JPH09248191A - 融合タンパク質およびその粒子、診断試薬 - Google Patents

融合タンパク質およびその粒子、診断試薬

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JPH09248191A
JPH09248191A JP8128724A JP12872496A JPH09248191A JP H09248191 A JPH09248191 A JP H09248191A JP 8128724 A JP8128724 A JP 8128724A JP 12872496 A JP12872496 A JP 12872496A JP H09248191 A JPH09248191 A JP H09248191A
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Susan M Kingsman
キングスマン，スーザン，メアリー
Sally E Adams
アダムス，サリー，エリザベス
Michael Henry Malim
ヘンリー マリム，ミカエル
Elizabeth-Jane Claire Mellor
クライヤー メロー，エリザベス−ジェーン
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 感染症に対する安全なワクチンの産生および
実験上、工業上および診断目的で生じ得る抗血清に対す
る特定タンパク質の合成を目的とする。 【構成】 第１アミノ酸配列とバイオ活性な第２アミノ
酸配列からなり、前記第１アミノ酸配列が、ＲＮＡレト
ロウィルスのｇａｇ遺伝子または昆虫コピア要素のｇａ
ｇ遺伝子、またはそのいずれかと構造的に類似な遺伝子
配列によってエンコードされた粒子形成配列である粒子
の組立て可能な融合タンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、融合タンパク質お
よびその粒子、診断試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】新しい組換えＤＮＡ技術の最も重要な応
用の１つは、感染症に対する安全なワクチンの産生およ
び実験上、工業上および診断目的で生じ得る抗血清に対
する特定タンパク質の合成にある。理論的には、これら
の目標は、酵母サッカロミセスセレビジエ(Saccharomyc
es cerevisiae)の如き微小有機体内で適切な抗原を合成
することによって達成し得る。抗原は、ＥＰＡ２−００
７３６３５号に記載の如く適切な発現ベクターから発現
させられる。
【０００３】動物またはヒトの免疫システムに対する抗
原の正確な提供は、有効なサブユニットワクチンまたは
イムノゲン（免疫抗原）に対する重要な要求である。提
供は、潜在的なワクチン及び化学的に合成されたエピト
ープに基づくものに対するものと同様に組換えＤＮＡに
よりなされたイムノゲンをともなう大きな問題となって
いる。理想的なイムノゲンは、高分子量担体に組み立て
られた多価抗原決定基のポリマーである。好適なイムノ
ゲンは、さらされたエピトープの最大数を有すべきであ
る。これらの要求は、抗原のキャリヤーへのランダム化
学カップリングによって達成することは困難である。理
想的な状態は、抗原が大粒子複合体の表面上に正確に配
合して存在することであろう。その上、かかるシステム
の微粒子特性は、簡単な物理的手段による抗原精製を促
進するだろう。
【０００４】これらの諸要求は、組換えＤＮＡ技術また
は化学合成法によるモノマータンパク質の簡単な合成法
によって、まれに達成されるだろう。本出願前に、酵母
内のイムノゲンを産生する自己集合微粒子抗原提供シス
テムは、組換えＤＮＡ技術(Valenzuela et al, Biotech
nology,3, 323,1985)による抗原（例えばヘルペス シ
ンプレックスウイルスＩ（ＨＳＶ−Ｉ）グリコプロテイ
ンＤまたはポリオウイルス抗原）のヘパティティスＢ表
面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質への融合に基づいてい
た。融合タンパク質は、凝集して２２nmの粒子を形成す
る。このシステムは、一連の不利益を有している。 １）収率が極めて低い。 ２）粒子が酵母細胞内で形成せず、抽出プロセスの副生
物である(Hitzeman et al,Nucl. Acids Res.,11,27450,
1983)。このことは、産生プロセスに制限を課す。 ３）融合物のなかには粒子を形成しないものがある。 ４）ＨＢｓＡｇ成分が、ある場合に、免疫優位性を発揮
する。即ち、抗体は、優先的にＨＢｓＡｇに作られる。
【０００５】ニスカーン等(Kniskern et al,Gene,46,13
5,1986)はヘパティティスＢコア抗原（ＨＢｃＡｇ）が
酵母内で極めて高いレベルで粒子を形成するが、他のエ
ピトープを運搬するその用途に関する報告がまだなされ
ていないことを報告している。これらの粒子が、マウス
に対して極めて高い免疫性を有することが報告されてい
るので、ＨＢｓＡｇ粒子の様に免疫優位性を発揮するだ
ろう。
【０００６】ハインズ等(Haynes et al,Bio/Technolog
y,4,637,1986)は、細菌における対応システムについて
報告している。タバコ モザイク ウイルス（ＴＭＶ）
被覆タンパク質は、粒子構造を組み立てる実体である。
ＴＭＶ被覆タンパク質が、イー．コリ (E. Coli)内で
発現し、そして精製されると、インビトロで該タンパク
質を多価粒子に組み立てることが可能となる。ＴＭＶ被
覆タンパク質および他のタンパク質によってなされた融
合タンパク質は、免疫抗原性であるハイブリッド粒子を
産生する。ポリオエピトープがサルク(Salk)ワクチンよ
り１／４程度免疫抗原性が低いけれども、８アミノ酸の
ポリオエピトープが試験され、そして免疫抗原性である
ことが示された。このシステムは、粒子径を実験的に変
化でき、混合粒子（即ち、１タイプのエピトープ以上を
運搬する）が極めて容易に産生できるという潜在的な利
益を有する。しかしながら、予想された不利益は、相対
的に小さな抗原のみがＴＭＶ粒子に添加可能である、と
いうことである。
【０００７】メロー等(Mellor et al,Nature,313,243,1
985)は、融合タンパク質が、酵母イーストＴｙ転写解読
枠ＯＲＦ１（ＴＹＡ遺伝子と指定する）、転写解読枠Ｏ
ＲＦ２（ＴＹＢ遺伝子と指定する）およびインターフェ
ロンをコードする核酸からなる生成物である、ことを開
示する。しかしながら、この報文には、産生融合タンパ
ク質または事実どんなＴｙタンパク質が組み立てられ粒
子となる、またはなるだろう、という記録も示唆もな
い。
【０００８】
【発明の実施の形態】レトロトランスポゾン類の遺伝物
質によって発現されたある種のタンパク質は粒子への自
己組み立て(assembling)能力を有することが見い出され
た。同様に、かかるレトロトランスポゾン誘導組み立て
タンパク質に基づくものであり、かつ、抗原−（または
他のバイオ活性分子）提供粒子へ組み立て得る融合タン
パク質を構成することが可能なことも見い出された。更
に、類似融合タンパク質がＲＮＡレトロウイルスからの
組み立てタンパク質に基づいて構成し得ることが見い出
された。
【０００９】第１の態様によれば、本発明は、粒子へ組
み立て可能な融合タンパク質を提供することにあり、こ
こで該タンパク質は第１アミノ酸配列およびバイオ活性
第２アミノ酸配列からなり、該第１アミノ酸配列がレト
ロトランスポゾンまたはＲＮＡレトロウイルスによって
エンコードされた粒子形成タンパク質と実質的に同一源
であり、また第２アミノ酸配列が３０アミノ酸残基以上
を含むのであれば、第２アミノ酸配列の最初の３０残基
は、対応するレトロトランスポゾンまたはＲＮＡレトロ
ウイルスによる第１アミノ酸配列へ自然に直接的に融合
したアミノ酸配列を形成することはない。
【００１０】第２の態様によれば、本発明は、複数の融
合タンパク質から成る粒子を提供することにあり、ここ
で各融合タンパク質は第１アミノ酸配列および第２アミ
ノ酸配列からなり、該第１アミノ酸配列がレトロトラン
スポゾンまたはＲＮＡレトロウイルスによりエンコード
された粒子形成タンパク質と実質的に同一源であり、該
第２アミノ酸配列がバイオ活性であり、かつ、該レトロ
トランスポゾンまたはＲＮＡレトロウイルスによる第１
アミノ配列に自然に融合しないものである。
【００１１】かかる粒子は、一般的には実質的に純粋で
あり、少なくとも５％、１０％、２０％、５０％、８０
％、９０％、９５％または９９％（重量）純粋であり、
好ましさが増加する。粒子は複数の異なる融合タンパク
質からなる。即ち、該融合タンパク質は、互いに異なる
第２アミノ酸配列を有する。２，３またはそれ以上の異
なる第２アミノ酸配列が粒子に存在する。
【００１２】第１アミノ酸配列は、酵母ＴｙＴＹＡ遺伝
子、コピア(Copia)生成物および昆虫またはＲＮＡレト
ロウイルスのｇａｇ遺伝子からのコピア様要素からの生
成物である。レトロウイルスとは、ヒト免疫欠失ウイル
スＩとII（ＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−II）、ＳＩＶ、ヒトＴ
−細胞リンホトロピックウイルスＩとII（ＨＴＬＶ−
Ｉ、ＨＴＬＶ−II）、ネズミ ルカエミア(Leukaemia)
ウイルス、モロネー ネズミルカエミア ウイルス、マ
ウス乳房腫瘍ウイルス、鳥類のルコシス(Leukosis)ウイ
ルス、ねこのルカエミア ウイルス、ヒトＢ−細胞リン
ホトロピック ウイルスおよび牛ルカエミア ウイルス
である。上記の如く、レトロトランスポゾンには、酵母
のＴｙ要素、ドロソフィリア メラノガスター(Drosphi
lia melanogaster)が如き昆虫のコピアおよびコピア要
要素、マウスのＶＬ３０およびマウスのＩＡＰ遺伝子が
含まれる。
【００１３】好適なレトロトランスポゾンは、酵母レト
ロトランスポゾンＴｙである。先に、Ｔｙが６０nmウイ
ルス様粒子（Ｔｙ−ＶＬＰ）の合成に関係することが示
されている(Mellor et al,Nature,318, 513,1985a)。ｐ
ｌタンパク質がＴＹＡ遺伝子によってエンコードされて
おり、安定であり、そして更なるプロセスを必要としな
いことが見い出された。それ故、Ｔｙエンコード化アミ
ノ酸配列は、好ましくはＴＹＡ遺伝子によってエンコー
ドされたｐｌタンパク質である。Ｔｙの両クラス（Ｉと
II）がｐｌを形成することは公知である(Fulton et al,
NAR,13(11),4097,1985)。従って、どちらも使用可能だ
ろう。
【００１４】Ｔｙエンコード化アミノ酸配列は、ｐｌタ
ンパク質の全体である必要はなく、代わりに、ＴＹＡ遺
伝子の一部によってエンコードされたｐｌタンパク質の
一部であってよく、該部分はＴｙウイルス様粒子（Ｔｙ
−ＶＬＰ）合成に関与し得る。アミノ酸配列の２８６〜
３８１（第１６図）部分が粒子形成に必要であることが
決定された。好ましくは、Ｔｙエンコード化アミノ酸配
列は、Ｔｙ１−１５から誘導可能である。ＴＹＡ遺伝子
末端における停止コドンは、含まれないことが好まし
い。しかし、含まれれば、融合タンパク質は、停止コド
ンがウイルソン等(NAR,14(17),7001,1986)の記載による
枠移動機構によって２０回に１回の割合で無視されるの
で、低収率ではあるが、発現が続くだろう。
【００１５】それ故に、なかでも、Ｔｙタンパク質ｐ
ｌ、ＴＹＡ遺伝子生成物(Dobson et al, EMBO.,J3,111
5,1984) および第１６図の少なくとも２８６〜３８１の
アミノ酸配列フラクションを含む部分がＴｙ−ＶＬＰ産
生に重要であることが示される。第２アミノ酸配列（即
ち、実施態様において、非Ｔｙタンパク質コード領域）
は、公知またはまだこれから説明すべきもののいずれか
のアミノ酸配列である。バイオ活性は、単一活性（例え
ば、抗原性）、レセプター結合活性、治療活性または標
的活性（即ち、ホームから特別な標的へ能力）、または
二種またはそれ以上の異種バイオ活性の組み合わせを有
する。同様に、異種融合タンパク質が粒子抗原に組み立
てられ、それによって、全粒子が１以上の活性を有する
ようになる。
【００１６】例えば、第２アミノ酸配列は、インターフ
ェロン遺伝子の如きリンフォカイン遺伝子、またはウイ
ルス、細菌または他の（例えば、原生動物の）寄生生物
の如き、感染因子の抗原をコードする遺伝子から誘導さ
れる。例えば、インフルエンザ ウイルス抗原、ＨＩＶ
−ＩまたはＨＩＶ−II（即ち、ＨＴＬＶ−III、ＬＡＶ
またはＡＩＤＳ）ウイルス、狂犬症ウイルス、ＦＭＤＶ
ウイルス、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ポリオウイルス、
インフルエンザ ウイルス、パラインフルエンザ ウイ
ルス、呼吸性シンシチウムウイルス、ライノウイルス、
コロナウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス、ノル
バルクウイルス(Norvalkviruses)、アルボウイルス、例
えばデング、ヘルペス シンプレックス、サイトメガロ
ウイルス、エプスタイン バール ウイルス、麻疹ウイ
ルス、ムスプス ウイルス、ルベラ(Rubella)、ウマ
インフルエンザ ウイルス、ウマの鼻肺炎、ブタ トラ
ンスミッシフル胃腸炎ウイルス、ジステンバー、パロボ
ウイルス(Parovovirus)、ＦｅＬＶ、ベネズエラまたは
ウエスターン ウマ脳炎、プラスモディウム トリパノ
ソーマ、住血吸虫、クラミジア トラコーマティス(tra
chomatis)若しくは髄膜炎菌であり、または上記抗原の
フラグメント若しくは化学的に合成されたコーディング
配列から生じたペプチドであるので生成したペプチド
は、上記抗原またはフラグメントと実質的に同一抗原性
を有する。
【００１７】多くのウイルスと細菌抗原のヌクレオチド
配列は既知であり、かかる抗原は、組換えＤＮＡ技術で
調製し得る。ＤＮＡコーディング配列は、本発明の融合
タンパク質の第２アミノ酸配列コードに使用し得る。例
えば、百日咳とマラリアの如き、通常の病気に関連した
抗原用のヌクレオチド配列は、公知である〔百日咳、百
日咳菌、WO87/03301,6月4日1987:Malaria Plasmodium v
ivaxとP. falciparum.Dame, et al.,Science, 225: 59
3, 1984;Enea, et al., Science, 225:628, 1984; Youn
g, et al., Science, 225:958, 1984〕。他の一般的な
病気に対する抗原ヌクレオチド配列は公知である[Hepat
itis, EPO 218, 474とEPO 020,251:Herpes, EPO 216, 1
985と日本の61-97630,Rabies, WO87/00179; Chickenpo
x, EPO 210,931;Polio, WO86/01828と日本の61-4758
5]。
【００１８】第２アミノ酸配列の最初の部分はリンカー
配列であり、その配列は、ある環境において容易に切断
される。第２アミノ酸配列残部は、精製段階において切
断される。それ故、本発明の微粒子抗体は、ワクチンの
調製に有効であり、このことは本発明の他の態様を形成
する。第２アミノ酸配列は、このように前記感染因子の
１つである抗原のアミノ酸配列をコードする。ワクチン
は、微粒子抗原および無菌生理食塩水または無菌ＰＢＳ
の如き生理学的に許容可能な非毒性キャリヤーからな
る。無菌性は、非経口投与ワクチンにとっては一般に必
須である。一以上の適切なアジュバントが存在してもよ
い。好適なアジュバントには、ムラミル ジペプチド、
水酸化アルミニウムおよびサポニンが挙げられる。
【００１９】本発明のワクチンが１以上の抗原を提供す
ることに注目すべきである。異種微粒子抗原のカクテル
かまたは１以上のエピトープを有する微粒子抗原の均質
集団（例えば、異なるハイブリッドタンパク質の混合物
を凝集させ、または１以上の微粒子抗原を小細胞に発現
させることによって調製されたものである）が使用され
る。または、ワクチンは、これら種類の微粒子抗原混合
物を含有することも可能であった。
【００２０】他の態様において、本発明は、第１ヌクレ
オチド配列と第２ヌクレオチド配列から成る核酸を提供
することにあり、ここで第１ヌクレオチド配列は、粒子
形成タンパク質をエンコードするレトロトランスポゾン
またはＲＮＡレトロウイルスの遺伝子物質と実質的に同
一源かまたは相補的であり、第２ヌクレオチド配列は、
他のバイオ活性アミノ酸配列をエンコードするヌクレオ
チド配列をエンコードするかまたは相補的であり、そし
て該核酸は、前記レトロトランスポゾンまたはＲＮＡレ
トロウイルスによって自然に産生されることのない融合
タンパク質を形成するように単位解読枠として発現し
得、そして融合タンパク質が粒子となる。
【００２１】核酸がスプライシングまたは終了阻害なし
で発現し得ることは、一般的な場合である。枠移動は、
一般には生じないだろう。本発明のある実施態様におい
て、ＴＹＡ融合遺伝子を産生するためのいずれの非Ｔｙ
タンパク質コーディング配列に融合し得るＴＹＡ遺伝子
誘導体を提供できる。ＴＹＡ融合遺伝子は、ハイブリッ
ド Ｔｙ−ＶＬＰに組み立てられる融合タンパク質を産
生する。ハイブリッド Ｔｙ−ＶＬＰは、高収率で産生
し得、かつ簡単な物理手段によって生成可能な高分子量
微粒子抗原（または他の粒子の）提供システムを構成す
る。
【００２２】更に本発明によれば、前に定義した核酸を
含む発現ベクターが提供される。例えば、ＴＹＡ遺伝子
誘導体を含み、そして酵母内においてハイブリッドＴｙ
−ＶＬＰの高度産生に関するｐＭＡ５６２０がある。本
発明の発現ベクターは、通常、プロモーターを含有す
る。ＰＧＫは好適なプロモーターであるが、他のプロモ
ーターも必要により使用可能であり、また好ましい。例
えば、ＧＡＰＤ、ＧＡＬ１−１０、ＰＨＯ５、ＡＤＨ
１、ＣＹＣ１、Ｔｙデルタ配列、ＰＹＫおよび１以上の
これらのプロモーター成分から作られたハイブリッドプ
ロモーターまたは他のプロモーターを挙げることができ
る。
【００２３】同様に、本発明はホスト細胞、例えばイ
ー．コリ(E. Coli)の如き細菌細胞、サッカロミセス
セレビジエ(Saccharomyces Cervisiae) 如き酵母、また
はチャイニーズハムスターオリバー細胞(CHO )またはハ
イブリッド粒子の産生に関する前記発現ベクターを含有
するＣＯＳ細胞の如き動物細胞を挙げられる。微粒子抗
原の多価特性のため、従来の抗原より容易に抗体を産生
し、かつ該抗体は、特異な性質を有しやすい。さらに本
発明は、抗原性である本発明の粒子に対して生ずる抗体
を提供する。抗体は、本発明のハイブリドーマ細胞によ
り産生されたポリクローナル（例えば、抗体をラビット
に注射して得られたもの）またはモノクローナル抗体で
ある。微粒子抗原の多価特性のため、インビトロ免疫法
は、抗原の他の形態を有するものよりも達成しやすい。
すなわち、このことは、ヒトモノクローナル抗体の産生
を促進する。ハイブリドーマ細胞は、免疫化動物の脾臓
細胞と腫瘍細胞を融合して調製し得る。その後、好適に
分泌ハイブリドーマ細胞が選択される(Koehler and Mil
stein,Nature, 296,495,1976)。
【００２４】同様に、本発明は、好適なバイオ活性ペプ
チド精製技術を提供する。本発明の態様は、例えば濾過
または遠心分離によって会合不純物から粒子を一般に相
対的容易に分離できるという事実に基づいている。それ
故に、実質的に純粋なバイオ活性ペプチド産生方法が与
えられるが、該方法は前記の如く会合不純物から粒子を
分離し、その後、粒子の融合タンパク質からバイオ活性
ペプチドを切断する方法である。
【００２５】本発明の融合タンパク質および微粒子抗原
は、診断薬として有効である。診断目的の微粒子抗原
は、遠心分離または濾過によって物理的に分離でき、か
つガラス、プラスチックスライド、ディップ スティッ
ク、マクロまたはミクロビーズ、試験管、微小力価ウエ
ル等の固形支持体上に直接分散し得るために、特に有効
である。本発明の微粒子抗原は、吸着剤ディスク（米国
特許第４，６３２，９０１号）、ストリップの如き繊維
状または吸水性材料、または固形支持体としてのクロマ
トグラフィーカラムにも分散し得る。粒子と融合タンパ
ク質は、容易に固形支持物に付着する。粒子は、精製後
融合タンパク質へ破裂させられ、該融合タンパク質は、
前記の如く表面分散し得る。試薬は、多くの診断試験に
有効である。例えば、微粒子抗原に対する抗体を有する
と思われる試験サンプルおよびケイ光、酵素または放射
性標識抗体は、固形支持体上の微粒子抗原または融合タ
ンパク質と競走的に反応する、そして固形支持体上の微
粒子抗原と結合する標識化抗体の量、同様に、本発明の
微粒子抗原は、抗原との凝集反応に有効である。診断分
野の当業者は、本発明の微粒子抗原および融合タンパク
質の診断用途に対する多くの応用例を認めるだろう。
【００２６】本発明は、添付図面を引用して、次の実施
例によって説明される。第１図は、プラスミドｐＭＡ９
１−１１で形質転換したＭＤ４０−４ｃから精製したＴ
ｙウィルス様粒子（Ｔｙ−ＶＬＰ）の写真である。第２
図は、ｐＭＡ５６２０とｐＭＡ５６２０−８の構造を示
す概略図である。第３図は、本発明の実施例の主要成分
の拡大図および主要結合部のヌクレオチドの配列を有す
るプラスミドｐＭＡ５６２０−８の概要図である。
【００２７】第４図は、ｐＡＭＡ９１−１１，ｐＭＡ９
１とｐＭＡ５６２０−８を含有するＭＤ４０−４ｃから
粒子とタンパク質のスクロースグラジェント分離のフラ
クションのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析の写真で
ある。第５図は、ｐＭＡ５６２０−８を含有するＭＤ４
０−４ｃから精製したハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬ
Ｐの写真である。
【００２８】第６図は、ｐＭＡ５６２０−８を含有する
ＭＤ４０−４ｃの抽出物からのスクロースグラジェント
フラクションのウエスターンブロットの写真である。
ａ）は抗Ｔｙ−ＶＬＰ抗体を使用する結果を示す。ｂ）
は抗インターフェロン抗体を使用する結果を示す。第７
図は、精製ハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰ製剤
（１）、ｐＭＡ５６２０−８で形質転換したＭＤ４０−
４ｃの全抽出物（２）と非形質転換ＭＤ４０−４ｃ
（３）内のタンパク質クーマシー染色ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル分析の写真である。
【００２９】第８図は、抗Ｔｙ−ＶＬＰ担体（ｂ）、抗
ハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰ抗体（ｄ）および対
応するプレブリード（Prebleed）血清（ａ＋ｃ）を使用
するウエスターンブロットの写真である。各々は、ｐＭ
Ａ９１（１）ｐＭＡ９１−１（２）を含有するＭＤ４０
−４ｃの全抽出物に対して使用される。プラスミドｐＭ
Ａ９１−１は、ＩＦＮ−アルファ２の合成を誘導する。
ｐＭＡ９１は、負の対照例であり、インターフェロンを
産生しない。
【００３０】第９図は、ＨＡコドン２５−１１１含有２
６２ｂｐ ＳｐｅＩ：ＳｐｅＩフラグメントのヌクレオ
チド配列を示す図である。実施例５を参照のこと。第１
０図は、プラスミドｐＭＡ５６２０−ｈａ２３を示す図
である。第１１図は、ｐＭＡ５６２０またはｐＭＡ５６
２０−ｈａ２３で形質転換したＭＤ４０−４ｃ抽出物の
スクロース グラジェント フラクションのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析結果を示す図である。タンパク質は、クーマ
シーブルーで染色されている。
【００３１】第１２図は、精製Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰｓの
電顕写真である。第１３図は、ｐＭＡ−５６２０−ｈａ
２３で形質転換したＭＤ４０−４ｃ抽出物のスクロース
グラジェント フラクションからのタンパク質のウエ
スターンブロット図である。ブロットは、抗Ｔｙ−ＶＬ
Ｐ抗体と抗全インフルエンザウィルス抗体でプローブさ
れた。
【００３２】第１４図は、精製Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰ、全
インフルエンザウィルスＮＴ６０（Ｈ３）および左から
右へ、正常“プレ−ブレッド（pre-bled) ”ラビット血
清、抗Ｔｙ−ＶＬＰ抗血清正常“プレ−ブレッド”ラビ
ット血清、抗Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰ抗血清および抗全イン
フルエンザウィルス血清でプローブした全インフルエン
ザウィルスＰＲ８のウエスターンブロット図を示す。
【００３３】第１５図は、ｐＭＡ５６２０からｐＭＡ５
６２０−３５８を調製する方法を示す図である。ｐＭＡ
５６２０−３５８は、ＴＹＡの最初の２８０コドンを含
有する。第１６図は、少なくとも粒子形成に必須なタン
パク質の２８６〜３８１セグメントを含むＴＹＡ１〜３
８１アミノ酸のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図であ
る。アミノ酸の記号は、次のようである。
【００３４】ア ミ ノ 酸 記 号 アラニン Ａ アルギニン Ｒ アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ Ａｓｎおよび／またはＡｓｐ Ｂ システイン Ｃ グルタミン Ｑ グルタミン酸 Ｅ Ｇｌｎおよび／またはＧｌｕ Ｚ グリシン Ｇ ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ ロイシン Ｌ リシン Ｋ メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ プロリン Ｐ セリン Ｓ トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ チロシン Ｙ バリン Ｖ
【００３５】実施例１ 使用した菌株は、イー．コリ（E. Coli)ＡＫＥＣ２８
（c600, thr C, thyA,trp C1117,hsd RK. Hsd K9）とエ
ス．セレビシエ（S. cerevisiae)ＭＤ４０−４ｃ（urd
2, trp 1, leu 2-3, leu 2-112. his 3-11, his 3-15）
であった。イー．コリ（E. Coli)媒体は、ミラー（Mill
er,Experiments in Molecular Genetics.,CSH p433,197
2)の方法で、そして酵母媒体は、ホーソーンとモーティ
マー（Hawthorne and Mortimer,Genetics,45,1085,196
0)の方法で調製した。イー．コリー（E. Coli)を標準的
な方法（Maniatis et al.,Molecular Cloning-A Labora
toryManual, CSH p199,1982)で形質転換した。酵母を、
ヒンネン等（Hinnen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,7
5, 1929,1978)の記載方法の如く形質転換した。
【００３６】制限消化およびプラスミド構成用の標準的
な方法を使用した（Maniatis et al.,1982, op. ci
t.）。制限酵素とＴ４ ＤＮＡリガーゼは、供給者の指
示どうりに使用した。Ｂａｌ ３１ エキソヌクレアー
ゼ消化は、ドブソン等の記述に沿って実施した（Dobson
et al., Nucl. Acids Res.,10, 5463,1982)。欠失終了
点は、ＤＮＡ配列化によって決定された（Sanger et a
l.,Proc. Natl. Acad.Sci.,74, 5463,1977)ＢａｍＨＩ
合成オリゴヌクレオチドリンカーは、ファーマシアから
得た。
【００３７】プラスミドＤＮＡをチノルトとカーボン
（Chinault and Carbon,Gene,5,111,1979)およびホルメ
スとクウイグレイによる急速分析（Holmes and Quigle
y,Anal.Biochem.,114, 193,1981)に記載の如く、予めイ
ー．コリー（E. Coli)から単離した。Ｔｙ−ＶＬＰを次
のように精製した。すなわち、酵母細胞を、３０℃にお
いて８×１０6細胞／mlの密度に選択的に成長させた。
その後、細胞を低速遠心分離で集め、氷冷水で１度洗浄
し、そして１ｌ当り１mlの細胞でＴＥＮバッファー（10
mM. Tris. pH7.4; 2mM EDTA; 140mM NaCl)に再懸濁させ
た。細胞を、＞７０％破壊するまで４℃においてガラス
ビーズ（４０メッシュ;BDH）で撹拌して破壊した。ビー
ズを低速遠心分離で小球化し、その後上澄を集め、破片
をミクロフュージ中で２０分間遠心分離にかけて除い
た。Ｔｙ−ＶＬＰを４℃において１００，０００ｇで１
時間遠心分離し、そして１夜ＴＥＮバッファー中で再懸
濁させて、上澄液からペレット化した。再懸濁Ｔｙ−Ｖ
ＬＰを、上澄液を10mM Tris, pH7.4; 10mM NaCl中の１
５−４５％（ｗ／ｖ）スクロースグラジェントに導入
し、そして１５℃において７６，３００ｇで３時間スピ
ンする前に、４℃において１５分間ミクロフュージ中で
遠心分離にかけて細胞破片を除いた。フラクションを試
験管の底から回収し、ピークフラクションを、アリコー
トのフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびクーマ
シーブルー染色法で試験し同定した。ＶＬＰを、４℃に
おいて１００，０００ｇで１時間ピークフラクションを
遠心分離することによって、濃縮した。
【００３８】全酵母細胞のタンパク質抽出物を、前記の
如く調製した（Mellor et al,Gene,24,1,1983)。ゲル工
程は、ラエムリの方法であった（Laemmll,Nature,227,
68,1970)。タンパク質濃度は、バイオーラド ラボラト
リーズから得た染色結合アッセイ法（Bradford,Anal. B
iochem.,72, 248,1976)を用いて測定した。ポリクロー
ナル馬抗インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ抗体は、
ベーリンガー マンハイムから購入した。抗Ｔｙ−ＶＬ
Ｐ抗血清は、標準的な方法でラビットから調製した。
【００３９】ウエスターン ブロッティング法は、タウ
ビン等の記載の方法に従って実施した（Towbin et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci.,76, 4350,1979)。結合抗体
を、西洋わさび（horse radish）パーオキシダーゼに共
役したラビット抗−ホース（horse)第２抗体（Miles Sc
ientific）かまたはラビット中に生じたパーオキシダー
ゼ抗パーオキシダーゼ（ＰＡＰ）複合体に附随するヤギ
抗ラビット第２抗体（シグマ）のいずれかによって検出
した。酵素反応は、デ ブラスとチェルビンスキーの記
載の方法（De Blas and Cherwinski,Anal. Biochem.,13
3, 214,1983)の如く展開した。
【００４０】プラスミドｐＭＡ９１−１１は、以前に記
載している（Dodson et al,EMBO. J.,3, 1115,1984)。
そのプラスミドは、高効率発現ベクターｐＭＡ９１に挿
入されたＴｙ要素、Ｔｙ１−１５、の主要転写単位であ
る最初の１４５０ヌクレオチドを含んでいる（Mellor e
t al.,1983 op. cit: Kingsman and Kingsman,Biotech.
and Genet. Eng. Rev.,3, 377,1985)。Ｔｙ成分は、ド
ブソン等〔Dobson et.al.(op. cit）〕等の記載の如
く、ｐＫＴ４０ｂから誘導された。ｐＫＴ４０ｂは、イ
ギリス国アバディーンのＮＣＩＢに寄託し、アクセッシ
ョンナンバーＮＣＩＢ１２４２７を受けた。次に、発現
ベクターｐＭＡ９１は、イー．コリー（E.Coli)内で複
製と選択を許容するプラスミドｐＢＲ３２配列、酵母内
で効率的な自立複製を許容する複製の酵母２ミクロンプ
ラスミド源、酵母ｌｅｕ２とＥ．ｃｏｌｉ ｌｅｕＢ突
然変異体の両者中の選択的マーカーとしての酵母ＬＥＵ
２遺伝子、および酵母転写終結用の全信号を含むＰＧＫ
の３’領域から１５００〜１の酵母ＰＧＫ遺伝子の上流
非コーディング領域を分離するＢｇ／ＩＩ発現部位から
成る。プラスミドｐＭＡ９１は、米国特許４６１５９７
４号の第１５図にｐＭＡ３０１３と指定されたプラスミ
ドがプラスミドｐＭＡ９１として公知であるが、該米国
特許に記載されている。米国特許４６１５９７４号の第
１図の下部に示されたプラスミドは、それ故に、改名さ
れている。
【００４１】従って、Ｔｙ発現は、高効率酵母ホスホグ
リセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）のプロモータおよ
びＴＹＡ遺伝子のｐｌタンパク質、第１翻訳生成物のｐ
ＭＡ９１−１１過多生産における大きなかたまりを含む
菌株の酵母抽出物から誘導される（Dobson et al., 198
4 op. cit; Mellor et al.,1985a. op. cit)。ｐＭＡ９
１−１１含有酵母形質転換体の抽出物は大量にＴｙ−Ｖ
ＬＰを含むことが示される（第１図）。それ故に、ＴＹ
Ａ単独でＴｙ−ＶＬＰ形成に関する十分な情報を含み、
そしてｐＭＡ９１−１１含有ＭＤ４０−４ｃの抽出物中
に発見されたｐｌタンパク質が粒子に組み立てられる
（第１図と第４図）。この情報は、本発明の基礎を提供
する。
【００４２】プラスミドベクターｐＭＡ５６２０の構
成、即ちハイブリッドＴｙ−ＶＬＰ粒子の合成に関する
ものは、第２図に図示されている。このことは、ベクタ
ー構成がＴＹＡ遺伝子内に便利な制限エンドヌクレアー
ゼ部位を要求しているので、いかなるコーディング配列
も該部位に挿入し、ＴＹＡハイブリッド遺伝子を産生し
得る。しかしながら、かかるハイブリッド内にＴｙ−Ｖ
ＬＰの合成に関する十分なＴＹＡコーディング配列が存
在することが必須である。プラスミドｐＭＡ９１−１１
は、ＢｇｌIIで切断され、多くの時間Ｂａｌ ３１エキ
ソヌクレアーゼで消化され、そして過剰のＢａｍＨＩリ
ンカー（CCGGATCCGG）の存在下で再リゲートされた。生
成したプラスミドの欠失終了点は、ＤＮＡ配列化によっ
て決定された。プラスミドｐＭＡ９１−３５７は、２６
５ｂｐが除去された欠失誘導体である。このことは、Ｂ
ａｍＨＩリンカーを、ＴＹＡのコドン３８１を越えてヌ
クレオチド上に配置する（第３図）。
【００４３】すべての三つの解読枠の転写終了配列およ
び翻訳停止コドンの両者を提供するために、ｐＭＡ９１
−３５７の欠失ＰＧＫ３’終止配列をプラスミドｐＤＴ
８６から単離した２８７ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ
ＤＮＡフラグメントで置換した。このＤＮＡフラグメン
トは、ＢａｍＨＩ部位下流における全ての三つの解読枠
に翻訳停止コドンを含む酵母ＰＧＫ遺伝子からの、修飾
３’転写終止フラグメントである（第２図と第３図）。
この終止フラグメントは、ＰＧＫコーディング配列の最
終センス コドンにリンクしたＢａｍＨＩリンカー（CC
GGATCCGG）で開始し、そしてＰＧＫコーディング配列を
越えてＨｉｎｄIII部位２７９ヌクレオチドに拡大する
（Hitzeman et al.,Nucl. Acids Res.,10, 7791,198
2）。これらの構成において、ＨｉｎｄIII部位は、合成
リンカーを用いてＳａｌＩに変更されている。終止フラ
グメントは、臨界的ではなく、そして酵母転写終止を附
随するすべての三つの解読枠の終止コドンを含むフラグ
メントは十分であろう。生成したプラスミドｐＭＡ５６
２０は、ハイブリッドＴｙ−ＶＬＰへ組み立てられるハ
イブリッドタンパク質を産生するために好適な配列が挿
入される唯一のＢａｍＨＩ部位を含んでいる。
【００４４】ｐＭＡ５６２０を試験するために、インタ
ーフェロン−アルファ２（ＩＦＮ）ｃＤＮＡがモデル抗
原コーディング配列として使用された。５４０ｂｐ Ｂ
ａｍＨＩ ＩＦＮ−アルファ２ ｃＤＮＡ フラグメン
ト、すなわちフラグメント８と指定されている（Mellor
et al.,Gene,33, 215,1985b)ものをプラスミドｐＭＡ
５６２０の唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入した。生成した
プラスミドは、ｐＭＡ５６２０−８（第２図と第３図）
と指定された。
【００４５】ＶＬＰは、プラスミドｐＭＡ５６２０−８
で形質転換された酵母菌株ＭＤ４０−４ｃから調製さ
れ、そして１５−４５％スクロースグラジェントからの
フラクションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで試験された。
グラジェント中のタンパク質は、クーマシーブルー染色
法で目視化された（第４図）。予想７０ｋｄ ＴＹＡ−
ＩＦＮ融合タンパク質のグラジェント中の位置は、最終
的にタンパク質の微粒子特性を示した。フラクションの
電子顕微鏡写真は、微粒子が存在することを確認した
（第５図）。７０ｋｄ微粒子タンパク質が事実、Ｔｙ
（５０ｋｄ）：ＩＦＮ（２０ｋｄ）であることを立証す
るために、スクロースグラジェントからの融合タンパク
質フラクションを再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで試験し、
そして分離したタンパク質をニトロセルロースフィルタ
ーに移した。１つのフィルターは、Ｔｙタンパク質との
反応が公知であるＴｙ−ＶＬＰ抗体でプローブし、そし
て他のものは、抗ＩＦＮ−アルファ抗体でプローブした
（第６図）。両者において、強く反応した７０ｋｄタン
パク質は、このタンパク質がＴｙとＩＦＮエピトープの
両者を含むことを示した。
【００４６】ハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰ生成方
法の効率は、第７図で示される。７０ｋｄハイブリッド
タンパク質は、製剤において非常に重要な種である。モ
デル抗体に対する免疫応答性を引き出すこれらのハイブ
リッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰ効能を試験するために、ラ
ビット内の抗血清が、ｐＭＡ５６２０−８で形質転換さ
れた酵母抽出物から精製された濃縮ハイブリッドＴｙ：
ＩＦＮ−ＶＬＰに対して提案させた。ＩＦＮ−アルファ
２を過剰生産するプラスミドｐＭＡ９１−１で形質転換
したＭＤ４０−４ｃ抽出物（Mellor et al.,1985b,op.
cit.）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、それに沿って
インターフェロンを産生しないｐＭＡ９１で形質転換し
たＭＤ４０−４ｃを抽出物も上記の如く行った。分離し
たタンパク質をニトロセルロースに写し、Ｔｙ−ＶＬＰ
抗血清かまたはＴｙ：ＩＮＦ−ＶＬＰ抗血清のいずれか
でプローブした（第８図）。両抗血清が抽出物中に存在
するＴｙタンパク質と反応するけれども、抗ハイブリッ
ドＴｙ：ＩＮＦ−ＶＬＰ抗血清がプラスミドｐＭＡ９１
−１を含有する抽出物中の２０ｋｄＩＦＮタンパク質と
反応した。
【００４７】これらのデータは、次のことを示す。１）
ｐＭＡ５６２０−８は、Ｔｙタンパク質ｐｌの最初の３
８１個のアミノ酸と非Ｔｙタンパク質とからなるハイブ
リッド融合タンパク質の合成を誘導する。この場合、イ
ンターフェロンアルファ２である。２）この融合タンパ
ク質は、ハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰを形成す
る。３）ハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰは、容易に
単離し得る。４）ハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰ
は、ラビット免疫システムに対してモデル抗原、インタ
ーフェロン−アルファ２を提出する。それ故、ｐＭＡ５
６２０がハイブリッドＴｙ−ＶＬＰの合成を誘導するも
のであり、そしてかかる粒子中に存在するいかなる抗原
も哺乳動物の免疫システム、例えばラット、ハムスタ
ー、犬、猫、ウシ、羊、ブタおよびヒトに提供すること
が理にかなっている。明らかに、ここで実施例として使
用したインターフェロンｃＤＮＡは、完全なタンパク質
またはタンパク質の部分をエンコードする他のＤＮＡ片
で置換できた。
【００４８】この抗原提供システムの微粒子特性および
そのためのハイブリッドＴｙ−ＶＬＰ精製の容易さは、
本発明を規定された抗原に対する抗体産生刺激手段とし
て、新規ワクチンの生産手段として、モノクローナル抗
体産生用に規定された抗原調製用の手段として、診断ア
ッセイ法用抗原の調製手段として有効にする。それ故、
ハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰは、抗ＩＦＮ抗体
（モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであ
るが、好ましくはモノクローナルである）を高めるため
に使用される、ここで該抗体はその後ＩＦＮ精製に使用
される。
【００４９】実施例２ ドロソフィラ メラノガスター（Drosophila melanogas
ter）のコピア要素は、遺伝子およびウィルス様粒子形
成の両者における酵母のＴｙ要素に極めて類似する（Mo
unt & Pubin,Mol. Cell. Biol., 5,1630,1985）。ＴＹ
Ａに等価なコピア領域は、レトロウィルス機構の類似に
よってｇａｇと称される。それ故、昆虫細胞発現システ
ムのコピア要素のｇａｇ領域における高度な発現は、Ｔ
ｙ−ＶＬＰｓ類似粒子に組み立てられるタンパク質を導
くことが見い出される。ｇａｇが他のタンパク質のコー
ディング配列と融合するならば、生成融合タンパク質も
同様に前記Ｔｙ：ＩＦＮハイブリッド粒子類似ハイブリ
ッドコピア粒子に組み立てられることも見い出される。
【００５０】抗原提供としてのコピア粒子および精製シ
ステムを確立するために、プラスミドｐＰＷ２２０から
のｇａｇ（Potter & Brosein,Cell,17,415,1979)は、プ
ラスミドｐＡＣ３７３−ｇａｇを産生するためにｐＡＣ
３７３（Smith et al.,J. Virol.,46, 584,1983）の如
き代表的な高効率バキュロウィルス（Baculovirus)発現
ベクターに挿入する標準的な組換えＤＮＡ方法で処理さ
れる。発現は、ポリヘドリンプロモーターによって行わ
れる。その後、インターフェロンｃＤＮＡは、枠のｇａ
ｇの３’端に挿入され、プラスミドｐＡＣ３７３−ｇａ
ｇ−ＩＦＮを産生する。このプラスミドは、直接的にｐ
ＭＡ５６２０−８に類似する（実施例１を参照のこ
と）。ｐＡＣ３７３−ｇａｇ−ＩＦＮは、その後スポド
プテラ フルギペルダ（Spodoptera frugi perda）細胞
内においてインビボ組換えによってバキュロウィルス
（Baculovirus)、オートグラファ カルフォニカ ニュ
クリアポリヘドロシス（Autographa californica nucle
ar polyhedrosis)(AcNPV）に導入される（Smith et a
l.,Mol. Cell. Biol.,4,2156,1983）。組換えウィルス
は、閉鎖マイナスプラークから収穫し、新鮮なエス．フ
ルギペルダ（S. frugiperda)細胞を再感染するために使
用される。ハイブリッドコピア：ＩＦＮ粒子を感染後７
２〜９６時間で収穫し、スクロース グラジェントで分
留してバキュロウィルス不純物から分離した。粒子は、
電子顕微鏡及びＴｙ−ＩＦＮハイブリッド粒子の項で記
載のウエスターンブロッティング法によって同定した
（実施例１を参照のこと）。
【００５１】実施例３ ドロソフィラ（Drosophila）ＡＤＨ遺伝子プロモーター
により発現したｇａｇＩＦＮ融合物を含有する組換えプ
ラスミド（Benyajati et al.,Cell, 33,125,1983)が簡
単なＤＮＡ仲介トランスフェクションによって昆虫細胞
に導入される（例えばドロソフィラ シュナイダー２細
胞）ことを除いて、実施例２の一般的な方法に従った。
【００５２】実施例４ 酵母Ｔｙ要素のＴＹＡ遺伝子は、鳥類及び哺乳類のレト
ロウィルスのｇａｇ遺伝子にまさに類似している。ＴＹ
Ａ生成物だけが粒子形成が可能であるので、ｇａｇタン
パク質が同一なことを行ない、それ故に、抗原提供およ
び精製システムの基礎として作用するだろう。
【００５３】抗原精製および提供システムとしてのレト
ロウィルス性ｇａｇタンパク質を立証するために、ＨＩ
Ｖ−Ｉからのｇａｇ遺伝子は、標準的な組換えＤＮＡ方
法で処理されて酵母発現ベクターｐＭＡ９１及び哺乳類
発現ベクターｐＳＶ２に導入される（Southern and Ber
g,J. Mol. Appl. Genet.,1,327,1982)、ここで該ベクタ
ーはｐＭＡ９１−ＨＩＶｇａｇおよびｐＳＶ２５−ＨＩ
Ｖｇａｇをそれぞれ産生するために哺乳類のｄｈｆｒｃ
ＤＮＡを含有する。その後インターフェロンｃＤＮＡ
は、枠内のそれぞれの分子のｇａｇ ３ｅｎｄ端に導入
されて、ｐＭＡ９１−ＨＩＶｇａｇ−ＩＦＮとｐＳＶ２
５−ＨＩＶｇａｇ−ＩＦＮをそれぞれ産生する。これら
の分子は、ｐＭＡ５６２０−８に類似する（実施例１を
参照のこと）。その後、ｐＭＡ９１−ＨＩＶｇａｇ−Ｉ
ＮＦは、酵母菌株ＭＤ４０−４ｃを形質転換するために
使用され、ｐＳＶ２５−ＨＩＶｇａｇ−ＩＮＦは、ＣＨ
Ｏ−ｄｈｆｒ細胞をトランスフェクト（transfect)する
ために使用される。安定な形質転換体が増殖させられ、
細胞抽出物が調製され、かつスクロースグラジェントで
分留される。ハイブリッドＨＩＶｇａｇ：ＩＮＦは、Ｔ
ｙ：ＩＮＦハイブリッド粒子の項で記載の如く、電子顕
微鏡及びウエスターンブロッティング法により同定され
る（実施例１を参照のこと）。
【００５４】実施例５ ｐＳＶ２５−ＨＩＶｇａｇ−ＩＮＦがＣＯＳ細胞に導入
され（Gluzman et al.,J. Virol.,24,534,1977）、かつ
ハイブリッド粒子がトランスフェクション後３〜９日で
収穫された以外は、実施例４の方法に従った。
【００５５】実施例６ この実験において、一部のインフルエンザ血球凝集素
（ＨＡ）含有ハイブリッドＴｙ−ＶＬＰを産生し得、か
つこれらのハイブリッドＴｙ：ＨＡ−ＶＬＰがラビット
中で抗ＨＡ抗体形成を誘導することを示す。
【００５６】これらの実験方法は、実施例１に記載のハ
イブリッドＴｙ−ＩＦＮ−ＶＬＰの産生と分析に関する
ものと、本質的には同じである。ＭＲＣ１２／８０抗全
インフルエンザウィルス抗体は、英国、ミルヒル、ＮＩ
ＭＲの世界インフルエンザセンターから得られ、インフ
ルエンザウィルス菌株Ａ／スコットランド／８４０／７
４×Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ３Ｎ２）に対して提案され
た。インフルエンザウィルスＡ／メンフィス／１０２／
７２（Ｈ３Ｎ２）のＨＡ１ドメインのコドン２５−１１
１に対応するＨＡコーディング配列領域は、ウィルソン
等のデータ（Wilson,Cell,37, 767,1984）に基づいてハ
イブリッドＴｙ：ＨＡ−ＶＬＰ形成用に選択された。コ
ドン２５−１１１に対応する２６２ｂｐ ＳｐｅＩ；Ｓ
ｐｅＩ（第９図）は、プラスミドｐＭＸ２９の適切な消
化で精製された。ｐＭＸ２９は、ＰｓｔＩ部位につづく
インフルエンザウィルス菌株Ａ／メンフィス／１０２／
７２ＧＧ：ｃから、ＨＡ ＲＮＡから誘導されたＨ３Ｈ
Ａ ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＡＴ１５３である
（Twigg and Sherratt,Nature,283, 216,1980）。Ｓｐ
ｅＩ：ＳｐｅＩフラグメントの粘着性端をＤＮＡポリメ
ラーゼＩを使用して仕上げ、その後、該フラグメントを
プラスミドｐＳＰ４６のＨｉｎｃII部位にリゲートし
（blunt-end ligate）てｐＳＰ４６−ｈａ２３を産生し
た。ｐＳＰ４６は、ｐＳＰ６４のＨｉｎｄIII部位がＢ
ｇｌII部位に転換されているｐＳＰ６４（プロメガバイ
オテック）の誘導体である。ｈａ２３と指定されたＢａ
ｍＨＩ；ＢａｌIIフラグメントは、ｐＳＰ４６−ｈａ２
３から精製された。ｈａ２３は、２６２ｂｐで埋められ
たＳｐｅＩ；ＳｐｅＩフラグメントを含有する。その
後、ｈａ２３は、ｐＭＡ５６２０のＢａｍＨＩ部位に挿
入されてｐＭＡ５６２０−ｈａ２３を産生する（第１０
図）。このプラスミドは、酵母菌株ＭＤ４０−４ｃを、
ロイシンインディペンデンスに形質転換するために使用
された。
【００５７】ＶＬＰを、ｐＭＡ５２６０−ｈａ２３また
はｐＭＡ５６２０で形質転換した酵母ＭＤ４０−４ｃか
ら調製し、１５〜４５％スクロースグラジェントで分留
した。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで試験し、
タンパク質をクーマーシーブル−染色法で目視化した
（第１１図）。予想ＴＹＡ−ＨＡ融合タンパク質のグラ
ジェント中の位置は、タンパク質の微粒子特性を示し
た。フラクション電子顕微鏡で粒子の存在が確認された
（第１２図）。
【００５８】粒子がＨＡ抗原を含有することを確認する
ために、類似グラジェントからｐＭＡ５６２０−ｈａ２
３を有するＭＤ４０−４ｃの分留抽出物を再度ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルで試験し、その後分離タンパク質をニトロ
セルロースフィルターへ電子ブロット（electroblot)し
た。１つのフィルターをＴｙタンパク質との反応が公知
の抗Ｔｙ−ＶＬＰ抗体でプローブし、他のものを抗ＨＡ
抗体でプローブした。両者において、反応した推定Ｔ
ｙ：ＨＡ融合タンパク質は、このタンパク質がＴｙとＨ
Ａエピトープの両者を含むことを強く示した（第１３
図）。
【００５９】ＨＡへの免疫応答性を引き出すハイブリッ
ドＴｙ：ＨＡ−ＶＬＰの効能をテストするために、ｐＭ
Ａ５６２０−ｈａ２３で形質転換したＭＤ４０−４ｃ抽
出物から精製した濃縮ハイブリッドＴｙ−ＨＡ−ＶＬＰ
に対してラビットにおいて抗血清が提案された。この抗
血清は、その後、ウェスターンブロッティング法によっ
て、全インフルエンザウィルスから破壊されたタンパク
質をプローブするために使用された。３タンパク質サン
プルが使用された。第１のものは、抗血清を高めるため
に使用される精製Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰであった。第２の
ものは、全インフルエンザウィルスＰＲ８（Ｈ３）であ
った。第３のものは、全インフルエンザウィルスＮＴ６
０（Ｈ１）であった。ＰＲ８とＮＴ６０の両者は、英国
オックスフォード パソロジーのサーウィリアム ダン
スクールのジョージ ブラウンリー（Geroge Brownle
e)から得た。第１４図は、抗Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰ抗体が
Ｈ３ＨＡのＨＡ１領域は反応するが、Ｈ１ＨＡとは反応
しないことを示す。かかる反応は、プレブリード血清で
観察されるが抗Ｔｙ−ＶＬＰ抗体では観察されない。正
の対照として、同一サンプルが抗全ウィルス抗体でプロ
ーブされた。この場合に、Ｈ１ＨＡのＨ３ＨＡの両方が
抗血清と反応した。ハイブリッドＴｙ：ＨＡ−ＶＬＰが
Ｈ３抗原エピトープに特異な抗ＨＡ抗体産生を誘導す
る。
【００６０】これらのデータは、ｐＭＡ５６２０−ｈａ
２３がＴｙタンパク質ｐｌの最初の３８１アミノ酸およ
びウィルス性タンパク質の小領域、インフルエンザウィ
ルスＨＡから成るハイブリッド融合タンパク質の合成を
誘導することを示す。この融合タンパク質は、ハイブリ
ッドＴｙ：ＨＡ−ＶＬＰを形成する。ハイブリッドＴ
ｙ：ＨＡ−ＶＬＰは容易に単離され、かつ、かかる方法
でラビット免疫システムにＨＡ成分を提供するので抗Ｈ
Ａ抗体が産生される。これらの抗体は、ウエスターンブ
ロット法においてＨ１ＨＡとＨ３ＨＡとを区別し得る。
明らかに、ハイブリッドＴｙ：ＨＡ−ＶＬＰのＨＡ成分
は、他のインフルエンザウィルス成分はまたは他のウィ
ルス成分で置換し得、かつ類似結果が得られることが予
想できる。
【００６１】実施例７ ３’端において累進的により少ない配列を含む一連の切
断ＴＹＡ遺伝子を得るために、標準的なＢａｌ３１消化
は、出発分子としてｐＭＡ５６２０を使用して行われ
た。プラスミドｐＭＡ５６２０は、ＢａｍＨＩで切断さ
れ、種々の時間Ｂａｌ３１で消化され、そして過剰のＢ
ａｍＨＩリンカー（CCGGATCCGG）存在下で再リゲートさ
れた。精製プラスミドの欠失端終了点は、ＤＮＡ配列化
で決定された。これらの欠失の１つは、ＴＹＡの最初の
２８６コドンだけを含み、３５８と指定された。３５８
の欠失ＰＧＫターミネーター配列は、ｐＭＡ５６２０か
らの大きなＰｖｕII−ＢａｍＨＩフラグメントを３５８
からの６８０ｂｐＰｖｕII−ＢａｍＨＩフラグメントで
リゲートすることによって置換された。生成したプラス
ミドは、ｐＭＡ５６２０−３５８と指定された（第１５
図）。
【００６２】２つの若干異なる３’ターミネーター（te
rmini)を有するインターフェロンアルファ２ｃＤＮＡ
ＢａｍＨＩフラグメント（IFN-８とIFN-2;Mellor et a
l.,Gene, 33, 215,1985;Mellor et al.,Nature,313, 24
3,1985）を、枠内の、ｐＭＡ５６２０とｐＭＡ５６２０
−３５８のＢａｍＨＩ部位に挿入してプラスミドｐＭＡ
５６２０−８とｐＭＡ５６２０−３５８−２を産生し
た。
【００６３】プラスミド ｐＭＡ９１−１１、ｐＭＡ５
６２０およびｐＭＡ５６２０−３５８を、酵母菌株ＭＤ
４０−４ｃをロイシン インディペンデンスに形質転換
するため使用した。生成形質転換体は、抗Ｔｙ−ＶＬＰ
抗体を使用するウエスターンブロッティング法で決定し
たように、プラスミドから生産されたＴＹＡ ＲＮＡお
よびｐｌまたは切断ｐｌタンパク質の量に匹敵する。Ｒ
ＮＡおよびタンパク質の量は、各形質転換体において同
じであった。
【００６４】各形質転換体からの抽出物は、その後、１
５〜４０％スクロースグラジェントで分留され、それに
続くｐＭＡ９１−１１とｐＭＡ５６２０の両方に対する
クーマシーブルー染色法によって分析された。微粒子構
造の特徴であるグラジェント領域にｐｌまたは切断ｐｌ
タンパク質がある。しかしながら、ｐＭＡ５６２０−３
５８の場合に、微粒子物質は観察されない。
【００６５】インターフェロン アルファー２ ｃＤＮ
Ａを枠内、プラスミドｐＭＡ５６２０およびｐＭＡ５６
２０−３５８の各々に融合してプラスミドｐＭＡ５６２
０−８およびｐＭＡ５６２０−３５８−２を産生した。
これらのプラスミドは、酵母菌株ＭＤ４０−４ｃをロイ
シン インディペンデンスに形質転換するために使用さ
れ、そしてＴｙ同一源ＲＮＡとｐｌおよびｐｌ：インタ
ーフェロン融合タンパク質は前記の如く測定された。Ｒ
ＮＡとタンパク質のレベルは、形質転換体の両方と同じ
であり、かつ、ｐＭＡ５６２０とも同じである。ｐＭＡ
５６２０−８を１４〜４５％スクロースグラジェントで
分析した。７０ＫＤｐｌ：インターフェロン融合タンパ
ク質は、微粒子構造のグラジェント特性領域中で観察さ
れた。しかしながら、ｐＭＡ５６２０−３５８−２の含
有抽出物が分析されたときに、微粒子物質が観察されな
かった。
【００６６】このように、Ｔｙ−ＶＬＰ形成には、少な
くともアミノ酸２８６〜３８１間の配列部分が要求され
る。ｐｌのＤＮＡとアミノ酸配列は、アミノ酸２８６〜
３８１のＤＮＡのアミノ酸配列をも示す（第１６図）。
【００６７】実施例８ ＶＬＰ抗原を用いる酵素イムノ
アッセイ法 ９６ウエル微少力値プレートを、各ウエルを室温で２時
間、５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー中の２０μｇ／
mlのＶＬＰ、ｐＨ９．５、の５０μｌでインキュベート
してＶＬＰ抗原（抗原を有するウィルス様粒子）で被覆
した。過剰のＶＬＰ抗原を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、
ｐＨ７．４、で３分間及び５分間の洗浄でウエルから除
去した。バックグランド反応を最小にするために、ウエ
ルを室温で、１時間ＰＢＳ中の２％カゼイン１００μｌ
で保護し、その後０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−
Ｔ）含有ＰＢＳで３分間及び５分間洗浄した。試験サン
プル中の第１抗体を、０．５％カゼイン含有ＰＢＳ−Ｔ
（ＰＢＳ−ＣＴ）中で好適に希釈する。好適な希釈液
は、１／１０〜１／７．２９０の３倍希釈系である。第
１抗体は、ハイブリッドＴｙ−ＶＬＰの非Ｔｙ成分に反
応性を有する。５０μｌの第１抗体を適切なウエルに加
え、室温で２時間インキュベートした。過剰の第１抗体
をＰＢＳ−Ｔで３分間および５分間洗浄して除去する。
第２抗体は、ホースラディッシュ パーオキシダーゼ標
準化抗種ＩｇＧであり、ＰＢＳ−ＣＴ中で１／１５００
に希釈された。５０μｌの希釈第２抗体を各ウエルに加
え、室温で２時間インキュベートし、その後ＰＢＳ−Ｔ
で５分間洗浄した。基質は３，３’，５，５’−テトラ
メチルベンジリデンであり、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中
で０．１mg／ml濃度であり、０．５Ｍクエン酸及び０．
０３％ハイドロジェン パーオキサイドでｐＨ６．０に
調節されている。５０μｌの基質を各ウエルに加え、カ
ラー反応を１０分間行なった。反応は、０．５Ｍ硫酸２
５μｌを各ウエルに加えて決定される。カラー反応は、
微小リーダーを用いて４５０ｎｍにおいて測定して評価
される。この方法で、試験サンプル中の第１抗体の直接
アッセイ法が実施される。
【００６８】実施例９ ハイブリッドＴｙ−ＶＬＰから
の外因性タンパク質の開裂 ハイブリッドＴｙ−ＶＬＰがｐｌ融合タンパク質を精製
するために使用される場合に、融合タンパク質のｐｌ成
分を除去して外因性または非ｐｌ成分を残すことが有益
である。このことは、ｐｌと非ｐｌ配列の結合部におけ
る開裂を要求する。このことは、Ｔｙ−ＶＬＰを使用し
て正確なタンパク質を産生する手段を提供する。この目
標を達成する一つの方法は、特異タンパク分解性開裂部
位をｐｌ／非ｐｌ接合部に導入することである。
【００６９】Ｔｙ−ＶＬＰから非融合インターフェロン
を産生するために、ｐＭＡ５６２３と指定されたｐＭＡ
５０２０誘導体を構成した。この構造は、ＴＹＡのコド
ン３８１において４つの付加コドンをＢａｍＨＩリンカ
ー前に加えた以外は、ｐＭＡ５６２０と同一である。こ
れらのコドンは、血液凝集因子Ｘaの開裂部位であるア
ミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをエンコー
ドする（Nagai & Thogersen, Nature, 309, 810,198
4)。ｐＭＡ５６２０−８、ｐＭＡ５６２３−８に類似す
る構成用の接合領域は次のようである。
【００７０】
【数１】
【００７１】ｐＭＡ５６２３−８が酵母菌株ＭＤ４０−
４ｃに形質転換されると、ハイブリッドＩＦＮ：Ｔｙ
ＶＬＰに組み立てられるｐｌ：ＩＮＦ融合タンパク質が
産生される。しかしながら、ｐＭＡ５６２０−８含有形
質転換体に対して融合タンパク質接合部において開裂部
位が存在するために、牛血フラクションＸaを有する微
粒子融合タンパク質をインキュベートすると粒子からの
インターフェロンを開裂する。
【００７２】前記の如く、それ故、ハイブリッドＩＦＮ
−Ｔｙ−ＶＬＰは、第１図のスクロース密度グラジェン
ト分留によって非微粒子タンパク質から精製される。そ
の後、ＩＦＮは開裂され、第２回のスクロース密度グラ
ジェント分留によって微粒子ｐｌタンパク質から精製さ
れて、純粋で“確かな”インターフェロンを生ずる。こ
の実施例で示されるインターフェロンコーディング配列
は、他のコーディング配列で置換可能であり、この方法
は他のタンパク質の発現および生成にも適用可能であ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＭＡ９１−１１で形質転換したＭ
Ｄ４０−４ｃから精製したＴｙウィルス様粒子（Ｔｙ−
ＶＬＰ）の写真である。
【図２】ｐＭＡ５６２０とｐＭＡ５６２０−８の構造を
示す概略図である。
【図３】本発明の実施例の主要成分の拡大図および主要
結合部のヌクレオチドの配列を有するプラスミドｐＭＡ
５６２０−８の概要図である。
【図４】ｐＡＭＡ９１−１１，ｐＭＡ９１とｐＭＡ５６
２０−８を含有するＭＤ４０−４ｃから粒子とタンパク
質のスクロースグラジェント分離のフラクションのＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル分析の写真である。
【図５】ｐＭＡ５６２０−８を含有するＭＤ４０−４ｃ
から精製したハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰの写真
である。
【図６】ｐＭＡ５６２０−８を含有するＭＤ４０−４ｃ
の抽出物からのスクロースグラジェントフラクションの
ウエスターンブロットの写真であり、ａ）は抗Ｔｙ−Ｖ
ＬＰ抗体を使用する結果を示し、ｂ）は抗インターフェ
ロン抗体を使用する結果を示す。
【図７】精製ハイブリッドＴｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰ製剤
（１）、ｐＭＡ５６２０−８で形質転換したＭＤ４０−
４ｃの全抽出物（２）と非形質転換ＭＤ４０−４ｃ
（３）内のタンパク質クーマシー染色ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル分析の写真である。
【図８】抗Ｔｙ−ＶＬＰ担体（ｂ）、抗ハイブリッドＴ
ｙ：ＩＦＮ−ＶＬＰ抗体（ｄ）および対応するプレブリ
ード（Prebleed）血清（ａ＋ｃ）を使用するウエスター
ンブロットの写真である。
【図９】ＨＡコドン２５−１１１含有２６２ｂｐ Ｓｐ
ｅＩ：ＳｐｅＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す
図である。
【図１０】プラスミドｐＭＡ５６２０−ｈａ２３を示す
図である。
【図１１】ｐＭＡ５６２０またはｐＭＡ５６２０−ｈａ
２３で形質転換したＭＤ４０−４ｃ抽出物のスクロース
グラジェント フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
結果を示す図である。
【図１２】精製Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰｓの電顕写真であ
る。
【図１３】ｐＭＡ−５６２０−ｈａ２３で形質転換した
ＭＤ４０−４ｃ抽出物のスクロース グラジェント フ
ラクションからのタンパク質のウエスターンブロット図
である。
【図１４】精製Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰ、全インフルエンザ
ウィルスＮＴ６０（Ｈ３）および左から右へ、正常“プ
レ−ブレッド（pre-bled) ”ラビット血清、抗Ｔｙ−Ｖ
ＬＰ抗血清正常“プレ−ブレッド”ラビット血清、抗Ｔ
ｙ：ＨＡ−ＶＬＰ抗血清および抗全インフルエンザウィ
ルス血清でプローブした全インフルエンザウィルスＰＲ
８のウエスターンブロット図を示す。
【図１５】ｐＭＡ５６２０からｐＭＡ５６２０−３５８
を調製する方法を示す図である。
【図１６】少なくとも粒子形成に必須なタンパク質の２
８６〜３８１セグメントを含むＴＹＡ１〜３８１アミノ
酸のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年１２月２６日
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】ｐＭＡ５６２０またはｐＭＡ５６２０−ｈａ
２３で形質転換したＭＤ４０−４ｃ抽出物のスクロース
グラジェント フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
結果を示す写真である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】ｐＭＡ−５６２０−ｈａ２３で形質転換した
ＭＤ４０−４ｃ抽出物のスクロース グラジェント フ
ラクションからのタンパク質のウエスターンブロットを
示す写真である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】精製Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰ、全インフルエンザ
ウィルスＭＴ６０（Ｈ３）および左から右へ、正常“プ
レーブレッド（ｐｒｅ−ｂｌｅｄ）”ラビット血清、抗
Ｔｙ−ＶＬＰ抗血清正常“プレーブレッド”ラビット血
清、抗Ｔｙ：ＨＡ−ＶＬＰ抗血清および抗全インフルエ
ンザウィルス血清でプローブした全インフルエンザウィ
ルスＰＲ８のウエスターンブロットを示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 キングスマン，スーザン，メアリー イギリス国 オクソン オーエツクス５ ２エスエフ，アイスリツプ，ミドルストリ ート，グレイストン （番地なし) (72)発明者 アダムス，サリー，エリザベス イギリス国 オクソン オーエツクス５ １エスピー，キドリングトン，グローバー ランヅ，ザ フエルブス12 (72)発明者 マリム，ミカエル ヘンリー イギリス国 ゴルス．，ジーエル18，アツ ブリードン フオーゲレーン，アサーズ （番地なし) (72)発明者 メロー，エリザベス−ジェーン クライヤ ー イギリス国 オツクスフオード オーエツ クス２ ６エルビー，バンパリーロード 119，サツクレーエンド41

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第１アミノ酸配列とバイオ活性な第２ア
    ミノ酸配列からなり、 前記第１アミノ酸配列が、ＲＮＡレトロウィルスのｇａ
    ｇ遺伝子または昆虫コピア要素のｇａｇ遺伝子、または
    そのいずれかと構造的に類似な遺伝子配列によってエン
    コードされた粒子形成配列である粒子の組み立て可能な
    融合タンパク質。
  2. 【請求項２】 第２アミノ酸配列のバイオ活性が、抗原
    性である請求項１記載の融合タンパク質。
  3. 【請求項３】 第２アミノ酸配列が、細菌、ウィルスま
    たは原生動物の抗原をエンコードする遺伝子配列によっ
    てエンコードされている請求項２記載の融合タンパク
    質。
  4. 【請求項４】 ＲＮＡレトロウィルスのｇａｇ遺伝子
    が、ヒト免疫欠失ウィルスＩ又はII、サル免疫欠失ウィ
    ルス、ヒトＴ−細胞リンホトロピックウィルスＩ又はI
    I、ネズミ ルカエミア（Leukaemia)ウィルス、モロネ
    ーネズミ ルカエミアウィルス、マウス乳房腫瘍ウィル
    ス、鳥類のルコシス（Leukosis) ウィルス、ねこのルカ
    エミアウィルス、ヒトＢ−細胞リンホトロピックウィル
    スおよび牛ルカエミアウィルスからなる群から選択され
    る請求項１〜３のいずれか１つに記載の融合タンパク
    質。
  5. 【請求項５】 第１アミノ酸配列とバイオ活性な第２ア
    ミノ酸配列からなり、前記第１アミノ酸配列が、ＲＮＡ
    レトロウィルスのｇａｇ遺伝子または昆虫コピア要素の
    ｇａｇ遺伝子、またはそのいずれかと構造的に類似の遺
    伝子配列によってエンコードされた粒子形成配列である
    粒子の組み立て可能な融合タンパク質の多数からなる粒
    子。
  6. 【請求項６】 融合タンパク質内の第２アミノ酸配列
    が、互いにすべて同一とは限らない請求項５記載の粒
    子。
  7. 【請求項７】 第２アミノ酸配列のバイオ活性が、抗原
    性である請求項５記載の粒子。
  8. 【請求項８】 会合不純物から、第１アミノ酸配列とバ
    イオ活性な第２アミノ酸配列からなり、前記第１アミノ
    酸配列が、ＲＮＡレトロウィルスのｇａｇ遺伝子または
    昆虫コピア要素のｇａｇ遺伝子、またはそのいずれかと
    構造的に類似の遺伝子配列によってエンコードされた粒
    子形成配列である粒子の組み立て可能な融合タンパク質
    の多数からなる粒子を分離し、その後、該粒子の融合タ
    ンパク質からバイオ活性ペプチドを開裂させることを特
    徴とする実質的に純粋なバイオ活性ペプチドを産生する
    方法。
  9. 【請求項９】 哺乳動物の感染因子に応答して生産され
    た抗体に免疫反応性である融合タンパク質又は粒子を固
    形支持体上に分散してなり、 前記融合タンパク質が、第１アミノ酸配列とバイオ活性
    な第２アミノ酸配列からなり、前記第１アミノ酸配列
    が、ＲＮＡレトロウィルスのｇａｇ遺伝子または昆虫コ
    ピア要素のｇａｇ遺伝子、またはそのいずれかと構造的
    に類似な遺伝子配列によってエンコードされた粒子形成
    配列である粒子の組み立て可能な融合タンパク質であ
    り、 前記粒子が、前記融合タンパク質の多数からなる粒子で
    ある診断試薬。
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