WO1999003987A2 - Epitopes du vrs et anticorps les comportant, utiles dans le diagnostic et la therapie - Google Patents

Epitopes du vrs et anticorps les comportant, utiles dans le diagnostic et la therapie Download PDF

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Alain Beck
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    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to respiratory syncytial virus, and. more particularly to the identification of new epitopes and to the corresponding antibodies, useful in particular in the field of treatment, prophylaxis and diagnosis of the conditions caused by this virus.
  • Respiratory syncytial virus is one of the most common etiological agents encountered in infants and the elderly. Bronchiolitis is often severe in children and requires hospitalization. Currently, there are no means of prevention against RSV disease, the first RSV infection does not prevent against the next. Treatment of severe cases with antibiotic therapy (Ribavirin) and / or combined with immunotherapy (human immunoglobulins) cannot reduce the worsening of the disease. However, this type of treatment is still very expensive. Recent clinical trials with ORAVAX HNK20 monoclonal antibodies (directed against RSV F protein) have not shown efficacy compared to placebo against RSV infection in children.
  • RSV is classified in the family of Paramyxoviridae, genus pneumovirus comprising a non-segmented RNA genome, of negative polarity, coding for 10 specific proteins.
  • Application WO 87/04185 proposed using RSV structural proteins for a vaccine, such as the envelope proteins called protein F (fusion protein) or protein G, a 22 Kd glycoprotein, a protein of 9.5 Kd, or the major capsid protein (protein N).
  • RSV protein G can be useful in the preparation of products intended for the treatment and / or prevention of disorders caused by RSV, subgroup A or B.
  • fragments of the RSV protein G containing specific epitopes, have particularly advantageous properties.
  • New peptide fragments of the RSV protein G can thus be prepared, in particular for the following applications: (i) said peptide fragment coupled or fused, by chemical methods or by genetic engineering, to a carrier, constitutes an effective vaccine against RSV infection, regardless of the mode of administration;
  • the same peptide fragments can be used to generate polyclonal and monoclonal antibodies which are very effective in the prophylactic or therapeutic treatments of the host infected with RSV;
  • these peptide fragments and the monoclonal antibodies can be used as reagents in a diagnostic kit allowing assert and identify infection in the host infected with RSV- ⁇ or RSV-B.
  • the subject of the invention is therefore polyclonal or monoclonal antibodies directed against an epitope of the G protein of RSV corresponding to a sequence chosen from one of the peptide sequences included respectively between the amino acid residues 150-159, 176-189 , 194-207 and 155-176 of the total sequence of protein G of RSV A or B, or of sequences having at least 80%, and preferably at least 98% of homology.
  • These antibodies will recognize peptides carried by the sequence between amino acid residues 130 and 230 of protein G of RSV, subgroup A or subgroup B.
  • G2Na This region corresponding to amino acids 130-230 of protein G of RSV A is hereinafter designated G2Na.
  • G2Na was produced in a bacterium such as E. coli, therefore not glycosylated. It confers, in particular when it is coupled to a carrier such as an OmpA of gram negative bacteria, for example of Klebsiella (protein p40, described in WO 96/14415) or a protein derived from streptococcus (such as the protein binding to serum albumin human, hereinafter called BB, described in WO 96/14416), an immune protection against RSV infections.
  • BB serum albumin human
  • a recombinant protein BBG2al a derivative of BBG2Na where only four residues have been modified on G2Na: the residues Asn (aal91), Lys (aal92), Gly (195) and Thr (aal98) have been replaced by the residues Ser , Asn, Lys and Pro respectively, confers VRS-A or VRS-B cross-protection in BALB / c mice.
  • BBG2a2 where the residues Asn (aal 57), Asn (aal60), ⁇ sn (aal61) and Phe (aal63) have been substituted by the residues Lys, Lys, ⁇ sp and Tyr respectively;
  • BBG2a3 contains the eight modified residues of BBG2a l and BBG2a2.
  • Particularly advantageous peptides according to the invention present in particular one of the sequences chosen from the sequences ID No. 1, ID No. 2, ID No. 3, ID No. 4, ID No. 5, ID No.
  • such a peptide can, in addition, comprise at least one cysteine residue in the N-terminal or C-terminal position.
  • G5a (aal44-159), G1a (aal64-176), G4a (aal72-187) and G9a (aal90-204).
  • the invention therefore also relates to antibodies, monoclonal or polyclonal, directed against a peptide having at least one of the sequences ID No. 1 to ID No. 22.
  • Peptides having one or more units corresponding to epitopes 150-159, 176-189, 194-207 and 155-176 of the GRS protein G sequence will be very useful for the various embodiments of the invention.
  • Peptides according to the invention, coupled to a carrier protein are useful as immunogens.
  • the carrier protein is advantageously chosen from the OmpA of gram negative bacteria and their fragments, the TT protein (tetanus toxoid), the human serum albumin binding protein of Streptococcus and its fragments and the B subunit of cholera toxin. (CTB); preferably, the carrier protein is an OmpA of a bacterium of the genus Klebsiella.
  • the peptide is conjugated to the carrier protein by a binding protein; this binding protein can in particular be chosen from a receptor for serum mammalian albumin and the receptors present on the surface of mucosal cells.
  • the coupling is preferably a covalent coupling, which can be carried out chemically or by recombinant DNA techniques.
  • the invention therefore relates to a nucleotide sequence coding for a peptide or an immunogenic agent as defined above. It may in particular be a hybrid DNA molecule produced by insertion or fusion into the DNA molecule coding for the carrier protein, DNA coding for a peptide according to one of claims 4 or 5 or l 'one of their fragments, fused with a promoter; it can also be an RNA molecule.
  • the peptides, antibodies, immunogens and nucleotide sequences according to the invention can be used as a medicament, and more particularly for the preparation of a composition intended for the preventive or curative treatment of conditions caused by RSV, group A or B.
  • monoclonal antibodies specifically recognizing the peptides G5a and G l ia and G l ⁇ Ca were generated. Passive transfer of monoclonal antibodies 5C2 (anti-G5a) and 18D 1 (anti-G l ⁇ Ca) to naive mice on the one hand prevents infection with RSV-A. And on the other hand, the same 5C2 monoclonal rapidly eliminates a chronic RSV-A infection in immunocompromised mice.
  • the subject of the invention is therefore also a pharmaceutical composition, characterized in that it contains at least one mono or polyclonal antibody, a peptide or an epitope according to the invention, an agent immunogen, or a nucleotide sequence as defined above, and pharmacologically acceptable excipients.
  • the monoclonal antibodies are preferably humanized and produced by the recombinant route. According to another aspect of the invention, they are obtained by the phage library method.
  • the peptides, immunogens, antibodies and nucleotide sequences according to the invention can, according to an embodiment of the invention, enter into the composition of a diagnostic kit.
  • the immunogens can be prepared by recombinant DNA technology, by the introduction of a nucleotide sequence according to the invention in a host cell.
  • This nucleotide sequence can be a fusion gene which is introduced via a DNA vector which comes from a plasmid, a bacteriophage, a virus and / or a cosmid.
  • This fusion gene can, in one embodiment of the preparation process, be integrated into the genome of the host cell.
  • the vector may be a viral vector, known to those skilled in the art.
  • the host cell can be a prokaryote, in particular chosen from the group comprising: E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Staphylococcus and Streptococcus.
  • the host cell can also be a yeast, a mammalian cell, a cell of plant origin or an insect cell.
  • the fusion protein is expressed: secreted, localized in the cytoplasm, or else exposed to the membrane of the host cells.
  • Figures 1 and 2 Principle of cloning the genes G2a l, G2a2 and G2a3 in vectors.
  • Figure 3 A-SDS-P ⁇ GE 20% Gel, staining with Comassie Blue.
  • M Standards of molecular sizes, tracks 1 and 2 proteins BBG2a l (theoretical mass 38.7 Kd) purified by affinity on HSA-Sepharose.
  • Figure 5 A- Immunogenicity of peptides G7a and G8a.
  • Figure 6 Immunogenicity of BBG2al to RSV A ( Figure 6A) and RSV B (6B) and protective efficacy against RSV A (6C) and RSV B (6D).
  • Figure 7 Curative effect of monoclonal antibodies 18D 1 and 5C2.
  • Figure 8 A- Prophylactic efficacy of the 18D 1 monoclonal antibody.
  • Figure 10 Determination of the recognition zone of the 5B7 monoclonal antibody by the Pepscan B method.
  • BHA Bromo hydrosuccimidyl acid
  • CE Capillary Electrophoresis
  • FZCE Free Zone Capillary Electrophoresis
  • HBTU 2- (l H-Benzotriazole- l-yl) - l, l, 3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
  • the peptide G5a is a peptide of 16 amino acids which corresponds to the fragment of the protein G (144-159) of the VRS-A. It is obtained by chemical synthesis on solid phase from the C side to the N-terminal side.
  • the peptides CysG5a and G5aCys correspond respectively to this peptide with an additional Cysteine on the N or C-terminal side which is intended for unequivocal coupling on a carrier protein.
  • the peptides were synthesized using an automatic solid phase peptide synthesizer from the C side to the N-terminal side (FMOC chemistry on the scale of 0.1, 0.25 or 1.0 mmol).
  • the synthesis of the CysG5a peptide is carried out from a Proline preloaded on a resin of HMP type, which allows after cleavage to obtain a free acid function on the C-terminal side or a resin of Rink amide MHBA type, which allows after cleavage to obtain an amide function on the C-terminal side. That of the G5aCys peptide begins with a Cysteine preloaded on one or the other of the resins.
  • the reactive functions of the side chains of the amino acids used are protected by groups compatible with chemistry
  • a coupling cycle takes place as follows: deprotection of the N-terminal amino function of the first amino acid using piperidine, activation of the acid function of the second amino acid to be coupled using HBTU / HMP and coupling.
  • the peptide ' is cleaved from the resin and the side chains are deprotected by reaction with a water / TFA mixture.
  • the peptide is precipitated with ether cooled beforehand to -40 ° C and the mixture is centrifuged. The pellet is washed three times with ether and then dried with nitrogen. The pellet is taken up with water containing 0.1% TFA.
  • Example 2 Coupling of peptides G5a, G7a, G8a, G9a, Gl la and Gl l ⁇ Ca on a carrier protein (P40, BB, TT, KLH).
  • the peptide Gl l ⁇ Ca (Seq ID No. 14) is a peptide of 13 amino acids derived from protein G of the RSV. It corresponds to the sequence 164-176 of this protein. During the synthesis, the Cys residue at position 173 was replaced by a Ser residue in order to keep only one Cys residue in position 176 and avoid the formation of a disulfurc bridge 1 -2 which does not exist in natural protein G (apparently 1 -4 / 2-3).
  • This peptide was coupled using glutaraldehyde (homobifunctional reagent, coupling on the amino and thiol functions) or unequivocally using BH ⁇ (heterobi onctional reagent, coupling on the thiol function of Cysteine in position C- terminal).
  • the solution is then dialyzed using a 0.1 M phosphate buffer, pH 7 + 0.1% Zwittergent 3-14, overnight at + 4 ° C. with stirring and the solution obtained is stored frozen. • Coupling to the P40 protein using a homobifunctional reagent (glutaraldehyde).
  • conjugates are thawed, sterile filtered (0.22 ⁇ m), aliquoted and stored at + 4 ° C to avoid problems of precipitation.
  • the conjugates are characterized by assaying the proteins by the Lowry method, electrophoresis of the SDS-PAGE type (development with Coomassie blue) and by assaying the amino acids after acid hydrolysis in the gas phase, derivation by PITC and analysis by HPLC.
  • Example 3 Cloning of G2al, G2a2 gene in expression vector pvaBB308 and production of BBG2al and BBG2a2 fusion proteins in E. coli
  • the principle of cloning of G2al gene (Seq ID No. 15), G2a2 (Seq ID No. 16 ) and G2a3 (Seq ID No. 17) in the vectors is explained in Figures 1 and 2.
  • G2al The gene coding for the protein G2al (Seq ID No. 15) is constructed by site-directed mutagenesis using the plasmid pRIT28G2Na as starting material. For this, two PCR reactions (Polymerase chain reaction) are carried out with the pairs of oligonucleotides RIT29 / TH 137 (PCR 1) on the one hand and RIT30 / TH 136 (PCR 2) on the other hand under the following conditions:
  • the fragments obtained, respectively 262 bp and 208 bp for reactions 1 and 2 are fixed on magnetic beads.
  • 25 ⁇ l of DYNAL® M-280 magnetic beads coupled to streptavidin are rinsed twice beforehand with TE buffer (10 mM Tris; EDTA ImM, pH 7.5) and then incubated for 20 minutes at 37 ° C with 90 ⁇ l of amplification reactions 1 and 2.
  • the fragments are denatured by incubating the magnetic beads with 50 ⁇ l of 0.15 M NaOH for 10 minutes at room temperature. The two supernatants are recovered, precipitated with absolute ethanol and resuspended in 50 ⁇ l of I ⁇ O.
  • the amplified fragment of 509 bp is digested with the restriction enzymes Psû and HindIII.
  • the generated fragment of 169 bp is cloned in the vector pRIT28 digested with the same enzymes.
  • the plasmid obtained pRIT28G2al down is sequenced with the Dye Deoxy Terminator chemistry according to the protocol described by Applied Biosystem (Perkin Elmer).
  • the plasmid pRIT28G2al is obtained by cloning the PstI / Hindlll fragment from pRIT28G2aldown (fragment downstream of the Pst 1 site) into the vector pRIT28G2Na.
  • the G2al gene is then cloned into the expression vector pvaBB308 at the EcoRI / HindIII restriction sites generating the vector pvaBBG2al.
  • oligonucleotide sequence list is shown below: RIT27: 5 '- GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG - 3'
  • TH 136 5'- CCG ⁇ GA ⁇ AAACCG ⁇ CGACC ⁇ ACCG ⁇ CC - 3 ' ⁇ -1137: 5' - TTTIT ⁇ CTTCGGTITGTTGJCTCGGG - 3 'RIT29: RIT27 biotinylated in 5' RIT30: RIT28 biotinylated in 5 '
  • oligonucleotides used in this construction are the following: RIT29 / TNG 193 (PCR 1) on the one hand and TNG 192 / RIT30 (PCR 2) on the other go.
  • PCR 1 RIT29 / TNG 193
  • TNG 192 / RIT30 PCR 2
  • sequences of the oligonucleotides are described below:
  • TNG 192 5'- CCGCCGAAAAAACCGAAAGACGAT - 3 '
  • TNG 193 5 '- CGAAATGGTAATCGTCTTTCGG - 3'
  • the three insert fragments G2al, G2a2 and G2a3 were cloned into different expression vectors in E. coli, in particular in our examples the vectors pvaBB308 where BB is the gene coding for the albumin receptor.
  • the fusion proteins obtained BBG2al, BBG2a2 and BBG2a3 can be easily purified by affinity on an HSA-Sepharose column (Human serum Albumin).
  • the parameters controlled during fermentation are: pH, agitation, temperature, oxygenation rate, feeding of combined sources (glycerol or glucose).
  • the pH is regulated at 7.0.
  • the temperature is set at 37 ° C.
  • a 30 g fraction of wet biomass is resuspended in 70 ml of TST solution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.05% Tween 20 and 0.5 mM EDTA).
  • the cells are disintegrated by sonication (Vibracell 72401, Sonics & Materials). After centrifugation of the cell lysate, the supernatant is filtered (1.2 ⁇ m) and diluted in 500 ml of TST.
  • the fusion proteins thus obtained in soluble form are purified on an affinity column: HSA-Sepharose (human serum albumin) according to the protocol described by (Stahl et al, J. Immunol. Methods, 1989; 124: 43-52).
  • the insoluble lysate after centrifugation, is washed once with a buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.5; 5 mM MgCl 2 ). After washing, the pellet is dissolved in 30 ml of 7 M guanidine hydrochloride, 25 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM Dithiotreitol (DTT), followed by incubation at 37 ° C for 2 hours. The solubilized proteins are added to a renaturation buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.5); 150 mM NaCl and 0.05% Tween 20).
  • the concentration of guanidine hydrochloride is adjusted to the final concentration of 0.5 M in the renaturation buffer before the addition of the solubilized fusion proteins.
  • the mixture is incubated at room temperature, with moderate shaking, for 16 hours. After centrifugation, the soluble products in the supernatant are purified on an HSA-Sepharose column.
  • the purified fusion proteins are analyzed on SDS-PAGE gel (12%), on the MINI PROTEAN II SYSTEM device (BIORADS). Proteins are visualized with Coomassie brilliant blue R250.
  • the analysis of the recombinant proteins by Immunoblot with antibodies specific for RSV shows that the proteins are antigenic (see example of SDS gel and BBG2al immunoblot in FIG. 3).
  • Example 4 Immunogenicity and protective efficacy of peptides G5a and G9a coupled to P40.
  • mice Groups of 7 mice were immunized twice ip with 20 ⁇ g of P40-G9aCys, P40-CysG5a, or P40-G5aCys. Control mice were immunized with PBS. Alhygrogel (20% v / v) was used as an adjuvant for all immunizations. The mice were taken from the retro-orbital sinus 2 weeks after the last immunization to confirm their seroconvcrsion against VRS-V, challenged a week later with 10 5 TCID 50 VRS- ⁇ by the in route, and sacrificed 5 days post-challenge . The lungs were removed and the titer of virus in the lungs determined.
  • the immunogenicity of the G5a peptide is dependent on the orientation of the coupling to P40. After coupling by the C-terminal part of the peptide, low to moderate anti-RSV-A antibody titers were induced in the serum. On the other hand, after coupling by the N-terminal part, G5a did not induce such antibodies.
  • the G9a peptide, coupled in C-terminal to P40 was weakly immunogenic in terms of induction of anti-RSV-A antibodies.
  • P40-G9acys developed a high anti-RSV-A antibody titer.
  • mice out of 7 immunized with P40-G5acys were protected without evidence of virus in the lungs, the last one had the virus only at the limit of detection of the test.
  • mice immunized with P40-cysG5a had virus titers in the lungs as high as control mice, immunized with PBS.
  • the peptides G5a and G9a contain protective epitopes against an RSV-A infection of the lungs.
  • the orientation of the coupling of G5a to a carrier protein is crucial for its protective efficacy.
  • Example 5 Immunogenicity and protective efficacy of peptides G7a and G8a.
  • mice Groups of 3 to 4 mice were immunized twice ip with 20 ⁇ g of G7a, G8a, BB-G7a, or BB-G8a.
  • Control mice were immunized with PBS.
  • Alhygrogel (20% v / v) was used as an adjuvant for all immunizations.
  • the mice were removed from the retro-orbital sinus 2 weeks after the last immunization to confirm their seroconversion vis-à-vis VRS-A, challenged a week later with 10 TCID 50 VRS-A by the inhalation route, and sacrificed for 5 days. post-challenge.
  • the lungs were removed and the nasal passages washed. The virus titers in the lungs and nasal passages were determined. Results - Humoral immune responses.
  • the peptides G7a and G8a are both immunogenic vis-à-vis the RSV- ⁇ coupled or not coupled to 1313. If we consider the titers of serum antibodies, the unlinked peptides seem to be a little more immunogenic than the coupled peptides.
  • the G7a and G8a peptides contain protective epitopes against the lungs.
  • the peptides are effective whether or not coupled to BB.
  • Example 6 Immunogenicity and protective efficacy of the BBG2al fusion protein.
  • mice were immunized 2 and 3 times, respectively, by ip route with 20 ⁇ g of protein 2 weeks apart .
  • Control mice were immunized with PBS.
  • Alhygrogel (20% v / v) was used as an adjuvant for all immunizations.
  • the mice were removed from the retro-orbital sinus 2 weeks after the last immunization to confirm their seroconversion with RSV-A, challenged a week later with 10 5 TCID 50 VRS- ⁇ by in route, and sacrifices 5 days post-challenge. The lungs were removed and the titer of virus in the lungs determined.
  • BBG2al is capable of inducing anti-RSV- ⁇ and B antibodies.
  • the anti-RSV- ⁇ antibody titer is much higher than the anti-RSV-B antibody titer. Nevertheless, antibody titers against the two strains of RSV are high.
  • mice challenged with VRS- ⁇ were protected without evidence of virus in the lungs (2 mice / 3) or only at the detection limit (1 mouse / 3).
  • the mice challenged with VRS-B were protected, either without evidence of virus in the lungs (1 mouse / 3) or with virus only at the detection limit (1 mouse / 3) or just above this detection limit (1 mouse / 3).
  • the BBG2al fusion protein is very immunogenic vis-à-vis VRS-A and vis-à-vis VRS-B.
  • BBG2al is capable of inducing responses which protect the lungs against a challenge with the 2 subgroups of RSV.
  • EXAMPLE 7 Obtaining the Antibodies 18D1, 5C2 and 5B7
  • Immunization peptide (i) G l ⁇ Ca coupled to KLI I (Kcyhole Lempct Haemocyanin), (ii) G2 ⁇ Ca and (iii) BBG2Na.
  • mice were immunized at OJ with 50 ⁇ g of CF ⁇ antigen (complete Freund Adjuvant) in ip, on D 14 with 10 ⁇ g of each antigen in IFA (Incomplete Freund Adjuvant) in ip, then on D38 in iv with 10 ⁇ g of each peptide without adjuvant.
  • the spleens are removed and fused with the myeloma cells SP2-O at D42 in a 1/1 ratio.
  • the hybridomas positive against each antigen are kept. These hybridomas were injected into mice to obtain ascites and then the different antibodies obtained were selected on different peptides in order to determine the specificity of the antibodies obtained.
  • the 18D 1, 5C2 monoclonal antibodies selected by their specificity against the peptides G l ⁇ Ca, G5a, specifically recognize VRS- ⁇ .
  • the monoclonal antibody 5B7 obtained from BBG2Na and recognizing the peptide G 1 recognizes it VRS-A.
  • Example 8 Curative effect of the 18D 1 and 5C2 monoclonal antibodies on chronic RSV-A infection obtained in SCID mice.
  • mice 10 5 TCID 50 of VRS-A, under 50 ⁇ l. Twenty-six days later, the mice received 50 ⁇ l of an 18D 1 antibody or 5C2 antibody preparation with an anti-RSV-A ELISA titre of 10 4, in and at the rate of 7 mice per group. . Control mice received anti-BB serum with an anti-BB ELISA titer of 10. The mice were sacrificed 5 days later and their lungs were removed for virus titration. Results.
  • Fig. 7 demonstrate that the 18D 1 and 5C2 monoclonal antibodies are capable of eliminating a chronic infection with VRS-A in SCID mice and this in a sterilizing manner. No traces of virus were detected in the lungs at the time of the sacrifice. The results obtained in the lungs of the mice treated with 5C2 correspond to the average of the detection limits of the test, a higher limit due to the lack of sample availability, and not to the presence of virus.
  • the monoclonal antibodies 5C2 and 18D 1 could be used as a therapeutic treatment in the context of pulmonary infections with RSV-A.
  • Example 9 Prophylactic effect of the 18D 1 monoclonal antibody on RSV-A infection in mice.
  • VRS-A received by intraperitoneal injection 200 ⁇ l of an 18D 1 antibody preparation adjusted for the anti-VRS-A ELISA titre of 10 ⁇ .
  • a group of ip transfer control mice received in parallel 200 ⁇ l of an anti-P40 serum preparation (irrelevant serum) adjusted to the anti-P40 ELISA titre of 10%. All the mice are infected the following day by the in route with 50 ⁇ l of a viral suspension containing 10 ⁇ TCID50 of VRS-A. They are sacrificed 5 days later for assay of virus in the lungs. Results.
  • the antibody 18 1 is capable after ip transfer of inducing protection in the lungs of naive mice during a challenge with VRS- ⁇ . All the mice are protected after injection of 200 ⁇ l of 18D 1 as 10 5 . Three out of 7 mice are protected without evidence of virus in the lungs. The others show traces of virus only at the detection limit of the trial (3 mice / 7), or just above this limit (1 mouse / 7). Control mice have titers between log i Q 3.70 and 4.45 per gram of lungs.
  • the 18D 1 antibody is capable of preventing a RSV-V pulmonary infection in B ⁇ LB / c mice. It demonstrates significant prophylactic efficacy.
  • Example 10 Prophylactic effect of 5C2 monoclonal antibody on RSV-A infection in mice.
  • Naive mice seronegative vis-à-vis VRS-A receive by transfer in, 50 ⁇ l of a preparation of 5C2 adjusted to the ELISA anti-VRS-A title of 10 4 .
  • Control mice receive in parallel anti-BB serum adjusted to the anti-BB ELISA titer of 10 4 . All mice are infected the next day by the in route with
  • mice treated with 5C2 at 10 4 were protected at the pulmonary level. Only 1 mouse out of 7 shows traces of virus. Control mice have titers between log i Q 3.70 and 4.70 per gram of lungs.
  • the 5C2 antibody is capable of preventing an RSV- ⁇ pulmonary infection in BALB / c mice. It demonstrates significant prophylactic efficacy.
  • Example 11 Pepscan: example of the multiple synthesis of 94 octapeptides covering the sequence of aa 130-230 of G2Na and overlapping with an amino acid.
  • peptides are synthesized on a solid support at the end of 96 "pins" (8 x 12) complementary to an ELISA microtiter plate in which the screening of monoclonal or polyclonal antibodies (sera) will be carried out directly.
  • control peptide # 1 PLAQGGGG A2 (l): control peptide # 2: GL ⁇ QGGGG
  • the synthesis corresponds to several cycles of deprotection, washing and coupling until the desired peptide sequences are obtained. At the end of the synthesis, the peptides are N-acetylated, before the step of deprotection of the side chains.
  • the amino acids used for synthesis on pins are protected by an Fmoc group (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) and the following side chain protecting groups: t-Butyl ether (tBu) for Serine, Threonine and Tyrosine, t-Butyl ester (OtBu) for Aspartic and Glutamic Acids, t-Butoxycarbonyl (Boc) for Lysine, Histidine and Tryptophan, 2,2,5,7,8-pcntamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) for Arginine, Trityle (Trt) for Cysteine, Asparagine and Glutamine.
  • the activation of the acid function is carried out with Diisopropylcarbodiimide (DIC) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) dissolved in DMF.
  • DIC Diisopropylcarbodiimide
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • Fmoc-amino acids undergo an activation step before they can be coupled.
  • the duration of a coupling step is 2 hours for a concentration of 100 mM with 1.5 equivalent of HOBt and 1.2 equivalent of DIC.
  • Software is used to calculate the quantities of reagents required for the coupling step.
  • the weighings are carried out in tubes classified in alphabetical order of the letter code of amino acids. The tubes are filled outside the balance on a sheet of paper-linen, then weighed until a mass close to that indicated on the weighing sheet is obtained. The mass must not be less than 0.2 mg nor more than 0.9 mg compared to the theoretical quantity.
  • Coupling step The pins are gently introduced into the wells. The box is closed carefully and left in a hood for the duration of the coupling for 2 hours for an amino acid concentration of 100 mM. A 2 hour coupling allows 3 couplings per day.
  • Acetylation of terminal amines the pine heads are incubated in the wells of a plate containing 150 ⁇ l of the following reactive mixture: DMF / acetic anhydride / trietylamine 50/5/1 (v / v / v). The block is enclosed in a box for 90 min. at room temperature. The block is then washed with 200 ml of MeOH for 15 min. then dried for 15 min.
  • the protective groups of the side chains are eliminated by immersing the pins in 200 ml of a TFA / anisole / Ethanedithiol 190/5/5 ml mixture for 2 h 30 at room temperature. After this deprotection step, the block of pins is removed from the acid solution. The box is rinsed once with MeOH, then filled with MeOH to completely immerse the block of pins in it for 10 min. The block is then struck on tissue paper and then immersed in 200 ml of a MeOH / water / acetic acid mixture (100/100/1 ml) for 1 hour and struck again on tissue paper. The block is placed under vacuum in a desiccator overnight.
  • Example 12 ELISA The plate carrying the pins is saturated for 1 hour at 37 ° C. in saturation buffer (PBS, Tween 0, 1%, gelatin 1%), washed for 10 min in PBS and incubated overnight at 4 ° C. with shaking. with the diluted serum to be analyzed. The plate is then washed 4 times 10 min in PBS and incubated for one hour at room temperature with a secondary antibody labeled with peroxidase, diluted to 1/5000 e. After 4 washes in PBS, the TMB substrate is added. The reaction is stopped by adding sulfuric acid.
  • saturation buffer PBS, Tween 0, 1%, gelatin 1%
  • FIGS. 9 ⁇ and 9B show a reactivity of the anti-BBG2Na mouse serum against 4 regions of the G2Na molecule (the residues in bold lines represent the amino acids playing an important role in ⁇ c / Ag recognition): - region 1 located between residues 150 and 159 whose sequence is QRQNKPPNKP. This region is included in the peptide G5a (144-159) and corresponds to the reactivity zone of the 5C2 monoclonal antibody;
  • Region 2 located between residues 176 and 189 whose sequence is CSNNPTCWAICKRI. It is a region located at the level of the peptide G l ⁇ Ca (174-187) and corresponding to the reactivity of the monoclonal antibodies 18D 1 and 5D3;
  • G l la the recognition zone of the monoclonal antibody 5B7 (obtained after immunization of BALB / c mice by the vaccine candidate BBG2Na) whose pepsean B is shown below in Figure 10.
  • This monoclonal antibody recognizes the sequence FEVFNFVP (165-172).
  • Table I shows that the anti-BBG2Na serum indeed exhibits "anti-G4a, G5a cys, G9a cys and Gl1a" activities.
  • Table I Anti-G4a, G5aCys, G9aCys and Gl l ⁇ Ca Titers Expressed in Logio of the Anti-BBG2Na Serum Ref. BE-02.

Abstract

La présente invention concerne un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre un épitope de la protéine G du VRS correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séquences peptidiques comprises respectivement entre les résidus d'acides aminés 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 98 % d'homologie.

Description

EPITOPES DU VRS ET ANTICORPS LES COMPORTANT, UTILES DANS LE DIAGNOSTIC ET LA THERAPIE.
La présente invention se rapporte au virus respiratoire syncytial, et. plus particulièrement à l'identification de nouveaux épitopes et aux anticorps correspondants, utiles notamment dans le domaine du traitement, de la prophylaxie et du diagnostic des affections provoquées par ce virus.
Le virus Respiratoire syncytial (VRS) est l'un des agents étiologiques les plus fréquemment rencontrés chez le nourrisson et chez les personnes âgées. Les bronchiolites sont souvent graves chez l'enfant et nécessitent l'hospitalisation. Actuellement, il n'existe pas de moyens de prévention contre la maladie due au VRS, la première infection au VRS ne prévient pas contre la suivante. Le traitement des cas graves par antibiothérapic (Ribavirine) et/ou associé avec l'immunothérapie (immunoglobulincs humains) ne peuvent pas atténuer l'aggravation de la maladie. Néanmoins, ce type de traitement reste encore très coûteux. Les essais cliniques récents avec les anticorps monoclonaux HNK20 de ORAVAX (dirigés contre la protéine F du VRS) n'ont pas montré d'efficacité du traitement par rapport au placebo contre l'infection du VRS chez l'enfant. Dans les années 60, les tentatives d'immunisation des enfants avec un vaccin VRS inactivé à la formaline avaient pour conséquence l'aggravation de la maladie au lieu de conférer une protection des poumons contre l'infection naturelle au VRS. Associé à ce problème, les diagnostics actuels ne permettent pas d'identifier de manière fiable l'infection au VRS, au moins chez l'adulte.
Le VRS est classé dans la famille des Paramyxoviridae, genre pneumovirus comportant un génome ARN non segmenté, de polarité négative, codant pour 10 protéines spécifiques. La demande WO 87/04185 a proposé d'utiliser des protéines structurales du VRS en vue d'un vaccin, comme les protéines d'enveloppe appelées protéine F (protéine de fusion) ou protéine G, une glycoprotéine de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure de capside (protéine N).
La demande WO 89/02935 décrit les propriétés de protection de la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiées sous forme monomérique ou déglycosylée.
Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de rechercher leurs propriétés neutralisantes.
Dans la demande WO 95/27787, il a été montré que la protéine G du VRS peut être utile dans la préparation de produits destinés au traitement et/ou à la prévention d'affections provoquées par le VRS, sous- groupe A ou B. Dans le cadre de la présente invention, il a maintenant été trouvé que des fragments de la protéine G du VRS, contenant des épitopcs spécifiques, possèdent des propriétés particulièrement avantageuses. De nouveaux fragments peptidiques de la protéine G du VRS peuvent ainsi être préparés, notamment pour les applications suivantes : (i) ledit fragment de peptide couplé ou fusionné, par des méthodes chimiques ou par génie génétique, à un porteur, constitue un vaccin efficace contre l'infection au VRS, quel que soit le mode d'administration ;
(ii) les mêmes fragments peptidiques peuvent servir à générer des anticorps polyclonaux et monoclonaux qui sont très efficaces dans les traitements prophylactiques ou thérapeutiques de l'hôte infecté par le VRS ;
(iii) ces fragments peptidiques et les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés comme réactifs dans un Kit de diagnostic permettant d'affirmer et d'identifier l'infection chez l'hôte infecté par le VRS-Λ ou le VRS-B.
L'invention a donc pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un épitope de la protéine G du VRS correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séquences peptidiques comprises respectivement entre les résidus d'acides aminés 150- 159, 176- 189, 194-207 et 155- 176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 80 %, et de préférence au moins 98 % d'homologie. Ces anticorps reconnaîtront des peptides portés par la séquence comprise entre les résidus d'acides aminés 130 et 230 de la protéine G du VRS, sous-groupe A ou sous-groupe B.
Cette région correspondant aux acides aminés 130-230 de la protéine G du VRS A est désignée ci-après G2Na. G2Na a été produite dans une bactérie telle que E. coli, donc non glycosylée. Elle confère, notamment lorsqu'elle est couplée à un porteur comme une OmpA de bactérie gram négatif, par exemple de Klebsiella (protéine p40, décrite dans WO 96/ 14415) ou une protéine dérivée du streptocoque (comme la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine, appelée ci-après BB, décrite dans WO 96/ 14416), une protection immunitaire contre les infections au VRS. De manière inattendue, il a été montré qu'une série de peptides préparés selon l'invention confère une protection croisée contre le VRS sous-groupe A ou sous-groupe B.
En particulier, une protéine recombinante BBG2al , un dérivé de BBG2Na où seulement quatre résidus ont été modifiés sur G2Na : les résidus Asn(aal91), Lys(aal92), Gly( 195) et Thr(aal98) ont été substitués par les résidus Ser, Asn, Lys et Pro respectivement, confère une protection croisée VRS-A ou VRS-B chez la souris BALB/c. Dans le même but de renforcer une protection croisée, deux nouvelles molécules ont été produites : BBG2a2 où les résidus Asn(aal 57), Asn(aal60), Λsn(aal61 ) et Phe(aal63) ont été substitués par les résidus Lys, Lys, Λsp et Tyr respectivemcnt ; BBG2a3 comporte les huit résidus modifiés de BBG2a l et BBG2a2. Des peptides particulièrement avantageux selon l'invention présentent notamment l'une des séquences choisies parmi les séquences ID n° 1 , ID n° 2, ID n° 3, ID n° 4, ID n° 5, ID n° 6, ID n° 7, ID n° 8, ID n° 9, ID n° 10, ID n° 1 1 , ID n° 12, ID n° 13, ID n° 14, ID n° 15, ID n° 16, ID n° 17, ID n° 18, ID n° 19, ID n° 20, ID n° 21 et/ou ID n° 22, figurant en annexe ; un tel peptide peut, en outre, comporter au moins un résidu cystéine en position N-terminale ou C-terminale.
La réactivité des peptides est mise en évidence par des sondes mono ou polyclonales. Quatre régions de G2Na ont été révélées par cette technique : G5a (aal44- 159), G l la(aal64- 176), G4a(aal72- 187) et G9a(aal90-204).
L'invention a donc également pour objet des anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre un peptide présentant au moins l'une des séquences ID n° 1 à ID n° 22.
Des peptides possédant une ou plusieurs unités correspondant aux épitopes 150- 159, 176- 189, 194-207 et 155- 176 de la séquence de la protéine G du VRS seront très utiles pour les différents modes de mise en oeuvre de l'invention.
Des peptides selon l'invention, couplés à une protéine porteuse, sont utiles comme agents immunogènes. La protéine porteuse est avantageusement choisie parmi les OmpA de bactéries gram négatif et leurs fragments, la protéine TT (tetanus toxoide), la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque et ses fragments et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) ; de préférence, la protéine porteuse est une OmpA d'une bactérie du genre Klebsiella.
Selon l'un des aspects de l'invention, le peptide est conjugué à la protéine porteuse par une protéine de liaison ; cette protéine de liaison peut notamment être choisie parmi un récepteur de l'albumine sérique de mammifère et les récepteurs présents à la surface des cellules mucosales.
Le couplage est de préférence un couplage covalent, qui peut être réalisé par la voie chimique ou par des techniques d'ADN recombinant.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a donc pour objet une séquence nucléotidique codant pour un peptide ou un agent immunogène tels que définis précédemment. Il peut s'agir notamment d'une molécule d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour la protéine porteuse, de l'ADN codant pour un peptide selon l'une des revendications 4 ou 5 ou l'un de leurs fragments, fusionné avec un promoteur ; il peut également s'agir d'une molécule d'ARN.
Les peptides, les anticorps, les agents immunogènes et les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisés à titre de médicament, et plus particulièrement pour la préparation d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B.
Par exemple, des anticorps monoclonaux reconnaissant de manière spécifique les peptides G5a et G l ia et G lΔCa ont été générés. Le transfert passif des anticorps monoclonaux 5C2 (anti-G5a) et 18D 1 (anti- G lΔCa) chez la souris naïve permet de prévenir l'infection au VRS-A d'une part. Et d'autre part, le même monoclonal 5C2 permet d'éliminer rapidement une infection chronique au VRS-A chez la souris immunodéprimée.
L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un anticorps mono ou polyclonal, un peptide ou un épitope selon l'invention, un agent immunogène, ou une séquence nucléotidique tels que définis précédemment, et des excipients pharmaccutiquement acceptables.
Les anticorps monoclonaux sont, de préférence, humanisés cl produits par la voie recombinante. Selon un autre aspect de l'invention, ils sont obtenus par la méthode de librairie de phages.
Les peptides, agents immunogènes, anticorps et séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent, selon un mode de mise en oeuvre de l'invention, entrer dans la composition d'un kit de diagnostic.
Comme indiqué plus haut, les agents immunogènes peuvent être préparés par la technologie de l'ADN recombinant, par l'introduction d'une séquence nucléotidique selon l'invention dans une cellule hôte. Cette séquence nucléotidique peut être un gène de fusion qu'on introduit par l'intermédiaire d'un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmide. Ce gène de fusion peut, dans un mode de réalisation du procédé de préparation, être intégré dans le génome de la cellule hôte.
Le vecteur pourra être un vecteur viral, connu de l'homme du métier.
La cellule hôte peut être un procaryote, notamment choisie dans le groupe comprenant : E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Staphylococcus et Streptococcus.
Mais la cellule hôte peut également être une levure, une cellule de mammifère, une cellule d'origine végétale ou une cellule d'insecte.
Selon l'un des aspects du procédé selon l'invention, la protéine de fusion est exprimée : sécrétée, localisée dans le cytoplasme, ou encore exposée à la membrane des cellules hôtes.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention. Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes. Figures 1 et 2 : Principe du clonage des gènes G2a l , G2a2 et G2a3 dans les vecteurs.
Figure 3 : A-Gel SDS-PΛGE 20 %, coloration au Bleu de Comassie. M = Standards de tailles moléculaires, pistes 1 et 2 protéines BBG2a l (masse théorique 38,7 Kd) purifiées par affinité sur HSA-Sépharose.
B- Immunoblot des protéines BBG2a l avec un anticorps monoclonal 18 D l . Figure 4 : A-Immunogénicité des peptides G5a et G9 a.
B- Efficacité protectrice des peptides G5a et G9a sur les poumons.
Figure 5 : A- Immunogénicité des peptides G7a et G8a.
B- Efficacité protectrice des peptides G7a et G8a sur les poumons.
Figure 6 : Immunogénicité de BBG2al vis-à-vis du VRS A (Figure 6A) et VRS B (6B) et efficacité protectrice contre le VRS A (6C) et le VRS B (6D). Figure 7 : Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5C2. Figure 8 : A- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 18D 1.
B- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 5C2. Figure 9 : Identification des épitopes B de G2Na représentés dans un sérum de souris immunisées par BBG2Na. A : révélation totale ; B : absence de révélation de la région 155- 176.
Figure 10 : Détermination de la zone de reconnaissance de l'anticorps monoclonal 5B7 par la méthode du Pepscan B.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse des peptides.
• Exemple de la synthèse des peptides G5aCys et CysG5a. Abréviations :
AA : acide aminé
Boc : tert Butoxycarbonyl
BHA : Bromo hydrosuccimidyl acide CE : Capillary Electrophoresis
ES-MS : Electrospray - Mass spectrometry
FMOC : Ωuorenylmethoxycarbonyl
FZCE : Free Zone Capillary Electrophoresis
HBTU : 2-( l H-Benzotriazole- l-yl)- l , l ,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate
HMP : p-Hydroxyméthylphénoxyméthyl polystyrène
MBHA : méthylbenzhydrylamine
NMP : N-méthyle-2-pyrrolidone
Pmc : 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl RP-HPLC : Reverse Phase - High Performance Liquide Chromatography
SPPS : Synthèse Peptidique en Phase Solide tBOC : t-butyloxycarbonyl tBu : tertio Butyl
TFA : trifluoroacetic acid Trt : trityle
Le peptide G5a est un peptide de 16 acides aminés qui correspond au fragment de la protéine G ( 144- 159) du VRS-A. Il est obtenu par synthèse chimique sur phase solide en partant du coté C vers le coté N- terminal. Les peptides CysG5a et G5aCys correspondent respectivement à ce peptide avec une Cystéine supplémentaire du côté N ou C-terminal qui est destinée à un couplage univoque sur une protéine porteuse. Ces 2 peptides permettent d'étudier l'influence que peut avoir l'orientation du peptide conjugué à une protéine porteuse sur la réponse immunologiquc observée.
Les peptides ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur automatique de peptide en phase solide du côté C vers le côté N-terminal (chimie FMOC à l'échelle de 0. 1 ; 0.25 ou 1.0 mmole). La synthèse du peptide CysG5a est effectuée à partir d'une Proline préchargée sur une résine de type HMP, qui permet après clivage d'obtenir une fonction acide libre du côté C-terminal ou une résine de type Rink amide MHBA, qui permet après clivage d'obtenir une fonction amide du coté C-terminal. Celle du peptide G5aCys débute par une Cystéine préchargée sur l'une ou l'autre des résines. Les fonctions réactives des chaînes latérales des acides aminés utilisés, sont protégées par des groupes compatibles avec la chimie
FMOC [Cys(Trt) ; Arg(Pmc) ; Asn(Trt) ; Gin (Trt) ; Lys(Boc) ; Ser(tBu) ;
Thr(tBu)]. Un cycle de couplage se déroule de la manière suivante : déprotection de la fonction aminé N-terminale du premier acide aminé à l'aide de pipéridine, activation de la fonction acide du deuxième acide aminé à coupler à l'aide d'HBTU/HMP et couplage. En fin de synthèse, le peptide' est clivé de la résine et les chaînes latérales sont déprotégées par réaction avec un mélange eau / TFA. Le peptide est précipité à l'éther refroidi préalablement à -40°C et le mélange est centrifugé. Le culot est lavé à trois reprises avec de l'éther puis séché à l'azote. Le culot est repris avec de l'eau contenant 0.1 % de TFA. La suspension est à nouveau centrifugée et le surnageant qui contient le peptide est séparé du culot, qui contient la résine. Le peptide brut est purifié par HPLC en phase inverse semi-préparative. L'homogénétié du peptide purifié est vérifiée par HPLC en phase inverse et par électrophorèse capillaire (FZCE). La structure théorique est confirmée par comparaison de la compatibilité de la masse mesurée par spectrométrie de masse de type ES-MS, avec la masse calculée à partir de la séquence théorique en acides aminés. .Peptide CysG5aNH2
Synthèse :
Poids théorique peptidc-résine en fin de synthèse: 593 mg Poids mesuré après séchage à l'azote : 619 mg
Clivage peptide-résine et analyse du peptide brut : 200 mg ( 1 /3 du lot) Masse de peptide brut clivé après lyophilisation : 84 mg (75 % de quantité nette de peptide soit 97 % de rendement) Homogénéité du peptide brut : 97 % (RP-HPLC ; UV 2 10 nm) 97 % (FZCE/MicrocoatI )
Purification :
Masse de peptide purifié après lyophilisation : 50 mg (75 % de quantité nette de peptide soit 58 % de rendement) Caractérisation :
Homogénéité du peptide purifié : > 99 % (RP-HPLC ; UV 210 nm)
> 99 % (FZCE/ MicrocoafM ; UV 200 nm)
Spectrométrie de masse ( ES-MS) Masse calculée : 1951.29 Da
Masse mesurée : 1950.80 Da ± 0.31
Exemple 2 : Couplage des peptides G5a, G7a, G8a, G9a, Gl la et Gl lΔCa sur une protéine porteuse (P40, BB, TT, KLH).
• Exemple du couplage du peptide Gl lΔCa sur la protéine P40.
Le peptide Gl lΔCa (Seq ID n° 14) est un peptide de 13 acides aminés issu de la protéine G du VRS. Il correspond à la séquence 164- 176 de cette protéine. Lors de la synthèse, le résidu Cys en position 173 a été remplacé par un résidu Ser afin de ne conserver qu'un seul résidu Cys en position 176 et éviter la formation d'un pont disulfurc 1 -2 n'existant dans la protéine G naturelle (apparicment 1 -4/2-3).
Ce peptide a été couplé à l'aide de glutaraldéhyde (réactif homobifonctionnel, couplage sur les fonctions aminés et thiols) ou de manière univoque à l'aide de BHΛ (réactif hétérobi onctionnel, couplage sur la fonction thiol de la Cystéine en position C-terminale).
• Couplage univoque par le BHA • Solubilisation du peptide Gl lΔCa.
2 mg de G l lΔCa sont solubilisés dans 2 ml de tampon phosphate 0, 1 M pH 7 + 0, 1 % Zwittergent 3- 14.
• Couplage univoque sur la protéine P40 à l'aide d'un réactif hétérobifonctionnel (BHA).
3 mg de BHA en solution dans 25 μl de DMF sont ajoutés à 2,5 mg de protéine P40 préalablement dialyses contre un tampon phosphate 0, 1 M pH7 + 0, 1 % Zwittergent 3- 14 et agités pendant 1 heure à température ambiante. Après dessalage sur colonne PD 10 et élution avec un tampon phosphate 0, 1 M pH 7 + 0, 1 % Zwittergent 3- 14 des fractions de 500 μl sont collectées et les tubes contenant la protéine bromoacétylée sont rassemblées (lecture de DO à 280 nm) dans des tubes contenant 0,95 ml de solution du peptide Gl lΔCa sont ajoutés. Le milieu réactionnel est saturé avec de l'azote et agité à l'obscurité pendant 2 heures à température ambiante. La solution est dialysée ensuite à l'aide d'un tampon phosphate 0, 1 M pH 7 + 0, 1 % Zwittergent 3- 14 pendant une nuit à + 4°C sous agitation et la solution obtenue est conservée congelée. • Couplage sur la protéine P40 à l'aide d'un réactif homobifonctionnel (glutaraldéhyde).
10 mg de P40 sont dialyses contre un tampon phosphate 0, 1 M pl i 7 + 0, 1 % Zwittergent 3- 14. La concentration est ajustée à 2 mg/ml à l'aide d'un tampon carbonate 0, 1 M pH 9 + 0, 1 % Zwittergent 3- 14. 200 mg de SDS d'une solutiuon à 4 % sont ajoutés.
55,5 μl de glutaraldéhyde à 2,5 % sont ajoutés à 2,5 ml d'une solution de peptide G l lΔCa à 1 mg/ml dans un tampon carbonate 0, 1 M pH 9 + 0, 1 % Zwittergent 3- 14 à un pH se situant entre 9 et 10. Le milieu réactionnel est agité à + 4°C pendant 24 heures puis ramené à température ambiante. 25 μl de lysine 1 M sont ajoutés pour bloquer la réaction. La solution est dialysée contre du tampon phosphate 0, 1 M pH 7 + 0, 1 % Zwittergent 3- 14 pendant 24 heures à + 4°C sous agitation. Le dialysat est récupéré et le SDS éliminé par précipitation à l'aide d'une solution de KC1 0,02 M à 6 reprises. Le dernier surnageant qui contient le conjugué P40-G l lΔCa glutaraldéhyde est conservé sous forme congelée à - 20°C.
• Stérilisation des conjugués Les conjugués sont décongelés, filtrés stérilement (0,22 μm), aliquotés et conservés à + 4°C afin d'éviter les problèmes de précipitation.
• Caractérisation analytique des conjugués
Les conjugués sont caractérisés par dosage des protéines par la méthode de Lowry, électrophorèse de type SDS-PAGE (révélation au bleu de Coomassie) et par dosage des acides aminés après hydrolyse acide en phase gazeuse, dérivation par le PITC et analyse par HPLC.
Figure imgf000015_0001
Exemple 3 : Clonage de gène G2al, G2a2 dans vecteur d'expression pvaBB308 et production de protéines de fusion BBG2al et BBG2a2 dans E. coli Le principe de clonage de gène G2al (Seq ID n° 15), G2a2 (Seq ID n° 16) et de G2a3 (Seq ID n° 17) dans les vecteurs est explicité dans les figures 1 et 2.
3.1 Construction de G2al Le gène codant pour la protéine G2al (Seq ID n° 15) est construit par mutagénèse dirigée en utilisant comme matériel de départ le plasmide pRIT28G2Na. Pour cela, deux réactions de PCR (Polymerase chain reaction) sont réalisées avec les couples d'oligonucléotides RIT29/TH 137(PCR 1) d'une part et RIT30/TH 136 (PCR 2)d'autre part dans les conditions suivantes :
PCR (94°C 15 secondes
25 cycles (55°C 30 secondes
(72°C 30 secondes
• Fixation sur les billes magnétiques
Les fragments obtenus respectivement de 262 pb et 208 pb pour les réactions 1 et 2 sont fixés sur des billes magnétiques. 25 μl de billes magnétiques DYNAL® M-280 couplées à la streptavidine sont préalablement rincées deux fois avec du tampon T.E. (Tris 10 mM; EDTA ImM, pH 7,5) puis mises à incuber 20 minutes à 37°C avec 90μl des réactions d'amplification 1 et 2. Après fixation les fragments sont dénaturés en incubant les billes magnétiques avec 50μl de NaOH 0, 15 M pendant 10 minutes à température ambiante. Les deux surnageants sont récupérés, précipités à l'éthanol absolu et resuspendus dans 50 μl d'I ^O.
• Réaction d'extension
Celle-ci est réalisée par PCR en prenant 10 μl de chacune des réactions d'amplification dans les conditions ci-dessous : (95°C 15 secondes 5 cycles (35°C 30 secondes
(72°C 30 secondes Le fragment généré est amplifié par PCR avec les oligonucléotides RIT27 et RIT28 :
(95°C 15 secondes 25 cycles (55°C 30 secondes
(72°C 30 secondes Le fragment amplifié de 509 pb est digéré avec les enzymes de restrictions Psû et HindIII. Le fragment généré de 169 pb est clone dans le vecteur pRIT28 digéré par les mêmes enzymes. Le plasmide obtenu pRIT28G2al down est séquence avec la chimie des Dye Deoxy Terminator selon le protocole décrit par Applied Biosystem (Perkin Elmer).
Le plasmide pRIT28G2al est obtenu en clonant le fragment Pstl/Hindlll de pRIT28G2aldown (fragment en aval du site Pst 1) dans le vecteur pRIT28G2Na.
Le gène G2al est ensuite clone dans le vecteur d'expression pvaBB308 aux sites de restriction EcoRI/HindlII générant le vecteur pvaBBG2al .
La liste des séquences des oligonucléotides est indiquée ci-dessous : RIT27: 5' - GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG - 3'
RIT28: 5' - ΛAAGGGGGΛTGTGCTGCΛΛGGCG - 3'
TH 136: 5'- CCGΛΛGAΛΛAAACCGΛCGACCΛΛACCGΛCC - 3' τι-1137: 5' - TTTITΓCTTCGGTITGTTGJCTCGGG - 3' RIT29 : RIT27 biotinylé en 5' RIT30 : RIT28 biotinylé en 5'
3.2 Construction de G2a2 (Seq ID n° 161
Le principe du clonage est schématisé en bas de la figure 2. Les couples d'oligonucléotides utilisés dans cette construction sont les suivants : RIT29/TNG 193(PCR 1) d'une part et TNG 192/ RIT30(PCR 2) d'autre part. Les séquences des oligonucléotides sont décrites ci-dessous :
TNG 192 : 5'- CCGCCGAAAAAACCGAAAGACGAT - 3'
TNG 193 : 5' - CGAAATGGTAATCGTCTTTCGG - 3'
3.3 Construction de G2a3 (Seq ID n° 17)
Les deux fragments en amont et en aval du site unique Pstl ont été rassemblés sur le même vecteur pour donner pRIT28G2a3.
Les trois fragments d'inserts G2al , G2a2 et G2a3 ont été clones dans différents vecteurs d'expression dans E. coli, en particulier dans nos exemples les vecteurs pvaBB308 où BB est le gène codant pour le récepteur d'Albumine. Les protéines de fusion obtenus BBG2al , BBG2a2 et BBG2a3 peuvent être aisément purifiées par affinité sur colonne HSA- Sepharose (Human sérum Albumin).
3.4 Fermentation et purification de protéines de fusion BBG2al et BBG2a2
Dans deux erlenmeyers contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) avec de l'Ampicilline ( 100 μg/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 μg/ml, Sigma), on inocule avec E. coli RV308 transformés avec les plasmides pvaBBG2a l et pvaBBG2a2 respectivement. On incube pendant 16 heures à T° = 37°C sous agitation. 200 ml de cette culture sont inoculés dans un fermenteur (CHEMAP CF3000, ALFA LAVAL) contenant 2 litres de milieu de culture. Le milieu contient (g/1) = glycérol, 5 ; sulfate d'ammonium, 2,6 ; dihydrogénophosphate de potassium, 3 ; hydro- génophosphate dipotassium, 2 ; citrate de sodium 0,5 ; extrait de levure, 1 ; Ampicilline, 0, 1 ; Tétracycline 0,008 ; Thiamine, 0,07 ; sulfate de magnésium, 1 et 1 ml/1 de solution de traces éléments et 0,65 ml/1 de solution de vitamines. Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de sources combinées (glycérol ou glucose). Le pH est régulé à 7,0. La température est fixée à 37°C. La croissance est contrôlée en alimentant du glycérol (87 %) à un débit constant ( 12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (après environ 24 heures de culture), la production des protéines est induite par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/1. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. Les rendements en biomasse obtenus sont environ 200gr de biomasse humide. Les rendements de production de BBG2al et de BBG2a2 sont environ de 4 à 6 mgr de protéines par gr de biomasse.
Une fraction de 30 g de biomasse humide est resuspendue dans 70 ml de solution de TST (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, 0,05 % Tween 20 et EDTA 0,5 mM). Les cellules sont désintégrées par sonication (Vibracell 72401 , Sonics & Materials). Après centrifugation du lysat cellulaire, le surnageant est filtré ( 1,2 μm) et dilué dans 500 ml de TST. Les protéines de fusion ainsi obtenues sous forme soluble sont purifiées sur colonne d'affinité : HSA-Sepharose (human sérum albumin) selon le protocole décrit par (Stahl et col, J. Immunol. Methods, 1989 ; 124 : 43- 52).
Le lysat insoluble, après centrifugation, est lavé une fois avec un tampon (Tris-HCl 50 mM pH 8,5 ; MgCl2 5 mM). Après lavage, le culot est solubilisé dans 30 ml de chlorhydrate de guanidine 7 M, Tris-HCl 25 mM (pH 8,5), Dithiotreitol (DTT) 10 mM, suivi d'une incubation à 37°C pendant 2 heures. Les protéines solubilisées sont additionnées à un tampon de renaturation (Tris-HCl 25 mM (pH 8,5) ; NaCl 150 mM et 0,05 % Tween 20). La concentration du chlorhydrate de guanidine est ajustée à la concentration finale de 0,5 M dans le tampon de renaturation avant l'addition des protéines de fusion solubilisées. Le mélange est incubé à température ambiante, sous agitation modérée, pendant 16 heures. Après centrifugation, les produits de fusion solubles dans le surnageant sont purifiés sur colonne HSA-Sepharose. Les protéines de fusion purifiées sont analysées sur gel SDS-PAGE ( 12 %), sur l'appareil MINI PROTEAN II SYSTEM (BIORADS) . Les protéines sont visualisées avec du Coomassie brilliant blue R250. De plus, l'analyse des protéines recombinantes par Immunoblot avec des anticorps spécifiques du VRS montre que les protéines sont antigéniques.(voir exemple de gel SDS et immunoblot de BBG2al sur la figure 3).
Exemple 4 : Immunogénicité et efficacité protectrice des peptides G5a et G9a couplés à P40.
Matériels et méthodes.
Des groupes de 7 souris ont été immunisés 2 fois par voie i.p. avec 20 μg de P40-G9aCys, P40-CysG5a, ou P40-G5aCys. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20 % v/v) a été utilisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconvcrsion vis-à-vis le VRS-Λ, challengécs une semaine plus tard avec 105 TCID50 VRS-Λ par voie i.n., et sacrifiées 5 jours post-challenge. Les poumons ont été prélevés et le titre de virus dans les poumons déterminé.
Résultats
Réponses immunes humorales.
Comme indiqué dans la Fig. 4A, l'immunogénicité du peptide G5a est dépendante de l'orientation du couplage au P40. Après couplage par la partie C-terminale du peptide, des titres en anticorps anti-VRS-A faibles à modérés ont été induits dans le sérum. Par contre, après couplage par la partie N-terminale, G5a n'a pas induit de tels anticorps. En général, le peptide G9a, couplé en C-terminal à P40, a été faiblement immunogénique en terme d'induction d'anticorps anti-VRS-A. Une souris sur sept immunisées avec P40-G9acys a développé un titre d'anticorps sériqucs anti-VRS-A élevé.
Efficacité protectrice des poumons des peptides G5a et G9a. Comme démontré dans la Fig. 4B, et en corrélation directe avec la détection des anticorps anti-VRS-A, le peptide G5a a induit des réponses immunes protectrices quand il était couplé en C-terminal, mais pas après couplage en N-terminal. En effet, 6 souris sur 7 immunisées avec le P40- G5acys (couplage C-terminal) ont été protégées sans évidence de virus dans les poumons, le dernier n'a eu du virus qu'à la limite de détection de l'essai. Par contre, les souris immunisées avec P40-cysG5a (couplage N- terminal) ont eu des titres de virus dans les poumons aussi élevés que les souris témoins, immunisées avec le PBS. Ces résultats confirment que l'orientation du couplage de ce peptide à une protéine porteuse est capitale pour son efficacité protectrice. La corrélation entre la protection et l'induction des anticorps anti-VRS-Λ suggère que la protection pulmonaire observée est médiéc, en partie au moins, par les anticorps.
Malgré le fait que le P40-G9aCys ait été faiblement immunogénique chez la souris en termes d'induction d'anticorps sériques anti-VRS-Λ, les poumons de 5 souris sur 7 ont été protégés contre un challenge par le
VRS-A. En effet, 1 souris sur 7 n'a pas montré d'évidence de virus dans les poumons, ni même d'anticorps anti-VRS-A dans le sérum.
Conclusions.
Les peptides G5a et G9a contiennent des épitopes protecteurs vis-à- vis d'une infection VRS-A des poumons. L'orientation du couplage de G5a à une protéine porteuse est capitale pour son efficacité protectrice.
Exemple 5 : Immunogénicité et efficacité protectrice des peptides G7a et G8a.
Matériels et méthodes.
Des groupes de 3 à 4 souris ont été immunisés 2 fois par voie i.p. avec 20 μg de G7a, G8a, BB-G7a, ou BB-G8a. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20 % v/v) a été ulitisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une semaine plus tard avec 10 TCID50 VRS-A par voie i.n., et sacrifiées 5 jours post-challenge. Les poumons ont été prélevés et les voies nasales lavées. Les titres de virus dans les poumons et les voies nasales ont été déterminés. Résultats- Réponses immunes humorales.
Comme indiqué dans la Fig. 5Λ, les peptides G7a et G8a sont tous deux immunogéniques vis-à-vis du VRS-Λ couplés ou non à 1313. Si l'on considère les titres d'anticorps sériques, les peptides non couplés semblent être un peu plus immunogènes que les peptides couplés.
Efficacité protectrice des poumons des peptides G7a et G8a.
Comme indiqué dans la Fig. 5B, les poumons de toutes les souris immunisées avec les peptides G7a ou G8a, couplés ou non à BB, sont protégés contre un challenge avec le VRS-A, sans présence de virus ou seulement à la limite de détection de l'essai.
Conclusions. Les peptides G7a et G8a contiennent des épitopes protecteurs vis-à- vis des poumons. Les peptides sont efficaces couplés ou non à BB.
Exemple 6 : Immunogénicité et efficacité protectrice de la protéine de fusion BBG2al.
Matériels et méthodes.
Afin de déterminer l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de BBG2al contre les VRS-A et B, des groupes de 3 souris ont été immunisés 2 et 3 fois, respectivement, par voie i.p. avec 20 μg de protéine à 2 semaines d'intervalle. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20 % v/v) a été utilisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une semaine plus tard avec 105 TCID50 VRS-Λ par voie i.n., et sacrifices 5 jours post-challenge. Les poumons ont été prélevés et le titre de virus dans les poumons déterminé.
Résultats. Immunogénicité de BBG2a l vis-à-vis des VRS-Λ et B.
Les résutats présentés dans les Fig. 6Λ et B démontrent que le
BBG2al est capable d'induire des anticorps anti-VRS-Λ et B. Comme attendu, le titre en anticorps anti-VRS-Λ est bien supérieur au titre en anticorps anti-VRS-B. Néanmoins, des titres en anticorps contre les deux souches de VRS sont élevés.
Efficacité protectrice de BBG2al vis-à-vis du VRS-A et du VRS-B.
Comme indiqué dans les Fig. 6C et D, l'immunisation des souris avec BBG2al a induit des réponses immunitaires capables de protéger les poumons contre un challenge avec le VRS-A et contre un challenge avec le VRS-B. Les souris challengées avec le VRS-Λ ont été protégées sans évidence de virus dans les poumons (2 souris/3) ou seulement à la limite de détection ( 1 souris/3). Les souris challengées avec le VRS-B ont été protégées, soit sans évidence de virus dans les poumons ( 1 souris/3) soit avec du virus qu'à la limite de détection ( 1 souris/3) ou juste au-dessus de cette limite ( 1 souris/3) de détection.
Conclusions.
La protéine de fusion BBG2al est très immunogénique vis-à-vis du VRS-A et vis-à-vis du VRS-B. BBG2al est capable d'induire des réponses qui protègent les poumons contre un challenge avec les 2 sous-groupes de VRS. Exemple 7 : Obtention des anticorps 18D1, 5C2 et 5B7
Peptide d'immunisation : (i) G lΔCa couplés au KLI I (Kcyhole Lempct Haemocyanin), (ii) G2ΛCa et (iii) BBG2Na.
Les souris ont été immunisées à JO avec 50 μg d'antigène en CFΛ (complète Freund Adjuvant) en ip, à J 14 avec 10 μg de chaque antigène en IFA (Incomplète Freund Adjuvant) en ip, puis à J38 en iv avec lOμg de chaque peptide sans adjuvant. Les rates sont prélevées et fusionnées avec les cellules de myélome SP2-O à J42 dans un rapport 1 / 1. Les hybridomes positifs contre chaque antigène sont gardés. Ces hybridomes ont été injectés à des souris pour obtenir des ascites puis les différents anticorps obtenus ont été sélectionnés sur différents peptides afin de déterminer la spécificité des anticorps obtenus. Les anticorps monoclonaux 18D 1 , 5C2 sélectionnés par leur spécificité contre les peptides G lΔCa, G5a, reconnaissent spécifiquement le VRS-Λ. L'anticorps monoclonal 5B7 obtenu à partir de BBG2Na et reconnaissant le peptide G l la reconnaît le VRS-A.
Exemple 8 : Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5C2 sur l'infection chronique à VRS-A obtenue chez la souris SCID.
Matériels et méthodes.
Les souris C.B- 17 scid/scid ont été challengées par voie i.n. avec
105 TCID50 de VRS-A, sous 50 μl. Vingt six jours plus tard, les souris ont reçu par voie i.n. et à raison de 7 souris par groupe, 50 μl d'une préparation d'anticorps 18D 1 ou d'anticorps 5C2 à un titre ELISA anti- VRS-A de 104. Des souris témoins ont reçu du sérum anti-BB à un titre ELISA anti-BB de 10 . Les souris ont été sacrifiées 5 jours plus tard et leurs poumons ont été prélevés pour titrage du virus. Résultats.
Les résultats présentés dans la Fig. 7 démontrent que les anticorps monoclonaux 18D 1 et 5C2 sont capables d'éliminer une infection chronique avec le VRS-A chez la souris SCID et ceci d'une manière stérilisante. Aucune trace de virus n'a été détectée dans les poumons au moment du sacrifice. Les résultats obtenus dans les poumons des souris traitées avec le 5C2 correspondent à la moyenne des limites de détection de l'essai, limite plus élevée du fait du manque de disponibilité d'échantillon, et non pas à la présence de virus.
Conclusions.
Les anticorps monoclonaux 5C2 et 18D 1 pourraient être utilisés comme traitement thérapeutique dans le cadre des infections pulmonaires à VRS-A.
Exemple 9 : Effet prophylatique de l'anticorps monoclonal 18D 1 sur l'infection à VRS-A chez la souris.
Matériels et méthodes. Un groupe de souris BALB/c naïves, séronégatives vis-à-vis du
VRS-A, ont reçu par injection intrapéritonéale 200 μl d'une préparation d'anticorps 18D 1 ajustée au titre ELISA anti-VRS-A de 10^. Un groupe de souris témoins transfert i.p. ont reçu en parallèle 200 μl d'une préparation de sérum anti-P40 (sérum irrelevant) ajustée au titre ELISA anti-P40 de ÎO^". Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie i.n. avec 50 μl d'une suspension virale contenant 10^ TCID50 de VRS-A. Elles sont sacrifiées 5 jours plus tard pour dosage de virus dans les poumons. Résultats.
Comme indiqué dans la Fig. 8Λ, l'anticorps 18 1 est capable après transfert i.p. d'induire une protection au niveau des poumons de souris naïves lors d'un challenge avec le VRS-Λ. Toutes les souris sont protégées après injection de 200 μl de 18D 1 au titre de 105. Trois souris sur 7 sont protégées sans évidence de virus dans les poumons. Les autres montrent des traces de virus seulement à la limite de détection de l'essai (3 souris/7), ou juste au-dessus de cette limite ( 1 souris/7). Les souris témoins ont des titres compris entre log i Q 3.70 et 4.45 par gramme de poumons.
Conclusion.
L'anticorps 18D 1 est capable de prévenir une infection pulmonaire à VRS-Λ chez la souris BΛLB/c. Il démontre une efficacité prophylactique importante.
Exemple 10 : Effet prophylatique d'anticorps monoclonal 5C2 sur l'infection à VRS-A chez la souris.
Matériels et méthodes.
Des souris naïves séronégatives vis-à-vis du VRS-A reçoivent par transfert i.n., 50 μl d'une préparation de 5C2 ajustée au titre ELISA anti- VRS-A de 104. Des souris témoins reçoivent en parallèle du sérum anti-BB ajusté au titre ELISA anti-BB de 104. Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie i.n. avec
50 μl d'une suspension virale contenant 105 TCID50 de VRS-A. Elles sont sacrifiées 5 jours plus tard pour titrage de virus dans les poumons. Résultats.
Comme le montre la Fig. 8B, toutes les souris traitées avec le 5C2 à 104 ont été protégées au niveau pulmonaire. Seule 1 souris sur 7 montre des traces de virus. Les souris témoins ont des titres compris entre log i Q 3.70 et 4.70 par gramme de poumons.
Conclusion.
L'anticorps 5C2 est capable de prévenir une infection pulmonaire à VRS-Λ chez la souris BALB/c. Il démontre une efficacité prophylactique importante.
Exemple 11 : Pepscan : exemple de la synthèse muliple de 94 octapeptides couvrant la séquence de l'aa 130-230 de G2Na et se chevauchant par un acide aminé. Une plaque "PEPSCAN" de 96 octapeptides synthétisés en parralléle
(2 peptides de contrôle + 94 peptides couvrant la séquence 130-230 de la protéine G du VRS-A) est préparée selon la technique MULTIPIN1 M décrite par Geysen ét al, Proc. Natl. Acad. Sri., 1984, 81 , 3998-4002.
Ces peptides sont synthétisés sur support solide à l'extrémité de 96 "pins" (8 x 12) complémentaires d'une plaque de microtitration ELISA dans laquelle sera effectuée directement le criblage d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux (sera).
• Système de repérage des positions des pins et des puits Le système de numérotation utilisé est le suivant : position Al(l) = Plaque n°A, ligne 1 ( 12 lignes) colonne 1 (position H l en
ELISA) position A2( l) = Plaque n°A, ligne 2, colonne 1 (position H2 en ELISA)
Al( l) : peptide de contrôle # 1 : PLAQGGGG A2( l) : peptide de contrôle # 2: GLΛQGGGG
Λ3( l) : octapcptide # 1 : TVKTKNTT
A4( l) : octapcptide # 2 : VKTKNTIT etc. A 12(8) : octapcptide # 94 : EVPTTKP
• Synthèse
La synthèse correspond à plusieurs cycles de déprotection, de lavages et de couplage jusqu'à obtention des séquences peptidiques désirées. A la fin de la synthèse, les peptides sont N-acétylés, avant l'étape de déprotection des chaînes latérales.
Les acides aminés utilisés pour la synthèse sur pins sont protégés par un groupement Fmoc (9-Fluorénylméthoxycarbonyl) et les groupements protecteurs des chaînes latérales suivants : t-Butyle éther (tBu) pour la Serine, la Thréonine et la Tyrosine, t-Butyle ester (OtBu) pour les Acides Aspartique et Glutamique, t-Butoxycarbonyle (Boc) pour la Lysine, l'Histidine et le Tryptophane, 2,2,5,7,8-pcntaméthylchroman-6- sulfonyle (Pmc) pour l'Arginine, Trityle (Trt) pour la Cystéine, l'Asparagine et la Glutamine. L'activation de la fonction acide est effectuée avec de la Diisopropylcarbodiimide (DIC) et du 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) dissouts dans du DMF.
• Fmoc-déprotection et lavages : La plaque de pins est immergée dans un bain contenant 200 ml d'une solution de pipéridine à 20 % dans le DMF (40/ 160 ml) pendant 20 min. à température ambiante sous agitation. Les pins sont ensuite retirés du bain. L'excès de solvant est éliminé en frappant le bloc de pins sur du papier-linge. Les pins sont lavés dans 200 ml de DMF pendant 2 min. à température ambiante sous agitation. Le bloc est frappé sur du papier-linge et immergé complètement dans un bain de MeOH pendant 2 min. sans agitation. Les pins sont immergés dans 200 ml de MeOH ensuite (3 bains de 2 minutes, 200 ml/bain). La plaque est séchée pendant 30 min.
• Couplage des Fmoc-amino acides : Les Fmoc-amino-acides subissent une étape d'activation avant de pouvoir être couplés. La durée d'une étape de couplage est de 2 heures pour une concentration de 100 mM avec 1.5 équivalent d'HOBt et 1.2 équivalent de DIC. Un logiciel permet de calculer les quantités de réactifs nécessaires pour l'étape de couplage. Les pesées sont effectuées dans des tubes classés par ordre alphabétique du code à une lettre des acides aminés. Les tubes sont remplis en dehors de la balance sur une feuille de papier-linge, puis pesés jusqu'à l'obtention d'une masse proche de celle indiquée sur la feuille de pesée. La masse ne doit pas être inférieure de 0.2 mg ni supérieure de 0.9 mg par rapport à la quantité théorique.
• Etape de couplage : Les pins sont introduits délicatement dans les puits. La boîte est fermée soigneusement et laissée sous une hotte pendant la durée du couplage pendant 2 h pour une concentration en acides aminés de 100 mM. Un couplage de 2 h permet de réaliser 3 couplages par jour.
• Traitement des blocs de pins après couplage : Les pins sont retirés de la plaque contenant les solutions de couplage et lavés avec 200 ml de MeOH sous agitation pendant 5 min. Le bloc est frappé sur du papier-linge et laissé sécher pendant 2 min. Le bloc est placé dans 200 ml de DMF et lavé pendant 5 min. sous agitation avant d'effectuer le cycle suivant de déprotection. La plaque est lavée classiquement et subit l'étape de clivage des groupements Fmoc comme décrit ci-dessus après le dernier couplage. • Acétylation des aminés terminales : les tètes de pins sont mises à incuber dans les puits d'une plaque contenant 150 μl du mélange réactif suivant : DMF/ Anhydride acétique/ triétylamine 50/5/ 1 (v/v/v). Le bloc est enfermé dans une boîte pendant 90 min. à température ambiante. Le bloc est lavé ensuite avec 200 ml de MeOH pendant 15 min. puis séché pendant 15 min.
• Déprotection des chaînes latérales : les groupements protecteurs des chaînes latérales sont éliminés en immergeant les pins dans 200 ml d'un mélange TFA/anisole/Ethanedithiol 190/5/5 ml pendant 2 h 30 à température ambiante. Après cette étape de déprotection, le bloc de pins est retiré de la solution acide. La boîte est rincée une fois au MeOH, puis remplie de MeOH pour y immerger complètement le bloc de pins pendant 10 min. Le bloc est alors frappé sur du papier-linge puis immergé dans 200 ml d'un mélange MeOH/eau/acide acétique ( 100/ 100/ 1 ml) pendant 1 heure et frappé à nouveau sur du papier-linge. Le bloc est mis sous-vide dans un dessiccateur pendant une nuit.
Exemple 12 : ELISA La plaque portant les pins est saturée 1 heure à 37°C en tampon de saturation (PBS, Tween 0, 1 %, gélatine 1%), lavée 10 min en PBS et incubée une nuit à 4°C sous agitation avec le sérum à analyser préalablement dilué. La plaque est ensuite lavée 4 fois 10 min en PBS et incubée une heure à température ambiante avec un anticorps secondaire marqué à la péroxydase, dilué au 1 /5000 e. Après 4 lavages en PBS, le substrat TMB est ajouté. L'arrêt de la réaction est effectué par addition d'acide sulfurique.
Le résumé des données résultant de l'analyse d'un sérum murin anti BBG2Na par la méthode du Pepscan B est représenté sur la figure 9. Les figures 9Λ et 9B montrent une réactivité du sérum de souris anti-BBG2Na contre 4 régions de la molécule G2Na (les résidus en trait gras représentent les acides aminés jouant un rôle important dans la reconnaissance Λc/Ag) : - la région 1 située entre les résidus 150 et 159 dont la séquence est QRQNKPPNKP. Cette région est comprise dans le peptide G5a ( 144- 159) et correspond à la zone de réactivité de l'anticorps monoclonal 5C2 ;
- la région 2 située entre les résidus 176 et 189 dont la séquence est CSNNPTCWAICKRI. Il s'agit d'une région localisée au niveau du peptide G lΔCa ( 174- 187) et correspondant à la réactivité des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5D3 ;
- la région 3 située entre les résidus 194 et 207 dont la séquence est PGKKTTTKPTKKPT. Cette séquence correspond à une réactivité au niveau du peptide G9 ( 194-204), réactivité déjà mise en évidence lors de la production d'anticorps monoclonaux dirigés contre BBG2Na ;
- la région 4 qui s'étend sur une large zone allant du résidu 155 au résidu 176 semble être le résultat de différentes réactivités. L'une de ces réactivités qui couvre une région très hydrophobe de la molécule G2Na (G l la) correspond à la zone de reconnaissance de l'anticorps monoclonal 5B7 (obtenu après immunisation de souris BALB/c par le candidat vaccin BBG2Na) dont le pepsean B est représenté ci-dessous dans la figure 10.
Cet anticorps monoclonal reconnaît la séquence FEVFNFVP ( 165- 172).
L'ensemble des quatre réactivités ci-dessus a par ailleurs été confirmé par la titration du sérum anti-BBG2Na au moyen de différents
ELISA mis au point pour chacune des réactivités. Le tableau I montre que le sérum anti-BBG2Na présente bien des activités "anti-G4a, G5a cys, G9a cys et Gl la". Tableau I : Titres anti-G4a, G5aCys, G9aCys et Gl lΔCa exprimés en logio du sérum anti-BBG2Na réf. BE-02.
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Conclusion :
L'étude d'un sérum anti-BBG2Na par la technique du Pepscan montre que l'immunisation de souris avec BBG2Na génère des anticorps contre 4 épitopes B situés respectivement dans les régions 150- 159, 176- 189, 194-207 et 155- 176. Cette technique permet donc de confirmer l'importance de la région 164- 176 (G l lΔCa).
Ces résultats sont, par ailleurs, en parfait accord avec les données ELISA concernant la réactivité d'un sérum anti-BBG2Na sur les peptides G4a, G5aCys, G9aCys et G l lΔCa.

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un épitope de la protéine G du VRS correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séquences peptidiques comprise respectivement entre les résidus d'acides aminés 150- 159, 176- 189, 194-207 et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 80 % d'homologie.
2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre un peptide porté par la séquence comprise entre les résidus d'acides aminés 130 et 230 de la protéine G du VRS, sous-groupe A ou sous-groupe B.
3. Anticorps selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un peptide présentant au moins l'une des séquences ID n° 1, ID n° 2, ID n° 3, ID n° 4, ID n° 5, ID n° 6, ID n° 7, ID n° 8, ID n° 9, ID n° 10, ID n° 1 1, ID n° 12, ID n° 13, ID n° 14, ID n° 15, ID n° 16, ID n° 17, ID n° 18, ID n° 19, ID n° 20, ID n° 21 et/ou ID n° 22.
4. Peptide susceptible de générer un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente au moins une des séquences choisies parmi les séquences ID n° 1, ID n° 2, ID n° 3, ID n° 4, ID n° 5, ID n° 6, ID n° 7, ID n° 8, ID n° 9, ID n° 10, ID n° 11, ID n° 12, ID n° 13, ID n° 14, ID n° 15, ID n° 16, ID n° 17, ID n° 18, ID n° 19, ID n° 20, ID n° 21 et/ou ID n° 22.
5. Peptide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins un résidu cystéine en position N-terminale ou C- terminale.
6. Agent immunogène, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un peptide selon l'une des revendications 4 ou 5, couplé à une protéine porteuse.
FEUÎLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
7. Agent immunogène selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine porteuse est choisie parmi les OmpΛ de bactéries gram négatif et leurs fragments, la protéine TT, la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque et ses fragments et la sous- unité B de la toxine cholérique (CTB).
8. Agent immunogène selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que la protéine porteuse est une OmpA d'une bactérie du genre Klebsiella.
9. Agent immunogène selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le peptide est conjugué à la protéine porteuse par une protéine de liaison.
10. Agent immunogène selon la revendication 9, caractérisé en ce que la protéine de liaison est choisie parmi un récepteur de l'albumine sérique de mammifère et les récepteurs présents à la surface des cellules mucosales.
1 1. Agent selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que le couplage est un couplage covalent.
12. Séquence nucléotidique codant pour un agent immunogène selon l'une des revendications 6 à 11.
13. Séquence nucléotidique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une molécule d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour la protéine porteuse, de l'ADN codant pour un peptide selon l'une des revendications 4 ou 5 ou l'un de leurs fragments, fusionné avec un promoteur.
14. Séquence nucléotidique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une molécule d'ARN.
15. A titre de médicament, anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, peptide selon l'une des revendications 4 ou 5, agent immunogène selon l'une des revendications 6 à 1 1, ou séquence nucléotidique selon l'une des revendications 12 à 14.
16. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, un peptide selon l'une des revendications 4 ou 5, un agent immunogène selon l'une des revendications 6 à 11, ou une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 12 à 14, et des excipients pharmaceutiquement acceptables.
17. Utilisation d'au moins un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, d'au moins un peptide selon l'une des revendications
4 ou 5, agent immunogène selon l'une des revendications 6 à 1 1, ou séquence nucléotidique selon l'une des revendications 12 à 14, pour la préparation d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B.
18. Kit de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, un peptide selon l'une des revendications 4 ou 5, un agent selon l'une des revendications 6 à 1 1 ou une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 12 à 14.
19. Procédé de préparation d'un agent immunogène selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que le couplage entre le peptide et la protéine porteuse est réalisé par voie chimique.
20. Procédé de préparation d'un agent immunogène selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que le couplage est réalisé par la technologie de l'ADN recombinant.
21. Procédé de préparation selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on introduit une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 12 à 14 dans une cellule hôte.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique est un gène de fusion qu'on introduit par l'intermédiaire d'un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmide.
23. Procédé selon l'une des revendications 21 ou 22, caractérisé en ce que le gène de fusion est intégré dans le génome de la cellule hôte.
24. Procédé selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que la cellule hôte est un procaryote.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la cellule hôte est choisie dans le groupe comprenant : E. coli, Bacillus,
Lactobacillus, Staphylococcus et Streptococcus.
26. Procédé selon les revendications 21 à 23, caractérisé en ce que la cellule hôte est une levure.
27. Procédé selon les revendications 21 à 23, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule de mammifère.
28. Procédé selon les revendications 21 à 23, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule d'origine végétale.
29. Procédé selon les revendications 21 à 23, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule d'insecte.
30. Procédé selon les revendications 21 à 23, caractérisé en ce que l'on utilise un vecteur viral.
31. Procédé selon l'une des revendications 20 à 27, caractérisé en ce que la molécule de fusion est exprimée, ancrée et exposée à la membrane des cellules hôtes.
32. Composition utile selon la revendication 16 en ce que les anticorps monoclonaux sont humanisés et produits par la voie recombinante.
33. Composition utile selon la revendication 16 en ce que les anticorps monoclonaux sont obtenus par la méthode de librairie de phages.
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