JPH02501026A - 融合タンパク質および粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２１、請求の範囲第７項に記載の粒子に対して生じた抗体。

２２、抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２１項に記載の抗体。

２３、抗体がヒト抗体である請求の範囲第２２項に記載の抗体。

２４、会合不純物から請求の範囲第７項に記載の粒子を分離し、その後、該粒子 の融合タンパク質からバイオ活性ペプチドを開裂することを特徴する実質的に純 粋なバイオ活性ペプチドを産生ずる方法。

２５、哺乳動物の感染因子に応答して生産された抗体に免疫反応性である請求の 範囲第７項に記載の粒子または融合タンパク質を固形支持体上に分散してなる診 断試薬。

２６、＠乳動物体液から抗体に免疫的に結合した請求の範囲第７項に記載の粒子 または融合タンパク質からな診断アッセイにおける中間体。

２７、第２アミノ酸配列が哺乳動物の感染因子に応答して産生された抗体に免疫 反応性である請求範囲第１項に記載の融合タンパク質。

明細書 融合タンパク質および粒子 技術分野 本発明は、抗原の提供および精製システムに関する。本発明は、実施態様におい て、酵母レトロトランスホゾ２１フ１粒子形成用遺伝子を含むベクター、粒子タ ンパク質および抗原の融合の高度発現用ベクターおよび酵母内融合タンパク質の 産生及び精製方法に関する。

背景技術 新らしい組換えＤＮＡ技術の最も重要な応用の１つは、感染症に対する安全なワ クチンの産生および実験上、工業上および診断目的で生じ得る抗血清に対する特 定タンパク質の合成にある。理論的には、これらの目標は、酵母サツカロミセス 　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｕ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の如き 微小有機体内で適切な抗原を合成することによって達成し得る。抗原は、ＥＰＡ ２−００７３６３５号に記載の如（適切な発現ベクターから発現させられる。

動物またはヒトの免疫システムに対する抗原の正確な提供は、有効なサブユニッ トワクチンまたはイムノゲン（免疫抗原）に対する重要な要求である。提供は、 潜在的なワクチン及び化学的に合成されたエピトープに基づくものに対するもの と同様に組換えＤＮＡによりなされたイムノゲンをともなう大きな問題となって いる。理想的なイムノゲンは、高分子世担体に組み立てられた多価抗原決定基の ポリマーである。好適なイムノゲンは、さらされたエピトープの最大数を有すべ きである。これらの要求は、抗原のキャリヤーへのランダム化学カップリングに よって達成することは困難である。理想的な状態は、抗原が大粒子複合体の表面 上に正確に配合して存在することであろう。その上、かかかるシステムの微粒子 特性は、簡単な物理的手段による抗原精製を促進するだろう。

これらの諸要求は、組換えＤＮＡ技術または化学合成法によるモノマータンパク 質の簡単な合成法によって、まれに達成されるだろう。

本出願前に、酵母内のイムノゲンを産生ずる自己集合微粒子抗原提供システムは 、組換えＤＮＡ技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａｅｔ　−ａｌ　１９８５　Ｂｌｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３．３２３）による抗原（例えばヘルペス　シンプレック スウィルスＩ　（Ｈ３Ｖ−Ｉ）グリコプロティンＤまたはポリオウィルス抗原） のへパテイタイス８表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質への融合に基づいていた 。融合タンパク質は、凝集して２２ｎｍの粒子を形成する。このシステムは、一 連の不利益を有している。

１）収率が極めて低い。

２）粒子が酵母細胞内で形成せず、抽出プロセスの副生物である（Ｈｉｔｚｅｍ ａｎ　ｅｔ　ａｔ　１９８３　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．２７ ４５０）。このことは、産生プロセスに制限を課す。

３）融合物のなかには粒子を形成しないものがある。

る。即ち、抗体は、優先的にＨＢｓＡｇに作られる。

ニスカーン等（Ｋｎｉｓｋｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ　ｉｎ　Ｇｅｎｅ　４６１３５（ １９８６）　）はへバティティスＢコア抗原（ＨＢｃＡｇ）が酵母内で極めて高 いレベルで粒子を形成するが、他のエピトープを運搬するその用途に関する報告 がまだなされていないことを報告している。これらの粒子が、マウスに対して極 めて高い免疫性を有することが報告されているので、ＨＢｓＡｇ粒子の様に免疫 優位性を発揮するだろう。

ハインズ等（Ｈａｙｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ（Ｂｌｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４６ ３７１９１Ｂ＞）は、細菌における対応システムについて報告している。タバコ 　モザイク　ウィルス（ＴＭＶ）被覆タンパク質は、粒子構造を組み立てる実体 である。ＴＭＶ被覆タンパク質が、イー、コリ（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ）内で発現し、 そして精製されると、インビトロで該タンパク質を多価粒子に組み立てることが 可能となる。ＴＭＶ被覆タンパク質および他のタンパク質によってなされた融合 タンパク質は、免疫抗原性であるハイブリッド粒子を産生ずる。ポリオエピトー プがサルク（Ｓａｌｋ）ワクチンより１／４程度免疫抗原性が低いけれども、８ アミノ酸のポリオエピトープが試験され、そして免疫抗原性であることが示され た。このシステムは、粒子径を実験的に変化でき、混合粒子（即ち、１タイプの エピトープ以上を運搬する）が極めて容易に産生できるという潜在的な利益を有 する。しかしながら、予想された不利益は、相対的に小さな抗原のみがＴＭＶ粒 子に添加可能である、ということである。

メロ−等（Ｍｅｌｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ　ｉｎ　Ｎａｔｕｒｅ　３１３２４３（１ ９８５））は、融合タンパク質が、酵母イーストＴｙ転写解読枠ＯＲＦ　１（Ｔ ＹＡ遺伝子と指定する）、転写解読枠０ＲＦ２　（ＴＹ旦遺伝子と指定する）お よびインターフェロンをコードする核酸からなる生成物である、ことを開示する 。しかしながら、この報文には、産生融合タンパク質または事実どんなＴｙタン パク質が組み立てられ粒子となる、またはなるだろう、という記載も示唆もない 。

発明の開示 レトロトランスポゾン類の遺伝物質によって発現されたある種のタンパク質は粒 子への自己組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）能力を有することが見い出された 。同様に、かかるレトロトランスポゾン誘導組み立てタンパク質に基づくもので あり、かつ、抗原−（または他のバイオ活性分子）提供粒子へ組み立て得る融合 タンパク質を構成することが可能なことも見い出された。更に、類似融合タンパ ク質がＲＮＡレトロウィルスからの組み立てタンパク質に基づいて構成し得るこ とが見い出された。

第１の態様によれば、本発明は、粒子へ組み立て可能な融合タンパク質を提供す ることにあり、ここで該タンパク質は第１アミノ酸配列およびバイオ活性第２ア ミノ酸配列からなり、該第１アミノ酸配列がレトロトランスポゾンまたはＲＮＡ レトロウィルスによってエンコードされた粒子形成タンパク質と実質的に同−源 であり、また第２アミノ酸配列が３０アミノ酸残基以上を含むのであれば、第２ アミノ酸配列の最初の３０残基は、対応するレトロトランスポゾンまたはＲＮＡ レトロウィルスによる第１アミノ酸配列へ自然に直接的に融合したアミノ酸配列 を形成することはない。

第２の態様によれば、本発明は、複数の融合タンパク質から成る粒子を提供する ことにあり、ここで各融合タンパク質は第１アミノ酸配列および第２アミノ酸配 列からなり、該第１アミノ酸配列がレトロトランスポゾンまたはＲＮＡレトロウ ィルスによりエンコードされた粒子形成タンパク質と実質的に同−源であり、該 第２アミノ酸配列がバイオ活性であり、かつ、該レトロトランスポゾンまたはＲ ＮＡレトロウィルスによる第１７ミノ配列に自然に融合しないものである。

かかる粒子は、一般的には実質的に純粋であり、少なくとも５％、１０％、２０ ％、５０％、８０％、９０％、９５％または９９％（重曾）純粋であり、好まし さが増加する。　粒子は複数の異なる融合タンパク質からなる。即ち、該融合タ ンパク質は、互いに異なる第２アミノ酸配列を有する。２．３またはそれ以上の 異なる第２アミノ酸配列が粒子に存在する。

第１アミノ酸配列は、酵母ＴｙＴＹＡ遺伝子、コピア（Ｃｏｐｉ　ａ）生成物お よび昆虫またはＲＮＡレトロウィルスのｇａｇ遺伝子からのコピア様要素からの 生成物である。

レトロウィルスとは、ヒト免疫欠失ウィルスＩとＩＩ　（ＨＩＶ−Ｌ　ＨＩＶ− ＩＩ）　、Ｓ　ＩＶ、　ヒトＴ−細胞リンホトロピックウイルスＩとｎ　（ＨＴ ＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ｎ）、ネズミ　ルカエミア（Ｌｅｕｋａｅｍｉａ）ウィル ス、モロネー　ネズミ　ルカエミア　ウィルス、マウス乳房腫瘍ウィルス、鳥類 のルコシス（Ｌｅｕｋｏｓｉｓ）ウィルス、ねこのルカエミアウイルス、ヒトＢ −細胞リンホトロピック　ウィルスおよび牛ルカエミア　ライスルである。上記 の如く、レトロトランスポゾンには、酵母のＴｙ要素、ドロソフィリアメラノガ スタ−（Ｄｒｏｓｐｈｉｌｉａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）が如き昆虫のコピ ア様コピア要素、マウスのＶＬ３０およびマウスの■ＡＰ遺伝子が含まれる。

好適なレトロトランスポゾンは、酵母レトロトランスポゾンＴｙである。先に、 Ｔｙが６０ｎａ＋ウィルス様粒子（ＴＶ−ＶＬＰ）の合成に関係することが示さ れている（Ｈｅｌｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ　１９８５ａ　Ｎａｔｕ、ｒｅ　３１８． ５１３）　ｏ　ｐ　１タンパク質が工ＹＡ遺伝子によってエンコードされており 、安定であり、そして更なるプロセスを必要としないことが見い出された。

それ故、Ｔｙエンコード化アミノ酸配列は、好ましくは工ＹＡ遺伝子によってエ ンコードされたｐ１タンパク質である。Ｔｙの両クラス（工と■）がｐｌを形成 することは公知である（Ｆｕｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ　ＮＡＲ１３（１１）１９８ ５４０９７）。従って、どちらも使用可能だろう。

Ｔｙエンコード化アミノ酸配列は、ｐ１タンパク質の全体である必要はなく、代 わりに、ＴＹＡ遺伝子の一部によってエンコードされたｐ１タンパク質の一部で あってよく、該部分はＴｙウィルス様様子子’ｒｙ−ｖｔｐ）合成に関与し得る 。アミノ酸配列の２８６〜３８１（第１６図）部分が粒子形成に必要であること が決定された。好ましくは、Ｔｙエンコード化アミノ酸配烈は、Ｔｙｌ−１５か ら誘導可能である。ＴＹＡ遺伝子末端における停止コドンは、含まれないことが 好ましい。−しかし、含まれれば、融合タンパク質は、停止コドンがウィルソン 等（ＮＡＲ１４（１７）１９８６７００１）の記載による枠移動機構によって２ ０回に１回の割合で無視されるので、低収率ではあるが、発現が続くだろ子生成 物（Ｄｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ　１９ｇ４　ＥＭＢＯ，Ｊ３，１１１５）および 第１６図の少なくとも２８６〜３８１のアミノ酸配列フラクションを含む部分が ”ｒｙ−ｖＬｐ産生に重要であることが示される。

第２アミノ酸配列（即ち、実施態様において、非Ｔｙタベきもののいずれかのア ミノ酸配列である。バイオ活性は、単一活性（例えば、抗原性）、レセプター結 合活性、治療活性または標的活性（即ち、ホームから特別な標的へ能力）、また は二種またはそれ以上の異種バイオ活性の組み合せを有する。同様に、異種融合 タンパク質が粒子抗原に組み立てられ、それによって、全粒子が１以上の活性を 有するようになる。

例えば、第２アミノ酸配列は、インターフェロン遺伝子の如きリンフ才力イン遺 伝子、またはウィルス、細菌または他の（例えば、原生動物の）寄生生物の如き 、感染因子の抗原をコードする遺伝子から誘導される。例えば、インフルエンザ 　ウィルス抗原、ＨＩＶ−ＩまたはＨＩＶ−Ｉｆ（即ち、ＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ、Ｌ ＡＶまたはＡＩＤＳ）ウィルス、狂犬症ウィルス、ＥＭＤＶウィルス、ＨＢｓＡ ｇＳＨＢｃＡｇ１ポリオウィルス、インフルエンザ　ウィルス、バラインフルエ ンザ　ウィルス、呼吸性シンシチウムウィルス、ライノウィルス、コロナウィル ス、アデノウィルス、ロタウィルス、ノルバルクウィルス（Ｎｏｒｖａｌｋｖｉ ｒｕｓｅｓ）　、アルボウィルス、例えばデンゾ、ヘルペス　シンプレックス、 サイトメガロウィルス、エプスタイン　パール　ウィルス、麻疹ウィルス、ムス プス　ウィルス、ルベラ（Ｒｕｂｅｌ　Ｉａ）、ウマ　インフルエンザ　ウィル ス、ウマの鼻肺炎、ブタトランスミッシフル胃腸炎ウィルス、ジステンパー、バ ロボウイルス（Ｐａｒｏｖｏｖｉｒｕｓ）　Ｆ　ｅ　Ｌ　Ｖ　、ベネズエラまた はウェスターン　ウマ脳炎、プラスモディウム　トリパノゾーマ、住血吸虫、ク ラミジア　トラコーマティス（ｔｒａｃｈｏｎ＋ａｔｉｓ）若しくは髄膜炎菌で あり、または上記抗原のフラグメント若しくは化学的に合成されたコーディング 配列から生じたペプチドであるので生成したペプチドは、上記抗原またはフラグ メントと実質的に同一抗原性を有する。

多くのウィルスと細菌抗原のヌクレオチド配列は既知であり、かかる抗原は、組 換えＤＮＡ技術で調製し得る。ＤＮＡコーディング配列は、本発明の融合タンパ ク質の第２アミノ酸配列コードに使用し得る。例えば、百日咳とマラリアの如き 、通常の病気に関連した抗原用のヌクレオチド配列は、公知である［百日咳、百 日咳菌　、ＷＯ３７１０３３０１゜６月４日１９８７：Ｍａｌａｒｉａ　Ｐｌａ ｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｉｖａｘとＰ、　ｆａｌｅｉｐａｒｕＬ　Ｄａｍｅ、　ｅｔ 　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２５：　５９３．１９８４：Ｅｎｅａ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２５：６２８．１９８４：　Ｙｏｕｎｇ、 　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２５：９５８．１９８４］。他の一般 的な病気に対する抗原ヌクレオチド配列は公知である ［Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、　ＥＰＯ２１８，４７４とＥＰＯ０２０，２５１：Ｈｅ ｒｐｅｓ、　ＥＰＯ２１Ｂ、　１９８５と日本の８１−９７６３０゜Ｒａｂｉｅ ｓ、　ＷＯ３７１００１７９：　Ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ、　ＥＰＯ２１０，９３ １：Ｐｏ１ｉｏ、　ＶＯ３Ｂ１０１８２８と日本の６１−４７５８５］。

第２アミノ酸配列の最初の部分はリンカ−配列であり、その配列は、ある環境に おいて容易に切断される。第２アミノ酸配列残部は、精製段階において切断され る。

それ故、本発明の微粒子抗体は、ワクチンの調製に有効であり、このことは本発 明の他の態様を形成する。第２アミノ酸配列は、このように前記感染因子の１つ である抗原のアミノ酸配列をコードする。ワクチンは、微粒子抗原および無菌生 理食塩水または無菌ＰＢＳの如き生理学的に許容可能な非毒性キャリヤーからな る。無菌性は、非経口投与ワクチンにとっては一般に必須である。−以上の適切 なアジュバントが存在してもよい。好適なアジュバントには、ムラミル　ジペプ チド、水酸化アルミニウムおよびサポニンが挙げられる。

本発明のワクチンが１以上の抗原を提供することに注目すべきである。異種微粒 子抗原のカクテルかまたは１以上のエピトープを有する微粒子抗原の均質集団（ 例えば、異なるハイブリッドタンパク質の混合物を凝集させ、または１以上の微 粒子抗原を小細胞に発現させることによって調製されたものである）が使用され る。または、ワクチンは、これら種類の微粒子抗原混合物を含有することも可能 であった。

他の態様において、本発明は、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列か ら成る核酸を提供することにあり、ここで第１ヌクレオチド配列は、粒子形成タ ンパク質をエンコードするレトロトランスポゾンまたはＲＮＡレトロウィルスの 遺伝子物質と実質的に同−源かまたは相補的であり、第２ヌクレオチド配列は、 他のバイオ活性アミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列をエンコードす るかまたは相補的であり、そして該核酸は、前記レトロトランスポゾンまたはＲ ＮＡレトロウィルスによって自然に産生されることのない融合タンパク質を形成 するように単位解読枠として発現し得、そして融合タンパク質が粒子となる。

核酸がスプライシングまたは終了阻害なしで発現し得ることは、一般的な場名Ｃ ある。枠移動は、一般には生じないだろう。

本発明のある実施態様において、ＴＹＡ融合遺伝子を産生ずるためのいずれの非 Ｔｙタンパク質コーディング配列に融合し得るＴＹＡ遺伝子誘導体を提供できる 。ＴＹＡ融合遺伝子は、ハイブリッド　ＴＶ−ＶＬＰに組み立てられる融合タン パク質を産生ずる。ハイブリッド　Ｔｙ−ＶＬＰは、高収率で産生じ得、かつ簡 単な物理手段によって生成可能な高分子量微粒子抗原（または他の粒子の）提供 システムを構成する。

更に本発明によれば、前に定義した核酸を含む発現ベクターが提供される。例え ば、ＴＹＡ遺伝子誘導体を含み、そして酵母内においてハイブリッド’ｒｙ−ｖ Ｌｐの高度産生に関するｐＭＡ５６２０がある。

本発明の発現ベクターは、通常、プロモーターを含有する。ＰＧＫは好適なプロ モーターであるが、他のプロモーターも必要により使用可能であり、また好まし い。例えば、ＧＡＰＤ、ＧＡＬＩ−１０、ＰＨ０５、ＡＤＨｌ、ＣＹＣｌ、Ｔｙ デルタ配列、ＰＹＫおよび１以上のこれらのプロモーター成分から作られたハイ ブリッドプロモーターまたは他のプロモーターを挙げることができる。

同様に、本発明はホスト細胞、例えはイー、コリ（Ｅ、　ｃ。

１ｉ）の如き細菌細胞、サツカロミセス　セレビシェ（ＳａＣｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）如き酵母、またはチャイニーズノ翫ムスターオリバ ー細胞（ＣＨＯ’）″またはハイブリッド粒子の産生に関する前記発現をベクタ ーを含有するＣＯ８細胞の如き動物細胞を挙げられる。

微粒子抗原の多価特性のため、従来の抗原より容易に抗体を産生じ、かつ該抗体 は、特異な性質を有しやすい。さらに本発明は、抗原性である本発明の粒子に対 して生ずる抗体を提供する。抗体は、本発明のハイブリドーマ細胞により産生さ れたポリクローナル（例えば、抗体をラビットに注射して得られたもの）または モノクローナル抗体である。微粒子抗原の多価特性のため、インビトロ免疫法は 、抗原の他の形態を有するものよりも達成しゃい。すなわち、このことは、ヒト モノクローナル抗体の産生を促進する。

ハイブリドーマ細胞は、免疫化動物の牌臓細胞と腫瘍細胞を融合して調製し得る 。その後、好適に分泌ハイブリドーマ細胞が選択される（　Ｋｏｅｈ　Ｉ　ｅｒ とＭｉｌｓｔｅｉｎ　Ｎａｔｕｒｅ　１９７６２９６４９５）。

同様に、本発明は、好適なバイオ活性ペプチド精製技術を提供する。本発明の態 様は、例えば濾過または遠心分離によって会合不純物から粒子を一般に相対的容 易に分離できるという事実に基づいている。それ故に、実質的に純粋なバイオ活 性ペプチド産生方法が与えられるが、該方法は前記の如く会合不純物から粒子を 分離し、その後、粒子の融合タンパク質からバイオ活性ペプチドを切断する方法 である。

本発明の融合タンパク質および微粒子抗原は、診断薬として有効である。診断目 、的の微粒子抗原は、遠心分離または濾過によって物理的に分離でき、かつガラ ス、プラスチックスライド、ディップ　スティック、マクロまたはミクロピース 、試験管、微小力価ウェル等の固形支持体上に直接分散し得るために、特に有効 である。本発明の微粒子抗原は、吸着剤ディスク（米国特許第４，６３２，９０ １号）、ストリップの如き繊維状または吸水性材料、または固形支持体としての クロマトグラフィーカラムにも分散し得る。

粒子と融合タンパク質は、容易に固形支持物に付着する。

粒子は、精製後融合タンパク質へ破裂させられ、該融合タンパク質は、前記の如 く表面分散し得る。試薬は、多くの診断試験に有効である。例えば、微粒子抗原 に対する抗体を有すると思われる試験サンプルおよびケイ光、酵素または放射性 標識抗体は、固形支持体上の微粒子抗原または融合タンパク質と競争的に反応す る、そして固形支持体上の微粒子抗原と結合する標識化抗体の量、同様に、本発 明の微粒子抗原は、抗原との凝集反応に有効である。診断分野の当業者は、本発 明の微粒子抗原および融合タンパク質の診断用途に対する多くの応用例を認める だろう。

本発明は、添付図面を引用して、次の実施例によって説明される。

第１図は、プラスミドｐＭＡ９１−１１で形質転換したＭＤ４０−４ｃから精製 した’ｒｙウィルス様粒子粒子ｙ−ＶＬＰ）の写真である。

第２図は、ｐＭＡ５６２０とｐＭＡ５６２０−８の構造を示す概略図である。

第３図は、本発明の実施例の主要成分の拡大図および主要結合部のヌクレオチド の配列を有するプラスミドｐＭＡ５６２０−８の概要図である。

第４図は、ｐＡＭＡ９１−１１．ｐＭＡ９１とｐＭＡ５６２０−８を含有するＭ Ｄ４０−４ｃから粒子とタンパク質のスクロースグラジェント分離のフラクショ ンのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析の写真である。

第５図は、ｐＭＡ５６２０−８を含有するＭＤ４０−４０から精製したハイブリ ッド’ｒｙ　：　ＩＦＮ−ＶＬＰの写真である。

第６図は、ｐＭＡ５６２０−８を含有するＭＤ４０−４０の抽出物からのスクロ ースグラジェントフラクションのウェスターンプロットの写真である。

ａ）は抗”ｒｙ−ｖｔｐ抗体を使用する結果を示す。

ｂ）は抗インターフェロン抗体を使用する結果を示す。

第７図は、精製ハイブリッドＴＶ　：　ＩＦＮ−ＶＬＰ製剤（１）　、ｐＭＡ５ ６２０−８で形質転換したＭＤ４０−４０の全抽出物（２）と非形質転換ＭＤ４ ０−４ｃ　（３）内のタンパク質クーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲ水 分析の写真である。

第８図は、抗Ｔｙ−ｖｔｐ担体（ｂ）、抗ハイブリッドＴＹ　：　Ｉ　ＦＮ−Ｖ ＬＰ抗体（ｄ）および対応するブレブリード（Ｐｒｅｂｌｅｅｄ）血清（ａ＋Ｃ ）を使用するウェスターンプロットの写真である。各々は、ｐＭＡ９１　（１） ｐＭＡ９１−１（２）を含有するＭＤ４０−４ｃの全抽出物に対して使用される 。プラスミドｐＭＡ９１−１は、ＩＦＮ−アルファ２の合成を誘導する。ｐＭＡ ９１は、負の対照例であり、インターフェロンを産生じすい。

第９図は、ＨＡコドン２５−１１１含有２６２ｂｐ　５ｐｅＩ：５ｐｅＩフラグ メントのヌクレオチド配列を示す図である。実施例５を参照のこと。

第１０図は、プラスミドｐＭＡ５６２０−ｈａ２３を示す図である。

第１１図は、ｐＭＡ５６２０またはｐＭＡ５６２０−ｈａ２３で形質転換したＭ Ｄ４０−４ｃ抽出物のスクロースグラジェント　フラクションの５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ分析結果を示す図である。タンパク質は、クーマシブルー染色されている。

第１２図は、精製Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰｓの電顕写真である。

第１３図は、ｐＭＡ−５６２０−ｈａ２３で形質転換したＭＤ４０−４Ｃ抽出物 のスクロース　グラジェント　フラクションからのタンパク質のウェスターンプ ロット図である。プロットは、抗Ｔｙ−ｖＬｐ抗体と抗全インフルエンザウィル ス抗体でプローブされた。

第１４図は、精製７ｙ　：　ＨＡ−ＶＬＰ、全インフルエンザウィルスＮＴ６０ 　（Ｈ３）および左から右へ、正常“プレーブレッド（ｐｒｅ−ｂｌｅｄ）”ラ ビット血清、抗ＴＶ−ＶＬＰ抗血清正常“プレーブレッド“ラビット血清、抗Ｔ Ｙ：ＨＡ−ＶＬＰ抗血清および抗全インフルエンザウィルス血清でプローブした 全インフルエンザウィルスＰＲ８のウェスターンプロット図を示す。

第１５図は、Ｐ　Ｍ　５６２０からｐＭＡ５６２０−３５８を調製する方法を示 す図である。ｐＭＡ５６２０−３５８は、ＴＹＡの最初の２８０コドンを含有す る。

第１６図は、少なくとも粒子形成に必須なタンパク質の２８６〜３８１セグメン トを含むＴＹＡ１〜３８１アミノ酸のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図である 。アミノ酸の記号は、次のようである。

アスパラギン酸　Ｄ Ａｓｎおよび／またはＡｓｐ　Ｂ システィン　Ｃ グルタミン　Ｑ グルタミン酸　Ｅ Ｇｌｎおよび／またはＧｌｕ　Ｚ バリン　Ｖ 実施例１ 使用した菌株は、イー、コリ（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ）　ＡＫＥＣ２８（ｃ８００．　 ｔｈｒ　Ｃ，ｔｈｙＡ、　ｔｒｐ　Ｃ１１１７，ｈｓｄ　ＲＫ、　Ｈｓｄ　Ｋ９ ）とニス、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＭＤ４０−４　ｃ　（ ｕｒｄ　２゜江ｐｔ、圏ｕ　２−３．江ｕ　２−１１２．肛３−１１．肛３−１ ５）であった。

イー、コリー（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ）媒体は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ　１９７２　Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃ３ Ｈｐ４３３）の方法で、そして酵母媒体は、ホーソーンと　モーティマー（Ｈａ ｖｔｈｏｒｎｅ　ａｎｄ　Ｍｏｒｔｉｍｅｒ　１９６０　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４ ５．１（１８５）の方法で調製した。　イー、コリー（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ）を標準 的な方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　１９８２　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃ３ｌＩ　ｐ１９９）で形質転換、した。酵母を、ヒンネン等（Ｈｉｎｎｅｎｅ ｔ　ａｔ、　１９７８　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ　７５． １９２９）の記載方法の如く形質転換した。

制限消化およびプラスミド構成用の標準的な方法を使用した（Ｍａｎｉａｔｉｓ 　ｅｔ　ａｌ、　１９８２．　ｏｐ、　ｅｆｔ、）　ｏ制限酵素とＴ４　ＤＮＡ リガーゼは、供給者の指示どうりに使用した。

Ｂａｌ　３１　エキソヌクレアーゼ消化は、ドブソン等の記述に沿って実施した （Ｄｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８２　Ｎｕｃ、１．　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 　１０．５４６３）。欠失終了点は、ＤＮＡ配列化によッテ決定された（Ｓａｎ ｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　１９７７　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ ｔ。

７４、５４６３）　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ合成オリゴヌクレオチドリンカーは、ファ ーマシアから得た。

プラスミドＤＮＡをチノルトとカーボン（Ｃｈｉｎａｕｌｔ　ａｎｄＣａｒｂｏ ｎ　１９７９　Ｇｅｎｅ　５．１１１）およびホルメスとフライグレイによる急 速分析（Ｈｏｌｍｅｓ　ａｎｄ　Ｑｕｉｇｌｅｙ　１９８１　Ａｎａｌ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　１１４．１９３）に記載の如く、予めイー、コリー（Ｅ、　Ｃｏ １ｔ）から単離した。

Ｔｙ−ＶＬＰを次のように精製した。すなわち、酵母細胞を、３０℃において８ Ｘ１０８細胞／ｍｌの密度に選択的に成長させた。その後、細胞を低速遠心分離 で集め、氷冷水で１度洗浄し、そして１ｆ１当り１ｍｌの細胞でＴＥＮバッフｙ −（ｌｏｍＭ、　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４；　２ｍＭ　ＥＤＴＡ：　１４０ｍＭ 　Ｎａｃｌ）に再懸濁させた。細胞を、〉７０％破壊するまで４℃においてガラ スピーズ（４０メツシユ、　ＢＤＨ）で撹拌して破壊した。ビーズを低速遠心分 離で小球化し、その後上澄を集め、破片をミクロフユージ中で２０分間遠心分離 にかけて除いた。

”ｒｙ−ｖＬｐを４℃において１００．０００ｇで１時間遠心分離し、そして１ 夜ＴＥＮバツフアー中で再懸濁させて、上澄液からペレット化した。再懸濁’ｒ ｙ−ｔｖｐを、上澄液を１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ７，４；　１０ｎＭ　Ｎ ａｃΩ中の１５−４５％（Ｗ／Ｖ）スクロースグラジェントに導入し、そして１ ５℃において７６．３００ｇで３時間スピンする前に、４℃において１５分間ミ クロフユージ中で遠心分離にかけて細胞破片を除いた。フラクションを試験管の 底から回収し、ピークフラクションを、アリコートのフラクションを５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥゲルおよびクーマシーブルー染色法で試験し同定した。ＶＬＰを、４℃に おいて１００、　０００　ｇで１時間ピークフラクションを遠心分離することに よって、濃縮した。

全酵母細胞のタンパク質抽出物を、前記の如く調製した（Ｍｅｌｌｏｒ　ｅｔ　 ａｔ　１９８３　Ｇｅｎｅ　２４．１）　ｏゲル工程は、ラエムリの方法であっ た（Ｌａｅｍｍｌｌ　１９７０　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６ｇ）　。タンパク質 濃度は、バイオ−ラド　ラボラトリーズから得た染料結合アッセイ法（Ｂｒａｄ ｆｏｒｄ　１９７６　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２．２４８）を用いて 測定した。

ポリクローナル馬抗インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ抗体は、イーリンガー 　マンハイムから購入した。抗ＴＶ−ＶＬＰ抗血清は、標準的な方法でラビット から調製した。

ウェスターン　ブロッティング法は、タウビン等の記載の方法に従って実施した （Ｔｏｖｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９７９　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｅｔ　７６、４３５０）　、結合抗体を、西洋わさび（ｈｏｒｓｅｒａｄ ｉｓｈ）パーオキシダーゼに共役したラビット抗−ホース（ｈｏｒｓｅ）第２抗 体（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）かまたはラビット中に生じたパーオキ シダーゼ抗パーオキシダーゼ（ＰＡＰ）複合体に附随するヤギ抗うビット第２抗 体（シグマ）のいずれかによって検出した。酵素反応は、デ　プラスとチェルピ ンスキーの記載の方法（Ｄｅ　Ｂｌａｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｌ　１９ ８３Ａｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　１３３．２１４）の如く展開した。

プラスミドｐＭＡ９１−１１は、以前に記載している（Ｄｏｄｓｏｎ　ｅｔ　ａ ｔ　１９８４　ＥＭＢＯ，Ｊ、　３．１１１５　）　ｏそのプラスミドは、高効 率発現ベクターｐＭＡ９１に挿入されたＴｙ要素、ＴＹＩ−１５、の主要転写単 位である最初の１４５０ヌクレオチドを含んでいる（Ｍｅｌｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ 、　１９８３　ｏｐ、　ｃｉｔ：　Ｋｌｎｇｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｋｉｎｇｓｍａ ｎ　１９８５　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔ、　Ｅｎｇ、　Ｒｅｖ、 　３．３７７）。Ｔｙ酸成分、ドブソン等［Ｄｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（ｏｐ 。

ｅｆｔ）］等の記載の如く、ｐＫＴ４０ｂから誘導された。

ｐＫＴ４０ｂは、イギリス国アバディーンのＮＣＩＢに寄託し、アクセッヨンナ ンバーＮＣｌＢ１２４２７を受けた。

次に、発現ベクターｐＭＡ９１は、イー、コリー（Ｅ、　Ｃｏ１１）内で複製と 選択を許容するプラスミドｐＢＲ３２配列、酵母内で効率的な自立複製を許容す る複製の酵母２ミクロンプラスミド源、酵母１ｅｕ２とＥ、ｃｏｌｉ　１ｅｕＢ 突然変異体の両者中の選択的マーカーとしての酵母ＬＥＵ２遺伝子、および酵母 転写終結用の全信号を含むＰＧＫの３′領域から１５００〜１の酵母ＰＧＫ遺伝 子の上流非コーディング領域を分離する旦ｇ／ＩＩ発現部位から成る。プラスミ ドｐＭＡ９１は、米国特許４６１５９７４号の第１５図にｐＭＡ３０１３と指定 されたプラスミドがプラスミドｐＭＡ９１として公知であるが、該米国特許に記 載されている。米国特許４６１５９７４号の第１図の下部に示されたプラスミド は、それ故に、改名されている。

従って、Ｔｙ発現は、高効率酵母ホスホグリセレートキのｐ１タンパク質、第１ 翻訳生成物のｐＭＡ９１−１１過多生産における大きなかたまりを含む菌株の酵 母抽出物から誘導される（Ｄｏｂｓｏｎ′ｅｔ　ａｌ、、　１９８４　ｏｐ、　 ｃｉｔ；　Ｍｅｌｌｏｒ　ｅｔａｌ、　１９８５ａ、　ｏｐ、　ｃｉｔ）　、　 ｐＭＡ９１−１１含有酵母形質転換体の抽出物は大量にＴＶ−ＶＬＰを含むこと が示される（第１図）。それ故に、ＴＹＡ単独で’ｒｙ−ｖｔ、ｐ形成に関する 十分な情報を含み、そしてｐＭＡ９１−１１含有ＭＤ４０−４ｃの抽出物中に発 見されたｐｌタンパク質が粒子に組み立てられる（第１図と第４図）。この情報 は、本発明の基礎を提供する。

プラスミドベクターｐＭＡ５６２０の構成、即ちハイブリッドＴＶ−ＶＬＰ粒子 の合成に関するものは、第２図に図示されている。このことは、ベクター構成が ＴＹＡ遺伝子内に便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を要求しているラスミドｐ ＭＡ９１−１１は、ＢｇｌＩ［で切断され、多くの時間Ｂａｌ　３１エキソヌク レアーゼで消化され、そして過剰のＢａｍＨＩリンカ−（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ ）の存在下で再すゲートされた。生成したプラスミドの欠失終了点は、ＤＮＡ配 列化によって決定された。プラスミドｐＭＡ９１−３５７は、２６５ｂｐが除去 された欠失誘導体である。このことは、ＢａｍＨＩリンカ−を、ＴＹＡのコドン ３８１を越えてヌクレオチド上に配置する（第３図）。

すべての三つの解読枠の転写終了配列および翻訳停止コドンの両者を提供するた めに、ｐＭＡ９１−３５７の欠失ＰＧＫ３’終止配列をプラスミドｐＤＴ８６か ら単離した２８７　ｂｐ　ＢａｍＨＩ−８ａｌＩ　ＤＮＡフラグメントで置換し た。このＤＮＡフラグメントは、ＢａｍＨＩ部位下流における全ての三つの解読 枠に翻訳停止コドンを含トである（第２図と第３図）。この終止フラグメントは 、ＰＧＫコーディング配列の最終センス　コドンにリンクしたＢａｍＨＩリンカ −（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）で開始し、モしてＰＧＫコーディング配列を越えて ＨｉｎｄＩＩＩ部位２７９ヌクレオチドに拡大する（Ｈｉｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　 ａｔ、　１９８２　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１０．７７９１）。これ らの構成において、ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、合成リンカ−を用いてＳ、１１　Ｉ に変更されている。終止フラグメントは、臨界的ではなく、そして酵母転写終止 を付随するすべての三つの解読枠の終止コドンを含むフラグメントは十分であろ う。生成したプラスミドｐＭＡ５６２０は、ハイブリッドＴｙ−ＶＬＰへ組み立 てられるハイブリッドタンパク質を産生ずるために好適な配列が挿入される唯一 のＢａｍＨＩ部位を含んでいる。

ｐＭＡ５６２０を試験するために、インターフェロン−アルファ２　（ＩＦＮ） 　ｃＤＮＡがモデル抗原コーディング配列として使用された。５４０ｂｐ　Ｂａ ｍＨＩ　ＩＦＮ−アルファ２　ｃＤＮＡ　フラグメント、すなわちフラグメント ８と指定されている（Ｍｅｌｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ　１９８５ｂ　Ｇｅｎｅ３３、 ２１５）ものをプラスミドｐＭＡ５６２０の唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入した。

生成したプラスミドは、ｐＭＡ５６２０−８　（第２図と第３図）と指定された 。

ｖＬＰは、プラスミドｐＭＡ５６２０−８で形質転換された酵母菌株ＭＤ４０− ４Ｃから調製され、そして１５−４５％スクロースグラジェントからのフラクシ ョンは、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで試験された。グラジェント中のタンパク質は、 クーマシーブルー染色法で目視化された（第４図）。予想７０ｋｄ　ＴＹＡ−Ｉ ＦＮ融合タンパク質のグラジェント中の位置は、最終的にタンパク質の微粒子特 性を示した。フラクションの電子顕微鏡写真は、微粒子が存在すること確認した （第５図）。７０ｋｄ微粒子タンパク質が事実、Ｔｙ　（５０ｋｄ）：　ＩＦＮ 　（２０ｋｄ）であることを立証するために、スクロースグラジェントからの融 合タンパク質フラクションを再度５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで試験し、そて分離した タンパク質をニトロセルロースフィルターに移した。１つのフィルターは、Ｔｙ タンパク質との反応が公知であるＴｙ−ＶＬＰ抗体でプローブし、そして他のも のは、抗ＩＦＮ−アルファ抗体でプローブした（第６図）。両者において、強く 反応した７０ｋｄタンパク質は、このタンパク質がＴＶとＩＦＮエピトープの両 者を含むことを示した。

ハイブリッドＴＶ　：　ＩＦＮ−ＶＬＰ生成方法の効率は、第７図で示される。

７０ｋｄハイブリツドタンパク質は、製剤において非常に重要な種である。

モデル抗体に対する免疫応答性を引き出すこれらのハイブリッドＴｙ：　Ｉ　Ｆ Ｎ−ＶＬＰ効能を試験するために°、ラビット内の抗血清が、ｐＭＡ５６２０− ８で形質転換された酵母抽出物から精製された濃縮ハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ− ＶＬＰに対して提案させた。ＩＦＮ−アルファ２を過剰生産するプラスミドｐＭ Ａ９１−１で形質転換したＭＤ４〇二４Ｃ抽出物（Ｍｅｌｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ、 　１９８５ｂ　ｏｐ、ｃｉｔ、）を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、それに沿っ てインターフェロンを産生じないｐＭＡ９１で形質転換したＭＤ４０−４ｃを抽 出物も上記の如く行なった。分離したタンパク質をニトロセルロースに移し、’ ｒｙ−ｖＬｐ抗血清かまたはＴｙ：ＩＮＦ−ＶＬＰ抗血清のいずれかでプローブ した（第８図）。両抗血清が抽出物中に存在するＴＶタンパク質と反応するけれ ども、抗ハイブリッドＴｙ：　ＩＮＦ−ＶＬＰ抗血清がプラスミドｐＭＡ９１− １を含有する抽出物中の２０ｋｄＩＦＮタンパク質と反応した。

これらのデータは、次のことを示す。１）ｐＭＡ５６２０−８は、Ｔｙタンパク 質ｐ１の最初の３８１個のアミノ酸と非ＴＶタンパク質とからなるハイブリッド 融合タンパク質の合成を誘導する。この場合、インターフェロンアルファ２であ る。２）この融合タンパク質は、ハイブリッドＴｙ：　ＩＦＮ−ＶＬＰを形成す る。３）ハイブリッドＴｙ：Ｉ　ＦＮ−ＶＬＰは、容易に単離し得る。４）ハイ ブリッド・ＴＶ　：　Ｉ　ＦＮ−ＶＬＰは、ラビット免疫システムに対してモデ ル抗原、インターフェロン−アルファ２を提出する。

成を誘導するものであり、そしてかかる粒子中に存在するいかなる抗原も哺乳動 物の免疫システム、例えばラット、ハムスター、犬、猫、ウシ、羊、ブタおよび ヒトに提供することが理にかなっている。明らかに、ここで実施例として使用し たインターフェロンｃＤＮＡは、完全なタンパク質またはタンパク質の部分をエ ンコードする他のＤＮＡ片で置換できた。

この抗原提供システムの微粒子特性およびそのためのハイブリッドＴｙ−ＶＬＰ 精製の容易さは、本発明を、規定された抗原に対する抗体産生刺激手段として、 新規ワクチンの生産手段として、モノクローナル抗体産生用に規定された抗原調 製用の手段として、診断アッセイ法用抗原の調製手段として有効にする。

ツレ故、ハイフリットＴｙ：　Ｉ　ＦＮ−ＶＩ　Ｐは、抗ＩＦＮ抗体（モノクロ ーナルまたはポリクローナルのいずれかであるが、好ましくはモノクローナルで ある）を高めるために使用される、ここで該抗体はその後ＩＦＮ精製に使用ドロ ソフィリア　メラノガスタ−（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ　ａ＋ｅｌａｎ。

ｇａｓｔｅｒ）のコピア要素は、遺伝子およびウィルス様粒子形成の両者におけ る酵母のＴｙ要素に極めて類似する（Ｎｏｕｎｔ　＆　Ｐｕｂｉｎ　１９８５　 Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５１６３０）　、　ＴＹＡに等価なコピア 領域は、レトロウィルス機構の類似によってｇａｇと称される。それ故、昆虫細 胞発現システムのコピア要素のｇａｇ領域における高度な発現は、Ｔｙ−ＶＬＰ ｓされる。ｇａｇが他のタンパク質のコーディング配列と融合するならば、生成 融合タンパク質も同様に前記Ｔｙ：ＩＦＮハイブリッド粒子類似ハイブリッドコ ピア粒子に組み立てられることも見い出される。

抗原提供としてのコピア粒子および精製システムを確立するために、プラスミド ｐ　ＰＷ２２０からのｇ　ａ　ｇ　（Ｐｏｔｔｅｒ　＆　Ｂｒｏｓｅｉｎ　１９ ７９　Ｃｅ１ｌ　１７４１’５）は、プラスミドｐＡｃ３７３−ｇａｇを産生ず るためにｐＡｃ３７３　（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ　１９８３　Ｊ、　Ｖｌｒｏ ｌ、　４８．５８４）の如き代表的な高効率バキュロウィルス（Ｂａｃｕｌｏｖ ｉｒｕｓ）発現ベクターに挿入する標準的な組換えＤＮＡ方法で処理される。発 現は、ポリへドリンプロモーターによって行われる。その後、インターフェロン ｃＤＮＡは、枠のｇａｇの３′端に挿入され、プラスミドｐＡｃ３７３−ｇａｇ −ＩＦＮを産生する。このプラスミドは、直接的にｐＭＡ５６２０−８に類似す る（実施例１を参照のこと）　ｏ　ｐＡ　ｃ　３７３−　ｇ　ａ　ｇ　Ｉ　Ｆ　 Ｎは、その後スポドブテラ　フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉ 　ｐｅｒｄａ）細胞内においてインビボ組換えによってバキュロウィルス（Ｂａ ｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）　、オートグラファ　カルフォニカ　ニュクリア　ポリへ ドロシス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｅａｌｉｆｏｒｎｉｅａ　ｎｕｃｌｅａｒ　 ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）（ＡｃＮＰＶ）に導入される（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　 ａｌ　１９８３Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　４２１５６）。組換えウィ ルスは、閉鎖マイナスプラークから収穫し、新鮮なニス、フルギベルダ（Ｓ。

ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を再感染するために使用される。ハイブリッ°トコ ピア：ＩＦＮ粒子を感染後７２〜９６時間で収穫し、スクロース　グラジェント で分留してバキュロウィルス不純物から分離した。粒子は、電子顕微鏡及びＴｙ −ＩＦＮハイブリッド粒子の項で記載のウェスターンブロッティング法によって 同定した（実施例１を参照のこと）。

実施例３ ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　、Ａ　Ｄ　Ｈ遺伝子プロモーターによ り発現したｇａｇ　ＩＦＮ融合物を含有する組換えプラスミド（Ｂｅｎｙａｊａ ｔｉ　ｅｔ　ａｌ、　１９８３　Ｃｅ１ｌ　３３１２５）が簡単なりＮＡ仲介ト ランスフェクションによって昆虫細胞に導入される（例えばドロソフィラ　シュ ナイダー２細胞）ことを除いて、実施例２の一般的な方法に従った。

実施例４ 酵母Ｔｙ要素のＴＹＡ遺伝子は、鳥類及び哺乳類のレトロウィルスのｇａｇ遺伝 子にまさに類似している。ＴＹＡ生成物だけが粒子形成が可能であるので、ｇａ ｇタンパク質が同一なことを行ない、それ故に、抗原提供および精製システムの 基礎として作用するだろう。

抗原精製および提供システムとしてのレトロウィルス性ｇａｇタンパク質を立証 するために、ＨＩ　Ｖ−Ｉからのｇａｇ遺伝子は、標準的な組換えＤＮＡ方法で 処理されて酵母発現ベクターｐＭＡ９１及び哺乳類発現ベクターｐＳＶ２に導入 される（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ　１９８２Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐ ｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、　ｌ　３２７）　、ここで該ベクターはｐＡＭ９１−ＨＩＶｇａｇ およびｐＳＶ２５−ＨＩＶｇａｇをそれぞれ産生ずるために哺乳類のｄｈｆｒｃ ＤＮＡを含有する。その後インターフェロンｃＤＮＡは、枠内のそれぞれの分子 のｇａｇ　３ｅｎｄ端に導入されて、ｐＭ９１−ＨＩＶｇａｇ　−ＩＦＮとｐＳ Ｖ２５−ＨＩＶｇａｇ−ＩＦＮをそれぞれ産生ずる。これらの分子は、ｐＭＡ５ ６２０−８に類似する（実施例１を参照のこと）。その後、ｐＭＡ９１−ＨＩＶ ｇａｇ−ＩＮＦは、酵母菌株ＭＤ４０−４ｃを形質転換すルタメニ使用され、ｐ 　ＳＶ２５−ＨＩ　Ｖｇ　ａ　ｇ　−Ｉ　ＮＦハ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞をトラ ンスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）するために使用される。安定な形質転換体 が増殖させられ、細胞抽出物が調製され、かつスクロースグラジェントで分留さ れる。ハイブリッドＨＩＶｇａｇ：　ＩＮＦは、Ｔｙ：ＩＮＦハイブリッド粒子 の項で記載の如く、電子顕微鏡及びウェスターンブロッティング法により同定さ れる（実施例１を参照のこと）。

実施例５ ｐＳＶ２５−ＨＩＶｇａｇ−ＩＮＦがＣＯ８細胞に導入され（Ｇｌｕｚａ＋ａｎ 　ｅｔ　ａｌ、１９７７　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　２４５３４）　、かツバイブリ ッド粒子がトランスフェクション後３〜９日で収穫された以外は、実施例４の方 法に従った。

実施例に の実験において、一部のインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）含有ハイブリ・ドＴ ｙ−ＶＬＰを産生し得、かつこれらのハイブリッドＴＶ　：　ＨＡ−ＶＬＰがラ ビット中で抗ＨＡ抗体形成を誘導することを示す。

これらの実験方法は、実施例１に記載のハイブリッドＴＹ　：　ＩＦＮ−ＶＬＰ の産生と分析に関するものと、本質的には同じである。ＭＲＣ１２／８０抗全イ ンフルエンザウィルス抗体は、英国、ミルヒル、ＮＩＭＲの世界インフルエンザ センターから得られ、インフルエンザウィルス菌株Ａ／スコツトランド／　８４ ０　／　７４　ｘ　Ａ　／　Ｐ　Ｒ／　８　／　３４（Ｈ３Ｎ　２）に対して提 案された。インフルエンザウィルスＡ／メンフィス／１０２／７２　（Ｈ３Ｎ２ ）のＩＡＩドメインのコドン２５−１１１に対応するＨＡココ−ィング配列領域 は、ウィルソン等のデータ（Ｗｉｌｓｏｎ　１９８４　Ｃｅ１ｌ　３７．７６７ ）に基づいてハイブリッドＴｙ：ＨＡ−ＶＬＰ形成用に選択された。コドン２５ −１１１に対応する２６２ｂｐＳｐｅＩ；５ｐｅＩ　（第９図）は、プラスミド ＭＸ２９の適切な消化で精製された。ＭＸ２９は、ＰｓｔＩ部位につづくインフ ルエンザウィルス菌株Ａ／メンフィス／１０２／７２Ｇ：ｃから、ＨＡ　ＲＮＡ から誘導されたＨ３ＨＡ　ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＡ７１５３である（Ｔ ｖｉｇｇ　ａｎｄ　５ｈｅｒｒａｔｔ、１９８０　Ｎａｔｕｒｅ　２ｇ３，２１ ６１　Ｓ　ｐ　ｅ　Ｉ　：　５ｐｅＩフラグメントの粘着性端をＤＮＡポリメラ ーゼＩを使用して仕上げ、その後、該フラグメントをプラスミドｐＳＰ４６のＨ ｉｎｃＩＩ部位にリゲートしくｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ　Ｉｉｇａｔｅ）てｐＳＰ４ ６−ｈａ２３を産生じた。ｐＳＰ４６は、ｐ５Ｐ６４のＨｉｎｄｍ部位がＢｇｌ ＩＩ部位に転換されているｐＳＰ６４　（プロメガバイオチック）の誘導体であ る。

ｈａ２３と指定されたＢａｍＨＩ；Ｂａ１ＩＩフラグメントは、ｐＳＰ４６−ｈ ａ２３から精製された。ｈａ２３は、２６２ｂｐで埋められた５ｐｅＩ；５ｐｅ Ｉフラグメントを含有する。その後、ｈａ２３は、ｐＭＡ５６２０のＢａｍＨＩ 部位に挿入されてｐＭへ５６２０−ｈａ２３を産生ずる（第１０図）。このプラ スミドは、酵母菌株ＭＤ４０−４ｃを、ロイシンインディペンデエンスに形質転 換するために使用された。

ＶＬＰを、ｐＭＡ５２６０−ｈａ２３またはｐ、ＭＡ５６２０で形質転換した酵 母ＭＤ４０−４ｃから調製し、１５〜４５％スクロースグラジェントで分留した 。フラクションを５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで試験し、タンパク質をクマーシーグル ー染色法で目視化した（第１１図）。予想ＴＹＡ−ＨＡ融合タンパク質のグラジ ェント中の位置は、タンパク質の微粒子特性を示した。フラクション電子顕微鏡 で粒子の存在が確認された（第１２図）。

粒子がＨＡ抗原を含有することを確認するために、類似グラジェントからｐＭＡ ５６２０−ｈａ２３を有するＭＤ４０−４ｃの分留抽出物を再度５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲルで試験し、その後分離タンパク質をニトロセルロースフィルターへ電子プ ロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）　Ｌ、た。１つのフィルターをＴｙタンパク 質との反応が公知の抗”ｒｙ−ｖＬｐ抗体でプローブし、他のものを抗ＨＡ抗体 でプローブした。両者において、反応した推定Ｔｙ：ＨＡ融合タンパク質は、こ のタンパク質がＴＶとＨＡエピトープの両者を含むことを強く示した（第１３図 ）。

ＨＡへの免疫応答性を引き出すハイブリッドＴｙ：ＨＡ−ＶＬＰの効能をテスト するために、ｐＭＡ５６２０−ｈａ２３で形質転換したＭＤ４０−４ｃ抽出物か ら精製した濃縮ハイブリッド７ｙ−ＨＡ−ＶＬＰに対してラビットにおいて抗血 清が提案された。この抗血清は、その後、ウェスターンブロッティング法によっ て、全インフルエンザウィルスから破壊されたタンパク質をプローブするために 使用された。３タンパク質サンプルが使用された。第１のものは、抗血清を高め るために使用される精製ＴＶ　：ＨＡ−ＶＬＰであった。第２のものは、全イン フルエンザウィルスＰＲ８（Ｈ３）であった。第３のものは、全インフルエンザ ウィルスＮＴ６０　（Ｈｌ）であった。ＰＨ１とＮＴ６０の両者は、英国オック スフォード　パソロジーのサーウィリアム　ダン　スクールのジョージ　ブラウ ンリー（Ｇｅｒｏｇｅ　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）から得た。第１４図は、抗ＴＶ　： ＨＡ−ＶＬＰ抗体がＨ３ＨＡのＨＡＩ領域は反応するが、ＨＩＨＡ血清で観察さ れるが抗Ｔｙ−ＶＬＰ抗体では観察されない。

正の対照として、同一サンプルが抗全ウィルス抗体でプローブされた。この場合 に、ＨＩＨＡのＨ３ＨＡの両方が抗血清と反応した。ハイブリッド７ｙ：　ＨＡ −ＶＬＰがＨ３抗原エピトープに特異な抗ＨＡ抗体産生を誘導する。

これらのデータは、ｐＭＡ５６２０−ｈａ２３がＴｙタンパク質ｐ１の最初の３ ８１アミノ酸およびウィルス性タンパク質の小領域、インフルエンザウィルスＨ Ａから成るハイブリッド融合タンパク質の合成を誘導することを示す。

この融合タンパク質は、ハイブリッドＴＶ　：　ＨＡ−ＶＬＰを形成する。ハイ ブリッドＴｙ：　ＨＡ−ＶＬＰは容易に単離され、かつ、かかる方法でラビット 免疫システムにＨＡ酸成分提供するので抗ＨＡ抗体が産生される。これらの抗体 は、ウェスターンプロット法においてＨＩＨＡとＨ３ＨＡとを区別し得る。明ら かに、ハイブリッドＴＶ　：　ＨＡ−ＶＬＰのＨＡ酸成分、他のインフルエンザ ウィルス成分はまたは他のウィルス成分で置換し得、かつ類似結果が得られるこ とが予想できる。

実施例７ ３′端において累進的により少ない配列を含む一連の切断ＴＹＡ遺伝子を得るた めに、標準的なりａ１３１消化は、出発分子としてｐＭＡ５６２０を使用して行 なわれた。プラスミドｐＭＡ５６２０は、ＢａｍＨＩで切断され、種々の時間Ｂ ａ１３１で消化され、そして過剰のＢａｍＨＩリンカ−（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ ）存在下で再すゲートされた。精製プラスミドの欠失端終了点は、ＤＮＡ配列化 で決定された。こ含み、３５８と指定された。３５８の欠失ＰＧＫターミネータ 配列は、ｐＭＡ５６２０からの大きなＰｖｕＩＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントを ３５８からの６８０ｂｐＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントでリゲートするこ とによって置換された。生成したプラスミドは、ｐＭＡ５６２０−３５８と指定 された（第１５図）。

２つの若干異なる３′ターミネータ（ｔｅｒｍｉｎｉ）を有するインターフェロ ンアルファ２ｃＤＮＡ　ＢａｍＨＩフラグ５６２０とｐＭＡ５６２０−３５８の ＢａｍＨＩ部位に挿入してプラスミドｐＭＡ５６２０−８とｐＭＡ５６２０−３ ５８−２を産生じた。

プラスミド　ｐＭＡ９１−１１、ｐＭＡ５６２０およびｐＭＡ５６２０−３５８ を、酵母菌株ＭＤ４０−４ｃをローンブロッティング法で決定したように、プラ スミドから生産されたＴＹＡ　ＲＮＡおよびｐｌまたは切断ｐ１タンパク質の量 に匹敵する。ＲＮＡおよびタンパク質の量は、各形質転換体において同じであっ た。

各形質転換体からの抽出物は、その後、１５〜４０％スクロースグラジェントで 分留され、それに続＜ｐＭＡ９１−１１とｐＭＡ５６２０の両方に対するクマー シーブルー染色法によって分析された。微粒子構造の特徴であるグラジェント領 域にｐｌまたは切断ｐ１タンパク質がある。しかしながら、ｐＭＡ５６２０−３ ５８の場合に、微粒子物質は観察されない。

インターフェロン　アルファー２　ＣＤＮＡを枠内、プラスミドｐＭＡ５６２０ およびｐＭＡ５６２０−３５８の各々に融合してプラスミドｐＭＡ５６２０−８ およびｐＭＡ５６２０−３５８−２を産生じた。これらのプラスミドは、酵母菌 株ＭＤ４０−４ｃをロイシン　インデペンダントに形質転換するために使用され 、そしてＴｙ同−源ＲＮＡとｐｌおよびｐｌ：インターフェロン融合タンパク質 は前記の如く測定された。ＲＮＡとタンパク質のレベルは、形質転換体の両方と 同じであり、かつ、ｐＭＡ５６２０とも同じである。ｐＭＡ５６２０−８を１４ 〜４５％スクロールグラジェントで分析した。７０ＫＤｐｌ：インターフェロン 融合タンパク質は、微粒子構造のグラジェント特性領域中で観察された。しかし ながら、ｐＭＡ５６２０−３５８−２の含有抽出物が分析されたときに、微粒子 物質が観察されなかった。

このように、Ｔｙ−ＶＬＰ形成には、少なくともアミノ酸２８６〜３８１間の配 列部分が要求される。ｐｌのＤＮＡとアミノ酸配列は、アミノ酸２８６〜３８１ のＤＮＡのアミノ酸配列をも示す（第１６図）。

ＶＬＰ抗原を用いる酵素イムノアッセイ法９６ウエル微小力価プレートを、各ウ ェルを室温で２時間、５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー中の２０μｇ　／　ｍ ｌのＶＬＰ、ｐＨ９，５、の５０μΩでインキュベートしてＶＬＰ抗原（抗原を 有するウィルス様粒子）で被覆した。

過剰（７）ＶＬＰ抗原を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）　、ｐＨ７゜４、で３分間及 び５分間の洗浄でウェルから除去した。バックグランド反応を最小にするために 、ウェルを室温で、１時間ＰＢＳ中の２％カゼイン１００μ９で保護し、その後 ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）含有ＰＢＳで３分間及び５分間の洗浄 した。試験サンプル中の第１抗体を、０．５％カゼイン含有ＰＢＳ−Ｔ　（ＰＢ Ｓ−ＣＴ）中で好適に希釈する。好適な希釈液は、１／１０〜１／７゜２９０の ３倍希釈系である。第１抗体は、ハイブリッドＴｙ−ｖＬｐの非Ｔｙ成分に反応 性を有する。５０μｐの第１抗体を適切なウェルに加え、室温で２時間インキュ ベートした。過剰の第１抗体をＰＢＳ−Ｔで３分間および５分間洗浄して除去す る。第２抗体は、ホースラディツシュパーオキシダーゼ標識化抗種ＩｇＧであり 、ＰＢＳ−ＣＴ中で１／１５００に希釈された。５０μΩの希釈第２抗体を各ウ ェルに加え、室温で２時間インキュベートし、その後ＰＢＳ−Ｔで５分間および ５分間洗浄した。基質は３゜３−．５．５＝−テトラメチルベンジリデンであり 、０゜１Ｍ酢酸ナトリウム中で０．１ａ＋ｇ／ｍｌ濃度であり、０．５Ｍクエン 酸及び０．０３％ハイドロジエン　パーオキサイドでｐＨ６，０に調節されてい る。５０μ９の基質を各ウェルに加え、カラー反応を１０分間行なった。反応は 、０゜５Ｍ硫酸２５μΩを各ウェルに加えて決定される。カラー反応は、微小リ ーダーを用いて４５０ｎｍにおいて測定して評価される。この方法で、試験サン プル中の第１抗体の直接アッセイ法が実施される。

ハイブリッドＴｙ−ＶＬＰがｐ１融合タンパク質を精製するために使用される場 合に、融合タンパク質のｐ１構成を除去して外因性または非ｐ１成分を残すこと が有益である。このことは、ｐｌと非ｐ１配列の結合部における開裂を要求する 。このことは、Ｔｙ−、ＶＬＰを使用して正確なタンパク質を産生ずる手段を提 供する。この目標を達成する一つの方法は、特異タンパク分解性開裂部位をｐｉ ／非ｐ非接１接 Ｔｙ−ＶＬＰから非融合インターフェロンを産生ずるために、ｐＭＡ５６２３と 指定されたｐＭＡ５０２０誘導体を構成した。この構造は、ＴＹＡのコドン３８ １において４つの付加コドンをＢａｍＨＩリンカ−前に加えた以外は、ｐＭＡ５ ６２０と同一である。これらのコドンは、血液凝集因子Ｘ　の開裂部位であるア ミノ酸配列１１ｅ−Ｇｌｕ一Ｇｉｙ−Ａｒｇをエンコードする（Ｎａｇａｉ　＆ 　Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ．１９８４、Ｎａｔｕｒｅ，３０９，８１０）　、ｐ　Ｍ Ａ　５　６　２　０　−　８、ｐＭＡ５６２３−８に類似する構成用の接合領域 は次のようである。

ＣＣＣ　ＡＡＡ　ＡＴＣ　ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ｇｇａ　ｔｅａ　ａｔｇ　 ｇｇＣ　’ｒｃｃ　ＡＡＧＰＲＩＢＧＲＧＳＭＧＣＫ ３８０　３８１　ファクターＸａ　Ｉ　ＦＮＴＹＡ　−ＢａｍＨ　Ｉ ＰＭＡ５６２３−８が酵母菌株ＭＤ４０−４ｃに形質転換されると、ハイブリッ ドＩＦＮ：Ｔｙ　ＶＬＰに組立てられるｐｌ：ＩＮＦ融合タンパク質が産生され る。しかしながら、ｐＭＡ５６２０−８含有形質転換体に対して融合タンパク質 接合部において開裂部位が存在するために、牛血フラクションＸ　を有する微粒 子融合タンパク質をインキュベートすると粒子からのインターフェロンを開裂す る。

前記の如く、それえゆ、ハイブリッドＩＦＮ−”ｒｙ−ｖＬＰは、第１図のスク ロース密度グラジェント分留によりて非微粒子タンパク質から精製される。その 後、ＩＦＮは開裂され、第２回のスクロース密度グラジェント分留によって微粒 子ｐ１タンパク質から精製されて、純粋で“確かな”インターフェロンを生ずる 。

この実施例で示されるインターフェロンコーディング配列は、他のコーディング 配列で置換可能であり、この方法は他のタンパク質の発現および生成にも適用可 能である。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧＬＪＲＥ　２ ＦＩＧＬＩＲＥ３ ＦＩＧＵＲＥ　４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧＵＲＥ６ ７ｙ−ＶＬＰ　ｔ４−　ＩＦ）Ｊ　を本ＦＩＧ、９ ＦＩＧＵＲε１０ ＦＩＧＵＲＥｌｌ Ｌμ８立 二２２よ旦配旦 ＦＩＧ、Ｉ２ ＦＩＧＵＲＥ　１３ Ｔ５６２０−ＨＡ２３胱Ｔｙ糀本 木“しな　←　ゲラジ゛ンート　ワラクシ３ン　−−−−−−−−−−−伽　￥ ７フ・Ｔ　５６２０−ＨＡ２３　抗貝Ｕ権本 零″トヘ　ー　り゛ラシ゛Ｙ〉ト　フラツジ）ン　ーーーーーーーーーー伽　ト 、、フ０ＦＩＧＵＲＥ　１４ ＦＩＧ．１５ つ ＦＩＧ．１６ 〒〒１〒士ｌ叩士１”ｒ０晋］“鰭）７〒°曹）〒７ＡＣ？’？Ｃ↑＾！　８ Ａ′Ａ′：′？（ｉ（Ａ（、ＡＡＡ，ＴＴ２？Ｃ：ＧＴ”ｒＭ（ＧＴ簀Ｍ〒：Ａ ＧＪ：ＡＧＪ：ｉＭＧＡｉＧＧニアζフ＾Ｃｃテ’ｃｃａｔｔシーー−１＾Ｃ＾ ？ＣＣ？ＡＴＣＣＧ　〒〒−ＡＴｉＡＴｋＣＯＣＡ？＆？ｅＡＴＧＡＡＡＡ？？ Ｃ？？？Ｃ：Ａ`ｋｋ（、−、Ａττ；ム ？？１１ＶＫＤＺ＆＄ＶＯＹｔＯ！ＭＫＺＬＳＫＳ：区入υ−１を箕３＾ｔ−閃 ＾υ（ＣロＶシ＾ＧＣＯす講Ｓ−に１費ｑ冒論ｃｃｃ糧ｃｍ講１ゴク０１τ＾τ υぼりＧＣ＾ατｌ　輿　ＯＳＯ　テ　Ｑ　Ｋ　Ａ　Ｎ　Ｏ　ｇ　Ｖ　？　Ｃ− 　Ａ　Ｎ　Ｌ　Ｑ　Ｙ　Ｍ　Ｓ　＄ＡＣ＾ＣＣ〒ＣＣ＾α＾Ｘ＾ｔ〒〒α＾＾＾ Ｃ入＾＾為Ｃ丁Ｃ入ζ入＾Ａζ入Ｔ〒入τＣＣ＾Ｃ＾らＡＣτＧ＾Ａζ＾Ａ丁入 ＾丁口ＣＣＡτ■G入τ＾ τｔ＾り＾ｒｇτＫＶｔＮｔｘｏａ−ＮＮＮｃ：Ｈ〒ｅＪＩＡ？＾＾ζ入＾％？ ＣＣＣＡ〒Ｃζロ入＾ｉ〒八Ａττ＾τ６＾Ｇへ（４？Ｃτ＆？ＣτＧＧζα＾ ＾丁Ａ？＾＾＾ττｉττＡＣ閧bフＡ（入Ｃ ！　Ｍ　纏　嘱　ＶＡＣＱＬ！Ｎ　鼠　ＧＬＳＧｔＹ　眞　ｒＬ　員　Ｙ　τ＾ テ＾ＣｃｈＡＴｋζ＾＾ζＨＡＡＡ（１：ＣＡＡＡＧ＋ｅｅ９啼鴫ｔｅ国際調査 報告 ７１．４１−ｍｗＡｍｌＡ＠ｅｌｋＪｌ−”＠、ＰＣ：／ＧＢａ７／ＣＣ７６ｑ

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．第１アミノ酸配列とバイオ活性な第２アミノ酸配列からなる融合タンパク質 であって、該第１アミノ酸配列がレトロトランスポゾンまたはＲＮＡレトロウィ ルスによってエンコードされた粒子形成タンパク質と実質的に同一源であり、そ して該第２アミノ酸配列が３０以上のアミノ酸残基を含むならば、第２アミノ酸 配列の最初の３０残基は前記レトロトランスポゾンまたはＲＮＡレトロウィルス によって自然に直接第１アミノ酸配列に融合したアミノ酸配列を形成しない、粒 子の組立て可能な融合タンパク質。
2. ２．融合タンパク質が実質的に純粋である請求の範囲第１項に記載の融合タンパ ク質。
3. ３．レトロトランスポゾンが酵母レトロトランスポゾンＴｙまたはコピア様要素 （ｅｌｅｍｅｎｔ）である請求の範囲第２項に記載の融合タンパク質。
4. ４．Ｔｙエンコード化アミノ酸配列がＴＹＡ遺伝子でエンコードされたＰ１タン パク質である請求の範囲第３項に記載の融合タンパク質。
5. ５．Ｔｙエンコード化アミノ酸配列がＴＹＡ遺伝子の一部分によりエンコードさ れたＰ１タンパク質の一部分であり、該部分がＴｙウィルス様粒子（Ｔｙ−ＶＬ Ｐ）合成の誘導可能である請求の範囲第３項に記載の融合タンパク質。
6. ６．Ｔｙエンコード化アミノ酸配列がＴｙ１−１５から誘導される請求の範囲第 ２項に記載の融合タンパク質。
7. ７．それぞれが第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列からなる融合タンパク質で あって、該第１アミノ酸配列がレトロトランスポゾンまたはＲＮＡレトロウイル スによってエンコードされた粒子形成タンパク質と実質的に同一源であり、そし て、第２アミノ酸配列がバイオ活性であり、かつ、前記レトロトランスポゾンま たはＲＮＡレトロウイルスによって自然に第１アミノ酸配列に融合しない複数の 融合タンパク質からなる粒子。
8. ８．粒子が実質的に純粋である請求の範囲第７項に記載の粒子。
9. ９．請求の範囲第１項に記載の複数の融合タンパク質からなる粒子。
10. １０．融合タンパク質内の第２アミノ酸配列が互いに同一でない請求の範囲第７ 項に記載の粒子。
11. １１．粒子が微粒子抗原である請求の範囲第８項に記載の粒子からなるワクチン 。
12. １２．第１ヌクレオチドが粒子形成タンパク質をエンコードするレトロトランス ポゾンまたはＲＮＡレトロウイルス内の遺伝物質と実質的に同一源でありまたは 相補的であり、第２ヌクレオチド配列が他のアミノ酸配列をエンコードル、また はエンコードするヌクレオチド配列に相補的であり、核酸が前記レトロトランス ボソンまたはＲＮＡレトロウィルスによって、自然に産生されない融合タンパク 質を形成する単一解説枠に発現可能であり、第２ヌクレオチド配列が９０以上の 塩基を含むならば、最初の９０塩基は、レトロトランスポゾンまたはＲＮＡレト ロウィルスで自然に産生された融合タンパク質部分として表わされるヌクレオチ ド配列を形成しない、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列からなる核 酸。
13. １３．請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質をコーディングする核酸。
14. １４．前記第２配列がリンカー配列を含まない請求の範囲第１２項に記載の核酸 。
15. １５．前記第２配列が前記第１配列に隣接するリンカー配列を含む請求の範囲第 １２項に記載の核酸。
16. １６．請求の範囲第１２項に記載の核酸からなる発現ベクター。
17. １７．発現ベクターが細菌、酵母、哺乳動物と昆虫の発現ベクターからなる群か ら選ばれたものである請求の範囲第１６項に記載の発現ベクター。
18. １８．ＴＹＡ遺伝子内に制限酵素開裂部位を有するＴＹＡ遺伝子誘導体を含み、 その内に第２ヌクレオチド配列が挿入されてなる請求の範囲第１７項に記載の発 現ベクター。
19. １９．ＴＹＡ遺伝子の最初の３８１コドンを含有する請求の範囲第１７項に記載 の発現ベクター。
20. ２０．細菌、酵母および請求の範囲第１６項に記載の発現ベクターを含む哺乳動 物と昆虫の細胞からなる群から選択された細胞。
21. ２１．請求の範囲第７項に記載の粒子に対して生じた抗体。
22. ２２．抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２１項に記載の抗体。
23. ２３．抗体がヒト抗体である請求の範囲第２２項に記載の抗体。
24. ２４．会合不純物から請求の範囲第７項に記載の粒子を分離し、その後、該粒子 の融合タンパク質からバイオ活性ペプチドを開裂することを特徴する実質的に純 粋なバイオ活性ペプチドを産生する方法。
25. ２５．哺乳動物の感染因子に応答して生産された抗体に免疫反応性である請求の 範囲第７項に記載の粒子または融合タンパク質を固形支持体上に分散してなる診 断試薬。
26. ２６．哺乳動物体液から抗体に免疫的に結合した請求の範囲第７項に記載の粒子 または融合タンパク質からな診断アッセイにおける中間体。
27. ２７．第２アミノ酸配列が哺乳動物の感染因子に応答して産生された抗体に免疫 反応性である請求範囲第１項に記載の融合タンパク質。