belastung herangezogen.
Statistische Datenverarbeitung
Die
Daten wurden mit der Software Medcalc (Medcalc, Mariakerke, Belgien)
verarbeitet.
Dabei
wurden die MLC-1-Werte zwischen den beiden Untergruppen mit dem
Verfahren der Streuanalyse (ANOVA, Kruskal-Wallis nach der Art der
Verteilung) und mittels ROC-Kurve verglichen.
Die
MLC-1-Konzentration und weitere Größen wurden hinsichtlich der
Datenverteilung mit dem Spearmann-Korrelationskoeffizient korreliert.
Die
kategorialen Daten wurden per χ2-Test verglichen. Als statistisch signifikant
galt ein Wert von p < 0,05.
Die
Normalität
wurde ebenfalls mitels χ2-Test bewertet.
Die
Unterschiede zwischen den MLC-I-Werten bei beiden Geschlechtern
wurden mit einer Streuanalyse (Kruskal-Wallis hinsichtlich der Art
der Verteilung) geprüft.
Die
Relevanz der MLC-1-Änderungen
im Testverlauf (MLC1 1-4) wurde mit einem paarigen nichtparametrischen
Wilcoxon-Test (hinsichtlich der Art der Datenverteilung) geprüft.
Ergebnisse
In
Tabelle 4 sind die grundlegenden statistischen Eigenschaften der
gesamten Gruppe angegeben. Wie aus dieser Tabelle hervorgeht, weist
die Mehrzahl der Parameter eine nicht normale Verteilung auf. Tabelle
4: Grundlegende Merkmale der Untersuchungsgruppe, 176 Probanden
- DF – Freiheitsgrad; χ2-Chi-Quadrat; X-Durchschnitt; SD-Standardabweichung;
Hb-Hämoglobin
- Kennwerte X 1-4 – Probenahme
vor, bei Maximalbelastung, nach 30 und 60 Minuten Ruhe; Htk – Hämatokrit
- DeltaPV – Änderung
Plasmavolumen; SSS – summarischer
Stress-Score; SDS-summarischer
Diff-Score;
- StressEF – Ejektionsfraktion
linke Kammer bei Belast.; RestEF-Ejektionsfraktion linke Kammer
nach Beruhig.
- TID – transiente
ischämische
Dilatation; Defektfläche
LK – Defektfläche linke
Kammer in %; ICHS – ischämische Herzkrankheit;
MLC 1-2 erwartet – der
auf Grund der festgestellten Plasmavolumenänderungen erwartete MLC-1-Wert
bei Maximalbelastung Die Auswertung zum Auftreten einer Myokardischämie nach
der SPECT unterschied sich nicht wesentlich von der Auswertung zum
Auftreten einer ICHS nach dem Ergometer-Belastungstest (χ2 = 2,3; DF = 1; p = 0,13).
Bei
der Aufteilung der Gruppe in zwei Untergruppen nach den bei der
SPECT ermittelten Ergebnissen (Auftreten bzw. Nichtauftreten von
Symptomen einer Myokardischämie
bei der SPECT) wurden 37 Patienten (27%) als Personen mit Myokardischämie eingeordnet;
bei 139 Individuen (63%) wurden in der SPECT keine typischen Symptome
einer Myokardischämie
festgestellt.
Beide
Untergruppen unterschieden sich signifikant hinsichtlich der MLC-1-Konzentrationen in
allen 4 Blutproben (Mediane in mg/l; 3,1 gegenüber 0,5 bei Blutprobe 1; 3,1
gegenüber
1,1 bei Blutprobe 2; 2,9 gegenüber
0,5 bei Blutprobe 3; 3,4 gegenüber
0,5 bei Blutprobe 4) sowie bezüglich
ihrer Geschlechterverteilung (Männer
wiesen häufiger
eine positive SPECT auf; χ2 = 13,3; DF = 1; p = 0,0003).
Das
Alter der Patienten in den beiden Untergruppen unterschied sich
nicht signifikant. Ebenso wenig unterschieden sich die beiden Grappen
hinsichtlich des Laktatwertes vor und nach Belastung, des CRP und der
beim Belastungstest erreichten Leistung.
Die
Patienten mit negativer SPECT erreichten statistisch signifikant
höhere
Werte bei der maximalen Pulsfrequenz und wiesen höhere Ejektionsfraktionswerte
der linken Herzkammer bei maximaler Belastung auf (Tabelle 5, Tabelle
6).
Tabelle
5: Unterschiede in den gemessenen Kennwerten nach dem Auftreten
von Symptomen einer ischämischen
Herzkrankheit (Myokardischämie)
bei der SPECT
- DF – Freiheitsgrad; χ2 – Chi-Quadrat;
X – Durchschnitt;
SD – Standardabweichung;
Hb – Hämoglobin
- Kennwert X 1-4 – Probenahme
vor, bei Maximalbelastung, nach 30 und 60 Minuten Ruhe; Htk – Hämatokrit
- DeltaPV – Änderung
Plasmavolumen; SSS – summarischer
Stress-Score; SDS – summarischer
Diff.-Score;
- StressEF – Ejektionsfraktion
linke Kammer bei Belast.; RestEF – Ejektionsfraktion linke Kammer
nach Beruhig.
- TID – transiente
ischämische
Dilatation; Defektfläche
LK – Defektfläche linke
Kammer in %; ICHS – ischämische Herzkrankheit;
MLC1-2 erwartet – der
auf Grund der festgestellten Plasmavolumenänderungen erwartete MLC-1-Wert
bei Maximalbelastung
Legende zu Tabelle 5:
- Ukazatel – Kennwert;
MLC 1-2 očekávaná – MLC 1-2
erwartet; Laktát – Laktat;
Plocha defektu – Defektfläche; Výkon – Leistung;
Vĕk – Alter;
Pohlaví – Geschlecht;
ICHS ANO – ICHS
JA; ICHS NE – ICHS
NEIN; Medián – Median;
Normalita – Normalität; Ne – nein;
Ano – ja;
... mužů a ... žen – ... Männer und
... Frauen
Tabelle
6: Unterschiede in den gemessenen Kennwerten nach dem Auftreten
von Symptomen einer ischämischen
Herzkrankheit (Myokardischämie)
bei der SPECT
Hinsichtlich
der Kennwerte SSS, SDS, TID und betroffene Fläche der linken Kammer, die
zu den Auswertungskriterien der SPECT gehören, wird an dieser Stelle
kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Untergruppen
erwähnt.
Tabelle 5, Tabelle 6
Die
MLC-I-Werte der beiden Geschlechter unterschieden sich nicht wesentlich
(p = 0,81, DF = 1).
Bei
der Suche nach signifikanten Änderungen
in der Dynamik der Parameter bei den definierten Blutentnahmen waren
keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen MLC-1-Konzentrationen
bei Belastung konstatierbar (MLCI-1/MLC1-2: p = 0,68, Z = 0,3; MLC1-2/MLC1-3:
p = 0,27, Z = –1,1;
MLCI-3/MLCI-4: p = 0,32, Z = –0,99,
MLCI-1/MLC1-4: p = 0,32; Z = –0,99;
MLC1-1/MLCI-3: p = 0,14, Z = –1,5,
MLC1-2/MLCI-4: p
= 0,56, Z = –0,57).
Bei
der detaillierteren Einteilung der positiven SPECT-Befunde in solche
mit einem manifesten und solche mit einem reversiblen Defekt wurde
festgestellt, dass Patienten mit einem reversiblen Defekt bei der SPECT
einen wesentlich höheren
basalen MLC-1-Wert
aufweisen; die MLC-1 von Personen mit einem manifesten Defekt dagegen
unterscheiden sich nicht von Patienten mit Normalbefund bei der
SPECT (Tabelle 7). Tabelle
7: MLC-1-Werte vor Belastungsbeginn bei Patienten nach dem Auftreten
eines manifesten oder reversiblen Defekts bei der SPECT
- X – Durchschnitt
SD – Standardabweichung
Tabelle
8: Unterschiede in den MLC-1-Werten vor Belastungsbeginn nach dem
Auftreten von Symptomen eines manifesten oder reversiblen Defekts
bei der SPECT
Bei
der Suche nach Abhängigkeiten
wurden signifikante positive Korrelationen (Spearman) zwischen der
MLC-1 vor Beginn des Belastungstests und dem SSS-Wert (c = 0,27;
p = 0,01), dem SDS-Wert (c = 0,26; p = 0,02) sowie der betroffenen
Fläche
der linken Kammer (c = 0,27; p = 0,01) ermittelt; gleichzeitig wurde
eine negative Abhängigkeit
zwischen der MLC-1 und dem Wert der maximalen Pulsfrequenz (–0,23, p
= 0,01) gefunden.
Zudem
wurden sehr enge Abhängigkeiten
zwischen der MLC-1 bei Belastung (c = 0,92-0,97; p < 0,0001) ermittelt. Unter basalen Bedingungen
wurden auch bei Belastung keine weiteren signifikanten Abhängigkeiten
zwischen der MLC-1 und anderen Messkennwerten festgestellt.
In
Anbetracht der unwesentlichen Differenzen zwischen den bei den wiederholten
Blutentnahmen ermittelten MLC-1 wurde die diagnostische Wirksamkeit
der MLC-1-Bestimmung
unter basalen Bedingungen für die
Diagnose einer per SPECT festgestellten Myokardischämie geprüft.
Aus
dem nachstehenden Diagramm gehen 64% Sensitivität und 88% Spezifizität der MLC-1-Bestimmung
für die
Diagnose einer bestehenden Myokardischämie bei einem MLC-1-Wert von > 2,2 mg/l hervor.
Die
Fläche
unter der ROC-Kurve (AUC) betrug 0,81 bei 95% Konfidenzintervall
0,72-0,88. Das positive Testergebnis
(LR+) lautete 5,9; der positive Prädiktorwert (PPV+) bei der untersuchten
Gruppe (mit einer Prävalenz
von 27%) betrug 68% und der negative Prädiktorwert (NPV-) 87% (4, 5).
Bedeutung
Die
Diagnostik der Myokardischämie
(ischämischen
Herzkrankheit) stützt
sich auf eine Kombination aus Ergebnissen einer Reihe von Untersuchungen.
Einen goldenen Standard für
diese Diagnostik gibt es derzeit nicht.
Als
eventuelles diagnostisches Verfahren der Wahl (vor allem für die Diagnostik
der latenten Myokardischämie)
kann die Untersuchung mittels Single-Photon-Emmissionscomputertomographie (SPECT)
angesehen werden [10, 11].
Jüngere Arbeiten
bestätigen
die steigende Zahl von SPECT zur Myokardperfusion und ihre Bedeutung sowohl
in der Diagnostik der Myokardischämie als auch für die Risikostratifizierung
und Planung einer eventuellen Therapie [15, 20].
Patienten
mit einer normalen Myokardperfusion nach Belastung besitzen vom
Standpunkt kardiovaskulärer
Komplikationen aus betrachtet durchaus eine positive Prognose und
können
je nachdem, ob bei ihnen eine transiente ischämische Dilatation festgestellt
wird, weiter klassifiziert werden [14, 15].
Eine
relativ gute Prognose haben auch Individuen mit einer gemäßigten Ischämie (sofern
es sich um eine gemäßigte Abnormität der Perfusion
handelt und keine Symptome einer postischämischen Myokard-Betäubung auftreten),
welche durch SSS-Werte
von 4-8, einen Defekt von < 10%
der Fläche
der linken Herzkammer, einen TID-Wert
von < 1,17 und
keine Abnahme der Ejektionsfraktion der linken Kammer bei Maximalbelastung
definiert ist; sind diese Bedingungen erfüllt, kann eine medikamentöse Therapie
bevorzugt werden.
Bei
SSS-Werten von > 9
hingegen müsste
ein invasiver Eingriff präferiert
werden, ebenso wie beispielsweise in dem Fall, dass bei einem SSS-Wert
von 4-8 Symptome einer Myokard-Betäubung (TID > 1,17 oder Abnahme der Ejektionsfraktion
der linken Kammer bei Maximalbelastung) vorliegen [13-23].
Obwohl
die Zahl der Untersuchungen mittels Myokard-SPECT in der Vergangenheit
gestiegen ist und sich die Interpretation der Ergebnisse unter dem
Gesichtspunkt der Myokardischämie
(vor allem ihrer latenten Form) und des kardiovaskulären Risikos
verbessert hat, handelt es sich hier doch um eine technisch und
finanziell anspruchsvolle Untersuchung, die das Risiko für den Patienten
zudem noch erhöht
(Belastungstest). Deshalb wird weiterhin nach anderen nichtinvasiven
Verfahren gesucht, die eventuell für die Diagnostik der Myokardischämie in Frage
kommen.
Eine
dieser Möglichkeiten
besteht in der Untersuchung bestimmter Proteine, deren Expression
sich unter dem Einfluss der Herzbelastung ändert. In diesem Kontext wurde
in der Literatur auch MLC-1 erwähnt.
Myosin
ist ein kontraktiles Strukturprotein (Heteropolymer), das aus zwei
schweren Aminosäureketten (relatives
Molekulargewicht etwa 200 kDa) und zwei Paaren leichter Aminosäureketten
besteht. Die Paare leichter Aminosäureketten heißen MLC-1
(rel. Mol.-gew. 25 kDa) und MLC-2 (rel. Mol.-gew. 19 kDa).
Die
MLC-1 wird auch als essentielle Kette bezeichnet, und obwohl ihre
vollständige
Funktion noch nicht bekannt ist, scheint sie zumindest die schweren
Ketten des Myosins zu stabilisieren.
Im
Organismus findet man verschiedene MLC-Typen (z. B. die MLC der
Skelettmuskulatur – sMLC, die
MLC der Herzkammern – vMLC,
die MLC der Herzvorhöfe – aMLC usw.).
Wird die Integrität
der Kardiomyozyten gestört
(z. B. beim Auftreten einer Myokardnekrose), kommt es zur Abgabe
von vMLC-1 aus dem Myokard in den Kreislauf der MLC-Anstieg lässt sich
bereits 3-6 Stunden nach diesem Ereignis feststellen, wobei der
Höchstwert
zwischen dem 1. und 5. Tag nach dem Eintreten der Nekrose erreicht
wird (die schweren Ketten wurden erst zwischen dem 2. und 10. Tag
nach dem Eintreten der Nekrose gefunden, mit dem Maximum am 5.-6.
Tag). Der MLC-Anstieg im Kreislauf hält etwa eine Woche an. Da die
MLC von den Nieren ausgeschieden wird, ist bei Individuen mit gestörter Nierenfunktion
ein höherer
MLC-Wert zu finden und die Dynamik der Änderungen nach einer Myokardnekrose
gestört.
Der MLC-Gehalt im Kreislauf sinkt nicht nur dank des Nierenstoffwechsels,
sondern auch auf Grund des Stoffwechsels in den Myofilamenten des
Infarktherdes. Es handelt sich hierum einen Marker, der unter dem
Aspekt der Myokardnekrose als relativ empfindlich und spezifisch
gilt (MLC-1 tritt vorwiegend im Herzen auf, und zwar als vMLC-1).
An
dieser Stelle muss auch angeführt
werden, dass MLC-1 zwar vorwiegend im Kammermyokard auftritt, aber
nicht myokardspezifisch ist (Vorkommen zum Beispiel in der Skelettmuskulatur).
Ein
MLC-1-Anstieg wurde auch in anderen Fällen einer Myokardbelastung
neben der ischämischen Nekrose
(Myokarditis) beschrieben [1, 2, 4, 7].
Aus
den in einigen jüngeren
Arbeiten vorgestellten Informationen geht hervor, dass sich mit
einem MLC-1-Anstieg nicht nur die Diagnose bestätigen, sondern je nach der
MLC-1-Konzentration
auch die Größe des Nekroseherdes
sowie die kurz- und langfristige Prognose des Patienten abschätzen lässt (sogar
mit einer höheren
Validität
als bei der Troponinkonzentration) [3, 6, 7].
In
der Vergangenheit erschienen Informationen darüber, dass eine MLC-1-Bestimmung
von hoher diagnostischer Wirksamkeit für die Einschätzung minimaler
Myokardschädigungen
allgemein sein könnte.
Für einen
Nachteil hält
man jedoch bei einigen Arten diagnostischer Systeme deren geringe
Sensitivität
für das Myokard
[2, 3, 6].
Ebenso
gab es in den vergangenen Jahren Arbeiten, die einen MLC-1-Anstieg
bei Patienten mit Herzdysfunktionen (NYHA III) beschrieben; bei
diesen Kranken ließ sich
anhand der MLC-1-Konzentration die Mortalität prognostizieren. Einer der
möglichen
Gründe
für den
MLC-1-Anstieg im Kreislauf dieser Patienten könnte eine Degeneration der
Myofibrillen unter Abgabe ihrer Komponenten an den Kreislauf sein,
die die Herzdysfunktion häufig
begleitet. Diese strukturellen Veränderungen können zudem die Dysfunktion
der Herzkammern mit einem Ansteigen des Fülldrucks noch beschleunigen
[2, 4, 5, 7].
Ein
weiterer möglicher
Grund könnte
beispielsweise eine übermäßige Genexpression
für MLC-1
sein, die einen übermäßigen Stress
(z. B. durch Stimulation usw.) der Kardiomyozyten bewirken würde. Diese
Erscheinung könnte
zu einer übermäßigen Synthese
des Proteins in den Myokardzellen mit dessen Übertritt in den Kreislauf (z.
B. über
eine leicht gestörte
Zellmembran) führen.
Dabei bleibt natürlich
in gewissem Maße die
Frage bestehen, ob dieser Übertritt
mit einer Störung
der Herzmyozytenstruktur verbunden ist (ob eine Störung der
Struktur überhaupt
eine Bedingung ist).
Es
ist möglich,
dass die bei Patienten mit einem MLC-1-Anstieg beobachtete höhere Mortalität eine Belastung
der Myozyten, eine gestörte
Integrität
der Myozytenmembran oder eine gestörte Struktur der Kardiomyozyten
wiederspiegeln könnte,
die von einem Entweichen intrazellularer Proteine in den Kreislauf
begleitet wird; relevant ist vor allem die Information, dass diese
Erscheinung bei Patienten gefunden wird, die klinisch stabil sind
[2].
Im
Zusammenhang mit dieser Hypothese bieten sich Informationen an,
die aus einigen jüngeren
Arbeiten zur Beschreibung der Bedeutung der MLC-1 im Rahmen der
Apoptose gewonnen wurden. Der programmierte Zelltod umfasst die
Aktivierung der Prothease (Kaspase), die zu einer Spaltung der Vitalproteine
des Cytoskeletts führt.
Es wurde beschrieben, dass man bei versagenden Myozyten eine Aktivierung
der Kaspase-3 (einhergehend
mit einer Verringerung der kontraktilen Leistung) vorfindet. Dabei
spaltet die aktivierte Kaspase-3 vMLC-1, wodurch es zu einer Unterbrechung
der biologisch wirksamen vMLC-1 kommt, was mit einer Verringerung
der kontraktilen Leistung des Myokards verbunden ist. Es ist möglich, dass
die direkte Spaltung der vMLC-1 durch die Kaspase-3 zu einer Verringerung
der Myokardfunktion durch Veränderung
der Kreuzbrücken
zwischen den Aktin- und Myosin-Molekülen führen kann.
Es
ist also wahrscheinlich, dass eine Aktivierung des apoptotischen
Weges vor dem Zelltod zu einer kontraktilen Dysfunktion führen kann
[4, 6].
Im
Zusammenhang mit den völlig
unerwarteten Ergebnissen, die im erfindungsgemäßen Kontext erzielt wurden,
kann man über
einen möglichen
Einfluss von "übermäßigem Stress" der Kardiomyozyten
auf ein Ansteigen des MLC-1-Wertes (und eventuell auch der Expression)
bei Patienten mit Myokardischämie
(und ihrer latenten Form) diskutieren. Der Befund höherer MLC-1-Werte
bei Patienten mit reversibler Myokardischämie bestätigt diese Hypothese.
Ebenso
ist fast sicher, dass in der Pathogenese einer ICHS die Apoptose
eine wichtige Rolle spielt, deren Bedeutung im Kontext der MLC-1
oben ausgeführt
wurde. Vollkommen überraschend
war die Feststellung hinsichtlich der hohen diagnostischen Wirksamkeit
einer einmaligen MLC-1-Bestimmung für die Diagnostik einer latenten
Myokardischämie.
Die erfindungsgemäße Feststellung
bedeutet, dass man in der Lage ist, bei Testpersonen mit hohem Risiko
mit einer hohen diagnostischen Wirksamkeit das Bestehen einer Myokardischämie abzuschätzen.
Als
Schlussfolgerung kann gesagt werden, dass sich mit Hilfe einer einmaligen
MLC-1-Bestimmung hinreichend
effektiv das Bestehen einer latenten Myokardischämie diagnostizieren und so
das Ausmaß ihres kardiovaskulären Risikos
einschätzen
lässt.
Ausführungsbeispiel 3
MLC-1 prospektive Screening-Studie
Es
wurden 1000 Männer
im Alter von 55-75 Jahren in einer epidemiologischen Studie untersucht.
Die Diagnose einer ischämischen
Herzerkrankung oder einer Hypertonie wurde im nachhinein durch Auswertung eines
Fragebogens festgestellt, der durch den jeweiligen Hausarzt des
Probanden ausgefüllt
wurde.
Ergebnis:
Probanden
mit einer ischämischen
Herzkrankheit (IHK) oder Hypertonie (HN) wiesen erhöhte MLC-1 Werte
auf (3,8 pg/ml gegenüber
0 pg/ml). Die Werte gesunder Personen unterschieden sich von solchen
mit IHK/HN mit einer Sensitivität
von 67% und Spezifität
von 84% (+PPV 93%; LR + 4,1; AUC 0,77; Abbildungen 6 und 7).
Ausführunsgbeispiel 4
Bestimmung von Myosin
Light Chain-1
Es
wurden 252 Probanden untersucht, davon 240 asymptomatische Probanden
mit hohem Risiko einer ischämischen
Herzkrankheit (Framingham oder Score Algorithmus) oder Probanden
mit einer IHK in der Anamnese, und 12 gesunde Freiwillige. Keine
von den untersuchten Personen wies Anzeichen eines akuten koronaren
Syndroms oder eines Herzversagens (Anamnese, Rtg des Herzens und
der Lunge, EKG, NT-proBNP und Troponin I-Spiegel) auf.
An
den Probanden wurden ergometrische Untersuchungen mit EKG-Aufnahme
(Belastungs-EKG) durchgeführt
(50 W mit einer Steigerung von 10 W pro Minute bis zur Erschöpfung),
wobei 15 Minuten nach Erreichen von 85% der aeroben Kapazität oder nach
Auftreten von ischämischer
Symptomatik (angina pectoris, EKG) 740 MBq 99Tc-MIBI intravenös verabreicht und eine SPECT
Untersuchung durchgeführt
wurde.
38
Probanden hatten ein Durchblutungsdefekt, festgestellt mit Hilfe
von sowohl SPECT als auch Belastungs-EKG. Die SPECT-Analyse ergab,
dass es sich in 14 Fällen
um einen fixen und in 27 Fällen
um einen vorübergehenden
Durchblutungsdefekt handelte.
Ergebnis:
Die basale MLC-1 Bestimmung kann zur Vorhersage einer latenten Herzischämie verwendet
werden, wobei negative prädiktive
Werte von 88% (fixe und vorrübergehende
Durchblutungsdefekte) und 92% (vorübergehende Durchblutungsdefekte)
erreicht wurden (Tabelle 9, 8A, 8B, 9A und 9B).
Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten
Merkmale der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung
der Erfindung in ihren verschiedene Ausgestaltungen von Bedeutung
sein.
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Legenden zu den Abbildungen:
1:
Die ROC-Analyse ergab für
Werte über "0" eine diagnostische Sensitivität von 91%
bei einer Spezifität
von 86%.
2:
Die Verteilung der MLC 1 Werte bei den Patienten mit nachgewiesener
Herzschädigung
verglichen mit den negativ befundenen Patienten.
3:
Eine repräsentative
Standardkurve, die mit Hilfe des MLC 1 erstellt wurde, ist in 3 dargestellt.
4:
Kennlinie des Abnahmeplans (ROC-Kurve) für MLC-1 vor Belastungsbeginn
unter dem Gesichtspunkt des Auftretens einer Myokardischämie bei
der SPECT.
5:
Grafischer Vergleich der MLC-1-Werte in Ruhe vor Belastungsbeginn
(angegeben ist der Median bei 95% Konfidenzintervall) bei Patienten
nach dem Auftreten einer Moykardischämie bei der SPECT.
6:
Die ROC-Analyse ergab für
Werte über „0" eine diagnostische
Sensitivität
von 67% bei einer Spezifität
von 84%.
7:
Die Verteilung der MLC-1 Werte bei den Patienten mit diagnostizierter
ischämischer
Herzerkrankung oder Hypertonie verglichen mit negativ befundenen
Patienten.
Tabelle 9:
Der
einzige Parameter, der unterschiedliche Werte bei negativ und positiv
befundenen Probanden aufwies, war MLC-1.
8A und 8B:
Bei einem optimierten cut-off Wert für MLC-1 von 2,2 ng/l wurde
eine Spezifität von
88% und eine Sensitivität
von 61% erreicht. Die Fläche
unter der ROC-Kurve betrug 0,79 (95%, CI 0,7-0,87).
9A und 9B:
Bei Probanden mit einem vorübergehenden
Durchblutungsdefekt und einem optimierten cut-off Wert für MLC-1
von 2,8 ng/ml wurde eine Sensitivität von 46% und eine Spezifität von 92% erreicht,
wobei der negative prädiktive
Wert für
die Diagnose der vorübergehenden
Myokard-Durchblutungsstörung
92% war. Der AUC Wert betrug 0,76 (95% CI 0,61-0,81).