JP2001510039A

JP2001510039A - 診断および治療に有用な呼吸器多核体ウイルスエピトープならびにそれらを含んでなる抗体

Info

Publication number: JP2001510039A
Application number: JP2000503193A
Authority: JP
Inventors: ティアン、ノック、ニュイアン; ウルタン、パワー; リリアンヌ、ゴスチ; アラン、ベック
Original assignee: ピエールファブルメディカマン
Priority date: 1997-07-17
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2001-07-31
Also published as: CA2296736A1; EP1003851A2; WO1999003987A3; CN1264425A; AU756110B2; BR9810907A; AU8812398A; FR2766192B1; FR2766192A1; WO1999003987A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、呼吸器多核体ウイルスＡもしくはＢのＧタンパク質の全配列、または少なくとも９８％の相同性を有する配列のそれぞれアミノ酸残基１５０〜１５９、１７６〜１８９、１９４〜２０７および１５５〜１７６の間に含まれるペプチド配列の中から選択される配列に相当する、呼吸器多核体ウイルスのＧタンパク質のエピトープに向けられたポリクローナルまたはモノクローナル抗体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、呼吸器多核体ウイルス、さらに詳しくは新規エピトープの同定、な
らびにこのウイルスによって引き起こされる症状の治療、予防および診断の分野
で特に有用な、これに対応する抗体に関する。

【０００２】呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は離乳していない乳児で、また年輩者で最も
よく遭遇する病原体の１つである。子供では細気管支炎がしばしば重くなり、入
院が必要となる。これまでにＲＳＶによって引き起こされる疾病に対する予防手
段はなく、最初のＲＳＶ感染は次回の感染の防御とならない。重症の場合、抗生
物質療法（リバビリン）および／または免疫療法（ヒト免疫グロブリン）の併用
による治療では病状の悪化を軽減することができない。しかしながらやはりこの
種の治療は依然として費用が高くつく。最近のＯＲＡＶＡＸ由来のモノクローナ
ル抗体ＨＮＫ２０（ＲＳＶＦタンパク質に向けられたもの）の臨床試験は、子
供におけるＲＳＶ感染に対する偽薬に比べ、治療において効果はなかった。ホル
マリンで不活性化したＲＳＶワクチンで６０秒間子供に感作させると、ＲＳＶの
自然感染に対して肺の防御を付与する代わりに、疾病を悪化させる結果となった
。この問題に伴って、現行の診断ではＲＳＶの感染を、少なくとも成人では信頼
性をもって確認することができない。

【０００３】ＲＳＶは、１０種の特異的タンパク質をコードし、負の極性を持ち、分接を持
たないＲＮＡを含んでなる肺炎ウイルス属のパラミクソウイルス科に分類される
。

【０００４】出願ＷＯ８７／０４１８５は、Ｆタンパク質（融合タンパク質）もしくはＧタ
ンパク質と呼ばれる外被タンパク質、２２Ｋｄの糖タンパク質、９．５Ｋｄのタ
ンパク質、または主要キャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）などのＲＳＶの構
造タンパク質をワクチンとして使用することを提案している。

【０００５】出願ＷＯ８９／０２９３５では、所望により単量体型または脱グリコシル化型
に改変された全ＲＳＶＦタンパク質の防御特性が記載されている。

【０００６】Ｆタンパク質の一連の断片が、それらの中和特性に関して調べるためにクロー
ン化されてきた。

【０００７】出願ＷＯ９５／２７７８７では、ＲＳＶのＧタンパク質が、ＲＳＶ亜群Ａまた
はＢによって引き起こされる症状の治療および／または予防を意図した生成物の
製造に使用できることが示されている。

【０００８】本発明では、今般、特異的エピトープを含有するＲＳＶのＧタンパク質の断片
が特に有利な特性を有していることがわかった。かくして特に下記の適用のため
の、ＲＳＶのＧタンパク質の新規ペプチド断片が製造できた：（ｉ）化学的方法により、もしくは遺伝子工学により担体と結合、または融合
させたこのペプチド断片は、投与様式にかかわらず、ＲＳＶ感染に対する有効な
ワクチンとなる；（ｉｉ）このペプチド断片は、ＲＳＶに感染した宿主の予防処置または治療処
置に極めて有効なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を作製するのに供
することができる；（ｉｉｉ）これらのペプチド断片およびモノクローナル抗体は、ＲＳＶ−Ａま
たはＲＳＶ−Ｂに感染した宿主における感染の確認および同定を可能にする診断
キットの試薬として使用できる。

【０００９】従って本発明の主題は、ＲＳＶＡもしくはＢのＧタンパク質の完全配列、または少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９８％の相同性を示す配列のそれ
ぞれアミノ酸残基１５０〜１５９、１７６〜１８９、１９４〜２０７および１５
５〜１７６の間のペプチド配列の１つから選択される配列に相当するＲＳＶのＧ
タンパク質エピトープに向けられたポリクローナルまたはモノクローナル抗体で
ある。

【００１０】これらの抗体は、ＲＳＶ亜群Ａまた亜群ＢのＧタンパク質のアミノ酸残基１３
０〜２３０の間の配列によって運ばれるペプチドを認識する。ＲＳＶＡのＧタンパク質のアミノ酸１３０〜２３０に相当するこの領域は、以
下Ｇ２Ｎａと示される。Ｇ２Ｎａは大腸菌(E. coli)などの細菌で産生され、それゆえグリコシル化されていないものであった。それは、特にグラム陰性菌、例
えばクレビシェラ属のＯｍｐＡ（ｐ４０タンパク質、ＷＯ９６／１４４１５に記
載）または連鎖球菌由来のタンパク質（ヒト血清アルブミン結合タンパク質など
、以下ＢＢと呼ぶ、ＷＯ９６／１４４１６に記載）などの担体と結合させた場合
、ＲＳＶの感染に対する免疫学的防御を付与する。

【００１１】予期しないことに、本発明に従い製造された一連のペプチドはＲＳＶ亜群Ａま
たは亜群Ｂに対する交叉防御を付与することがわかった。

【００１２】ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、特に、Ｇ２Ｎａにおける４つの残基のみが変えられ
た、すなわち、残基Ａｓｎ（ａａ１９１）、Ｌｙｓ（ａａ１９２）、Ｇｌｙ（ａ
ａ１９５）およびＴｈｒ（ａａ１９８）がそれぞれＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓおよ
びＰｒｏ残基で置換された、ＢＢＧ２Ｎａの誘導体である組換えタンパク質ＢＢ
Ｇ２ａ１が交叉防御ＲＳＶ−ＡまたはＲＳＶ−Ｂを付与する。同じく交叉防御を
増強する目的で２つの新規分子が作出され、すなわち、ＢＢＧ２ａ２は、残基Ａ
ｓｎ（ａａ１５７）、Ａｓｎ（ａａ１６０）、Ａｓｎ（ａａ１６１）およびＰｈ
ｅ（ａａ１６３）がそれぞれ残基Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、ＡｓｐおよびＴｙｐで置換さ
れたものであり；ＢＢＧ２ａ３は、ＢＢＧ２ａ１およびＢＢＧ２ａ２の残基の変
更を８つ含んでなる。

【００１３】本発明の特に有利なペプチドは、添付に示された特に配列番号１、配列番号２
、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８
、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配
列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列
番号１９、配列番号２０、配列番号２１および／または配列番号２２から選択さ
れる配列の１つを有し；かかるペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端の位置に少なく
とも１つのシステイン残基をさらに含んでなってもよい。

【００１４】ペプチドの反応性はモノクローナルまたはポリクローナルプローブによって証
明される。Ｇ２Ｎａの４つの領域、すなわち、Ｇ５ａ（ａａ１４４〜１５９）、
Ｇ１１ａ（ａａ１６４〜１７６）、Ｇ４ａ（ａａ１７２〜１８７）およびＧ９ａ
（ａａ１９０〜２０４）はこの技術により明らかにされた。

【００１５】従って本発明の主題はまた、配列番号１〜配列番号２２の少なくとも１つを有
するペプチドに向けられたモノクローナルまたはポリクローナル抗体でもある。

【００１６】ＲＳＶのＧタンパク質配列のエピトープ１５０〜１５９、１７６〜１８９、１
９４〜２０７および１５５〜１７６に相当する１以上のユニットを有するペプチ
ドは、本発明の種々の具体例に極めて有用であると考えられる。

【００１７】担体タンパク質と結合した本発明のペプチドは免疫原物質として有用である。

【００１８】担体タンパク質は有利には、グラム陰性菌のＯｍｐＡおよびそれらの断片、Ｔ
Ｔ（破傷風トキソイド）タンパク質、連鎖球菌のヒト血清アルブミン結合タンパ
ク質およびその断片、ならびにコレラトキシンＢ（ＣＴＢ）サブユニットから選
択され；好ましくは担体タンパク質はクルブシェラ属の細菌のＯｍｐＡである。

【００１９】本発明の１つの態様によれば、ペプチドは結合タンパク質を介して担体タンパ
ク質と結合しており、この結合タンパク質は、特に哺乳類血清アルブミン受容体
および粘膜細胞の表面に存在する受容体から選択されてもよい。

【００２０】この結合は好ましくは共有結合であり、それは化学的経路により、または組換
えＤＮＡ技術により達成されてもよい。

【００２１】従って、もう１つのその態様によれば、本発明の主題は、前記で定義したペプ
チドまたは免疫原物質をコードするヌクレオチド配列である。それは特に、担体
タンパク質をコードするＤＮＡ分子において、プロモーターを連結した、請求項
４および５のいずれかに記載のペプチドをコードするＤＮＡ、またはそれらの断
片の１つを挿入または融合することによって作出された雑種ＤＮＡ分子であって
もよく、それはまたＲＮＡ分子であってもよい。

【００２２】本発明のペプチド、抗体、免疫原物質およびヌクレオチド配列は医薬として、
さらに詳しくは、ＲＳＶ亜群ＡまたはＢによって引き起こされる症状の予防処置
または治療処置をいとした組成物の製造のために使用してもよい。例えば、Ｇ５ａおよびＧ１１ａおよびＧ１△Ｃａペプチドを特異的に認識する
モノクローナル抗体が作製された。モノクローナル抗体５Ｃ２（抗Ｇ５ａ）およ
び１８Ｄ１（抗Ｇ１△Ｃａ）の、未供試マウスへの受身移入により、一方でＲＳ
Ｖ−Ａの感染を防ぐことが可能となり、他方、同じくモノクローナル５Ｃ２によ
り、免疫抑制マウスで慢性的ＲＳＶ−Ａ感染を速やかに排除することが可能とな
る。

【００２３】従って本発明の主題はまた、少なくとも１種の本発明のモノクローナルもしく
はポリクローナル抗体、ペプチドもしくはエピトープ、前記に定義された免疫原
物質またはヌクレオチド配列と医薬上許容される賦形剤を含有することを特徴と
する医薬組成物でもある。

【００２４】モノクローナル抗体は組換え経路によりヒト化および産生されることが好まし
い。本発明のもう１つの態様によれば、それらはファージライブラリー法によっ
て得られる。

【００２５】本発明のペプチド、免疫原物質、抗体およびヌクレオチド配列は、本発明の１
つの具体例に従って診断キットの組成に封入される。

【００２６】前記で示されたように、免疫原物質は組換えＤＮＡ技術により、宿主細胞へ本
発明のヌクレオチド配列を導入することによって製造されてもよい。このヌクレ
オチド配列は、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスおよび／またはコス
ミド由来のＤＮＡベクターによって導入される融合遺伝子であってもよい。この
融合遺伝子は、本製造法の１つの具体例では、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。

【００２７】ベクターは当業者に公知のウイルスベクターであってもよい。宿主細胞は、特に大腸菌、バチルス菌、乳酸菌、ブドウ球菌および連鎖球菌か
らなる群から選択される原核生物であってもよい。

【００２８】しかしながら、宿主細胞は酵母菌、哺乳類細胞、植物起源の細胞、または昆虫
細胞であってもよい。

【００２９】本発明の方法の態様の１つによれば、融合タンパク質は発現し、分泌するか、
細胞質中に局在するか、または膜に露出する。

【００３０】以下、実施例により本発明を説明する。これらの実施例においては以下の図面
を参照する。

【００３１】実施例実施例１：ペプチドの合成ペプチドＧ５ａＣｙｓおよびＣｙｓＧ５ａの合成例略号：ＡＡ：アミノ酸Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニルＢＨＡ：ブロモヒドロスクシミジル酸ＣＥ：キャピラリー電気泳動ＥＳ−ＭＳ：エレクトロスプレー−質量分析法ＦＭＯＣ：フルオレニルメトキシカルボニルＦＺＣＥ：フリーゾーンキャピラリー電気泳動ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，
３，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートＨＭＰ：ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレンＭＢＨＡ：メチルベンズヒドリルアミンＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリドンＰｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相−高性能液体クロマトグラフィーＳＳＰＳ：固相ペプチド合成法ｔＢＯＣ：ｔ−ブチルオキシカルボニルｔＢｕ：ｔ−ブチルＴＦＡ：トリフルオロ酢酸Ｔｒｔ：トリチル

【００３２】ペプチドＧ５ａは、ＲＳＶ−ＡのＧタンパク質（１４４〜１５９）の断片に相
当する１６個のアミノ酸からなるペプチドである。これはＣ末端側からＮ末端側
に向かって始まる固相化学合成により得られる。ペプチドＣｙｓＧ５ａおよびＧ
５ａＣｙｓそれぞれ、Ｎ末端またはＣ末端側にシステインの付加を持つこのペプ
チドに対応し、これは担体タンパク質との特異的結合を意図したものである。こ
れら２種のペプチドにより、担体タンパク質と結合したペプチドの方向が観察さ
れた免疫原性に及ぼし得る影響を研究すことが可能となる。

【００３３】これらのペプチドは自動固相ペプチド合成装置によって、Ｃ末端側からＮ末端
側へ向かって合成された（０．１、０．２５または１．０ｍｍｏｌスケールのＦ
ＭＯＣ化学）。ペプチドＧ５ａの合成は、切断後にＣ末端側に遊離酸官能基が得
られるＨＭＰ型の樹脂、または切断後にＣ末端側にアミド官能基が得られるリン
クアミドＭＨＢＡ型の樹脂に予め添加されたプロリンで開始して行う。ペプチド
Ｇ５ａＣｙｓの合成は、これら樹脂のいすれかに予め添加されたシステインで開
始する。用いられるアミノ酸の側鎖の反応性のある官能基は、ＦＭＯＣ化学と適
合する基［Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）；Ａｒｇ（Ｐｍｃ）；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）；Ｇｌｎ（
Ｔｒｔ）；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ｓｅｒ（ｔＢｕ）；Ｔｈｒ（ｔＢｕ）］により保
護される。結合サイクルは以下の方法：ピペリジンによる第１のアミノ酸のＮ末
端アミン官能基の脱保護、ＨＢＴＵ／ＨＭＰによって結合される第２のアミノ酸
の酸官能基の活性化、および結合により行われる。合成が終了すると、ペプチド
を樹脂から切断し、水／ＴＦＡ混合物と反応させることにより側鎖を脱保護する
。このペプチドを予め−４０℃に冷却したエーテルで沈殿させ、混合物を遠心分
離する。ペレットをエーテルで３回洗浄し、次いで窒素で乾燥させる。このペレ
ットを０．１％ＴＦＡを含有する水に取る。この懸濁液を再び遠心分離し、ペプ
チドを含有する上清を樹脂を含むペレットから分離する。この未精製ペプチドを
部分分取逆相ＨＰＬＣにより精製する。精製されたペプチドの均一性は逆相ＨＰ
ＬＣにより、またキャピラリー電気泳動（ＦＺＣＥ）により確認する。理論構造
は、ＥＳ−ＭＳ型質量分析法で測定された質量と理論的アミノ酸配列から算出し
た質量との適合性を比較することにより確認する。

【００３４】ペプチドＣｙｓＧ５ＮＨ２合成：合成終了時のペプチド−樹脂の理論質量：５９３ｍｇ窒素のよる乾燥後に測定した質量：６１９ｍｇペプチド−樹脂の切断および未精製ペプチドの分析：２００ｍｇ（バッ
チの１／３）凍結乾燥後に切断した未精製ペプチドの質量：８４ｍｇ（ペプチ
ドの正味量の７５％、すなわち収率９７％）未精製ペプチドの均一性：９７％（ＲＰ−ＨＰＬＣ；ＵＶ２１０ｎｍ）９７％（ＦＺＣＮ／Microcoat（商標））

【００３５】精製：凍結乾燥後の精製ペプチドの質量：５０ｍｇ（ペプチ
ドの正味量の７５％、すなわち収率５８％）

【００３６】同定：精製ペプチドの均一性：＞９９％（ＲＰ−ＨＰＬＣ；ＵＶ２１０ｎｍ
）＞９９％（ＦＺＣＮ／Microcoat（商標）；ＵＶ２００ｎｍ））質量分析（ＥＳ−ＭＳ）算出質量：１９５１．２９Ｄａ測定質量：１９５０．８０Ｄａ±０．３１

【００３７】実施例２：ペプチドＧ５ａ、Ｇ７ａ、Ｇ８ａ、Ｇ９ａ、Ｇ１１ａおよびＧ１１ △Ｃａの担体タンパク質（Ｐ４０、ＢＢ、ＴＴ、ＫＬＨ）との結合ペプチドＧ１１△Ｃａのタンパク質Ｐ４０との結合例ペプチドＧ１１△Ｃａ（配列番号１４）はＲＳＶのＧタンパク質由来の１３個
のアミノ酸からなるペプチドである。それはこのタンパク質の配列１６４〜１７
６番に相当する。合成中、１７６番のＣｙｓ残基１つだけを保存し、かつ天然の
Ｇタンパク質には存在しない１−２ジスルフィド架橋（１−４／２−３対合）の
形成を妨げるように１７３番のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基で置換した。

【００３８】ペプチドをグルタルアルデヒド（ホモ二官能価試薬、アミンおよびチオール官
能基と結合する）により、または特殊な方法ではＢＨＡ（ヘテロ二官能価試薬、
Ｃ末端のシステインのチオール官能基と結合する）により結合させた。

【００３９】ＢＨＡとの特異な結合ペプチドＧ１１△Ｃａの溶解Ｇ１１△Ｃａ２ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液２ｍｌ、ｐＨ７＋０．１％Ｚｗ
ｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４に溶解させる。

【００４０】ヘテロ二官能価試薬（ＢＨＡ）による、タンパク質Ｐ４０との特異な結合ＤＭＦ２５μｌに溶解したＢＨＡ３ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７＋
０．１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４に対して予め透析したタンパク質Ｐ４
０２５ｍｇに添加し、室温で１時間攪拌した。ＰＤカラムで脱塩し、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７＋０．１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４で希釈した後、５００−μｌ画分を回収し、ブロモアセチル化したタンパク質の入った試験
管をペプチドＧ１１△Ｃａの溶液０．９５ｍｌの入った試験管に組み入れ（２８
０ｎｍでＯＤ読み取り）て加える。反応媒質を窒素で飽和させ、暗所にて室温で
２時間攪拌する。次いでその溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７＋０．１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４により、＋４℃で一晩、攪拌しながら透析し、
得られた溶液を冷凍保存する。

【００４１】ホモ二官能価試薬（グルタルアルデヒド）による、タンパク質Ｐ４０との結合Ｐ４０１０ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７＋０．１％Ｚｗｉｔｔｅｒ
ｇｅｎｔ３−１４で透析する。その濃度は０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９＋０．１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４で２ｍｇ／ｍｌに調整する。４％ＳＤＳ溶
液２００ｍｇを添加する。

【００４２】２．５％グルタルアルデヒド５５．５μｌを０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９＋０．１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４中、１ｍｇ／ｍｌのペプチドＧ１１△
Ｃａ溶液２．５ｍｌ、ｐＨ９〜１０に添加する。反応媒質を＋４℃で２４時間攪
拌し、さらに室温にする。１Ｍリジン２５μｌを添加して反応をブロックする。
溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７＋０．１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３− １４で、＋４℃で２４時間、攪拌しながら透析する。透析物を回収し、０．０２
ＭＫＣｌ溶液で６回沈殿させてＳＤＳを除去する。複合体Ｐ４０−Ｇ１１△Ｃａグルタルアルデヒドを含む最終上清を−２０℃で冷凍状態で保存する。

【００４３】複合体の滅菌沈殿の問題を避けるため、複合体を解凍して、濾過除菌（０．２２μｍ）し、
小分けして＋４℃で保存する。

【００４４】複合体の分析同定ローリー法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ型電気泳動（クマシブルーで染色）により、ま
た気相酸加水分解、ＰＩＴＣによる誘導体化、およびＨＰＬＣによる解析の後の
アミノ酸アッセイにより、タンパク質をアッセイすることにより複合体を同定す
る。

【００４５】

【表１】

【００４６】実施例３：遺伝子Ｇ２ａ１、Ｇ２ａの、発現ベクターｐｖａＢＢ３０８へのクローン化と大腸菌における融合タンパク質ＢＢＧ２ａ１およびＢＢＧ２ａ２の産生

【００４７】遺伝子Ｇ２ａ１（配列番号１５）、Ｇ２ａ２（配列番号１６）およびＧ２ａ３
（配列番号１７）のベクターへのクローン化の原理は図１および２に説明されて
いる。

【００４８】３．１Ｇ２ａ１の構築タンパク質Ｇ２ａ１（配列番号１５）をコードする遺伝子を、出発材料として
プラスミドｐＲＩＴ２８Ｇ２Ｎａを用いる位置指定突然変異誘発により構築する
。このため、２種のＰＣＲ反応（ポリメラーゼ鎖反応）を、一方はオリゴヌクレ
オチドＲＩＴ２９／ＴＨ１３７（ＰＣＲ１）、他方はＲＩＴ３０／ＴＨ１３６（
ＰＣＲ２）対を用いて、次の条件下：ＰＣＲ（９４℃ １５秒２５サイクル（５５℃ ３０秒（７２℃ ３０秒で行う。

【００４９】磁気ビーズへ付着反応１および２に対し、得られた各々２６２ｂｐおよび２０８ｂｐの断片を磁
気ビーズに付着させる。ストレプトアビジンに結合したＤＹＮＡＬ（登録商標）
Ｍ−２８０磁気ビーズ２５μｌを、Ｔ．Ｅ．緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ；１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で予め２回すすぎ、次いで１および２の増幅反応物９０μｌとともに、３７℃で２０分間インキュベートする。付着させた後、磁気
ビーズを０．１５ＭＮａＯＨ５０μｌとともに室温で１０分間インキュベートすることにより、その断片を変性させる。２種の上清を回収し、無水エタノール
で沈殿させ、Ｈ_２Ｏ５０μｌに再懸濁させる。

【００５０】伸長反応増幅反応物各１０μｌを使用し、ＰＣＲにより次の条件下：（９５℃ １５秒５サイクル（３５℃ ３０秒（７２℃ ３０秒でこれを行う。

【００５１】得られた断片をオリゴヌクレオチドＲＩＴ２７およびＲＩＴ２８とともに、Ｐ
ＣＲにより：（９５℃ １５秒２５サイクル（５５℃ ３０秒（７２℃ ３０秒で増幅する。

【００５２】増幅した５０９ｂｐの断片を制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化す
る。得られた１６９ｂｐの断片を同制限酵素で消化したベクターｐＲＩＴ２８へ
クローン化する。

【００５３】得られたプラスミドｐＲＩＴ２８Ｇ２ａｌの下流を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により記載されるプロトコールに従い、ダイ・デオキシ・ターミネーター化学で配列決定する。

【００５４】ｐＲＩＴ２８Ｇ２ａ１の下流（ＰｓｔＩ部位下流の断片）のＰｓｔＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片のベクターｐＲＩＴ２８Ｇ２Ｎａへのクローン化により、プラスミ
ドｐＲＩＴ２８Ｇ２ａｌを得る。

【００５５】次いでＧ２ａ１遺伝子を、発現ベクターｐｖａＢＢ３０８のＥｃｏＲＩ／Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ制限部位へクローン化して、ベクターｐｖａＢＢＧ２ａ１を作出する
。オリゴヌクレオチドに対する配列一覧表を下記に示す：ＲＩＴ２７：５’−ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧ−３’ ＲＩＴ２８：５’−ＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧ−３’ ＴＨＩ３６：５’−ＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＡＡＡＣＣＧ
ＡＣＣ−３’ ＴＨＩ３７：５’−ＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＧＧ−３
’ ＲＩＴ２９：５’でビオチン化したＲＩＴ２７ＲＩＴ３０：５’でビオチン化したＲＩＴ２８

【００５６】３．２Ｇ２ａ２（配列番号１６）の構築クローン化の原理は図２の下に模式的に示されている。

【００５７】この構築に用いるオリゴヌクレオチド対は、一方がＲＩＴ２９／ＴＮＧ１９３
（ＰＣＲ１）、他方がＴＮＧ１９２／ＲＩＴ３０（ＰＣＲ２）である。オリゴヌ
クレオチド配列を下記に記載する：ＴＮＧ１９２：５’−ＣＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴ−３
’ ＴＮＧ１９３：５’−ＣＧＡＡＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＴＣＧＧ−３’

【００５８】３．３Ｇ２ａ３（配列番号１７）の構築特異なＰｓｔＩ部位の上流および下流の２つの断片を、同一のベクターに組み
込み、ｐＲＩＴ２８Ｇ２ａ３を得た。

【００５９】挿入配列Ｇ２ａ１、Ｇ２ａ２およびＧ２ａ３の３断片を種々の発現ベクター、
特に発明者らの例ではＢＢがアルブミン受容体をコードする遺伝子である発現ベ
クターｐｖａＢＢ３０８にて大腸菌へクローン化した。得られた融合タンパク質
ＢＢＧ２ａ１、ＢＢＧ２ａ２およびＢＢＧ２ａ３は、ＨＳＡ−セファロース（ヒ
ト血清アルブミン）カラムで容易にアフィニティー精製できる。

【００６０】３．４融合タンパク質ＢＢＧ２ａ１およびＢＢＧ２ａ２の発酵および精製プラスミドｐｖａＢＢＧ２ａ１およびｐｖａＢＢＧ２ａ２で形質転換した大腸
菌ＲＶ３０８を各々、ＴＳＢ（ＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙＢｒｏｔｈ、Ｄｉｆｃｏ）培地２５０ｍｌおよびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）およ
びテトラサイクリン（８μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を含む２つのエルレンマイヤ
ーフラスコに接種する。その培地をＴ°＝３７℃で１６時間、攪拌しながらイン
キュベートする。この培養物２００ｍｌを、培地２リットルを含む発酵槽（ＣＨ
ＥＭＡＰＣＦ３０００、ＡＬＦＡＬＡＶＡＬ）に接種する。この培地は（ｇ／
ｌ）＝グリセロール５；硫酸アンモニウム、２．６；リン酸二水素カリウム、３；リン酸水素二カリウム、２；クエン酸ナトリウム、０．５；酵母抽出物、１
；アンピシリン、０．１；テトラサイクリン０．００８；チアミン、０．０７；硫酸マグネシウム、１および微量元素溶液１ｍｌ／ｌおよびビタミン溶液０．
６５ｍｌ／ｌを含む。発酵中に制御するパラメーターは；ｐＨ、攪拌、温度、酸
素化速度、栄養源の供給の組合せ（グリセロールまたはグルコース）である。ｐ
Ｈは７．０に調整する。温度は３７℃に設定する。増殖は一定の流速（１２ｍｌ
／時間）で供給するグリセロール（８７％）により制御し、溶存酸素圧シグナル
を３０％に維持する。培養物の濁度（５８０ｎｍで測定）が８０に達した時（培
養後約２４時間）、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を最終濃度２５ｍｇ／ｌで
添加することによりタンパク質の産生を誘導する。誘導後約４時間、細胞を遠心
分離により回収する。得られるバイオマス収量は湿潤バイオマス約２００ｇであ
る。ＢＢＧ２ａ１およびＢＢＧ２ａ２の産生収量はバイオマスｇ当たりタンパク
質約４〜６ｍｇである。

【００６１】湿潤バイオマス３０ｇの画分をＴＳＴ溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭｐＨ
８．０，２００ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５ｍＭＥＤＴＡ）７０ｍｌに再懸濁させる。この細胞を音波処理（Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ
７２４０１、Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌ）により溶解する。細胞溶解物を
遠心分離した後、上清を濾過し（１．２μｍ）、ＴＳＴ５００ｍｌで希釈する。このように可溶型で得られた融合タンパク質を(Stahl et al.、J.Immunol.Meth
ods、1989;124:43-52)により記載されるプロトコールに従い、アフィニティーカラム：ＨＳＡ−セファロース（ヒト血清アルブミン）で精製する。

【００６２】不溶性細胞溶解物は、遠心分離後、緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５，５ｍＭＭｇＣｌ_２）で１回洗浄する。洗浄後、ペレットを７Ｍ塩酸グアニジン、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）３０ｍｌに可溶化し、次いで３７℃で２時間インキュベート
する。可溶化したタンパク質を復元緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）；１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に添加する。可溶化した融合タンパク質を添加する前に、塩酸グアニジン濃度を復元緩衝液
中、最終濃度０．５Ｍに調整する。混合物を室温で１６時間、適宜攪拌しながら
、インキュベートする。遠心分離後、上清に溶解している融合産物をＨＳＡ−セ
ファロースカラムで精製する。精製した融合タンパク質は、ＭＩＮＩＰＲＯＴＥＡＮＩＩＳＹＳＴＥＭ装置（ＢＩＯＲＡＤＳ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１
２％）にて解析する。タンパク質をクマシブリリアントブルーＲ２５０で視覚化
する。さらに、ＲＳＶに特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングによる組換え
タンパク質の解析では、そのタンパク質に抗原性があることが示されている（図
３のＢＢＧ２ａ１のＳＤＳゲルおよび免疫ブロットの例を参照）。

【００６３】実施例４：Ｐ４０と結合するペプチドＧ５ａおよびＧ９ａの免疫原性ならびに防御効力材料および方法７個体のマウス群を腹膜内経路により、Ｐ４０−Ｇ９ａＣｙｓ、Ｐ４０−Ｃｙ
ｓＧ５ａ、またはＰ４０−Ｇ５ａＣｙｓ２０μｇで２回免疫化した。対照マウスはＰＢＳで免疫化した。Ａｌｈｙｇｒｏｇｅｌ（２０％ｖ／ｖ）を総ての免疫化のアジュバントとして用いた。最終の免疫化から２週間後、マウスの眼窩後
部静脈洞からサンプルを採取し、ＲＳＶ−Ａに関するそれらの血清変換を確認し
、１週間後、鼻腔内経路により、１０^５ＴＣＩＤ_５０ＲＳＶ−Ａで抗原投与し
、抗原投与から５日後に犠牲にした。肺を摘出し、肺のウイルス力価を決定した
。

【００６４】結果体液性免疫応答図４Ａで示されるように、ペプチドＧ５ａの免疫原性はＰ４０への結合の配向
による。ペプチドのＣ末端部での結合の後では、血清中に抗ＲＳＶ−Ａ抗体力価
を和らげるよう低く誘導され、他方、Ｎ末端部での結合の後では、Ｇ５ａはかか
る抗体を誘導しなかった。一般に、Ｃ末端部でＰ４０と結合したペプチドＧ９ａ
は、抗ＲＳＶ−Ａ抗体の誘導に関しては免疫原性が弱かった。Ｐ４０−Ｇ９ａＣ
ｙｓで免疫化した７個体のうち１個体のマウスは高い抗ＲＳＶ−Ａ血清抗体力価
を生じた。

【００６５】肺におけるペプチドＧ５ａおよびＧ９ａの防御効力図４Ｂで、また抗ＲＳＶ−Ａ抗体の検出との直接的な相互関係で示されるよう
に、ペプチドＧ５ａは、Ｃ末端部で結合した場合には防御的免疫応答を誘導した
が、Ｎ末端部で結合した後では誘導しなかった。実際に、Ｐ４０−Ｇ５ａＣｙｓ
で免疫化（Ｃ末端結合）した７個体中６個体のマウスでは肺にウイルスが存在せ
ず、防御されており、残りの１個体だけがアッセイ検出限界内でウイルスを保有
していた。他方、Ｐ４０−ＣｙｓＧ５ａで免疫化（Ｎ末端結合）したマウスの肺
は、ＰＢＳで免疫化した対照マウスと同程度の高さのウイルス力価を有していた
。これらの結果により、このペプチドの担体タンパク質への結合の配向がその防
御効力に不可欠であることが確実となる。防御と抗ＲＳＶ−Ａ抗体の誘導の相互
関係から、観察された肺の防御の少なくともある部分は、これらの抗体により媒
介されることが示唆される。

【００６６】マウスにおいてＰ４０−Ｇ９ａＣｙｓは、抗ＲＳＶ−Ａ血清抗体の誘導に関し
て免疫原性が弱いということにもかかわらず、ＲＳＶ−Ａの抗原投与に対し、７
個体中５個体のマウスの肺を防御した。実際に、７個体中１個体のマウスの肺に
はウイルスは存在しなかった、または血清中に抗ＲＳＶ−Ａ抗体の形跡すら示さ
なかった。

【００６７】結論ペプチドＧ５ａおよびＧ９ａは、肺におけるＲＳＶ−Ａの感染に対する防御エ
ピトープを含む。Ｇ５ａの担体タンパク質への結合の配向がその防御効力に不可
欠である。

【００６８】実施例５：ペプチドＧ７ａおよびＧ８ａの免疫原性および防御効力材料および方法３〜４個体のマウス群を腹膜内経路により、Ｇ７ａ、Ｇ８ａ、ＢＢ−Ｇ７ａ、
またはＢＢ−Ｇ８ａ２０μｇで２回免疫化した。対照マウスはＰＢＳで免疫化した。Ａｌｈｙｇｒｏｇｅｌ（２０％ｖ／ｖ）を総ての免疫化のアジュバントとして用いた。最終の免疫化から２週間後、マウスの眼窩後部静脈洞からサンプ
ルを採取し、ＲＳＶ−Ａに関してそれらの血清変換を確認し、１週間後、鼻腔内
経路により、１０^５ＴＣＩＤ_５０ＲＳＶ−Ａで抗原投与し、抗原投与５日後に
犠牲にした。肺を摘出し、鼻腔管を洗浄した。肺および鼻腔管のウイルス力価を
決定した。

【００６９】結果体液性免疫応答図５Ａで示されるように、ＢＢと結合した、またはそうでないペプチドＧ７ａ
およびＧ８ａは、ＲＳＶ−Ａに関して免疫原性があった。血清抗体力価を考慮す
れば、非結合ペプチドは、結合ペプチドよりわずかに免疫原性が高いと考えられ
る。

【００７０】肺におけるペプチドＧ７ａおよびＧ８ａの防御効力図５Ｂで示されるように、ＢＢと結合した、またはそうでないペプチドＧ７ａ
またはＧ８ａで免疫化した総てのマウスの肺はＲＳＶ−Ａの抗原投与に対し防御
され、ウイルスは存在しないか、またはアッセイの検出限界内でのみそうである
。

【００７１】結論ペプチドＧ７ａおよびＧ８ａは肺に関して防御的なエピトープを含む。ＢＢと
結合した、またはそうでないペプチドは有効である。

【００７２】実施例６：融合タンパク質ＢＢＧ２ａ１の免疫原性および防御効力材料および方法ＲＳＶ−ＡおよびＢに対するＢＢＧ２ａ１の免疫原性および防御効力を決定す
るために、３個体のマウス群を腹膜内経路により、タンパク質２０μｇで、２週間の間隔で、各々２回および３回免疫化した。対照マウスはＰＢＳで免疫化し
た。Ａｌｈｙｇｒｏｇｅｌ（２０％ｖ／ｖ）を総ての免疫化のアジュバントとして用いた。最終の免疫化から２週間後、マウスの眼窩後部静脈洞からサンプル
を採取し、ＲＳＶ−Ａに関してそれらの血清変換を確認し、１週間後、鼻腔内経
路により、１０^５ＴＣＩＤ_５０ＲＳＶ−Ａで抗原投与し、抗原投与５日後に犠牲
にした。肺を摘出し、肺のウイルス力価を決定した。

【００７３】結果ＲＳＶ−ＡおよびＢに関するＢＢＧ２ａ１の免疫原性図６ＡおよびＢに示される結果は、ＢＢＧ２ａ１が抗ＲＳＶ−ＡおよびＢ抗体
を誘導できることを実証する。予期されたように、抗ＲＳＶ−Ａ抗体力価は、抗
ＲＳＶ−Ｂ抗体力価よりかなり高い。それにもかかわらず、２系統のＲＳＶに対
する抗体力価は高い。

【００７４】ＲＳＶ−ＡおよびＢに関するＢＢＧ２ａ１の防御効力図６ＣおよびＤに示されるように、ＢＢＧ２ａ１を有するマウスの免疫化によ
り、ＲＳＶ−Ａの抗原投与に対し、およびＲＳＶ−Ｂの抗原投与に対し、肺を防
御できる免疫応答が誘導された。ＲＳＶ−Ａで抗原投与したマウスは防御され、
肺にウイルスが存在しないか（マウス３個体中２個体）、またはアッセイの検出
限界内でのみ（マウス３個体中１個体）そうであった。ＲＳＶ−Ｂで抗原投与し
たマウスは防御され、肺にウイルスが存在しないか（マウス３個中１個体）、ま
たはアッセイの検出限界内でのみウイルスを保有し（マウス３個体中１個体）、
またはこの検出限界を超えつつある（マウス１個体中３個体）のいずれかであっ
た。

【００７５】結論融合タンパク質ＢＢＧ２ａ１は、ＲＳＶ−Ａに関して、およびＲＳＶ−Ｂに関
して免疫原性が高かった。ＢＢＧ２ａ１は、ＲＳＶの２つの亜群の抗原投与に対
し、肺を防御する応答を誘導できる。

【００７６】実施例７：抗体１８Ｄ１、５Ｃ２および５Ｂ７の産生免疫化ペプチド：（ｉ）ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）に結合したＧ１△Ｃ
ａ、（ｉｉ）Ｇ２△Ｃａおよび（ｉｉｉ）ＢＢＧ２Ｎａ。マウスを０日に腹膜内経路により、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）中
の抗原２０μｇで、１４日に腹膜内経路によりＩＦＡ（不完全フロイントアジュ
バント）中の各抗原１０μｇで、次いで３８日に血管内経路によりアジュバント
なしの各ペプチド１０μｇで免疫化した。脾臓を摘出し、４２日に骨髄腫細胞Ｓ
Ｐ２−Ｏと１／１比で融合させる。各抗原に対し陽性のハイブリドーマを維持す
る。これらのハイブリドーマをマウスに注入して腹水を得、次いで得られた種々
の抗体を種々のペプチドにおいて選択し、得られた抗体の特異性を検定した。ペ
プチドＧ１△ＣａおよびＧ５ａに対するそれらの特異性により選択したモノクロ
ナール抗体１８Ｄ１および５Ｃ２は、ＲＳＶ−Ａを特異的に認識する。ＢＢＧ２
Ｎａから得られ、かつペプチドＧ１１ａを認識するモノクロナール抗体５Ｂ７は
、ＲＳＶ−Ａを認識する。

【００７７】実施例８：ＳＣＩＤマウスにおいてもたらされるモノクロナール抗体１８Ｄ１および５Ｃ２の慢性ＲＳＶ−Ａ感染症への治癒効果材料および方法Ｃ．Ｂ−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに、鼻腔内経路により、ＲＳＶ−Ａの１０^５ＴＣＩＤ_５０５０μｇで抗原投与した。２６日後、各群につき７個体の
マウスに、鼻腔内経路により、抗ＲＳＶ−ＡＥＬＩＳＡ力価１０^４で抗体１８
Ｄ１または抗体５Ｃ２の調製物５０μｌを施した。対照マウスには抗ＢＢＥＬＩＳＡ力価１０^４で抗ＢＢ血清を施した。これらのマウスを５日後に犠牲にし、ウイルスの滴定のためにそれらの肺を摘出した。

【００７８】結果図７に示される結果は、モノクロナール抗体１８Ｄ１および５Ｃ２が、ＳＣＩ
ＤマウスのＲＳＶ−Ａの慢性感染を排除できることを実証する。犠牲にした際に
肺ではウイルスの痕跡は検出されなかった。５Ｃ２で処理したマウスの肺で得ら
れた結果はアッセイの検出限界の平均に対応し、限界は利用可能なサンプルが少
ないためにより高くなり、ウイルスの存在は認められなかった。

【００７９】結論モノクロナール抗体５Ｃ２および１８Ｄ１は、肺のＲＳＶ−Ａ感染に関する治
療薬として用いることができた。

【００８０】実施例９：マウスのＲＳＶ−Ａ感染におけるモノクロナール抗体１８Ｄ１の予防効果材料および方法ＲＳＶ−Ａに対して血清反応が陰性である未供試のＢＡＬＢ／ｃマウス群に、
腹膜内注入により、抗ＲＳＶ−ＡＥＬＩＳＡ力価１０^５に調整した抗体１８Ｄ
１の調製物２００μｌを施した。腹膜内注入の対照マウス群には、同時に抗Ｐ４
０ＥＬＩＳＡ力価１０^４に調整した抗Ｐ４０血清（無関係な血清）の調製物２
００μｌを施した。翌日、総てのマウスに鼻腔内経路により、ＲＳＶ−Ａの１０ ^５ＴＣＩＤ_５０を含むウイルス懸濁液５０μｌで感染させる。それらを５日後に犠牲にし、肺のウイルスを検定する。

【００８１】結果図８Ａに示されるように、抗体１８Ｄ１は、腹膜内注入後、ＲＳＶ−Ａの抗原
投与中の未経験マウスの肺レベルで防御を誘導できる。力価１０^５の１８Ｄ１２００μｌの注入後、総てのマウスが防御される。７個体中３個体のマウスは肺
にウイルスが存在せず、防御された。他のものはアッセイ検出限界内でのみ（マ
ウス７個体中３個体）、またはこの検出限界を超えたところで（マウス７個体中
１個体）ウイルスの痕跡を示す。対照マウスは肺グラム当たりｌｏｇ_１０３．７
０〜４．４５の力価を有する。

【００８２】結論抗体１８Ｄ１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺のＲＳＶ−Ａ感染を予防することが
できる。それは本質的な予防効力を示す。

【００８３】実施例１０：マウスのＲＳＶ−Ａ感染におけるモノクロナール抗体５Ｃ２の予防効果材料および方法ＲＳＶ−Ａに対して血清反応が陰性である未供試マウスに、鼻腔内注入により
、抗ＲＳＶ−ＡＥＬＩＳＡ力価１０^４に調整した５Ｃ２の調製物５０μｌを施
した。対照マウスには、同時に抗ＢＢＥＬＩＳＡ力価１０^４に調整した抗ＢＢ
血清を施した。

【００８４】翌日、総てのマウスに、鼻腔内経路により、ＲＳＶ−Ａの１０^５ＴＣＩＤ_５ _０を含むウイルス懸濁液５０μｌで感染させる。肺のウイルスの滴定のため、そ
れらを５日後に犠牲にした。

【００８５】結果図８Ｂに示されるように、１０^４の５Ｃ２で処置した総てのマウスは肺レベル
で防御された。７個体中１個体のマウスだけはウイルスの形跡を示す。対照マウ
スは肺のグラム当たりｌｏｇ_１０３．７０〜４．７０の力価を有する。

【００８６】結論抗体５Ｃ２は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺のＲＳＶ−Ａ感染を予防することがで
きる。それは本質的な予防効力を示す。

【００８７】実施例１１：ペプスキャン：Ｇ２Ｎａのａａ１３０〜２３０の配列を包含し、かつ１つのアミノ酸が重複する９４のオクタペプチドの多系合成例並行して合成された９６オクタペプチドの「ペプスキャン」プレート（２つの
対照ペプチド＋ＲＳＶ−ＡのＧタンパク質の配列１３０〜２３０を包含する９４
のペプチド）を、Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81, 3998-40
02により記載されるＭＵＬＴＩＰＩＮ（商標）技術に従い調製する。

【００８８】これらのペプチドをモノクロナールまたはポリクロナール抗体（血清）のスク
リーニングを直接行うＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートの９６相補「ピン」
（８×１２）の末端の固相支持体上で合成する。・

【００８９】ピンおよびウェルの位置を同定するための系用いるナンバリングシステムは、次の通り：位置Ａ１（１）＝プレート番号Ａ、ライン１（１２ライン）、カラム１（ＥＬＩ
ＳＡの位置Ｈ１）位置Ａ２（１）＝プレート番号Ａ、ライン２、カラム１（ＥＬＩＳＡの位置Ｈ２）Ａ１（１）：対照ペプチド＃１：ＰＬＡＱＧＧＧＧＡ２（１）：対照ペプチド＃２：ＧＬＡＱＧＧＧＧＡ３（１）：オクタペプチド＃１：ＴＶＫＴＫＮＴＴＡ４（１）：オクタペプチド＃２：ＶＫＴＫＮＴＴＴ他Ａ１２（８）：オクタペプチド＃９４：ＫＥＶＰＴＴＫＰ

【００９０】合成合成は、所望のペプチド配列が得られるまでの脱保護、洗浄および結合の数サ
イクルに当たる。合成の終了時、側鎖を脱保護する工程の前にペプチドをＮ−ア
セチル化する。

【００９１】ピン上での合成に用いるアミノ酸は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル）基および以下の側鎖保護基：セリン、トレオニンおよびチロシンに対
するｔ−ブチルエーテル（ｔＢｕ）、アスパラギン酸およびグルタミン酸に対す
るｔ−ブチルエステル（ＯｔＢｕ）、リジン、ヒスチジンおよびトリプトファン
に対するｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、アルギニンに対する２，２，５，
７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、システイン、アス
パラギンおよびグルタミンに対するトリチル（Ｔｒｔ）により保護される。酸官
能基の活性化は、ＤＭＦに溶解したジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）お
よび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）によって行う。

【００９２】Ｆｍｏｃによる脱保護および洗浄：ピンのプレートを室温で２０分間、攪拌しな
がら、ＤＭＦ中２０％のピペリジン溶液２００ｍｌ（４０／１６０ｍｌ）の入っ
た槽に浸漬する。次いで、ピンを槽から取り出す。過剰の溶媒を、ピンのブロッ
クをペーパークロスにあてて除去する。ピンを室温で２分間、攪拌しながら、Ｄ
ＭＦ２００ｍｌ中で洗浄する。ブロックをペーパークロスにあて、攪拌しながら
２分間、ＭｅＯＨ槽に完全に浸漬する。さらに、そのピンをＭｅＯＨ２００ｍｌに浸漬する（２分間３槽、２００ｍｌ／槽）。このプレートを３０分間乾燥さ
せる。

【００９３】Ｆｍｏｃ−アミノ酸結合：Ｆｍｏｃ−アミノ酸は、それらが結合する前に活性化
工程を施す。結合工程の持続時間は、ＨＯＢｔ１．５当量およびＤＩＣ１．２当量を含む濃度１００ｍＭに対して２時間である。ソフトウェアにより結合工程
に必要な試薬量の算出が可能である。アミノ酸の１文字コードのアルファベット
順に配置された試験管で秤量を行う。１枚のペーパークロス上でスケールまで試
験管を満たし、次いで秤量板に表示されるものに近似した質量が得られるまで秤量する。質量は理論量よりも０．２ｍｇ低いか、または０．９ｍｇ高くあって
はならない。

【００９４】結合工程：ピンを静かにウェルに入れる。箱を注意深く閉め、結合の持続時間の
間、アミノ酸濃度１００ｍＭで２時間、有毒ガス排出装置付き実験容器に置く。
２時間の結合により、１日当たり３回の結合が実施可能である。

【００９５】結合後のピンのブロックの処理：ピンを結合溶液の入ったプレートから取り出し
、５分間、攪拌しながらＭｅＯＨ２００ｍｌで洗浄する。ブロックをペーパーク
ロスにあて、２分間乾燥させる。次のサイクルの脱保護を行う前には、そのブロ
ックをＤＭＦ２００ｍｌ中に入れ、５分間攪拌しながら洗浄する。便宜には、プ
レートを洗浄し、最後の結合後、前記のＦｍｏｃ基の切断工程を施す。

【００９６】末端アミノ酸のアセチル化：ピンの頭部を以下の反応混合液：ＤＭＦ／無水酢酸
／トリエチルアミン５０／５／１（ｖ／ｖ／ｖ）１５０μｌの入ったプレートのウェル中でインキュベートする。ブロックを室温で９０分間、箱に封入する。
次いでそのブロックをＭｅＯＨ２００ｍｌで１５分間洗浄し、さらに１５分間乾
燥させる。

【００９７】側鎖の脱保護：ピンを室温で２時間３０分間、ＴＦＡ／アニソール／エタンジチ
オール１９０／５／５ｍｌ混合物２００ｍｌに浸けることにより側鎖保護基を除去する。この脱保護工程後、ピンのブロックを酸溶液から取り出す。この箱を
ＭｅＯＨで１度すすぎ、さらにＭｅＯＨを満たし、結果としてピンのブロックは
そこに１０分間完全に浸漬される。次いでブロックをペーパークロスにあて、さ
らに１時間、ＭｅＯＨ／水／酢酸（１００／１００／１ｍｌ）混合物２００ｍｌ
中に浸漬し、再びペーパークロスにあてる。ブロックをデシケーターで真空下、
一晩置く。

【００９８】実施例１２：ＥＬＩＳＡピンを有するプレートを３７℃で１時間、飽和緩衝液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ、１％ゼラチン）に浸漬し、１０分間ＰＢＳで洗浄し、予め希釈した、解
析される血清とともに、４℃で一晩攪拌しながらインキュベートする。次いで、
プレートを１０分間、ＰＢＳで４回洗浄し、ペルオキシダーゼで標識した、１／
５０００希釈の二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳで
４回洗浄した後、ＴＭＢ基質を添加する。硫酸の添加により反応を停止させる。

【００９９】抗ＢＢＧ２Ｎａハツカネズミ血清のペプスキャンＢ法による解析から得られる
データの要約は図９に示されている。

【０１００】図９Ａおよび９Ｂは、Ｇ２Ｎａ分子（太字の残基（カッコで囲んだ残基）はＡ
ｃ／Ａｇ認識に重要な役割を果たすアミノ酸を表す）の４領域：配列が(Ｑ)Ｒ(Ｑ)ＮＫＰＰ(Ｎ)Ｋ(Ｐ)である、残基１５０〜１５９間に位置す
る領域１。この領域はペプチドＧ５ａ（１４４〜１５９）に含まれ、モノクロナ
ール抗体５Ｃ２の反応性ゾーンに相当する；配列が(Ｃ)ＳＮ(Ｎ)(Ｐ)Ｔ(Ｃ)(Ｗ)Ａ(Ｉ)(Ｃ)ＫＲ(Ｉ)である、残基１７６〜
１８９間に位置する領域２。これはペプチドＧ１△Ｃａ（１７４〜１８７）のレ
ベルに位置する領域であり、モノクロナール抗体１８Ｄ１および５Ｃ３の反応性
に相当する；配列が(Ｐ)(Ｇ)(Ｋ)ＫＴ(Ｔ)(Ｔ)(Ｋ)ＰＴＫＫＰ(Ｔ)である、残基１９４〜２
０７間に位置する領域３。この配列はペプチドＧ９（１９４〜２０４）のレベル
の反応性に相当し、その反応性はＢＢＧ２Ｎａに対して向けられたモノクロナー
ル抗体の産生中にすでに実証されている；種々の反応性の結果と思われる残基１５５〜１７６に達する広いゾーンにわた
り広がる領域４。分子Ｇ２Ｎａ（Ｇ１１ａ）の疎水性の高い領域を包含するこれ
らの反応性の１つは、モノクロナール抗体５Ｂ７（ＢＡＬＢ／ｃマウスの候補ワ
クチンＢＢＧ２Ｎａによる免疫化の後に得られる）の認識ゾーンに相当し、その
ペプスキャンＢは下記の図１０に示されている、に対する抗ＢＢＧ２Ｎａマウスの血清反応性を示す。

【０１０１】このモノクロナール抗体は配列(Ｆ)(Ｅ)ＶＦＮ(Ｆ)(Ｖ)(Ｐ)（１６５〜１７２
）を認識する。

【０１０２】前記の４種の反応性は総て、さらに、各々の反応性に対して開発された異なる
ＥＬＩＳＡによる、抗ＢＢＧ２Ｎａ血清の滴定により確認された。表Ｉは抗ＢＢ
Ｇ２Ｎａ血清が、実際に「抗Ｇ４ａ、Ｇ５ａＣｙｓ、Ｇ９ａＣｙｓおよびＧ１１
△Ｃａ」活性を示すことを示している。

【０１０３】表Ｉ：抗ＢＢＧ２Ｎａ血清のｌｏｇ_１０で表した抗Ｇ４ａ、Ｇ５ａＣｙｓ、Ｇ９
ａＣｙｓおよびＧ１１△Ｃａ力価、参照ＢＥ−０２

【表２】

【０１０４】結論ペプスキャン技術による抗ＢＢＧ２Ｎａ血清の研究は、ＢＢＧ２Ｎａによるマ
ウスの免疫化により、領域１５０〜１５９、１７６〜１８９、１９４〜２０７お
よび１５５〜１７６に各々位置する４Ｂエピトープに対する抗体を産生すること
を示している。よってこの技術により、領域１６４〜１７６（Ｇ１１△Ｃａ）の
重要性が確認可能となる。

【０１０５】さらに、これらの結果はペプチドＧ４ａ、Ｇ５ａＣｙｓ、Ｇ９ａＣｙｓおよび
Ｇ１１△Ｃａの抗ＢＢＧ２Ｎａ血清の反応性に関するＥＬＩＳＡデータに完全に
一致する。配列表配列番号１の情報：Ｇ１△Ｃａ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１４アミノ酸、４２ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化１】配列番号２の情報：Ｇ１’△Ｃａ配列の型：アミノ酸配列の長さ：１４アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化２】配列番号３の情報：Ｇ１△Ｃｂ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１４アミノ酸、４２ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化３】配列番号４の情報：Ｇ１’△Ｃｂ配列の型：アミノ酸配列の長さ：１４アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化４】配列番号５の情報：Ｇ５ａ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１６アミノ酸、４８ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化５】配列番号６の情報：Ｇ５ｂ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１６アミノ酸、４８ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化６】配列番号７の情報：Ｇ７ａ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：３３アミノ酸、９９ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化７】配列番号８の情報：Ｇ７ｂ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：３３アミノ酸、９９ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化８】配列番号９の情報：Ｇ８ａ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：４３アミノ酸、１２９ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化９】配列番号１０の情報：Ｇ８ｂ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：４３アミノ酸、１２９ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化１０】配列番号１１の情報：Ｇ９ａ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１５アミノ酸、４５ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化１１】配列番号１２の情報：Ｇ９ｂ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１５アミノ酸、４５ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化１２】配列番号１３の情報：Ｇ１１ａ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１３アミノ酸、３９ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化１３】配列番号１４の情報：Ｇ１１△Ｃａ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１３アミノ酸、３９ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化１４】配列番号１５の情報：Ｇ２ａ1 配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１０１アミノ酸、３０３ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化１５】配列番号１６の情報：Ｇ２ａ２配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１０１アミノ酸、３０３ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化１６】配列番号１７の情報：Ｇ２ａ３配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１０１アミノ酸、３０３ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化１７】配列番号１８の情報：Ｇ９ｖ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１５アミノ酸、４５ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：タンパク質

【化１８】配列番号１９の情報：Ｇ５ｖ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１６アミノ酸、４８ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化１９】配列番号２０の情報：Ｇ４Ａ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１７アミノ酸、４２ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化２０】配列番号２１の情報：Ｇ４Ｂ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１７アミノ酸、４２ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化２１】配列番号２２の情報：Ｇ４Ｖ配列の型：アミノ酸およびヌクレオチド配列の長さ：１７アミノ酸、５１ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状分子型：ペプチド

【化２２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】遺伝子Ｇ２ａ１、Ｇ２ａ２およびＧ２ａ３のベクター中へのクローン化の原理
。

【図２】遺伝子Ｇ２ａ１、Ｇ２ａ２およびＧ２ａ３のベクター中へのクローン化の原理
。

【図３】Ａ：２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、クマシブルー染色Ｍ＝分子量標準、レー
ン１および２ＨＳＡ−セファロースでアフィニティー精製したＢＢＧ１ａ１タ
ンパク質（理論質量３８．７Ｋｄ）。Ｂ：モノクローナル抗体１８Ｄ１による
ＢＢＧ２ａ１タンパク質の免疫ブロット。

【図４】Ａ：ペプチドＧ５ａおよびＧ９ａの免疫原性。Ｂ：肺におけるペプチドＧ５ａ
およびＧ９ａの防御効力。

【図５】Ａ：ペプチドＧ７ａおよびＧ８ａの免疫原性。Ｂ：肺におけるペプチドＧ７ａ
およびＧ８ａの防御効力。

【図６】ＲＳＶＡ（図６Ａ）およびＲＳＶＢ（図６Ｂ）に関するＢＢＧ２ａ１の免
疫原性、ならびにＲＳＶＡ（６Ｃ）およびＲＳＶＢ（６Ｄ）に対する防御効
力。

【図７】モノクローナル抗体１８Ｄ１および５Ｃ２の治癒効果。

【図８】Ａ：モノクローナル抗体１８Ｄ１の予防効力。Ｂ：モノクローナル抗体５Ｃ２
の予防効力。

【図９】ＢＢＧ２Ｎａで免疫化したマウスの血清中で提示されるＧ２ＮａのＢエピトー
プの同定Ａ：１５５〜１７６領域の全染色；Ｂ：非染色。

【図１０】ペプスキャンＢ法によるモノクローナル抗体５Ｂ７の認識ゾーンの決定。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１月１７日（２０００．１．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 11/00 Ｃ０７Ｋ 14/135 ４Ｈ０４５ 31/14 14/26 Ｃ０７Ｋ 14/135 16/10 14/26 19/00 16/10 Ｃ１２Ｎ 1/19 19/00 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ (72)発明者アラン、ベックフランス国コロンジュ、スー、サレーブ、ルート、デュ、ポワリエ、ア、ラーヌ、 503 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA32 BA51 CA07 CA11 DA06 EA04 GA03 GA11 GA18 GA19 HA03 4B064 AG01 AG27 AG32 CA02 CA10 CC01 CC06 CC07 CC12 CC24 CD10 CD12 CE02 CE08 CE12 CE14 DA01 DA13 DA15 4B065 AA01X AA26X AA49Y AA72X AA88X AA90X AA90Y AA92X AA95Y AB01 AB05 AC14 AC15 AC16 BA02 BA08 BB06 BB13 BC02 BC03 BC06 BC09 BD14 BD15 BD16 BD50 CA24 CA25 CA45 CA46 4C084 AA13 BA44 CA53 CA59 DA39 ZB092 ZB332 4C085 AA03 BA82 BB23 DD62 4H045 AA11 AA20 AA30 BA40 BA41 BA42 CA01 CA11 CA50 DA76 DA86 EA31 EA50 FA74 FA83 GA01 GA10 GA15 GA26 GA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＲＳＶＡもしくはＢのＧタンパク質の完全配列、または少なくとも８０％の相同性を示す配列のそれぞれアミノ酸残基１５０〜１５９、１７６〜１８９、１
９４〜２０７および１５５〜１７６の間のペプチド配列の１つから選択される配
列に相当するＲＳＶのＧタンパク質エピトープに向けられたポリクローナルまた
はモノクローナル抗体。
【請求項２】ＲＳＶ亜群Ａまたは亜群ＢのＧタンパク質のアミノ酸残基１３０〜２３０の間
の配列によって運ばれるペプチドに向けられた、請求項１記載の抗体。
【請求項３】配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番
号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号
１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および／また
は配列番号２２の少なくとも１つを有するペプチドに向けられた、請求項１およ
び２のいずれかに記載の抗体。
【請求項４】配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番
号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号
１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および／また
は配列番号２２から選択される配列の少なくとも１つを有する、請求項１〜３の
いずれか１項に記載の抗体を生成し得る。
【請求項５】Ｎ末端またはＣ末端の位置に少なくとも１つのシステイン残基をさらに含んで
なる、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】担体タンパク質と結合した、請求項４および５のいずれかに記載の少なくとも
１つのペプチドを含んでなる免疫原物質。
【請求項７】担体タンパク質がグラム陰性菌のＯｍｐＡおよびそれらの断片、ＴＴタンパク
質、連鎖球菌のヒト血清アルブミン結合タンパク質およびその断片、ならびにコ
レラトキシンＢ（ＣＴＢ）サブユニットから選択される、請求項６記載の免疫原
物質。
【請求項８】担体タンパク質がクルブシェラ属の細菌のＯｍｐＡである、請求項６および７
のいずれかに記載の免疫原物質。
【請求項９】ペプチドが結合タンパク質を介して担体タンパク質と結合している、請求項６
〜８のいずれか１項に記載の免疫原物質。
【請求項１０】結合タンパク質が哺乳類血清アルブミン受容体および粘膜細胞の表面に存在す
る受容体から選択される、請求項９記載の免疫原物質。
【請求項１１】結合が共有結合である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の物質。
【請求項１２】請求項６〜１１のいずれか１項に記載の免疫原物質をコードするヌクレオチド
配列。
【請求項１３】担体タンパク質をコードするＤＮＡ分子において、プロモーターを連結した、
請求項４および５のいずれかに記載のペプチドをコードするＤＮＡ、またはそれ
らの断片の１つを挿入または融合することによって作出されたハイブリッドＤＮ
Ａ分子である、請求項１２記載のヌクレオチド配列。
【請求項１４】ＲＮＡ分子である、請求項１２記載のヌクレオチド配列。
【請求項１５】医薬としての、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体、請求項４および５
のいずれかに記載のペプチド、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の免疫原物
質、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１６】請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体、請求項４および５のいずれかに記
載のペプチド、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の免疫原物質、または請求
項１２〜１４のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１種と医薬
上許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項１７】ＲＳＶ亜群ＡまたはＢによって引き起こされる症状の予防処置または治療処置
を意図した組成物の製造のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体、
請求項４および５のいずれかに記載のペプチド、請求項６〜１１のいずれか１項
に記載の免疫原物質、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のヌクレオ
チド配列の少なくとも１種の使用。
【請求項１８】請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体、請求項４および５のいずれかに記
載のペプチド、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の物質、または請求項１２
〜１４のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含んでなる診断キット。
【請求項１９】請求項６〜１１のいずれか１項に記載の免疫原物質の製造方法であって、ペプ
チドと担体タンパク質の間の結合が化学的経路によって達成される方法。
【請求項２０】請求項６〜１１のいずれか１項に記載の免疫原物質の製造方法であって、結合
が組換えＤＮＡ技術によって達成される方法。
【請求項２１】請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列が宿主細胞に導入
される工程を含んでなる、請求項１９記載の製造方法。
【請求項２２】プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスおよび／またはコスミド由来のＤ
ＮＡベクターによってヌクレオチド配列が導入される融合遺伝子である、請求項
２１記載の方法。
【請求項２３】融合遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれる、請求項２１および２２のいずれ
かに記載の方法。
【請求項２４】宿主細胞が原核生物である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】宿主細胞が大腸菌、バチルス菌、乳酸菌、ブドウ球菌および連鎖球菌からなる
群から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】宿主細胞が酵母菌である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法
。
【請求項２８】宿主細胞が植物起源の細胞である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項２９】宿主細胞が昆虫細胞である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】ウイルスベクターが用いられる、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項３１】宿主細胞の膜で融合分子が発現し、固定され、および露出される、請求項２０
〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】モノクローナル抗体が組換え経路によってヒト化され、作出される、請求項１
６記載の有用な組成物。
【請求項３３】モノクローナル抗体がファージライブラリー法によって得られる、請求項１６
記載の有用な組成物。