JP2708046B2 - 融合タンパク質および粒子 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗原の提供および精製システムに関する。
本発明は、実施態様において、酵母レトロトランスポゾ
ンTy、粒子形成用遺伝子を含むベクター、粒子タンパク
質および抗原の融合の高度発現用ベクターおよび酵母内
融合タンパク質の産生及び精製方法に関する。 背景技術 新らしい組換えDNA技術の最も重要な応用の１つは、
感染症に対する安全なワクチンの産生および実験上、工
業上および診断目的で生じ得る抗血清に対する特定タン
パク質の合成にある。理論的には、これらの目標は、酵
母サッカロミセス セレビジエ（Saccharomyces cerevi
siae）の如き微小有機体内で適切な抗原を合成すること
によって達成し得る。抗原は、EPA2−0073635号に記載
の如く適切な発現ベクターから発現させられる。 動物またはヒトの免疫システムに対する抗原の正確な
提供は、有効なサブユニットワクチンまたはイムノゲン
（免疫抗原）に対する重要な要求である。提供は、潜在
的なワクチン及び化学的に合成されたエピトープに基づ
くものに対するものと同様に組換えDNAによりなされた
イムノゲンをともなう大きな問題となっている。理想的
なイムノゲンは、高分子量担体に組み立てられた多価抗
原決定基のポリマーである。好適なイムノゲンは、さら
されたエピトープの最大数を有すべきである。これらの
要求は、抗原のキャリヤーへのランダム化学カップリン
グによって達成することは困難である。理想的な状態
は、抗原が大粒子複合体の表面上に正確に配合して存在
することであろう。その上、かかるシステムの微粒子特
性は、簡単な物理的手段による抗原精製を促進するだろ
う。 これらの諸要求は、組換えDNA技術または化学合成法
によるモノマータンパク質の簡単な合成法によって、ま
れに達成されるだろう。 本出願前に、酵母内のイムノゲンを産生する自己集合
微粒子抗原提供システムは、組換えDNA技術（Valenzuel
a et al 1985 Biotechnology 3,323）による抗原（例え
ばヘルペス シンプレックスウイルスＩ（HSV−Ｉ）グ
リコプロテインＤまたはポリオウイルス抗原）のヘパテ
ィティスＢ表面抗原（HBsAg）タンパク質への融合に基
づいていた。融合タンパク質は、凝集して22nmの粒子を
形成する。このシステムは、一連の不利益を有してい
る。 １）収率が極めて低い。 ２）粒子が酵母細胞内で形成せず、抽出プロセスの副生
物である（Hitzeman et al 1983 Nucl.Acids Res.11,27
450）。このことは、産生プロセスに制限を課す。 ３）融合物のなかには粒子を形成しないものがある。 ４）HBsAg成分が、ある場合に、免疫優位性を発揮す
る。即ち、抗体は、優先的にHBsAgに作られる。 ニスカーン等（Kniskern et al in Gene 46 135（198
6））はヘパティティスＢコア抗原（HBcAg）が酵母内で
極めて高いレベルで粒子を形成するが、他のエピトープ
を運搬するその用途に関する報告がまだなされていない
ことを報告している。これらの粒子が、マウスに対して
極めて高い免疫性を有することが報告されているので、
HBsAg粒子の様に免疫優位性を発揮するだろう。 ハインズ等（Haynes et al（Bio/Technology 4 637 1
986））は、細菌における対応システムについて報告し
ている。タバコ モザイク ウイルス（TMV）被覆タン
パク質は、粒子構造を組み立てる実体である。TMV被覆
タンパク質が、イー．コリ（E.Coli）内で発現し、そし
て精製されると、インビトロで該タンパク質を多価粒子
に組み立てることが可能となる。TMV被覆タンパク質お
よび他のタンパク質によってなされた融合タンパク質
は、免疫抗原性であるハイブリッド粒子を産生する。ポ
リオエピトープがサルク（Salk）ワクチンより1/4程度
免疫抗原性が低いけれども、８アミノ酸のポリオエピト
ープが試験され、そして免疫抗原性であることが示され
た。このシステムは、粒子径を実験的に変化でき、混合
粒子（即ち、１タイプのエピトープ以上を運搬する）が
極めて容易に産生できるという潜在的な利益を有する。
しかしながら、予想された不利益は、相対的に小さな抗
原のみがTMV粒子に添加可能である、 ということである。 メロー等（Mellor et al in Nature 313 243（1985））
は、融合タンパク質が、酵母イーストTy転写解読枠ORF1
（TYA遺伝子と指定する）、転写解読枠ORF2（TYB遺伝子
と指定する）およびインターフェロンをコードする核酸
からなる生成物である、ことを開示する。しかしなが
ら、この報文には、産生融合タンパク質または事実どん
なTyタンパク質が組み立てられ粒子となる、またはなる
だろう、という記載も示唆もない。 発明の開示 レトロトランスポゾン類の遺伝物質によって発現され
たある種のタンパク質は粒子への自己組み立て（assemb
ling）能力を有することが見い出された。同様に、かか
るレトロトランスポゾン誘導組み立てタンパク質に基づ
くものであり、かつ、抗原−（または他のバイオ活性分
子）提供粒子へ組み立て得る融合タンパク質を構成する
ことが可能なことも見い出された。更に、類似融合タン
パク質がRNAレトロウイルスからの組み立てタンパク質
に基づいて構成し得ることが見い出された。 第１の態様によれば、本発明は、粒子へ組み立て可能
な融合タンパク質を提供することにあり、ここで該タン
パク質は第１アミノ酸配列およびバイオ活性第２アミノ
酸配列からなり、該第１アミノ酸配列がレトロトラスポ
ゾンまたはRNAレトロウイルスによってエンコードされ
た粒子形成タンパク質と実質的に同一源であり、また第
２アミノ酸配列が30アミノ酸残基以上を含むのであれ
ば、第２アミノ酸配列の最初の30残基は、対応するレト
ロトランスポゾンまたはRNAレトロウイルスによる第１
アミノ酸配列へ自然に直接的に融合したアミノ酸配列を
形成することはない。 第２の態様によれば、本発明は、複数の融合タンパク
質から成る粒子を提供することにあり、ここで各融合タ
ンパク質は第１アミノ酸配列および第２アミノ酸配列か
らなり、該第１アミノ酸配列がレトロトランスポゾンま
たはRNAレトロウイルスによりエンコードされた粒子形
成タンパク質と実質的に同一源であり、該第２アミノ酸
配列がバイオ活性であり、かつ、該レトロトランスポゾ
ンまたはRNAレトロウイルスによる第１アミノ配列に自
然に融合しないものである。 かかる粒子は、一般的には実質的に純粋であり、少な
くとも５％、10％、20％、50％、80％、90％、95％また
は99％（重量）純粋であり、好ましさが増加する。粒子
は複数の異なる融合タンパク質からなる。即ち、該融合
タンパク質は、互いに異なる第２アミノ酸配列を有す
る。2,3またはそれ以上の異なる第２アミノ酸配列が粒
子に存在する。 第１アミノ酸配列は、酵母TyTYA遺伝子、コピア（Cop
ia）生成物および昆虫またはRNAレトロウイルスのgag遺
伝子からのコピア様要素からの生成物である。 レトロウイルスとは、ヒト免疫欠失ウイルスＩとII
（HIV−Ｉ、HIV−II）、SIV、ヒトＴ−細胞リンホトロ
ピックウイルスＩとII（HTLV−Ｉ、HTLV−II）、ネズミ
ルカエミア（Leukaemia）ウイルス、モロネー ネズ
ミ ルカミエア ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、
鳥類のルコシス（Leukosis）ウイルス、ねこのルカエミ
ア ウイルス、ヒトＢ−細胞リンホトロピック ウイル
スおよび牛ルカエミア ウイスルである。上記の如く、
レトロトランスポゾンには、酵母のTy要素、ドロソフィ
リアメラノガスター（Drosphilia melanogaster）が如
き昆虫のコピアおよびコピア様要素、マウスのVL30およ
びマウスのIAP遺伝子が含まれる。 好適なレトロトランスポゾンは、酵母レトロトランス
ポゾンTyである。先に、Tyが60nmウイルス様粒子（Ty−
VLP）の合成に関係することが示されている（Mellor et
al 1985a Nature 318,513）。p1タンパク質がTYA遺伝
子によってエンコードされており、安定であり、そして
更なるプロセスを必要としないことが見い出された。そ
れ故、Tyエンコード化アミノ酸配列は、好ましくはTYA
遺伝子によってエンコードされたp1タンパク質である。
Tyの両クラス（ＩとII）がp1を形成することは公知であ
る（Fulton et al NAR 13（11）1985 4097）。従って、
どちらも使用可能だろう。 Tyエンコード化アミノ酸配列は、p1タンパク質の全体
である必要はなく、代わりに、TYA遺伝子の一部によっ
てエンコードされたp1タンパク質の一部であってよく、
該部分はTyウイルス様粒子（Ty−VLP）合成に関与し得
る。アミノ酸配列の286〜381（第16図）部分が粒子形成
に必要であることが決定された。好ましくは、Tyエンコ
ード化アミノ酸配列は、Ty1−15から誘導可能である。T
YA遺伝子末端における停止コドンは、含まれないことが
好ましい。しかし、含まれれば、融合タンパク質は、停
止コドンがウイルソン等（NAR 14（17）1986 7001）の
記載による枠移動機構によって20回に１回の割合で無視
されるので、低収率ではあるが、発現が続くだろう。 それ故に、なかでも、Tyタンパク質p1、TYA遺伝子生
成物（Dobson et al 1984 EMBO.J3 1115）および第16図
の少なくとも286〜381のアミノ酸配列フラクションを含
む部分がTy−VLP産生に重要であることが示される。 なお、第１アミノ酸配列は、TYA遺伝子配列又はTyウ
ィルス様粒子合成に関与しうるTYA遺伝子配列の一部
が、粒子形成能が損なわれない範囲で、１もしくは数個
のヌクレオチドが欠損、置換もしくは付加された遺伝子
配列によってエンコードされていてもよい。 第２アミノ酸配列（即ち、実施態様において、非Tyタ
ンパク質コード領域）は、公知またはまだこれから説明
すべきもののいずれかのアミノ酸配列である。バイオ活
性は、単一活性（例えば、抗原性）、レセプター結合活
性、治療活性または標的活性（即ち、ホームから特別な
標的へ能力）、または二種またはそれ以上の異種バイオ
活性の組み合せを有する。同様に、異種融合タンパク質
が粒子抗原に組み立てられ、それによって、全粒子が１
以上の活性を有するようになる。 例えば、第２アミノ酸配列は、インターフェロン遺伝
子の如きリンフォカイン遺伝子、またはウイルス、細菌
または他の（例えば、原生動物の）寄生生物の如き、感
染因子の抗原をコードする遺伝子から誘導される。例え
ば、インフルエンザ ウイルス抗原、HIV−ＩまたはHIV
−II（即ち、HTLV−III、LAVまたはAIDS）ウイルス、狂
犬症ウイルス、PMVDウイルス、HBsAg、HBcAg、ポリオウ
イルス、インフルエンザ ウイルス、パラインフルエン
ザ ウイルス、呼吸性シンシチウムウイルス、ライノウ
イルス、コロナウイルス、アデノウイルス、ロタウイル
ス、ノルバルクウイルス（Norwalkviruses）、アルボウ
イルス、例えばデング、ヘルペス シンプレックス、サ
イトメガロウイルス、エプスタイン バール ウイル
ス、麻疹ウイルス、ムスプス ウイルス、ルベラ（Rube
lla）、ウマ インフルエンザ ウイルス、ウマの鼻肺
炎、ブタトランスミッシフル胃腸炎ウイルス、ジステン
バー、パロボウイルス（Parovovirus）、FeLV、ベネズ
エラまたはウエスターン ウマ脳炎、プラスモディウム
トリパノソーマ、住血吸虫、クラミジア トラコーマ
ティス（trachomatis）若しくは髄膜炎菌であり、また
は上記抗原のフラグメント若しくは化学的に合成された
コーディング配列から生じたペプチドであるので生成し
たペプチドは、上記抗原またはフラグメントと実質的に
同一抗原性を有する。 多くのウイルスと細菌抗原のヌクレオチド配列は既知
であり、かかる抗原は、組換えDNA技術で調製し得る。D
NAコーディング配列は、本発明の融合タンパク質の第２
アミノ酸配列コードに使用し得る。例えば、百日咳とマ
ラリアの如き、通常の病気に関連した抗原用のヌクレオ
チド配列は、公知である［百日咳、百日咳菌、WO87/033
01,6月４日1987:Malaria Plasmodium vivaxとP.falcipa
rum,Dame,et al.,Science,225:593,1984;Enea,et al.,S
cience,225:628,1984;Young,et al.,Science,225:958,1
984］。他の一般的な病気に対する抗原ヌクレオチド配
列は公知である ［Hepatitis,EPO 218,474とEPO 020,251: Herpes,EPO 216,1985と日本の61−97630, Rabies,WO87/00179;Chickenpox,EPO 210,931; Polio,WO86/01828と日本の61−47585］。 第２アミノ酸配列の最初の部分はリンカー配列であ
り、その配列は、ある環境において容易に切断される。
第２アミノ酸配列残部は、精製段階において切断され
る。 それ故、本発明の微粒子抗体は、ワクチンの調製に有
効であり、このことは本発明の他の態様を形成する。第
２アミノ酸配列は、このように前記感染因子の１つであ
る抗原のアミノ酸配列をコードする。ワクチンは、微粒
子抗原および無菌生理食塩水または無菌PBSの如き生理
学的に許容可能な非毒性キャリヤーからなる。無菌性
は、非経口投与ワクチンにとっては一般に必須である。
一以上の適切なアジュバントが存在してもよい。好適な
アジュバントには、ムラミル ジペプチド、水酸化アル
ミニウムおよびサポニンが挙げられる。 本発明のワクチンが１以上の抗原を提供することに注
目すべきである。異種微粒子抗原のカクテルかまたは１
以上のエピトープを有する微粒子抗原の均質集団（例え
ば、異なるハイブリッドタンパンク質の混合物を凝集さ
せ、または１以上の微粒子抗原を小細胞に発現させるこ
とによって調製されたものである）が使用される。また
は、ワクチンは、これら種類の微粒子抗原混合物を含有
することも可能であった。 他の態様において、本発明は、第１ヌクレオチド配列
と第２ヌクレオチド配列から成る核酸を提供することに
あり、ここで第１ヌクレオチド配列は、粒子形成タンパ
ク質をエンコードするレトロトランスポゾンまたはRNA
レトロウイルスの遺伝子物質と実質的に同一源かまたは
相補的であり、第２ヌクレオチド配列は、他のバイオ活
性アミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列をエ
ンコードするかまたは相補的であり、そして該核酸は、
前記レトロトランスポゾンまたはRNAレトロウイルスに
よって自然に産生されることのない融合タンパク質を形
成するように単位解読枠として発現し得、そして融合タ
ンパク質が粒子となる。 核酸がスプライシングまたは終了阻害なしで発現し得
ることは、一般的な場合である。枠移動は、一般には生
じないだろう。 本発明のある実施態様において、TYA融合遺伝子を産
生するためのいずれの非Tyタンパク質コーディング配列
に融合し得るTYA遺伝子誘導体を提供できる。TYA融合遺
伝子は、ハイブリッド Ty−VLPに組み立てられる融合
タンパク質を産生する。ハイブリッド Ty−VLPは、高
収率で産生し得、かつ簡単な物理手段によって生成可能
な高分子量微粒子抗原（または他の粒子の）提供システ
ムを構成する。 更に本発明によれば、前に定義した核酸を含む発現ベ
クターが提供される。例えば、TYA遺伝子誘導体を含
み、そして酵母内においてハイブリッドTy−VLPの高度
産生に関するpMA5620がある。 本発明の発現ベクターは、通常、プロモーターを含有
する。PGKは好適なプロモーターであるが、他のプロモ
ーターも必要により使用可能であり、また好ましい。例
えば、GAPD、GAL1−10、PHO5、ADH1、CYC1、Tyデルタ配
列、PYKおよび１以上のこれらのプロモーター成分から
作られたハイブリッドプロモーターまたは他のプロモー
ターを挙げることができる。 同様に、本発明はホスト細胞、例えはイー．コリ（E.
coli）の如き細菌細胞、サッカロミセス セレビジエ
（Sacharomyces Cerevisiae）如き酵母、またはチャイ
ニーズハムスターオリバー細胞（CHO）またはハイブリ
ッド粒子の産生に関する前記発現をベクターを含有する
COS細胞の如き動物細胞を挙げられる。 微粒子抗原の多価特性のため、従来の抗原より容易に
抗体を産生し、かつ該抗体は、特異な性質を有しやす
い。さらに本発明は、抗原性である本発明の粒子に対し
て生ずる抗体を提供する。抗体は、本発明のハイブリド
ーマ細胞により産生されたポリクローナル（例えば、抗
体をラビットに注射して得られたもの）またはモノクロ
ーナル抗体である。微粒子抗原の多価特性のため、イン
ビトロ免疫法は、抗原の他の形態をするものよりも達成
しやすい。すなわち、このことは、ヒトモノクローナル
抗体の産生を促進する。ハイブリドーマ細胞は、免疫化
動物の脾臓細胞と腫瘍細胞を融合して調製し得る。その
後、好適に分泌ハイブリドーマ細胞が選択される（Koeh
lerとMilstein Nature 1976 296 495）。 同様に、本発明は、好適なバイオ活性ペプチド精製技
術を提供する。本発明の態様は、例えば濾過または遠心
分離によって会合不純物から粒子を一般に相対的容易に
分離できるという事実に基づいている。それ故に、実質
的に純粋なバイオ活性ペプチド産生方法が与えられる
が、該方法は前記の如く会合不純物から粒子を分離し、
その後、粒子の融合タンパク質からバイオ活性ペプチド
を切断する方法である。 本発明の融合タンパク質および微粒子抗原は、診断薬
として有効である。診断目的の微粒子抗原は、遠心分離
または濾過によって物理的に分離でき、かつガラス、プ
ラスチックスライド、ディップ スティック、マクロま
たはミクロビース、試験管、微小力価ウエル等の固形支
持体上に直接分散し得るために、特に有効である。本発
明の微粒子抗原は、吸着剤ディスク（米国特許第4,632,
901号）、ストリップの如き繊維状または吸水性材料、
または固形支持体としてのクロマトグラフィーカラムに
も分散し得る。粒子と融合タンパク質は、容易に固形支
持物に付着する。粒子は、精製後融合タンパク質へ破裂
させられ、該融合タンパク質は、前記の如く表面分散し
得る。試薬は、多くの診断試験に有効である。例えば、
微粒子抗原に対する抗体を有すると思われる試験サンプ
ルおよびケイ光、酵素または放射性標識抗体は、固形支
持体上の微粒子抗原または融合タンパク質と競争的に反
応する、そして固形支持体上の微粒子抗原と結合する標
識化抗体の量、同様に、本発明の微粒子抗原は、抗原と
の凝集反応に有効である。診断分野の当業者は、本発明
の微粒子抗原および融合タンパク質の診断用途に対する
多くの応用例を認めるだろう。 本発明は、添付図面を引用して、次の実施例によって
説明される。 第１図は、プラスミドpMA91−11で形質転換したMD40
−4cから精製したTyウィルス様粒子（Ty−VLP）の写真
である。 第２図は、pMA5620とpMA5620−８の構造を示す概略図
である。 第３図は、本発明の実施例の主要成分の拡大図および
主要結合部のヌクレオチドの配列を有するプラスミドpM
A5620−８の概要図である。 第４図は、pAMA91−11,pMA91とpMA5620−８を含有す
るMD40−4cから粒子とタンパク質のスクロースグラジェ
ント分離のフラクションのSDSポリアクリルアミドゲル
分析の写真である。 第５図は、pMA5620−８を含有するMD40−4cから精製
したハイブリッドTy:IFN−VLPの写真である。 第６図は、pMA5620−８を含有するMD40−4cの抽出物
からのスクロースグラジェントフラクションのウエスタ
ーンブロットの写真である。 ａ）は抗Ty−VLP抗体を使用する結果を示す。 ｂ）は抗インターフェロン抗体を使用する結果を示す。 第７図は、精製ハイブリッドTy:IFN−VLP製剤 （１）、pMA5620−８で形質転換したMD40−4cの全抽出
物（２）と非形質転換MD40−4c（３）内のタンパク質ク
ーマシー染色SDSポリアクリルアミドゲル分析の写真で
ある。 第８図は、抗Ty−VLP担体（ｂ）、抗ハイブリッドTy:
IFN−VLP抗体（ｄ）および対応するプレブリード（Preb
leed）血清（ａ＋ｃ）を使用するウェスターンブロット
の写真である。各々は、pMA91（１）pMA91−１（２）を
含有するMD40−4cの全抽出物に対して使用される。プラ
スミドpMA91−１は、IFN−アルファ２の合成を誘導す
る。pMA91は、負の対照例であり、インターフェロンを
産生しない。 第９図は、HAコドン25−111含有262bp SpeI:SpeIフ
ラグメントのヌクレオチド配列を示す図である。実施例
５を参照のこと。 第10図は、プラスミドpMA5620−ha23を示す図であ
る。 第11図は、pMA5620またはpMA5620−ha23で形質転換し
たMD40−4c抽出物のスクロースグラジェント フラクシ
ョンのSDS−PAGE分析結果を示す図である。タンパク質
は、クーマシブルー染色されている。 第12図は、精製Ty:HA−VLPsの電顕写真である。 第13図は、pMA−5620−ha23で形質転換したMD40−4c
抽出物のスクロース グラジェント フラクションから
のタンパク質のウエスターンブロット図である。ブロッ
トは、抗Ty−VLP抗体と抗全インフルエンザウイルス抗
体でプローブされた。 第14図は、精製Ty:HA−VLP、全インフルエンザウイル
スNT60（H3）および左から右へ、正常“プレーブレッド
（pre−bled）”ラビット血清、抗Ty−VLP抗血清正常
“プレーブレッド”ラビット血清、抗Ty:HA−VLP抗血清
および抗全インフルエンザウイルス血清でプローブした
全インフルエンザウイルスPR8のウエスターンブロット
図を示す。 第15図は、PM5620からpMA5620−358を調製する方法を
示す図である。pMA5620−358は、TYAの最初の280コドン
を含有する。 第16図は、少なくとも粒子形成に必須なタンパク質の
286〜381セグメントを含むTYA1〜381アミノ酸のDNAおよ
びアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸の記号は、次
のようである。 ア ミ ノ 酸 記 号 アラニン Ａ アルギニン Ｒ アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ Asnおよび／またはAsp Ｂ システイン Ｃ グルタミン Ｑ グルタミン酸 Ｅ Glnおよび／またはGlu Ｚ グリシン Ｇ ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ ロイシン Ｌ リシン Ｋ メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ プロリン Ｐ セリン Ｓ トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ チロシン Ｙ バリン Ｖ 実施例１ 使用した菌株は、イー．コリ（E.Coli）AKEC28（c60
0,thr C,thyA,trp C1117,hsd RK.Hsd K9）とエス．セレ
ビシエ（S.cerevisiae）MD40−4c（urd 2,trp l,leu 2
−3,leu 2−112,his 3−11,his 3−15）であった。イ
ー．コリー（E.Coli）媒体は、ミラー（Miller 1972 Ex
periments in Molecular Genetics,CSH p433）の方法
で、そして酵母媒体は、ホーソーンとモーティマー（Ha
wthorne and Mortimer 1960 Genetics 45,1085）の方法
で調製した。イー．コリー（E.Coli）を標準的な方法
（Maniatis et al.1982 Molecular Cloning−A Laborat
ory Manual,CSH p199）で形質転換した。酵母を、ヒン
ネン等（Hinnen et al.1978 Proc.Natl.Acad.Sci 75,19
29）の記載方法の如く形質転換した。 制限消化およびプラスミド構成用の標準的な方法を使
用した（Maniatis et al.1982,op.cit.）。制限酵素とT
4 DNAリガーゼは、供給者の指示どうりに使用した。Ba
1 31 エキソヌクレアーゼ消化は、ドブソン等の記述
に沿って実施した（Dobson et al.1982 Nucl.Acids Re
s.10,5463）。欠失終了点は、DNA配列化によって決定さ
れた（Sanger et al.1977 Proc.Natl.Acad.Sci.74,546
3）BamH I合成オリゴヌクレオチドリンカーは、ファー
マシアから得た。 プラスミドDNAをチノルトとカーボン（Chinault and
Carbon 1979 Gene 5,111）およびホルメスとクウイグレ
イによる急速分析（Holmes and Quigley 1981 Anal.Bio
chem.114,193）に記載の如く、予めイー．コリー（E.Co
li）から単離した。 Ty−VLPを次のように精製した。すなわち、酵母細胞
を、30℃において８×106細胞/mlの密度に選択的に成長
させた。その後、細胞を低速遠心分離で集め、氷冷水で
１度洗浄し、そして１当り1mlの細胞でTENバッファー
（10mM.Tris.pH7.4;2mM EDTA;140mM Nacl）に再懸濁さ
せた。細胞を、＞70％破壊するまで４℃においてガラス
ビーズ（40メッシュ;BDH）で撹拌して破壊した。ビーズ
を低速遠心分離で小球化し、その後上澄を集め、破片を
ミクロフュージ中で20分間遠心分離にかけて除いた。Ty
−VLPを４℃において100,000gで１時間遠心分離し、そ
して１夜TENバッファー中で再懸濁させて、上澄液から
ペレット化した。再懸濁Ty−VLPを、上澄液を10mM Tri
s,pH7.4;10nM Nacl中の15−45％（w/v）スクロースグ
ラジェントに導入し、そして15℃において76,300gで３
時間スピンする前に、４℃において15分間ミクロフュー
ジ中で遠心分離にかけて細胞破片を除いた。フラクショ
ンを試験管の底から回収し、ピークフラクションを、ア
リコートのフラクションをSDS−PAGEゲルおよびクーマ
シーブル−染色法で試験し同定した。VLPを、４℃にお
いて100,000gで１時間ピークフラクションを遠心分離す
ることによって、濃縮した。 全酵母細胞のタンパク質抽出物を、前記の如く調製し
た（Mellor et al 1983 Gene 24.1）。ゲル工程は、ラ
エムリの方法であった（Laemmll 1970 Nature 227,6
8）。タンパク質濃度は、バイオーラド ラボラトリー
ズから得た染料結合アッセイ法（Bradford 1976 Anal.B
iochem.72,248）を用いて測定した。 ポリクローナル馬抗インターフェロン（IFN）アルフ
ァ抗体は、ベーリンガー マンハイムから購入した。抗
Ty−VLP抗血清は、標準的な方法でラビットから調製し
た。 ウエスターン ブロッティング法は、タウビン等の記
載の方法に従って実施した（Towbin et al.1979 Proc.N
atl.Acad.Sci 76.4350）。結合抗体を、西洋わさび（ho
rse radish）パーオキシダーゼに共役したラビット抗−
ホース（horsc）第２抗体（Miles Scientific）かまた
はラビット中に生じたパーオキシダーゼ抗パーオキシダ
ーゼ（PAP）複合体に附随するヤギ抗ラビット第２抗体
（シグマ）のいずれかによって検出した。酵素反応は、
デ ブラスとチェルビンスキーの記載の方法（De Blas
and Cherwinski 1983 Anal.Biochem.133,214）の如く展
開した。 プラスミドpMA91−11は、以前に記載している（Dodso
n et al 1984 EMBO.J.3,1115）。そのプラスミドは、高
効率発現ベクターpMA91に挿入されたTy要素、Ty1−15、
の主要転写単位である最初の1450ヌクレオチドを含んで
いる（Mellor et al.1983 op.cit:Kingsman and Kingsm
an 1985 Biotech.and Genet.Eng.Rev.3,377）。Ty成分
は、ドブソン等［Dobson et al.（op. cit）］等の記載
の如く、pKT40bから誘導された。pKT40bは、イギリス国
アバディーンのNCIBに寄託し、アクセッョンナンバーNC
IB12427を受けた。次に、発現ベクターpMA91は、イー．
コリー（E.Coli）内で複製と選択を許容するプラスミド
pBR32配列、酵母内で効率的な自立複製を許容する複製
の酵母２ミクロンプラスミド源、酵母leu2とE.coli le
uB突然変異体の両者中の選択的マーカーとしての酵母LE
U2遺伝子、および酵母転写終結用の全信号を含むPGKの
３′領域から1500〜１の酵母PGK遺伝子の上流非コーデ
ィング領域を分離するBg/II発現部位から成る。プラス
ミドpMA91は、米国特許4615974号の第15図にpMA3013と
指定されたプラスミドがプラスミドpMA91として公知で
あるが、該米国特許に記載されている。米国特許461597
4号の第１図の下部に示されたプラスミドは、それ故
に、改名されている。 従って、Ty発現は、高効率酵母ホスホグリセレートキ
ナーゼ遺伝子（PGK）のプロモータおよびTYA遺伝子のp1
タンパク質、第１翻訳生成物のpMA91−11過多生産にお
ける大きなかたまりを含む菌株の酵母抽出物から誘導さ
れる（Dobson et al.,1984 op.cit;Mellor et al.1985
a.op.cit）。pMA91−11含有酵母形質転換体の抽出物は
大量にTy−VLPを含むことが示される（第１図）。それ
故に、TYA単独でTy−VLP形成に関する十分な情報を含
み、そしてpMA91−11含有MD40−4cの抽出物中に発見さ
れたp1タンパク質が粒子に組み立てられる（第１図と第
４図）。この情報は、本発明の基礎を提供する。 プラスミドベクターpMA5620の構成、即ちハイブリッ
ドTy−VLP粒子の合成に関するものは、第２図に図示さ
れている。このことは、ベクター構成がTYA遺伝子内に
便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を要求しているの
で、いかなるコーディング配列も該部位に挿入し、TYA
ハイブリッド遺伝子を産生し得る。しかしながら、かか
るハイブリッド内にTy−VLPの合成に関する十分なTYAコ
ーディング配列が存在することが必須である。プラスミ
ドpMA91−11は、Bg1 IIで切断され、多くの時間Ba1 31
エキソヌクレアーゼで消化され、そして過剰のBamH Iリ
ンカー（CCGGATCCGG）の存在下で再リゲートされた。生
成したプラスミドの欠失終了点は、DNA配列化によって
決定された。プラスミドpMA91−357は、265bpが除去さ
れた欠失誘導体である。このことは、BamH Iリンカー
を、TYAをコドン381を越えてヌクレオチド上に配置する
（第３図）。 すべての三つの解読枠の転写終了配列および翻訳停止
コドンの両者を提供するために、pMA91−357の欠失PGK
3′終止配列をプラスミドpDT86から単離した287 bp B
amH I−Sa1I DNAフラグメントで置換した。このDNAフ
ラグメントは、BamH I部位下流における全ての三つの解
読枠に翻訳停止コドンを含む酵母PGK遺伝子からの、修
飾３′転写終止フラグメントである（第２図と第３
図）。この終止フラグメントは、PGKコーディング配列
の最終センス コドンにリンクしたBamH Iリンカー（CC
GGATCCGG）で開始し、そしてPGKコーディング配列を越
えてHind III部位279ヌクレオチドに拡大する（Hitzema
n et al.1982 Nucl.Acids Res.10,7791）。これらの構
成において、Hind III部位は、合成リンカーを用いてSa
1Iに変更されている。終止フラグメントは、臨界的では
なく、そして酵母転写終止を付随するすべての三つの解
読枠の終止コドンを含むフラグメントは十分であろう。
生成したプラスミドpMA5620は、ハイブリッドTy−VLPへ
組み立てられるハイブリッドタンパク質を産生するため
に好適な配列が挿入される唯一のBamH I部位を含んでい
る。 pMA5620を試験するために、インターフェロン−アル
ファ２（IFN） cDNAがモデル抗原コーディング配列と
して使用された。540bp BamH I IFN−アルファ２ cD
NA フラグメント、すなわちフラグメント８と指定され
ている（Mellor al 1985b Gene 33,215）ものをプラス
ミドpMA5620の唯一のBamH I部位に挿入した。生成した
プラスミドは、pMA5620−８（第２図と第３図）と指定
された。 VLPは、プラスミドpMA5620−８で形質転換された酵母
菌株MD40−4cから調製され、そして15−45％スクロース
グラジェントからのフラクションは、SDS−PAGEゲルで
試験された。グラジェント中のタンパク質は、クーマシ
ーブルー染色法で目視化された（第４図）。予想70kd
TYA−IFN融合タンパク質のグラジェント中の位置は、最
終的にタンパク質の微粒子特性を示した。フラクション
の電子顕微鏡写真は、微粒子が存在すること確認した
（第５図）。70kd微粒子タンパク質が事実、Ty（50k
d）:IFN（20kd）であることを立証するために、スクロ
ースグラジェントからの融合タンパク質フラクションを
再度SDS−PAGEゲルで試験し、そて分離したタンパク質
をニトロセルロースフィルターに移した。１つのフィル
ターは、Tyタンパク質との反応が公知であるTy−VLP抗
体でプローブし、そして他のものは、抗IFN−アルファ
抗体でプローブした（第６図）。両者において、強く反
応した70kdタンパク質は、このタンパク質がTyとIFNエ
ピトープの両者を含むことを示した。 ハイブリッドTy:IFN−VLP生成方法の効率は、第７図
で示される。70kdハイブリッドタンパク質は、製剤にお
いて非常に重要な種である。 モデル抗体に対する免疫応答性を引き出すこれらのハ
イブリッドTy:IFN−VLP効能を試験するために、ラビッ
ト内の抗血清が、pMA5620−８で形質転換された酵母抽
出物から精製された濃縮ハイブリッドTy:IFN−VLPに対
して提案させた。IFN−アルファ２を過剰生産するプラ
スミドpMA91−１で形質転換したMD40−4c抽出物（Mello
w et al.1985b op.cit.）をSDS−PAGEゲルで分析し、そ
れに沿ってインターフェロンを産生しないpMA91で形質
転換したMD40−4cを抽出物も上記の如く行なった。分離
したタンパク質をニトロセルロースに移し、Ty−VLP抗
血清かまたはTy:INF−VLP抗血清のいずれかでプローブ
した（第８図）。両抗血清が抽出物中に存在するTyタン
パク質と反応するけれども、抗ハイブリッドTy:INF−VL
P抗血清がプラスミドpMA91−１を含有する抽出物中の20
kdIFNタンパク質と反応した。 これらのデータは、次のことを示す。１）pMA5620−
８は、Tyタンパク質p1の最初の381個のアミノ酸と非Ty
タンパク質とからなるハイブリッド融合タンパク質の合
成を誘導する。この場合、インターフェロンアルファ２
である。２）この融合タンパク質は、ハイブリッドTy:I
FN−VLPを形成する。３）ハイブリッドTy:IFN−VLPは、
容易に単離し得る。４）ハイブリッドTy:IFN−VLPは、
ラビット免疫システムに対してモデル抗原、インターフ
ェロン−アルファ２を提出する。それ故、pMA5620がハ
イブリッドTy−VLPの合成を誘導するものであり、そし
てかかる粒子中に存在するいかなる抗原も哺乳動物の免
疫システム、例えばラット、ハムスター、犬、猫、ウ
シ、羊、ブタおよびヒトに提供することが理にかなって
いる。明らかに、ここで実施例として使用したインター
フェロンcDNAは、完全なタンパク質またはタンパク質の
部分をエンコードする他のDNA片で置換できた。 この抗原提供システムの微粒子特性およびそのための
ハイブリッドTy−VLP精製の容易さは、本発明を、規定
された抗原に対する抗体産生刺激手段として、新規ワク
チンの生産手段として、モノクローナル抗体産生用に規
定された抗原調製用の手段として、診断アッセイ法用抗
原の調製手段として有効にする。 それ故、ハイブリッドTy:IFN−VLPは、抗IFN抗体（モ
ノクローナルまたはポリクローナルのいずれかである
が、好ましくはモノクローナルである）を高めるために
使用される、ここで該抗体はその後IFN精製に使用され
る。 実施例２ ドロソフィリア メラノガスター（Drosophilia mela
no gaster）のコピア要素は、遺伝子およびウイルス様
粒子形成の両者における酵母のTy要素に極めて類似する
（Mount＆Pubin 1985 Mol.Cell.Biol.５1630）。TYAに
等価なコピア領域は、レトロウイルス機構の類似によっ
てgagと称される。それ故、昆虫細胞発現システムのコ
ピア要素のgag領域における高度な発現は、Ty−VLPs類
似粒子に組み立てられるタンパク質を導くことが見い出
される。gagが他のタンパク質のコーディング配列と融
合するならば、生成融合タンパク質も同様に前記Ty:IFN
ハイブリッド粒子類似ハイブリッドコピア粒子に組み立
てられることも見い出される。 抗原提供としてのコピア粒子および精製システムを確
立するために、プラスミドpPW220からのgag（Potter＆B
rosein 1979 Cell 17 415）は、プラスミドpAc373−gag
を産生するためにpAc373（Smith et al 1983 J.Virol.4
6,584）の如き代表的な高効率バキュロウィルス（Bacul
ovirus）発現ベクターに挿入する標準的な組換えDNA方
法で処理される。発現は、ポリヘドリンプロモーターに
よって行われる。その後、インターフェロンcDNAは、枠
のgagの３′端に挿入され、プラスミドpAc373−gag−IF
Nを産生する。このプラスミドは、直接的にpMA5620−８
に類似する（実施例１を参照のこと）。pAc373−gag−I
FNは、その後スポドプテラ フルギペルダ（Spodoptera
frugi perda）細胞内においてインビボ組換えによって
バキュロウイルス（Baculovirus）、オートグラファ
カルフォニカ ニュクリア ポリヘドロシス（Autograp
ha californica nuclear polyhedrosis）（AcNPV）に導
入される（Smith et al 1983 Mol.Cell.Biol.4 215
6）。組換えウィルスは、閉鎖マイナスプラークから収
穫し、新鮮なエス．フルギペルダ（S.frugiperda）細胞
を再感染するために使用される。ハイブリッドコピア:I
FN粒子を感染後72〜96時間で収穫し、スクロース グラ
ジェントで分留してバキュロウイルス不純物から分離し
た。粒子は、電子顕微鏡及びTy−IFNハイブリッド粒子
の項で記載のウエスターンブロッティング法によって同
定した（実施例１を参照のこと）。 実施例３ ドロソフィラ（Drosophila）ADH遺伝子プロモーター
により発現したgag IFN融合物を含有する組換えプラス
ミド（Benyajati et al.1983 Cell 33 125）が簡単なD
NA仲介トランスフェクションによって昆虫細胞に導入さ
れる（例えばドロソフィラ シュナイダー２細胞）こと
を除いて、実施例２の一般的な方法に従った。 実施例４ 酵母Ty要素のTYA遺伝子は、鳥類及び哺乳類のレトロ
ウィルスのgag遺伝子にまさに類似している。TYA生成物
だけが粒子形成が可能であるので、gagタンパク質が同
一なことを行ない、それ故に、抗原提供および精製シス
テムの基礎として作用するだろう。 抗原精製および提供システムとしてのレトロウイルス
性gagタンパク質を立証するために、HIV−Ｉからのgag
遺伝子は、標準的な組換えDNA方法で処理されて酵母発
現ベクターpMA91及び哺乳類発現ベクターpSV2に導入さ
れる（Southern and Berg 1982J.Mol.Appl.Genet.1 32
7）、ここで該ベクターはpAM91−HIVgagおよびpSV25−H
IVgagをそれぞれ産生するために哺乳類のdhfrcDNAを含
有する。その後インターフェロンcDNAは、枠内のそれぞ
れの分子のgag 3end端に導入されて、pM91−HIVgag−I
FNとpSV25−HIVgag−IFNをそれぞれ産生する。これらの
分子は、pMA5620−８に類似する（実施例１を参照のこ
と）。その後、pMA91−HIVgag−INFは、酵母菌株MD40−
4cを形質転換するために使用され、pSV25−HIVgag−INF
は、CHO−dhfr細胞をトランスフェクト（transfect）す
るために使用される。安定な形質転換体が増殖させら
れ、細胞抽出物が調製され、かつスクロースグラジェン
トで分留される。ハイブリッドHIVgag:INFは、Ty:INFハ
イブリッド粒子の項で記載の如く、電子顕微鏡及びウエ
スターンブロッティング法により同定される（実施例１
を参照のこと）。 実施例５ pSV25−HIVgag−INFがCOS細胞に導入され（Gluzman e
t al.1977 J.Virol.24 534）、かつハイブリッド粒子が
トランスフェクション後３〜９日で収穫された以外は、
実施例４の方法に従った。 実施例６ この実験において、一部のインフルエンザ血球凝集素
（HA）含有ハイブリッドTy−VLPを産生し得、かつこれ
らのハイブリッドTy:HA−VLPがラビット中で抗HA抗体形
成を誘導することを示す。 これらの実験方法は、実施例１に記載のハイブリッド
Ty:IFN−VLPの産生と分析に関するものと、本質的には
同じである。MRC12/80抗全インフルエンザウイルス抗体
は、英国、ミルヒル、NIMRの世界インフルエンザセンタ
ーから得られ、インフルエンザウィルス菌株A/スコット
ランド/840/74×A/PR/8/34（H3N2）に対して提案され
た。インフルエンザウィルスA/メンフィス/102/72（H3N
2）のHA1ドメインのコドン25−111に対応するHAコーデ
ィング配列領域は、ウィルソン等のデータ（Wilson 198
4 Cell 37,767）に基づいてハイブリッドTy:HA−VLP形
成用に選択された。コドン25−111に対応する262bp Sp
eI;SpeI（第９図）は、プラスミドMX29の適切な消化で
精製された。MX29は、Pst I部位につづくインフルエン
ザウィルス菌株A/メンフィス/102/72G:cから、HA RNA
から誘導されたH3 HA cDNAを有するプラスミドpAT153
である（Twigg and Sherratt,1980 Nature 283,216）.S
peI:SpeIフラグメントの粘着性端をDNAポリメラーゼＩ
を使用して仕上げ、その後、該フラグメントをプラスミ
ドpSP46のHinc II部位にリゲートし（blunt−end ligat
e）てpSP46−ha23を産生した。pSP46は、pSP64のHind I
II部位がBg1 II部位に転換されているpSP46（プロメガ
バイオテック）の誘導体である。ha23と指定されたBamH
I;Ba1 IIフラグメントは、pSP46−ha23から精製され
た。ha23は、262bpで埋められたSpeI;SpeIフラグメント
を含有する。その後、ha23は、pMA5620のBamH I部位に
挿入されてpMA5620−ha23を産生する（第10図）。この
プラスミドは、酵母菌株MD40−4cを、ロイシンインディ
ペンデェンスに形質転換するために使用された。 VLPを、pMA5260−ha23またはpMA5620で形質転換した
酵母MD40−4cから調製し、15〜45％スクロースグラジェ
ントで分留した。フラクションをSDS−PAGEゲルで試験
し、タンパク質をクマーシーブルー染色法で目視化した
（第11図）。予想TYA−HA融合タンパク質のグラジェン
ト中の位置は、タンパク質の微粒子特性を示した。フラ
クション電子顕微鏡で粒子の存在が確認された（第12
図）。 粒子がHA抗原を含有することを確認するために、類似
グラジェントからpMA5620−ha23を有するMD40−4cの分
留抽出物を再度SDS−PAGEゲルで試験し、その分離タン
パク質をニトロセルロースフィルターへ電子ブロット
（electroblot）した。１つのフィルターをTyタンパク
質との反応が公知の抗Ty−VLP抗体でプローブし、他の
ものを抗HA抗体でプローブした。両者において、反応し
た推定Ty:HA融合タンパク質は、このタンパク質がTyとH
Aエピトープの両者を含むことを強く示した（第13
図）。 HAへの免疫応答性を引き出すハイブリッドTy:HA−VLP
の効能をテストするために、pMA5620−ha23で形質転換
したMD40−4c抽出物から精製した濃縮ハイブリッドTy−
HA−VLPに対してラビットにおいて抗血清が提案され
た。この抗血清は、その後、ウェスターンブロッティン
グ法によって、全インフルエンザウィルスから破壊され
たタンパク質をプローブするために使用された。３タン
パク質サンプルが使用された。第１のものは、抗血清を
高めるために使用される精製Ty:HA−VLPであった。第２
のものは、全インフルエンザウィルスPR8（H3）であっ
た。第３のものは、全インフルエンザウィルスNT60（H
1）であった。PR8とNT60の両者は、英国オックスフォー
ド パソロジーのサーウィリアム ダン スクールのジ
ョージ ブラウンリー（Geroge Brownlee）から得た。
第14図は、抗Ty:HA−VLP抗体がH3HAのHA1領域は反応す
るが、H1HAとは反応しないことを示す。かかる反応は、
プレブレッド血清で観察されるが抗Ty−VLP抗体では観
察されない。正の対照として、同一サンプルが抗全ウィ
ルス抗体でプローブされた。この場合に、H1HAのH3HAの
両方が抗血清と反応した。ハイブリッドTy:HA−VLPがH3
抗原エピトーブに特異な抗HA抗体産生を誘導する。 これらのデータは、pMA5620−ha23がTyタンパク質p1
の最初の381アミノ酸およびウィルス性タンパク質の小
領域、インフルエンザウィルスHAから成るハイブリッド
融合タンパク質の合成を誘導することを示す。この融合
タンパク質は、ハイブリッドTy:HA−VLPを形成する。ハ
イブリッドTy:HA−VLPは容易に単離され、かつ、かかる
方法でラビット免疫システムにHA成分を提供するので抗
HA抗体が産生される。これらの抗体は、ウエスターンプ
ロット法においてH1HAとH3HAとを区別し得る。明らか
に、ハイブリッドTy:HA−VLPのHA成分は、他のインフル
エンザウィルス成分はまたは他のウィルス成分で置換し
得、かつ類似結果が得られることが予想できる。 実施例７ ３′端において累進的により少ない配列を含む一連の
切断TYA遺伝子を得るために、標準的なBa131消化は、出
発分子としてpMA5620を使用して行なわれた。プラスミ
ドpMA5620は、BamH Iで切断され、種々の時間Ba131で消
化され、そして過剰のBamH Iリンカー（CCGGATCCGG）存
在下で再リゲートされた。精製プラスミドの欠失端終了
点は、DNA配列化で決定された。これらの欠失の１つ
は、TYAの最初の286コドンだけを含み、358と指定され
た。358の欠失PGKターミネータ配列は、pMA5620からの
大きなPvu II−BamH Iフラグメントを358からの680bpPv
u II−BamH Iフラグメントでリゲートすることによって
置換された。生成したプラスミドは、pMA5620−358と指
定された（第15図）。 ２つの若干異なる３′ターミネータ（termini）を有
するインターフェロンアルファ2cDNA BamH Iフラグメ
ント（IFN−８とIFN−2;Mellor et al.1985 Gene 33,21
5;Mellor et al.1985 Nature 313,243）を、枠内の、pM
A5620とpMA5620−3580のBamH I部位に挿入してプラスミ
ドpMA5620−８とpMA5620−358−２を産生した。 プラスミド pMA91−11、pMA5620およびpMA5620−358
を、酵母菌株MD40−4cをロイシン インディペンスに形
質転換するため使用した。生成形質転換体は、抗Ty−VL
P抗体を使用するウェスターンブロッティング法で決定
したように、プラスミドから生産されたTYA RNAおよび
p1または切断p1タンパク質の量に匹敵する。RNAおよび
タンパク質の量は、各形質転換体において同じであっ
た。 各形質転換体からの抽出物は、その後、15〜40％スク
ロースグラジェントで分留され、それに続くpMA91−11
とpMA5620の両方に対するクマーシーブルー染色法によ
って分析された。微粒子構造の特徴であるグラジェント
領域にp1または切断p1タンパク質がある。しかしなが
ら、pMA5620−358の場合に、微粒子物質は観察されな
い。 インターフェロン アルファー２ cDNAを枠内、プラ
スミドpMA5620およびpMA5620−358の各々に融合してプ
ラスミドpMA5620−８およびpMA5620−358−２を産生し
た。これらのプラスミドは、酵母菌株MD40−4cをロイシ
ン インデペンダントに形質転換するために使用され、
そしてTy同一源RNAとp1およびp1:インターフェロン融合
タンパク質は前記の如く測定された。RNAとタンパク質
のレベルは、形質転換体の両方と同じであり、かつ、pM
A5620とも同じである。pMA5620−８を14〜45％スクロー
ルグラジェントで分析した。70KDp1:インターフェロン
融合タンパク質は、微粒子構造のグラジェント特性領域
中で観察された。しかしながら、pMA5620−358−２の含
有抽出物が分析されたときに、微粒子物質が観察されな
かった。 このように、Ty−VLP形成には、少なくともアミノ酸2
86〜381間の配列部分が要求される。p1のDNAとアミノ酸
配列は、アミノ酸286〜381のDNAのアミノ酸配列をも示
す（第16図）。 実施例８ VLP抗原を用いる酵素イムノアッセイ法 96ウエル微小力価プレートを、各ウエルを室温で２時
間、50mM炭酸ナトリウムバッファー中の20μg/mlのVL
P、pH9.5、の50μでインキュベートしてVLP抗原（抗
原を有するウイルス様粒子）で被覆した。過剰のVLP抗
原を、リン酸緩衝液（PBS）、pH7.4、で３分間及び５分
間の洗浄でウエルから除去した。バックグランド反応を
最小にするために、ウエルを室温で、１時間PBS中の２
％カゼイン100μで保護し、その後0.1％Tween−20（P
BS−Ｔ）含有PBSで３分間及び５分間の洗浄した。試験
サンプル中の第１抗体を、0.5％カゼイン含有PBS−Ｔ
（PBS−CT）中で好適に希釈する。好適な希釈液は、1/1
0〜1/7.290の３倍希釈系である。第１抗体は、ハイブリ
ッドTy−VLPの非Ty成分に反応性を有する。50μの第
１抗体を適切なウエルに加え、室温で２時間インキュベ
ートした。過剰の第１抗体をPBS−Ｔで３分間および５
分間洗浄して除去する。第２抗体は、ホースラディッシ
ュパーオキシダーゼ標識化抗種IgGであり、PBS−CT中で
1/1500に希釈された。50μの希釈第２抗体を各ウエル
に加え、室温で２時間インキュベートし、その後PBS−
Ｔで５分間および５分間洗浄した。基質は3,3′,5,5′
−テトラメチルベンジリデンであり、0.1M酢酸ナトリウ
ム中で0.1mg/ml濃度であり、0.5Mクエン酸及び0.03％ハ
イドロジェン パーオキサイドでpH6.0に調節されてい
る。50μの基質を各ウエルに加え、カラー反応を10分
間行なった。反応は、0.5M硫酸25μを各ウエルに加え
て決定される。カラー反応は、微小リーダーを用いて45
0nmにおいて測定して評価される。この方法で、試験サ
ンプル中の第１抗体の直接アッセイ法が実施される。 実施例９ ハイブリッドTY−VLPからの外因性タンパク質の開裂 ハイブリッドTy−VLPがp1融合タンパク質を精製する
ために使用される場合に、融合タンパク質のp1成分を除
去して外因性または非p1成分を残すことが有益である。
このことは、p1と非p1配列の結合部における開裂を要求
する。このことは、Ty−VLPを使用して正確なタンパク
質を産生する手段を提供する。この目標を達成する一つ
の方法は、特異タンパク分解性開裂部位をp1/非p1接合
部に導入することである。 Ty−VLPから非融合インターフェロンを産生するため
に、pMA5623と指定されたpMA5020誘導体を構成した。こ
の構造は、TYAのコドン381において４つの付加コドンを
BamH Iリンカー前に加えた以外は、pMA5620と同一であ
る。これらのコドンは、血液凝集因子Xaの開裂部位であ
るアミノ酸配列I1e−G1u−G1y−Argをエンコードする
（Nagai＆Thogersen,1984,Nature,309,810）.pMA5620−
８、pMA5623−８に類似する構成用の接合領域は次のよ
うである。 PMA5623−８が酵母菌株MD40−4cに形質転換される
と、ハイブリッドIFN:Ty VLPに組立てられるp1:INF融
合タンパク質が産生される。しかしながら、pMA5620−
８含有形質転換体に対して融合タンパク質接合部におい
て開裂部位が存在するために、牛血フラクションXaを有
する微粒子融合タンパク質をインキュベートすると粒子
からのインターフェロンを開裂する。 前記の如く、それえゆ、ハイブリッドIFN−Ty−VLP
は、第１図のスクロース密度グラジェント分留によって
非微粒子タンパク質から精製される。その後、IFNは開
裂され、第２回のスクロース密度グラジェント分留によ
って微粒子p1タンパク質から精製されて、純粋で“確か
な”インターフェロンを生ずる。 この実施例で示されるインターフェロンコーディング
配列は、他のコーディング配列で置換可能であり、この
方法は他のタンパク質の発現および生成にも適用可能で
ある。
本発明は、実施態様において、酵母レトロトランスポゾ
ンTy、粒子形成用遺伝子を含むベクター、粒子タンパク
質および抗原の融合の高度発現用ベクターおよび酵母内
融合タンパク質の産生及び精製方法に関する。 背景技術 新らしい組換えDNA技術の最も重要な応用の１つは、
感染症に対する安全なワクチンの産生および実験上、工
業上および診断目的で生じ得る抗血清に対する特定タン
パク質の合成にある。理論的には、これらの目標は、酵
母サッカロミセス セレビジエ（Saccharomyces cerevi
siae）の如き微小有機体内で適切な抗原を合成すること
によって達成し得る。抗原は、EPA2−0073635号に記載
の如く適切な発現ベクターから発現させられる。 動物またはヒトの免疫システムに対する抗原の正確な
提供は、有効なサブユニットワクチンまたはイムノゲン
（免疫抗原）に対する重要な要求である。提供は、潜在
的なワクチン及び化学的に合成されたエピトープに基づ
くものに対するものと同様に組換えDNAによりなされた
イムノゲンをともなう大きな問題となっている。理想的
なイムノゲンは、高分子量担体に組み立てられた多価抗
原決定基のポリマーである。好適なイムノゲンは、さら
されたエピトープの最大数を有すべきである。これらの
要求は、抗原のキャリヤーへのランダム化学カップリン
グによって達成することは困難である。理想的な状態
は、抗原が大粒子複合体の表面上に正確に配合して存在
することであろう。その上、かかるシステムの微粒子特
性は、簡単な物理的手段による抗原精製を促進するだろ
う。 これらの諸要求は、組換えDNA技術または化学合成法
によるモノマータンパク質の簡単な合成法によって、ま
れに達成されるだろう。 本出願前に、酵母内のイムノゲンを産生する自己集合
微粒子抗原提供システムは、組換えDNA技術（Valenzuel
a et al 1985 Biotechnology 3,323）による抗原（例え
ばヘルペス シンプレックスウイルスＩ（HSV−Ｉ）グ
リコプロテインＤまたはポリオウイルス抗原）のヘパテ
ィティスＢ表面抗原（HBsAg）タンパク質への融合に基
づいていた。融合タンパク質は、凝集して22nmの粒子を
形成する。このシステムは、一連の不利益を有してい
る。 １）収率が極めて低い。 ２）粒子が酵母細胞内で形成せず、抽出プロセスの副生
物である（Hitzeman et al 1983 Nucl.Acids Res.11,27
450）。このことは、産生プロセスに制限を課す。 ３）融合物のなかには粒子を形成しないものがある。 ４）HBsAg成分が、ある場合に、免疫優位性を発揮す
る。即ち、抗体は、優先的にHBsAgに作られる。 ニスカーン等（Kniskern et al in Gene 46 135（198
6））はヘパティティスＢコア抗原（HBcAg）が酵母内で
極めて高いレベルで粒子を形成するが、他のエピトープ
を運搬するその用途に関する報告がまだなされていない
ことを報告している。これらの粒子が、マウスに対して
極めて高い免疫性を有することが報告されているので、
HBsAg粒子の様に免疫優位性を発揮するだろう。 ハインズ等（Haynes et al（Bio/Technology 4 637 1
986））は、細菌における対応システムについて報告し
ている。タバコ モザイク ウイルス（TMV）被覆タン
パク質は、粒子構造を組み立てる実体である。TMV被覆
タンパク質が、イー．コリ（E.Coli）内で発現し、そし
て精製されると、インビトロで該タンパク質を多価粒子
に組み立てることが可能となる。TMV被覆タンパク質お
よび他のタンパク質によってなされた融合タンパク質
は、免疫抗原性であるハイブリッド粒子を産生する。ポ
リオエピトープがサルク（Salk）ワクチンより1/4程度
免疫抗原性が低いけれども、８アミノ酸のポリオエピト
ープが試験され、そして免疫抗原性であることが示され
た。このシステムは、粒子径を実験的に変化でき、混合
粒子（即ち、１タイプのエピトープ以上を運搬する）が
極めて容易に産生できるという潜在的な利益を有する。
しかしながら、予想された不利益は、相対的に小さな抗
原のみがTMV粒子に添加可能である、 ということである。 メロー等（Mellor et al in Nature 313 243（1985））
は、融合タンパク質が、酵母イーストTy転写解読枠ORF1
（TYA遺伝子と指定する）、転写解読枠ORF2（TYB遺伝子
と指定する）およびインターフェロンをコードする核酸
からなる生成物である、ことを開示する。しかしなが
ら、この報文には、産生融合タンパク質または事実どん
なTyタンパク質が組み立てられ粒子となる、またはなる
だろう、という記載も示唆もない。 発明の開示 レトロトランスポゾン類の遺伝物質によって発現され
たある種のタンパク質は粒子への自己組み立て（assemb
ling）能力を有することが見い出された。同様に、かか
るレトロトランスポゾン誘導組み立てタンパク質に基づ
くものであり、かつ、抗原−（または他のバイオ活性分
子）提供粒子へ組み立て得る融合タンパク質を構成する
ことが可能なことも見い出された。更に、類似融合タン
パク質がRNAレトロウイルスからの組み立てタンパク質
に基づいて構成し得ることが見い出された。 第１の態様によれば、本発明は、粒子へ組み立て可能
な融合タンパク質を提供することにあり、ここで該タン
パク質は第１アミノ酸配列およびバイオ活性第２アミノ
酸配列からなり、該第１アミノ酸配列がレトロトラスポ
ゾンまたはRNAレトロウイルスによってエンコードされ
た粒子形成タンパク質と実質的に同一源であり、また第
２アミノ酸配列が30アミノ酸残基以上を含むのであれ
ば、第２アミノ酸配列の最初の30残基は、対応するレト
ロトランスポゾンまたはRNAレトロウイルスによる第１
アミノ酸配列へ自然に直接的に融合したアミノ酸配列を
形成することはない。 第２の態様によれば、本発明は、複数の融合タンパク
質から成る粒子を提供することにあり、ここで各融合タ
ンパク質は第１アミノ酸配列および第２アミノ酸配列か
らなり、該第１アミノ酸配列がレトロトランスポゾンま
たはRNAレトロウイルスによりエンコードされた粒子形
成タンパク質と実質的に同一源であり、該第２アミノ酸
配列がバイオ活性であり、かつ、該レトロトランスポゾ
ンまたはRNAレトロウイルスによる第１アミノ配列に自
然に融合しないものである。 かかる粒子は、一般的には実質的に純粋であり、少な
くとも５％、10％、20％、50％、80％、90％、95％また
は99％（重量）純粋であり、好ましさが増加する。粒子
は複数の異なる融合タンパク質からなる。即ち、該融合
タンパク質は、互いに異なる第２アミノ酸配列を有す
る。2,3またはそれ以上の異なる第２アミノ酸配列が粒
子に存在する。 第１アミノ酸配列は、酵母TyTYA遺伝子、コピア（Cop
ia）生成物および昆虫またはRNAレトロウイルスのgag遺
伝子からのコピア様要素からの生成物である。 レトロウイルスとは、ヒト免疫欠失ウイルスＩとII
（HIV−Ｉ、HIV−II）、SIV、ヒトＴ−細胞リンホトロ
ピックウイルスＩとII（HTLV−Ｉ、HTLV−II）、ネズミ
ルカエミア（Leukaemia）ウイルス、モロネー ネズ
ミ ルカミエア ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、
鳥類のルコシス（Leukosis）ウイルス、ねこのルカエミ
ア ウイルス、ヒトＢ−細胞リンホトロピック ウイル
スおよび牛ルカエミア ウイスルである。上記の如く、
レトロトランスポゾンには、酵母のTy要素、ドロソフィ
リアメラノガスター（Drosphilia melanogaster）が如
き昆虫のコピアおよびコピア様要素、マウスのVL30およ
びマウスのIAP遺伝子が含まれる。 好適なレトロトランスポゾンは、酵母レトロトランス
ポゾンTyである。先に、Tyが60nmウイルス様粒子（Ty−
VLP）の合成に関係することが示されている（Mellor et
al 1985a Nature 318,513）。p1タンパク質がTYA遺伝
子によってエンコードされており、安定であり、そして
更なるプロセスを必要としないことが見い出された。そ
れ故、Tyエンコード化アミノ酸配列は、好ましくはTYA
遺伝子によってエンコードされたp1タンパク質である。
Tyの両クラス（ＩとII）がp1を形成することは公知であ
る（Fulton et al NAR 13（11）1985 4097）。従って、
どちらも使用可能だろう。 Tyエンコード化アミノ酸配列は、p1タンパク質の全体
である必要はなく、代わりに、TYA遺伝子の一部によっ
てエンコードされたp1タンパク質の一部であってよく、
該部分はTyウイルス様粒子（Ty−VLP）合成に関与し得
る。アミノ酸配列の286〜381（第16図）部分が粒子形成
に必要であることが決定された。好ましくは、Tyエンコ
ード化アミノ酸配列は、Ty1−15から誘導可能である。T
YA遺伝子末端における停止コドンは、含まれないことが
好ましい。しかし、含まれれば、融合タンパク質は、停
止コドンがウイルソン等（NAR 14（17）1986 7001）の
記載による枠移動機構によって20回に１回の割合で無視
されるので、低収率ではあるが、発現が続くだろう。 それ故に、なかでも、Tyタンパク質p1、TYA遺伝子生
成物（Dobson et al 1984 EMBO.J3 1115）および第16図
の少なくとも286〜381のアミノ酸配列フラクションを含
む部分がTy−VLP産生に重要であることが示される。 なお、第１アミノ酸配列は、TYA遺伝子配列又はTyウ
ィルス様粒子合成に関与しうるTYA遺伝子配列の一部
が、粒子形成能が損なわれない範囲で、１もしくは数個
のヌクレオチドが欠損、置換もしくは付加された遺伝子
配列によってエンコードされていてもよい。 第２アミノ酸配列（即ち、実施態様において、非Tyタ
ンパク質コード領域）は、公知またはまだこれから説明
すべきもののいずれかのアミノ酸配列である。バイオ活
性は、単一活性（例えば、抗原性）、レセプター結合活
性、治療活性または標的活性（即ち、ホームから特別な
標的へ能力）、または二種またはそれ以上の異種バイオ
活性の組み合せを有する。同様に、異種融合タンパク質
が粒子抗原に組み立てられ、それによって、全粒子が１
以上の活性を有するようになる。 例えば、第２アミノ酸配列は、インターフェロン遺伝
子の如きリンフォカイン遺伝子、またはウイルス、細菌
または他の（例えば、原生動物の）寄生生物の如き、感
染因子の抗原をコードする遺伝子から誘導される。例え
ば、インフルエンザ ウイルス抗原、HIV−ＩまたはHIV
−II（即ち、HTLV−III、LAVまたはAIDS）ウイルス、狂
犬症ウイルス、PMVDウイルス、HBsAg、HBcAg、ポリオウ
イルス、インフルエンザ ウイルス、パラインフルエン
ザ ウイルス、呼吸性シンシチウムウイルス、ライノウ
イルス、コロナウイルス、アデノウイルス、ロタウイル
ス、ノルバルクウイルス（Norwalkviruses）、アルボウ
イルス、例えばデング、ヘルペス シンプレックス、サ
イトメガロウイルス、エプスタイン バール ウイル
ス、麻疹ウイルス、ムスプス ウイルス、ルベラ（Rube
lla）、ウマ インフルエンザ ウイルス、ウマの鼻肺
炎、ブタトランスミッシフル胃腸炎ウイルス、ジステン
バー、パロボウイルス（Parovovirus）、FeLV、ベネズ
エラまたはウエスターン ウマ脳炎、プラスモディウム
トリパノソーマ、住血吸虫、クラミジア トラコーマ
ティス（trachomatis）若しくは髄膜炎菌であり、また
は上記抗原のフラグメント若しくは化学的に合成された
コーディング配列から生じたペプチドであるので生成し
たペプチドは、上記抗原またはフラグメントと実質的に
同一抗原性を有する。 多くのウイルスと細菌抗原のヌクレオチド配列は既知
であり、かかる抗原は、組換えDNA技術で調製し得る。D
NAコーディング配列は、本発明の融合タンパク質の第２
アミノ酸配列コードに使用し得る。例えば、百日咳とマ
ラリアの如き、通常の病気に関連した抗原用のヌクレオ
チド配列は、公知である［百日咳、百日咳菌、WO87/033
01,6月４日1987:Malaria Plasmodium vivaxとP.falcipa
rum,Dame,et al.,Science,225:593,1984;Enea,et al.,S
cience,225:628,1984;Young,et al.,Science,225:958,1
984］。他の一般的な病気に対する抗原ヌクレオチド配
列は公知である ［Hepatitis,EPO 218,474とEPO 020,251: Herpes,EPO 216,1985と日本の61−97630, Rabies,WO87/00179;Chickenpox,EPO 210,931; Polio,WO86/01828と日本の61−47585］。 第２アミノ酸配列の最初の部分はリンカー配列であ
り、その配列は、ある環境において容易に切断される。
第２アミノ酸配列残部は、精製段階において切断され
る。 それ故、本発明の微粒子抗体は、ワクチンの調製に有
効であり、このことは本発明の他の態様を形成する。第
２アミノ酸配列は、このように前記感染因子の１つであ
る抗原のアミノ酸配列をコードする。ワクチンは、微粒
子抗原および無菌生理食塩水または無菌PBSの如き生理
学的に許容可能な非毒性キャリヤーからなる。無菌性
は、非経口投与ワクチンにとっては一般に必須である。
一以上の適切なアジュバントが存在してもよい。好適な
アジュバントには、ムラミル ジペプチド、水酸化アル
ミニウムおよびサポニンが挙げられる。 本発明のワクチンが１以上の抗原を提供することに注
目すべきである。異種微粒子抗原のカクテルかまたは１
以上のエピトープを有する微粒子抗原の均質集団（例え
ば、異なるハイブリッドタンパンク質の混合物を凝集さ
せ、または１以上の微粒子抗原を小細胞に発現させるこ
とによって調製されたものである）が使用される。また
は、ワクチンは、これら種類の微粒子抗原混合物を含有
することも可能であった。 他の態様において、本発明は、第１ヌクレオチド配列
と第２ヌクレオチド配列から成る核酸を提供することに
あり、ここで第１ヌクレオチド配列は、粒子形成タンパ
ク質をエンコードするレトロトランスポゾンまたはRNA
レトロウイルスの遺伝子物質と実質的に同一源かまたは
相補的であり、第２ヌクレオチド配列は、他のバイオ活
性アミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列をエ
ンコードするかまたは相補的であり、そして該核酸は、
前記レトロトランスポゾンまたはRNAレトロウイルスに
よって自然に産生されることのない融合タンパク質を形
成するように単位解読枠として発現し得、そして融合タ
ンパク質が粒子となる。 核酸がスプライシングまたは終了阻害なしで発現し得
ることは、一般的な場合である。枠移動は、一般には生
じないだろう。 本発明のある実施態様において、TYA融合遺伝子を産
生するためのいずれの非Tyタンパク質コーディング配列
に融合し得るTYA遺伝子誘導体を提供できる。TYA融合遺
伝子は、ハイブリッド Ty−VLPに組み立てられる融合
タンパク質を産生する。ハイブリッド Ty−VLPは、高
収率で産生し得、かつ簡単な物理手段によって生成可能
な高分子量微粒子抗原（または他の粒子の）提供システ
ムを構成する。 更に本発明によれば、前に定義した核酸を含む発現ベ
クターが提供される。例えば、TYA遺伝子誘導体を含
み、そして酵母内においてハイブリッドTy−VLPの高度
産生に関するpMA5620がある。 本発明の発現ベクターは、通常、プロモーターを含有
する。PGKは好適なプロモーターであるが、他のプロモ
ーターも必要により使用可能であり、また好ましい。例
えば、GAPD、GAL1−10、PHO5、ADH1、CYC1、Tyデルタ配
列、PYKおよび１以上のこれらのプロモーター成分から
作られたハイブリッドプロモーターまたは他のプロモー
ターを挙げることができる。 同様に、本発明はホスト細胞、例えはイー．コリ（E.
coli）の如き細菌細胞、サッカロミセス セレビジエ
（Sacharomyces Cerevisiae）如き酵母、またはチャイ
ニーズハムスターオリバー細胞（CHO）またはハイブリ
ッド粒子の産生に関する前記発現をベクターを含有する
COS細胞の如き動物細胞を挙げられる。 微粒子抗原の多価特性のため、従来の抗原より容易に
抗体を産生し、かつ該抗体は、特異な性質を有しやす
い。さらに本発明は、抗原性である本発明の粒子に対し
て生ずる抗体を提供する。抗体は、本発明のハイブリド
ーマ細胞により産生されたポリクローナル（例えば、抗
体をラビットに注射して得られたもの）またはモノクロ
ーナル抗体である。微粒子抗原の多価特性のため、イン
ビトロ免疫法は、抗原の他の形態をするものよりも達成
しやすい。すなわち、このことは、ヒトモノクローナル
抗体の産生を促進する。ハイブリドーマ細胞は、免疫化
動物の脾臓細胞と腫瘍細胞を融合して調製し得る。その
後、好適に分泌ハイブリドーマ細胞が選択される（Koeh
lerとMilstein Nature 1976 296 495）。 同様に、本発明は、好適なバイオ活性ペプチド精製技
術を提供する。本発明の態様は、例えば濾過または遠心
分離によって会合不純物から粒子を一般に相対的容易に
分離できるという事実に基づいている。それ故に、実質
的に純粋なバイオ活性ペプチド産生方法が与えられる
が、該方法は前記の如く会合不純物から粒子を分離し、
その後、粒子の融合タンパク質からバイオ活性ペプチド
を切断する方法である。 本発明の融合タンパク質および微粒子抗原は、診断薬
として有効である。診断目的の微粒子抗原は、遠心分離
または濾過によって物理的に分離でき、かつガラス、プ
ラスチックスライド、ディップ スティック、マクロま
たはミクロビース、試験管、微小力価ウエル等の固形支
持体上に直接分散し得るために、特に有効である。本発
明の微粒子抗原は、吸着剤ディスク（米国特許第4,632,
901号）、ストリップの如き繊維状または吸水性材料、
または固形支持体としてのクロマトグラフィーカラムに
も分散し得る。粒子と融合タンパク質は、容易に固形支
持物に付着する。粒子は、精製後融合タンパク質へ破裂
させられ、該融合タンパク質は、前記の如く表面分散し
得る。試薬は、多くの診断試験に有効である。例えば、
微粒子抗原に対する抗体を有すると思われる試験サンプ
ルおよびケイ光、酵素または放射性標識抗体は、固形支
持体上の微粒子抗原または融合タンパク質と競争的に反
応する、そして固形支持体上の微粒子抗原と結合する標
識化抗体の量、同様に、本発明の微粒子抗原は、抗原と
の凝集反応に有効である。診断分野の当業者は、本発明
の微粒子抗原および融合タンパク質の診断用途に対する
多くの応用例を認めるだろう。 本発明は、添付図面を引用して、次の実施例によって
説明される。 第１図は、プラスミドpMA91−11で形質転換したMD40
−4cから精製したTyウィルス様粒子（Ty−VLP）の写真
である。 第２図は、pMA5620とpMA5620−８の構造を示す概略図
である。 第３図は、本発明の実施例の主要成分の拡大図および
主要結合部のヌクレオチドの配列を有するプラスミドpM
A5620−８の概要図である。 第４図は、pAMA91−11,pMA91とpMA5620−８を含有す
るMD40−4cから粒子とタンパク質のスクロースグラジェ
ント分離のフラクションのSDSポリアクリルアミドゲル
分析の写真である。 第５図は、pMA5620−８を含有するMD40−4cから精製
したハイブリッドTy:IFN−VLPの写真である。 第６図は、pMA5620−８を含有するMD40−4cの抽出物
からのスクロースグラジェントフラクションのウエスタ
ーンブロットの写真である。 ａ）は抗Ty−VLP抗体を使用する結果を示す。 ｂ）は抗インターフェロン抗体を使用する結果を示す。 第７図は、精製ハイブリッドTy:IFN−VLP製剤 （１）、pMA5620−８で形質転換したMD40−4cの全抽出
物（２）と非形質転換MD40−4c（３）内のタンパク質ク
ーマシー染色SDSポリアクリルアミドゲル分析の写真で
ある。 第８図は、抗Ty−VLP担体（ｂ）、抗ハイブリッドTy:
IFN−VLP抗体（ｄ）および対応するプレブリード（Preb
leed）血清（ａ＋ｃ）を使用するウェスターンブロット
の写真である。各々は、pMA91（１）pMA91−１（２）を
含有するMD40−4cの全抽出物に対して使用される。プラ
スミドpMA91−１は、IFN−アルファ２の合成を誘導す
る。pMA91は、負の対照例であり、インターフェロンを
産生しない。 第９図は、HAコドン25−111含有262bp SpeI:SpeIフ
ラグメントのヌクレオチド配列を示す図である。実施例
５を参照のこと。 第10図は、プラスミドpMA5620−ha23を示す図であ
る。 第11図は、pMA5620またはpMA5620−ha23で形質転換し
たMD40−4c抽出物のスクロースグラジェント フラクシ
ョンのSDS−PAGE分析結果を示す図である。タンパク質
は、クーマシブルー染色されている。 第12図は、精製Ty:HA−VLPsの電顕写真である。 第13図は、pMA−5620−ha23で形質転換したMD40−4c
抽出物のスクロース グラジェント フラクションから
のタンパク質のウエスターンブロット図である。ブロッ
トは、抗Ty−VLP抗体と抗全インフルエンザウイルス抗
体でプローブされた。 第14図は、精製Ty:HA−VLP、全インフルエンザウイル
スNT60（H3）および左から右へ、正常“プレーブレッド
（pre−bled）”ラビット血清、抗Ty−VLP抗血清正常
“プレーブレッド”ラビット血清、抗Ty:HA−VLP抗血清
および抗全インフルエンザウイルス血清でプローブした
全インフルエンザウイルスPR8のウエスターンブロット
図を示す。 第15図は、PM5620からpMA5620−358を調製する方法を
示す図である。pMA5620−358は、TYAの最初の280コドン
を含有する。 第16図は、少なくとも粒子形成に必須なタンパク質の
286〜381セグメントを含むTYA1〜381アミノ酸のDNAおよ
びアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸の記号は、次
のようである。 ア ミ ノ 酸 記 号 アラニン Ａ アルギニン Ｒ アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ Asnおよび／またはAsp Ｂ システイン Ｃ グルタミン Ｑ グルタミン酸 Ｅ Glnおよび／またはGlu Ｚ グリシン Ｇ ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ ロイシン Ｌ リシン Ｋ メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ プロリン Ｐ セリン Ｓ トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ チロシン Ｙ バリン Ｖ 実施例１ 使用した菌株は、イー．コリ（E.Coli）AKEC28（c60
0,thr C,thyA,trp C1117,hsd RK.Hsd K9）とエス．セレ
ビシエ（S.cerevisiae）MD40−4c（urd 2,trp l,leu 2
−3,leu 2−112,his 3−11,his 3−15）であった。イ
ー．コリー（E.Coli）媒体は、ミラー（Miller 1972 Ex
periments in Molecular Genetics,CSH p433）の方法
で、そして酵母媒体は、ホーソーンとモーティマー（Ha
wthorne and Mortimer 1960 Genetics 45,1085）の方法
で調製した。イー．コリー（E.Coli）を標準的な方法
（Maniatis et al.1982 Molecular Cloning−A Laborat
ory Manual,CSH p199）で形質転換した。酵母を、ヒン
ネン等（Hinnen et al.1978 Proc.Natl.Acad.Sci 75,19
29）の記載方法の如く形質転換した。 制限消化およびプラスミド構成用の標準的な方法を使
用した（Maniatis et al.1982,op.cit.）。制限酵素とT
4 DNAリガーゼは、供給者の指示どうりに使用した。Ba
1 31 エキソヌクレアーゼ消化は、ドブソン等の記述
に沿って実施した（Dobson et al.1982 Nucl.Acids Re
s.10,5463）。欠失終了点は、DNA配列化によって決定さ
れた（Sanger et al.1977 Proc.Natl.Acad.Sci.74,546
3）BamH I合成オリゴヌクレオチドリンカーは、ファー
マシアから得た。 プラスミドDNAをチノルトとカーボン（Chinault and
Carbon 1979 Gene 5,111）およびホルメスとクウイグレ
イによる急速分析（Holmes and Quigley 1981 Anal.Bio
chem.114,193）に記載の如く、予めイー．コリー（E.Co
li）から単離した。 Ty−VLPを次のように精製した。すなわち、酵母細胞
を、30℃において８×106細胞/mlの密度に選択的に成長
させた。その後、細胞を低速遠心分離で集め、氷冷水で
１度洗浄し、そして１当り1mlの細胞でTENバッファー
（10mM.Tris.pH7.4;2mM EDTA;140mM Nacl）に再懸濁さ
せた。細胞を、＞70％破壊するまで４℃においてガラス
ビーズ（40メッシュ;BDH）で撹拌して破壊した。ビーズ
を低速遠心分離で小球化し、その後上澄を集め、破片を
ミクロフュージ中で20分間遠心分離にかけて除いた。Ty
−VLPを４℃において100,000gで１時間遠心分離し、そ
して１夜TENバッファー中で再懸濁させて、上澄液から
ペレット化した。再懸濁Ty−VLPを、上澄液を10mM Tri
s,pH7.4;10nM Nacl中の15−45％（w/v）スクロースグ
ラジェントに導入し、そして15℃において76,300gで３
時間スピンする前に、４℃において15分間ミクロフュー
ジ中で遠心分離にかけて細胞破片を除いた。フラクショ
ンを試験管の底から回収し、ピークフラクションを、ア
リコートのフラクションをSDS−PAGEゲルおよびクーマ
シーブル−染色法で試験し同定した。VLPを、４℃にお
いて100,000gで１時間ピークフラクションを遠心分離す
ることによって、濃縮した。 全酵母細胞のタンパク質抽出物を、前記の如く調製し
た（Mellor et al 1983 Gene 24.1）。ゲル工程は、ラ
エムリの方法であった（Laemmll 1970 Nature 227,6
8）。タンパク質濃度は、バイオーラド ラボラトリー
ズから得た染料結合アッセイ法（Bradford 1976 Anal.B
iochem.72,248）を用いて測定した。 ポリクローナル馬抗インターフェロン（IFN）アルフ
ァ抗体は、ベーリンガー マンハイムから購入した。抗
Ty−VLP抗血清は、標準的な方法でラビットから調製し
た。 ウエスターン ブロッティング法は、タウビン等の記
載の方法に従って実施した（Towbin et al.1979 Proc.N
atl.Acad.Sci 76.4350）。結合抗体を、西洋わさび（ho
rse radish）パーオキシダーゼに共役したラビット抗−
ホース（horsc）第２抗体（Miles Scientific）かまた
はラビット中に生じたパーオキシダーゼ抗パーオキシダ
ーゼ（PAP）複合体に附随するヤギ抗ラビット第２抗体
（シグマ）のいずれかによって検出した。酵素反応は、
デ ブラスとチェルビンスキーの記載の方法（De Blas
and Cherwinski 1983 Anal.Biochem.133,214）の如く展
開した。 プラスミドpMA91−11は、以前に記載している（Dodso
n et al 1984 EMBO.J.3,1115）。そのプラスミドは、高
効率発現ベクターpMA91に挿入されたTy要素、Ty1−15、
の主要転写単位である最初の1450ヌクレオチドを含んで
いる（Mellor et al.1983 op.cit:Kingsman and Kingsm
an 1985 Biotech.and Genet.Eng.Rev.3,377）。Ty成分
は、ドブソン等［Dobson et al.（op. cit）］等の記載
の如く、pKT40bから誘導された。pKT40bは、イギリス国
アバディーンのNCIBに寄託し、アクセッョンナンバーNC
IB12427を受けた。次に、発現ベクターpMA91は、イー．
コリー（E.Coli）内で複製と選択を許容するプラスミド
pBR32配列、酵母内で効率的な自立複製を許容する複製
の酵母２ミクロンプラスミド源、酵母leu2とE.coli le
uB突然変異体の両者中の選択的マーカーとしての酵母LE
U2遺伝子、および酵母転写終結用の全信号を含むPGKの
３′領域から1500〜１の酵母PGK遺伝子の上流非コーデ
ィング領域を分離するBg/II発現部位から成る。プラス
ミドpMA91は、米国特許4615974号の第15図にpMA3013と
指定されたプラスミドがプラスミドpMA91として公知で
あるが、該米国特許に記載されている。米国特許461597
4号の第１図の下部に示されたプラスミドは、それ故
に、改名されている。 従って、Ty発現は、高効率酵母ホスホグリセレートキ
ナーゼ遺伝子（PGK）のプロモータおよびTYA遺伝子のp1
タンパク質、第１翻訳生成物のpMA91−11過多生産にお
ける大きなかたまりを含む菌株の酵母抽出物から誘導さ
れる（Dobson et al.,1984 op.cit;Mellor et al.1985
a.op.cit）。pMA91−11含有酵母形質転換体の抽出物は
大量にTy−VLPを含むことが示される（第１図）。それ
故に、TYA単独でTy−VLP形成に関する十分な情報を含
み、そしてpMA91−11含有MD40−4cの抽出物中に発見さ
れたp1タンパク質が粒子に組み立てられる（第１図と第
４図）。この情報は、本発明の基礎を提供する。 プラスミドベクターpMA5620の構成、即ちハイブリッ
ドTy−VLP粒子の合成に関するものは、第２図に図示さ
れている。このことは、ベクター構成がTYA遺伝子内に
便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を要求しているの
で、いかなるコーディング配列も該部位に挿入し、TYA
ハイブリッド遺伝子を産生し得る。しかしながら、かか
るハイブリッド内にTy−VLPの合成に関する十分なTYAコ
ーディング配列が存在することが必須である。プラスミ
ドpMA91−11は、Bg1 IIで切断され、多くの時間Ba1 31
エキソヌクレアーゼで消化され、そして過剰のBamH Iリ
ンカー（CCGGATCCGG）の存在下で再リゲートされた。生
成したプラスミドの欠失終了点は、DNA配列化によって
決定された。プラスミドpMA91−357は、265bpが除去さ
れた欠失誘導体である。このことは、BamH Iリンカー
を、TYAをコドン381を越えてヌクレオチド上に配置する
（第３図）。 すべての三つの解読枠の転写終了配列および翻訳停止
コドンの両者を提供するために、pMA91−357の欠失PGK
3′終止配列をプラスミドpDT86から単離した287 bp B
amH I−Sa1I DNAフラグメントで置換した。このDNAフ
ラグメントは、BamH I部位下流における全ての三つの解
読枠に翻訳停止コドンを含む酵母PGK遺伝子からの、修
飾３′転写終止フラグメントである（第２図と第３
図）。この終止フラグメントは、PGKコーディング配列
の最終センス コドンにリンクしたBamH Iリンカー（CC
GGATCCGG）で開始し、そしてPGKコーディング配列を越
えてHind III部位279ヌクレオチドに拡大する（Hitzema
n et al.1982 Nucl.Acids Res.10,7791）。これらの構
成において、Hind III部位は、合成リンカーを用いてSa
1Iに変更されている。終止フラグメントは、臨界的では
なく、そして酵母転写終止を付随するすべての三つの解
読枠の終止コドンを含むフラグメントは十分であろう。
生成したプラスミドpMA5620は、ハイブリッドTy−VLPへ
組み立てられるハイブリッドタンパク質を産生するため
に好適な配列が挿入される唯一のBamH I部位を含んでい
る。 pMA5620を試験するために、インターフェロン−アル
ファ２（IFN） cDNAがモデル抗原コーディング配列と
して使用された。540bp BamH I IFN−アルファ２ cD
NA フラグメント、すなわちフラグメント８と指定され
ている（Mellor al 1985b Gene 33,215）ものをプラス
ミドpMA5620の唯一のBamH I部位に挿入した。生成した
プラスミドは、pMA5620−８（第２図と第３図）と指定
された。 VLPは、プラスミドpMA5620−８で形質転換された酵母
菌株MD40−4cから調製され、そして15−45％スクロース
グラジェントからのフラクションは、SDS−PAGEゲルで
試験された。グラジェント中のタンパク質は、クーマシ
ーブルー染色法で目視化された（第４図）。予想70kd
TYA−IFN融合タンパク質のグラジェント中の位置は、最
終的にタンパク質の微粒子特性を示した。フラクション
の電子顕微鏡写真は、微粒子が存在すること確認した
（第５図）。70kd微粒子タンパク質が事実、Ty（50k
d）:IFN（20kd）であることを立証するために、スクロ
ースグラジェントからの融合タンパク質フラクションを
再度SDS−PAGEゲルで試験し、そて分離したタンパク質
をニトロセルロースフィルターに移した。１つのフィル
ターは、Tyタンパク質との反応が公知であるTy−VLP抗
体でプローブし、そして他のものは、抗IFN−アルファ
抗体でプローブした（第６図）。両者において、強く反
応した70kdタンパク質は、このタンパク質がTyとIFNエ
ピトープの両者を含むことを示した。 ハイブリッドTy:IFN−VLP生成方法の効率は、第７図
で示される。70kdハイブリッドタンパク質は、製剤にお
いて非常に重要な種である。 モデル抗体に対する免疫応答性を引き出すこれらのハ
イブリッドTy:IFN−VLP効能を試験するために、ラビッ
ト内の抗血清が、pMA5620−８で形質転換された酵母抽
出物から精製された濃縮ハイブリッドTy:IFN−VLPに対
して提案させた。IFN−アルファ２を過剰生産するプラ
スミドpMA91−１で形質転換したMD40−4c抽出物（Mello
w et al.1985b op.cit.）をSDS−PAGEゲルで分析し、そ
れに沿ってインターフェロンを産生しないpMA91で形質
転換したMD40−4cを抽出物も上記の如く行なった。分離
したタンパク質をニトロセルロースに移し、Ty−VLP抗
血清かまたはTy:INF−VLP抗血清のいずれかでプローブ
した（第８図）。両抗血清が抽出物中に存在するTyタン
パク質と反応するけれども、抗ハイブリッドTy:INF−VL
P抗血清がプラスミドpMA91−１を含有する抽出物中の20
kdIFNタンパク質と反応した。 これらのデータは、次のことを示す。１）pMA5620−
８は、Tyタンパク質p1の最初の381個のアミノ酸と非Ty
タンパク質とからなるハイブリッド融合タンパク質の合
成を誘導する。この場合、インターフェロンアルファ２
である。２）この融合タンパク質は、ハイブリッドTy:I
FN−VLPを形成する。３）ハイブリッドTy:IFN−VLPは、
容易に単離し得る。４）ハイブリッドTy:IFN−VLPは、
ラビット免疫システムに対してモデル抗原、インターフ
ェロン−アルファ２を提出する。それ故、pMA5620がハ
イブリッドTy−VLPの合成を誘導するものであり、そし
てかかる粒子中に存在するいかなる抗原も哺乳動物の免
疫システム、例えばラット、ハムスター、犬、猫、ウ
シ、羊、ブタおよびヒトに提供することが理にかなって
いる。明らかに、ここで実施例として使用したインター
フェロンcDNAは、完全なタンパク質またはタンパク質の
部分をエンコードする他のDNA片で置換できた。 この抗原提供システムの微粒子特性およびそのための
ハイブリッドTy−VLP精製の容易さは、本発明を、規定
された抗原に対する抗体産生刺激手段として、新規ワク
チンの生産手段として、モノクローナル抗体産生用に規
定された抗原調製用の手段として、診断アッセイ法用抗
原の調製手段として有効にする。 それ故、ハイブリッドTy:IFN−VLPは、抗IFN抗体（モ
ノクローナルまたはポリクローナルのいずれかである
が、好ましくはモノクローナルである）を高めるために
使用される、ここで該抗体はその後IFN精製に使用され
る。 実施例２ ドロソフィリア メラノガスター（Drosophilia mela
no gaster）のコピア要素は、遺伝子およびウイルス様
粒子形成の両者における酵母のTy要素に極めて類似する
（Mount＆Pubin 1985 Mol.Cell.Biol.５1630）。TYAに
等価なコピア領域は、レトロウイルス機構の類似によっ
てgagと称される。それ故、昆虫細胞発現システムのコ
ピア要素のgag領域における高度な発現は、Ty−VLPs類
似粒子に組み立てられるタンパク質を導くことが見い出
される。gagが他のタンパク質のコーディング配列と融
合するならば、生成融合タンパク質も同様に前記Ty:IFN
ハイブリッド粒子類似ハイブリッドコピア粒子に組み立
てられることも見い出される。 抗原提供としてのコピア粒子および精製システムを確
立するために、プラスミドpPW220からのgag（Potter＆B
rosein 1979 Cell 17 415）は、プラスミドpAc373−gag
を産生するためにpAc373（Smith et al 1983 J.Virol.4
6,584）の如き代表的な高効率バキュロウィルス（Bacul
ovirus）発現ベクターに挿入する標準的な組換えDNA方
法で処理される。発現は、ポリヘドリンプロモーターに
よって行われる。その後、インターフェロンcDNAは、枠
のgagの３′端に挿入され、プラスミドpAc373−gag−IF
Nを産生する。このプラスミドは、直接的にpMA5620−８
に類似する（実施例１を参照のこと）。pAc373−gag−I
FNは、その後スポドプテラ フルギペルダ（Spodoptera
frugi perda）細胞内においてインビボ組換えによって
バキュロウイルス（Baculovirus）、オートグラファ
カルフォニカ ニュクリア ポリヘドロシス（Autograp
ha californica nuclear polyhedrosis）（AcNPV）に導
入される（Smith et al 1983 Mol.Cell.Biol.4 215
6）。組換えウィルスは、閉鎖マイナスプラークから収
穫し、新鮮なエス．フルギペルダ（S.frugiperda）細胞
を再感染するために使用される。ハイブリッドコピア:I
FN粒子を感染後72〜96時間で収穫し、スクロース グラ
ジェントで分留してバキュロウイルス不純物から分離し
た。粒子は、電子顕微鏡及びTy−IFNハイブリッド粒子
の項で記載のウエスターンブロッティング法によって同
定した（実施例１を参照のこと）。 実施例３ ドロソフィラ（Drosophila）ADH遺伝子プロモーター
により発現したgag IFN融合物を含有する組換えプラス
ミド（Benyajati et al.1983 Cell 33 125）が簡単なD
NA仲介トランスフェクションによって昆虫細胞に導入さ
れる（例えばドロソフィラ シュナイダー２細胞）こと
を除いて、実施例２の一般的な方法に従った。 実施例４ 酵母Ty要素のTYA遺伝子は、鳥類及び哺乳類のレトロ
ウィルスのgag遺伝子にまさに類似している。TYA生成物
だけが粒子形成が可能であるので、gagタンパク質が同
一なことを行ない、それ故に、抗原提供および精製シス
テムの基礎として作用するだろう。 抗原精製および提供システムとしてのレトロウイルス
性gagタンパク質を立証するために、HIV−Ｉからのgag
遺伝子は、標準的な組換えDNA方法で処理されて酵母発
現ベクターpMA91及び哺乳類発現ベクターpSV2に導入さ
れる（Southern and Berg 1982J.Mol.Appl.Genet.1 32
7）、ここで該ベクターはpAM91−HIVgagおよびpSV25−H
IVgagをそれぞれ産生するために哺乳類のdhfrcDNAを含
有する。その後インターフェロンcDNAは、枠内のそれぞ
れの分子のgag 3end端に導入されて、pM91−HIVgag−I
FNとpSV25−HIVgag−IFNをそれぞれ産生する。これらの
分子は、pMA5620−８に類似する（実施例１を参照のこ
と）。その後、pMA91−HIVgag−INFは、酵母菌株MD40−
4cを形質転換するために使用され、pSV25−HIVgag−INF
は、CHO−dhfr細胞をトランスフェクト（transfect）す
るために使用される。安定な形質転換体が増殖させら
れ、細胞抽出物が調製され、かつスクロースグラジェン
トで分留される。ハイブリッドHIVgag:INFは、Ty:INFハ
イブリッド粒子の項で記載の如く、電子顕微鏡及びウエ
スターンブロッティング法により同定される（実施例１
を参照のこと）。 実施例５ pSV25−HIVgag−INFがCOS細胞に導入され（Gluzman e
t al.1977 J.Virol.24 534）、かつハイブリッド粒子が
トランスフェクション後３〜９日で収穫された以外は、
実施例４の方法に従った。 実施例６ この実験において、一部のインフルエンザ血球凝集素
（HA）含有ハイブリッドTy−VLPを産生し得、かつこれ
らのハイブリッドTy:HA−VLPがラビット中で抗HA抗体形
成を誘導することを示す。 これらの実験方法は、実施例１に記載のハイブリッド
Ty:IFN−VLPの産生と分析に関するものと、本質的には
同じである。MRC12/80抗全インフルエンザウイルス抗体
は、英国、ミルヒル、NIMRの世界インフルエンザセンタ
ーから得られ、インフルエンザウィルス菌株A/スコット
ランド/840/74×A/PR/8/34（H3N2）に対して提案され
た。インフルエンザウィルスA/メンフィス/102/72（H3N
2）のHA1ドメインのコドン25−111に対応するHAコーデ
ィング配列領域は、ウィルソン等のデータ（Wilson 198
4 Cell 37,767）に基づいてハイブリッドTy:HA−VLP形
成用に選択された。コドン25−111に対応する262bp Sp
eI;SpeI（第９図）は、プラスミドMX29の適切な消化で
精製された。MX29は、Pst I部位につづくインフルエン
ザウィルス菌株A/メンフィス/102/72G:cから、HA RNA
から誘導されたH3 HA cDNAを有するプラスミドpAT153
である（Twigg and Sherratt,1980 Nature 283,216）.S
peI:SpeIフラグメントの粘着性端をDNAポリメラーゼＩ
を使用して仕上げ、その後、該フラグメントをプラスミ
ドpSP46のHinc II部位にリゲートし（blunt−end ligat
e）てpSP46−ha23を産生した。pSP46は、pSP64のHind I
II部位がBg1 II部位に転換されているpSP46（プロメガ
バイオテック）の誘導体である。ha23と指定されたBamH
I;Ba1 IIフラグメントは、pSP46−ha23から精製され
た。ha23は、262bpで埋められたSpeI;SpeIフラグメント
を含有する。その後、ha23は、pMA5620のBamH I部位に
挿入されてpMA5620−ha23を産生する（第10図）。この
プラスミドは、酵母菌株MD40−4cを、ロイシンインディ
ペンデェンスに形質転換するために使用された。 VLPを、pMA5260−ha23またはpMA5620で形質転換した
酵母MD40−4cから調製し、15〜45％スクロースグラジェ
ントで分留した。フラクションをSDS−PAGEゲルで試験
し、タンパク質をクマーシーブルー染色法で目視化した
（第11図）。予想TYA−HA融合タンパク質のグラジェン
ト中の位置は、タンパク質の微粒子特性を示した。フラ
クション電子顕微鏡で粒子の存在が確認された（第12
図）。 粒子がHA抗原を含有することを確認するために、類似
グラジェントからpMA5620−ha23を有するMD40−4cの分
留抽出物を再度SDS−PAGEゲルで試験し、その分離タン
パク質をニトロセルロースフィルターへ電子ブロット
（electroblot）した。１つのフィルターをTyタンパク
質との反応が公知の抗Ty−VLP抗体でプローブし、他の
ものを抗HA抗体でプローブした。両者において、反応し
た推定Ty:HA融合タンパク質は、このタンパク質がTyとH
Aエピトープの両者を含むことを強く示した（第13
図）。 HAへの免疫応答性を引き出すハイブリッドTy:HA−VLP
の効能をテストするために、pMA5620−ha23で形質転換
したMD40−4c抽出物から精製した濃縮ハイブリッドTy−
HA−VLPに対してラビットにおいて抗血清が提案され
た。この抗血清は、その後、ウェスターンブロッティン
グ法によって、全インフルエンザウィルスから破壊され
たタンパク質をプローブするために使用された。３タン
パク質サンプルが使用された。第１のものは、抗血清を
高めるために使用される精製Ty:HA−VLPであった。第２
のものは、全インフルエンザウィルスPR8（H3）であっ
た。第３のものは、全インフルエンザウィルスNT60（H
1）であった。PR8とNT60の両者は、英国オックスフォー
ド パソロジーのサーウィリアム ダン スクールのジ
ョージ ブラウンリー（Geroge Brownlee）から得た。
第14図は、抗Ty:HA−VLP抗体がH3HAのHA1領域は反応す
るが、H1HAとは反応しないことを示す。かかる反応は、
プレブレッド血清で観察されるが抗Ty−VLP抗体では観
察されない。正の対照として、同一サンプルが抗全ウィ
ルス抗体でプローブされた。この場合に、H1HAのH3HAの
両方が抗血清と反応した。ハイブリッドTy:HA−VLPがH3
抗原エピトーブに特異な抗HA抗体産生を誘導する。 これらのデータは、pMA5620−ha23がTyタンパク質p1
の最初の381アミノ酸およびウィルス性タンパク質の小
領域、インフルエンザウィルスHAから成るハイブリッド
融合タンパク質の合成を誘導することを示す。この融合
タンパク質は、ハイブリッドTy:HA−VLPを形成する。ハ
イブリッドTy:HA−VLPは容易に単離され、かつ、かかる
方法でラビット免疫システムにHA成分を提供するので抗
HA抗体が産生される。これらの抗体は、ウエスターンプ
ロット法においてH1HAとH3HAとを区別し得る。明らか
に、ハイブリッドTy:HA−VLPのHA成分は、他のインフル
エンザウィルス成分はまたは他のウィルス成分で置換し
得、かつ類似結果が得られることが予想できる。 実施例７ ３′端において累進的により少ない配列を含む一連の
切断TYA遺伝子を得るために、標準的なBa131消化は、出
発分子としてpMA5620を使用して行なわれた。プラスミ
ドpMA5620は、BamH Iで切断され、種々の時間Ba131で消
化され、そして過剰のBamH Iリンカー（CCGGATCCGG）存
在下で再リゲートされた。精製プラスミドの欠失端終了
点は、DNA配列化で決定された。これらの欠失の１つ
は、TYAの最初の286コドンだけを含み、358と指定され
た。358の欠失PGKターミネータ配列は、pMA5620からの
大きなPvu II−BamH Iフラグメントを358からの680bpPv
u II−BamH Iフラグメントでリゲートすることによって
置換された。生成したプラスミドは、pMA5620−358と指
定された（第15図）。 ２つの若干異なる３′ターミネータ（termini）を有
するインターフェロンアルファ2cDNA BamH Iフラグメ
ント（IFN−８とIFN−2;Mellor et al.1985 Gene 33,21
5;Mellor et al.1985 Nature 313,243）を、枠内の、pM
A5620とpMA5620−3580のBamH I部位に挿入してプラスミ
ドpMA5620−８とpMA5620−358−２を産生した。 プラスミド pMA91−11、pMA5620およびpMA5620−358
を、酵母菌株MD40−4cをロイシン インディペンスに形
質転換するため使用した。生成形質転換体は、抗Ty−VL
P抗体を使用するウェスターンブロッティング法で決定
したように、プラスミドから生産されたTYA RNAおよび
p1または切断p1タンパク質の量に匹敵する。RNAおよび
タンパク質の量は、各形質転換体において同じであっ
た。 各形質転換体からの抽出物は、その後、15〜40％スク
ロースグラジェントで分留され、それに続くpMA91−11
とpMA5620の両方に対するクマーシーブルー染色法によ
って分析された。微粒子構造の特徴であるグラジェント
領域にp1または切断p1タンパク質がある。しかしなが
ら、pMA5620−358の場合に、微粒子物質は観察されな
い。 インターフェロン アルファー２ cDNAを枠内、プラ
スミドpMA5620およびpMA5620−358の各々に融合してプ
ラスミドpMA5620−８およびpMA5620−358−２を産生し
た。これらのプラスミドは、酵母菌株MD40−4cをロイシ
ン インデペンダントに形質転換するために使用され、
そしてTy同一源RNAとp1およびp1:インターフェロン融合
タンパク質は前記の如く測定された。RNAとタンパク質
のレベルは、形質転換体の両方と同じであり、かつ、pM
A5620とも同じである。pMA5620−８を14〜45％スクロー
ルグラジェントで分析した。70KDp1:インターフェロン
融合タンパク質は、微粒子構造のグラジェント特性領域
中で観察された。しかしながら、pMA5620−358−２の含
有抽出物が分析されたときに、微粒子物質が観察されな
かった。 このように、Ty−VLP形成には、少なくともアミノ酸2
86〜381間の配列部分が要求される。p1のDNAとアミノ酸
配列は、アミノ酸286〜381のDNAのアミノ酸配列をも示
す（第16図）。 実施例８ VLP抗原を用いる酵素イムノアッセイ法 96ウエル微小力価プレートを、各ウエルを室温で２時
間、50mM炭酸ナトリウムバッファー中の20μg/mlのVL
P、pH9.5、の50μでインキュベートしてVLP抗原（抗
原を有するウイルス様粒子）で被覆した。過剰のVLP抗
原を、リン酸緩衝液（PBS）、pH7.4、で３分間及び５分
間の洗浄でウエルから除去した。バックグランド反応を
最小にするために、ウエルを室温で、１時間PBS中の２
％カゼイン100μで保護し、その後0.1％Tween−20（P
BS−Ｔ）含有PBSで３分間及び５分間の洗浄した。試験
サンプル中の第１抗体を、0.5％カゼイン含有PBS−Ｔ
（PBS−CT）中で好適に希釈する。好適な希釈液は、1/1
0〜1/7.290の３倍希釈系である。第１抗体は、ハイブリ
ッドTy−VLPの非Ty成分に反応性を有する。50μの第
１抗体を適切なウエルに加え、室温で２時間インキュベ
ートした。過剰の第１抗体をPBS−Ｔで３分間および５
分間洗浄して除去する。第２抗体は、ホースラディッシ
ュパーオキシダーゼ標識化抗種IgGであり、PBS−CT中で
1/1500に希釈された。50μの希釈第２抗体を各ウエル
に加え、室温で２時間インキュベートし、その後PBS−
Ｔで５分間および５分間洗浄した。基質は3,3′,5,5′
−テトラメチルベンジリデンであり、0.1M酢酸ナトリウ
ム中で0.1mg/ml濃度であり、0.5Mクエン酸及び0.03％ハ
イドロジェン パーオキサイドでpH6.0に調節されてい
る。50μの基質を各ウエルに加え、カラー反応を10分
間行なった。反応は、0.5M硫酸25μを各ウエルに加え
て決定される。カラー反応は、微小リーダーを用いて45
0nmにおいて測定して評価される。この方法で、試験サ
ンプル中の第１抗体の直接アッセイ法が実施される。 実施例９ ハイブリッドTY−VLPからの外因性タンパク質の開裂 ハイブリッドTy−VLPがp1融合タンパク質を精製する
ために使用される場合に、融合タンパク質のp1成分を除
去して外因性または非p1成分を残すことが有益である。
このことは、p1と非p1配列の結合部における開裂を要求
する。このことは、Ty−VLPを使用して正確なタンパク
質を産生する手段を提供する。この目標を達成する一つ
の方法は、特異タンパク分解性開裂部位をp1/非p1接合
部に導入することである。 Ty−VLPから非融合インターフェロンを産生するため
に、pMA5623と指定されたpMA5020誘導体を構成した。こ
の構造は、TYAのコドン381において４つの付加コドンを
BamH Iリンカー前に加えた以外は、pMA5620と同一であ
る。これらのコドンは、血液凝集因子Xaの開裂部位であ
るアミノ酸配列I1e−G1u−G1y−Argをエンコードする
（Nagai＆Thogersen,1984,Nature,309,810）.pMA5620−
８、pMA5623−８に類似する構成用の接合領域は次のよ
うである。 PMA5623−８が酵母菌株MD40−4cに形質転換される
と、ハイブリッドIFN:Ty VLPに組立てられるp1:INF融
合タンパク質が産生される。しかしながら、pMA5620−
８含有形質転換体に対して融合タンパク質接合部におい
て開裂部位が存在するために、牛血フラクションXaを有
する微粒子融合タンパク質をインキュベートすると粒子
からのインターフェロンを開裂する。 前記の如く、それえゆ、ハイブリッドIFN−Ty−VLP
は、第１図のスクロース密度グラジェント分留によって
非微粒子タンパク質から精製される。その後、IFNは開
裂され、第２回のスクロース密度グラジェント分留によ
って微粒子p1タンパク質から精製されて、純粋で“確か
な”インターフェロンを生ずる。 この実施例で示されるインターフェロンコーディング
配列は、他のコーディング配列で置換可能であり、この
方法は他のタンパク質の発現および生成にも適用可能で
ある。
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 ０３６，８０７
(32)優先日 1987年４月10日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
審判番号 平8−6008
(72)発明者 キングスマン，スーザン，メアリー
イギリス国 オクソン オーエックス５
２エスエフ，アイスリップ，ミドルス
トリート，グレイストン （番地なし)
(72)発明者 アダムス，サリー，エリザベス
イギリス国 オクソン オーエックス５
１エスピー，キドリングトン，グロー
バーランヅ，ザ フェルプス12
(72)発明者 マリム，ミカエル ヘンリー
イギリス国 ゴルス．，ジーエル18，ア
ップリードン フォーゲ レーン，アサ
ーズ （番地なし)
(72)発明者 メロー，エリザベス‐ジェーン クライ
ヤー
イギリス国 オックスフォード オーエ
ックス２ ６エルビー，バンバリーロー
ド119，サックレーエンド 41
(56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，313（1985）Ｐ．243−
246
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．第１アミノ酸配列と抗原性を有する第２アミノ酸配
列からなり、 前記第１アミノ酸配列が、TYA遺伝子配列又はTyウィル
ス様粒子合成に関与しうるTYA遺伝子配列の一部によっ
てエンコードされ、前記第１アミノ酸配列と第２アミノ
酸配列とはリンカーを介してか介せずして融合してお
り、かつ 前記第１アミノ酸配列との融合部位に直接隣接するリン
カー及び第２アミノ酸配列の一部のいずれもが、第１ア
ミノ酸配列に天然に直接に融合するアミノ酸配列でない
ことを特徴とする粒子の組み立て可能な融合タンパク
質。 ２．第２アミノ酸配列が、細菌、ウィルス又は原生動物
の抗原をエンコードしている遺伝子配列によってエンコ
ードされている請求項１記載の融合タンパク質。 ３．第１アミノ酸配列と抗原性を有する第２アミノ酸配
列からなり、前記第１アミノ酸配列が、TYA遺伝子配列
又はTyウィルス様粒子合成に関与しうるTYA遺伝子配列
の一部によってエンコードされ、前記第１アミノ酸配列
と第２アミノ酸配列とはリンカーを介してか介せずして
融合しており、かつ 前記第１アミノ酸配列との融合部位に直接隣接するリン
カー及び第２アミノ酸配列の一部のいずれもが、第１ア
ミノ酸配列に天然に直接に融合するアミノ酸配列でない
粒子の組み立て可能な融合タンパク質の複数からなる粒
子。 ４．融合タンパク質内の第２アミノ酸配列が、互いに全
て同一とは限らない請求項３記載の粒子。 ５．会合不純物から、第１アミノ酸配列と抗原性を有す
る第２アミノ酸配列からなり、前記第１アミノ酸配列
が、TYA遺伝子配列又はTyウィルス様粒子合成に関与し
うるTYA遺伝子配列の一部によってエンコードされ、前
記第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列とはリンカーを
介してか介せずして融合しており、かつ前記第１アミノ
酸配列との融合部位に直接隣接するリンカー及び第２ア
ミノ酸配列の一部のいずれもが、第１アミノ酸配列に天
然に直接に融合するアミノ酸配列でない粒子の組み立て
可能な融合タンパク質の複数から構成された粒子を分離
し、その後、該粒子の融合タンパク質から抗原性を有す
るペプチドを解裂させることを特徴とする実質的に純粋
な抗原性を有するペプチドを産生する方法。 ６．哺乳動物の感染因子に応答して産生された抗体に免
疫反応性である融合タンパク質又は粒子を固形支持体上
に分散してなり、 前記融合タンパク質が、第１アミノ酸配列と抗原性を有
する第２アミノ酸配列からなり、 前記第１アミノ酸配列が、TYA遺伝子配列又はTyウィル
ス様粒子合成に関与しうるTYA遺伝子配列の一部によっ
てエンコードされ、前記第１アミノ酸配列と第２アミノ
酸配列とはリンカーを介してか介せずして融合してお
り、かつ 前記第１アミノ酸配列との融合部位に直接隣接するリン
カー及び第２アミノ酸配列の一部のいずれもが、第１ア
ミノ酸配列に天然に直接に融合するアミノ酸配列でない
粒子の組み立て可能な融合タンパク質であり、 前記粒子が、前記融合タンパク質の複数からなる粒子で
ある診断試薬。
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