DE102005014752A1

DE102005014752A1 - Entzündungsmarker und Kombinationen davon als biochemische Marker bei kardiovaskulären Erkrankungen

Info

Publication number: DE102005014752A1
Application number: DE200510014752
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Blankenberg; Hans J. Prof.Dr. Rupprecht; Christoph Dr. Bickel
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2006-11-23

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Marker der vaskulären Entzündung und Kombinationen davon als Werkzeuge zur Diagnose und deren Prognose in Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen. Die Marker dienen weiterhin als Werkzeuge, die die Auswahl von Wirkstoffen zur Behandlung solcher Erkrankungen erleichtern, und schließlich als Ansatzpunkt für die Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen. Weiterhin betrifft die Erfindung die Erstellung eines individuellen Risikoprofils von negativen Vorgängen, die mit dem Fortschreiten der Arteriosklerose zusammenhängen.

Description

Die Erfindung betrifft neue Marker der vaskulären Entzündung und Kombinationen davon als Werkzeuge zur Diagnose und deren Prognose in Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen. Die Marker dienen weiterhin als Werkzeuge, die die Auswahl von Wirkstoffen zur Behandlung solcher Erkrankungen erleichtern und schließlich als Ansatzpunkt für die Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen. Weiterhin betrifft die Erfindung die Erstellung eines individuellen Risikoprofils von negativen Vorgängen, die mit dem Fortschreiten der Arteriosklerose zusammenhängen.

Hintergrund der Erfindung

Kürzliche Fortschritte in der Grundlagenforschung haben eine fundamentale Rolle für die Entzündung bei der Vermittlung aller Phasen der Arteriosklerose, von ihrem Beginn über Fortschreiten und, letztendlich, den thrombotischen Komplikationen von arteriosklerotischen Läsionen etabliert (Libby P, Ridker PM, Maseri A. Entzündung und atherosclerosis. Circulation 2002; 105 (9): 1135-43, Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease. N Engl J Med 1999; 340 (2): 115-26, Davies MJ, Thomas AC. Plaque fissuring-the cause of akute myocardial infarction, sudden ischaemic death, and crescendo angina. Br Heart J 1985; 53 (4): 363-73, Libby P. Molecular bases of the akute coronary syndromes. Circulation 1995; 91 (11): 2844-50,).

Die aus dem Zusammenhang zwischen Entzündung und Arteriosklerose erhaltenen Ergebnisse bilden die Rationale zur Verwendung von zirkulierenden Entzündungsmarkern als potentielle prädiktive Instrumente bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen. In der Tat gehen erhöhte Spiegel von Entzündungsmarkern, wie zum Beispiel hoch sensitives C-reaktives Protein (hsCRP), Serum Amyloid A, und Interleukin-6 (IL-6) nicht nur allgemein mit akuten Koronarsyndromen einher (Berk BC, Weintraub WS, Alexander RW. Elevation of C-reactive protein in "active" coronary artery disease. Am J Cordial 1990; 65 (3) : 168-72„ Biasucci LM, Vitelli A, Liuzzo G, et al. Elevated levels of interleukin-6 in unstable angina. Circulation 1996; 94 (5) : 874-7,), sondern – was wichtiger ist – können auch eine Aussage über den klinischen Ausgang von Patienten mit akuten Koronarsyndromen vorhersagen (Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR, et al. The prognostic value of C-reactive protein and serum amyloid a protein in severe unstable angina. N Engl J Med 1994; 331 (7) : 417-24, Biasucci LM, Liuzzo G, Grillo RL, et al. Elevated levels of C-reactive protein at discharge in patients with unstable angina predict recurrent instability. Circulation 1999; 99 (7): 855-60, Toss H, Lindahl B, Siegbahn A, Wallentin L. Prognostic influence of increased fibrinogen and C-reactive protein levels in unstable coronary artery disease. FRISC Study Group. Fragmin during Instability in Coronary Artery Disease. Circulation 1997; 96 (12) : 4204-10,).

Obwohl das "klassische" akute Phase Protein hsCRP als der am meisten versprechende Biomarker für klinische Zwecke angesehen wird, besteht eine substantielle Heterogenität im Hinblick auf die Prävalenz von erhöhten hsCRP Spiegeln in Patienten mit akuten Koronarsyndromen (Biasucci LM, Liuzzo G, Colizzi C, Rizzello V. Clinical use of C-reactive protein for the prognostic stratification of patients with ischemic heart disease. Ital Heart J 2001; 2 (3) : 164-71,). So zeigen mehr als 30 % der Patienten mit schwerer instabiler Angina keine erhöhten hsCRP Spiegel (Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR, et al. The prognostic value of C-reactive protein and serum amyloid a protein in severe unstable angina. N Engl J Med 1994; 331 (7) : 417-24„ Heeschen C, Hamm CW, Bruemmer J, Simeons ML. Predictive value of C-reactive protein and troponin T in patients with unstable angina : a comparative analysis. CAPTURE Investigators. Chimeric c7E3 Anti Platelet Therapy in unstable angina refractory to standard treatment trial. J Am Coll Cardiol 2000; 35 (6) : 1535-42,). Darüber hinaus können individuelle Unterschiede im Ausmaß der Antwort auf bestimmte entzündliche Stimuli möglicherweise die Spiegel der "stromabwärts" akute-Phase Reaktanten, wie hsCRP beeinflussen (Pepys MB, Hirschfield GM. C-reactive protein and its role in the pathogenesis of myocardial infarction. Ital Heart J2001,2(11) : 804-6, Liuzzo G, Biasucci LM, Rebuzzi AG, et al. Plasma protein acutephase response in unstable angina is not induced by ischemic injury. Circulation 1996; 94 (10) 2373-80,). Daher besteht immer noch eine wichtige Herausforderung darin, proximale Stimuli für vaskuläre Entzündung zu identifizieren, die als Risiko- vorhersagende Serummarker in Patienten mit koronarer Arteriosklerose verwendet werden können.

Eine Thrombusbildung im Koronargefäß ist das auslösende Ereignis einer instabilen koronaren Herzerkrankung. Die zentrale Rolle der Plättchenaktivierung wird bei Patienten mit einer instabilen koronaren Herzerkrankung zusätzlich noch durch Thromboxan- und Prostaglandin-Metaboliten, die von den Plättchen freigesetzt werden, gefördert. Deshalb ist die Plättchenaktivierung ein allgemeines therapeutisches Ziel. Bisher haben derartige Therapien die Verwendung von Aspirin, Tienopyridinen und einem direkten Glycoprotein IIb/IIIa-Inhibitor umfasst.

Allerdings konnte ein zuverlässiger biochemischer Marker der Plättchenaktivierung bis heute nicht identifiziert werden. Ergebnisse mit P-Selektin, dem bisher aussichtsreichsten Marker für eine Plättchenaktivierung, sind bis heute kontrovers.

Der Ausschluss von akuten Myokardinfarkten (MI) nach heutigen Standards ist nicht zufrieden stellend. In den letzten Jahren hat eine Konzentration auf die Risikostratifizierung und Steuerung der Behandlung stattgefunden mit dem Ziel, Patienten zu identifizieren, bei denen das Risiko besteht, lebensbedrohliche kardiologische Ereignisse zu entwickeln, und die vor allem von verbesserten therapeutischen und intervenierenden Strategien profitieren (Hamm CW, Bertrand M, Braunwald E. Lancet 2001; 358: 1533-8). Das EKG hat in dieser Hinsicht nur begrenzte prognostische Relevanz, da bedeutende Abnormitäten selten sind und ihr Nachweis wenig empfindlich und spezifisch ist (Kaul P, Fu Y, Chang WC, et al., J Am Coll Cardiol 2001; 38 : 64-71 und Savonitto S, Ardissino D, Granger CB, et al. JAMA 1999; 281: 707-13). Deshalb haben sich Marker einer Nekrose von Myokardzellen, vor allem kardiale Troponine, zu wertvollen Werkzeugen bei der Evaluierung von Patienten mit akuten koronaren Syndromen entwickelt (Hamm CW, Braunwald E. Circulation 2000; 102 : 118-22). Troponine sind allerdings nicht aktiv an der Pathophysiologie akuter koronarer Syndrome beteiligt, sondern stellen eher eine Art Surrogat-Marker für die fragile Thrombusbildung dar (Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B, Venge P, Wallentin L. J Am Coll Cardio. 2001; 38 : 979-86, Heeschen C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML. Circulation 1999; 100:1509-14; Benamer H, Steg PG, Benessiano J, et al.. Am Heart J 1999; 137 : 815-20).

Entzündungsmarker, welche die Aktivität der Erkrankung bestimmen, möglichst bevor eine Myokardnekrose auftritt, könnten wichtige zusätzliche Informationen für die diagnostische und therapeutische Stratifizierung bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen darstellen. Die spezifische therapeutische Inhibierung von Cytokinen, die für die Plaque-Stabilität wesentlich sind, mag eine neue Behandlungsstrategie für Patienten mit instabiler und stabiler koronarer Herzerkrankung sein.

Im Stand der Technik finden sich viele verschiedene molekulare Marker, die für die Diagnose einer kardiovaskulären Erkrankung geeignet sein können. Beispiele solcher Marker sind unter anderem: Schwangerschaft-assoziiertes Plasma Protein A (PAPP-A); C-reaktives Protein (CRP); hs-CRP; plazentaler Wachstumsfaktor(P1GF); Interleukin-18 (IL-18/IL-18b); Hirn natriuretisches Peptid (BNP); NT-pro Hirn natriuretisches Peptid (NT-pro NP); sCD40L, cTnI/T, IL-10, ICAM-1, VCAM-1, E-Selektin, P-Selektin, IL-6, VEGF, Serum Amyloid A (SAA), CKMB, MPO, IL1-RA, TAF1, lösliches Fibrin, MCP-1, Gewebefaktor (TF), MMP-9, bFGF, PCM und VEGF-A.

Das Endothel spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des vaskulären Tonus. Ein Faktor von großer Wichtigkeit für die Aufrechterhaltung der endothelialen Homeostase ist Stickoxid. Das Substrat für die endotheliale Stickoxidsynthese ist die Aminosäure L-Arginin. Das Endothel ist auch in der Lage, methylierte Aminosäuren, wie zum Beispiel asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), zu produzieren, die in der Lage sind, mit L-Arginin als ein Substrat für die endotheliale Stickoxidsynthase kompetitiv zu sein, was zu endothelialer Dysfunktion führt (für eine Zusammenfassung, siehe Cooke JP, 2000). Es haben sich Hinweise darauf ergeben, dass zirkulierende Spiegel von asymmetrischem Dimethylarginin in Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren und Nierenversagen erhöht sind.

Resistin ist ein Cytokin, das von Adipozyten exprimiert wird. Die Funktion liegt vor allem in der Antagonisierung des Insulineffekts und der Beeinträchtigung der Glukosetoleranz.

Mehrere Untersuchungen haben gezeigt, dass die extrazelluläre Matrixdegradation durch Gewebe-Matrix Metalloproteinasen (MMPs), insbesondere MMP-9 an der Pathogenese eines weiten Spektrums von kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt ist, einschließlich Arteriosklerose, Restenose, Kardiomyopathie, kongestivem Herzversagen, Myokardinfarkt und aortischer Aneurysmie (Dollery, 1995; Benjamin, 2001). Spiegel von zirkulierender MMP-9 sind mit zukünftigen kardiovaskulären Ereignissen assoziiert (Blankenberg, 2003).

Die MMP Aktivität wird durch endogene Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs) kontrolliert, von denen es vier bekannte Familienmitglieder gibt (Nagase, 1996; Liu, 2003). TIMP-1 ist einer der am besten charakterisierten TIMPs, der mit hoher Affinität an aktivierte MMPs bindet. TIMP-1 scheint eine wichtige Rolle in der Regulation der linken Ventrikelstruktur und systolischen Funktion zu haben (Li, 1998; Timms, 2002) und Plasma TIMP-1 Spiegel sind in koronarer Erkrankung erhöht (Hirohata, 1997). In der Framingham Herzstudie war gesamt-TIMP-1 mit bedeutenden kardiovaskulären Risikofaktoren assoziiert (Sundstrom, 2004). Jedoch wurde die direkte mechanistische Rolle von MMPs und TIMPs in dem post-MI Remodellingprozeß nicht vollständig etabliert.

Caspasen weisen Funktionen in apoptotischen Signalwegen auf. Die primäre Rolle von Caspase-1 ist jedoch die Regulation von entzündlichen Prozessen. In 1995 wurde die co-Lokalisierung von Caspase-1 mit apoptotischen Zellen in fortgeschrittenen menschlichen Plaques berichtet. An Stellen der Plaqueruptur wurde eine fokale Apoptose von Makrophagen mit einer extensiven Expression von Caspase-1 nachgewiesen und mit plötzlichem Herztod assoziiert.

Einige der oben genannten Marker sind somit bekannte und charakterisierte Marker für die Untersuchung von koronaren Erkrankungen, andere wurden bisher jedoch noch nicht entsprechend untersucht.

Fast alle angegebenen Marker besitzen einen diagnostischen Wert im Hinblick auf bestimmte kardiovaskuläre Vorfälle. Zum Beispiel ist TnT von besonderem Wert für die Diagnose und die Vorhersage von MI (siehe oben). Entzündliche Marker wie CRP sind für die Diagnose und Vorhersage von einer Entzündung wertvoll, die zu einer Plaqueruptur und MI führen kann.

Viele der oben genannten Marker besitzen einen diagnostischen Wert für kardiovaskulären Erkrankungen. Die Verwendung einer Kombination von Markern wurde jedoch nur sehr zurückhaltend beschrieben.

Lund et al. in Circulation. 2003,108 : 1924-1926, beschreiben die Kombination von PAPP-A mit TnI (Troponin I); Peng et al. in Clinica Chimica Acta 319 (2002) 19-26, beschreiben die Kombination von sCD40L mitsICAM-1 und sVCAM-1. Lenderink et al. in European Heart Journal (2003) 24, 77-85, beschreiben die Kombination von TnT mit CRP. Heeschen et al. in Journal of the American College of Cardiology; Vol. 35, No. 6,2000, erwähnen die Kombination von TnT mit CRP.

Heeschen et al. in Circulation. 2003; 107 : 2109-2114, beschreiben die Kombination von TnT, CRP und IL-10, Blankenberg et al. in Circulation. 2002; 106 : 24-30, beschreiben die Kombination von CRP und IL-6, Autiero et al. in Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1:1356-1370, beschreiben die Kombination von P1GF und VEGF.

Jedoch ist das Potential der verbesserten Analyse durch die Kombination bis jetzt weder untersucht. noch wurde die Entwicklung gezielter überlegener Marker-Tests abgeschlossen. Welche Marker sich zu einer effektiven Diagnose eignen, lässt sich somit aus den oben genannten Dokumenten nicht ohne weiteres erschließen.

Zusammengefasst wird die kardiovaskuläre Risikostratifizierung zur Zeit mittels klassischer Risikofaktoren und diversen Risikorechnern (Framingham/PROCAM) durchgeführt. In letzter Zeit wurde zunehmend diskutiert, inwieweit hoch sensitives C-reaktives Protein (CRP) als Marker der Entzündung eine genauere Risikostratifizierung ermöglicht. Die Assoziation zwischen verschiedenen Markern der Entzündung (CRP, Interleukin-6 oder lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül-1) und zukünftigem kardiovaskulären Risiko wurde bereits in mehreren Studien bestätigt.

Die bekannten Lösungen, d.h. die Ermittlung des kardiovaskulären Risikos mittels traditioneller Risikofaktoren, besitzen jedoch eine weniger als 50%ige Sensitivität und Spezifität. Gleiches gilt für die Diagnose des akuten Koronarsyndroms: EKG und Troponin sowie CK-Wert Bestimmungen bieten keine 100%ige Diagnosesicherheit für das akute Koronarsyndrom.

Im Hinblick auf das oben Genannte ist es somit eine. Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem die Möglichkeit der Risikostratifizierung der Koronaren Herzerkrankung durch die Bestimmung bestimmter Einzelmarker und/oder eines bestimmten „Markerpanels" bestehend aus Biomarkern der Entzündung verbessert wird. Weiterhin soll die Diagnosemöglichkeit des „Akuten Koronarsyndroms" erweitert werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist weiterhin, ein Verfahren zur Evaluierung der Wahrscheinlichkeit, dass eine Behandlung mit einem Wirkstoff zur Hemmung der Plättchenaktivierung von Vorteil ist, zu entwickeln. Mit Hilfe dieses Verfahren soll der behandelnden Arzt besser als bisher in die Lage versetzt wer- den, geeignete Maßnahmen auswählen zu können, um den Patienten positiv zu beeinflussen, ein nachteiliges Ereignis zu verhindern oder zumindest in seiner Schwere für den betroffenen Patienten zu vermindern.

In einem ersten Aspekt davon wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zur Analyse von Proben in Zusammenhang mit akuten kardiovaskulären Erkrankungen gelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte von:

(a) Zur Verfügung stellen einer zu untersuchenden biologischen Probe aus einem Subjekt;
(b) Bestimmen der Konzentration von mindestens einem Entzündungsmarker, ausgewählt aus Fibrinogen, sTNFR-2, IL-18, ADMA, Caspase-1, TIMP-1, Resistin und sVCAM-1,
(c) gegebenenfalls, Bestimmen der Konzentration mindestens eines weiteren Marker ausgewählt aus sTNFR-1, Troponin T (TnT), IL-6, sIL1-RA, CRP, lösliches Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1, lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül-1, lösliches E-Selektin, Matrix-Metalloproteinase-9, CD40, Lipoprotein-assoziierte Phospholipase A2 und weiteren entzündlichen Markern, und
(d) Vergleich des/der für die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisse/s mit Referenzwerten und/oder den Werten aus Referenzproben.

Diese Erfindung hat zum Inhalt, dass verschiedene Marker der Entzündung (löslicher Tumor Nekrose Faktor – Rezeptor 1 und 2 (sTNFR-1 und sTNFR-2), löslicher Interleukin-1 Rezeptor Antagonist (sIL1-RA), Interleukin-18 (IL-18), lösliches Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1, lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül-1, lösliches E-Selektin, Matrix-Metalloproteinase-9, Interleukin-6 (IL-6), Fibrinogen, ADMA, Caspase-1, TIMP-1, Resistin, sVCAM-1 und C-reaktives Protein (CRP)) eine Vorhersage des kardiovaskulären Risikos ermöglichen. Diese Marken beinhalten einerseits das Potential, ein akutes Koronarsyndrom zu diagnostizieren; andererseits kann anhand dieser Marker wie auch eines speziell gebildeten „Markerclusters" das Risiko, einen fatalen oder nicht-fatalen Myokardinfarkt zu erleiden, abgeschätzt werden. Diese Risikoabschätzung erweitert diejenige, welche zur Zeit mit klassischen Risikofaktoren möglich ist.

Dabei wurden unter anderem akute Phase Reaktanten (C-reaktives Protein, Fibrinogen und Interleukin-6), proinflammatorische Cytokine und lösliche Rezeptoren (Tumornekrosefaktor-Rezeptoren 1 und 2, löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist und Interleukin-18), lösliche Adhäsionsmoleküle (interzelluläres Adhäsionsmolekül-1, vaskuläres Adhäsionsmolekül-1, lösliches E-Selektin) und Matrixmetalloproteinase-9 ausgewählt.

Eine Vielzahl entzündlicher Biomarker ist mit der kardiovaskulären Prognose assoziiert. Besonders stark ist ein inflammatorischer Wert bestehend aus der parallelen Bestimmung von 8 Biomarkern der Entzündung (TIMP-1, ADMA, Resistin, Caspase-1, sTNFR-2, IL-18, sVCAM-1, Fibrinogen) mit dem Risiko eines zukünftigen kardiovaskulären Ereignisses assoziiert.

Weiter bevorzugt ist die gefundene Assoziierung der Einzelmarker Caspase-1 und sTNFR-2 mit dem zukünftigen myokardialen Ereignis. Ebenfalls erstmals wird ein inflammatorisches Markerpanel als starker und unabhängiger Prädiktor des kardiovaskulären Risikos beschrieben.

Entzündliche Gefäßwandprozesse sind ursächlich an der Destabilisierung der arteriosklerotischen Plaques und der Verstärkung der der Thrombusbildung beteiligt. Diese Ergebnisse haben die Suche nach zirkulierenden biochemische Markern ausgelöst, die die entzündliche Aktivität innerhalb der vaskulären Wand widerspiegeln. Zusätzlich zu Fibrinogen, dem ersten entzündlichen Biomarker, der mit zukünftigem kardiovaskulärem Risiko in Zusammenhang gebracht wurde, wurde das C-reaktive Protein am meisten untersucht. Seine klinische Brauchbarkeit wurde jedoch kürzlich bezweifelt. Andere (pro)inflammatorische Marker, wie z.B. Interleukin-6, lösliche Adhäsionsmoleküle, Interleukin-18 oder Lipoprotein-assoziierte Phospholipase A2 sind ebenfalls aufkommende potentielle Werkzeuge für eine kardiovaskuläre Risiko-Vorhersage.

Um zu ermitteln, ob die gleichzeitige Untersuchung von ausgewählten inflammatorischen Markern eine zusätzliche Information gegenüber den klassischen Risikofaktoren und einzelnen Markern ergibt, analysierten die Erfinder mehrere zirkulierende entzündlichen Biomarker in einer großen Kohorte von Patienten mit koronarer Herzerkrankung. Die Erfinder wählten dafür unter anderem akute Phase Reaktanten (C-reaktives Protein, Fibrinogen und Interleukin-6), proinflammatorische Cytokine und lösliche Rezeptoren (Tumornekrosefaktor-Rezeptoren 1 und 2, löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist und Interleukin-18), lösliche Adhäsionsmoleküle (interzelluläres Adhäsionsmolekül-1, vaskuläres Adhäsionsmolekül-1, lösliches E-Selektin) und Matrixmetalloproteinase-9 aus.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde evaluiert, welche Basislinien-Spiegel dieser entzündlichen Biomarker unabhängig mit dem zukünftigen Risiko kardiovaskulärer Erkrankung assoziiert sind und ob die gleichzeitige Untersuchung von speziellen inflammatorischen Markern eine verbesserte Fähigkeit ergab, hoch-Risikopatienten außerhalb klassischer Risikofaktoren und einzelner Marker Bestimmung zu identifizieren.

Die zur Analyse im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Marker sind zum größten Teil aus dem Stand der Technik gut bekannte und charakterisierte Marker, die jedoch bisher immer noch unzureichend für die Verwendung zur Diagnose einer akuten kardiovaskulären Erkrankung charakterisiert waren.

So sind das C-reaktive Protein (CRP) und hsCRP als Marker der systemischen Entzündung, Troponin cTnI/T als Marker für Nekrose; das Schwangerschaft assoziierte Plasmaprotein A (PAPP-A) als Marker für Makrophagen Aktivierung; IL-10 (Interleukin 10) als Marker für die inflammatorische Balance, sCD40L als Marker für die Thrombo-inflammatorische Aktivierung, MPO (Myeloperoxidase) als Marker für oxidativen Stress, der plazentale Wachstumsfaktor (PlGF) als Marker für vaskuläre Entzündung und die Marker Hirn natriuretisches Peptid (BNP) und NT-pro Hirn natriuretisches Peptid (NT-proNP) als Marker neurohumoraler Aktivierung und der Ischämie charakterisiert. Andere ähnliche und auch verwendbare Marker sind Interleukin-18 (IL-18/IL-18b), ICAM-1, VCAN-1, E-Selektin, P-Selektin, IL-6, VEGF, Serum Amyloid A (SAA), CKMB, IL-1-RA, TAF-1, lösliches Fibrin, MCP-1, Gewebefaktor (TF), MMP-9, bFGF, PCM und VEGF-A.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe aus einem Säugetier, insbesondere aus dem Menschen, stammen. Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus peripherem Blut oder Fraktionen davon und Zellkultur-Suspensionen oder Fraktionen davon. Bevorzugt ist weiterhin, dass die untersuchende Probe und/oder Referenzprobe Blutserum oder Blutplasma ist. Besonders bevorzugt ist peripheres Vollblut als zu untersuchende Probe und/oder Referenzprobe.

Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe vorbehandelt sein, wobei dem peripheren Blut z. B. ein Gerinnungshemmer, insbesondere Heparin, zugesetzt wird.

Erfindungsgemäß konnte überraschenderweise gefunden werden, dass neben der Einzelanalyse verschiedener der oben genannten Marker zur Diagnose oder der Verfolgung akuter kardialer Ereignisse auch Kombinationen von solchen Markern möglich sind, die eine erheblich verbesserte Analyse ermöglichen. Als besonders bevorzugt haben sich dabei Kombinationen von Markern erwiesen, die verschiedene Aspekte des nachteiligen kardialen Ereignisses betreffen, sich aber gleichzeitig (also simultan oder in einer mehr oder weniger zeitlich beanstandeten Messreihe) analysieren lassen.

Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die analysierten Marker und Kombinationen daraus ausgewählt aus:
Fibrinogen + sTNFR-2, Fibrinogen + IL-18, Fibrinogen + sVCAM-1, Fibrinogen + ADMA, Fibrinogen + Caspase-1, Fibrinogen + TIMP-1, Fibrinogen + Resistin, sTNFR-2 + IL-18, sTNFR-2 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA, sTNFR-2 + Caspase-1, sTNFR-2 + TIMP-1, sTNFR-2 + Resistin, IL-18 + sVCAM-1, IL-18 + ADMA, IL-18 + Caspase-1, IL-18 + TIMP-1, IL-18 + Resistin, sVCAM-1 + ADMA, sVCAM-1 + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-1, sVCAM-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1, ADMA + TIMP-1, ADMA + Resistin, Caspase-1 + TIMP-1, Casapse-1 + Resistin, TIMP-1 + Resistin,
Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18, Fibrinogen + sVCAM-1 + IL-18, Fibrinogen + ADMA + IL-18, Fibrinogen + Caspase-1 + IL-18, Fibrinogen + TIMP-1 + IL-18, Fibrinogen + Resistin + IL-18, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA + sVCAM-1, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1, sTNFR-2 + TIMP-1 + sVCAM-1, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1, IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, IL-18 + TIMP-1 + ADMA, IL-18 + Resistin + ADMA, sVCAM-1 + ADMA + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1, sVCAM-1 + Resistin + Caspase-1, ADMA + Caspase-1 + TIMP-1, ADMA + Resistin + TIMP-1, Caspase-1 + TIMP-1 + Resistin,
Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, Fibrinogen + ADMA + IL-18 + Caspase-1, Fibrinogen + TIMP-1 + IL-18 + Resistin, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-1, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1 + IL-18, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-1, IL-18 + Resistin + ADMA + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1 + TIMP-1 + Resistin,
Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, Fibrinogen + TIMP-1 + IL-18 + Resistin + sTNFR-2, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-1 + sTNFR-2, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-1 + Resistin, sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1 + Resistin + ADMA,
Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-1, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-1 + sTNFR-2 + IL-18, Fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1 + Resistin + ADMA, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-1 + Caspase-1, Fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1 + Resistin + ADMA + sTNFR-2 und Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + Caspase-1 + TIMP-1 + Resistin + sVCAM-1, Bevorzugt ist dann die weitere Kombination mit mindestens einem weiteren der Marker ausgewählt aus sTNFR-1, Troponin T (TnT), IL-6, CRP, Selektin(en), CD40, Lipoproteinassoziierte Phospholipase A2 und weiteren entzündlichen Markern.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist dann ein Verfahren wobei die analysierten Marker und Kombinationen daraus ausgewählt sind aus Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 und Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + Caspase-1 + TIMP-1 + Resistin + sVCAM-1, Das erfindungsgemäß verwendete Verfahren zum Bestimmen der Konzentration der analysierten Marker kann aus allen dem Fachmann zum Nachweis von Proteinen in biologischen Proben bekannten geeigneten Verfahren ausgewählt sein. Das spezifische Verfahren ist im Rahmen der vorliegenden. Erfindung solange nicht wichtig, wie das Verfahren empfindlich genug ist, um die für eine genaue Bestimmung der Konzentrationen der Marker erforderliche Nachweisgrenze zu unterschreiten. Geeignete Verfahren beruhen normalerweise auf der Bindung einer Markierung an den nachzuweisenden Marker und den anschließenden Nachweis dieser Markierung. Die Bindung kann dabei kovalent oder nicht-kovalent sein und/oder direkt oder indirekt erfolgen. Geeignete Messverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung schließen z. B. die Elektrochemilumineszenz ein. Turbidimetrie, Nephelometrie und Latex-verstärkte Turbidimetrie oder Nephelometrie können ebenfalls verwendet werden.

Auf Grund ihrer hohen Sensitivität und der Tatsache, dass sich diese Verfahren auch auf Hoch-Durchsatz-Umgebungen anpassen lassen, sind erfindungsgemäß Verfahren bevorzugt, wobei das Bestimmen der Konzentration mittels eines immunologischen Verfahrens mittels an die Marker bindenden Moleküle erfolgt. Beispiele für solche Verfahren sind ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), Sandwich Enzymimmuntests oder Festphasen Immuntests. Bevorzugt ist somit, dass die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus anti-Marker-Antikörpern oder Teilen davon und Marker-Rezeptoren oder Teilen davon.

Diese Moleküle können aus einer sehr großen Vielzahl von für die Marker spezifischen Molekülen ausgewählt sein. Bevorzugt ist, dass die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, die spezifisch gegen Marker oder gegen Teile davon gerichtet sind, oder Teilen oder Fragmenten davon und einem Marker-Rezeptor oder Teilen davon oder einem Integrin. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Antikörper, Teile oder Fragmente davon polyklonale Antikörpern, monoklonale Antikörpern, Fab-Fragmente, scFv-Antikörper und Diabodies umfassen.

Gemäß eines weiteren Aspekts des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können Komponenten des Verfahrens an eine feste Phase gebunden vorliegen, somit können die an einen Marker bindenden Moleküle in Lösung oder Matrix-immobilisiert vorliegen. Als Matrices können eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Materialien verwendet werden, wie zum Beispiel Harz-Matrices und/oder herkömmliche Säulenmatrices. Besonders bevorzugt ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die an einen Marker bindenden Moleküle an eines oder mehrere Detektionsmoleküle aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszeinthioisocyanat, Phycoerythrin, Enzymen (zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase) und magnetisches Bead gekoppelt sind.

Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens können die an die Marker bindenden Moleküle mit einem Antikörper, an den eine oder mehrere Detektionsmoleküle gekoppelt sind, nachgewiesen werden. Es handelt sich somit um einen indirekten Nachweis der Bindung des Moleküls. Solche zweistufigen Nachweise sind dem Fachmann zum Beispiel aus der anti-Antikörper-Nachweistechnik bestens bekannt.

Gemäß einem weiteren Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Analyse der Probe immunzytologischen Verfahren angewandt werden. Dabei sind alle Verfahren geeignet, die eine spezifische Bestimmung anhand der Marker/Molekül-Interaktion erlauben. Bevorzugt sind Verfahren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sandwich-Enzym-Immuntest, ELISA und Festphasen-Immuntests.

Die für die zu untersuchende Probe ermittelten Ergebnisse werden üblicherweise mit einer Referenzprobe verglichen. Welche Probe als Referenzprobe dienen kann, wird insbesondere von der Art der untersuchten Probe und der Krankengeschichte des Individuums, aus dem die zu untersuchende Probe stammt, abhängen. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Referenzprobe aus einem oder dem Mittelwert mehrerer Säugetiere stammt, in dem/in denen eine kardiovaskuläre Erkrankung ausgeschlossen wurde. Dies muss aber nicht zwangsläufig so sein, wenn z. B. das Fortschreiten einer Erkrankung bestimmt werden soll, kann auch eine "alte" Probe desselben Patienten als Referenzprobe verwendet werden. Dem Fachmann ist offensichtlich, welche Proben als Referenzprobe für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.

Gemäß einem weiteren Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung können die zu diagnostizierenden und/oder prognostizierenden und/oder deren Therapie zu überwachen- den akuten kardiovaskulären Erkrankungen ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus instabiler Angina, Myokardinfarkt, akutem Herzsyndrom, koronarer Arterienerkrankung und Herzinsuffizienz. Es soll jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren noch für weitere akute kardiologische Erkrankungszustände eignet und anwenden lässt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft. einen. diagnostischen Kit, wobei der Kit Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, unter Umständen zusammen mit weiteren Komponenten und/oder Hilfsstoffen umfasst. Solche Mittel sind bevorzugterweise mindestens ein Antikörper zum Nachweis von Marker und Mittel zur anschließenden Quantifizierung der Marker. Der Kit kann außerdem andere Komponenten und/oder Enzyme zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, z. B. Gebrauchsanweisungen zur Interpretation der Ergebnisse des Tests im Hinblick auf das Risikoprofil des Patienten und entsprechende Gegenmaßnahmen und Therapievorschläge enthalten.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Prognose akuter kardiovaskulärer Erkrankungen und/oder zur Überwachung von deren Therapie. Dies geschieht durch die quantitative und kritische Bestimmung von Markern. Aufgrund des daraufhin erstellbaren Risikoprofils können dann geeignete Gegenmaßnahmen durch den behandelnden Arzt durchgeführt werden, um den Patienten positiv zu beeinflussen und das nachteilige Ereignis zu verhindern oder zumindest in seiner Schwere für den betroffenen Patienten zu vermindern. Eine solche Therapie kann erfindungsgemäß z. B. die Verabreichung von Statinen oder Inhibitoren des Glycoprotein IIb/III-Rezeptors insbesondere Abciximab umfassen. Dem Fachmann sind jedoch weitere mögliche Therapien bekannt, um kardiovaskuläre Erkrankungen zu therapieren, die nach herkömmlichen Schemata erfolgen können.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann weiterhin ein anti-inflammatorisches Mittel mit verabreicht werden. Dieses Mittel kamen ausgewählt sein aus nicht-Steroid oder Steroid anti-inflammatorischen Mitteln, die z.B. einschließen können: Alclofenac; Alclometason; Dipropionat; Algestonacetonide; Alpha-Amylase; Amcinafal; Amcinafid; Amfenac Natrium; Amiprilosehydrochlorid; Anakinra; Anirolac; Anitrazafen; Apazon; Balsalazid Dinatrium; Bendazac; Benoxaprofen; Benzydamin Hydrochlorid; Bromelain; Broperamol; Budesonid; Carprofen; Cicloprofen; Cintazon; Cliprofen; Clobetasolpropionat; Clobetasonbutyrat; Clopirac; Cloticasonpropionat; Cormethasonacetat; Cortodoxon; Deflazacort; Desonid; Desoximetason; Dexamethasondipropionat; Diclofenac Kalium; Diclofenac Natrium; Diflorasondiacetat; Diflunudon Natrium; Diflunisal; Difluprednat; Diftalon; Dimethylsulfoxid; Drocinonid; Endryson; Enlimomab; Enolicam Natrium; Epirizol; Etodolac; Etofenamat; Felbinac; Fenamol; Fenbufen; Fenclofenac; Fenclorac; Fendosal; Fenpipalon; Fentiazac; Flazalon; Fluazacort; Flufenaminsäure; Flumizol; Runisolidacetat; Plunixin; Flunixin Meglumin; Fluocortin Butyl; Fluormetholonacetat; Fluquazon; Flurbiprofen; Fluretofen; Fluticasonpropionat; Puraprofen; Furobufen; Halcinonid; Halobetasolpropionat; Halopredonacetat; Ibufenac; Ibuprofen; Ibuprofen Aluminium; Ibuprofen Piconol; Ilonidap; Indomethacin; Indomethacin Natrium; Indorofen; Indoxol; Mitrazol; Isoflupredonacetat; Isoxepac; Isoxicam; Ketoprofen; Lofemizol Hydrochlorid; Lomoxicam; Loteprednol Etabonat; Meclofenamat Natrium; Meclofenaminsäure; Meclorison Dibutyrat; Mefenaminsäure; Mesalamin; Meseclazon; MethylprednisolonSuleptanat; Momiflumat; Nabumeton; Naproxen; Naproxen Natrium; Naproxol; Nimazon; Olsalazin Natrium; Orgotein; Orpanoxin; Oxaprozin; Oxyphenbutazon; Paranylin Hydrochlorid; Pentosan Polysulfat Natrium; Phenbutazon Natriumglycerat; Pirfenidon; Piroxicam; Piroxicam Cinnamat; Piroxicam Olamin; Pirprofen; Prednazat; Prifelon; Prodolinsäure; Proquazon; Proxazol; Proxazolcitrat; Rimexolon; Romazarit; Salcolex; Salnacedin; Salsalat; Salicylate; Sanguinariumchlorid; Seclazon; Sermetacin; Sudoxicam; Sulindac; Suprofen; Talmetacin; Talniflumat; Talosalat; Tebufelon; Tenidap; Tenidap Natrium; Tenoxicam; Tesicam; Tesimid; Tetrydamin; Tiopinac; Tixocortol Pivalat; Tolmetin; Tolmetin Natrium; Triclonid; Triflumidat; Zidometacin; Glucocorticoide; Zomepirac Natrium.

Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "Diagnose" die Überprüfung, ob ein Individuum an einem bestimmten kardiovaskulären Ereignis gelitten hat. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "Prognose" die Vorhersage der Wahrscheinlichkeit (in %) ob ein Individuum an einem bestimmten kardiovaskulären Ereignis leiden wird. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "Stratifizierung der Therapie" die Ermittlung der geeigneten therapeutischen Behandlung für das kardiovaskuläre Ereignis, das auftreten wird oder aufgetreten ist.

Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "Überwachung der Therapie" die Kontrolle und, gegebenenfalls, ein Einstellen der therapeutischen Behandlung eines Individuums. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "therapeutische Behandlung" schließt jede Behandlung ein, die möglicherweise den pathophysiologischen Zustand eines Individuums und schließt z. B. die Verabreichung von Pharmazeutika sowie chirurgische Behandlung (z. B. Ballondilatation).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Patienten mit koronarer Arterienerkrankung für mehr als 5 Jahre verfolgt, es wurde dabei der Einfluss von elf inflammatorischen Markern bei der Vorhersage eines zukünftigen kardiovaskulären Ereignisses untersucht. Einzeln berücksichtigt waren die meisten der Marker unabhängig von klassischen Risikofaktoren hoch prädiktiv. Jedoch verblieben einige wenige dieser Marker, nämlich lösliches vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1, löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2, Interleukin-18 und Fibrinogen – unabhängige Risiko-Vorhersageparameter. Die Analyse eines Wertes, der diese vier Marker kombinierte ließ vermuten, dass die Untersuchung von mehreren sorgfältig ausgewählten Markern etwas zur individuellen Vorhersagekraft einzelner Marker hinzufügte. Das Konzept des Multi-Markerwertes, assoziiert mit dem Risiko koronarer Arterienerkrankung wird auch durch die Ergebnisse aus der HOPE Studie unterstützt, wobei gezeigt wird, dass ein Wert, der 3 inflammatorische Marker einschließt, in einer Kohorte von Hochrisikopatienten stark mit kardiovaskulärem Ausgang assoziiert war.

Von wesentlicher Bedeutung sind die Definition und Interpretation der hier vorgestellten inflammatorischen Werte. Die Erfinder verwendeten ein schrittweises Verfahren zur Auswahl der Marker, die unabhängig mit dem Ausgang assoziiert waren. Das vorwärts- und rückwärts-Verfahren zur Auswahl ergab ähnliche Ergebnisse. Interessanterweise gehörten die vier ausgewählten Marker zu verschiedenen Signalwegs, was auf die Aktivierung von distinkten pathophysiologischen Systemen hindeutet – dem Tumornekrosefaktor Signalweg, dem Interleukin-18 (oder allgemeiner dem Interleukin-1) Signalweg, der Adhäsionsmolekül-Familie und dem Cluster von akute-Phase Reaktanten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass jeder Schritt innerhalb der pathophysiologischen Kaskade von Entzündung einen unabhängigen Beitrag zur Vorhersage des Risikos aufweist. Die Kombination mehrerer Marker, die aus einem gemeinsamen pathophysiologischen Signalweg und daher eng miteinander verwandt sind, würden zu einer Redundanz führen, wie kürzlich in einer prospektiven Untersuchung gesunder Männer gezeigt wurde, wobei die gleichzeitige Messung von fünf Entzündungs-sensitiven Plasmaproteinen – die alle die akute Phase Antwort widerspiegelten – keine weitere Information für die klinische Risikovorhersage, verglichen mit CRP Messung allein, ergab.

Mehrere mechanistische Untersuchungen betreffen die kausative Rolle von Tumornekrosefaktor und Interleukin-1 Familien im arteriosklerotischen Prozess. Jedoch sind Tumornekrosefaktor-α und Interleukin-1 im Kreislauf aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit schwer zu messen. Im Gegenzug sind die Erhöhung des löslichen Tumornekrosefaktor-Rezeptors und löslichen Interleukin-1 Rezeptorantagonists eng mit jeweils Tumornekrosefaktor-α und Interleukin-1 assoziiert und zeigen stabile basale Serumspiegel. Obwohl löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 und löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist potentiell schädlichen Effekten entgegenwirken, scheint die endogene Produktion nicht ausreichend zu sein, um die negativen Effekte der primären Cytokine zu verhindern, die lokal produziert werden (26). Daher scheinen die löslichen Rezeptoren bessere Marker für die Aktivität der Erkrankung zu sein, als die Cytokine selber (27). Die vorliegende Erfindung zeigt eine starken Zusammenhang von löslichem Interleukin-1 Rezeptorantagonist mit kardiovaskulärem Risiko in univarianter Analyse, jedoch war der Effekt nicht länger signifikant, wenn mehrere entzündliche Marker gleichzeitig berücksichtigt wurden. Dies ist möglicherweise in der Tatsache begründet, dass löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist-Spiegel mit löslichem Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 stark korrelieren.

Kürzlich wurde eine erhöhte Interleukin-18 Expression – einem weiteren Mitglied der Interleukin-1 Familie in menschlichen arteriosklerotischen Plaques identifiziert, und die Inhibierung von Interleukin-18 wurde als einen vorteilhaften Effekt auf das Fortschreiten der Plaquebildung und -Zusammensetzung in Tiermodellen gezeigt. Die Assoziierung von Basislinien-Interleukin-18 Spiegeln mit zukünftigem kardiovaskulärem Tod wurde kürzlich in der AtheroGene Untersuchung sowohl in stabiler Angina pectoris und akutem Koronarsyndrom gezeigt und wurde weiter in der Kohorte von anfänglich gesunden Subjekten der PRIME Studie bestätigt. In der vorliegenden Erfindung sind die Interleukin-18 Spiegel schwach mit anderen entzündlichen Markern korreliert, was vermuten lässt, dass Interleukin-18 einen eher distinkten pathophysiologischen Signalweg darstellt.

Aus klinischer Sicht ist es wichtig, dass der systemisch nachweisbare entzündliche Zustand, der durch multiple Marker widergespiegelt wird, klar eine bessere Abschätzung des kardiovaskulären Risikos zur Verfügung stellt, als einzelne Biomarker.

Zusammenfassend lässt sich somit sagen, dass die vorliegende Erfindung die bedeutende und unabhängige Rolle von Fibrinogen, sTNFR-2, IL-18, ADMA, Caspase-1, TIMP-1, Resistin und sVCAM-1 als Marker der Plättchenaktivierung für die diagnostische und therapeutische Risikostratifizierung dokumentiert.

Die Erfindung soll nun im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher erläutert werden, ohne jedoch dadurch begrenzt zu werden. In den Figuren zeigt:
1 die paarweise Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen inflammatorischen Markern in Patienten mit stabiler Angina pectoris und denjenigen mit akutem Koronarsyndrom (log oder Quadratwurzel Transformationen wurden verwendet, um die Verteilungen zu normalisieren).
2 die Hazard-Verhältnisse von zukünftigen kardiovaskulären Ereignissen durch erhöhende Drittel inflammatorischer Marker. Die Hazard-Verhältnisse wurden auf Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, Raucherstatus, Geschichte von Hochdruck oder Diabetes, HDL-Cholesterin, Statintherapie und Zahl der stenösen Gefäße angepasst.
3 die Kaplan-Meier Überlebenskurven für kardiovaskuläre Ereignisse durch inflammatorischen Wert bei Patienten mit stabiler Angina (Panel A) und akutem Koronarsyndrom (Panel B).
4 den Unterschied im Akaike Informations Kriterium (AIC) zwischen dem Modell basierend auf dem 4-Marker Wert (umgeben) und denjenigen basierend auf den besten 1-Marker- 2-Marker- und 3-Markerwerten (links) und dem 5-Markerwert (rechts). Der minAIC wurde für den 4-Markerwert erhalten und auf 0 gesetzt.
5 und 6 die Kaplan-Meier Kurven für Ereignis-freies Überleben gemäß Dritteln von TIMP-1 Spiegel.
7 die prädiktive Stärke von TIMP-1 im Kontext mit den neuen biologischen Markern CRP und BNP.
8 die Kaplan-Meier Kurven für Ereignis-freies Überleben gemäß Dritteln von ADMA Spiegel.
9 die prädiktive Stärke von TIMP-1 im Kontext mit den neuen biologischen Markern CRP, BNP und Creatinin.
Beispiele
Beispiel 1 – Untersuchung von elf entzündlichen Markern
Die Erfinder untersuchten zunächst, welche Ausgangsspiegel von elf entzündlichen Markern – einige zum ersten Mal analysiert – unabhängig mit zukünftigem kardiovaskulärem Risiko assoziiert warten und ob die gleichzeitige Ermittlung von multiplen entzündlichen Markern die Fähigkeit verbesserte, Hoch-Risikopatienten über die klassischen Risikofaktoren und Einzelmarkerbestimmung hinaus nachzuweisen.
Studienpopulation
Eine genaue Beschreibung des Aufbaus der AtheroGene Studie wurde bereits vorher beschrieben (18). Zwischen November 1996 und Juni 2000 wurden 1303 Patienten, die koronarer Angiographie in der medizinischen Abteilung II der Johannes Gutenberg-Universität Mainz oder dem Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz unterzogen wurden, und die mindestens eine Stenose von >30% in einer Haupt-Koronararterie diagnostiziert hatten, in ein kardiovaskuläres Register aufgenommen. Von den Patienten erschienen 880 (67,5%) mit stabiler Angina pectoris und 423 (32,5%) mit einem akuten Koronarsyndrom; in der zuletzt genannten Gruppe, wiesen 367 Patienten eine instabile Angina, klassifiziert durch Braunwald Klassifikation (Klasse B oder C) auf und 56 wiesen einen akuten Myokardinfarkt innerhalb der vorherigen 48 Stunden auf. Die Ausschlußkriterien waren Auftreten von hämodynamisch signifikante valvulare Herzerkrankung, Chirurgie oder Trauma innerhalb des vorhergehenden Monats, bekannte Kardiomyopathie, bekannte maligne Erkrankungen, febrile Zustände oder orale Antikoagulans-Therapie innerhalb der letzten vier Wochen.
Evaluierung von Endpunkten
Eine Gesamtzahl von 1292 (99,2%) Patienten wurde während einer mittleren Zeitdauer von 5,4 (Maximum 7,6) Jahren nach-verfolgt. Die Patienten wurden entweder an der Klinik der Erfinder präsentiert (78,2 %) oder wurden durch geschultes medizinisches Personal per Telefon befragt. Die Nachfolge-Information wurde über Tod aus kardiovaskulären Gründen (n=168), Tod aus Gründen, die nicht mit kardiovaskulärer Erkrankung zusammenhing (n=61), nicht fatalem Myokardinfarkt (n=67) und nicht fatalem Schlaganfall (n=45) erhalten. Die Information über die Todesursache oder klinische Ereignisse wurden aus Krankenhaus- oder Arztpraxisakten erhalten.
Laborverfahren
Blut wurde von allen Studiensubjekten unter standardisierten Bedingungen abgenommen, bevor die Koronarangiographie durchgeführt wurde. Die Proben wurden bei –80°C bis zur Analyse gelagert. C-reaktives Protein wurde durch einen hoch-sensitiven, Latexpartikel-verstärkten Immuntest (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) bestimmt. Serum Interleukin-6, löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist, lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (alle EASIA^TM, Biosource Europe), löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 und 2 (R&D Systems, Europe), Interleukin-18 (MBL Co, Ltd), sowie Plasma lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül-1 (EASIA^TM, Biosource Europe), Plasma-lösliches E-Selektin, (Bender Medical Systems, Austria), und Plasma Metalloproteinase-9 (Fuji Chemical Industries, Japan) wurden unter der Verwendung der ELISA Technik gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Von allen ELISA Messungen waren wiederholte Messungen der selben Proben hoch korreliert (von 0,96 bis 0,99) und die Koeffizienten der Variation reichten von 2% bis 17%. Fibrinogen (abgeleitetes Verfahren, Dade Behring, Germany) und Serum Lipidspiegel (gesamtes Cholesterin, HDL-Cholesterin, LDL-Cholesterin und Triglyceride) wurden sofort bestimmt.
Statistische Analyse
In allen Überlebensanalysen war der kombinierte Endpunkt Tod aus kardiovaskulären Gründen und nicht fataler Myokardinfarkt (n=235) und Daten von Patienten, die aus anderen Gründen starben wurden zum Todeszeitpunkt zensiert. Alters- und Geschlechts-eingestellte Mittlere Spiegel von entzündlichem Marker wurden in Patienten mit und ohne kardiovaskulärem Ereignis durch ein allgemein lineares Modell abgeschätzt. Die Assoziierung von entzündlichem Marker mit Ausgang wurde auch durch Cox Regressionsanalyse durch Teilen der Marker in Drittel – getrennt bei Patienten mit stabiler Angina und akutem Koronarsyndrom – und Kontrollieren auf klassische Risikofaktoren (Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, Rauchen, Geschichte von Bluthochdruck oder Diabetes, HDL-Cholesterin, Statintherapie und die Zahl von stenösen Gefäßen) evaluiert.
Eine schrittweise Cox Regressionsanalyse wurde durchgeführt, um diejenigen entzündlichen Marker zu identifizieren, die unabhängig mit Ausgang assoziiert waren. Ein entzündlicher Wert wurde als nächstes durch Kombinieren der 4 Marker, die durch schrittweise Analyse ausgewählt waren, berechnet. Der Wert eines Individuums wurde als die Zahl von Marker in dem oberen Drittel der Verteilung definiert. Das Cox Modell basierend auf diesem 4-Marker Wert wurde weiter im Hinblick auf Information mit Modellen basierend auf Werten, die eine kleinere oder größere Zahl von Markern aufwiesen, verglichen. Zu diesen Zweck wurde das Akaike Informations Kriterium (AIC) (19) verwendet, und das Modell mit dem Minimum AIC (minAIC) wurde als die beste empirische Stützung aufweisend betrachtet (20). Ein Modell mit einer AIC Differenz ≤ 2 mit dem minAIC wurde als äquivalent mit dem minAIC Modell betrachtet, wohingegen ein Modell mit einer AIC Differenz ≥ 4 als verschieden von dem minAIC Modell betrachtet wurde (20, 21). Die Annahme der Proportionalität der Gefährdungen wurde durch die Einführung einen Interaktions-Begriffes Wert*log(Zeit) in das Cox Modell eingeführt, und wurde nicht zurückgewiesen (P = 0,46 und 0,60 jeweils in der stabiler Angina und akutes Koronarsyndromgruppe). Die Hazard-Verhältnisse (HRs) und 95% CI wurden dargestellt. P < 0,05 wurde als signifikant betrachtet. Alle Analysen wurden mit der SAS Software Version 8,2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) durchgeführt.
Ausgangsliniendaten und zirkulierende Spiegel von entzündlichem Marker im Verhältnis zu kardiovaskulärem Ausgang
Im Hinblick auf klassische Risikofaktoren und klinische Daten ergaben geringe Ausstoßfraktion, Diabetes mellitus, Alter und niedrige HDL-Cholesterinspiegel die stärkste Assoziierung mit zukünftigem kardiovaskulärem Ereignis (Tabelle 1). Da 33% of Patienten bei Studieneintritt eine Statintherapie erhielten, waren die Spiegel von LDL- und Gesamt-Cholesterin bereits therapeutisch beeinträchtigt und nicht zusammenhängend – im Gegensatz zu HDL-Cholesterin und Triglyceridspiegeln – mit zukünftigen kardiovaskulären Ereignissen.
Alle entzündlichen Marker, außer löslichem E-Selektin, waren in der Ausgangslinie in Patienten die ein kardiovaskulärem Ereignis (Tabelle 2) erfuhren, signifikant erhöht. Die Erhöhung der Markerspiegel war allgemein von vergleichbarer Größenordnung zwischen Patienten mit stabiler Angina pectoris und denjenigen mit akutem Koronarsyndrom.
Es gab zwei Cluster von stark assoziierten Markern, wobei der erste löslichen Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 und 2 und löslichen Interleukin-1 Rezeptorantagonist umfasste, und der zweite akute-Phase Entzündungsmarker (C-reaktives Protein, Fibrinogen, und Interleukin-6) (1) umfasste. Die Korrelationen schienen in ihrer Größenordnung zwischen Patienten mit stabiler Angina und denjenigen mit akutem Koronarsyndrom sehr ähnlich.
Prospektive Evaluierung der entzündlichen Marker im Hinblick auf kardiovaskulären Ausgang
2 zeigt die Hazard-Verhältnisse von kardiovaskulärem Ereignis, eingestellt auf klassische Risikofaktoren, gemäß den ansteigenden Dritteln jedes Markers. In der stabilen Angina zukünftigem kardiovaskulärem Ereignis-Gruppe zeigten die Patienten eine zunehmende Gefährdung in dem obersten gegenüber dem untersten Drittel der Verteilung von jeweils löslichem Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (HR=2,2, P=0,001), Interleukin-18 (HR=2,0, P=0,003), löslichem Interleukin-1 Rezeptorantagonist (HR=1,9, P=0,008), löslichem vaskulärem Adhäsionsmolekül-1 (HR=2,2, P=0,001), Matrix Metalloproteinase-9 (HR=2,3, P=0,0004) und Interleukin-6 (HR=1,6, P=0,02). In Patienten mit akutem Koronarsyndrom waren die Hazard-Verhältnisse, die mit dem obersten Drittel des Markers assoziiert waren, von vergleichbarer Größenordnung zu denjenigen, die in der stabilen Anginagruppe gesehen wurden, mit Ausnahme von Matrix Metalloproteinase-9 und Interleukin-6, die ihre Signifikanz verloren. Umgekehrt war Fibrinogen signifikant mit dem Ausgang in dieser Gruppe assoziiert (HR=1,9, P=0,03). Lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül-1, C-reaktives Protein und lösliches E-Selektin waren nicht mit dem Ausgang in beiden Gruppe assoziiert.
Gleichzeitige Ermittlung von multiplen entzündlichen Markern auf kardiovaskulären Ausgang
Aufgrund der starken Korrelationen zwischen Markern führten die Erfinder eine schrittweise Cox Regressionsanalyse durch um zu bestimmen, welche der Marker unabhängig mit dem Ausgang assoziiert waren. Das Modell schloss die klassischen Risikofaktoren und löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2, Interleukin-18, löslichen Interleukin-1 Rezeptorantagonist, lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül-1, Matrix Metalloproteinase-9 und Fibrinogen als die Repräsentativen des Clusters der akute Phase Reaktanten ein. Die durch das Modell ausgewählten Variablen waren lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül-1 (P<0,001), löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (P=0,013), Interleukin-18 (P=0,018) und Fibrinogen (P=0,019).
Prospektive Evaluierung eines entzündlichen Werts auf kardiovaskulären Ausgang
Basierend auf diesen Ergebnissen erzeugten die Erfinder einen entzündlichen Wert, der die oberen Drittel von löslichem Tumornekrosefaktor-Rezeptor-2, löslichem vaskulärem Adhäsionsmolekül-1, Interleukin-18 und Fibrinogen zusammenfasste. Der Wert eines Individuums wurde als die Zahl von Marker in dem oberen Drittel definiert. Der Wert variierte von 0 bis 4, mit 24,9% (26,3%), 34,3% (35,4%), 26,6% (23,7%), 10,9% (11%) und 3,3% (3,6%) of Patienten mit stabiler Angina (jeweils akutes Koronarsyndrom) die jeweils 0, 1, 2, 3 und 4 Marker im oberen Drittel aufwiesen.
Der entzündliche Wert war stark mit kardiovaskulärem Ausgang assoziiert, auf eine sehr ähnliche Weise in stabiler Angina- und akutem Koronarsyndrom-Patienten (Tabelle 3). Patienten, die drei erhöhte Marker aufwiesen, wiesen eine 4-fache Erhöhung an Gefährdung auf, verglichen mit Patienten, die keinen erhöhten Marker aufwiesen, während diejenigen mit vier erhöhten Markern eine 7- bis 8-fache Erhöhung an Gefährdung hatten. Die Anpassung an klassische Risikofaktoren modifizierte die Hazard-Verhältnisse wenig (Tabelle 3). 3 stellt die Kaplan-Meier Überlebenskurven nach dem entzündlichen Wert in stabilen Angina- (Panel A) und akutes Koronarsyndrom- (Panel B) Patienten dar.
Um zu bestimmen, ob der entzündliche Wert, der diese 4 Marker einschloss im Hinblick auf Information besser als Werte mit weniger Markern war, verglichen die Erfinder den AIC Wert des Cox Modells basierend auf dem 4-Marker Wert mit denjenigen der besten 1-Marker-, 2-Marker- und 3-Marker-Werte (4). Das minAIC wurde für den 4-Marker Wert erhalten (auf 0 gesetzt) und wurde als die beste empirische Stützung aufweisend betrachtet. Werte die eine geringere Zahl von Markern aufwiesen hatten eine schlechtere empirische Stützung (AIC Differenz ≥4), wohingegen das best Modell basierend auf einem 5-Marker nicht dem 4-Marker Wert im Hinblick auf Information überlegen war (AIC Differenz < 2). Als ein Maß der klinischen Brauchbarkeit untersuchten die Erfinder, ob der entzündliche Wert zusätzliche Information über die durch traditionelle Risikofaktoren hinaus hinzufügte. Die Hinzufügung des entzündlichen Werts zu herkömmlichen Risikofaktoren erhöhte die Fläche unter der Receiver-operating-Charakteristika Kurve von 0,63 auf 0,68, Tabelle 1. Basislinien-Charakteristika von Patienten mit und ohne kardiovaskulärem Ereignis während der Nachfolgezeit
Kategorische Variablen sind als Prozent von Patienten, kontinuierliche Variablen sind als Alters- und Geschlecht-angepasste Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben

* Der Zusammenhang zwischen kardiovaskulärem Ausgang und jeder Variable (kategorisch oder kontinuierlich) wurden durch Cox Regressionsanalyse, eingestellt auf Alter und Geschlecht, bestimmt
† Die Ausstoßfraktion wurde bei 1083 Patienten bestimmt.

ACE: – Angiotensin überführendes Enzym
CAD: – Koronare Arterienerkrankung
MI: – Myokardinfarkt

* Eingestellt auf Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, Rauchen, Geschichte von Bluthochdruck oder Diabetes, HDL-Cholesterin, Statintherapie und die Zahl von erkrankten Gefäßen

Beispiel 2 - Resistin
Methoden: Bei 1194 Patienten mit dokumentierter KHK wurde zum Zeitpunkt des Studieneinschlusses Resistin (ng/ml) bestimmt. Patienten präsentierten sich mit stabiler Angina pectoris (AP), Troponin negativer instabiler AP, subakuten und akuten Myokardinfarkt (MI). Während des Beobachtungszeitraumes von 3,2 ± 0,9 Jahren wurde ein Follow up (f/u) bei 1171 Patienten (98,1 %) durchgeführt.
Ergebnisse: Es besteht eine signifikante Assoziation zwischen Resistin Konzentration und Troponin negativer instabiler AP sowie AMI (Tabelle 4). Bei Patienten mit erhöhtem Mortalitätsrisiko ist Resistin erhöht (5,8 ng/ml vs. 6,6 ng/ml; p=0,068). Der Anstieg pro Standardabweichung geht mit einem 1,3fach (95% CI 1,1-1,5; p=0,008) erhöhten Mortalitätsrisiko einher.
Nach Einstellung auf Alter und Geschlecht besteht eine signifikante Assoziation mit zukünftigen kardialen Ereignissen (Hazard Risiko Verhältnis (HRR) 1,2 (95% CI 1,0-1,5; p=0,02). Diese Assoziation bleibt nach Einstellung auf Diabetes und Nikotin nicht mehr unabhängig signifikant, da Diabetes (p=0,08) und Nikotin (p=0,06) starke Resistin- sowie Mortalitätsprädiktoren darstellen. Tabelle 4

Plasmakonzentration des Kesistins (ng/ml)

Bei Patienten mit Brustschmerz besitzt Resistin somit eine hohe Aussagekraft über das Risiko eines akuten Koronarsyndroms und ist moderat mit dem Mortalitätsrisiko assoziiert.
Beispiel 3 – Caspase-1;
Tabelle 5 Hazard-Verhältnisse von zukünftigem kardiovaskulären Ereignis gemäß Quartilen von Caspase-1 Plasmakonzentration

Modell 1 ist nicht kontrolliert; Modell 2 ist kontrolliert auf Alter und Geschlecht; Modell 3 ist zusätzlich kontrolliert auf BMI, Geschichte von Hochdruck, Diabetes, Rauchen, HDL-Cholesterinspiegel, FH
Modell 4 zusätzlich eingestellt auf multiple Gefäßerkrankung, Statin und beta-Blockertherapie, ACS
Modell 5 wird durch Forward-Wahrscheinlichkeits-Verhältnis variable Auswahl aus allen Variablen in Modell 4 erhalten

Modell 1 Variablen in der Gleichung
Modell 2 Variablen in der Gleichung
Modell 3 Variablen in der Gleichung
Modell 4 Variablen in der Gleichung
Modell 5 Variablen in der Gleichung
Beispiel 4 – TIMP-1
Studienpopulation
Zwischen Juni 1999 und Februar 2004 wurden 1979 Patienten in das AtheroGene Register wie in Beispiel 1 aufgenommen. Zusätzlich wurden Diabetes mellitus, Bluthochdruck und Hyperlipoproteinämie diagnostiziert und die Patienten nach ihren Rauchgewohnheiten aufgeteilt.
Eine Gesamtzahl von 1945 (98,4%) Patienten wurde während einer mittleren Zeitdauer von 2,6 (Maximum 5,0) Jahren nach-verfolgt. Es gab 75 Tote aus kardiovaskulären Gründen, 33 Tote aus anderen Gründen, und 47 nicht fatale Myokardinfarkte und 49 nicht fatale Schlaganfälle. Die Information über die Todesursache oder klinische Ereignisse wurden aus Krankenhaus- oder Arztpraxisakten erhalten.
Laborverfahren
Blut wurde von allen Studiensubjekten unter standardisierten Bedingungen abgenommen, bevor die Koronarangiographie durchgeführt wurde. Die Proben wurden bei 4000 g für 10 Minuten zentrifugiert, in Aliquots aufgeteilt und bei –80°C bis zur Analyse gelagert. Serum TIMP-1 wurde unter der Verwendung der ELISA Technik gemäß den Anweisungen des Herstellers (Human, Biotrak, ELISA System, Amersham Biosciences, USA) mit einem Bereich von 3,1 – 50 ng/ml bestimmt. Der Test wies einen innerhalb des Tests Koeffizienten der Variation von zwischen 8,9 – 11,4 % und einen zwischen den Tests Koeffizienten der Variation von zwischen 13,1 – 15,25 % auf.
Plasma BNP wurde unter der Verwendung eines Fluoreszenz Immuntest (Biosite Diagnostics Inc., San Diego, Kalifornien) bestimmt. Die angegebene Nachweisgrenze ist weniger als 5 pg/ml. Der Test wies einen zwischen den Tests Koeffizienten der Variation von nahe 10 % auf, und eine Ausbeute von 100% von hinzugefügtem Peptid wurde gefunden. C-reaktives Protein und Lipid Serumspiegel wurden wie in Beispiel 1 und durch Standardverfahren bestimmt.
Statistische Analyse
Mittlere Spiegel und Anteile von Basislinien kardiovaskulären Risikofaktoren wurden für Patienten mit und ohne kardiovaskulärem Tod berechnet. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Mitteln für die zwei Gruppen wurde mit dem Studenten t-Test ermittelt, und die Signifikanz der Unterschiede in Anteilen wurde mit der chi-Quadrat Statistik getestet. Variablen mit einer verzerrten Verteilung wurden als Mediane dargestellt und der Mann-Whitney-U Test wurde angewendet. Um die Assoziierung zwischen TIMP-1 und Überleben zu untersuchen, verwendeten die Erfinder das Kaplan-Meier Verfahren und den log-rank Test. Der primäre Endpunkt war Tod aus kardiovaskulären Gründen. Die Daten von Patienten, die aus anderen Gründen starben wurden zum Zeitpunkt des Todes zensiert. Um die Verteilung von verzerrten Variablen zu normalisieren, wurde eine log Transformation durchgeführt. Zusätzlich, um den unabhängigen prädiktiven Wert von Dritteln von TIMP-1 Spiegel auf das Risiko von kardiovaskulärem Tod anzuzeigen, wurden verschiedene Cox Regressionsmodelle durchgeführt. Das erste Modell wurde auf Alter und Geschlecht angepasst und das zweite zusätzlich auf traditionelle Risikofaktoren sowie klinische und therapeutische Variablen. Eine weitere Einstellung wurde für Ausstoßfraktion (Modell 3) vorgenommen und zuletzt für andere kardiovaskuläre Biomarker (Modell 4). Subgruppen-Analysen wurden durch Konstruieren von Cox Regressionsmodellen durchgeführt, wobei die oberen gegenüber den unteren Dritteln von TIMP-1 verglichen wurden. Zuletzt wurde die prognostische Stärke von neuen Biomarkern durch Berechnen der Hazard Verhältnisse für das obere Drittel jedes Biomarkers in verschiedenen Cox Regressionsmodellen, eingestellt auf kardiovaskuläre Confounder, und zusätzlich für alle drei Marker gleichzeitig verglichen. Die Hazard Verhältnisse und 95 Prozent Konfidenzintervalle sind dargestellt. Die P Werte sind zweiseitig; Werte von p < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Alle Berechnungen wurden unter der Verwendung des SPSS Version 11,05 Programms verglichen.
Basislinien Charakteristika
Tabelle 6 stellt die Basislinien Charakteristika der 75 Studien-Teilnehmer zur Verfügung, die anschließend aus kardiovaskulären Gründen starben und der 1870, die kein zukünftiges kardiovaskuläres Ereignis hatten. Die linke ventrikuläre Ausstoßfraktion, wie durch Angiographie bestimmt, war signifikant höher in Patienten ohne kardiovaskulären Tod (P < 0,001). Tabelle 6: Basislinien Charakteristika
Der TIMP-1 Spiegel war unter den Studien-Teilnehmern normal verteilt. Er reichte von 6,0 bis 2667 ng/ml, mit einem Mittel (± SD) von 699 ± 225, einem Median von 676 und einem interquartilen Bereich von 561 bis 803 ng/ml. Der Basislinien Spiegel der TIMP-1 Aktivität war signifikant höher zwischen denjenigen, die aus kardiovaskulären Ursachen starben, als zwischen denjenigen, die nicht daran starben (820 gegenüber 692 ng/ml; P < 0,0001). Wie erwartet, waren in Patienten mit zukünftigem kardiovaskulärem Tod BNP (P < 0,0001), CRP (P < 0,0001) und Creatinin (P < 0,0001) signifikant erhöht.
Prädiktoren von TIMP-1
Tabelle 7 stellt jeweils die mittleren und medianen Spiegel von entzündlichen Markern dar, wie zum Beispiel TIMP-1, CRP und BNP, gemäß der Prävalenz von traditionellen Risikofaktoren und klinischen Variablen. TIMP-1 war signifikant höher unter Patienten mit Diabetes, Bluthochdruck und schwerer Gefäßerkrankung. Patienten, die Statinmedikation erhielten, wiesen niedrigere TIMP-1 Spiegel auf. Interessanterweise korrelierten TIMP-1 Spiegel invers mit der Rauchergeschichte. Tabelle 7; mediane Spiegel von entzündlichen Markern
TIMP-1 und zukünftiges kardiovaskuläres Ereignis
5 zeigt die Kaplan-Meier Kurven für Ereignis-freies Überleben, gemäß Dritteln von TIMP-1 Spiegel. Die nicht-eingestellte Rate an kardiovaskulärem Tod war am höchsten in Patienten innerhalb des oberen Drittels an TIMP-1 Spiegel (P log rank < 0,0001). Wichtigerweise wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wenn die Analyse gemäß Patienten, die mit stabiler Angina (P log Rang über Drittel = 0,002) und akutem Koronarsyndrom (6; P log Rang über Drittel = 0,0005) präsentiert wurden, stratifiziert wurde.
Tabelle 8 zeigt die Hazard-Verhältnisse für kardiovaskulärem Tod, assoziiert mit Dritteln von TIMP-1 Spiegel. Um den unabhängigen prädiktiven Wert zu ermitteln, verwendeten die Erfinder verschieden Cox prädiktive Modelle. Das Hazard-Verhältnis von zukünftigem kardiovaskulärem Tod stieg mit ansteigenden Dritteln an (P = 0,001) so dass Patienten innerhalb des obersten Drittel von TIMP-1 Spiegel ein 2,54faches (95% CI 1,38 bis 4,68; P = 0,003) erhöhtes Risiko, verglichen zu Individuen als innerhalb des untersten Drittels in einem Alters- und Geschlecht-eingestellten Modell hatten. Die Hazard-Verhältnisse verblieben nach Einstellung auf kardiovaskuläre Risikofaktoren und klinische Merkmale (Modell 2) nahezu unverändert. Eine weitere Einstellung auf Ausstoßfraktion (Modell 3) sowie C-reaktives Protein und B-Typ natriuretisches Peptid (Modell 4) veränderte die mit TIMP-1 Spiegel assoziierten Hazard-Verhältnisse auch nicht. Tabelle 8: Hazard-Verhältnisse für kardiovaskulärem Tod, assoziiert mit Dritteln von TIMP-1 Spiegel.
Die Hazard-Verhältnisse von zukünftigem kardiovaskulärem Tod, assoziiert mit dem obersten Drittel von TIMP-1 Spiegel, waren in allen analysierten Untergruppen ähnlich.
Vergleichende Analysen von kardiovaskulärem Biomarker
Zuletzt platzierten die Erfinder die prädiktive Stärke von TIMP-1 in den Kontext von denjenigen, die von den neuen biologischen Markern CRP und BNP (7) erhalten wurde. Wenn getrennt in ein auf Alter, Geschlecht und herkömmliche Risikofaktoren angepasstes Modell, ergab BNP die stärkste Assoziierung mit zukünftigem kardiovaskulärem Tod (HR 3,4, 95% CI 2,0 bis 5,7; P < 0,0001), wohingegen die prädiktive Stärke von TIMP-1 und CRP eine ähnliche Größenordnung aufwies. Wenn auf die drei respektiven Marker gleichzeitig eingestellt, behielt TIMP-1 seine unabhängige Assoziierung mit zukünftigem kardiovaskulärem Tod bei, jedoch blieb BNP immer noch der stärkste prognostische Faktor.
Beispiels – ADMA
Studienpopulation
Eine genaue Beschreibung des Aufbaus der AtheroGene Studie wurde bereits vorher beschrieben. Zwischen Juni 1999 und Februar 2004 wurden 1908 Patienten wie in Beispiel 1 aufgenommen. Zusätzlich wurden Diabetes mellitus, Bluthochdruck und Hyperlipoproteinämie diagnostiziert und die Patienten nach ihren Rauchgewohnheiten aufgeteilt.
Eine Gesamtzahl von 1874 (98,2 %) Patienten wurde während einer mittleren Zeitdauer von 2,6 (Maximum 5,0) Jahren nach-verfolgt. Es gab 69 Tote aus kardiovaskulären Gründen, 32 Tote aus anderen Gründen, und 45 nicht fatale Myokardinfarkte und 45 nicht fatale Schlaganfälle. Die Information über die Todesursache oder klinische Ereignisse wurden aus Krankenhaus- oder Arztpraxisakten erhalten.
Laborverfahren
Blut wurde von allen Studiensubjekten wie in Beispiel 1 abgenommen und gelagert.
Asymmetrisches Dimethylarginin wurde aus Serumproben durch kompetitive Enzym verknüpften Immunabsorbent-Test (DLD Diagostika GmbH, Hamburg, Germany) mit einem Bereich von 0,1 μmol/l bis 5,0 μmol/l durchgeführt. Die Nachweisspezifität ist 0,05 μmol/l. Die Kreuzreaktivität mit Methylargininen ist als gering angegeben (Arginin <0,02 Prozent; N^G-Monomethyl-L-Arginin 1,0 Prozent; symmetrisches Dimethylarginin 1,2 Prozent).
Plasma BNP wurde unter der Verwendung eines Fluoreszenz Immuntest (Biosite Diagnostics Inc., San Diego, Kalifornien) bestimmt. Die angegebene Nachweisgrenze ist weniger als 5 pg/ml. Der Test wies einen zwischen den Tests Koeffizienten der Variation von nahe 10 % auf, und eine Ausbeute von 100% von hinzugefügtem Peptid wurde gefunden. C-reaktives Protein- und Lipid-Serumspiegel wurden wie in Beispiel 1 und durch Standardverfahren bestimmt.
Statistische Analyse
Mittlere Spiegel und Anteile von Basislinien kardiovaskulären Risikofaktoren wurden für Patienten mit und ohne kardiovaskulärem Tod berechnet. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Mitteln für die zwei Gruppen wurde mit dem Studenten t-Test ermittelt, und die Signifikanz der Unterschiede in Anteilen wurde mit der chi-Quadrat Statistik getestet. Variablen mit einer verzerrten Verteilung wurden als Mediane dargestellt und der Wilcoxon Rang-Summen Test wurde angewendet. Die kumulativen Ereignisplots gemäß Dritteln von asymmetrischem Dimethylarginin wurden durch das Kaplan-Meier Verfahren abgeschätzt und mit der Verwendung des log-Rang Test verglichen. Der primäre Endpunkt war Tod aus kardiovaskulären Gründen oder nicht-fatalem Myokardinfarkt. Die Daten von Patienten, die aus anderen Gründen starben wurden zum Zeitpunkt des Todes zensiert. Um die Verteilung von verzerrten Variablen zu normalisieren, wurde eine log Transformation durchgeführt und das Hazard-Verhältnis pro ein Standardabweichung-Inkrement angewandt. Zusätzlich wurden die Hazard-Verhältnisse für zukünftiges koronares Ereignis gemäß Dritteln von asymmetrischem Dimethylarginin durch Cox Regressionsmodelle, eingestellt auf potentielle Confounder, abgeschätzt. Drei eingestellte Modelle wurden konstruiert. Die Erfinder stellten zunächst auf Alter und Geschlecht ein und Zweitens auf andere traditionelle und klinische Risikofaktoren. Das finale Modell schloss klinische und therapeutische Variablen sowie C-reaktives Protein und B-Typ natriuretisches Peptid ein. Weiterhin wurde die Stärke von asymmetrischem Dimethylarginin, B-Typ natriuretischem Peptid, C-reaktivem Protein und Creatinin für kardiovaskulärem Risikovorhersage verglichen. Daher wurden Cox prädikative Modelle für das obere Drittel von jeder Variable, eingestellt auf kardiovaskuläre Confounders (Modell 2), und zusätzlich für alle drei Marker gleichzeitig (Modell 3), berechnet. Die Hazard-Verhältnisse und 95 Prozent Konfidenzintervalle sind angegeben. Um einen potentielle Anstieg in der prädiktiven Information im Hinblick auf zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse zu ermitteln, wurden Bereiche unter den Receiver-Operating-Kurven für die kombinierte Analyse von traditionellen Risikofaktoren (Modell 1) und einzelner Biomarker-Bestimmung, sowie gleichzeitiger Ermittlung aller vier Marker zusätzlich zu klassischen Risikofaktoren berechnet. Die P Werte sind zweiseitig; Werte von p < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Alle Berechnungen wurden unter der Verwendung des SPSS Version 11,05 Programms verglichen.
Basislinien Charakteristika
Das mittlere Alter der Studienteilnehmer war 61,0 ± 9,8 Jahre, 79,1 Prozent waren männlich. Die Konzentration an asymmetrischem Dimethylarginin war unter den Studienteilnehmern leicht verzerrt: Sie reichte von 0,07 bis 7,49 mit einem Mittel von 0,68 und einem Median von 0,63 μmol/l mit einem 25^th/75^th interquartil-Bereich von 0,53/0,74 μmol/l. Patienten, die mit akutem Koronarsyndrom präsentiert wurden, hatten ähnliche asymmetrische Dimethylarginin Konzentrationen, verglichen zu stabiler Angina-Patienten (0,63 gegenüber 0,64 μmol/l; P=0,72). Die Basislinien-Konzentration an asymmetrischem Dimethylarginin war signifikant höher zwischen denjenigen, die aus kardiovaskulären Ursachen starben, als zwischen denjenigen, die nicht daran starben. Wie erwartet, waren in Patienten mit zukünftigem kardiovaskulärem Ereignis die Plasmaspiegel von B-Typ natriuretischem Peptid (P<0,001), C-reaktivem Protein (P<0,001) und Creatinin (P<0,001) erhöht. Weitere Charakteristika der 114 Studienteilnehmer, die ein kardiovaskuläres Ereignis entwickelten und der 1760, die dies nicht taten, sind in Tabelle 9 angegeben, die asymmetrischen Dimethylarginin Spiegel waren weder signifikant mit Alter oder Geschlecht assoziiert. Der stärkste Prädiktor des Spiegels an asymmetrischem Dimethylarginin waren Raucherstatus und Diabetes. Signifikant höhere Serumkonzentrationen wurden in laufenden und jemals Rauchern gegenüber niemals Rauchern gemessen (0,64 gegenüber 0,61 μmol/l in Nichtrauchern; P=0,002). Diabetische Patienten zeigten erhöhte asymmetrischem Dimethylarginin Spiegel im Vergleich mit nicht-Diabetikern (0,65 gegenüber 0,63 μmol/L; P=0,012). Keine Assoziierung von Serumkonzentrationen und einer Geschichte von Bluthochdruck oder einem erhöhten Body-Mass-Index wurde nachgewiesen. Tabelle 9 Basislinien Charakteristika
Keine Korrelation wurde zwischen asymmetrischem Dimethylarginin Spiegel und C-reaktivein Protein, B-Typ natriuretischem Peptid oder jeglichem Lipidspiegel (Lipoprotein hoher Dichte: r = –0,02; Lipoprotein geringer Dichte: r = –0,01) beobachtet. Jedoch wurde eine moderate Beziehung zwischen C-reaktivem Protein und B-Typ natriuretischem Peptid beobachtet (r = 0,34).
Auftreten von anschließendem Ereignis
Tabelle 10 stellt die Assoziierung von ein Standardabweichung-Inkrement in log asymmetrischem Dimethylarginin Werten mit zukünftigem kardiovaskulärem Ereignis zur Verfügung. Die Erhöhung des asymmetrischen Dimethylarginin Spiegels war mit einem erhöhten Risiko von kardiovaskulärem Tod (Erhöhung of 42 Prozent für asymmetrisches Dimethylarginin für jedes Inkrement von 1 Standardabweichung in log transformierten asymmetrischen Dimethylarginin-Werten), koronarem Ereignis und Schlaganfall assoziiert. Nach Einstellung auf klinische und therapeutische Variablen blieben diese Assoziierungen unabhängig signifikant. Im Gegensatz wurde keine signifikante Assoziierung zwischen asymmetrischem Dimethylarginin-Werten und Tod aus anderen als kardiovaskulären Gründen (Hazard-Verhältnis 1,14; 95 Prozent Drittel 0,86 bis 1,52; P=0,36) beobachtet. Der primäre Endpunkt der Studie war Tod aus kardiovaskulären Gründen und nicht-fatales Koronarereignis. 8 stellt die Kaplan-Meier Kurven für Ereignis-freies Überleben gemäß Dritteln am asymmetrischem Dimethylarginin-Spiegel zur Verfügung. Die nicht eingestellte kardiovaskuläre Ereignisrate erhöhte sich auf eine schrittweise Art über die ansteigenden Drittel von Basislinien asymmetrischen Dimethylarginin-Spiegeln (P< 0,001). Um den unabhängigen prädiktiven Wert von asymmetrischem Dimethylarginin Konzentration zu ermitteln, führten die Erfinder eine Reihe von Cox prädiktiven Modellen durch (Tabelle 11). In einem Alters und Geschlecht eingestellten Modell, zeigten Individuen in dem oberen Drittel eine 2,47 Erhöhung (95 Prozent Konfidenzintervall 1,51 bis 4,03) in kardiovaskulärem Risiko, verglichen zu denen in dem ersten Drittel. Eine weitere Einstellung auf klinische und therapeutische Variablen sowie C-reaktives Protein, Creatinin, und B-Typ natriuretisches Peptid veränderte das mit asymmetrischem Dimethylarginin Konzentration assoziierte Hazard-Verhältnis nicht. Tabelle 10
Tabelle 11
Vergleichende Analysen von kardiovaskulärem Biomarker
Um den prädiktiven Wert an Basislinie asymmetrischem Dimethylarginin Spiegel in den Kontext von denjenigen wie erhalten aus Messungen von B-Typ natriuretischem Peptid, C-reaktivem Protein und Creatinin-Spiegel als ein Maß der Nierenfunktion zu platzieren, wandten die Erfinder zwei Cox prädiktive Modelle an, wie in 9 angegeben, Werte oberhalb der oberen Tertile von asymmetrischem Dimethylarginin (>0,70 μmol/l), B-Typ natriuretischem Peptid (>102,31 pg/mL), Creatinin (>1,02 mg/dL), und C-reaktivem Protein (>5,44 mg/l) waren unabhängig mit einer Erhöhung im Risiko von kardiovaskulärem Ereignis von jeweils 76 Prozent, 124 Prozent, 78 Prozent, und 91 Prozent assoziiert, in einem Modell, das auf potentielle kardiovaskuläre Confounder angepasst war. In multivariablen Analysen, die zusätzlich alle Marker gleichzeitig einschlossen, ergaben asymmetrisches Dimethylarginin (Hazard-Verhältnis 1,87, 95 Prozent Konfidenzintervall 1,25 bis 2,78) und B-Typ natriuretisches Peptid (Hazard-Verhältnis 1,92, 95 Prozent Konfidenzintervall 1,25 bis 2,95) den stärksten prädiktiven Wert. Der Bereich unter der Receiver-Operating-Kurve, 0,67 in dem Modell, das alle traditionellen Risikofaktoren einschloss, erhöhte sich moderat mit zusätzlichem B-Typ natriuretischem Peptid oder asymmetrischem Dimethylarginin (Bereich unter der Kurve: 0,69). Wenn alle Marker gleichzeitig eingeschlossen wurden, erhöhte sich der Bereich unter der Receiver-Operating-Kurve auf 0,71,

Claims

Verfahren zur Analyse von Proben in Zusammenhang mit akuten kardiovaskulären Erkrankungen, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Zur Verfügung stellen einer zu untersuchenden biologischen Probe aus einem Subjekt; (b) Bestimmen der Konzentration von mindestens einem Entzündungsmarker, ausgewählt aus Fibrinogen, sTNFR-2, IL-18, ADMA, Caspase-1, TIMP-1, Resistin und sVCAM-1, (c) gegebenenfalls, Bestimmen der Konzentration mindestens eines weiteren Marker ausgewählt aus sTNFR-1, Troponin T (TnT), IL-6, CRP, Selektin(en), CD40, Lipoproteinassoziierte Phospholipase A2 und weiteren entzündlichen Markern, und (d) Vergleich des/der für die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisse/s mit Referenzwerten und/oder den Werten aus Referenzproben.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe aus einem Menschen stammt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zu untersuchende Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus peripherem Blut oder Fraktionen davon und Zellkultur-Suspensionen oder Fraktionen davon.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die zu untersuchende Probe Blutplasma ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei dem peripheren Blut ein Gerinnungshemmer, insbesondere Heparin, zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die analysierten Marker und Kombinationen daraus ausgewählt sind aus Fibrinogen + sTNFR-2, Fibrinogen + IL-18, Fibrinogen + sVCAM-1, Fibrinogen + ADMA, Fibrinogen + Caspase-1, Fibrinogen + TIMP-1, Fibrinogen + Resistin, sTNFR-2 + IL-18, sTNFR-2 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA, sTNFR-2 + Caspase-1, sTNFR-2 + TIMP-1, sTNFR-2 + Resistin, IL-18 + sVCAM-1, IL-18 + ADMA, IL-18 + Caspase-1, IL-18 + TIMP-1, IL-18 + Resistin, sVCAM-1 + ADMA, sVCAM-1 + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-1, sVCAM-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1, ADMA + TIMP-1, ADMA + Resistin, Caspase-1 + TIMP-1, Casapse-1 + Resistin, TIMP-1 + Resistin, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18, Fibrinogen + sVCAM-1 + IL-18, Fibrinogen + ADMA + IL-18, Fibrinogen + Caspase-1 + IL-18, Fibrinogen + TIMP-1 + IL-18, Fibrinogen + Resistin + IL-18, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA + sVCAM-1, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1, sTNFR-2 + TIMP-1 + sVCAM-1, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1, IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, IL-18 + TIMP-1 + ADMA, IL-18 + Resistin + ADMA, sVCAM-1 + ADMA + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1, sVCAM-1 + Resistin + Caspase-1, ADMA + Caspase-1 + TIMP-1, ADMA + Resistin + TIMP-1, Caspase-1 + TIMP-1 + Resistin, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, Fibrinogen + ADMA + IL-18 + Caspase-1, Fibrinogen + TIMP-1 + IL-18 + Resistin, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-1, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1 + IL18, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-1, IL-18 + Resistin + ADMA + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1 + TIMP-1 + Resistin, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, Fibrinogen + TIMP-1 + IL-18 + Resistin + sTNFR-2, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-1 + sTNFR-2, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-1 + Resistin, sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1 + Resistin + ADMA, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-1, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-1 + sTNFR-2 + IL-18, Fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1 + Resistin + ADMA, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-1 + Caspase-1, Fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-1 + Caspase-1 + Resistin + ADMA + sTNFR-2 und Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + Caspase-1 + TIMP-1 + Resistin + sVCAM-1,
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die analysierten Marker und Kombinationen daraus ausgewählt sind aus Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 und Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + Caspase-1 + TIMP-1 + Resistin + sVCAM-1,
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Bestimmen der Konzentration mittels eines immunologischen Verfahrens mittels an die Marker bindenden Moleküle erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus anti-Marker-Antikörpern oder Teilen davon und Marker-Rezeptoren oder Teilen davon.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Antikörper, Teile oder Fragmente davon polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Fab-Fragmente, scFv-Fragmente und Diabodies umfassen.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Marker und/oder die an die Marker bindenden Moleküle in Lösung oder Matrix-immobilisiert vorliegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die an die Marker bindenden Moleküle an eines oder mehrere Nachweisgruppen aus der Gruppe bestehend aus Fluoresceinthioisocyanat, Phycoerythrin, einem Enzym und magnetisches Bead gekoppelt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die an die Marker bindenden Moleküle mit einem Antikörper, an den eine oder mehrere Nachweismoleküle gekoppelt sind, nachgewiesen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die immunologischen Verfahren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sandwich-Enzym-Immuntest, ELISA und Festphasen-Immuntests.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die kardiovaskulären Erkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus instabiler Angina, Myokardinfarkt, akutem Herzsyndrom, koronarer Arterienerkrankung und Herzinsuffizienz.
Diagnostischer Kit, umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Komponenten und/oder Hilfsstoffen.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Kits nach Anspruch 16 zur Diagnose und/oder Prognose akuter kardiovaskulärer Erkrankungen und/oder zur Überwachung von deren Therapie.