DE3788807T2

DE3788807T2 - Fusionsproteine und -partikel.

Info

Publication number: DE3788807T2
Application number: DE3788807T
Authority: DE
Inventors: Sally Adams; Alan Kingsman; Susan Kingsman; Michael Malim; Elizabeth-Jane Mellor
Original assignee: British Bio Technology Ltd
Current assignee: Vernalis R&D Ltd
Priority date: 1986-11-01
Filing date: 1987-10-28
Publication date: 1994-06-30
Anticipated expiration: 2007-10-29
Also published as: AU8105787A; ES2010231A6; EP0330661B1; JP2708046B2; WO1988003563A1; EP0330661A1; NO177793C; NO882917L; JPH09248191A; DE3788807D1; NO177793B; CA1339263C; JPH02501026A; AU606896B2; NO882917D0

Description

WISSENSCHAFTLICHER BEREICH

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Antigendarbietungs- und reinigungssystem. In besonderen Ausführungsbeispielen betrifft sie Partikel, die von dem Hefe-Retrotransposon Ty kodiert werden, einen Vektor, der das Gen zur Partikelbildung enthält, einen Vektor für die hochwertige Expression von Fusionen des Partikelproteins und einem Antigen und ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung dieser Fusionsproteine in Hefe.

WISSENSCHAFTLICHER HINTERGRUND

Eine der wichtigsten Anwendungen der neuen rekombinanten DNA-Technologie ist die Herstellung von sicheren Impfstoffen gegen infektiöse Erkrankungen und die Synthese von definierten Proteinen, gegen welche Antiseren zu experimentellen, industriellen und diagnostischen Zwecken gebildet werden können. Theoretisch können diese Zielsetzungen durch die Synthese von geeigneten Antigenen in Mikroorganismen wie der Hefe Saccharomyces cerevisiae erreicht werden. Das Antigen würde von einem geeigneten Expressionsvektor, wie zum Beispiel in der Europäischen Patentanmeldung EPA2-0073635 beschrieben, exprimiert werden.
Die korrekte Darbietung des Antigens in einem tierischen oder menschlichen Immunsystem ist eine kritische Anforderung für einen effektiven Untereinheitenimpfstoff oder ein Immunogen. Die Darbietung ist bei potentiellen Impfstoffen und Immunogenen, die durch rekombinante DNA hergestellt werden, wie auch bei jenen, die auf chemisch synthetisierten Epitopen basieren, ein wesentliches Problem. Ein ideales Immunogen ist ein Polymer von zahlreichen Antigen-Determinanten, die in einem Träger mit hohem Molekulargewicht zusammengefügt werden. Ein gutes Immunogen sollte auch die maximale Anzahl an exponierten Epitopen aufweisen. Diese Anforderungen können durch zufällige chemische Kopplung von Antigenen an einen Träger schwer erfüllt werden. Eine ideale Situation entstünde bei einer Darbietung des Antigens in der korrekten Konformation an der Oberfläche eines großen Partikelkomplexes. Ferner würde die partikuläre Eigenschaft eines solchen Systems die Reinigung des Antigen durch einfache physikalische Mittel erleichtern.
Diese Anforderungen werden kaum durch die einfache Synthese von monomeren Proteinen durch rekombinante DNA Technologie oder chemische Synthese erfüllt.
Vor der vorliegenden Erfindung basierte das einzige selbstbildende partikuläre Antigendarbietungssystem zur Herstellung von Immunogenen in Hefe auf der Fusion von Antigenen (z. B. dem Herpes Simplex Virus I (HSV-I) Glycoprotein D oder einem Poliovirusantigen) mit dem Hepatitis B Oberflächenantigen (HBsAg) Protein durch rekombinante DNA Technologie (Valenzuela et al., 1985, Biotechnology 3, 323). Diese Fusionsproteine aggregieren zur Bildung von 22 nm Partikel. Dieses System weist ernsthafte Nachteile auf: 1) die Ausbeuten sind gering; 2) die Partikel bilden sich nicht in der Hefezelle, sondern sind ein Nebenprodukt des Extraktionsverfahrens (Hitzeman et al., 1983, Nucl. Acids Res. 11, 27450). Dadurch sind dem Herstellungsverfahren Grenzen gesetzt; 3) einige Fusionen bilden keine Partikel; 4) die HBsAg-Komponente übt in einigen Fälle eine Immunodominanz aus, d. h. Antikörper werden vorzugsweise gegen HBsAg gebildet. Kniskern et al. berichteten in Gene 46, 135 (1986), daß das Hepatitis B Core-Antigen (HBcAg) Partikel in Hefe mit sehr hohen Werten bildet, aber es gibt keinen veröffentlichten Bericht, daß es als Träger von anderen Epitopen verwendet wird. Da von diesen Partikeln berichtet wird, daß sie bei Mäusen höchst immunogen sind, könnten sie ähnlich wie die HBsAg Partikel Immunodominanz ausüben.
Ein entsprechendes System in Bakterien wurde von Haynes et al. (Bio/Technology 4, 637, 1986) berichtet. Das Tabakmosaikvirus (TMV) Hüllenprotein ist die Einheit, die sich zu einer partikulären Struktur zusammenfügt. Wenn das TMV-Hüllenprotein in E. coli exprimiert und dann gereinigt wird, ist es möglich, die Proteine in vitro zu Polyvalenten Partikeln zu vereinen. Fusionsproteine, die aus dem TMV-Hüllenprotein und einem weiteren Protein gebildet werden, können hybride Partikel erzeugen, die immunogen sind. Ein Polioepitop aus nur acht Aminosäuren wurde getestet und als immunogen nachgewiesen, obwohl es viermal weniger immunogen als der Salkimpfstoff war. Dieses System weist die möglichen Vorteile auf, daß die Größe des Partikels experimentell verändert werden kann und daß gemischte Partikel (d. h. Partikel, die mehr als eine Art von Epitop tragen) möglicherweise einfach herzustellen sind. Ein erwarteter Nachteil besteht jedoch darin, daß nur verhältnismäßig kleine Antigene dem TMV-Partikel beigegeben werden können.
Mellor et al. offenbaren in Nature 313, 243 (1985) ein Fusionsprotein, bestehend aus dem Produkt eines Hefe Ty offenen Leserasters ORF1 (nun als TYA Gen bezeichnet), eines offenen Leserasters ORF2 (nun als TYB Gen bezeichnet), und einer Nucleinsäure, die für Interferon kodiert. In dieser Schrift findet sich jedoch keine Offenbarung oder kein Hinweis, daß die erzeugten Fusionsproteine, oder tatsächlich irgendein Ty Protein zur Vereinigung zu Partikeln imstande ist oder sein könnte.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nun entdeckt, daß gewisse Proteine, die von dem genetischen Material von Retrotransposonen exprimiert werden, die Fähigkeit besitzen, selbst Partikel zu bilden. Es wurde auch entdeckt, daß es möglich ist, Fusionsproteine auf der Basis solcher, von Retrotransposonen abgeleiteten, selbstvereinenden Proteine zu konstruieren, die sich zu Antigen- (oder ein anderes biologisch aktives Molekül) darstellenden Partikel vereinen können. Eine weitere Entdeckung war, daß ähnliche Fusionsproteine auf der Basis von sich vereinigenden Proteinen von RNA-Retroviren konstruiert werden können.
Gemäß einem ersten Merkmal schafft die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein, das zur Partikelbildung imstande ist, welches Fusionsprotein eine erste Aminosäuresequenz und eine biologisch aktive zweite Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die erste Aminosäuresequenz im wesentlichen mit einem partikelbildenden Protein homolog ist, das durch ein Retrotransposon oder ein RNA-Retrovirus kodiert wird, wobei die zweite Aminosäuresequenz im wesentlichen nicht mit einem HIV-Antigen homolog ist und wobei, wenn die zweite Aminosäuresequenz mehr als dreißig Aminosäurereste enthält, die ersten dreißig Reste der zweiten Aminosäuresequenz keine Aminosäuresequenz bilden, die von Natur aus durch das Retrotransposon oder das RNA-Retrovirus direkt an die erste Aminosäuresequenz fusioniert ist.
Gemäß einem zweiten Merkmal schafft die Erfindung ein Partikel, bestehend aus einer Vielzahl von Fusionsproteinen, wobei jedes Fusionsprotein eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die erste Aminosäuresequenz im wesentlichen mit einem partikelbildenden Protein homolog ist, das durch ein Retrotransposon oder ein RNA-Retrovirus kodiert wird, und die zweite Aminosäuresequenz im wesentlichen nicht mit einem HIV-Antigen homolog ist, und wobei die zweite Aminosäuresequenz biologisch aktiv und nicht von Natur aus durch das Retrotransposon oder das RNA-Retrovirus an die erste Aminosäuresequenz fusioniert ist. Solche Partikel sind allgemein im wesentlichen rein, das heißt, zumindest 5 Gew.-%, 10 Gew.-%, 20 Gew.-%, 50 Gew.-%, 80 Gew.-%, 90 Gew.-%, 95 Gew.- % oder 99 Gew. - % rein, in zunehmender Reihenfolge der Bevorzugung.
Ein bestimmtes Partikel kann aus einer Vielzahl von verschiedenen Fusionsproteinen zusammengesetzt sein; das heißt, Fusionsproteinen mit untereinander unterschiedlichen zweiten Aminosäuresequenzen. In einem Partikel können zwei, drei oder sogar mehr unterschiedliche zweite Aminosäuresequenzen vorhanden sein.
Die erste Aminosäuresequenz kann das Produkt des Hefe Ty TYA Gens, das Produkt von Copia und copiaähnlichen Elementen von Insekten oder das gag Gen von RNA-Retroviren sein.
Retroviren umfassen das menschliche Immunschwächevirus I und II (HIV-I, HIV-II), SIV, menschliche T-Zellen lymphotrope Virus I und II (HTLV-I, HTLV-II), Mäuseleukämievirus, Moloney-Mäuseleukämievirus, Mäusemammatumorvirus, Vogel-Leukosevirus, Katzenleukämievirus, menschliche B-Zellen lymphotrope Virus und Rinderleukämievirus. Retrotransposone, wie oben erwähnt, umfassen das Ty Element von Hefe, die und copiaähnliche Copiaelemente von Insekten wie Drosophilia melanogaster, VL30 bei Mäusen und IAP Gene von Mäusen. Zu bevorzugten Retrotransposonen zählt das Hefe Retrotransposon Ty. Es wurde kürzlich nachgewiesen, daß Ty die Synthese von 60 nm virusähnlichen Partikeln (Ty-VLPs) steuert (Mellor et al., 1985a, Nature 318, 513). Es wurde nun entdeckt, daß das p1 Protein, das von dem TYA Gen kodiert wird, stabil ist und anscheinend keine weitere Bearbeitung benötigt. Daher ist die Ty-kodierte Aminosäuresequenz vorzugsweise das von dem TYA Gen kodierte p1 Protein. Es ist bekannt (Fulton et al., NAR L3(11), 1985, 4097), daß beide Klassen (I und II) von Ty p1 erzeugen; so kann jede Klasse verwendet werden. Die Ty-kodierte Aminosäuresequenz muß nicht die ganze des p1 Proteins sein; statt dessen kann sie ein Teil des p1 Proteins sein, das von einem Teil des TYA Gens kodiert wird, welcher Teil imstande ist, die Synthese von Ty virusähnlichen Partikeln (Ty-VLPs) zu steuern. Es wurde bestimmt, daß ein Teil der Aminosäuresequenz 286 bis 381 (Fig. 16) zur Partikelbildung benötigt wird. Vorzugsweise ist die Ty-kodierte Aminosäuresequenz von Ty 1-15 ableitbar. Das Stoppkodon am Ende des TYA Gens ist vorzugsweise nicht enthalten; wenn es jedoch enthalten ist, kann das Fusionsprotein weiter exprimiert werden, wenn auch mit geringer Ausbeute, und es scheint, daß das Stoppkodon mit einer Häufigkeit von o etwa einmal von zwanzigmal durch den Rasterverschiebungsmechanismus, der von Wilson et al. beschrieben wurde (NAR 14(17), 1986, 7001) ignoriert werden kann. Es wird daher nun unter anderem gezeigt, daß das Ty Protein p 1, das Produkt des TYA Gens (Dobson et al., 1984, EMBO. J 3, 1115) und Teile davon, die zumindest eine Fraktion der 286 bis 381 Aminosäurefrequenz in Fig. 16 enthalten, zur Erzeugung von Ty-VLPs genügen.
Die zweite Aminosäuresequenz (d. h. in besonderen Ausführungsbeispielen die nicht-Ty Protein kodierende Region) kann jede Aminosäuresequenz sein, die entweder in der Wissenschaft bekannt ist oder noch definiert werden muß. Die biologische Aktivität kann eine einzige Art von Aktivität sein (zum Beispiel Antigenität), Rezeptorbindungsaktivität, therapeutische Aktivität oder Trefferaktivität (d. h. die Fähigkeit, zu einem bestimmten Ziel zu gelangen) oder es kann eine Kombination von zwei oder mehr verschiedenen biologischen Aktivitäten sein. Auf gleiche Weise können sich verschiedene Fusionsproteine zu einem bestimmten Antigen vereinen, wodurch das gesamte Partikel mehr als eine Aktivität erhält.
Als Beispiel kann die zweite Aminosäuresequenz von einem lymphokinen Gen wie einem Interferon-Gen, oder einem Gen, das für ein Antigen oder einen Infektionserreger wie ein Virus, Bakterium oder anderen (z. B. protozoischen) Parasiten kodiert, erhalten werden. Sie kann zum Beispiel ein Antigen des Influenzavirus sein, ein HIV-I oder HIV-II (d. h. HTLV-III, LAV oder AIDS) Virus, ein Tollwut-Virus, FMDV-Virus, HBsAg, HBcAg, Poliovirus, Influenzavirus, Parainfluenzavirus, Atmungssyncyntial-Virus, Rhinovirus, Coronavirus, Adenovirus, Rotaviren, Norwalkviren, Arboviren, z. B. Denguefieber-Virus, Herpes simplex, Cytomegalovirus, Epstein Barr-Virus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rötelnvirus, equines Influenzavirus, equine Rhinopneumonie, porcines übertragbares Gastroenteritisvirus, Staupe, Parovovirus, FeLV, equine Venezuela oder westliche Encephalitis, Plasmodium-Trypanosom, Schistosome, Chlamydia trachomatis oder ein Meningococcus, oder sie kann ein Fragment der obengenannten Antigene oder ein Peptids sein, das aus einer chemisch synthetisierten Kodierungssequenz resultiert, so daß das erhaltene Peptid im wesentlichen dieselbe Antigenität wie die obengenannten Antigene oder Fragmente davon aufweist.
Die Nucleotidsequenz einer Vielzahl von viralen und bakteriellen Antigenen ist bekannt, so daß das Antigen durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden kann. Diese DNA kodierenden Sequenzen können zur Kodierung der zweiten Aminosäuresequenz des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel ist die Nucleotidsequenz für das Antigen, das mit allgemeinen Erkrankungen wie Keuchhusten und Malaria zusammenhängt, bekannt. Whooping Cough, Bordatella pertussis, WO 87/03301, 4. Juni 1987; Malaria Plasmodium vivax and P. falciparum, Dame, et al., Science, 225 : 593, 1984; Enea, et al., Science, 225 : 628, 1984; Young, et al., Science, 225 : 958, 1984. Andere allgemeine Erkrankungen, für die die Antigen-Nucleotidsequenz bekannt ist, sind: Hepatitis, EPO 218.414 und EPO 020.251; Herpes, EPO 216.195 und Japan 61-97630; Rabies, WO 87/00179; Windpocken, EPO 210.931; und Polio, WO 86/01828 und Japan 61-47585.
Ein erster Teil der zweiten Aminosäuresequenz kann eine Linkersequenz sein, die in einigen Fällen ohne weiteres spaltbar ist. Der Rest der zweiten Aminosäuresequenz kann somit in einem Reinigungsschritt abgespalten werden.
Daher sind partikuläre Antigene gemäß der Erfindung in der Herstellung von Impfstoffen zweckmäßig, die ein weiteres Merkmal der Erfindung bilden. Die zweite Aminosäuresequenz kann somit für eine Aminosäuresequenz eines Antigens eines der obigen Infektionserreger kodieren. Der Impfstoff umfaßt ein partikuläres Antigen und einen physiologisch verträglichen, nichttoxischen Träger, wie sterile physiologische Kochsalzlösung oder sterile PBS. Die Sterilität ist allgemein für parenteral verabreichbare Impfstoffe wesentlich. Ebenso können ein oder mehrere geeignete Adjuvantien vorhanden sein. Zu Beispielen für geeignete Adjuvantien zählen Muramyldipeptid, Aluminiumhydroxid und Saponin.
Es ist zu beachten, daß die erfindungsgemäßen Impfstoffe mehr als ein Antigen aufweisen können. Es kann entweder eine Mischung von verschiedenen partikulären Antigenen verwendet werden, oder eine homogene Population von partikulären Antigenen mit mehr als einem Epitop (hergestellt, zum Beispiel, indem eine Mischung von verschiedenen hybriden Proteinen zu Partikeln aggregieren gelassen wird oder indem mehr als ein partikuläres Antigen in derselben Zelle exprimiert wird); ein Impfstoff könnte aber auch ein Mischung dieser Arten von partikulären Antigenen enthalten.
In einem weiteren Merkmal schafft die Erfindung eine Nucleinsäure, bestehend aus einer ersten Nucleotidsequenz und einer zweiten Nucleotidsequenz, wobei die erste Nucleotidsequenz im wesentlichen homolog mit oder komplementär zu genetischem Material in einem Retrotransposon oder RNA-Retrovirus ist, das ein partikelbildendes Protein kodiert, wobei die zweite Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz nicht kodiert oder zu dieser nicht komplementär ist, die ein HIV-Antigen kodiert, und wobei die zweite Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz kodiert oder zu dieser komplementär ist, die eine weitere, biologisch aktive, Aminosäuresequenz kodiert, wobei die Nucleinsäure imstande ist, in einem einfachen Leseraster ausgedrückt zu werden, um ein Fusionsprotein zu bilden, das von Natur aus nicht von dem Retrotransposon oder RNA-Retrovirus erzeugt wird, und wobei das Fusionsprotein ein Partikel bildet.
Es ist im allgemeinen der Fall, daß die Nucleinsäure imstande ist, ohne Spleißen oder Antiterminationsvorgänge exprimiert zu werden. Im allgemeinen gibt es keine Rasterverschiebung.
In gewissen Ausführungsbeispielen der Erfindung wird ein TYA Gen-Derivat geschaffen, das an jede nicht-Ty Protein kodierende Sequenz fusioniert werden kann, um ein TYA Fusionsgen zu erzeugen. Das TYA Fusionsgen erzeugt ein Fusionsprotein, das hybride Ty-VLPs bildet. Diese hybriden Ty-VLPs bilden ein Darbietungssystem für ein partikuläres Antigen (oder anderes Partikel) mit hohem Molekulargewicht, das mit sehr hohen Ausbeuten hergestellt werden kann und das durch einfache physikalische Verfahren gereinigt werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Expressionsvektor geschaffen, der die oben definierte Nucleinsäure enthält. Ein Beispiel ist pMA5620, welches das TYA Genderivat enthält und die hochwertige Produktion von hybriden Ty-VLPs in Hefe steuert.
Erfindungsgemäße Expressionsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor. PGK ist ein bevorzugter Promotor, aber es kann jeder andere Promotor, falls notwendig oder erwünscht, verwendet werden. Beispiele umfassen GAPD, GAL1-10, PHO5, ADH1, CYC1, Ty Deltasequenz, PYK und hybride Promotoren, die aus Komponenten von mehr als einem dieser Promotoren oder jedem anderen Promotor hergestellt werden.
Die Erfindung umfaßt auch Wirtszellen, zum Beispiel bakterielle Zellen wie E. coli, Hefezellen wie Saccharomyces Cerevisae, oder tierische Zellen wie chinesische Hamsterovarzellen (CHO) oder COS-Zellen, die die obigen Expressionsvektoren enthalten, die die Produktion von hybriden Partikeln steuern.
Wegen der polyvalenten Eigenschaft der partikulären Antigene ist es wahrscheinlich, daß die Erzeugung von Antikörpern einfacher als bei herkömmlichen Antigenen ist und daß diese Antikörper spezifische Eigenschaften besitzen. Die Erfindung schafft somit ferner Antikörper, die gegen Partikel der Erfindung gebildet werden, die antigen sind. Die Antikörper können polyklonal sein (die zum Beispiel durch Injizieren von Antigenen in ein Kaninchen erhalten werden) oder monoklonale Antikörper, die durch Hybridomzellen gemäß der Erfindung erzeugt werden. Wegen der polyvalenten Eigenschaft der partikulären Antigene ist es wahrscheinlich, daß die in vitro Immunisierung rascher erzielt werden kann als bei anderen Formen von Antigenen; dies könnte die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern erleichtern. Hybridomzellen können durch Fusion von Milzzellen von einem immunisierten Tier mit einer Tumorzelle hergestellt werden. Danach können richtig sezernierende Hybridomzellen ausgewählt werden. (Siehe Koehler & Milstein, Nature 1976, 296 495). Die Erfindung schafft auch eine geeignete Technik zum Reinigen der biologisch aktiven Peptide. Dieses Merkmal der Erfindung beruht auf der Tatsache, daß es im allgemeinen verhältnismäßig einfach ist, Partikel von zugehörigen Unreinheiten zum Beispiel durch Filtration oder Zentrifugation zu trennen. Daher wird auch ein Verfahren zum Herstellen eines im wesentlichen reinen, biologisch aktiven Peptids geschaffen, wobei das Verfahren das Abtrennen der oben beschriebenen Partikel von zugehörigen Unreinheiten und das anschließende Abspalten des biologisch aktiven Peptids von den Fusionsproteinen der Partikel umfaßt.
Fusionsprotein und partikuläre Antigene dieser Erfindung sind als Diagnostika zweckmäßig. Partikuläre Antigene für diagnostische Zwecke sind besonders vorteilhaft, da sie physikalisch durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt werden können und direkt auf festen Trägern wie Glas- oder Kunststoffträgern, Tauchstäben, Makro- oder Mikrokugeln, Teströhrchen, Vertiefungen von Mikrotiterplatten und dergleichen dispergiert werden können. Die partikulären Antigene dieser Erfindung können auch in faserigen oder saugfähigen Materialien dispergiert werden, wie einer absorbierenden Scheibe (siehe U.S. Patent 4.632.901), Streifen oder Chromatographiesäulen als festen Träger. Die Partikel und Fusionsproteine haften sofort an festen Trägern. Die Partikel können nach der Reinigung in Fusionsproteine aufgespalten werden, und das Fusionsprotein kann auf den obengenannten Oberflächen dispergiert werden. Diese Reagenzien sind für eine Reihe von diagnostischen Tests zweckmäßig. Zum Beispiel wird eine Testprobe, von der angenommen wird, daß sie einen Antikörper zu dem partikulären Antigen enthält, und ein fluoreszierender, enzym- oder radiomarkierter Antikörper mit dem partikulären Antigen oder Fusionsprotein und der Menge des markierten Antikörpers, die an den festen Träger bindet, auf einem festen Träger konkurrenzreagiert. Partikuläre Antigene dieser Erfindung sind auch für Agglutinierungsreaktionen mit Antikörpern zweckmäßig. Für den Fachmann in der Diagnostik wird eine Vielzahl von Anwendungen des partikulären Antigens und Fusionsproteins dieser Erfindung für diagnostische Zwecke offensichtlich sein.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele mit Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht, von welchen: Fig. 1 eine Photographie von Ty virusahnlichen Partikeln (Ty-VLPs) ist, die von MD40-4c, transformiert mit Plasmid pMA91-11, gereinigt wurden.
Fig. 2 ein schematisches Diagramm der Konstruktion von pMA5620 und pMA5620-8 ist.
Fig. 3 ein schematisches Diagramm des Plasmids pMA5620-8 ist, mit einem erweiterten Diagramm der Schlüsselkomponenten dieses Beispiels der Erfindung und der Nucleotidsequenzen der wesentlichen Übergänge ist.
Fig. 4 Photographien von SDS-Polyacrylamidgelanalysen von Fraktionen einer Sucrosegradiententrennung von Partikeln und Proteinen von MD40-4c, enthaltend pMA91-11, pMA91 und pMA5620-8, zeigt.
Fig. 5 eine Photographie von hybriden Ty:IFN-VLPs ist, die von MD40-4c, enthaltend pMA5620-8, gereinigt wurden.
Fig. 6 Photographien von Westernblots von Sucrosegradientenfraktionen von Extrakten von MD40-4c, enthaltend pMA5620-8, zeigt. a) Zeigt das Ergebnis bei Verwendung eines Anti-Typ Antikörpers; b) zeigt die Ergebnisse bei Verwendung eines Anti-Interferon Antikörpers.
Fig. 7 eine Photographie von Coomassie-gefärbten SDS-Polyacrylamidgelanalysen von Proteinen in der gereinigten hybriden Ty:IFN-VLP Zubereitung (1) und der gesamten Extrakte von MD40-4c, transformiert mit pMA5620-8 (2) und nichttransformiertem MD40-4c (3) zeigt.
Fig. 8 Photographien von Westernblots bei Verwendung des Anti-Ty-VLP Antikörpers (b), Anti-hybriden Ty:IFN-VLP Antikörpers (d) und der entsprechenden vorbehandelten Seren (a + c) zeigt. Jedes wird gegen die gesamten Extrakte von MD40-4c, enthaltend pMA91 (1) und pMA91-1 (2), verwendet. Das Plasmid pMA91-1 steuert die Synthese von IFN-Alpha2. pMA91 ist eine negative Kontrolle und erzeugt kein Interferon.
Fig. 9 die Nucleotidsequenz des 262 bp SpeI:SpeI Fragments zeigt, das HA Kodons 25-111 enthält und auf das in Beispiel 5 Bezug genommen wird.
Fig. 10 ein Diagramm von Plasmid pMA 5620-ha23 zeigt.
Fig. 11 eine SDS-PAGE Analyse von Sucrosegradientenfraktionen von Extrakten von MD40-4c, transformiert mit pMA5620 oder pMS5620-ha23, zeigt. Proteine sind mit Coomassie-Blau gefärbt.
Fig. 12 eine elektronenmikroskopische Abbildung von gereinigten Ty:HA-VLPs zeigt.
Fig. 13 Westernblots von Proteinen von Sucrosegradientenfraktionen von Extrakten von MD40-4c, transformiert mit pMA5620-ha23, zeigt. Die Blots wurden mit Anti-Ty-VLP Antikörper und Anti-intaktem Influenzavirus Antikörper geprüft.
Fig. 14 Westernblots von gereinigten Ty:HA-VLPs, intaktem Influenzavirus NT60 (H3) und intaktem Influenzavirus PR8 zeigt, die von links nach rechts mit normalem vorbehandelten Kaninchenserum, Anti-Ty-VLP-Antiserum, normalem vorbehandelten Kaninchenserum, Anti-Ty:HA-VLP Antiserum und Anti-intaktem Influenzavirusserum geprüft wurden.
Fig. 15 die Strategie zur Herstellung von pMAs620-358 aus pMA5620 zeigt. pMA5620-358 enthält die ersten 280 Kodons von TYA.
Fig. 16 die DNA und Aminosäuresequenz der TYA 1 bis 381 Aminosäuren zeigt, die das 286 bis 381 Segment enthält, von dem zumindest ein Teil zur Partikelbildung benötigt wird. Die Symbole für Aminosäuren sind wie folgt: Aminosäure Ein-Buchstabensymbol
Alanin A
Arginin R
Asparagin N
Asparaginsäure D
Asn und/oder Asp B
Cystein C
Glutamin Q
Glutaminsäure E
Gin und/oder Glu Z
Glycin G
Histidin H
Isoleucin I
Leucin L
Lysin K
Methionin M
Phenylalanin F
Prolin P
Serin S
Threonin T
Tryptophan W
Tyrosin Y
Valin V

Beispiel 1

Die verwendeten Stämme waren E. coli AKEC28 (C600, thrC, thyA, trpC1 117 hsdRK, hsdK) und S.cerevisiae MD40-4c (urd2, trp1 leu2-3 leu2-112, his3-11, his3-15). E. coli Medien wurden nach Miller hergestellt (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, CSH S. 433) und Hefemedien wurden nach Hawthorne und Mortimer hergestellt (Hawthorne und Mortimer, 1960, Genetics 45, 1085).
E. coli wurde bei Verwendung von Standardverfahren transformiert (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, CSH, S. 199). Hefe wurde nach der Beschreibung von Hinnen et al. transformiert (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 1929).
Zur Restriktionsdigestion und Plasmidkonstruktion wurden Standardverfahren verwendet (Maniatis et al., 1982, op. cit.). Restriktionsenzyme und T4 DNA-Ligasen wurden nach den Anweisungen des Zulieferers verwendet. Bal 31 Exonucleasedigestionen wurden nach der Beschreibung von Dobson et al. durchgeführt (Dobson et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10, 5463). Deletionsendpunkte wurden durch DNA-Sequenzierung bestimmt (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463). Synthetische BamHI Oligonucleotidlinker wurden von Pharmacia erhalten.
Plasmid DNA wurde von E. coli als Vorbereitung, wie von Chinault und Carbon beschrieben (Chinault und Carbon, 1979, Gene 5, 111), und zur raschen Analyse nach dem Verfahren von Holmes und Quigley (Holmes und Quigley, 1981, Anal. Biochem 114, 193) isoliert.
Ty-VLPs wurden wie folgt gereinigt: Hefezellen wurden selektiv bei 30ºC bis zu einer Dichte von 8·10&sup6; Zellen·ml&supmin;¹ vermehrt. Die Zellen wurden dann durch langsame Zentrifugation gesammelt, einmal in eiskaltem Wasser gewaschen und in TEN-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 2 mM EDTA; 140 mM NaCl) mit 1 ml pro 1 Liter Zellen resuspendiert. Die Zellen wurden durch Verwirbelung mit Glaskugeln (40 mesh; BDH) bei 4ºC gespalten, bis > 70% aufgebrochen waren. Die Kugeln wurden durch langsame Zentrifugation pelletisiert, dann wurde der Überstand gesammelt und die Trümmer durch 20minütige Zentrifugation in einer Mikrofuge entfernt. Die Ty-VLPs wurden dann von dem Überstand durch Zentrifugation bei 100.000 g, 1 Stunde bei 4ºC, pelletisiert und über Nacht in TEN-Puffer resuspendiert. Die resuspendierten Ty-VLPs wurden in einer Mikrofuge 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, bevor der Überstand auf einen 15-45% (Gew.-/Vol.-) Sucrosegradienten in 10 mM Tris, pH 7,4; 10 nM NaCl geladen und bei 76.300 g 3 Stunden bei 15ºC schnellrotiert wurde. Die Fraktionen wurden durch den Boden des Rohres gesammelt, und die Peakfraktionen wurden identifiziert, indem Teilmengen der Fraktionen auf SDS-PAGE-Gelen wandern gelassen und mit Coomassie-Blau gefärbt wurden. VLPs wurden durch Zentrifugation der Peakfraktionen bei 100.000 g, 1 Stunde bei 4ºC, konzentriert.
Proteinextrakte von intakten Hefezellen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Mellor et al., 1983, Gene 24, 1). Die Gelverfahren waren jene von Laemmli (Laemmli, 1970, Nature 227, 68). Die Proteinkonzentrationen wurden durch einen farbstoffbindenden Test gemessen (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248), der von Bio-Rad Laboratories erhalten wurde. Ein polyklonaler Pferde-Anti-Interferon (IFN)-Alpha-Antikörper wurde von Boehringer Mannheim gekauft. Anti-Ty-VLP Antiseren wurden in Kaninchen durch Standardverfahren hergestellt.
Western-Blotting wurde nach der Beschreibung von Towbin et al. durchgeführt (Towbin et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 4350). Gebundener Antikörper wurde durch Verwendung entweder eines Kaninchen-Anti-Pferd-zweiten Antikörpers, konjugiert an Meerrettichperoxidase (Miles Scientific), oder eines Ziegen-Anti-Kaninchen zweiten Antikörpers, gefolgt von einem Peroxidase-Anti-Peroxidase (PAP)-Komplex, der in Kaninchen gebildet worden war, (Sigma) nachgewiesen. Die enzymatische Reaktion wurde nach der Beschreibung von De Blas und Cherwinski entwickelt (De Blas und Cherwinski, 1983, Anal. Biochem. 133, 214).
Plasmid pMA91-11 wurde bereits beschrieben (Dodson et al., 1984, EMBO.J. 3, 115): es enthält die ersten 1450 Nucleotide der Haupttranskriptionseinheit des Ty Elements, Tyl-15, eingesetzt in den hochwirksamen Expressionsvektor pMA91 (Mellor et al., 1983, op. cit; Kingsman und Kingsman, 1985, Biotech. und Genet. Eng. Rev. 3, 377). Die Ty Komponente wurde von pKT40b, wie von Dobson et al., (op. cit) beschrieben, abgeleitet; pKT40b wurde bei der National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, U.K. unter der Zugriffsnummer NCIB 12427 hinterlegt. Der Expressionsvektor pMA91 besteht wiederum aus Plasmid pBR322-Sequenzen, die eine Replikation und Selektion in E. coli ermöglichen, dem Hefe 2 Mikron Plasmid-Replikationsursprung, der eine wirksame autonome Replikation in Hefe ermöglicht, dem Hefe LEU2 Gen als selektierbaren Marker sowohl bei Hefe leu2 als auch E. coli leuB Mutanten und einer Bg/II Expressionstelle, die die stromaufwärtige nichtkodierende Region des Hefe PGK Gens von -1500 bis -1 von der 3' Region von PGK trennt, die alle Signale für die Hefe Transkriptionstermination enthält. Plasmid pMA91 wird auch in USA-4615974 beschrieben, obwohl sorgfältig darauf geachtet werden sollte, daß das Plasmid, das in Fig. 15 dieses US-Patents als pMA3013 bezeichnet wird, jenes ist, das nun als Plasmid pMA91 bekannt ist. Das Plasmid, das in dem unteren Teil von Fig. 1 von USA-4615974 dargestellt ist, wurde seither neu benannt. Die Ty-Expression wird daher von dem Promotor des hocheffizienten Hefe-Phosphoglyceratkinasegens (PGK) angetrieben und Hefeextrakte von Stämmen, die mPA91-11 enthalten, bilden vermehrt massive Mengen von p1 Protein, dem primären Translationsprodukt des TYA Gens (Dobson et. al., 1984, op. cit; Mellor et al., 1985a, op. cit.). Es wird nun gezeigt, daß Extrakte von Hefetransformanden, die pMA91-11 enthalten, Ty-VLPs in großen Mengen enthalten (Fig. 1). Daher enthält TYA alleine genügend Information, um Ty-VLPs herzustellen, und das p1 Protein, das in Extrakten von MD40-4c, das pMA91-11 enthält, gefunden wird, wird zu Partikeln vereint (Fig. 1 und 4). Diese Information liefert die Grundlage für die vorliegende Erfindung.
Die Konstruktion eines Plasmidvektors, pMA5620, der die Synthese jedes hybriden Ty-VLP Partikels reguliert, ist in Fig. 2 schematisch dargestellt. Dies erfordert die Konstruktion eines Vektors, der eine passende Restriktionsendonucleasestelle in dem TYA Gen enthält, so daß jede kodierende Sequenz in diese Stelle eingesetzt werden kann, um ein hybrides TYA Gen zu schaffen. Es ist jedoch wesentlich, daß in einem solchen Hybrid genügend TYA kodierende Sequenz vorliegt, um die Synthese von Ty-VLPs zu steuern.
Plasmid pMA91-11 wurde mit BglII gespalten, mit Bal 31 Exonuclease mehrmals digeriert und in Gegenwart von überschüssigen Bam HI Linkern religiert (CCGGATCCGG). Die Deletionsendpunkte der erhaltenen Plasmide wurden durch DNA-Sequenzierung bestimmt. Das Plasmid pMA91-357 ist ein Deletionsderivat, bei dem 265 bp entfernt wurden. Dadurch wird der BamHI Linker ein Nucleotid über Kodon 381 von TYA hinaus angeordnet (Fig. 3). Zur Schaffung von sowohl Transkriptionsterminationssequenzen als auch Translationsstoppkodons in allen drei Leserastern wurden die deletierten PGK3' Terminatorsequenzen von pMA91-357 durch ein 287 bp BamHI-SalI DNA Fragment ersetzt, das von Plasmid pDT86 isoliert worden war. Dieses DNA Fragment ist ein modifiziertes 3' transkriptionsterminatorfragment von dem Hefe PGK Gen, das Translationsstoppkodons in allen drei Leserastern stromabwärts von der BamHI Stelle enthält (Fig. 2 und 3). Dieses Terminatorfragment beginnt mit einem BamHI Linker (CCGGATCCGG), der mit dem letzten kodierenden Kodon der PGK kodierenden Sequenz verbunden ist und sich zu der HindIII Stelle 279 Nucleotide über die PGK kodierende Sequenz hinaus erstreckt (Hitzemann et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10, 7791). Bei diesen Konstruktionen wurde die HindIII Stelle bei Verwendung eines synthetischen Linkers zu einer SalI Stelle konvertiert. Das Terminatorfragment ist nicht kritisch sind es würde jedes Fragment, das in allen drei Leserastern Terminationskodons enthält, auf die der Hefe-Transkriptionsterminator folgt, genügen. Das erhaltene Plasmid, pMA5620, enthält eine einzige BamHI-Stelle, in die jede geeignete Sequenz eingesetzt werden kann, um ein hybrides Protein zu erzeugen, das hybride Ty-VLPs bildet.
Zur Testung von pMA5620 wurde eine Interferon-Alpha2 (IFN) cDNA als modellartige Antigen-kodierende Sequenz verwendet. Ein 540bp BamHI IFN-Alpha2 cDNA Fragment, das als Fragment 8 bezeichnet wird (Mellor et al., 1985b, Gene 33, 215), wurde in die einzige BamHI Stelle des Plasmids pMA5620 eingesetzt. Das erhaltene Plasmid wird als pMA5620-8 bezeichnet (Fig. 2 und 3).
VLPs wurden aus Hefestamm MD40-4c, transformiert mit Plasmid pMAs620-8, hergestellt und Fraktionen eines 15-45% Sucrosegradienten wurden auf einem SDS-PAGE-Gel wandern gelassen. Die Proteine in dem Gradienten wurden durch Coomassie-Blau-Färbung sichtbar gemacht (Fig. 4). Die Position des vorhergesagten 70 kd TYA-IFN Fusionsproteins in dem Gradienten zeigt schlüssig die partikuläre Eigenschaft des Proteins. Die Elektronenmikroskopie der Fraktionen bestätigte, daß Partikel vorhanden waren (Fig. 5). Für den Nachweis, daß dieses 70 kd partikuläre Protein tatsächlich ein Ty(50kd):IFN(20kd) Fusionsprotein ist, wurden Fraktionen von Sucrosegradienten neuerlich auf SDS-PAGE-Gelen wandern gelassen und die abgetrennten Proteine auf Nitrocellulosefilter transferiert. Ein Filter wurde mit einem Ty-VLP Antikörper getestet, von dem bekannt ist, daß er mit Ty Proteinen regiert, und ein weiterer wurde mit einem Anti-IFN-Alpha-Antikörper getestet (Fig. 6). In beiden Fällen reagierte das 70 kd Protein stark, wodurch angezeigt wird, daß dieses Protein sowohl Ty als auch IFN Epitope enthielt.
Die Wirksamkeit des Reinigungsverfahrens von hybriden Ty:IFN-VLPs ist in Fig. 7 dargestellt. Das 70 kd hybride Protein ist bei weitem die bedeutendste Form in der Zubereitung.
Zur Testung der Wirksamkeit dieser hybriden Ty:IFN-VLPs in der Herbeiführung einer Immunantwort auf das Modellantigen, Interferon, wurde ein Antiserum in Kaninchen gegen konzentrierte hybride Ty:IFN-VLPs, gereinigt von Hefeextrakten, transformiert mit pMA5620-8, gebildet. Ein Extrakt von MD40-4c, transformiert mit Plasmid pMA91-1, der vermehrt IFN-Alpha2 bildet (Mellow et al., 1985b, op. cit.) wurde auf einem SDS-PAGE-Gel neben einem Extrakt von MD40-4c, transformiert mit pMA91, der kein Interferon erzeugt, wandern gelassen. Die abgetrennten Proteine wurden auf Nitrocellulose transferiert und entweder mit Ty-VLP Antiseren oder Ty:IFN-VLP Antiseren getestet (Fig. 8). Während beide Antiseren mit Ty Proteinen reagierten, die in den Extrakten vorhanden waren, reagierten nur die Anti-hybriden Ty:IFN-VLP-Antiseren mit dem 20 kd IFN Protein in dem Extrakt, der Plasmid pMA91-1 enthielt.
Diese Daten zeigen: 1) pMA5620 steuert die Synthese eines hybriden Fusionsproteins, bestehend aus den ersten 381 Aminosäuren von Ty Protein p1 und einem nicht-Ty Protein. In diesem Fall Interferon-Alpha2; 2) dieses Fusionsprotein bildet hybride Ty:IFN-VLPs; 3) die hybriden Ty-IFN-VLPs können leicht isoliert werden; 4) die hybriden Ty:IFN-VLPs stellen das Modellantigen, Interferon-Alpha2, zu dem Immunsystem des Kaninchens dar. Es kann daher erwartet werden, daß pMA5620 die Synthese jedes hybriden Ty-VLP steuert und daß jedes Antigen, das in einem solchen Partikel vorhanden ist, jedem Säugetier-Immunsystem, wie z. B. der Ratte, des Hamsters, des Hundes, der Katze, des Rindes, des Schafes, des Schweines und des Menschen, dargeboten wird. Natürlich kann die Interferon cDNA, die hier als Beispiel verwendet wurde, durch jedes andere DNA Stück ersetzt werden, das ein vollstandiges Protein oder einen Teil eines Proteins kodiert.
Die partikuläre Eigenschaft dieses Antigendarbietungssystems und die einfache Reinigung der hybriden Ty-VLPs machen diese Erfindung als Mittel zur Stimulierung der Erzeugung von Antikörpern gegen bestimmte Antigene, als Mittel zur Schaffung neuer Impfstoffe, als Mittel zur Herstellung bestimmter Antigene zur Erzeugung monoklonaler Antikörper, als Mittel zur Herstellung von Antigenen zur Verwendung in diagnostischen Testmethoden geeignet.
Hybride Ty:IFN-VLPs können daher zur Bildung von Anti-IFN Antikörpern (entweder monoklonalen oder polyklonalen, aber vorzugsweise monoklonalen) verwendet werden, die dann für die Reinigung von IFN eingesetzt werden.

BEISPIEL 2

Das Copiaelement von Drosophilia melanogaster ist dem Ty Element von Hefe sowohl in der genetischen Organisation als auch in der virusähnlichen Partikelbildung auffallend ähnlich (Mount & Rubin, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 1630). Die Region von Copia, die dem TYA entspricht, wird analog zu der Retrovirusorganisation gag genannt. Daher kann es sich herausstellen, daß die hochwertige Expression der gag Region eines Copiaelements in einem Insektenzellenexpressionssystem zu Proteinen führt, die sich zu Partikeln ähnlich den Ty-VLPs vereinen. Wenn gag an die kodierende Sequenz eines anderen Proteins fusioniert wird, kann es sich erweisen, daß sich das erhaltene Fusionsprotein zu einem hybriden Copiapartikel bildet, analog den zuvor beschriebenen hybriden Ty:IFN Partikeln.
Zur Bildung von Copiapartikeln als Antigendarbietungs- und Reinigungssystem wird gag von Plasmid pPW220 (Potter & Brosein, 1979, Cell 17, 415) durch rekombinante DNA Standardverfahren für die Insertion in einen typischen, hocheffizienten Baculovirus-Expressionsvektor, wie zum Beispiel pAc373 (Smith et al., 1983, J. Virol. 46, 584) manipuliert, um Plasmid pAc373-gag herzustellen. Die Expression wird von dem Polyhedrinpromotor angetrieben. Dann wird eine Interferon cDNA im Raster in das 3' Ende von gag zur Herstellung von Plasmid pAc373-gag-IFN eingesetzt. Dieses Plasmid ist direkt analog zu pMA5620-8 (siehe vorangehendes Beispiel 1). pAc373-gag-IFN wird dann in das Baculovirus, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) durch in vivo Rekombination in Spodoptera frugiperda Zellen (Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 4, 2156) eingeführt. Rekombinante Viren werden von Okklusion-minus Plaques geerntet und zur Reinfektion von frischen & frugiperda Zellen verwendet. Hybride Copia:IFN Partikel werden 72-96 Stunden nach der Infektion geerntet und auf einem Sucrosegradienten zur Abtrennung von der Baculovirus-Kontamination fraktioniert. Die Partikel werden durch Elektronenmikroskopie und Westernblotting identifiziert, wie für die hybriden Ty-IFN Partikel beschrieben wurde (siehe vorangehendes Beispiel 1).

BEISPIEL 3

Es wird nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 2 vorgegangen, mit der Ausnahme, daß ein rekombinantes Plasmid, das die gag-IFN Fusion enthält, die durch den Drosophila ADH Gen-Promotor exprimiert wird (Benyajati et al., 1983, Cell 33, 125) in irgendeine Insektenzelle (z. B. Drosophila Schneider 2 Zellen) durch einfache DNA-vermittelte Transfektion eingeführt wird.

BEISPIEL 4

Das TYA Gen des Hefe Ty Elements ist den gag Genen von Vogel und Säugetier-Retroviren direkt analog. Da das Produkt von TYA alleine imstande ist, Partikel zu bilden, ist es wahrscheinlich, daß jedes gag-Protein dasselbe vollbringt und daher als Basis für ein Antigendarbietungs- und reinigungssystem dienen könnte. Zur Bildung von retroviralen gag-Proteinen als Antigenreinigungs- und darbietungssystem wird das gag-Gen von HIV-I durch rekombinante DNA-Standardverfahren manipuliert, um in den Hefe-Expressionsvektor pMA91 und ein Derivat des Säugetier-Expressionsvektors pSV2 (Southern und Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 327), das eine Säugetier-dhrf-cDNA (Kaufman et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 1750) enthält, eingesetzt zu werden, um pMA91-HIVgag bzw. pSV25-HIVgag zu erhalten. Dann wird eine Interferon-cDNA im Raster in beide dieser Moleküle am 3 Ende von gag zur Herstellung von pMA91-HIVgag-IFN bzw. pSV25-HIVgag-IFN eingefügt. Diese Moleküle sind zu pMA5620-8 (siehe vorangehendes Beispiel 1) analog. pMA91-HIVgag-IFN wird dann zur Transformation von Hefestamm MD40-4c verwendet und pSV25-HIVgag-IFN wird zur Transfektion von CHO-dhfr-Zellen verwendet. Stabile Transformanden werden vermehrt und Zellextrakte hergestellt und auf Sucrosegradienten fraktioniert. Hybride HIVgag:IFN Partikel werden durch Elektronenmikroskopie und Westernblotting identifiziert. Wie für hybride Ty:IFN Partikel beschrieben wurde (siehe vorangehendes Beispiel 1).

BEISPIEL 5

Es wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 vorgegangen, mit der Ausnahme, daß pSV25-HIVgag-IFN in COS-Zellen (Gluzman et al., 1977, J. Virol. 24, 534) eingeführt wird und hybride Partikel zwischen 3 und 9 Tagen nach der Transfektion geerntet werden.

BEISPIEL 6

In diesem Beispiel wird gezeigt, daß hybride Ty-VLPs, die einen Teil eines Influenzavirus-Hämagluttinins (HA) enthalten, erzeugt werden können und daß diese hybriden Ty:HA-VLPs die Bildung von Anti-HA-Antikörpern in Kaninchen herbeiführen. Die Strategie für diese Experimente war im wesentlichen dieselbe wie für die Produktion und Analysen der hybriden Ty:IFN-VLPs, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. MRC12/80 Anti-intakter Influenzavirus-Antikörper wurde von dem World Influenza Centre in MMR, Mill Hill, U.K. erhalten und wurde gegen den Influenzavirusstamm A/Scotland/840/74·A/PR/8/34 (H3N2) gebildet. Eine Region der HA kodierenden Sequenz, die den Kodons 25-111 der HAI Domäne des Influenzavirus A/Memphis/102/72 (H3N2) entspricht, wurde aufgrund der Daten von Wilson et al., (1984, Cell 37, 767) für die Bildung von hybriden Ty:HA-VLPs ausgewählt. Ein 262 bp SpeI-SpeI (Fig. 9), entsprechend den Kodons 25-111, wurde von einem geeigneten Digest von Plasmid MX29 gereinigt. MX29 ist Plasmid pAT153 (Twigg und Sherratt, 1980, Nature 283, 216) mit einer H3 HA cDNA, abgeleitet von der HA RNA vom Influenzavirusstamm A/Memphis/102/72 G:C, ansynthetisiert an die PstI-Stelle. Die kIebrigen Enden des SpeI:SpeI Fragments wurden unter Verwendung von DNA Polymerase I aufgefüllt und dann wurde das Fragment in die HincII Stelle von Plasmid pSP46 stumpfendig ligiert, um pSP46-ha23 zu erzeugen. pSP46 ist ein Derivat von pSP64 (Promega Biotec), bei dem die HindIII Stelle von pSP64 in eine BglII Stelle konvertiert wurde. Ein BamHI:BglII Fragment, als ha23 bezeichnet, wurde von pSP46-ha23 gereinigt. ha23 enthält das eingefüllte 262 bp SpeI:SpeI Fragment. Dann wurde ha23 in die BamHI Stelle von pMA5620 zur Erzeugung von PMA5620-ha23 (Fig. 10) inseriert. Dieses Plasmid wurde dann zur Transformation des Hefestamms MD40-4c zu Leucin-Unabhängigkeit verwendet. VLPs wurden aus dem Hefestamm MD40-4c bereitet, der mit pMA5620-ha23 oder pMA5620 transformiert war, und auf einem 15-45% Sucrosegradienten fraktioniert. Die Fraktionen wurden auf einem SDS-PAGE-Gel wandern gelassen und die Proteine mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht (Fig. 11). Die Position in dem Gradienten des vorhergesagten TYA-HA Fusionsproteins zeigte die partikuläre Eigenschaft des Proteins. Die Elektronenmikroskopie der Fraktionen bestätigte, daß Partikel vorhanden waren (Fig. 12).
Zur Bestätigung, daß die Partikel HA-Antigene enthielten, wurden fraktionierte Extrakte von MD40-4c, enthaltend pMA5620-ha23, von gleichen Gradienten auf SDS-PAGE-Gelen neuerlich wandern gelassen, und dann wurden getrennte Proteine auf Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. Ein Filter wurde mit Anti-Ty-VLP Antikörper getestet, von dem bekannt ist, daß er mit Ty Proteinen reagiert, und ein weiterer wurde mit Anti-HA Antikörper getestet. In beiden Fällen reagierte das vermeintliche Ty:HA Fusionsprotein stark, wodurch angezeigt wird, daß dieses Protein sowohl Ty als auch HA Epitope enthielt (Fig. 13).
Zur Testung der Wirksamkeit dieser hybriden Ty:HA-VLPs bei der Herbeiführung einer Immunantwort auf HA wurde ein Antiserum in Kaninchen gegen konzentrierte hybride Ty-HA-VLPs gebildet, die von Extrakten von MD40-4c, transformiert mit pMA5620-ha23, gereinigt waren. Dieses Antiserum wurde dann zur Testung von Proteinen von aufgespaltenem intakten Influenzavirus durch Westernblotting verwendet. Es wurden drei Proteinproben verwendet. Die erste bestand aus gereinigten Ty:HA-VLPs, die zur Bildung des Antiserums verwendet wurden. Die zweite war das intakte Influenzavirus PR8 (H3). Die dritte war das intakte Influenzavirus NT60 (H 1). Sowohl PR8 als auch NT60 wurden von Professor George Brownlee, Sir William Dunn School of Pathology, Oxford, U.K., erhalten. Fig. 14 zeigt, daß der Anti-Ty:HA-VLP Antikörper mit der HAI Region von H3 HA aber nicht mit H1 HA reagierte. Es konnte keine derartige Reaktion bei vorbehandeltem Serum oder bei Anti-Ty-VLP Antikörper beobachtet werden. Als positive Kontrolle wurden dieselben Proben mit Anti-intaktem Virusantikörper getestet. In diesem Fall reagierte sowohl H1 HA als auch H3 HA mit dem Antiserum. Die hybriden Ty:HA-VLPs leiten die Produktion von Anti-HA Antikörper ein, der für ein Epitop des H3 Antigens spezifisch ist.
Diese Daten zeigen, daß pMA5620-ha23 die Synthese eines hybriden Fusionsproteins steuert, das aus den ersten 381 Aminosäuren des Ty Proteins p1 und einer kleinen Region eines viralen Proteins, dem Influenzavirus HA besteht. Dieses Fusionsprotein bildet hybride Ty:HA-VLPs. Die hybriden Ty:HA-VLPs können einfach isoliert werden und bieten die kleine HA-Komponente dem Immunsystem des Kaninchens derart dar, daß Anti-HA Antikörper erzeugt werden. Diese Antikörper können zwischen H1 HA und H3 HA in einem Westernblot unterscheiden. Die HA Komponente der hybriden Ty:HA-VLPs könnte natürlich durch jede andere Influenzaviruskomponente oder jede andere Viruskomponente ersetzt werden, und es ist angebracht, ähnliche Ergebnisse zu erwarten.

BEISPIEL 7

Zur Schaffung einer Reihe von abgestumpften TYA Genen, die zunehmend weniger Sequenz an dem 3' Ende enthielten, wurde eine Standard Bal 31 Digestion unter Verwendung von pMA5620 als Startermolekül verwendet. Das Plasmid 5620 wird mit BamHI gespalten, mehrmals mit Bal 31 digeriert und in Gegenwart von überschüssigen BamHI Linkern (CCGGATCCGG) religiert. Die Deletionsendpunkte der erhaltenen Plasmide wurden durch DNA Sequenzierung bestimmt. Eine dieser Deletionen enthielt nur die ersten 286 Kodons von TYA und wird mit 358 bezeichnet. Die deletierten PGK Terminator Sequenzen von 358 wurden durch Ligation des großen PvuII-BamHI Fragments von pMA5620 mit dem 680 bp PvuII-BamHI Fragment von 358 ersetzt. Das erhaltene Plasmid wird mit pMA5620-358 bezeichnet (Fig. 15).
Interferon Alpha-2 cDNA BamHI Fragmente mit zwei leicht unterschiedlichen 3' Termini (IFN-8 und IFN 2; Mellor et al., 1985, Gene 33, 215; Mellor et al., 1985, Nature 313 243) wurden im Raster in die BamHI Stellen für pMA5620 und pMA5620-358 zur Herstellung der Plasmide pMA5620-8 und pMA5620-358-2 inseriert. Die Plasmide pMA91-11, pMA5620 und pMA5620-358 wurden zur Transformierung des Hefestamms MD40-4c zu Leucin-Unabhängigkeit verwendet.
Die erhaltenen Transformanden wurden in bezug auf TYA RNA, die von den Plasmiden erzeugt worden war, und in bezug auf die Mengen von p1 oder abgestumpften p1 Proteinen verglichen, wie durch Westerblotting unter Verwendung des Anti Ty-VLP Antikörpers bestimmt wurde. Die RNA und Proteinmengen waren bei jedem Transformanden gleich.
Dann wurden Extrakte von jedem Transformanden durch Fraktionierung auf 15-45% Sucrosegradienten mit anschließender Coomassie-Blau Färbung analysiert, und bei beiden, pMA91-11 und pMA5620, befinden sich p1 oder angestumpfte p1 Proteine in der Region des Gradienten, der für die partikulären Strukturen charakteristisch ist. Im Fall von pMA5620-358 wird jedoch kein partikuläres Material beobachtet.
Eine Interferon Alpha-2 cDNA wurde im Raster an jedes der Plasmide pMA5620 und pMAs620-358 zur Erzeugung der Plasmide pMA5620-8 und pMA5620-358-2 fusioniert. Diese Plasmide wurden zur Transformierung des Hefestammes MD40-4c zu Leucin-Unabhängigkeit verwendet, und Ty homologe RNA und p1 und p1:Interferon Fusionsproteine wurden wie oben beschrieben gemessen. Die Werte von RNA und Protein sind für beide Transformanden gleich und auch gleich wie pMA5620. Wenn Extrakte von Hefetransformanden, die pMA5620-8 enthielten, auf 15-45% Sucrosegradiente analysiert wurden, wurde ein 70 kd p1 :Interferon Fusionsprotein in der Region des Gradienten beobachtet, die für partikuläre Strukturen charakteristisch ist. Es wurde jedoch kein partikuläres Material beobachtet, wenn Extrakte, die pMA5620-358-2 enthielten, analysiert wurden.
Somit erfordert die Ty-VLP Bildung zumindest einen Teil der Sequenz zwischen den Aminosäuren 286 und 381. Die DNA und Aminosäuresequenz von p1 ist in Fig. 16 dargestellt, die auch die DNA und Aminosäuresequenz der Aminosäuren 286 bis 381 zeigt.

BEISPIEL 8

ENZYMIMMUNOASSAYVERFAHREN MIT VLP ANTIGEN

Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit VLP Antigen (virusähnliches Partikel mit Antigen) bedeckt, indem 50 ul von 20 ug/ml VLPs in 50 mM Natriumkarbonatpuffer, pH 9,5, in jeder Vertiefung 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Überschüssige VLPs Antigene wurden aus den Vertiefungen durch drei fünfminütige Waschungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, gewaschen. Zur Minimierung von Hintergrundreaktionen wurden die Vertiefungen mit 100 ul 2% Kasein in PBS über eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert, worauf drei fünfminütige Waschungen mit PBS, enthaltend 0,1% Tween-20 (PBS-T), folgten. Primärer Antikörper in einer Testprobe wird ausreichend in PBS-T, enthaltend 0,5% Kasein (PBS-CT), verdünnt. Eine ausreichende Verdünnung kann eine dreifache Verdünnungsserie von 1/10 bis 1/7.290 sein. Primärer Antikörper, der mit der nicht-Ty Komponente von jedem hybriden Ty-VLP reaktiv ist. 50 ul verdünnter primärer Antikörper werden in die richtigen Vertiefungen eingebracht und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Überschüssiger primärer Antikörper wird durch drei fünfminütige Waschungen mit PBS-T entfernt. Sekundärer Antikörper ist mit Meerrettichperoxidase markiertes Antispezies IgG und wird 1/1.500 in PBS-CT verdünnt. 50 ul des verdünnten sekundären Antikörpers werden in jede Vertiefung eingebracht und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, worauf fünf fünfminütige Waschungen mit PBS-T folgen. Das Substrat ist 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml in 0,1M Natriumacetat, eingestellt auf pH 6,0 mit 0,5M Zitronensäure, aus 0,03% Wasserstoffperoxid. 50 ul des Substrats werden in jede Vertiefung angebracht und die Farbreaktion 10 Minuten entwickelt. Die Reaktion wird durch die Beigabe von 25 ul 0,5M Schwefelsäure zu jeder Vertiefung unterbrochen. Die Farbentwicklung wird durch Messung bei 450 nm unter Verwendung einer Mikroplattenlesevorrichtung bestimmt. Auf diese Weise wird ein direkter Test des primären Antikörpers in der Testprobe durchgeführt.

BEISPIEL 9

ABSPALTUNG VON EXOGENEM PROTEIN VON HYBRIDEN TY-VLPs

In Situationen, in welchen hybride Ty-VLPs zur Reinigung von p1 Fusionsproteinen verwendet werden, ist es vorteilhaft, die p1 Komponente des Fusionsproteins zu entfernen und die exogene oder nicht-p1 Komponente zu bewahren. Dies erfordert die Spaltung an der Übergangsstelle der p1 und nicht-p1 Sequenz. Dies stellt ein Mittel dar, Ty-VLPs zur Erzeugung authentischer Proteine zu verwenden. Eine Möglichkeit, dieses Ziel zu erreichen, ist das Einführen einer spezifischen proteolytischen Spaltstelle an der p1/nicht-p1l Übergangsstelle.
Zur Erzeugung von nichtfusioniertem Interferon aus Ty-VLPs wurde ein Derivat von pMA5620, als pMA5623 bezeichnet, konstruiert. Dies ist mit pMA5620 identisch, mit der Ausnahme, daß bei Kodon 381 von TYA vier zusätzlich Kodons vor dem BamHI Linker eingefügt sind. Diese Kodons kodieren die Aminosäuresequenzen Ile-Glu-Gly-Arg, die eine Spaltstelle für den Blutgerinnungsfaktor Xa darstellt (Nagai & Thogersen, 1984, Nature, 309, 810). Die Übergangsregion für eine Konstruktion analog zu pMA5620-8, pMA5623-8, ist wie folgt:
CCC AAA ATC GAG GGT AGG gga tcc atg ggc TGC AAG
P R I B G R G S MG C K
380 381 Faktor Xa IFN
TYA -BamHI
Wenn pMA5623-8 in den Hefestamm MD40-4c transformiert wird, wird ein p1:IFN Fusionsprotein erzeugt, das hybride IFN-Ty VLPs bildet. Im Gegensatz zu Transformanden, die pMA5620-8 enthalten, spaltet jedoch die Inkubation des artikulären Fusionsproteins mit Rinder-Blutfaktor Xa wegen der Spaltstelle an dem Proteinfusionsübergang das Interferon von den Partikeln ab.
Hybride IFN-Ty-VLPs werden daher von nichtpartikulären Proteinen durch eine erste Runde Sucrosedichtegradientenfraktionierung, wie zuvor beschrieben, abgetrennt. Das IFN wird dann abgespalten und von dem partikulären p1 Protein durch eine zweite Runde Sucrosedichtegradientenfraktionierung abgetrennt, um reines "authentisches" Interferon zu erzeugen.
Die Interferon kodierende Sequenz, die in diesem Beispiel dargestellt ist, kann durch jede andere kodierende Sequenz ersetzt werden und somit kann diese Strategie bei der Expression und Reinigung jedes Proteins angewendet werden.

Claims

1. Fusionsprotein eine erste Aminosäuresequenz und eine biologisch aktive zweite Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die erste Aminosäuresequenz im wesentlichen mit einem partikelbildenden Protein homolog ist, das durch ein Retrotransposon oder ein RNA-Retrovirus kodiert wird, wobei die zweite Aminosäuresequenz nicht wesentlich mit einem HIV-Antigen homolog ist und wobei, wenn die zweite Aminosäuresequenz mehr als dreißig Aminosäurereste enthält, die ersten dreißig Reste der zweiten Aminosäuresequenz keine Aminosäuresequenz bilden, die von Natur aus durch das Retrotransposon oder das RNA-Retrovirus direkt an die erste Aminosäuresequenz fusioniert ist.

2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, das im wesentlichen rein ist.

3. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Retrotransposon das Hefe-Retrotransposon Ty oder ein copiaähnliches Element ist.

4. Fusionsprotein nach Anspruch 3, wobei die Ty-kodierte Aminosäuresequenz das p1 Protein ist, das durch das TYA Gen kodiert wird.

5. Fusionsprotein nach Anspruch 3, wobei die Ty-kodierte Aminosäuresequenz Teil des p1 Proteins ist, das durch einen Teil des TYA Gens kodiert wird, welcher Teil imstande ist, die Synthese von Ty virusähnlichen Partikeln (Ty-VLPs) zu steuern.

6. Fusionsprotein nach Anspruch 3, 4 oder 5, wobei die Ty-kodierte Aminosäuresequenz jene von Tyl-15 ist.

7. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die zweite Aminosäuresequenz mit einem Antikörper immunologisch reaktionsfähig ist, der als Reaktion auf einen Infektionserreger bei Säugetieren erzeugt wird.

8. Partikel, bestehend aus einer Vielzahl von Fusionsproteinen, wobei jedes Fusionsprotein eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die erste Aminosäuresequenz im wesentlichen mit einem partikelbildenden Protein homolog ist, das durch ein Retrotransposon oder ein RNA-Retrovirus kodiert wird, und wobei die zweite Aminosäuresequenz nicht wesentlich mit einem HIV-Antigen homolog ist, und wobei die zweite Aminosäuresequenz biologisch aktiv und nicht von Natur aus durch das Retrotransposon oder das RNA-Retrovirus an die erste Aminosäuresequenz fusioniert ist.

9. Partikel nach Anspruch 8, das im wesentlichen rein ist.

10. Partikel, bestehend aus einer Vielzahl fusionierter Proteine nach Anspruch 1.

11. Partikel nach Anspruch 8, 9 oder 10, wobei die zweiten Aminosäuresequenzen in den Fusionsproteinen alle gleich sind.

12. Impfstoff, enthaltend ein Partikel nach Anspruch 8, 9, 10 oder 11, wobei das Partikel ein partikuläres Antigen ist.

13. Nucleinsäure, welche eine erste Nucleotidsequenz und eine zweite Nucleotidsequenz aufweist, wobei die erste Nucleotidsequenz im wesentlichen homolog mit oder komplementär zu genetischem Material in einem Retrotransposon oder RNA-Retrovirus ist, das ein partikelbildendes Protein kodiert, wobei die zweite Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz nicht kodiert oder zu dieser nicht komplementär ist, die ein HIV-Antigen kodiert, und wobei die zweite Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz kodiert oder zu dieser komplementär ist, die eine weitere Aminosäuresequenz kodiert, wobei die Nucleinsäure imstande ist, in einem einfachen Leseraster zur Bildung eines Fusionsproteins kodiert zu werden, das von Natur aus nicht von dem Retrotransposon oder RNA-Retrovirus erzeugt wird, und wobei, wenn die zweite Nucleotidsequenz mehr als neunzig Basen enthält, die ersten neunzig Basen keine Nucleotidsequenz bilden, die als Teil eines Fusionsproteins exprimiert wird, das von Natur aus von dem Retrotransposon oder RNA-Retrovirus erzeugt wird.

14. Nucleinsäure, die für ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert.

15. Nucleinsäure nach Anspruch 13, wobei die zweite Nucleotidsequenz keine Linkersequenz enthält, die für eine spaltbare Aminosäuresequenz kodiert.

16. Nucleinsäure nach Anspruch 13, wobei die zweite Nucleotidsequenz eine Linkersequenz enthält, die für eine spaltbare Aminosäuresequenz kodiert, die an die erste Nucleotidsequenz angrenzt.

17. Expressionsvektor, umfassend eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 16.

18. Expressionsvektor nach Anspruch 17, der ein Bakterien-, Hefe-, Säugetier- oder Insekt-Expressionsvektor ist.

19. Expressionsvektor nach Anspruch 18, enthaltend das TYA Gen mit einer Restriktionsenzym-Spaltstelle innerhalb des TYA Gens, in die die zweite Nucleotidsequenz eingesetzt wird.

20. Expressionsvektor nach Anspruch 18 oder 19, der die ersten 381 Kodons des TYA Gens enthält.

21. Bakterien-, Hefe-, Säugetier- oder Insektzelle, die einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 17 bis 20 enthält.

22. Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen reinen, biologisch aktiven Peptids, wobei das Verfahren das Abtrennen von Partikeln nach einem der Ansprüche 8 bis 11 von damit verbundenen Unreinheiten sowie die folgende Abspaltung des biologisch aktiven Peptids von den Fusionsproteinen der Partikel umfaßt.

23. Diagnostikum, umfassend ein Partikel nach einem der Ansprüche 8 bis 11, oder ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dispergiert auf einem festen Träger, welches Partikel oder Fusionsprotein immunologisch mit einem Antikörper reaktionsfähig ist, der als Reaktion auf einen Infektionserreger bei Säugetieren erzeugt wird.

24. Zwischenprodukt in einem diagnostischen Test, bestehend aus einem Partikel nach einem der Ansprüche 8 bis 11, oder einem Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das immunologisch an einen Antikörper aus Säugetier-Körperflüssigkeit gebunden ist.