FR2766192A1 - Epitopes du vrs et anticorps les comportant, utiles dans le diagnostic et la therapie - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un épitope de la protéine G du VRS correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séquences peptidiques comprise respectivement entre les résidus d'acides aminés 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 98% d'homologie.

Description

La présente invention se rapporte au virus respiratoire syncytial, et plus

particulièrement à l'identification de nouveaux épitopes et aux anticorps correspondants, utiles notamment dans le domaine du traitement, de la prophylaxie et du diagnostic des affections provoquées par ce virus. Le virus Respiratoire syncytial (VRS) est l'un des agents étiologiques les plus fréquemment rencontrés chez le nourisson et chez les personnes âgées. Les bronchiolites sont souvent graves chez l'enfant et nécessitent l'hospitalisation. Actuellement il n'existe pas de moyens de prévention contre la maladie due au VRS, La première infection au VRS ne prévient pas contre la suivante. Le traitement des cas graves par antibiothérapie (Ribavirine) et/ou associé avec l'immunothérapie (immunoglobulines humains) ne peuvent pas atténuer l'aggravation de

la maladie. Néanmoins, ce type de traitement reste encore très coûteux.

Les essais cliniques récents avec les anticorps monoclonaux HNK20 de ORAVAX(dirigés contre la protéine F du VRS) n'ont pas montré d'efficacité du traitement par rapport au placebo contre l'infection du VRS chez l'enfant. Dans les années 60, les tentatives d'immunisation des enfants avec un vaccin VRS inactivé à la formaline avaient pour conséquence l'aggravation de la maladie au lieu de conférer une protection des poumons contre l'infection naturelle au VRS. Associé à ce problème, les diagnostics actuels ne permettent pas d'identifier de

manière fiable l'infection au VRS, au moins chez l'adulte.

Le VRS est classé dans la famille des Paramyxoviridae, genre pneumovirus comportant un génome ARN non segmenté, de polarité

négative, codant pour 10 protéines spécifiques.

La demande WO 87/04185 a proposé d'utiliser des protéines structurales du VRS en vue d'un vaccin, comme les protéines d'enveloppe appelées protéine F (protéine de fusion) ou protéine G, une glycoprotéine de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure

de capside (protéine N).

La demande WO 89/02935 décrit les propriétés de protection de la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiées sous forme monomérique ou déglycosylée. Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de

rechercher leurs propriétés neutralisantes.

Dans la demande WO 95/27787, il a été montré que la protéine G du VRS peut être utile dans la préparation de produits destinés au traitement et/ou à la prévention d'affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B. Dans le cadre de la présente invention, il a maintenant été trouvé que des fragments de la protéine G du VRS, contenant des épitopes spécifiques, possèdent des propriétés particulièrement avantageuses. De nouveaux fragments peptidiques de la protéine G du VRS peuvent ainsi être préparés, notamment pour les applications suivantes: (i) ledit fragment de peptide couplé ou fusionné, par des méthodes chimiques ou par génie génétique, à un porteur, constitue un vaccin efficace contre l'infection au VRS, quel que soit le mode

d'administration.

(ii) les mêmes fragments peptidiques peuvent servir à générer des anticorps polyclonaux et monoclonaux qui sont très efficaces dans les traitements prophylactiques ou thérapeutiques de l'hôte infecté par le VRS. (iii) ces fragments peptidiques et les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés comme réactifs dans un Kit de diagnostic permettant d'affirmer et d'identifier l'infection chez l'hôte infecté par le

VRS-A ou le VRS-B.

L'invention a donc pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un épitope de la protéine G du VRS correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séquences peptidiques comprise respectivement entre les résidus d'acides aminés - 159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 80%,

et de préférence au moins 98% d'homologie.

Ces anticorps reconnaîtront des peptides portés par la séquence comprise entre les résidus d'acides aminés 130 et 230 de la protéine G du VRS, sous-groupe A ou sous-groupe B. l0 Cette région correspondant aux acides aminés 130-230 de la protéine G du VRS A est désignée ci-après G2Na. G2Na a été produite dans une bactérie telle que E. coli, donc non glycosylée. Elle confère, notamment lorsqu'elle est couplée à un porteur comme une OmpA de bactérie gram négatif, par exemple de Klebsiella (protéine p40, décrite t5 dans WO 96/14415) ou une protéine dérivée du streptocoque (comme la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine, appelée ci-après BB, décrite dans WO 96/14416), une protection immunitaire contre les

infections au VRS.

De manière inattendue, il a été montré qu'une série de peptides préparés selon l'invention confère une protection croisée contre le VRS sous-groupe A ou sous-groupe B. En particulier, une protéine recombinante BBG2al, un dérivé de BBG2Na o seulement quatre résidus ont été modifiés sur G2Na: les résidus Asn(aal91), Lys(aa192), Gly(195) et Thr(aa198) ont été substitués par les résidus Ser, Asn, Lys et Pro respectivement, confère une protection croisée VRS-A ou VRS-B chez la souris BALB/c. Dans le même but de renforcer une protection croisée, deux nouvelles molécules ont été produites: BBG2a2 o les résidus Asn(aa157), Asn(aal60), Asn(aal61) et Phe(aa163) ont été substitués par les résidus Lys, Lys, Asp et Tyr respectivement; BBG2a3 comporte les huits résidus modifiés

de BBG2al et BBG2a2.

Des peptides particulièrement avantageux selon l'invention presentent notamment l'une des séquences choisies parmi les séquences ID n 1, ID n 2, ID n 3, ID n 4, ID n 5, ID n 6, ID n 7, ID n 8, ID n 9, ID n 10, ID n 11, ID n 12, ID n 13, ID n 14, ID n 15, ID n 16, ID n 17, ID n 18, ID n 19, ID n 20, ID n 21 et/ou ID n 22, figurant en annexe; un tel peptide peut, en outre, comporter au moins un résidu

cystéine en position N-terminale ou C-terminale.

La réactivité des peptides est mise en évidence par des sondes mono ou polyclonales. Quatre régions de G2Na ont été révélées par cette technique: GSa (aa144-159), Glla(aa164-176), G4a(aa172-187) et G9a(aa190- 204). L'invention a donc également pour objet des anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre un peptide présentant au

moins l'une des séquences ID n 1 à ID n 22.

Des peptides possédant une ou plusieurs unités correspondant aux épitopes 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence de la protéine G du VRS seront très utiles pour les différents modes de

mise en oeuvre de l'invention. -

Des peptides selon l'invention, couplés à une protéine porteuse,

sont utiles comme agents immunogènes.

La protéine porteuse est avantageusement choisie parmi les OmpA de bactéries gram négatif et leurs fragments, la protéine TT (tetanus toxoide), la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque et ses fragments et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB); de préférence, la protéine porteuse est une OmpA d'une bactérie

du genre Klebsiella.

Selon l'un des aspects de l'invention, le peptide est conjugué à la protéine porteuse par une protéine de liaison; cette protéine de liaison peut notamment étre choisie parmi un récepteur de l'albumine sérique de mammifère et les récepteurs présents à la surface des cellules mucosales. Le couplage est de préférence un couplage covalent, qui peut être

réalisé par la voie chimique ou par des techniques d'ADN recombinant.

Selon un autre de ses aspects, l'invention a donc pour objet une séquence nuclétotidique codant pour un peptide ou un agent immunogène tel que définis précédemment. Il peut s'agir notamment d'une molécule d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour la protéine porteuse, de l'ADN codant pour

un peptide selon l'une des revendications 4 ou 5 ou l'un de leurs

fragments, fusionné avec un promoteur; il peut également s'agir d'une

molécule d'ARN.

Les peptides, les anticorps, les agents immunogènes et les séquences nuclétotidiques selon l'invention peuvent être utilisés à titre de médicament, et plus particulièrement pour la préparation d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B. Par exemple, des anticorps monoclonaux reconnaissant de

manière spécifique les peptides G5a et Gl la et GlACa ont été générés.

Le transfert passif des anticorps monoclonaux 5C2 (anti-GSa) et 18D1

(anti- GlACa) chez la souris naïve permet de prévenir l'infection au VRS-

A d'une part. Et d'autre part, le même monoclonal 5C2 permet d'éliminer rapidement une infection chronique au VRS-A chez la souris immunodéprimée. L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un anticorps mono ou polyclonal, un peptide ou un épitope selon l'invention, un agent immunogène, ou une séquence nucléotidique tels que définis précédemment, et des excipients pharmaceutiquement

acceptables.

Les anticorps monoclonaux sont, de préférence, humanisés et produits par la voie recombinante. Selon un autre aspect de l'invention,

ils sont obtenus par la méthode de librairie de phages.

Les peptides, agents immunogènes, anticorps et séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent, selon un mode de mise en

oeuvre de l'invention, entrer dans la composition d'un kit de diagnostic.

Comme indiqué plus haut, les agents immunogènes peuvent être préparés par la technologie de l'ADN recombinant, par l'introduction

d'une séquence nucléotidique selon l'invention dans une cellule hôte.

Cette séquence nucleotidique peut être un gène de fusion qu'on introduit par l'intermédiaire d'un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmide. Ce gène de fusion peut, dans un mode de réalisation du procédé de préparation,

être intégré dans le génome de la cellule hôte.

Le vecteur pourra être un vecteur viral, connu de l'homme du métier. La cellule hôte peut être un procaryote, notamment choisie dans le groupe comprenant: E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Staphylococcus

et Streptococcus.

Mais la cellule hôte peut également être une levure, une cellule

de mammifère, une cellule d'origine végétale ou une cellule d'insecte.

Selon l'un des aspects du procédé selon l'invention, la protéine de fusion est exprimée: secréte, localisée dans le cytoplasme, ou encore

exposée à la membrane des cellules hôtes.

Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention.

Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes.

Figure 1 et 2: Principe du clonage des gènes G2al, G2a2 et G2a3 dans

les vecteurs.

Figure 3: A-Gel SDS-PAGE 20%, coloration au Bleu de Comassie. M= Standards de tailles moléculaires, pistes 1 et 2 protéines BBG2al

(masse théorique 38,7 Kd) purifiées par affinité sur HSA-Sépharose.

B- Immunoblot des protéines BBG2al avec un anticorps monoclonal 18 D1.

Figure 4: A-Immunogénicité des peptides G5a et G9 a.

B- Efficacité protectrice des peptides GSa et G9a sur les poumons.

Figure 5: A- Immunogénicité des peptides G7a et G8a.

B- Efficacité protectrice des peptides G7a et G8a sur les poumons. Figure 6: Immunogénicité de BBG2al vis-à-vis du VRS A (Figure 6A) et VRS B (6B) et efficacité protectrice contre le VRS A (6C) et le VRS B (6D).

Figure 7: Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D1 et 5C2.

Figure 8: A- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 18D1.

B- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 5C2.

Figure 9: Identification des épitopes B de G2Na représentés dans un sérum de souris immunisées par BBG2Na. A: révélation totale; B:

absence de révélation de la région 155-176.

Figure 10: Détermination de la zone de reconnaissance de l'anticorps monoclonal 5B7 par la méthode du Pepscan B.

EXEMPLES

Exemple i1: Synthèse des peptides.

Exemple de la synthèse des peptides G5aCys et CysG5a.

Abréviations: AA: acide aminé Boc: tert Butoxycarbonyl BHA: Bromo hydrosuccimidyl acide CE: Capillary Electrophoresis ES-MS: Electrospray Mass spectrometry FMOC: fluorenylmethoxycarbonyl FZCE: Free Zone Capillary Electrophoresis HBTU: 2-( H-Benzotriazole- 1 -yl)1,1,3,3-tétraméthyluronium 1 0 hexafluorophosphate HMP: pHydroxyméthylphénoxyméthyl polystyrène MBHA: méthylbenzhydrylamine NMP: N-méthyle-2-pyrrolidone Pmc: 2,2,5,7,8- Pentamethylchroman-6-sulfonyl RP-HPLC: Reverse Phase - High Performance Liquide Chromatography SPPS: Synthèse Peptidique en Phase Solide tBOC:t-butyloxycarbonyl tBu: tertio Butyl TFA: trifluoroacetic acid Trt: trityle Le peptide G5a est un peptide de 16 acides aminés qui correspond au fragment de la protéine G (144-159) du VRS-A. Il est obtenu par synthèse chimique sur phase solide en partant du coté C D vers le coté N-terminal. Les peptides CysG5a et G5aCys correspondent respectivement à ce peptide avec une Cystéine supplémentaire du coté N ou C-terminal qui est destinée à un couplage univoque sur une protéine porteuse. Ces 2 peptides permettent d'étudier l'influence que peut avoir l'orientation du peptide conjugué à une protéine porteuse sur la réponse

immunologique observée.

Les peptides ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur

automatique de peptide en phase solide du coté C vers le coté N-

terminal (chimie FMOC à l'échelle de 0.1; 0.25 ou 1.0 mmole). La synthèse du peptide CysG5a est effectuée à partir d'une Proline préchargée sur une résine de type HMP, qui permet après clivage d'obtenir une fonction acide libre du coté C-terminal ou une résine de type Rink amide MHBA, qui permet après clivage d'obtenir une fonction amide du coté C-terminal. Celle du peptide G5aCys débute par une Cystéine préchargée sur l'une ou l'autre des résines. Les fonctions réactives des chaînes latérales des acides aminés utilisés, sont protégées par des groupes compatibles avec la chimie FMOC [Cys(Trt); Arg(Pmc) Asn(Trt); Gln (Trt); Lys(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu)]. Un cycle de couplage

se déroule de la manière suivante: déprotection de la fonction amine N-

terminale du premier acide aminé à l'aide de pipéridine, activation de la fonction acide du deuxième acide aminé à coupler à l'aide d'HBTU/HMP et couplage. En fin de synthèse, le peptide est clivé de la résine et les chaînes latérales sont déprotégées par réaction avec un mélange eau / TFA. Le peptide est précipité à l'éther refroidi préalablement à -40 C et le mélange est centrifugé. Le culot est lavé à trois reprises avec de l'ether puis séché à l'azote. Le culot est repris avec de l'eau contenant 0.1 % de TFA. La suspension est à nouveau centrifugée et le surnageant qui contient le peptide est séparé du culot, qui contient la résine. Le peptide

brut est purifié par HPLC en phase inverse semi-préparative.

L'homogénétié du peptide purifié est vérifiée par HPLC en phase inverse et par électrophorèse capillaire (FZCE). La structure théorique est confirmée par comparaison de la compatibilité de la masse mesurée par spectrométrie de masse de type ES-MS, avec la masse calculée à partir

de la séquence théorique en acides aminés.

Peptide CysG5aNH2 Synthèse: Poids théorique peptide-résine en fin de synthèse: 593 mg Poids mesuré après séchage à l'azote: 619 mg Clivage peptide-résine et analyse du peptide brut: 200 mg (1/3 du lot) Masse de peptide brut clivé après lyophilisation: 84 mg (75 % de quantité nette de peptide soit 97 % de rendement) Homogéneité du peptide brut: 97 % (RP-HPLC; UV 210 nm)

97 % (FZCE/

MicrocoatTM) Purification: Masse de peptide purifié après lyophilisation: 50 mg (75 % de quantité nette de peptide soit 58 % de rendement) Caractérisation: Homogéneité du peptide purifié: > 99% (RP- HPLC; UV 210 nm) > 99 % (FZCE/MicrocoatTM; UV 200 nm) Spectrométrie de masse (ES-MS) Masse calculée 1951.29 Da Masse mesurée: 1950.80 Da + 0.31 Exemple 2: Couplage des peptides G5a, G7a, G8a, G9a, Gl la et

G1 1ACa sur une protéine porteuse (P40, BB, TT, KLH).

Exemple du couplage du peptide G1 lACa sur la protéine P40.

Le peptide Gl lACa (Seq ID n 14) est un peptide de 13 acides

aminés issu de la protéine G du VRS. Il correspond à la séquence 164-

176 de cette protéine. Lors de la synthèse, le résidu Cys en position 173 a été remplacé par un résidu Ser afin de ne conserver qu'un seul résidu Cys en position 176 et éviter la formation d'un pont disulfure 1- 2

n'existant dans la protéine G naturelle (appariement 1-4/2-3).

Ce peptide a été couplé à l'aide de glutaraldéhyde (réactif homobifonctionnel, couplage sur les fonctions amines et thiols) ou de manière univoque à l'aide de BHA (réactif hétérobifonctionnel, couplage

sur la fonction thiol de la Cystéine en position C-terminale).

* Couplage univoque par le BHA

* Solubilisation du peptide G1 lACa.

2 mg de G 1lACa sont solubilisés dans 2 ml de tampon phosphate

0, 1M pH 7 + 0,1% Zwittergent 3-14.

* Couplage univoque sur la protéine P40 à l'aide d'un réactif

hétérobifonctionnel (BHA).

3 mg de BHA en solution dans 25 pl de DMF sont ajoutés à 2,5 mg de protéine P40 préalablement dialysés contre un tampon phosphate 0,1M pH7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 et agités pendant 1 heure à température ambiante. Après dessalage sur colonne PD10 et élution avec un tampon phosphate 0,1M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 des fractions de 500 pl sont collectées et les tubes contenant la protéine bromoacétylée sont rassemblées (lecture de DO à 280 nm) dans des tubes contenant 0,95 ml de solution du peptide G 1 lACa sont ajoutés. Le milieu réactionnel est saturé avec de l'azote et agité à l'obscurité pendant 2 heures à température ambiante. La solution est dialysée ensuite à l'aide d'un tampon phosphate 0,1 M pH 7 + 0,1% Zwittergent 3-14 pendant une nuit à +4 C sous agitation et la solution obtenue est

conservée congelée.

a Couplage sur la protéine P40 à l'aide d'un réactif

homobifonctionnel (glutaraldéhyde).

10 mg de P40 sont dialysé contre un tampon phosphate 0,1 M pH 7 + 0,1% Zwittergent 3-14. La concentration est ajustée à 2 mg/ml à l'aide d'un tampon carbonate 0,1 M pH 9 + 0,1% Zwittergent 3-14. 200

mg de SDS d'une solutiuon à 4% sont ajoutés.

,5 pl de glutaraldéhyde à 2,5 % sont ajoutés à 2,5 ml d'une solution de peptide G11ACa à 1 mg/ml dans un tampon carbonate 0,1 M pH 9 + 0,1% Zwittergent 3-14 à un pH se situant entre 9 et 10. Le milieu réactionnel est agité à + 4 C pendant 24 heures puis ramené à température ambiante. 25 gil de lysine 1 M sont ajoutés pour bloquer la réaction. La solution est dialysée contre du tampon phosphate 0,1 M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à +4 C sous agitation. Le dialysat est récupéré et le SDS éliminé par précipitation à l'aide d'une solution de KCl 0,02 M à 6 reprises. Le dernier surnageant qui contient le conjugué P40-G1 lACa glutaraldéhyde est conservé sous forme

congelée à -20 C.

Stérilisation des conjugués Les conjugués sont décongelés, filtrés stérilement (0,22 pm),

aliquotes et conservés à +4 C afin d'éviter les problèmes de précipitation.

Caractérisation analytique des conjugués Les conjugués sont caractérisés par dosage des protéines par la méthode de Lowry, électrophorèse de type SDS-PAGE (révélation au bleu de Coomassie) et par dosage des acides aminés après hydrolyse acide en phase gazeuse, dérivation par le PITC et analyse par HPLC. Conjugué Volume [prot] Nb de GllAC [GllAC] mg/ml (ml) mg/ml Fixés rP40-Gl lACa 2,7 0,74 2 0,05 (BHA) rP40-G 11ACa 5,1 1,29 16 0,49 (glutaraldéhyd eL Exemple 3: Clonage de gène G2al, G2a2 dans vecteur d'expression pvaBB308 et production de protéines de fusion BBG2al et BBG2a2 dans E. coli Le principe de clonage de gène G2al (Seq ID n 15), G2a2 (Seq ID n 16) et de G2a3 (Seq ID n 17) dans les vecteurs est explicité dans les figures 1 et 2 3.1 Construction de G2a 1 Le gène codant pour la protéine G2al (Seq ID n 15) est construit par mutagénèse dirigée en utilisant comme matériel de départ le plasmide pRIT28G2Na. Pour cela deux réactions de PCR (Polymerase chain reaction) sont réalisées avec les couples d'oligonucléotides RIT29/TH137(PCR 1) d'une part et RIT30/TH136 (PCR 2)d'autre part dans les conditions suivantes: PCR (94 C 15 secondes cycles (55 C 30 secondes (72 C 30 secondes Fixation sur les billes magnétiques Les fragments obtenus respectivement de 262 pb et 208 pb pour les réactions 1 et 2 sont fixés sur des billes magnétiques. 25 Kl de billes magnétiques DYNAL M-280 couplées à la streptavidine sont préalablement rincées deux fois avec du tampon T.E. (Tris 10 mM; EDTA lmM, pH 7,5) puis mis à incuber 20 minutes à 37 C avec 901l des réactions d'amplification 1 et 2. Après fixation les fragments sont dénaturés en incubant les billes magnétiques avec 50g1 de NaOH 0,15 M pendant 10 minutes à température ambiante. Les deux surnageants sont récupérés, précipités à l'éthanol absolu et resuspendus dans 50 gl d'H20. * Réaction d'extension Celle-ci est réalisée par PCR en prenant 10 kl de chacune des réactions d'amplification dans les conditions ci- dessous (95 C 15 secondes cycles (35 C 30 secondes (72 C 30 secondes Le fragment généré est amplifié par PCR avec les oligonucléotides RIT27 et RIT28: (95 C 15 secondes cycles (55 C 30 secondes (72 C 30 secondes Le fragment amplifié de 509 pb est digéré avec les enzymes de restrictions PstI et HindIII. Le fragment généré de 169 pb est clone dans

le vecteur pRIT28 digéré par les mêmes enzymes.

Le plasmides obtenu pRIT28G2al down est séquencé avec la chimie des Dye Deoxy Terminator selon le protocole décrit par Applied Biosystem

(Perkin Elmer).

Le plasmide pRIT28G2al est obtenu en clonant le fragment PstI/HindIll de pRIT28G2aldown (fragment en aval du site Pst I) dans le vecteur pRIT28G2Na. Le gène G2al est ensuite cloné dans le vecteur d'expression pvaBB308 aux sites de restriction EcoRI/HindIII générant le vecteur pvaBBG2al. La liste des séquences des oligonucléotides est indiquée cidessous:

RIT27: 5' - GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG- 3'

RIT28: 5' - AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG - 3'

TH136: 5'- CCGAAGAAAAAACCGACGACCAAACCGACC - 3'

TH137: 5' - TTTTCTFCGGT=GTTGCTCGGG - 3'

RIT29: RIT27 biotinylé en 5' RIT30: RIT28 biotinylé en 5' 3.2 Construction de G2a2 (Seq ID n 16}

Le principe du clonage est schématisé en bas de la figure 2.

Les couples d'oligonucléotides utilisés dans cette construction sont les suivants: RIT29/TNG193(PCR 1) d'une part et TNG192/RIT30(PCR 2) d'autre part. Les séquences des oligonucléotides sont décrits ci-dessous:

TNG192: 5'- CCGCCGAAAAAACCGAAAGACGAT - 3'

TNG193: 5' - CGAAATGGTAATCGTCTITCGG - 3'

3.3 Construction de G2a3 (Seq IDn 17) Les deux fragments en amont et en aval du site unique PstI ont

été rassemblés sur le même vecteur pour donner pRIT28G2a3.

Les trois fragments d'inserts G2al, G2a2 et G2a3 ont été clonnés dans différents vecteurs d'expression dans E. coli, en particulier dans nos exemples les vecteurs pvaBB308 o BB est le géne codant pour le récepteur d'Albumine. Les protéines de fusion obtenus BBG2al, BBG2a2 et BBG2a3 peuvent être aisément purifiées par affinité sur

colonne HSA-Sepharose (Human serum Albumin).

3.4 Fermentation et purification de protéines de fusion BBG2al et BBG2a2 Dans deux erlenmeyers contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) avec de l'Ampicilline (100 pg/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8,ug/ml, Sigma), on inocule avec E. coli RV308 transformés avec les plasmides pvaBBG2al et pvaBBG2a2 respectivement. On incube pendant 16 heures à T = 37 C sous agitation. 200 ml de cette culture sont inoculés dans un fermenteur (CHEMAP CF3000, ALFA LAVAL) contenant 2 litres de milieu de culture. Le milieu contient (g/l) = glycérol, 5; sulfate d'ammonium, 2,6; dihydrogénophosphate de potassium, 3; hydrogénophosphate dipotassium, 2; citrate de sodium 0,5; extrait de levure, 1; Ampicilline, 0,1; Tétracycline 0,008; Thiamine, 0,07; sulfate de magnésium, 1 et 1 ml/l de solution de traces éléments et 0,65 ml/l de solution de vitamines. Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont: le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de sources combinées (glycérol ou glucose). Le pH est régulé à 7,0. La température est fixée à 37 C. La croissance est contrôlée en alimentant du glycérol (87%) à un débit constant (12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (après environ 24 heures de culture), la production des protéines est induite par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/L. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. Les rendements en biomasse obtenus sont environ 200gr de biomasse humide. Les rendements de production de BBG2al et de BBG2a2 sont

environ de 4 à 6 mgr de protéines par gr de biomasse.

Une fraction de 30 g de biomasse humide est resuspendue dans 70 ml de solution de TST (Tris-HC1 50 mM pH 8,0, NaCI 200 mM, 0,05 % Tween 20 et EDTA 0,5 mM). Les cellules sont désintégrées par sonication (Vibracell 72401, Sonics & Materials). Après centrifugation du lysat cellulaire, le surnageant est filtré (1,2 pm) et dilué dans 500 ml de TST. Les protéines de fusion ainsi obtenues sous formes solubles sont purifiées sur colonne d'affinité: HSA-Sepharose (human serum albumin) selon le protocole décrit par (Stahl et col, J. Immunol.

Methods, 1989; 124: 43-52).

Le lysat insoluble, après centrifugation, est lavé une fois avec un tampon (Tris-HCl 50 mM pH 8,5; MgC12 5 mM). Après lavage, le culot est solubilisé dans 30 ml de chlorhydrate de guanidine 7 M, Tris-HCl 25 mM (pH 8,5), Dithiotreitol (DTT) 10 mM, suivi d'une incubation à 37 C pendant 2 heures. Les protéines solubilisées sont additionnées à un tampon de renaturation (Tris-HCl 25 mM (pH 8,5); NaCI 150 mM et 0,05 % Tween 20). La concentration du chlorhydrate de guanidine est ajustée à la concentration finale de 0,5 M dans le tampon de renaturation avant l'addition des protéines de fusion solubilisées. Le mélange est incubé à température ambiante, sous agitation modérée, pendant 16 heures. Après centrifugation, les produits de fusion solubles dans le surnageant sont purifiés sur colonne HSA-Sepharose. Les protéines de fusion purifiées sont analysées sur gel SDS-PAGE (12 %), sur l'appareil MINI PROTEAN II SYSTEM (BIORADS). Les protéines sont visualisées avec du Coomassie brilliant blue R250. De plus, l'analyse des proteines recombinantes par Immunoblot avec des anticorps spécifiques du VRS montre que les protéines sont antigéniques.(voir

exemple de gel SDS et immunoblot de BBG2al sur la figure 3).

Exemple 4: Immunogénicité et efficacité protectrice des peptides

G5a et G9a couplés à P40.

Matériels et méthodes.

Des groupes de 7 souris ont été immunisés 2 fois par voie i.p. avec 20 M. g de P40-G9aCys, P40-CysG5a, ou P40-GSaCys. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20% v/v) a été utilisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pourconfirmer leur séroconversion vis-à-vis le VRS-A, challengées une semaine plus tard avec 105 TCID50 VRS-A par voie i.n., et sacrifiées 5 jours post-challenge. Les poumons ont été prélevés et le

titre de virus dans les poumons déterminés.

Résultats.

Réponses immunes humorales.

Comme indiqué dans la Fig. 4A, l'immunogénicité du peptide G5a est dépendante de l'orientation-du couplage au P40. Après couplage par la partie C-terminale du peptide, des titres en anticorps anti-VRS-A faibles à modérés ont été induits dans le sérum. Par contre, aprés

couplage par la partie N-terminale, G5a n'a pas induit de tels anticorps.

En général, le peptide G9a, couplé en C-terminal à P40, a été faiblement immunogénique en terme d'induction d'anticorps anti-VRS-A. Une souris sur sept immunisées avec P40-G9acys a développé un titre

d'anticorps sériques anti-VRS-A élevé.

Efficacité protectrice des poumons des peptides G5a et G9a.

Comme démontré dans la Fig. 4B, et en corrélation directe avec la détection des anticorps anti-VRS-A, le peptide G5a a induit des réponses immunes protectrices quand il était couplé en C-terminal, mais pas après coulrage en N-terminal. En effet, 6 souris sur 7 immunisées avec le P40G5acys (couplage C-terminal) ont été protégées sans évidence de virus dans les poumons, le dernier n'a eu du virus qu'à la limite de détection de l'essai. Par contre, les souris immunisées avec P40-cysG5a (couplage N-terminal) ont eu des titres de virus dans les

poumons aussi élevés que les souris témoins, immunisées avec le PBS.

Ces résultats confirment que l'orientation du couplage de ce peptide à une protéine porteuse est capitale pour son efficacité protectrice. La corrélation entre la protection et l'induction des anticorps anti-VRS-A suggère que la protection pulmonaire observée est médiée, en partie au

moins, par les anticorps.

Malgré le fait que le P40-G9aCys ait été faiblement immunogénique chez la souris en termes d'induction d'anticorps sériques anti-VRS-A, les poumons de 5 souris sur 7 ont été protégés contre un challenge par le VRS-A. En effet, 1 souris sur 7 n'a pas

montré d'évidence de virus dans les poumons, ni même d'anticorps anti-

VRS-A dans le sérum.

Conclusions.

Les peptides G5a et G9a contiennent des épitopes protecteurs vis-a-vis d'une infection VRS-A des poumons. L'orientation du couplage de G5a à une protéine porteuse est capitale pour son efficacité protectrice. Exemple 5: Immunogénicité et efficacité protectrice des peptides

G7a et G8a.

Matériels et méthodes.

Des groupes de 3 à 4 souris ont été immunisées 2 fois par voie i.p. avec 20 mg de G7a, G8a, BB-G7a, ou BB-G8a. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20% v/v) a été ulitisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une semaine plus tard avec 105 TCID5so VRS-A par voie i.n., et sacrifiées 5 jours post-challenge. Les poumons ont été prélevés et les voies nasales lavées. Les titres de virus dans les poumons et les voies

nasales ont été déterminés.

Résultats.

Réponses immunes humorales.

Comme indiqué dans la Fig. 5A, les peptides G7a et G8a sont tous deux immunogéniques vis-à-vis du VRS-A couplés ou non à BB. Si l'on considère les titres d'anticorps sériques, les peptides non couplés

semblent ètre un peu plus immunogènes que les peptides couplés.

Efficacité protectrice des poumons des peptides G7a et G8a.

Comme indiqué dans la Fig. 5B, les poumons de toutes les souris immunisées avec les peptides G7a ou G8a, couplés ou non à BB, sont protégés contre un challenge avec le VRS-A, sans présence de virus ou

seulement à la limite de détection de l'essai.

Conclusions. Les peptides G7a et G8a contiennent des épitopes protecteurs

vis-à-vis des poumons. Les peptides sont efficaces couplés ou non à BB.

Exemple 6: Immunogénicité et efficacité protectrice de la protéine

de fusion BBG2al.

Matériels et méthodes.

Afin de déterminer l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de BBG2al contre les VRS-A et B, des groupes de 3 souris ont été immunisées 2 et 3 fois, respectivement, par voie i.p. avec 20,.g de protéine à 2 semaines d'intervalle. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20% v/v) a été utilisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une semaine plus tard avec 105 TCID5so VRS-A par voie i.n., et sacrifiées 5 jours post- challenge. Les poumons ont été prélevés et le titre de virus

dans les poumons déterminé.

Résultats. Immunogénicité de BBG2al vis-à-vis des VRS-A et B. Les résutats présentés dans les Fig. 6A et B démontrent que le BBG2al est capable d'induire des anticorps anti-VRS-A et B. Comme attendu, le titre en anticorps anti-VRS-A est bien supérieur au titre en anticorps anti- VRS-B. Néanmoins, des titres en anticorps contre les

deux souches de VRS sont élevés.

Efficacité protectrice de BBG2al vis-à-vis du VRS-A et du VRS-B.

Comme indiqué dans les Fig. 6C et D, l'immunisation des souris avec BBG2al a induit des réponses immunitaires capables de protéger les poumons contre un challenge avec le VRS-A et contre un challenge avec le VRS-B. Les souris challengées avec le VRS-A ont été protégées sans évidence de virus dans les poumons (2 souris /3) ou seulement à la limite de détection (1 souris /3). Les souris challengées avec le VRS-B ont été protégées, soit sans évidence de virus dans les poumons (1 souris/3) soit avec du virus qu'à la limite de détection (1 souris/3) ou juste au-dessus de cette limite (1 souris/3) de détection. Conclusions.

La protéine de fusion BBG2al est très immunogénique vis-à-vis du VRS-

A et vis-à-vis du VRS-B. BBG2al est capable d'induire des réponses qui protègent les poumons contre un challenge avec les 2 sous-groupes de VRS. Exemple 7: Obtention des anticorps 18D1, 5C2 et 5B7 Peptide d'immunisation: (i) GlACa couplés au KLH (Keyhole

Lempet Haemocyanin), (ii) G2ACa et (iii) BBG2Na.

Les souris ont été immunisées à J0 avec 50gg d'antigène en CFA(complete Freund Adjuvant) en ip, à J14 avec 10pg de chaque antigène en IFA (Incomplete Freund Adjuvant) en ip, puis à J38 en iv avec 10pg de chaque peptide sans adjuvant. Les rates sont prélevées et fusionnées avec les cellules de myélome SP2-O à J42 dans un rapport 1/1. Les hybridomes positifs contre chaque antigène sont gardés. Ces hybridomes ont été injectés à des souris pour obtenir des ascites puis les différents anticorps obtenus ont été sélectionnés sur différents peptides afin de déterminer la spécificité des anticorps obtenus. Les anticorps monoclonaux 18D1, 5C2 sélectionnés par leur spécificité

contre les peptides GlACa, GSa, reconnaissent spécifiquement le VRS-A.

L'anticorps monoclonal 5B7 obtenu à partir de BBG2Na et

reconnaissant le peptide G 1 la reconnaît le VRS-A.

Exemple 8: Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D1 et SC2

sur l'infection chronique à VRS-A obtenue chez la souris SCID.

Matériels et méthodes.

Les souris C.B-17 scid/scid ont été challengées par voie i.n. avec TCID50 de VRS-A, sous 50 p1. Vingt six jours plus tard, les souris ont reçu par voie i.n. et à raison de 7 souris par groupe, 50 p1 d'une

préparation d'anticorps 18D1 ou d'anticorps 5C2 à un titre ELISA anti-

VRS-A de 104. Des souris témoins ont reçu du sérum anti-BB à un titre ELISA anti-BB de 104. Les souris ont été sacrifiées 5 jours plus tard et

leurs poumons ont été prélevés pour titrage du virus.

Résultats. Les résultats présentés dans la Fig. 7 démontrent que les anticorps monoclonaux 18D1 et 5C2 sont capables d'éliminer une infection chronique avec le VRS-A chez la souris SCID et ceci d'une manière stérilisante. Aucune trace de virus n'a été détectée dans les poumons au moment du sacrifice. Les résultats obtenus dans les poumons des souris traitées avec le 5C2 correspondent à la moyenne des limites de détection de l'essai, limite plus élevée du fait du manque de disponibilité

d'échantillon, et non pas à la présence de virus.

Conclusions. Les anticorps monoclonaux 5C2 et 18D1 pourraient être utilisés comme traitement thérapeutique dans le cadre des infections

pulmonaires à VRS-A.

Exemple 9: Effet prophylatique de l'anticorps monoclonal 18D1 sur

l'infection à VRS-A chez la souris.

Matériels et méthodes.

Un groupe de souris BALB/c naïves, séronégatives vis-à-vis du VRS-A, ont reçu par injection intrapéritonéale 200 Il d'une préparation d'anticorps 18D1 ajustée au titre ELISA anti-VRS-A de 105. Un groupe de souris témoin transfert i.p. ont reçu en parallèle 200 pl d'une préparation de sérum anti-P40 (sérum irrelevant) ajustée au titre ELISA anti-P40 de 104. Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie

i.n. avec 50 pl d'une suspension virale contenant 105 TCID50 de VRS-A.

Elles sont sacrifiées 5 jours plus tard pour dosage de virus dans les poumons.

Résultats.

Comme indiqué dans la Fig. 8A, l'anticorps 18D1 est capable après transfert i.p. d'induire une protection au niveau des poumons de souris naïves lors d'un challenge avec le VRS-A. Toutes les souris sont protégées après injection de 200p1 de 18D1 au titre de 105. Trois souris sur 7 sont protégées sans évidence de virus dans les poumons. Les autres montrent des traces de virus seulement à la limite de détection

de l'essai (3 souris/7), ou juste au-dessus de cette limite (1 souris/7).

Les souris témoin ont des titres compris entre loglo 3.70 et 4.45 par

gramme de poumons.

Conclusion. L'anticorps 18D 1 est capable de prévenir une infection pulmonaire à VRS-A chez la souris BALB/c. Il démontre une efficacité

prophylactique importante.

Exemple 10: Effet prophylatique d'anticorps monoclonal 5C2 sur

l'infection à VRS-A chez la souris.

Matériels et méthodes. Des souris naïves séronégatives vis-à-vis du VRS- A reçoivent par transfert i.n., 50 pl d'une préparation de 5C2 ajustée au titre ELISA anti-VRS-A de 104. Des souris témoins reçoivent en parallèle du sérum

anti-BB ajusté au titre ELISA anti-BB de 104.

Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie i.n. avec pl d'une suspension virale contenant 105 TCID50 de VRS-A. Elles sont

sacrifiées 5 jours plus tard pour titrage de virus dans les poumons.

Résultats. Comme le montre la Fig. 8B, toutes les souris traitées avec le 5C2 à 104 ont été protégées au niveau pulmonaire. Seule 1 souris sur 7 montre des traces de virus. Les souris témoin ont des titres compris

entre logo10 3.70 et 4.70 par gramme de poumons.

Conclusion.

L'anticorps 5C2 est capable de prévenir une infection pulmonaire à VRS-A chez la souris BALB/c. Il démontre une efficacité

prophylactique importante.

Exemple 11: Pepscan: exemple de la synthèse muliple de 94 octapeptides couvrant la séquence de l'aa 130-230 de G2Na et se

chevauchant par un acide aminé.

Une plaque "PEPSCAN" de 96 octapeptides synthétisés en parrallèle (2 peptides de contrôle + 94 peptides couvrant la séquence -230 de la protéine G du VRS-A) est préparée selon la technique MULTIPINTM décrite par Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81,

3998-4002.

Ces peptides sont synthétisés sur support solide à l'extrémité de 96 "pins" (8 x 12) complémentaires d'une plaque de microtitration ELISA dans laquelle sera effectuée directement le criblage d'anticorps

monoclonaux ou polyclonaux (sera).

Système de repérage des positions des pins et des puits Le système de numérotation utilisé est le suivant: position AI1(1) = Plaque n A, ligne 1 (12 lignes) colonne 1 (position H1 en

ELISA)

position A2(1) = Plaque n A, ligne 2, colonne 1 (position H2 en ELISA) A 1(1): peptide de contrôle # 1: PLAQGGGG A2(1): peptide de contrôle # 2: GLAQGGGG A3(1): octapeptide # 1: TVKTKNTT A4(1): octapeptide # 2: VKTKNTTT etc...... A12(8): octapeptide # 94: KEVPTTKP * Synthèse La synthèse correspond à plusieurs cycles de déprotection, de lavages et de couplage jusqu'à obtention des séquences peptidiques désirées. A la fin de la synthèse, les peptides sont N- acétylés, avant

l'étape de déprotection des chaines latérales.

Les acides aminés utilisés pour la synthèse sur pins sont protégés par un groupement Fmoc (9-Fluorénylméthoxycarbonyl) et les groupements protecteurs des chaines latérales suivants: t-Butyle ether (tBu) pour la Serine, la Thréonine et la Tyrosine, t-Butyle ester (OtBu) pour les Acides Aspartique et Glutamique, t-Butoxycarbonyle (Boc) pour la Lysine, l'Histidine et le Tryptophane, 2,2,5,7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyle (Pmc) pour l'Arginine, Trityle (Trt) pour la Cystéine, l'Asparagine et la Glutamine. L'activation de la fonction acide est effectuée avec de la Diisopropylcarbodiimide (DIC) et du 1-hydroxybenzotriazole (HOBt)

dissouts dans du DMF.

Fmoc-déprotection et lavages: La plaque de pins est immergée dans un bain contenant 200 ml d'une solution de pipéridine à 20% dans le DMF (40/160 ml) pendant 20 min. à température ambiante sous agitation. Les pins sont ensuite retirés du bain. L'excès de solvant est éliminé en frappant le bloc de pins sur du papier-linge. Les pins sont lavés dans 200 ml de DMF pendant 2 min. à température ambiante sous agitation. Le bloc est frappé sur du papier-linge et immergé

complètement dans un bain de MeOH pendant 2 min. sans agitation.

Les pins sont immergés dans 200 ml de MeOH ensuite (3 bains de 2 minutes, 200 ml/bain). La plaque est séchée pendant 30 min. Couplage des Fmocamnino acides: Les Fmoc-amino-acides subissent une étape d'activation avant de pouvoir être couplés. La durée d'une étape de couplage est de 2 heures pour une concentration de mM avec 1.5 équivalent d'HOBt et 1.2 équivalent de DIC. Un logiciel permet de calculer les quantités de réactifs nécessaires pour l'étape de couplage. Les pesées sont effectuées dans des tubes classés par ordre alphabétique du code à une lettre des acides aminés. Les tubes sont remplis en dehors de la balance sur une feuille de papier linge, puis pesés jusqu'à l'obtention d'une masse proche de celle indiquée sur la feuille de pesée. La masse ne doit pas être inférieure de 0.2 mg ni

supérieure de 0.9 mg par rapport à la quantité théorique.

Etape de couplage: Les pins sont introduits délicatement dans les puits. La boite est fermée soigneusement et laissée sous une hotte pendant la durée du couplage pendant 2h pour une concentration en acides aminés de 100mM. Un couplage de 2h permet de réaliser 3 couplages par jour. Traitement des blocs de pins après couplage: Les pins sont retirés de la plaque contenant les solutions de couplage et lavés avec 200 ml de

* MeOH sous agitation pendant 5 min. Le bloc est frappé sur du papier-

linge et laisser sécher pendant 2 min. Le bloc est placé dans 200 ml de DMF et lavé pendant 5 min. sous agitation avant d'effectué le cycle suivant de déprotection. La plaque est lavée classiquement et subit l'étape de clivage des groupements Fmoc comme décrit ci-dessus après

le dernier couplage.

Acétylation des amines terminales: les tête de pins sont mises à incuber dans les puits d'une plaque contenant 150p1 du mélange réactif suivant: DMF/Anhydride acétique/triétylamine 50/5/1 (v/v/v). Le bloc est enfermé dans une boite pendant 90 min. à température ambiante. Le bloc est lavé ensuite avec 200 ml de MeOH pendant 15 min. puis séché pendant 15 min. Déprotection des chaines latérales: les groupements protecteurs des chaînes latérales sont éliminés en immergeant les pins dans 200 ml d'un mélange TFA/anisole/Ethanedithiol 190/5/5 ml pendant 2 h 30 à température ambiante. Après cette étape de déprotection, le bloc de pins est retiré de la solution acide. La boite est rincée une fois au MeOH, puis remplie de MeOH pour y immerger complètement le bloc de pins pendant 10 min. Le bloc est alors frappé sur du papier-linge puis immergé dans 200 ml d'un mélange MeOH/eau/acide acétique (100/100/1 ml) pendant 1 heure et frappé à nouveau sur du papier

linge. Le bloc est mis sous-vide dans un dessiccateur pendant une nuit.

Exemple 12: ELISA La plaque portant les pins est saturée 1 heure à 37 C en tampon de saturation (PBS, Tween 0.1%, gélatine 1%), lavée 10 min en PBS et incubée une nuit à 4 C sous agitation avec le sérum à analyser préalablement dilué. La plaque est ensuite lavée 4 fois 10min en PBS et incubée une heure à température ambiante avec un anticorps secondaire marqué à la peroxydase, dilué au 1/5000 e. Après 4 lavages en PBS, le substrat TMB est ajouté. L'arrêt de la réaction est effectué par

addition d'acide sulfurique.

Le résumé des données résultant de l'analyse d'un sérum murin anti BBG2Na par la méthode du Pepscan B est représenté sur la figure 9. Les figures 9A et 9B montrent une réactivité du sérum de souris anti-BBG2Na contre 4 régions de la molécule G2Na (les résidus en trait gras représentent les acides aminés jouant un rôle important dans la reconnaissance Ac/Ag): - la région 1 située entre les résidus 150 et 159 dont la séquence est QRQNKPPNKP. Cette région est comprise dans le peptide G5a (144-159)

et correspond à la zone de réactivité de l'anticorps monoclonal 5C2.

- la région 2 située entre les résidus 176 et 189 dont la séquence est CSNNPTCWAICKRI. Il s'agit d'une région localisée au niveau du peptide G1ACa (174-187) et correspondant à la réactivité des anticorps

monoclonaux 18D1 et 5D3.

- la région 3 située entre les résidus 194 et 207 dont la séquence est PGKKTTTKPTKKPT. Cette séquence correspond à une réactivité au niveau du peptide G9 (194-204), réactivité déjà mise en évidence lors de

la production d'anticorps monoclonaux dirigés contre BBG2Na.

- la région 4 qui s'étend sur une large zone allant du résidu 155 au résidu 176 semble être le résultat de différentes réactivités. L'une de ces réactivité qui couvre une région très hydrophobe de la molécule G2Na (Gl la) correspond à la zone de reconnaissance de l'anticorps monoclonal 5B7 (obtenu après immunisation de souris BALB/c par le candidat vaccin BBG2Na) dont le pepscan B est représenté ci-dessous

dans la figure 10.

Cet anticorps monoclonal reconnaît la séquence FEVFNFVP (165-

172). L'ensemble des quatre réactivités ci-dessus a par ailleurs été confirmé par la titration du sérum anti-BBG2Na au moyen de différents ELISA mis au point pour chacune des réactivités. Le tableau I montre que le sérum anti-BBG2Na présente bien des activités "anti-G4a, G5a

cys, G9a cys et G1 la".

Tableau I: Titres anti-G4a, GSaCys, G9aCys et G11ACa exprimés en

log1o du sérum anti-BBG2Na ref. BE-02.

Titre(logïo) BE - 02 G2Na 5.9 KLH-G4a 4.7

KLH- 5.0

G9aCys

KLH- 3.8

G5aCys P40-G1 1ACal3.5 Conclusion L'étude d'un sérum anti-BBG2Na par la technique du Pepscan montre que l'immunisation de souris avec BBG2Na génère des anticorps contre 4 épitopes B situés respectivement dans les régions 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176. Cette technique permet donc de

confirmer l'importance de la région 164-176 (G 11ACa).

Ces résultats sont, par ailleurs, en parfait accord avec les données ELISA concernant la réactivité d'un sérum anti-BBG2Na sur les

peptides G4a, G5aCys, G9aCys et Gl lACa.

LTSIEE] SÉaENMS InfEaKtcn pcur la SEl ID N: 1 GACa IYPE EE SB E: acides anines et ucletides LC =R ME LA S E;: 14 acids anm-és, 42 rnuzléotides RE DE RINS: simple (NTI EN: 'irie TYEE E LE. peptid e

174 176 182 186 187

N - Ser Ile Cys Ser Asm Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys - C '- Poe ATC =IC AXr APC APC 0S PCC IGC T(33 GC ATC PoC AAA - 3' Infrtin pcur la SE ID NO: 2 G 'ACa Y EE SSIIE: acides aminrs LT IR EE LA SEB; : 14 acides arnans NCl E BRIS: simple CI/RATICN: linéaire TY E E ir E: peptide

174 176 182 186 187

N - Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Mhr O:n Ip Ala Ile Ser Lys - C In fa- tin pour la SE ID NO: 3 G1ACb TYPE S J5:E: acides amires et rcléotides LCIJR nEE LA SE: 14 acides aminés, 42 rcléotides NDJRE EE BINS: sinple CUFI i: linéaire TYEE M//IIE: peptide

174 176 182 186 187

N - Ser Ile Cys G2y Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Ser Lys - C ' - rC AC C (C AAC AC CPG C= IC AAA PG A/ PGC APA - 3' InfG=naticn pour la SEQ ID N: 4 Gi'ACb TI'E S'JEr=: acides aminés L2 ER E LA SE2JENE: 14 acides aminés NUIEOE DE ERINS: simple OCC IGLP=CN: ie TYPE IE %rIBOLR: peptide

174 176 182 186 187

N - Ser Ile Asp Gly Asn As n Gln Ieu OCn Lys Ser Ile Ser Lys - C Infcmation pour la SEQ ID NO: 5 G5a IYPE DE SEQISE: acides aruws et nirxldtides LLE3lIUR EE LA SESJE'NE: 16 acides anminérs, 48 rniléoticdes NvEBRE EE E: simple CCNFIGURPIICN: linéaire TYP E ECLB_: petide

144 159

N - Ser Lys Pro Mar 'lnr Lys Gln Arg Gn Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro - C

' - AGC AAA C ACC ACC- AAA CPG = CPG AAC AAA CCS CCG AAC AAA C - 5'

Infoatin p:ur la SEQ ID O: 6 G5b IYPE DE SE: acides amiu-s et ruléotides LCNSUER EE LA SEL=: 16 acides amTiés, 48 ncléotides NZERE DE E?: sinple CCNFI1RAION: linéaire TYP IE L3LE: peptide

144 159

N - Asn Lys Pro Ser Tbr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro - C ' - AAC AAA CCG AGC ACC AAA AG AGr AAA AAC COS CCS AAA AAA CCG - 3' Inf. ti.i poir la SB2 ID NO: 7 G7a IYPE CE S JE E: acides anules et xcleotides LNUUR IEE LA S5Er: 33 acides airis, 99 ricléotidèes NERE IE BRIN: simple CONFIU: liaire TYPE E M l: protéine

158 173

N - Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile ' - AA COM AAC AAC GAT TIC CAT TIC GA GIG TIC AAC TIC GIG CCG SCe PoC AC

176 182 186 190

Cys Ser Am Am Pro I-r Cys ITp Ala lie Cys Lys Arg lie Pro - C ISC P3 AC A AP PC C CM ie G' S 1ATC ITGC AAA ATC C[ - 3 Infcn ticE p:xr la SE2 ID NO1: 8 G7b IYPE SEEE: acides ares et ri=létides LC = i EE LA S5ICE: 33 acides airés, 99 rlcléotides 2 ER E EBRIN: simple CNFIG([CN: linaire iEE r"',,'',,'',q '-T-Y protéine

158 173 176

N - Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser lie Cys Gly S '- -AA CG1 AAA GPT GL 'IC (C TIC llC GlA TIC AzC TIC GIG CC 'lC oe AC leC GC

182 186 190

Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Ibr Ile Pro - C AAC AAC CPG CMG TC AAA A3C ATC IC AAA PAe ATC CM - 3' Infa.,ati.: pcur la SFQ ID NO: 9 G8a IYE SI JE: acides anfnés et nrclétides LCSI=R]EE LA S BE] C: 43 acides ar/nés, 129 rniléotides N EE BRINS: sinple ZNFItlRPTICN: linare T Y DLULE E protéine

158 173 176

N - Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn the Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser ' - AA C AAC AC AT TIC CAT TIC GAA GIG TIC AA TIC GIG C C Poe C AC lC PC

182 186 197

Asn Asn Pro Ihr Cys rp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr AAC A 0C C LC 'le = l T ATC AA C AC AAAC AAA =13C AA AAA AC hrThr - C

ACOGA0C - 3'

Infrmtionx pour la SID NO: 10 G8b IYPE nE IE S: acides anifrs et nrclctides LCNLEUR EE LA SJENOE: 43 acides amns, 129 rnuléotides N3EARE EE BE/iN: sinple C GLFPACN: li'aire TYP E NDE L E protéine

158 173 176

N - Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe As Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly '- AAPA CS APA GAT GA iC (C TIC GA GIG TIC ACC TIC GIG CC TSc C A TC AM TZ GC

178 182 186 198

Asn Asn Gln Laeu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Ihr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro

AAC AAC G CG TCI C A AAA TW AIC ICC AAA AG AAC CA AA ACA A AAAAG AAA CCG

Thr Ile - C

AATC - 3'

_nEcnmaticn pour la SE ID NO: 11 G9a TYP E E SEEe: acides anurs et nruclotides LCNGJR LE LA SBEU: 15 acides amnrés, 45 rnxléotides NCFIE E DE _: sinple CNFIGRATICN: lineaire TYPE n:LES=: protéine

204

N - Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Uhr Ihr Thr Lys Pro Thr Lys - C '- CM AAC AAA AAA CC3 G3C AAA AAA AoCC AAA ACCAA A CC AAA-3' Infonmtion pour la SEQ ID NO:12 G9b TYPE E SE CE: acides armriés et ricléotides LONGULUR E LA SEJEM: 15 acides amirés, 45 nic1ltides N1MRE DE M': simple CZFIGRPTIPCN: limare TYPE E: "'rL'.E: protéine

204

N - Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn - C

'- C AS AAC AAA CM AAA AG AAA CC ACC ATC AAA COS AM AAC - 3'

Incrmation por la SEQ ID NO: 13 Glla TYPE EE SEB J: acides amunes et nrclo.tides LCQLUR EE LA SEU: 13 acides amirés, 39 rnlicotides NCMBRE DE ERINS: simple UFTGURAIICN: linéaire EE NDLIL: potéioe

164 176

N - His he Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Tle Cys -C '- CT TIC CA GIG TIC AAC TIC GITG CCS IGCl AC TC -3' Infcrticn pE.x la SE2 ID NO: 14 G.làCa TYPE e SBJ EE: acides anes et rcléotides LQ'JUER iE IA SENLE: 13 acides aminrs, 39 rnjcléotides NZM3E EE BRI/: sinple C=GLATI(CN: linéaire TYPE DE I: protéire

164 176

N - His Phe Glu Val Pe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys -C 51 '- CT TIC GA GIG TIC AAC TIC GIG C(; Poe;C AC =C -3' Inifn -tin la SE ID lNO: 15 G2al TYPE E SJE: acides amines et rnl:lotides IL[ ER E LA S B: 101 acides aniés, 303 rcléotides NCERE IE INS: simple CCtZINRMICN linéaire TYPE E ELE: protéine N - M-r Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr 'hr Ihr Gln Thr G(n Pro Ser Lys Pro 2hr hr Lys S'- P GIG AAA PAC AAA APC Ae PAM PAM PAoe CG A CPG PCM P AAA C PL PeC; AAA Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp he His Phe Glu Val Poe Asn Phe CP r CPG A;C AAA C AAC AAA = AAC A (T TIC k TIC GA GIG TIC C

171 173 176 182 186 191

Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser An Asn Pro Thr Cys ITrp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Ser GS e oe =AC e Poe C P AC =AM = C GC ATC Toe AAA A= C "s Ar

192 195 198

Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro nlr Thr Lys Pro TMr Lys Lys Pro nhr Phe Lys Ihr hr Lys APC AAA CS APG AAA AAA PC oe APA 02 PCC AAA ANA C ;C TIC AAA PLC PLC AAA

213 230

Lys Asp His Lys Pro Gln Ihr Ihr Lys Pro Lys Glu Val Pro Ihr Ihr Lys Pro C AAA AU CT AAA C/ CAO AMC PA AAA CS AAA GA GIG CCS PeC Poe AAA " - 3' Infa2mticn pour la SB D NO: 16 G2a2 TYP E E SEE: acides amirnés et rnrléotides LC R I:EE LA SBE: 101 acides andr, 303 ricléotides EE INS: sirrple FGL CN: linéaireZ TYPE IE I-TT: protéaine N - Ihr Val Lys Tir Lys Asn ir hir Ihr Ihr Gln Tnir Gln Pro Ser Lys Pro Mhr Ihr Lys - PAeC GIG APA ACC AAA AAC PCC AG PCC l C CG ALC CPG CC PA AAA CC ACC PCE AAA

157 160 161 163

Gln Arg G(n Asn Lys Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tr His Pe Glu Val he Asn h

CT CS APC AA A CM AA AM A CUS AA GPC GAT IC CAT T GA GIG TIC APC T

171 173 176 182 186

Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn SIG asc GA C A ASC AAC AAC / CCG U SGO APC =c AAA T AC C AC Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Ihr tir Lys Pro hr Lys Lys Pro tnr Phe Lys Ihr Ihr Lys AAA AAA CI (G3C AAA AAA ALC AO Ao AAA C!X APC AAA AAA CS A TIC AAA APC P AAA

213 230

Lys Asp His Lys Pro Gln hr Mir Lys Pro Lys Glu Val Pro Ihr thr Lys Pro - C AAA GAT CaT AAA CM CPG PC oeC ACA CM AAA (PA GIG CI P AM AAPA C - 3' Infcratit pour la SE ID): 17 G2a3 TYPE]E SB:UE: acides ads et mrléotides LU P DEE LA S5EJE: 101 acides ainrés, 303 rclétides UEîE DE BRS: sirple CinFBI CTN: 'a I:E DCEU R prtén N - Thr Val Lys Ihr Lys Asn Ihr Ihr Ihr]ir GI n Thr Gin Pro Ser Lys Pro thr Tir Lys ' - ACC GIG AAA AM AAA AAC PeC P{i PCC AM G PD A C M PoC AAA fI PCC ALC APA

157 160 161 163

Gln Arg GIn Ash Lys Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Iyr His Phe Glu ValPhe Asn Phe CG C cG AAC AA C AA AA CGA AM AGC GU WC CkT TC GPA GIG T APC TC

171 173 176 182 186 191

Val Pro Cyse Ile Cy Ser e SerAAsn As Pro hr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Ser GIGs CM Toc CI A TC C C AAC AAC CM ACT TW USO AM 7oC AA = mU CM PGC

192 195 198

Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro tir tr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Ihr Pe Lys thr tir Lys AAC AAA C APG AAA AAA A Ai APAA C AoC AAA APA = Te C AAA C-C PI PA

213 230

Lys Asp His Lys Pro G(in Thr Thr Lys Pro Lys (Glu Val Pro Thr thr Lys Pro - C AAA GT CCT AAA 1 PG AoC A AA AAA C AA G C'G Aoe AC AAA C3 - 3' Infaatian pour la SE2 ID: 18 G9v IYPE BE SJE: acides amriés et r1. clotides L(3UELR EE LA SBJEE: 15 acides arrnés, 45 nr_éotides NZMqOE IE E S: simple 1FILRPATICN: 1inéaire TYPE E MYLELE: protéire

204

N - hr Glu Arg Ala Pro Ser Arg Ala Pro Thr Ile Ihr Leu Lys Lys - C , - PA3 GDA P GC CM Ao3C AGP GC7 CIE DER AtC Ae C= AAA APG - 3' Info.i pax la SEO ID N: 19 Gv TYE E SEJENEE: acides annes et rcléotides LCrJR DEE LA SE9J E: 16 acides amirns, 48 rzilétides NC4ERE [E E: simple Y EE E;LE: peptide

144 159

N - Arg Lys Pro Pro Lie Asn Pro Ser Gly Ser Ile Pro Pro Glu Asn His - C 51 - PG.A/A O23:CM PIT AAT O: Z/CA GSI AGC ATC 0CM 0CM GzA AAC CAT - 3' IrnfkIntinpo ir la SQ ID M): 20 G4A iYPE nE SBE: acides amins et ncleotides LCNLIR DE LA SEENCE: 17 acides an-d, 42 rucléotides NaMBRE EE ERIS: simple CCbêFIGCPTICN: é e TY IE N E: peptide

171 173 176 182 186 187

N - Val Pro cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro nhr Cys Trp Ala Ie Cys Lys - C '- GIG CECG IC PC AIZ' SC ', C A C APPC PC CC 'IoT T3G GC PIC AOC AA - 3' InEcnatipn pcur la SE ID N3: 21 G4B TYPE E SCB E: acides aminés et nilctides LCNJUR EE LA S ENOE: 17 acides aan-és, 42 rnzCléotides NiEMBE nE EM S: simple OUFIGRATICN: lineaire TYPE Iv NBL.E: peptide

171 173 176 182 186 187

N - Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly A Asn As Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys C ' -GIG CCC TGCI Poe ATSACT C (3 AC APC CPG CIM TSC AA ASC AIC TGC AAA 3' Infocnaticn pour la S0Q ID N: 22 G4V TYPE EE SEILNCE: acides amires et nr!léDtides LNEXI3E DE LA SEJENE: 17 acides arirnés, 51 nrcléotides ND4BRE LE E2INS: simple TZ'E]>rLE= Leptd

171 173 176 182 186 187

N - Val Pro Cys Ser Ihr Cys Glu Gly As Leu Ala Cys Leu Ser LIu Cys His - C ' - GIT oC r AC: P- GA G=- AAT CIT GM C TIA CCI CT - 3'

Claims (29)

REVENDICATIONS

1. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un épitope de la protéine G du VRS correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séquences peptidiques comprise respectivement entre les résidus d'acides aminés 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences

présentant au moins 80% d'homologie.

2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont diriges contre un peptide porté par la séquence comprise entre les

résidus d'acides aminés 130 et 230 de la protéine G du VRS, sous-

groupe A ou sous-groupe B.

3. Anticorps selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en

ce qu'il est dirigé contre un peptide présentant au moins l'une des séquences ID n 1, ID n 2, ID n 3, ID n 4, ID n 5, ID n 6, ID n 7, ID n 8, ID n 9, ID n 10, ID n 11, ID n 12, ID n 13, ID n 14, ID n 15,

ID n 16, ID n 17, ID n 18, ID n 19, ID n 20, ID n 21 et/ou ID n 22.

4. Peptide susceptible de générer un anticorps selon l'une des

revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente au moins une des

séquences choisies parmi les séquences ID n 1, ID n 2, ID n 3, ID n 4, ID n 5, ID n 6, ID n 7, ID n 8, ID n 9, ID n 10, ID n 11, ID n 12, ID n 13, ID n 14, ID n 15, ID n 16, ID n 17, ID n 18, ID n 19, ID n

, ID n 21 et/ou ID n 22.

5. Peptide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins un résidu cystéine en position N-terminale

ou C-terminale.

6. Agent immunogène, caractérisé en ce qu'il comporte au moins

un peptide selon l'une des revendications 4 ou 5, couplé à une protéine

porteuse. 7. Agent immunogène selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine porteuse est choisie parmi les OmpA de bactéries gram négatif et leurs fragments, la protéine TT, la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque et ses fragments et la sous-

unité B de la toxine cholérique (CTB).

8. Agent immunogène selon l'une des revendications 6 ou 7,

caractérisé en ce que la protéine porteuse est une OmpA d'une bactérie

du genre Klebsiella.

9. Agent immunogéne selon l'une des revendications 6 à 8,

caractérisé en ce que le peptide est conjugué à la protéine porteuse par

une protéine de liaison.

10. Agent immunogène selon la revendication 9, caractérisé en ce que la protéine de liaison est choisie parmi un récepteur de l'albumine sérique de mammifère et les récepteurs présents à la

surface des cellules mucosales.

11. Agent selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce

que le couplage est un couplage covalent.

12. Séquence nucléotidique codant pour un agent immunogène

selon l'une des revendications 6 à 1 1.

13. Séquence nucléotidique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une molécule d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour la protéine porteuse, de l'ADN codant pour un peptide selon l'une des

revendications 4 ou 5 ou l'un de leurs fragments, fusionné avec un

promoteur. 14. Séquence nucléotidique selon la revendication 12,

caractérisée en ce qu'il s'agit d'une molécule d'ARN.

15. A titre de médicament, anticorps selon l'une des

revendications 1 à 3, peptide selon l'une des revendications 4 ou 5,

agent immunogène selon l'une des revendications 6 à 11, ou séquence

nucléotidique selon l'une des revendications 12 à 14.

16. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle

contient au moins un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, un

peptide selon l'une des revendications 4 ou 5, un agent immunogène

selon l'une des revendications 6 à 11, ou une séquence nucléotidique

selon l'une des revendications 12 à 14, et des excipients

pharmaceutiquement acceptables.

17. Utilisation d'au moins un anticorps selon l'une des

revendications 1 à 3, d'au moins un peptide selon l'une des

revendications 4 ou 5, agent immunogène selon l'une des revendications

6 à 11, ou séquence nucléotidique selon l'une des revendications 12 à

14, pour la préparation d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B. 18. Kit de diagnostic,- caractérisé en ce qu'il comprend un

anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, un peptide selon l'une

des revendications 4 ou 5, un agent selon l'une des revendications 6 à

11 ou une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 12 à

14. 19. Procédé de préparation d'un agent immunogène selon l'une

des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que le couplage entre le

peptide et la protéine porteuse est réalisé par voie chimique.

20. Procédé de préparation d'un agent immunogène selon l'une

des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que le couplage est réalisé

par la technologie de l'ADN recombinant.

21. Procédé de préparation selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on introduit une

séquence nucléotidique selon l'une des revendications 12 à 14 dans une

cellule hôte.

22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique est un gène de fusion qu'on introduit par l'intermédiaire d'un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un

bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmide.

23. Procédé selon l'une des revendications 21 ou 22, caractérisé

en ce que le gène de fusion est intégré dans le génome de la cellule hôte.

24. Procédé selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en

ce que la cellule hôte est un procaryote.

25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la cellule hôte est choisie dans le groupe comprenant: E. coli, Bacillus,

Lactobacillus, Staphylococcus et Streptococcus.

26. Procédé selon les revendications 21 à 23, caractérisé en ce

que la cellule hôte est une levure.

27. Procédé selon les revendications 21 à 23, caractérisé en ce

que la cellule hôte est une cellule de mammifère.

28. Procédé selon les revendications 21 à 23, caractérisé en ce

que la cellule hôte est une cellule d'origine végétale.

29. Procédé selon les revendications 21 à 23, caractérisé en ce

que la cellule hôte est une cellule d'insecte.

30. Procédé selon les revendications 21 a 23, caractérisé en ce

que l'on utilise un vecteur viral.

31. Procédé selon l'une des revendications 20 à 27, caractérisé en

ce que la molécule de fusion est exprimée, ancrée et exposée à la

membrane des cellules hôtes.

32. Composition utile selon la revendication 16 en ce que les anticorps monoclonaux sont humanisés et produits par la voie recombinante. 33. Composition utile selon la revendication 16 en ce que les anticorps monoclonaux sont obtenus par la méthode de librairie de phages.