JP2974348B2 - ヘモフイルス インフルエンザｂ型の膜タンパク及びペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はヘモフイルス インフルエンザｂ型から得
られるあるタンパクに対するDNA配列、その配列の変形
で適当なベクターで発現させるとタンパク及びペプチド
をもたらし、それらは天然のタンパクの免疫特性のすべ
て又はいくらかを保持しているものに関する。

これらのタンパクやペプチドは連結して（conjugat
e）又はそれなしでヘモフイルス インフルエンザｂ型
病に対するワクチンに使うことができる。

又これらタンパクは、Ｔ細胞膜抗原として他のハプテ
ン及び担体と共に用いることもできる。

ヘモフイルス インフルエンザｂ型菌がひき起す病気
の主なものは、５才以下の児童の髄膜炎である。

この病気に対する防御抗体は上記の生物体外皮膜の多
糖類から誘導することができ、精製したポリリボシルリ
ビトール燐酸（PRP）を抗原に利用したワクチンが開発
されている。

このワクチンは成人と24月令以上の小児に対しては90
％の防御率を示すが、24月令以下の小児では効果がな
い。

他の多糖類ワクチンと同じように、PRPはヘルパーＴ
細胞の増殖を誘導しないし、再免疫処置では追加応答も
記憶細胞増加もうまくゆかない。

PRPジフテリヤ毒素コンジュゲートを使ったコンジュ
ゲートワクチンが開発されているが（ヨーロッパ特許第
0098581を参照のこと）、これはＴ細胞依存性、追加免
疫及びPRP特異的IgG抗体産生を来たす。

しかしImmunisation Practices Advisory Committee
とAmerican Academmy of Pediatricsのどちらの勧告
も、18月令以上の小児の場合にはワクチンを使用して免
疫させるようにとのことだけであり、これは幼若者にあ
ってはワクチンの有効性が一定していなかったからであ
る。

２月令から６月令ないしもっと後の危険があるグルー
プにおいて普遍的な防御を得るためには、非外皮膜性抗
原の採用が要求されるのであろう。

病気に対して免疫を誘導する方法は常に改良がなされ
ており、現在ではより小さなよりよく限定された材料を
抗原とする動きにある。

これは或る種の天然の免疫原に基く副作用の発現可能
性を最小にし、又除去しかつ病気に対する防御を与える
免疫原性を維持している。

本発明ではヘモフイルス インフルエンザｂ型菌の外
皮膜から単離された精製されたタンパクでP2と命名され
たものが示されており、これはラットで前記病気に防御
的な抗体を誘導できるが、このタンパクの構造は今日ま
で知られていない。

発明者等はその精製タンパクのＮ−末端のエドマン分
解を行なったところ、その配列からヘモフイルス イン
フルエンザｂ型菌ゲノムライブラリーを選びだすプロー
ブのオリゴヌクレオチドを合成することができた。

この主法で約1700bpのEcoR Iフラグメントをクローニ
ングすることができ、これにはP2遺伝子の５′部分を含
んでいた。

残りのP2遺伝子部分を含む重複したPvu IIフラグメン
トを引続きクローニングした。

その重複したフラグメントに対するDNAのオープンリ
ーディングフレームを翻訳することで、P2タンパクのア
ミノ酸配列が得られた。そしてＥ．coliで組換えタンパ
クを発現させた。

発現したタンパクは、ヘモフイルス インフルエンザ
ｂ型菌から分離したものと免疫学的に類似のものであ
り、その病気に対して防御的に使用できるだろうと見ら
れた。

発明者等はまた、同じ遺伝子を他のヘモフイルス イ
ンフルエンザｂ型菌からクローニングし配列も決めた。
これらの遺伝子は、塩基配列及びそれに基くアミノ酸配
列において小規模の多形性を示す。従って本発明では第
１にヘモフイルス インフルエンザｂ型の外皮膜タンパ
クP2をコードする遺伝子を開示するものであるが、それ
は固有のものないしはそれと実質的に相同のものの塩基
配列である。本発明はまた、遺伝子工学によって作られ
た上記遺伝子の塩基配列により記されるアミノ酸配列を
持つP2外皮膜タンパクを含むものである。発明者等は更
に上記遺伝子に幾多の突然変異を起させて部分変更を行
なったがこれは天然のタンパクの免疫特性のすべて又は
いくらかを保持しているタンパク同族体を与える。これ
ら突然変異のいくらかは、オリジナルのものより小さい
けれど依然として免疫原性でありうるようなものへの一
部削除である。従って本発明はまた、ヘモフイルス イ
ンフルエンザｂ型菌の天然タンパクの免疫特性の少なく
とも一部を持つタンパク又はペプチドを与えるものであ
りこれらは、前記の特有の塩基配列又はそれと実質的に
相同の遺伝子変異物の断片であり適当なベクターの中で
発現を起させる。

特にその遺伝子はヘモフイルス インフルエンザｂゲ
ノムとして染色体に再構成されるものである。

本発明で用いられる天然ヘモフィルス インフルエン
ザｂ型菌のP2タンパクからこのP2免疫特性の少なくとも
一部を持つタンパク又はペプチドを得ることもできる。

このタンパク又はペプチドは適当な発現系例えばＥ．
coli、バチルス、BCG、酵母、バキュロビールス、アデ
ノビールス又は哺乳動物の発現系から得られるであろう
組換えタンパク又はP2タンパクフラグメントであろう。

一方これらタンパク又はペプチドは合成によっても得
られよう。

このP2アミノ酸配列に由来する免疫タンパク又はペプ
チドはワクチンの構成の一部となり得よう。

P2タンパクは防御性抗原能力を持っているから、発明
者等によってコンジュゲートワクチンの一部として使用
され、そこではコンジュゲートのハプテン部分はヘモフ
イルス生物体のカプセル多糖類部分であった。

これはコンジュゲートタンパクにジフテリア毒素を用
いる際に（ヨーロッパ特許第0098581を参照）起る、ジ
フテリヤに対する過免疫の可能性を避けることができ
て、病気に対して、特に小児において、良好な防御を保
証する。

更に加えて、発明者等はワクチンにあって抗原として
作用しうる、P2タンパクのＮ−及びＣ−末端にそれぞれ
対応するアミノ酸配列の２種類のペプチドを固相法で合
成した。

これらのペプチドはコンジュゲートワクチンに使用で
きる。

本発明には更に、ヘモフイルス インフルエンザｂ型
菌培養物から抽出精製した生物学的に純粋な天然P2タン
パク質を提供するものでそれを得る方法には尿素溶液中
に培養物を溶解させる方法を含む。

第１図には精製P2タンパクのＮ−末端アミノ酸配列、
逆転写による塩基配列及びP2遺伝子単離に使ったオリゴ
ヌクレオチドプローブを示している。

第２図は、P2遺伝子の為のシーケンシングストラテジ
ーを示す。EcoR I断片とPvu II断片はM13に両方向にク
ローニングし、矢印で示したようにM13プライマーと20
−merオリゴヌクレオチドプライマーでジデオキシ法で
シーケンスした。P2遺伝子に対する領域はボックスで示
した。オープンボクッスは成熟タンパクを示し、ソリッ
ドボックスはシグナルペプチドを示す。

第３図は、Durst（OMPサブタイプ2L）、8358種（OMP
サブタイプ6U）及びMinnA（OMPサブタイプIH）よりのP2
遺伝子の全塩基及びそれに由来するアミノ酸の配列を示
す。OMPサブタイプ3Lから単離したP2遺伝子は、MinnA
P2遺伝子のものと同一であるから示していない。

第４図は、P2遺伝子の再構築を示す。1700bp EcoR I
断片を含むM13ファージは、翻訳開始部位でのNde Iサイ
トをオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発に付した。こ
のファージはmP2A1と命名した。mp2A1複製フォームを分
離してP2遺伝子のＮ−末端を含む約600bpのフラグメン
ト（斜線で示す）をpT7−７にクローニングしてpRSM432
を作った。P2遺伝子の３′−部分を含む−1kbpのEcoR I
−Pst I断片（ソリッドバー）とおよそ500bpの３′でそ
の遺伝子に対するもの（オープンバー）をmP2Bの複製フ
ォーム、Pvu II断片を含むM13ファージから得てpRSM478
を作り出すためのpRSM432にクローニングした。ベクタ
ーシーケンスは線で示した。P2遺伝子の位置と、T7φ10
プロモーターからの転写の方向は矢印で示した。

第５図は、JM101（pRSM478）のウエスターンブロット
解析を示す。第１列は分子量のマーカーを含む。第２列
はヘモフイルス インフルエンザｂ型MinnAの外皮タン
パクに富む界面活性剤不溶フラクションを含む。第３か
ら第５列は、次の菌株の超音波破砕物を含みそれに抗−
P2抗血清で発色させたものである。ヘモフイルス イン
フルエンザｂ型MinnA（３列）、JM101（pRSM478）でイ
ンデュースしていないもの（４列）及びJM101（pRSM47
8）でmGP−１でインデュースしたもの（第５列）であ
る。

ヘモフイルス インフルエンザ（Heamophilus influ
enzae）ｂ型MinnA株からの外皮膜プロテインP2（outer
membrane proteinP2）をコードする遺伝子がゲノムライ
ブラリーからクローニングされ、このヌクレオチド配列
が決定された。P2遺伝子の全配列を含み、重複部を有す
るEcoR I及びPvu IIゲノム断片（genomic fragments）
が同定され、クローンが第１図に示す配列を有する混合
オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼー
ションによりスクリーニングされた。P2遺伝子の配列決
定の際には、第２図に示す切断部位を利用した。第３図
にMinnA株からのP2遺伝子の完全なヌクレオチド配列及
び該ヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸配列を示
す。この誘導されたアミノ酸配列は化学的に同定された
タンパク質における配列と、すなわちＮ末端配列及びト
リプシンとしての作用を有する内在ペプチドの配列にお
いて同一であった。このP2遺伝子から誘導されたP2のア
ミノ酸組成（理論値）は、実際の化学分析値と、測定誤
差範囲内の違いはあるが、一致した。４つのクローンが
更に他の単離物から、Pvu IIフラグメントとしてあるい
はP2遺伝子のPCR増幅（polymerase chain reaction amp
lification）によって単離された。その際、遺伝子及び
誘導アミノ酸配列は高率で保存されていることが見い出
された。これらのヌクレオチド遺伝子及びその誘導配列
は、対応するMinnA株の配列と比較された（第３図）。

P2遺伝子の再構築は、隣接する５′側を構成するフラ
グメントと３′側を構成するフラグメントの再結合によ
り行なわれた。その一列が後述の実施例２に示されてい
る。この実施例では、P2遺伝子の５′側を構成するフラ
グメントの翻訳開始部位に、部位指定突然変異（site d
irected mutagenisis）によりNde I切断部位を形成し、
形成されたNde I切断部位を利用して、Nde I−EcoR Iフ
ラグメントを発現ベクタープラスミドpT7−７にクロー
ニングし、更にP2遺伝子の３′側部分及びその下流部の
配列を含むEcoR I−Pst Iフラグメントをクローニング
された前記Nde I−EcoR Iフラグメントのすぐ下流にク
ローニングすることにより、全P2遺伝子の再構築が行な
われた（第４図）。この構築は、ａ）P2遺伝子の翻訳開
始部位までの５′側の配列を除去し、ｂ）Ｅ．coli中で
のP2遺伝子の非調節発現は致命的であるので、P2遺伝子
を調節プロモーターのコントロール下に置くことにより
行なわれた。MinnA株からのP2遺伝子がＥ．coliで発現
され、対応する大きさの遺伝子産物が生産された。この
遺伝子産物は、ヘモフィルスから精製されたP2プロテイ
ンに対して調製されたうさぎ抗血清により確認された。

Ｅ．coli中でのP2発現の毒性を減少させるための一方
法として、リーダーペプチドをコードする配列を除去
し、融合タンパクあるいはメチオニンにより始まる成熟
タンパクとしてP2を発現させることが行なわれた。ま
た、他の方法として、該遺伝子の断片あるいは頭部（尾
部）を欠失させた遺伝子（truncated genes）をそれぞ
れ単独であるいは融合タンパクの一部として発現させる
ことができる。後述の実施例３は、そのような融合タン
パク（２種）の形成を示す。一つは、Ｎ末端アミノ酸と
してのアラニンが欠失した成熟P2タンパクをコードする
配列を含む。２番目のものは、ユニークなEcoR I切断部
位までのP2遺伝子の３′側部分をコードする配列を含
む。これらの配列の両方がベクターpT7−７に挿入さ
れ、転写開始部位、翻訳開始コドン及びpT7−７中にあ
るバクテリオファージT7プロテイン10遺伝子のマルチク
ローニング領域からのDNA配列によりコードされる種々
のアミノ酸を有することになる。

これら組換え融合プロテインの半精製品に対して調製
された抗血清は、ヘモフイルス インフルエンザ中に生
産されたP2プロテインと反応し、このことにより、これ
ら融合タンパク及び組換えP2フラグメントは、天然のP2
を認識する抗体を誘導できることが示された。

P2遺伝子あるいはその断片は、Ｅ．coli中で他の調節
プロモーターのコントロール下でも好適に発現させるこ
とができる。また、リーダーペプチドなしでも発現させ
ることができる。更に、その毒性が問題とならないとこ
ろで、他のクローニング系で発現させることができる。
該遺伝子及びその断片は、適当なプライマーを用いたPC
R（polymerase chian reaction）により（後述の実施例
１参照）合成することができ、また、その毒性を避ける
ことができる場合には、Ｅ．coliあるいは他の適当な宿
主中に、適当なクローニングベクターやバクテリオファ
ージベクターを用いて直接クローニングすることもでき
る。好適な発現系としては、グラム陽性細菌、牛痘、ウ
イルス、アデノウイルス、バクロウイルス（baculoviru
s）、酵母、カビ、BCGあるいは哺乳類を用いた発現系を
挙げることができる。

調節された酸加水分解で調製したヘモフィルス オリ
ゴ糖（HPRP:Haemophilus oligosaccharides）が、臭化
シアン反応を利用して、精製されたP2プロテインと接合
された。この接合に用いられたPRPの平均分子量は、約2
0,000ダルトンと同定された。また、この接合にはリン
カーは使用されなかった。過剰のパプテンを得るため
に、PRPとプロテインの比（PRP）／（プロテイン）とし
て、約７のものが用いられた。反応後の生産物の分析で
は、（PRP）／（プロテイン）は約0.1であった。この接
合体のうさぎでの免疫原性が試験され、第１次及び第２
次抗PRP免疫応答が観察された（後述の表１参照）。イ
ムノブロッティングによる分析において、うさぎの抗−
PRP−P2抗血清は、P2に対して強い反応性を示した。こ
のデータは、ジフテリアや破傷風のトキソイドが接合プ
ロテイン（conjugation protein）として使用される際
に、ジフテリアや破傷風に対する過免疫の可能性の問題
を避けるために、コンジゲートワクチン（conjugate va
ccine）の担体プロテインとしてP2が利用できることを
示している。更に、P2プロテインに対する抗体によって
付与される同型防御の結果として、ワクチンとしてのPR
P−P2は、特に乳児や幼児におけるヘモフイルス イン
フルエンザｂ型感染に対するより確実な防御を保証し得
る。

P2のポリン活性（Porin activity）及びP2に対する抗
体のラットを用いた菌血症モデルでの防御性から、本発
明者らはP2の防御エピトープの確認、及びP2をベースと
したヘモフイルス インフルエンザｂ型ワクチンに組み
入れるべきP2の機能領域の位置及び特性の分析を行なう
ためのプローブの作成を行なうことを決定した。Ｎ−及
びＣ−両末端は、P2プロテイン配列のキーテードーリト
ルプロット（Kyte−Doolittle plot）において親水性で
あると予想されたので、この両末端がまず研究の対象と
された。Ｃ末端及びＮ末端のそれぞれにシステインが付
加されたポリン−Ｉ（porin−I,アミノ酸残基No.1〜1
4）及びＣ−HIBP2（アミノ酸残基No.314〜341）ポリペ
プチドが化学的に合成された。ペプチドの一方の末端に
ユニークなシステインを有することは、特異的な方向で
の担体プロテインとのカップリングを可能とする。２機
能性クロスリンカー（cross−linker）であるスルホ−S
IAB（Sulfo−SIAB）が、担体プロテインとシステイン含
有ペプチドとのカップリングのための試薬として、ｍ−
マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシサクシニミド
エステル（MBS:m−maleimidobenzoyl−Ｎ−hydroxysu
ccinimide ester）よりも良好であることが判明した。

はつかねずみ及びモルモットにおいて天然P2に対して
生じた抗血清との両合成ペプチド、すなわちポリン−１
及びＣ−HIBP2の反応性がペプチド特異的ELISA法により
評価された。全ての抗P2抗血清がＣ−HIBP2ペプチドを
良く認識したが、ポリン−Ｉとは反応しなかった。この
データは、P2の主要な免疫優性Ｂ細胞エピトープはＣ末
端領域（残基No.314〜341）中にあることを示してい
る。

合成された上記のペプチドが、ワクチンとして利用で
きるかどうかを決定するために、ペプチド−KLHコンジ
ュゲートの免疫原性が個々に評価された。うさぎが免疫
され、抗ペプチド抗血清がELISA、二重免疫拡散法及び
イムノブロッティング法により評価された。うさぎ抗血
清は、免疫に用いたペプチドに対する単一特異性をELIS
Aにおいて示した。ポリン−Ｉに特異的な抗体及びＣ−H
IBP2に特異的な抗体のいずれも全てのアッセイにおいて
P2を認識した。この結果は、両者の末端領域が露出して
おり、かつ抗体との相互作用がないことを示している。
両者のペプタイドにおけるKLHとのコンジュゲート体
は、いずれも強い抗体応答をうさぎにおいて誘発させた
ので、これらがワクチンの調製において抗原として作用
できることは明らかである。

本発明の中において明白に述べられていないが、分子
生物学、タンパク生物化学、ハイブリドーマテクノロジ
ーの方法を用いる。また、ここに示す実施例は科学文献
に十分に報告されているものであり、それらの技術分野
の熟練した能力の範囲内で十分である。

実施例１ 本実施例は、P2遺伝子のクローニングと配列を説明す
るものである。

染色体DNAをヘモフイルス インフルエンザｂ型から
通常の方法にて分離し、EcoR I,Pvu IIまたはPst I、あ
るいはPst IとPvu IIの混合物とを用いて完全消化し
た。消化したDNA2μｇを0.7％のアガロースのそれぞれ
のレーンに付し、操作指示に従ってハイボンド−Ｎメン
ブラン（Hybond−N membranes）に電気泳動し転写し
た。Ｎ−末端のシーケンスデーターと［α−³²P］−ATP
でラベルした末端（end）をもとにして合成オリゴヌク
レオチド プローブを合成した。約1700bpのシングルEc
oR Iフラグメント、約1600bpのユニークPvu IIフラグメ
ントおよび約10,000bpのユニークPst Iフラグメントを
このプローブにハイブリダイズした。

染色体DNAをEcoR Iで消化し、1000〜2000bpのフラグ
メントを分離し、ベクターλ gt11にクローン化した。
E.coliは組み替えλ gt11にクローンに感染され、プラ
ークをハイブリダイゼーションによってスクリーニング
した。約1700bpのEcoR Iのフラグメントをバクテリオフ
ァージM13ベクターに移し、部分的にシーケンスした。
混合したオリゴヌクレオチド プローブをプライマーと
して使用することによってデオキシ シーケンス法を実
施した。付加されたプライマーは生成されたP2遺伝子の
５′末端が第２図のようにシーケンスされた。また、ユ
ニーク Pvu IIシートがリーダーペプチドに対してコー
ドされているDNAシーケンスの３′末端付近に同定され
た。

上述のように、P2遺伝子に含まれている遺伝子Pvu II
のフラグメントは約1600bpのサイズである。Pvu IIのフ
ラグメントの部分的ライブラリーはM13に生成され、第
２図に示されるようにシーケンスされた。

他のヘモフイルス インフルエンザ ｂ型からのP2遺
伝子は、Pvu II制限フラグメントとしてクローン化され
るか、またはポリメラーゼによるチェーンリアクション
（PCR）による遺伝子DNAの増幅のあとにクローン化され
る。

増幅に使用されたオリゴヌクレオチドは以下のとおり
である。

５′CTTGGATCCTTAATCGTTGGTGCATTCGCAGC および ５′GCAAAGCTTGCGAATCTTTCGATTCGCCT これらのオリゴヌクレオチドは５′末端に独自の切断
部位を含んでおり、遺伝子のPCR法（polymerase chain
reaction）の後でのクローニングを容易にする。クロー
ン化されたPvu II遺伝子フラグメントまたは増幅後のク
ローン化された遺伝子は十分にシーケンスされた。

実施例２ 本実施例は、Ｅ．coliのP2遺伝子の再構築と発現につ
いて説明するものである。構築するP2遺伝子に対してシ
ーケンス５′末端を除去し、P2遺伝子をベクターpT7−
７中において調節バクテリオファージT7プロモーターか
ら下流に再構築した。P2遺伝子の翻訳開始部位でNde I
部位を形成するために、約1700bpEcoR Iフラグメントを
含むクローンに部位指定の突然変異をおこなった。EcoR
Iフラグメントに対するNde Iは、pT7−７に再結合した
M13の複写型からサブクローン化された。その遺伝子の
リマインダーとしてEcoR I−Pst Iフラグメントが加え
られた。それを第４図に示した。その構成物をＥ．coli
のJMI01株にトランスフォームした。類似のサイズの複
製（recombinant）P2（rP2）が、抗−天然P2抗血清を用
いてウエスタンブロット法によって測定したとき、本株
の抽出物のなかから検出された（第５図）。バクテリオ
ファージT7RNAポリメラーゼ遺伝子をlacプロモーター／
オペレーターのコントロール条件のもとに、イソプロピ
ルチオガラクトシドの存在下において発現するバクテリ
オファージによる本菌株の感染がrP2合成のレベルを増
加させた。

実施例３ 本実施例は、P2エピトープを示す融合タンパクを生じ
る遺伝子の構築を示したものである。

ほとんどの成熟したP2タンパクをコードするDNAシー
ケンスを含むPvu II−Pst Iフラグメントと、P2遺伝子
の３′部位のコードシーケンスを含むEcoR I−Pst Iフ
ラグメントがpT7−７ベクターの中でクローン化され、
それはSma IとPst I又はEcoR IとPst Iでそれぞれ切断
された。

バクテリオファージT7遺伝子10を用いたフレームフュ
ージョンにおいて、タンパクがそれらのクローンの中に
生成された。ファージDE3に溶菌的であるE.coli、BL21
株の誘導株にその構成物を挿入した。DE3はラクトース
プロモーター／オペレーターのコントロール下にT7 RN
Aポリメラーゼ遺伝子を含んでいる。T7RNAポリメラーゼ
はイソプロピルチオガラクトシドの添加によって誘発さ
れた。その融合タンパク遺伝子の転写と翻訳が行われ
た。融合タンパクは不溶性の包括体に蓄積され、ソニケ
ーションによる溶菌の後で2Mのシュークロース上でペレ
ットさせることによって部分的に精製された。精製した
融合タンパクでネズミが部分的な免疫状態になった。こ
れらの抗血清はヘモフイルス インフルエンザによって
生産されたP2と認められた。

実施例４ 本実施例は、ヘモフイルス インフルエンザｂ型の培
養液からP2プロテインを精製する方法について示してい
る。

純粋のP2プロテインがEagen株の培養液のセタブロン
（Cetavlon）沈澱物から精製された。培養液ペーストを
4M尿素を含むPBSバッファーを用いてポリトロン中で90
秒間ホモゲナイズし、そのサスペンションを室温で90分
間撹拌した。8,000gで30分間遠心分離することによって
透明な上清が得られ、それをPBSで透析することによっ
て尿素を除去した。透析の間に沈澱が形成され、それを
8,000g、30分間の遠心分離により収集した。収集した沈
澱物を２％のオクチルグルコシド0.2％のソディウムデ
オキシコレートを含む100mMのトリスバッファー、pH8に
懸濁した。この段階で、SDSポリアクリルアミド電気泳
動分析（SDS PAGE分析）によれば、P2の調製は95％の精
製が達成されていた。

実施例５ 本実施例は、オリゴサッカライドとP2接合体の調製に
ついて示す。

ヘモフイルス インフルエンザ タイプｂからの精製
ポリサッカライド（PRP）はpH3.2の0.1Mクエン酸ナトリ
ウム中でセファクリルＳ−200カラムにおけるゲル濾過
によって測定される分子量サイズ15〜40、000ダルトン
の範囲になるように十分な時間をかけて80〜90℃まで加
熱された。PRPの反応液を0.85％塩化ナトリウムpH8.5と
6.7％トリエチルアミンハイドロクロライド中に25mg/ml
になるように希釈した。アイスバス中で撹拌しながら、
シアノ−ゲンブロミド（BrCN）の濃縮液（1gBrCN/1mlア
セトン）全量の1/10の量を１分毎に間隔をあけて５回加
えた。添加の間、pHは1.0N NaOHで8.0〜9.0に保った。
最終添加の後２分間、その反応混合物のpHを1.0Nの塩酸
で6.0まで下げた。活性化されたポリサッカライドは低
分子量の反応物を除去するため、４℃で0.85％塩化ナト
リウムに対して完全濾過することによって精製した。PR
P濃度は25mg/mlで維持した。

精製したP2タンパクは４℃で限外濾過によって約3.5m
gまで濃縮した。その後、1.0％アクチルグルコシドを含
む0.85％塩化ナトリウムに対して４℃で完全濾過し、ト
リスとデオキシコレートを除去した。完全濾過し、精製
したP2タンパクと完全濾過し、活性化したPRPを等量容
器中で混合しシールした。pHを8.5に調整し、その反応
混合液を４℃で15〜18時間振盪した。この時点では、未
反応のタンパク質またはPRPからその接合体を精製する
ための試みは行われていない。

混合物中のポリサッカライドとタンパク接合体は常法
によって測定された。

参考例１ 本実施例は、ペプチドの合成とペプチド担体の調製を
示している P2のＮ−とＣ−末端シーケンスに対応するペプチドは
個々にコマーシャルペプチド合成機中で合成され、続い
て酢酸を用いて樹脂から分離した。そしてVydacC4カラ
ムにおいて0.1％トフリフルオロ樹脂中のアセトニトリ
ルの濃度勾配（０〜40％）を用いて分離層HPLCによって
精製した。ペプチドプロテイン−１はＮ−末端シークエ
ンス（アミノ酸残基１〜14）と添加したシステインを含
んでいる。そのシーケンスは、Ala−Val−Val−Tyr−As
n−Asn−Glu−Gly−Thr−Asn−Val−Glu−Gly−Cysであ
る。ペプチドＣ−HIB P2はＣ−末端シークエンス（アミ
ノ酸基314〜341）と添加したシステインを含んでいる。
そのシーケンスは、Cys−Ala−Arg−Thr−Arg−Thr−Th
r−Glu−Thr−Gly−Lys−Gly−Val−Thr−Glu−Lys−Se
r−Val−Gly−Val−Gly−Leu−Arg−Tyr−Pheである。
免疫学的研究に対して用いられているすべての合成ペプ
チドはHPLC分析による判定で95％以上の精製度であっ
た。ペプチドの加水分解によるアミノ酸分析は理論的組
成と良く一致した。

個々のペプチドとKLH（keyhole limpet haemocyani
n）またはBSA（bovin serum albumin）との複合は、担
体タンパクに対してペプチドの分子量比が10:1の条件で
以下の装飾法を用いて常法（Liuet al..Biochemistry,1
8,690,（1979））に従って行った。担体タンパクはまず
スルフォスクシニル（４−ヨウドアセチル）−アミノベ
ンゾエート（Sulfo−SIAB）で修飾された。その修飾さ
れたタンパクはさらにゲル濾過HPLCによって精製され
た。ペプチドは引き続いて４〜６時間かけて担体タンパ
クと修飾され、ペプチド−担体タンパク複合体がゲル濾
過によって分離された。

実施例６ 本実施例は、プロトコルを動物に免疫性を与えるため
に使用し、抗血清を調製することのついて示している。

P2タンパクに特異的な抗血清と、ペプチドに特異的な
抗血清を以下のように調製した。すなわち、ウサギ、モ
ルモット、マウスのそれぞれに、フロインド完全アジュ
バンドにエマルジョンさせたP2、PRP−２及びこれらのK
LH接合体のそれぞれを個々に筋肉注射し免疫した。PBS
バッファ−500μｌ中に20〜500μｇ含まれる物質が注射
された。最初の注射から２週間毎にそれぞれの動物から
採血した。血清を遠心分離によって凝固血から分離し、
30分間56℃の加熱によって不活性化し、その後−20℃で
保存した。

実施例７ 本実施例ではELISAにおけるP2に対して特異的な調製
物を調製した。

P2ペプチド（５μg/ウエル）を、16時間、４℃でイン
キュベーションすることによってマイクロタイタープレ
ートの各ウエルに直接コートした。各ウエルは３％のウ
シ血清アルブミンを含むPBSで30分間の処理によりブロ
ックされた。次に、先に調製したP2に特異的な抗血清及
び各ペプチドに特異的な抗血清のそれぞれの所定の希釈
濃度シリーズをウエルに加えた。室温において２時間プ
レートがインキュベートされた。過剰の抗体は洗浄用の
バッファー（0.1％ツイーン20を含むPBS）で３回洗浄し
除去した。市販のプロテイン Ａ−ペルオキシダーゼ複
合体が各ウエルに添加され、プレートはさらに１時間室
温にてインキュベートされた。過剰のプロテイン Ａ−
ペルオキシダーゼを除去した後、プレートを洗浄用バッ
ファーで洗い、0.2mlのテトラメチルベンジジン（TMB）
を各ウエルに添加した。プレートを色が変化し終わるま
で暗所にてインキュベートした。反応を1N硫酸50μ添
加によって添加し、各ウエルをエリザ（ELISA）リーダ
ーを用いて450nmで測定した。

実施例８ 本実施例は、抗−P2抗血清を特徴化するイムノブロッ
テイング法の実施について示す。

天然のタンパクＰ−２、レコンビナントＰ−２、合成
KLH−ペプチド接合体及びPRP−P2接合体に対するウサギ
から調製した抗体は、イムノブロッティング法を用いて
その特性を試験した。文献に記載されている方法によっ
て（Towbin et al.Proc.Nat.Acid.Sci.,76,4350（197
9）、精製したネガティブなＰ−２とリコンビナントＰ
−２を電気泳動にかけ、続いてSDS−PAGEゲルからニト
ロセルロース膜に電気移動した。ニトロセルロース膜は
ネイティブなＰ−２、レコンビナントＰ−２、合成KLH
−ペプチド接合体、またはPRP−P2接合体に対して作用
のある様々なウサギ抗体の適正な希釈物で２〜４時間イ
ンキュベートした。抗血清は、洗浄バッファー（0.1％
トリトンＸ−100を含むリン酸バッファー塩）にて500倍
に希釈した。過剰の抗体が洗浄バッファーで３〜５回洗
浄することによって除去された。ゴート抗ウサギIgG抗
体が市販のアルカリ−フォスファターゼに接合され、第
２の抗体として使用される。

なお、poPRP−Ｍ−CRMは破傷風トキソイドとPRPのコ
ンジュゲートを、HPRP−P2はP2とPRPのコンジュゲート
を、HPRP−ＤはジフテリアトキソイドとPRPのコンジュ
ゲートをそれぞれ表わす。また、ポスト１は免疫後２週
間経過時における値を、ポスト２は４週経過時における
値を、ポスト３は６週経過時における値をそれぞれ示
す。

【図面の簡単な説明】 第１図は、精製P2タンパクのＮ−末端アミノ酸配列、そ
の逆転写による塩基配列及びP2遺伝子単離用オリゴヌク
レオチドプローブを示し、第２図は、P2遺伝子シーケン
シングストラテジーを示し、第３図はP2遺伝子とそれに
由来するアミノ酸の全配列を示し、第４図は、P2遺伝子
の再構築を示し、第５図は、JM101（pRSM478）のウエス
ターンブロット解析を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 ワシントン ユニバシティ セントルイ ス アメリカ合衆国 63110 ミズリー州 セントルイス サウス ユークリッド アヴェニュー 724 (72)発明者 ロバート エス．ムンソン、ジュニアー 米国 63011 ミゾリー州 ボールイン ナントツケツト ドライブ 340 (72)発明者 ロバート ダブリュ．トルアン 米国 46222 インデアナ州 インデア ナポリス ユージーン 2844 (72)発明者 ペレ チョング カナダ国 エル４ジエイ ２エス４ オ ンタリオ州 ソンヒル ボローズ スト リート 20 (72)発明者 ラファット ファーヒム カナダ国 エル５アール ２テイ２ オ ンタリオ州 ミシソーガ セレモニアル ドライブ 524 (72)発明者 パトリック マクヴェリイ 米国 18360 ペンシルヴアニア州 ス トロードスヴェーク ノルトン ロード （無番地) (72)発明者 ミシエル クレイン カナダ国 エム５エイ ３エム２ オン タリオ州 ウイローダール マンロー ブールヴァード 16 (56)参考文献 特開 昭63−190896（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−90517（ＪＰ，Ａ) Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｕｔｙ，Ｖｏｌ．56，Ｎｏ．10（Ｏ ｃｔ．1988）ｐ．2709−2716 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｕｔｙ，Ｖｏｌ．56，Ｎｏ．５（Ｍ ａｙ．1988）ｐ．1084−1089 阿南功−他４名編「基礎生化学実験法 ２ 抽出・分離・精製」（昭和49．９. 30)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】接合分子の形成方法であって、 （ａ）プロモーターの制御下にある、ヘモフィルス イ
   ンフルエンザｂ型1H株、2L株または6U株の外皮膜プロテ
   インP2をコードするDNA配列を含む発現ベクターを提供
   する過程と、 （ｂ）前記発現ベクターを細菌に導入して形質転換する
   過程と、 （ｃ）前記細菌において前記DNA配列にコードされた外
   膜プロテインP2を発現させて、ヘモフィルス インフル
   エンザｂ型から遺伝子操作によって得られた外膜プロテ
   インP2を供給する過程と、 （ｄ）前記過程（ｃ）で得られた外膜プロテインP2と、
   ヘモフィルス インフルエンザｂ型のポリリボシルリビ
   トール燐酸（PRP）カプセル多糖類部分とを接合する過
   程と を有し、 前記外皮膜プロテインP2が、1H株、2L株及び6U株から得
   られた以下に示すアミノ酸配列Ａ、Ｂ及びC: 及び、これらアミノ酸配列の一部を前記ヘモフィルスの
   カプセル多糖類部分に対する担体としての機能及びそれ
   自身の抗原性が損なわれない範囲内で変異させたアミノ
   酸配列からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する ことを特徴とする接合分子の形成方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の方法により得られた接合
   分子に薬学的に許容される担体を配合することを特徴と
   するヘモフィルス インフルエンザ ｂ型に対するワク
   チンの製造方法。
3. 【請求項３】請求項１に記載の方法で得られた接合分子
   と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする
   ヘモフィルス インフルエンザ ｂ型に対するワクチ
   ン。