EP0953050A1 - Nouveaux moyens pour le diagnostic, la prevention et le traitement vis-a-vis de contaminations ou d'infections par des virus a tropisme muqueux - Google Patents

Nouveaux moyens pour le diagnostic, la prevention et le traitement vis-a-vis de contaminations ou d'infections par des virus a tropisme muqueux

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Publication number
EP0953050A1
EP0953050A1 EP97953956A EP97953956A EP0953050A1 EP 0953050 A1 EP0953050 A1 EP 0953050A1 EP 97953956 A EP97953956 A EP 97953956A EP 97953956 A EP97953956 A EP 97953956A EP 0953050 A1 EP0953050 A1 EP 0953050A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
peptide
sequence
amino acid
rsv
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP97953956A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Catherine Bourgeois
Evelyne Kohli
Pierre Pothier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Bourgogne
Original Assignee
Universite de Bourgogne
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Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Bourgogne filed Critical Universite de Bourgogne
Publication of EP0953050A1 publication Critical patent/EP0953050A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the invention is new means for the diagnosis, prevention and treatment of humans or animals with respect to contaminations or infections by viruses with mucous tropism.
  • Viruses with a mucous tropism can infect various human or animal mucous membranes such as the respiratory, intestinal or vaginal mucous membranes, according to different mechanisms.
  • the immunological defenses against these infections frequently involve the secretion of IgA.
  • viruses of the family Reoviridae more particularly of the genus Rotavir s (hereinafter referred to as RV)
  • viruses of the family of Paramyxoviridae more particularly of the genus Pneumovirus such as respiratory syncytial virus (hereinafter referred to as RSV)
  • RSV respiratory syncytial virus
  • viruses pose complex problems in human medicine, in communities and in hospitals where people particularly sensitive to such infections are confined: newborns, babies, premature babies in particular, children, immunocompromised adults, the elderly, but also veterinary medicine in the case of animal husbandry such as foals or calves.
  • the invention therefore aims to provide such peptide sequences capable of recognizing key epi topes in a contamination or viral infection, and in particular capable of constituting paratopes vis-à-vis RV and RSV. It also aims to provide the corresponding nucleotide sequences.
  • the invention relates to the applications of these different sequences for diagnostic, preventive or therapeutic purposes in the case of infection by viruses with mucous tropism, and in particular by
  • the peptides of the invention are characterized in that they essentially consist of an amino acid sequence capable of recognizing, according to an antigen-antibody type reaction, at least one epitope of a mucosal tropism virus, involved in infections caused by such a virus.
  • Such recognition of the viral epitope by the peptide can be demonstrated, for example, by an antigen-antibody reaction such as, for example, ELISA.
  • the invention relates in particular to peptides as indicated above capable of neutralizing the viral infection and, if necessary, of inhibiting fusion between cells infected and uninfected or between cells and viruses when the viral epitope is involved in fusion, and / or to exert a protective effect by passive or active route and / or to inhibit the transcription of the mucous tropism virus.
  • Such peptides can exhibit specificity of a viral subgroup in neutralization.
  • Such peptides are characterized in that they are capable of inhibiting an essential stage of viral multiplication.
  • Such peptides are further characterized in that they comprise an amino acid sequence having the properties of a CDR of anti-mucosal anti-virus antibodies, such as RSV or RV.
  • CDR designates an amino acid sequence of hypervariable regions of the antibody involved in the recognition of major viral antigenic sites.
  • the amino acid sequence of the peptides of the invention comprises one or more sequences of these CDR regions, and / or one or more analogs of such sequences.
  • the term "analog”, as used according to the invention designates an amino acid sequence, which differs from that of a native CDR region by one or more amino acids, but which exhibits immunological properties of the type of those observed with the native CDR, as highlighted in the examples.
  • the differences in the sequences can correspond to modifications of one or more amino acids and / or substitutions of native amino acids by chemical groups appropriate in view of the biological applications envisaged, or of the statements. They can also correspond to the presence of additional natives, compared to the native sequences.
  • Preferred peptides of this type are characterized in that they exhibit antigen-antibody type properties with RSV.
  • the invention relates in particular to peptides characterized in that they are capable of reacting with the epitope 205-225 and / or 255-278 of the VRS F protein.
  • Such peptides are in particular characterized in that they are capable in vitro of exerting an activity of neutralizing an infection of cells, such as Hep-2 cells, by RSV, and / or of inhibiting fusion between cells infected with RSV and uninfected cells, or the fusion between cells and RSV.
  • Such peptides are particularly remarkable, characterized in that they are capable in vivo, in particular when administered by the intranasal route, of exerting a protective effect by the passive route against an RSV infection.
  • Peptides of this group specially targeted by the invention in particular have a size of between 5 and
  • amino acids approximately, preferably between 10 and 30 amino acids approximately.
  • Peptides of this group specially targeted by the invention correspond to the amino acid sequences SEQ ID No.1 to SEQ ID No.12 and SEQ ID No.25 to SEQ ID No.42.
  • the invention relates in particular to peptides characterized in that they are derived from antibodies capable of reacting with site III and / or IV of the protein VP ⁇ of RV.
  • peptides advantageously correspond to or are analogs of CDR regions of monoclonal antibodies with RV specificity.
  • Peptides of this group specially targeted by the invention essentially comprise one or more amino acid sequence (s) chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID No. 13 to SEQ ID No. 24, and SEQ
  • anti-RV anti-RV peptides
  • peptides described above in relation to the regions of CDR can correspond to, or constitute analogs of regions of CDR of heavy chains of anti-mucosal anti-virus antibodies, and / or light chains.
  • the different peptides can be presented in linear form, or alternatively in cyclized form.
  • the peptides of the invention are obtained by peptide synthesis, advantageously using conventional techniques, or also by genetic engineering using the nucleic acids defined below.
  • they can be produced by bacterial, animal and plant cells into which are inserted the DNA sequences carrying the genetic information corresponding to these peptides and placed under the control of appropriate promoters.
  • modified cells where appropriate, the organisms or plants made up of such cells are also included in the scope of the invention.
  • the invention indeed also relates to the nucleic acids corresponding according to the universal genetic code to the peptides defined above.
  • nucleic acids include DNA comprising the genetic information corresponding to said peptides, advantageously DNA capable of coding for these peptides. They also include the A ENs, especially the AENm, and the corresponding cDNAs.
  • Transfer and / or expression vectors such as cosmid, plas ide, phage, animal or plant virus containing such nucleic acids, and host cells containing such vectors also fall within the scope of the invention.
  • the study of the compounds defined above has led to highlight anti-viral properties of great interest, as illustrated by the examples.
  • the invention thus relates to means, namely compositions, methods and kits, for detecting the presence of the virus in humans or animals, or for demonstrating an immune response to contamination or to viral infection.
  • the diagnostic compositions of the invention are characterized in that they comprise:
  • At least one antibody directed against a peptide of the invention or an equivalent ligand that is to say which binds to the peptide, the peptide, the antibody or the ligand, being associated with a marker for the detection reaction, such as a radiolabel or an enzymatic marker and, where appropriate, with a vehicle suitable for carrying out the diagnosis.
  • a marker for the detection reaction such as a radiolabel or an enzymatic marker
  • the invention also relates to a method of in vitro diagnosis of contamination or infection by a mucous tropism virus, characterized in that it comprises: - bringing into contact a biological sample, such as a body fluid, with
  • the invention further relates to kits for the diagnosis of contamination or infection by a mucous tropism virus.
  • kits are characterized in that they comprise at least one peptide, or an anti-peptide antibody, or an equivalent ligand, and the reagents suitable for the detection reaction, in particular markers and solvents.
  • peptides according to the invention or, where appropriate, anti-peptide antibodies or of ligands which bind to these peptides proves to be of great interest for preventing or treating infections by viruses with mucous tropism, in particular by
  • VRS and RV Regarding RSV, the preferred administration is intranasally.
  • the invention therefore also relates to pharmaceutical compositions having anti-viral properties, characterized in that they contain at least one peptide with anti-viral properties as defined above, an anti-peptide antibody or a binding ligand to this peptide, in association with a pharmaceutically inert vehicle.
  • the invention relates more specifically to the compositions produced using anti-RSV or anti-RV peptides.
  • the invention relates to anti-RSV pharmaceutical compositions, containing at least one peptide corresponding to one of the sequences SEQ ID No. 7 to SEQ ID No. 12 and very particularly to the sequence SEQ ID No. 9 whose neutralizing properties are of great interest.
  • compositions are preferably administered nasally, orally or parenterally, at a rate of 1 to 80 mg / kg, in different forms.
  • administration in the form of heavy esters, such as decanoate, oenanthate or palmitate, or in delayed dosage form.
  • Another aspect of the invention of major interest concerns the vaccine applications of antibodies directed against said peptides, or of equivalent ligands.
  • Such vaccine compositions which are characterized in that they contain an effective amount of antibodies or ligands directed against said peptides in association with an appropriate vehicle, also fall within the scope of the invention.
  • compositions are combined with at least one other vaccine, for example childhood vaccines, which makes it possible to have broad spectrum vaccine compositions.
  • the anti-peptide antibodies of the invention or said ligands are advantageously conjugated to a carrier molecule to reinforce their immunogenicity.
  • a carrier molecule to reinforce their immunogenicity.
  • the anti-peptide peptides or antibodies, or the said ligands are inserted into a human immunoglobulin A structure, if necessary modified in the framework region of its variable regions adjacent to the peptide, or to the anti-peptide antibody.
  • the presentation of the peptides is carried out in the form of a fragment of the ScFv type, or of insertion into a hexon protein structure of adenovi rus.
  • FIGS. 1 to 7 which represent:
  • FIG. 4 the CDRs of these chains
  • FIG. 5 the heavy V H and light V L chain sequences of the FV-138 and EV-133 monoclonal antibodies (CDR underlined),
  • Mouse spleen cells are harvested and fused with SP2 / 0 myeloma cells according to conventional techniques.
  • hybridomas (hybridoma cells) secreting either anti-RSV antibodies or anti-RV antibodies were selected by IF or ELISA, cloned and stored by freezing. - growing conditions
  • the cells After thawing, the cells are cultured in RPMI 1640-10% FCS medium (Fetal Calf Serum) in an oven at 37 ° C, 5% C02. -detection of antibodies by indirect immunofluorescence (IF).
  • FCS medium Fetal Calf Serum
  • hybridomas are incubated for 30 minutes at 37 ° C. in wells covered with Hep 2 cells (human cells) infected or not (controls) with the A2 or Long strain of the respiratory syncytial virus, or in wells covered with cells.
  • MA104 monkey kidney cells infected or not by the bovine RF strain or by the human strain 46, (isolated from a clinical sample then cloned) of the rotavirus.
  • the antibodies present are revealed by a 30-minute incubation with an anti-mouse IgG antibody labeled with fluorescein. The slides are then observed under a fluorescence microscope.
  • anti-RSV monoclonal antibodies RS-348, RS-18E2, RS-2 B3 and RS-255, and three anti-RV monoclonal antibodies, called RV-133, EV-138 and EV-238. . anti-RSV monoclonal antibodies
  • the RS-348 antibody has a very strong neutralizing activity. It recognizes the strains of RSV of the subgroups
  • the RS antibody epitope below is very conformational and is located mainly between amino acids 190 and 289 of the RSV fusion protein (sites 205-225 and 255-278).
  • RV-138 and RV-238 all recognize close antigenic sites on the rotavirus internal capsid protein, VP6.
  • RV-133 and RV-238 unlike FV-138, recognize a group epitope common to all strains of group A related to the region of VP6 involved in viral transcription. Indeed, the restoration of the transcriptase activity does not take place when VP ⁇ is previously incubated with the antibody RV-133 before the reassociation with the cores (see "Inhibition of in vitro reconstitution of rotavirus transcriptionally active particles by anti-VP6 monoclonal antibodies ".
  • Fab fragments of antibodies which can in particular be obtained by digestion of the papain anticoprs (anti body / papain ratio between 1000 and 2000/1) in the presence of EDTA and ⁇ -mercaptoethanol at 37 ° C.
  • FIG. 1 illustrates the inhibition of the transcription of double-layered viral particles ("doule- * layer particles") (Rotavirus) exerted by the anti-VP6 RV- monoclonal antibodies 238, RV-133 and RV-138 (overnight incubation at 0 ° C in the presence of double-layer viral particles of the RF strain, or if appropriate 46, of Rotavirus.
  • double-layered viral particles (“doule- * layer particles") (Rotavirus) exerted by the anti-VP6 RV- monoclonal antibodies 238, RV-133 and RV-138 (overnight incubation at 0 ° C in the presence of double-layer viral particles of the RF strain, or if appropriate 46, of Rotavirus.
  • Example 2 Obtaining amino acid sequences of the heavy and light chains of monoclonal antibodies with mucous tropism anti-RSV and anti-RV.
  • amino acid sequences are deduced from the DNA sequences of the V and V L genes.
  • This step is carried out using a QuickPrepR Micro mRNA purification kit sold by Pharmacia-E otech, using 10 hybridoma cells. - Extraction of total RNA:
  • hybridoma cells are centrifuged and the pellet is taken up in 0.4 ml of extraction buffer (guanidiu thiocyanate and N-lauroyl sarcosine) then 0.8 ml of elution buffer (Tris-HCl pH 7.5 10 mM ; EDTA ImM). - purification of mRNA on oligo column (dT)
  • RNA sample is added to the homogenized cellulose-oligo (dT) gel and freed from its storage buffer.
  • the whole is centrifuged and washed 5 times with a buffer with a high concentration of salts then 3 times with a buffer with a low concentration of salts.
  • the gel resuspended in the latter buffer is transferred to a column (MicroSpin®, Pharmacia) placed in a microtube. After 3 washes with the lo-sal buffer, the mRNAs are eluted with the elution buffer, then stored in ice.
  • RNA & ⁇ in the pellet then they are resuspended in elution buffer.
  • the synthesis is carried out in duplicate, one tube used for the amplification of VH (variable region of heavy chain) and the other for VL (variable region of light chain). After heating to 65 ° C. to remove the secondary structures, the mRNAs (5 ⁇ l) are incubated for 1 hour in the presence of l ⁇ l of 200 mM dithiothreitol (DTT), ll ⁇ l of a reaction mixture containing a reverse transcriptase.
  • DTT dithiothreitol
  • ddNTP dideoxynucleotides
  • reaction mixtures are as follows:
  • VL 33 ⁇ l of cDNA, 2 ⁇ l of primer L and 64 ⁇ l of distilled water.
  • thermocycler GeneAmp PCR syste 2400
  • This technique is similar to the Sanger sequencing method based on dideoxynucleotides (ddNTP).
  • ddNTP dideoxynucleotides
  • Each ddNTP is labeled with a different fluorophore, which allows the DNA chain in formation to terminate and to be simultaneously labeled with the fluorophore corresponding to the last base added.
  • sequenced products are then separated by electrophoretic migration in an automatic sequencer, such as the DNA 373 stretch sequencer which has an optical system based on a laser coupled to a computer analysis program. All the devices and reagents used are marketed by Perkin-Elmer.
  • the sequencing primers were deduced from various consensus sequences of VH and VL genes synthesized by Eurogentec (KABIT EA, WU T. T, REID-MILLER M., PERRY HM, GOTTESAN KS 1987. Sequences of proteins of immunological interest, US Dept of Health and Human Services, US Government Printing Office; KAEAT EA, WU TT, PERRY HM, GOTTE__MAN KS, FOELLER C. 1991. Séquences of proteins of immunological interest, US Department of Health and Human Services, NIH, Bsthesda, MD).
  • the sequencing reaction is carried out using a ready-to-use reaction mixture: the cycle sequencing kit for ABE PRISM® dye terminators.
  • This medium contains the 4 differently labeled ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP and ddTTP), the 4 unlabeled dNTPs (dITP, dATP, dCTP and dTTP), Tris-HCl (pH9.0), MgCl 2 , a pyrophosphatase and l Taq FS DNA polymerase.
  • PCR tube suitable for the thermal cycler, approximately 30 ng of purified PCR product are added to 1 ⁇ l of sequencing primer (at 3.2 pmol / ⁇ l), to 8 ⁇ l of the reaction medium and of ultrapure water (qs 20 ⁇ l).
  • reaction tubes are then placed in the thermocycler programmed for 25 cycles of 3 stages:
  • the excess nucleotides are removed by ethanol precipitation of the sequencing products.
  • the 20 ⁇ l of reaction are transferred to a 1.5 ml micro-centrifuge tube in which 2 ⁇ l of 3M sodium acetate (pH4.6) and 50 ⁇ l of 95% ethanol have been deposited.
  • the tubes are placed for 10 minutes in ice, then centrifuged for 20 to 30 minutes at maximum speed. After decantation, the DNA pellets are washed with 70% ethanol and then dried.
  • a deposition buffer is prepared by mixing 5 ⁇ l of deionized formamide and 1 ⁇ l of 50 mM EDTA (pH 8.0). Each pellet of sequencing product is taken up in 4 ⁇ l of this mixture before being deposited on the migration gel. - separation of sequencing products by electrophoretic migration.
  • a 4.75% polyacrylamide gel is prepared at least 2 hours before migration in order to obtain good polymerization.
  • 80 ml of gel 40 g of urea are dissolved in approximately 27 ml of ultrapure water to which are added 1 g of resin and 9.5 ml of a 40% acrylamide stock solution (38 g of acrylamide and 2 g of bis-acrylamide in qs 100 ml of water). The mixture is stirred for 5 minutes, then filtered and degassed.
  • N 1 , N 1 - tetramethylethylenediamine and ammonium peroxydisulfate at 0, lg / ml (400 ⁇ l).
  • the internal face of the plates is cleaned beforehand with a detergent, then rinsed several times with distilled water and dried.
  • the glass plates are cleaned externally in the same manner as previously and their cleanliness is checked directly in the electrophoresis tank of the sequencer by the laser. Once the plates are clean, the gel can be placed in the tank and the migration buffer added (Tffi IX). A pre-migration is then carried out for 15 minutes in order to preheat the gel before depositing the samples.
  • the migration buffer added Tffi IX
  • the samples are deposited on top of the gel after a denaturation of 2 minutes at 90 ° C and the migration is launched at the same time as the collection of the data by the computer program.
  • the purified and separated products are then cloned according to conventional techniques, then sequenced.
  • the nucleic acid sequencing was carried out on double stranded DNA using an automated DNA sequencer (ABC).
  • V H chains heavy variable chains
  • V L light variable chains
  • Antibodies RV-138 and RV-133 are given, according to the 1-letter code, in Figure 5.
  • the amino acid sequences of the heavy chain (H) CDRs 1,2,3 are referenced, respectively, under SEQ ID No. 1, 2.3, and those of the CDRs 1.2 , 3 of light chain (L) under SEQ ID No. 4,5,6.
  • the amino acid sequences of the heavy chain (H) CDRs 1,2,3 are referenced, respectively, under SEQ ID No. 13,14,15 and those of the CDR 1,2, 3 of light chain (L) under SEQ ID No. 16,17,18.
  • the amino acid sequences of the heavy chain (H) CDRs 1,2,3 are referenced, respectively, under SEQ ID No. 19,20,21 and those of the CDR 1,2, 3 of light chain (L) under SEQ ID No. 22,23,24.
  • the sequences or amino acids of the heavy chain (H) CDRs 1,2,3 are referenced, respectively, under SEQ ID No. 43,44,45 and those of the CDR 1,2, 3 of light chain (L) under SEQ ID No. 46,47,48.
  • the amino acid sequences of CDR 1,2,3 of heavy chain (H) are referenced, respectively, under SEQ ID No. 25,26,27 and those of CDR 1,2,3 of light chain (L) under SEQ ID No. 28,29,30.
  • the amino acid sequences of the heavy chain (H) CDRs 1,2,3 are referenced, respectively, under SEQ ID No. 31,32,33 and those of the CDR 1,2, 3 of light chain (L) under SEQ ID No. 34,35,36.
  • amino acid sequences of the heavy chain (H) CDRs 1,2,3 are referenced, respectively, under SEQ ID No. 37,38,39 and those of the CDR 1,2, 3 of light chain (L) under SEQ ID No. 40,41,42.
  • Anti-RSV Peptides Peptides of 20 amino acids corresponding to each of the 6 CDR regions of RS-348 and comprising amino acids of the framework region added to each end of the CDRs were prepared by synthesis. length or to facilitate synthesis. To obtain cyclized peptides, cysteine was added to each of the two ends.
  • the synthesis was carried out with a Milligen® 9050 automatic synthesizer, according to a solid phase method which uses amino acids activated by protected JSf-Fmoc esters, on a polystyrene resin (PEG-PS).
  • the acylation was carried out in anhydrous DMF using activated esters of each amino acid (Dhbt for Thr and Ser, Pfp for the others) with 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) or 1-hydroxy 7- azabenzotriazole (HOAt) as coupling reagents. 20% piperidine in DMF was used for the N 01 deprotection steps.
  • the peptide side chains were deprotected and extracted from the solid phase by cleavage with trifluoroacetic acid with the reagent derived from King for 2 hours, in the absence of light and oxygen.
  • the thiol groups of the C- and N-terminal cysteines were thus free of their protective trityl groups and have therefore could form disulfide bridges for peptic di cyclization.
  • the peptides were then recovered by precipitation in cold ethyl ether, centrifugation and repeated washing in ether. The precipitates were resuspended in distilled water.
  • CDs of the RS-348 monoclonal antibody are reported in the attached sequence listing.
  • the sequences referenced under SEQ ID No. 7,8,9 represent, respectively, the sequences of the peptides
  • sequences referenced under SEQ ID No. 10, 11, 12 represent, respectively, the sequences of the peptides
  • PEP1L348, PEP2L348, PEP3L348, that is to say the sequences of synthetic peptides • constructed by homology to the CDRs
  • PEP3H348, PEP1L348, PEP2L348, PEP3L348) derived from the six CDRs of the RS-348 monoclonal antibody (sequences of these peptides: SEQ ID No. 7 to No. 12).
  • Hep-2 cells are first infected with vi us (5 x 10 3 plaque forming units). Six hours later, amounts ranging from 0 to 15 ⁇ g of synthetic peptides were added to these infected cells.
  • the binding of the peptides PEP2L348 and PEP3L348 to the RSV fusion protein F therefore seem, when administered in linear form, to enhance the fusion activity of this protein.
  • the conformation of these peptide sequences is an important element of this effect.
  • the activity of the FRS fusion protein F can be modulated, that is to say stimulated or else inhibited, by simple association with small peptide sequences, and thus lead to an increase or else to a decrease in RSV infectivity.
  • the CDR3 of the V H heavy chain variable region of the antibody RS-348 is capable of inhibiting viral infection of RSV in vitro. It is therefore possible to inhibit the infectivity of RSV using a peptide corresponding to a single CDR of a neutralizing antibody. This result also indicates that the
  • V H CDR3 is a major part of the antibody determinant
  • mice Passive immunization of mice (protective effect).
  • a preparation of peptides, monoclonal antibody, or PBS (control) was administered nasally to batches of 10 E & lb / c mice. The animals were infected 4 hours later intranasally with the Long strain of the respiratory syncytial virus diluted in EME medium.
  • the decrease in virus titer in the lungs of mice was calculated as follows: (logio means' of pfu per gram of mice lung tissue) - (logio using pfu per gram of tissue of lungs of mice having received a dose of molecules to be tested).
  • the mean virus titers are statistically different from those of the control mice.
  • mice Four groups of 7-8 B mice ! VLB / c 10 week old females (IFFA / Credo, L'Arbresle, France) were used. These animals weighed approximately 20 g each. Fifty microliters of
  • PBS phosphate buffer
  • ascites fluid containing either RS-348 antibody (1/25 dilution; 5.4 ⁇ g Ig), or linear peptide derived from CDR3H348 (PEP3H348 SEQ ID No. 9; 140 ⁇ g) were inoculated intranasally, under Retamine-xylamine anesthesia, in each mouse of the first, or respectively of the second group.
  • the mice of the third group were each inoculated in a comparable manner with a peptide
  • mice therefore serves as a peptide control.
  • mice Twenty-four hours later, the mice were inoculated intranasally, under a second anesthesia, by
  • mice Five days after infection, the mice are sacrificed and their lungs harvested.
  • a lung treated with PEP3H348 was mixed (1/1) volume / volume) with an infected lung which did not receive any peptide. No neutralizing activity was obtained.
  • the resistance of the lung pretreated with PEP3H348 to RSV infection is not due to a residual neutralizing activity in vitro.
  • mice Six batches of each 10 10-week-old female deKLE / c mice were used. Each animal weighed about 20g. Each of the mice was inoculated intranasally with 10 pfu of VRS Long strain diluted in Bffi medium. Two days later, each of the mice then underwent one of the following treatments: no treatment: experimental control,
  • PEP3H peptide homologous to the CDR3 of the heavy chain of RS-348, (SEQ ID No. 9) in linear form at a rate of 70 ⁇ g per mouse, or
  • the average decrease in RSV concentrations measured for each of the therapeutic treatments tested was calculated as follows: (average log of pfu per gram of lung tissue from experimental control mice) - ((lloogg mmooyyeenn ddeess ppffuu pplor gpara ggrraammmmee dd ⁇ e lung tissue from the mice tested).
  • sequence SEQ ID No. 1 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR1H348 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID N c 2 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR2H348 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID No. 3 is an amino acid sequence of a heavy chain CDP3H348 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID No. 4 is an amino acid sequence of a light chain CDR1L348 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID No. 5 is an amino acid sequence of a light chain CDR2L348 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID No. 6 is an amino acid sequence of a light chain CDR3L348 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID No. 7 is an amino acid sequence of a synthetic peptide (PEP1H348) derived from a heavy chain CDKL of anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID No. 8 is an amino acid sequence of a synthetic peptide (PEP2H348) derived from a heavy chain CDR2 of anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID No. 9 is an amino acid sequence of a synthetic peptide (PEP3H348) derived from a heavy chain CDR3 of anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID No. 10 is an amino acid sequence of a synthetic peptide (PEP1L348) derived from a light chain CDR1 of anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID N c ll is an amino acid sequence of a synthetic peptide (PEP2L348) derived from a light chain CDR2 of anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • sequence SEQ ID No. 12 is an amino acid sequence of a synthetic peptide (PEP3L348) derived from a CDR3 light chain of anti-RSV monoclonal antibody (RS-348).
  • SEQ ID NO: 13 is an amino acid sequence d 1 a heavy chain of a monoclonal antibody CDR1H138 anti FW (RV-138).
  • sequence SEQ ID No. 14 is an amino acid sequence of a heavy chain CD 2H138 of an anti-I monoclonal antibody (IV-138).
  • sequence SEQ ID No. 15 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR3H138 of an anti-IV monoclonal antibody (FV-138).
  • sequence SEQ IP No. 16 is an amino acid sequence of a light chain CDR1L138 of an anti-FV monoclonal antibody (FV-138).
  • sequence SEQ ID No. 17 is an amino acid sequence of a light chain CDR2L138 of an anti-RV monoclonal antibody (RV-138).
  • sequence SEQ ID No. 18 is an amino acid sequence of a light chain CDR3L138 of an anti-FV monoclonal antibody (FV-138).
  • sequence SEQ ID No. 19 is an amino acid sequence of a heavy chain CDRLH133 of an anti-IV monoclonal antibody (RV-133).
  • sequence SEQ ID No. 20 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR2H133 of an anti-IV monoclonal antibody (FV-133).
  • sequence SEQ ID No. 21 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR3H133 of an anti-IV monoclonal antibody (FV-133).
  • sequence SEQ ID No. 22 is an amino acid sequence of a light chain CDKLL133 of an anti-IV monoclonal antibody (IV-133).
  • sequence SEQ ID No. 23 is an amino acid sequence of a light chain CDR2L133 of an anti-IV monoclonal antibody (FV-133).
  • sequence SEQ ID No. 24 is an amino acid sequence of a light chain CDR3L133 of an anti-IV monoclonal antibody (FV-133).
  • sequence SEQ ID No. 25 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR1 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-18E2).
  • sequence SEQ ID No. 26 is an amino acid sequence of a heavy chain CDP2 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-18E2).
  • sequence SEQ ID No. 27 is an amino acid sequence of a heavy chain CDP3 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-18E2).
  • sequence SEQ ID No. 28 is an amino acid sequence of a light chain CDR1 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-18B2).
  • sequence SEQ ID No. 29 is an amino acid sequence of a light chain CDR2 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-18E2).
  • sequence SEQ ID No. 30 is an amino acid sequence of a light chain CDR3 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-183E2).
  • sequence SEQ ID No. 31 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR1 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-2B3).
  • sequence SEQ ID No. 32 is an amino acid sequence of a heavy chain CDP2 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-2B8).
  • sequence SEQ ID No. 33 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR3 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-2E8).
  • sequence SEQ ID No. 34 is an amino acid sequence of a light chain CD RI of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-2B8).
  • sequence SEQ ID No. 35 is an amino acid sequence of a light chain CDR2 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-2B8).
  • sequence SEQ ID No. 36 is an amino acid sequence of a light chain CDR3 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-2B8).
  • sequence SEQ ID No. 37 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR1 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-255).
  • sequence SEQ ID No. 38 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR2 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-255).
  • sequence SEQ ID No. 39 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR3 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-255).
  • sequence SEQ ID No. 40 is an amino acid sequence of a light chain CDR1 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-255).
  • sequence SEQ ID No. 41 is an amino acid sequence of a light chain CDR2 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-255).
  • sequence SEQ ID No. 42 is an amino acid sequence of a light chain CDR3 of an anti-RSV monoclonal antibody (RS-255).
  • sequence SEQ ID No. 43 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR1 of an anti-RV monoclonal antibody (RV-238).
  • sequence SEQ ID No. 44 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR2 of an anti-FV monoclonal antibody (FV-238).
  • sequence SEQ ID No. 45 is an amino acid sequence of a heavy chain CDR3 of an anti-RV monoclonal antibody (RV-238).
  • sequence SEQ ID No. 46 is an amino acid sequence of a light chain CDR1 of an anti-FV monoclonal antibody (FV-238).
  • sequence SEQ ID No. 47 is an amino acid sequence of a light chain CDR2 of an anti-RV monoclonal antibody (RV-238).
  • sequence SEQ ID No. 48 is an amino acid sequence of a light chain CDR3 of an anti-IV monoclonal antibody (IV-238).
  • sequence SEQ ID No. 49 is the amino acid sequence 60-75 of the protein VP6 of Rotavirus.

Abstract

Les moyens de l'invention comportent des peptides essentiellement constitués par une séquence d'acide aminés capable de reconnaître selon une réaction de type antigène-anticorps au moins un épitope d'un virus à tropisme muqueux, impliqué dans les infections provoquées par un tel virus. Les moyens de l'invention comportent également les anticorps dirigés contre ces peptides et les ligands de ces peptides. Applications au diagnostic, traitement thérapeutique et vaccination chez l'homme et l'animal.

Description

"Nouveaux moyens pour le diagnostic, la prévention et le traitement vis-à-vis de contaminations ou d'infections par des virus à tropisme muqueux"
L'invention a pour objet de nouveaux moyens pour le diagnostic, la prévention et le traitement de l'homme ou de l'animal vis-à-vis de contaminations ou d'infections par des virus à tropisme muqueux.
Les virus à tropisme muqueux peuvent infecter diverses muqueuses humaines ou animales telles que les muqueuses respiratoi e, intestinale ou vaginale, selon différents mécanismes. Les défenses immuno logiques contre ces infections impliquent fréquemment la sécrétion d' IgA.
On citera les virus de la famille des Reoviridae, plus particulièrement du genre Rotavir s (dénommé ci-après RV) , les virus de la famille des Paramyxoviridae, plus particulièrement du genre Pneumovirus tel que le virus respiratoire syncytial (dénommé ci-après VRS) . Mais aussi les papillomavi rus , les adénovi rus , les entérovirus, les poli ovi rus, les virus de la grippe ou encore les virus de l' immunodéficience humaine.
Ces virus posent des problèmes complexes en médecine humaine, dans les collectivités et en milieu hospitalier où sont confinés des sujets particulièrement sensibles à de telles infections : nouveau-nés, bébés, prématurés en particulier, enfants, adultes immunodéprimés , personnes âgées, mais aussi en médecine vétérinaire dans le cas des élevages d' animaux comme les poulains ou les veaux.
De .telles situations conduisent à des infections épi demi ques d' autant plus lourdes et difficiles à gérer qu'elles peuvent donner lieu non seulement à des primoinfections, mais également à des ré-infections. Certaines de ces épidémies apparaissent, de plus, de manière périodique: c'est le cas, par exemple, des infections à VRS au cours des mois d'hiver, de novembre, décembre et janvier. Or, pour nombre de ces virus, les moyens prophylactiques ou thérapeutiques proposés à ce jour ne présentent pas l'efficacité souhaitée ou, pour certains, ne sont même pas disponibles. Il en est ainsi en particulier en ce qui concerne le VRS, agent infectieux de l' appareil respiratoire et responsable de bronchiolites et pneumonies sévères, et le Potavi rus , agent infectieux de l' appareil intestinal et responsable de gastroentérites sévères, pour lesquels il n' existe actuellement aucune thérapie, prophylaxie ou vaccination efficace.
Les recherches effectuées par les inventeurs dans ce domaine les ont conduits à étudier plus spécialement les régions déterminant la complémentarité, ou CDR, d' anticorps monoclonaux anti -virus à tropisme muqueux et à élaborer des séquences peptidiques de grand intérêt au regard de leurs propriétés immuno logiques. Divers outils utiles pour le diagnostic, la prévention et le traitement des contaminations et infections par ces virus ont pu être ainsi élaborés.
L'invention a donc pour but de fournir de telles séquences peptidiques capables de reconnaître des épi topes clés dans une contamination ou infection virale, et en particulier capables de constituer des paratopes vis-à-vis de RV et de VRS. Elle a également pour but de fournir les séquences de nucléotides correspondantes.
Selon encore un autre aspect, l'invention vise les applications de ces différentes séquences à des fins de diagnostic, préventives ou thérapeutiques dans le cas d'infection par des virus à tropisme muqueux, et notamment par
FV ou VRS.
Les peptides de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont essentiellement constitués par une séquence d'acides aminés capable de reconnaître, selon une réaction de type antigène-anticorps, au moins un épitope d'un virus à tropisme muqueux, impliqué dans les infections provoquées par un tel virus.
Une telle reconnaissance de l' épitope viral par le peptide peut être mise en évidence par exemple par une réaction antigène-anticorps comme par exemple l'ELISA.
L'invention vise en particulier des peptides tels qu'indiqués ci-dessus capables de neutraliser l'infection virale et, le cas échéant, d'inhiber la fusion entre cellules infectées et non infectées ou entre cellules et virus lorsque l' épitope viral est impliqué dans la fusion, et/ou encore d' exercer un effet protecteur par voie passive ou active et/ou d'inhiber la transcription du virus à tropisme muqueux.
De tels peptides peuvent présenter une spécificité de sous -groupe viral en neutralisation.
Ils sont caractérisés en ce qu'ils sont capables d'inhiber une étape essentielle de la multiplication virale. De tels peptides sont encore caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence d' acides aminés possédant les propriétés d'un CDR d'anticorps anti -virus à tropisme muqueux, tel que le VRS ou le RV.
L'expression "CDR" désigne une séquence d'acides aminés de régions hypervariables de l' anticorps impliquées dans la reconnaissance de sites antigéniques viraux majeurs.
Avantageusement, la séquence d' acides aminés des peptides de l'invention comprend une ou plusieurs séquences de ces régions CDR, et/ou un ou plusieurs analogues de telles séquences. Le terme "analogue", tel qu'utilisé selon l'invention, désigne une séquence d'acides aminés, différant de celle d'une région de CDR natif par un ou plusieurs acides aminés, mais présentant des propriétés immuno logiques du type de celles observées avec le CDR natif, telles que mises en évidence dans les exemples. Les différences au niveau des séquences peuvent correspondre à des modifications d'un ou plusieurs acides aminés et/ou des substitutions de natifs d'acides aminés par des groupes chimiques appropriés au regard des applications biologiques envisagées, ou des délations. Elles peuvent également correspondre à la présence de natifs additionnels, par rapport aux séquences natives. Des peptides préférés de ce type sont caractérisés en ce qu'ils présentent des propriétés de type antigène-anticorps avec VRS.
L'invention vise notamment les peptides caractérisés en ce qu'ils sont capables de réagir avec l' épitope 205-225 et/ou 255-278 de la protéine F de VRS. De tels peptides sont notamment caractérisés en ce qu'ils sont capables in vitro d'exerce une activité de neutralisation d'une infection de cellules, telles que des cellules Hep-2, par VRS, et/ou d'inhiber la fusion entre cellules infectées par VRS et celllules non infectées, ou la fusion entre cellules et VRS. De tels peptides sont de manière particulièrement remarquable, caractérisés en ce qu'ils sont capables in vivo, notamment lorsqu'ils sont administrés par voie intranasale, d'exercer un effet protecteur par voie passive contre une infection à VRS.
Il s'agit en particulier de peptides correspondant à, ou analogues de régions CDR d' anticorps monoclonaux spécifiques du VRS, du sous -groupe A ou E
Des peptides de ce groupe spécialement visés par l'invention présentent notamment une taille comprise entre 5 et
50 acides aminés environ, de préférence comprise entre 10 et 30 acides aminés environ.
Des peptides de ce groupe spécialement visés par l'invention répondent aux séquences d'acides aminés SEQ ID N°l à SEQ ID N°12 et SEQ ID N°25 à SEQ ID N°42.
Des peptides préférés de ce groupe répondent essentiellement aux séquences d'acides aminés SEQ ID N°3 Ou SEQ ID N°9 ( = SEQ ID N°27) .
D' autres peptides préférés du type mentionné ci- dessus sont caractérisés en ce qu'ils présentent des propriétés de type anti gène- anti corps avec RV.
L'invention vise notamment les peptides caractérisés en ce qu'ils dérivent d'anticorps capables de réagi avec le site III et/ou IV de la protéine VPβ de RV. De tels peptides, avantageusement, correspondent à, ou sont des analogues de régions CDR d' anticorps monoclonaux à spécificité RV.
Des peptides de ce groupe spécialement visés par l'invention comprennent essentiellement une ou plusieurs séquence (s) d'acides aminés choisie (s) parmi le groupe constitué par les séquences SEQ ID N°13 à SEQ ID N°24, et SEQ
ID N°43 à SEQ ID N°48. De tels peptides "anti-RV" peuvent avantageusement être greffés en lieu et place des CDR d'une immunoglobuline IgG ou IgA.
On observera que les peptides décrits ci -dessus en rapport avec les régions de CDR peuvent correspondre à, ou constituer des analogues de régions de CDR de chaînes lourdes d'anticorps anti -virus à tropisme muqueux, et/ou de chaînes légères.
Les différents peptides peuvent se présenter sous forme linéaire, ou en variante sous forme cyclisée.
Les peptides de l'invention sont obtenus par synthèse peptidique, en utilisant avantageusement les techniques classiques, ou encore par génie génétique en utilisant les acides nucléiques définis ci-dessous. En particulier, ils peuvent être produits par des cellules bactériennes, animales et végétales dans lesquelles sont insérées les séquences d'ADN portant l'information génétique correspondant à ces peptides et placées sous le contrôle de promoteurs appropriés. De telles cellules modifiées, le cas échéant, les organismes ou les plantes constitués de telles cellules sont également comprises dans le champ de l'invention.
L'invention vise en effet également les acides nucléiques correspondant selon le code génétique universel aux peptides définis plus haut.
Ces acides nucléiques comprennent les ADN comportant l'information génétique correspondant auxdits peptides, avantageusement les ADN capables de coder pour ces peptides. Ils comprennent également les A EN, notamment les AENm, et les ADNc correspondants.
Les vecteurs de transfert et/ou d'expression tels que cosmide, plas ide, phage, virus animal ou végétal renfermant de tels acides nucléiques, et les cellules hôtes contenant de tels vecteurs entrent également dans le champ de l'invention. L'étude des composés définis ci-dessus a conduit à mettre en évidence des propriétés anti -virales de grand intérêt, comme illustré par les exemples.
Ainsi, les propriétés de neutralisation et, le cas échéant, d'inhibition de la fusion du virus et/ou de sa transcription, sont avantageusement mises à profit, pour le diagnostic, la prévention et le traitement de contaminations et d'infections par de tels virus à tropisme muqueux et la fabrication d' immuno gènes en vue de vaccins. L'invention vise ainsi des moyens, à savoir des compositions, des méthodes et des kits, pour détecter la présence du virus chez l'homme ou l'animal, ou pour mettre en évidence une réponse immunitaire à une contamination ou à une infection virale. Les compositions de diagnostic de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent :
. pour détecter la présence du virus chez l'homme ou l' animal, d'au moins un peptide tel que défini ci -dessus, ou
. pour mettre en évidence une réponse immunitaire, d'au moins un anticorps dirigé contre un peptide de l'invention ou un ligand équivalent, c'est-à-dire se fixant sur le peptide, le peptide, l' anticorps ou le ligand, étant associé à un marqueur de la réaction de détection, tel qu' un radiomarqueur ou un marqueur enzymatique et, le cas échéant, à un véhicule approprié pour réaliser le diagnostic.
L'invention vise également une méthode de diagnostic in vitro d'une contamination ou d'une infection par un virus à tropisme muqueux, caractérisée en ce qu' elle comprend : - la mise en contact d'un échantillon biologique, tel qu' un fluide corporel, avec
. pour détecter la présence du virus chez l'homme ou l'animal, d'au moins un peptide de l'invention, ou une composition de diagnostic telle que définie plus haut, dans des conditions permettant la mise en évidence d'une réaction du type antigène-anticorps, ou
. pour mettre en évidence une réponse immunitaire, avec au moins un anticorps anti -peptide, un ligand se fixant au peptide, ou une composition de diagnostic les renfermant, comme défini ci-dessus, et la révélation de la réaction produite lorsque l' antigène vi al est présent. L'invention vise en outre des kits pour le diagnostic d'une contamination ou d'une infection par un virus à tropisme muqueux.
Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un peptide, ou un anticorps anti -peptide, ou un ligand équivalent, et les réactifs appropriés pour la réaction de détection, notamment des marqueurs et des solvants.
L'administration de peptides selon l'invention ou le cas échéant d' anticorps anti -peptides ou de ligands se fixant à ces peptides s'avère de grand intérêt pour prévenir ou traiter des infections par les virus à tropisme muqueux, notamment par
VRS et RV. Concernant le VRS, l' administration préférée est par voie intranasale.
L'invention vise donc également des compositions pharmaceutiques possédant des propriétés anti -vi raies , caractérisées en ce qu'elles renferment au moins un peptide à propriétés anti -virales tel que défini ci-dessus, un anticorps anti -peptide ou un ligand se fixant à ce peptide, en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.
L'invention vise plus spécialement les compositions élaborées à l' aide des peptides anti -VRS ou anti-RV. En particulier, l'invention vise les compositions pharmaceutiques anti -VRS, renfermant au moins un peptide répondant à l'une des séquences SEQ ID N°7 à SEQ ID N°12 et tout particulièrement à la séquence SEQ ID N°9 dont les propriétés neutralisantes présentent un grand intérêt.
Ces compositions sont administ râbles de préférence par voie nasale, par voie orale ou par voie parentérale, à raison de 1 à 80 mg/kg, sous différentes formes. On citera à titre d'exemple l'administration sous forme d'esters lourds, tels que décanoate, oenanthate ou palmitate, ou sous forme galénique retard.
Un autre aspect de l'invention revêtant un intérêt majeur concerne les applications vaccinales des anticorps dirigés contre lesdits peptides, ou de ligands équivalents.
De telles compositions vaccinales, qui sont caractérisées en ce qu' elles renferment une quantité efficace d' anticorps ou de ligands dirigés contre lesdits peptides en association avec un véhicule approprié, entrent également dans le cadre de l'invention.
Des compositions particulièrement avantageuses sont associées à au moins un autre vaccin, par exemple des vaccins pour l'enfance, ce qui permet de disposer de compositions vaccinales à large spectre. Dans les applications prophylactiques, les anticorps anti -peptides de l'invention ou lesdits ligands sont avantageusement conjugués à une molécule porteuse pour renforcer leur immunogénécité. A titre d' exemple, on citera des molécules de type haptène (anatoxine tétanique, anatoxine diphtérique ou autres).
En variante, les peptides ou anticorps anti -pepti des , ou lesdits ligands, sont insérés dans une structure d' immunoglobuline A humaine, le cas échéant modifiée dans la région charpente de ses régions variables adjacentes au peptide, ou à l' anticorps anti -peptide inséré, ou au ligand, de manière notamment à rétablir dans l' IgA résultante, les propriétés dudit peptide ou anticorps anti -pepti de.
La présentation des peptides est réalisée sous forme de fragment de type ScFv, ou d'insertion dans une structure de protéine hexon d' adénovi rus .
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent.
Dans les exemples qui vont suivre, donnés à titre illustratifs et non limitatifs, il est fait référence aux figures 1 à 7 qui représentent :
- la figure 1, l'inhibition de la transcription des particules virales double-couche {Rotavirus) par différents anticorps monoclonaux anti-VPβ, à savoir les anticorps monoclonaux RV-238, RV-133 et EV-138.
- la figure 2,1a neutralisation du pouvoir infectieux du VRS par le peptide synthétique homologue du CDR3 de la chaîne lourde de l' anticorps RS-348 (PEP3H).
- la figure 3, les séquences des chaînes VH et VT. d'anticorps monoclonaux anti -VRS ( CDR soulignés ) ,
- la figure 4, les CDR de ces chaînes,
- la figure 5, les séquences chaînes lourdes VH et légers VL des anticorps monoclonaux FV-138 et EV-133 (CDR soulignés ) ,
- la figure 6, les séquences des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l' anticorps monoclonal RV-238 (CDR soulignés ) , et - la figure 7, les séquences de peptides synthétiques anti -VRS,
Exemple 1: Production d'anticorps monoclonaux anti- VRS et d'anticorps monoclonaux anti-VR - obtention des hybridomes
Des souris Wy Ε/c ont été infectées
- en intranasal avec
. 10 pfu (unités formant plage) de VRS souche A2 ou Long ou - en intrapéritonéal
. 10 pfu de EV souche bovine RF.
Les cellules spléniques de souris sont récoltées et fusionnées avec des cellules de myélome SP2/0 selon les techniques classiques.
Les hybridomes (cellules hybridomales ) sécrétant soit des anticorps anti -VRS, soit des anticorps anti-RV, ont été sélectionnés par IF ou ELISA, clonées et conservées par congélation. - conditions de culture
Après décongélation, les cellules sont cultivées en milieu RPMI 1640-10% SVF (Sérum de Veau Foetal) dans une étuve à 37 °C, 5 % C02. -détection des anticorps par immunofluorescence indirecte (IF) .
Les surnageants d' hybridomes sont incubés 30 minutes à 37 °C dans des puits recouverts de cellules Hep 2 (cellules humaines) infectées ou non (témoins) par la souche A2 ou Long du virus syncytial respiratoi e, ou dans des puits recouverts de cellules MA104 (cellules de rein de singe) infectées ou non par la souche bovine RF ou par la souche humaine 46, (isolée à partir d'un prélèvement clinique puis clonée) du rotavirus.
Après 3 lavages au P BS, les anticorps présents sont révélés par une incubation de 30 minutes avec un anticorps anti-IgG de souris marqué à la fluorescéine. Les lames sont ensuite observées au microscope à fluorescence.
Les résultats rapportés dans les exemples ci-après concernent les sept anticorps monoclonaux suivants, à savoir : quatre anticorps monoclonaux anti-VRS, appelés respectivement
RS-348, RS-18E2, RS-2 B3 et RS-255, et trois anticorps monoclonaux anti-RV, appelés RV-133, EV-138 et EV-238. . anticorps monoclonaux anti-VRS
Les quatre anticorps monoclonaux anti-VRS, RS-348, RS-18E2, RS-2 E8 et RS-255, reconnaissent des épi topes proches sur la protéine de fusion F du VRS et sont tous, excepté RS-255 qui a été obtenu à partir du site 255-275 de la protéine F du
VRS, des IgGl fortement neutralisants.
L' anticorps RS-348 possède une très forte activité neutralisante. Il reconnaît les souches de VRS des sous -groupes
A et B en immunofluorescence alors qu'il présente une spécificité de sous -groupe en neutralisation. L' épitope des anticorps RS ci-dessous, tel qu'identifié par différentes techniques, est très conformationnel et est situé principalement entre les acides aminés 190 et 289 de la protéine de fusion du VRS (sites 205-225 et 255-278).
. anticorps monoclonaux anti-RV Les anticorps monoclonaux anti -rot a vi rus , RV-133,
RV-138 et RV-238, reconnaissent tous trois des sites antigeniques proches sur la protéine de capside interne du rotavirus, VP6. Cependant, RV-133 et RV-238 à la différence de FV-138, reconnaissent un épitope de groupe commun à toutes les souches du groupe A ayant un rapport avec la région de VP6 impliquée dans la transcription virale. En effet, la restauration de l'activité transcriptase n' a pas lieu lorsque VPβ est préalablement incubée avec l'anticorps RV-133 avant la réassociation avec les cores (voir "Inhibition of in vitro reconstitution of rotavirus transcriptionally active particles by anti-VP6 monoclonal antibodies". Evelyne KOHLI, Pierre POTHIER, Guenola TOSSER, Jean COHEN, Anna-Mari a SANDINO et Eugenio SPENCER, Archives of Vi rology 1994, 135, 193-200). Brièvement, 0,2 μg de particules virales double- coucle de la souche bovine RF ou de la souche humaine 46 de Rotavirus sont mis à incuber soit lh à 37° C, soit pendant une nuit à 0°C, en présence de concentrations croissantes de l' anticorps monoclonal anti-VP6 testé (volume total de la solution d'incubation 20 μl). Les anticorps monoclonaux testés sont ici FV-238, RV-133 et RV-138. On ajoute 20 μl d'un mélange contenant de l'ATP, de CTP, de GTP, d' UTP, marquée 3H ou non marqués, du Tris, du MgCl2, du DTT et de la RNasine.
L'ensemble est placé à 42°C. Des prélèvements sont effectués au bout de 30 minutes, puis déposés sur filtre GF/C et précipités au TGA. Les coups par min (cpm) sont alors comptés. Le même type de test peut être effectué avec des
• fragments Fab d' anticorps qui peuvent notamment être obtenus par digestion de l' anticoprs à la papaïne (rapport anti corps /papaïne entre 1000 et 2000/1 ) en présence d' EDTA et de β-mercaptoéthanol à 37° C.
La figure 1 illustre l'inhibition de la transcription de particules virales double-couche ("doule-*layer particules") {Rotavirus) exercée par les anticorps monoclonaux anti-VP6 RV- 238, RV-133 et RV-138 (incubation une nuit à 0°C en présence de particules virales double-couche de la souche RF, ou le cas échéant 46, de Rotavirus.
Les résultats obtenus avec les fragements Fab de ces anticorps RV-238, RV-133 et RV-138 sont comparables à ceux obtenus avec les anticorsp complets respectifs. Il est donc mis en évidence que, de manière surprenante, les fragments Fab des anticorps RV-238 et RV-138 exercent un effet inhibiteur sur la transcription de particules virales double-couche (Rotavirus) .
Exemple 2 : Obtention des séquences en acides aminés des chaînes lourdes et légères des anticorps monoclonaux à tropisme muqueux anti-VRS et anti-RV.
Les séquences en acides aminés sont déduites des séquences en ADN des gènes V et VL.
- Extraction et purification des ARNm
Cette étape est réalisée à l'aide d'un kit QuickPrepR Micro mRNA purification commercialisé par Pharmacia- E otech, à g partir de 10 cellules hybridomales. - Extraction des ARN totaux :
Les cellules d' hybridome sont centrifugées et le culot est repris dans 0,4 ml de tampon d'extraction (thiocyanate de guanidiu et N-lauroyl sarcosine) puis 0.8 ml de tampon d' élution (Tris-HCl pH 7,5 10 mM ; EDTA ImM) . - purification des ARNm sur colonne oligo(dT)
L'échantillon d' ARN totaux est ajouté au gel de cellulose-oligo (dT) homogénéisé et débarrassé de son tampon de stockage. Le tout est centrifugé et lavé 5 fois avec un tampon à forte concentration en sels puis 3 fois avec un tampon à faible concentration de sels.
Le gel remis en suspension dans ce dernier tampon est transféré dans une colonne (MicroSpin ®, Pharmacia) placée dans un microtube. Après 3 lavages avec le tampon lo -salt, les ARNm sont élues avec le tampon d' élution, puis conservés dans la glace.
- précipitation des ARNm L' éluat est additionné d'une solution de glycogene, d' acétate de potassium et d' éthanol 95 % avant d' être placé 30 minutes à -20° C. Après centrifugation, on récupère les
ARN&α dans le culot, puis on les remet en suspension dans du tampon d' élution.
- Synthèse de 1 'ADNc
La synthèse est réalisée en duplicata, un tube servant pour l'amplification de VH (région variable de chaîne lourde) et l'autre pour VL (région variable de chaîne légère). Après chauffage à 65 °C pour éliminer les structures secondaires, les ARNm (5μl) sont incubés pendant 1 heure en présence de lμl de dithiothréitol (DTT) 200 mM, llμl d'un mélange réactionnel contenant une transcriptase inverse
(origine : virus de la leucémie murine) , des amorces et les 4 didéoxynucléotides (ddNTP) à 1,25 mM chacun, et 16 μl d'eau distillée.
- Amplification par PCR de l 'ADN codant pour les gènes VH et VL
- conditions d' amplification : L'amplification des gènes codant pour VH et VL est réalisée séparément par PCR grâce à des amorces spécifiques du commerce : Hl (Heavy primer 1) et H2 (Heavy primer 2) pour amplifier VH, L (Light primer mix) pour amplifier VL (Pharmacia- E otech) .
Les mélanges réactionnels sont les suivants :
* pour VH : 33 μl d'ADNc, 2 μl d'amorce Hl, 2 μl d' amorce H2 et 62 μl d'eau distillée.
* pour VL : 33 μl d'ADNc, 2 μl d'amorce L et 64 μl d' eau distillée.
Chaque échantillon est recouvert d'huile minérale et, après dénaturation à 95 °C pendant 1 minute, 1 μl de Taq polymérase ( ELoprobe) est ajouté. Les tubes sont ensuite placés dans le thermocycleur (PHC-3, Techne) programmé pour 30 cycles de 3 étapes :
. dénaturation de l' ADN bicaténaire à 94° C, 1 minute, . hybridation des amorces à 55 °C, 2 minutes, . élongation du brin complémentaire à 72 ° C, 2 minutes.
- purification des produits de PCR
Les produits de PCR sont purifiés à l'aide d'un kit QIAquick PCR purification® de QIAGEN. Une aliquote est ensuite déposée sur gel d' agarose- EET ( BET = bromure d' éthidium) pour vérifier la bonne amplification des gènes.
- Séquençage des produits de PCR
Le séquençage des produits de PCR est réalisé sur un thermocycleur (GeneAmp PCR syste 2400) selon la méthode non- radioactive des terminateurs colorants. Cette technique s' apparente à la méthode de séquençage de Sanger basée sur les didéoxynucléotides (ddNTP) . Chaque ddNTP est marqué par un fluorophore différent, ce qui permet à la chaîne d'ADN en formation de se terminer et d' être simultanément marquée par le fluorophore correspondant à la dernière base ajoutée.
Les produits séquences sont ensuite séparés par migration electropho rétique dans un séquenceur automatique, tel que le séquenceur à ADN 373 stretch qui possède un système optique basé sur un laser couplé à un programme d' analyse informatique. Tous les appareils et réactifs utilisés sont commercialisés par Perkin-Elmer.
Les amorces de séquençage ont été déduites de diverses séquences consensus de gènes VH et VL synthétisées par Eurogentec (KABIT E.A. , WU T. T, REID-MILLER M. , PERRY H. M. , GOTTESAN K. S. 1987. Séquences of proteins of immunological interest, U. S. Dept of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office ; KAEAT E.A. , WU T. T. , PERRY H. M. , GOTTE__MAN K. S. , FOELLER C. 1991. Séquences of proteins of immunological interest, U. S. Department of Health and Human Services, NIH, Bsthesda, MD) .
- réaction de séquençage La réaction de séquençage est réalisée à l' aide d'un mélange réactionnel prêt à l'emploi : le kit de séquençage par cycle pour terminateurs colorants ABE PRISM®. Ce milieu contient les 4 ddNTP marqués différemment (ddATP, ddCTP, ddGTP et ddTTP) , les 4 dNTP non marqués (dITP, dATP, dCTP et dTTP) , du Tris-HCl (pH9,0), MgCl2, une pyrophosphatase et l'ADN polymérase Ampli Taq FS.
Dans un tube à PCR adapté au thermocycleur, environ 30 ng de produit de PCR purifié sont ajoutés à 1 μl d' amorce de séquençage (à 3,2 pmol/μl) , à 8 μl du milieu réactionnel et d'eau ultrapure (qsp 20 μl).
Les, tubes de réaction sont ensuite placés dans le thermocycleur programmé pour 25 cycles de 3 étapes :
* dénaturation : 96° C, 10s, * hybridation de l'amorce : 50° C, 5s,
* élongation : 60 ° C, 4 min.
- purification des produits séquences
L'excès de nucléotides est éliminé par une précipitation à l' éthanol des produits de séquençage. Les 20 μl de réaction sont transférés dans un micro tube à centrifuger de 1,5 ml où 2 μl d'acétate de sodium 3M (pH4, 6) et 50 μl d' éthanol 95 % ont été déposés. Les tubes sont placés 10 minutes dans la glace, puis centrifugés 20 à 30 minutes à vitesse maximale. Après décantation, les culots d'ADN sont lavés à l' éthanol 70% puis séchés.
Un tampon de dépôt est préparé en mélangeant 5 μl de formamide déionisé et 1 μl d' EDTA 50 mM (pH 8,0). Chaque culot de produit de séquençage est repris dans 4 μl de ce mélange avant d' être déposé sur le gel de migration. - séparation des produits de séquençage par migration electropho rétique.
Un gel de polyacrylamide à 4,75 % est préparé au moins 2 heures avant la migration afin d'obtenir une bonne polymérisation. Pour 80 ml de gel, 40 g d' urée sont dissous dans environ 27 ml d'eau ultrapure auxquels sont ajoutés 1 g de résine et 9,5 ml d'une solution stock d' acrylamide à 40 % (38 g d' acrylamide et 2 g de bis -acrylamide dans qsp 100 ml d' eau). Le mélange est agité pendant 5 minutes, puis filtré et dégazé.
8 ml d'une solution stock de Tris Borate EDTA 10X (108g de Tris base, 55 g de borate et 8,3 g d' EDTA pour 1 litre) sont ajoutés et le volume final est porté à 80 ml avec de l' eau. Le gel, d'une épaisseur de 0,4 mm, est coulé entre 2 plaques de verre après l'addition des catalyseurs : Temed (45 μl) , Temed = N, N,
N1 , N1 - tetramethylethylenediamine et ammonium peroxydisulfate à 0,lg/ml (400 μl). La face interne des plaques est préalablement nettoyée grâce à un détergent, puis rincée plusieurs fois à l'eau distillée et séchée.
Après polymérisation du gel, les plaques de verre sont nettoyées extérieurement de la même manière que précédemment et leur propreté est vérifiée directement dans la cuve à électrophorèse du séquenceur par le laser. Une fois les plaques bien propres, le gel peut être placé dans la cuve et le tampon de migration ajouté (Tffi IX). Une pré-migration est ensuite effectuée pendant 15 minutes afin de préchauffer le gel avant le dépôt des échantillons.
Les échantillons sont déposés en haut du gel après une dénaturation de 2 minutes à 90° C et la migration est lancée en même temps que la collection des données par le programme informatique.
Les produits purifiés et séparés sont ensuite clones selon les techniques classiques, puis séquences. Le séquençage des acides nucléiques a été réalisé sur des ADN double brin à l'aide d'un séquenceur à ADN automatisé (ABC).
- séquences : Après séquençage, la déduction de la séquence en acides aminés suivant le code génétique a permis d'identifier les 3 régions de CDR sur la chaîne lourde et les 3 régions de CDR sur la chaîne légère, chez chaque anticorps monoclonal. Chacune des régions CDR est identifiée par homologie avec les séquences d' immunoglobulines déjà publiées.
L' ensemble de ces séquences est rapporté dans la liste de séquences en fin de description. De plus, on a représenté sur la figure 3, la séquence en acides aminés, selon le code à 1 lettre, des VH et VL pour RS-348, RS-18E2,. RS-2 EB et RS-255. Les CDR sont indiqués et soulignés et sont donnés sur la figure 4.
De plus, les séquences des chaînes VH (chaînes varaibles lourdes) et VL (chaînes variables légères). Des anticorps RV-138 et RV-133 sont données, selon le code à 1 lettre, sur la figure 5.
Les séquences des chaînes VH et VL de l' anticoprs RV- 238 sont données, selon le code à 1 lettre, sur la figure 6. Les séquences CDR sont soulignées sur les figures 3 à
6.
Pour l' anticorps monoclonal RS-348, les séquences en acides aminés des CDR 1,2,3 de chaîne lourde (H) sont référencées, respectivement, sous SEQ ID n°l,2,3, et celles des CDR 1,2,3 de chaîne légère (L) sous SEQ ID n°4,5,6.
Pour l' anticorps monoclonal RV-138, les séquences en acides aminés des CDR 1,2,3 de chaîne lourde (H) sont référencées, respectivement, sous SEQ ID n°13,14,15 et celles des CDR 1,2,3 de chaîne légère (L) sous SEQ ID n°16,17,18. Pour l' anticorps monoclonal RV-133, les séquences en acides aminés des CDR 1,2,3 de chaîne lourde (H) sont référencées, respectivement, sous SEQ ID n°19,20,21 et celles des CDR 1,2,3 de chaîne légère (L) sous SEQ ID n°22,23,24.
Pour l' anticorps monoclonal FV-238, les séquences ou acides aminés des CDR 1,2,3 de chaîne lourde (H) sont référencées, respectivement, sous SEQ ID N°43,44,45 et celles des CDR 1,2,3 de chaîne légère (L) sous SEQ ID N°46,47,48.
Pour l'antico ps monoclonal RS-18B2, les séquences en acides aminés des CDR 1,2,3 de chaîne lourde (H) sont référencées, respectivement, sous SEQ ID n° 25,26,27 et celles des CDR 1,2,3 de chaîne légère (L) sous SEQ ID n°28,29,30. Le CDF3 de VH de RS-18 E2 présente la même séquence que celui de RS-348 (SEQ ID N°9 = SEQ ID N°27). Pour l'anticorps monoclonal RS-2B8, les séquences en acides aminés des CDR 1,2,3 de chaîne lourde (H) sont référencées, respectivement, sous SEQ ID n° 31,32,33 et celles des CDR 1,2,3 de chaîne légère (L) sous SEQ ID n°34,35,36.
Pour l'anticorps monoclonal RS-255, les séquences en acides aminés des CDR 1,2,3 de chaîne lourde (H) sont référencées, respectivement, sous SEQ ID n° 37,38,39 et celles des CDR 1,2,3 de chaîne légère (L) sous SEQ ID n°40,41,42.
Exemple 3: Peptides anti-VRS On a préparé par voie de synthèse des peptides de 20 acides aminés correspondant à chacune des 6 régions CDR de RS- 348 et comportant des acides aminés de la région ossature ajoutés à chaque extrémité des CDR pour parvenir à cette longueur ou pour faciliter la synthèse. Pour obtenir des peptides cyclisés, on a ajouté une cystéine à chacune des deux extrémités.
La synthèse a été réalisée avec un synthétiseur automatique Milligen® 9050, selon une méthode en phase solide qui utilise des acides aminés activés par des esters JSf-Fmoc protégés, sur une résine polystyrène (PEG-PS). L' acylation a été réalisée dans du DMF anhydre en utilisant des esters activés de chaque acide aminé (Dhbt pour Thr et Ser, Pfp pour les autres) avec de l' 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) ou de l' 1- hydroxy 7-azabenzotriazole (HOAt) comme réactifs de couplage. De la pipéridine à 20% dans du DMF a été utilisée pour les étapes de déprotection en N01.
En fin de synthèse, les chaînes latérales peptidiques ont été déprotégées et extraites de la phase solide par clivage à l' acide trifluoroacétique avec le réactif dérivé de King pendant 2 heures, en l'absence de lumière et d'oxygène. Les groupements thiol des cystéines C- et N-terminales étaient ainsi libres de leurs groupements trityl protecteurs et ont donc pu former des ponts disulfure pour la cyclisation pepti di que.
Les peptides ont alors été récupérés par précipitation dans de l' éther d' éthyle froid, centrifugations et lavages répétés dans de l' éther. Les précipités ont été remis en suspension dans de l' eau distillée.
La forme cyclique des peptides a été obtenue par oxydation spontanée des groupements Cys thiol : un aliquot de
25 umole (lmg/ml) déprotoné par NaOH (pH final = 8 à 8,5) a été maintenu une nuit durant sous forte agitation.
La forme linéaire des peptides a été obtenue en maintenant la protonation (pH = 5,5 à 6,5) et, en cas d' insolubilisation, par mélange avec du P BS dégazé (pH = 7,4) sous bullage d'azote de manière à empêcher la cyclisation. Les solutions de peptides sont ensuite rapidement congelées.
Les séquences des peptides synthétisés homologues des
6 CD te de l' anticorps monoclonal RS-348 sont rapportées dans le listing de séquences joint. Les séquences référencées sous SEQ ID n°7,8,9 représentent, respectivement, les séquences des peptides
PEP1H348, PEP2H348, PEP3H348, c'est-à-dire les séquences des peptides synthétiques construits par homologie avec les CDR
1,2,3, respectivement, de la chaîne lourde de RS-348. Les séquences référencées sous SEQ ID n°10,ll,12 représentent, respectivement, les séquences des peptides
PEP1L348, PEP2L348, PEP3L348, c'est-à-dire les séquences des •peptides synthétiques construits par homologie avec les CDR
1,2,3, respectivement, de la chaîne légère de RS-348. De plus, on a représenté sur la figure 7, les séquences de ces peptides synthétiques selon le code à 1 lettre.
Exemple 4 : Etude des propriétés fonctionnelles immunologiques des peptides de 1 'exemple 3 - activité de neutralisation
Des tests de neutralisation de VRS de souche Long (sous-groupe A) ont été réalisés par mesure de réduction de plaques. 5 x 10 pfu/ml de virus ont été mélangées pendant lh à 37 °C avec une dilution en série des peptides (de 15 μg à 0,875 μg) sous la forme cyclique ou linéaire.
Des monocouches de cellules Hep-2 sur plaques à 6 puits ont alors été infectées. La neutralisation a été mesurée, pour chaque concentration en peptides testée, lorsqu'une réduction de plaques de 50% est observée et est exprimée en logio moyen par quantité de peptides.
Aucune toxicité des peptides synthétiques n' a été détectée. L' activité neutralisante apparaît particulièrement élevée avec le peptide SEQ ID n°9 (PEP3H348). Celle-ci s'observe que le peptide soit présenté sous forme cyclique ou linéaire. Le peptide linéaire a, cependant, une activité neutralisante dans une plus large gamme de concentrations. Le peptide SEQ ID N°9 (PEP3H348) reproduit donc en neutralisation la spécificité de sous -groupe présentée par l' anticorps dont il désire (RS-348) (spécificité pour le sous-groupe A de VRS ; pas de neutralisation de la souche 9320 de VRS de sous-groupe B) .
Les résultats de neutralisation obtenus avec le peptide PEP3H (SEQ ID N°9) sont rapportés sur la figure 1 où le
% d'inhibition du pouvoir infectieux du virus est donné en ordonnée et la quantité de peptides est indiqué en abscisse, ( — — pour la forme cyclique du peptide, — D — pour la forme linéaire). En revanche, l' étude de la capacité à neutraliser une souche de sous-groupe B montre qu'aucun des peptides SEQ ID n°7 à 12 ne présente une forte activité neutralisante sur ce sous- groupe. Ces résultats indiquent que le peptide homologue au CDR3 de la chaîne lourde de RS-348 (SEQ ID n°9) est fortement neutralisant, qu'il porte de plus une spécificité de sous- groupe (A) et que la conformation imposée par la cyclisation n'influe pas sur la spécificité de cette activité. - Activité de fusion
Des tests de fusion de cellules infectées par le VRS de souche Long (sous -groupe A) ont été réalisés en présence et en l' absence des peptides synthétiques (PEP1H348, PEP2H348,
PEP3H348, PEP1L348, PEP2L348, PEP3L348) dérivés des six CDR d' 1' anticorps monoclonal RS-348 (séquences de ces peptides : SEQ ID N°7 à N°12).
Des cellules Hep-2 sont tout d' abord été infectées avec le vi us (5 x 103 unités formant plaque). Six heures plus tard, des quantités s' échelonnant de 0 à 15 μg de peptides synthétiques ont été ajoutées à ces cellules infectées.
Une activité inhibitrice de la fusion des cellules infectées par le VRS a notamment été observée en présence du peptide PEP3H348, (SEQ id N°9) (inhibition de 25% de la fusion en présence de 60 μg de PEP3H348).
Les peptides PEP2L348 (SEQ ID N°ll) et PEP3L348 (SEQ ID N°12) quant à eux, stimulent la fusion des cellules infectées, lorsqu'ils sont administrés sous forme linéaire, et ne présentent pas cet effet stimulateur de la fusion lorsqu'ils sont administrés dans les mêmes conditions mais sous forme cyclisée. La liaison des peptides PEP2L348 et PEP3L348 à la protéine F de fusion du VRS semblent donc, lorsqu'ils sont administrés sous forme linéaire, renforcer l' activité de fusion de cette protéine. La conformation de ces séquences peptidiques est un élément important de cet effet.
Aucun des peptides synthétiques testés n'a donné lieu à des effets cytotoxiques.
Il apparaît donc que l' activité de la protéine F de fusion du VRS peut être modulée, c'est-à-dire stimulée ou bien inhibée, par simple association avec des petites séquences peptidiques, et ainsi mener à une augmentation ou bien à une diminution de l' infectivité du VRS. Le CDR3 de la région variable de la chaîne lourde VH de l'anticorps RS-348 est capable d'inhiber l'infection virale du VRS in vitro. Il est donc possible d'inhiber l' infectivité du VRS à l' aide d'un peptide correspondant à un seul CDR d'un anticorps neutralisant. Ce résultat indique également que le
CDR3 de VH est une partie majeure du déterminant de l' anticorps
RS-348 impliqué dans l'interaction vi rus -anti corps. Ce CDR3H
(et le peptide PEP3H dérivé) portent la même spécificité de sous-groupe en neutralisation que l'anticorps dont il désire (RS-348).
- Immunisation passive de souris (effet protecteur) .
Infection quatre heures après instillation intranasale
Une préparation de peptides, d'anticorps monoclonal, ou de PBS (témoin), a été administrée par voie nasale à des lots de 10 souris E&lb/c. Les animaux ont été infectés 4 heures plus tard intranasalement avec la souche Long du virus respiratoire syncytial diluée dans du milieu EME.
Cinq jours après exposition au VRS, les poumons de chaque souris ont été homogénéisés et le taux d'infection par VRS mesuré en unités formant plaque (pfu).
Les résultats indiquent que la protection par l'immunisation passive est totale avec l'anticorps RS-348 et nulle avec le PBS témoin.
Un pouvoir protecteur important a été observé avec des peptides synthétiques homologues des CDRs de RS-348 (SEQ ID n°7 à 12), tout particulièrement avec PEP3H, le peptide synthétique homologue du CDR3 de la chaîne lourde de l'anticorps RS-348 (SEQ ID n°9) , comme indiqué sur le tableau 1 ci -des sous: Tableau 1
Dans ce tableau 1, la diminution du titre en virus dans les poumons de souris a été calculée de la manière suivante: (logio moyen 'des pfu par gramme de tissus de poumons de souris témoins) - (logio moyen des pfu par gramme de tissus de poumons de souris ayant reçu une dose de molécules à tester). Les titres moyens en virus sont statistiquement différents de ceux des souris témoins.
Infection vingt-quatre heures après instillation intranasale
Nous rapportons ici les résultats d' essais in vivo obtenus avec le peptide PEP3H348 (SEQ ID N°9) sous forme linéaire. Le même protocole peut toutefois être suivi avec d'autres peptides.
Quatre groupes de 7-8 souris B!VLB/c femelles âgées de 10 semaines (IFFA/Credo, L'Arbresle, France) ont été utilisés. Ces animaux pesaient environ 20 g chacun. Cinquante microlitres de
PBS (tampon phosphate) ou de fluide ascitique contenant soit, de l' anticorps RS-348 (dilution 1/25 ; 5,4 μg d' Ig) , soit du peptide linéaire dérivé du CDR3H348 (PEP3H348 SEQ ID N°9 ; 140 μg) ont été inoculés intranasalement, sous anesthésie Rétamine- xylamine, à chaque souris du premier, ou respectivement du deuxième groupe. Les souris du troisième groupe ont été chacune inoculées de manière comparable par un peptide
(NEDFGLLGTTLLNLDAG SEQ ID N°49) dérivé de la séquence 60 à 75 en acides aminés de la protéine VP6 du Rotavirus. Ce troisième groupe de souris sert donc de témoin peptide.
Vingt-quatre heures plus tard, les souris ont été inoculées intranasalement, sous une seconde anesthésie, par
3,75.104 de VRS souche Long dilué dans du milieu Basai Médium Eagle.
Cinq jours après l'infection, les souris sont sacrifiées et leurs poumons récoltés. Le titre en VRS des homogénats de poumons, dilués au 1/10 (mass e/ volume ) , est alors mesuré par essai sur plaque avec des cellules Hep-2 après coloration au rouge neutre. Les titres viraux sont exprimés en unités formant plaque (PFU) par gramme de tissu. On vérifie le caractère significatif des différences entre groupes à l' aide des tests de comparaison multiple (Duncan, Scheffé, Student-Newman-Keuls et Tukey-Kramer) .
Les résultats statistiques obtenus avec ces quatre tests sont en accord les uns avec les autres. Une dose unique de 140 μg de PEP3H348 (SEQ ID N°9) s'est ainsi montrée efficace pour prévenir l'infection par le VRS. En effet, l'administration intranasale de PEP3H348 (SEQ ID N°9) vingt-quatre heures avant l'infection a provoqué une diminution significative du virus dans les poumons de souris infectées par le VRS.
Dans ces conditions, le titre viral dans les poumons est diminué d'un facteur de 2,3 logio. Avec l'anticorps RS-348, une diminution d'un facteur de 1,56 logio a été mesurée. Aucune différence significative n' a pu être mesurée entre PEP3H348 et l'anticorps RS-348 complet. Le peptide utilisé à titre de témoin peptide (SEQ ID N°49) n'a provoqué aucune diminution de la repli cation du VRS. Tous les tests statistiques mènent à ces mêmes conclusions (un niveau α classique de 1 % a été choisi). Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : protection passive contre l'infection de VRS après instillation intranasale de PBS, RS-348, PEP3H348 (SEQ ID N°9) linéaire, or d'un peptide témoin (SEQ ID N°49).
Réactif instillé Titre viral moyeu Diminution
24 h avant l' infection (+_ déviation standard) moyenne du
(μg/souris ) dans les poumons , titre viral de souris pré-traitées dans les
(logio. poumons (logio)
PBS 3,26 + 0,43
RS-348 (5,4) 1,70 + 0,85 1,56 PEP3H348 (140) 0,95 + 1,02 2,31 Peptide témoin (140) 3,33 + 0,27
a Les titres viraux moyens dans les essais avec RS-348 et PEP3H348 sont statistiquement différents de ceux obtenus dans les essais PBS et Peptide témoin (tests à comparaison multiple) .
Pour vérifier l'absence d'activité neutralisante résiduelle qui pourrait interférer au moment de la récolte des poumons, un poumon traité au PEP3H348 a été mélangé (1/1) volume/volume) à un poumon infecté qui n' a reçu aucun peptide. Aucune activité neutralisante n' a été obtenue.
Ainsi, la résistance du poumon pré-traité au PEP3H348 à l'infection de VRS n'est pas due à une activité neutralisante résiduelle in vitro.
C'est donc la première démonstration qu'un simple CDR peut prévenir la progression d'une infection à VRS in vivo. Jusqu'à présent, les études de prophylaxie de l'infection à VRS n' avaient été menées qu' avec des Ig complètes ou des fragments Fab. En plus de la facilité de production (simple synthèse), les produits selon l'invention présentent également l'avantage d'éviter les réponses immunes allotypiques secondaires.
Exemple 5: Tests thérapeutiques chez les souris
Six lots de chacun 10 souris femelles ΕKLE/c âgées de 10 semaines ont été utilisés. Chaque animal pesait environ 20g. Chacune des souris a été inoculée intranasalement g avec 10 pfu de VRS souche Long dilué dans du milieu Bffi. Deux jours plus tard, chacune des souris a ensuite subi l'un des traitements suivants: aucun traitement: témoin expérimental,
- inoculation intranasale de PBS : témoin inoculation,
- inoculation intranasale de PEP3H (peptide homologue au CDR3 de la chaîne lourde de RS-348, (SEQ ID n°9 ) sous forme linéaire à raison de 70μg par souris, ou
- inoculation intranasale de PEP3H (SEQ ID n°9) sous forme linéaire à raison de 140μg par souris,
- inoculation intranasale de PEP3H (SEQ ID n°9) sous forme cyclique à raison de 70μg par souris, ou
- inoculation intranasale de PEP3H (SEQ ID n°9) sous forme cyclique à raison de 140μg par souris.
Toutes les inoculations ont été réalisées sous anesthésie à la kéta ine/xylamine. Un jour plus tard, toutes les souris ont été sacrifiées et leurs poumons récoltés. La concentration en RSV des homogénats de poumons a été mesurée par test sur plaque avec des cellules Hep-2 et par coloration au rouge neutre.
La diminution moyenne des concentrations en RSV mesurées pour chacun des traitements thérapeutiques testés a été calculée de la manière suivante : (log moyen des pfu par gramme de tissus de poumons de souris témoins expérimentaux) - ( (lloogg mmooyyeenn ddeess ppffuu ppaarr ggrraammmmee dd<e tissus de poumons des souris ayant subi le traitement testé). RESUME DES SEQUENCES
La séquence SEQ ID N°l est une séquence en acides aminés d'un CDR1H348 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID Nc2 est une séquence en acides aminés d' un CDR2H348 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID N°3 est une séquence en acides aminés d'un CDP3H348 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID N°4 est une séquence en acides aminés d'un CDR1L348 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID N°5 est une séquence en acides aminés d'un CDR2L348 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID N°6 est une séquence en acides aminés d'un CDR3L348 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID N°7 est une séquence en acides aminés d' un peptide synthétique (PEP1H348) dérivé d'un CDKL de chaîne lourde d'anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID N°8 est une séquence en acides aminés d' un peptide synthétique (PEP2H348) dérivé d'un CDR2 de chaîne lourde d'anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID N°9 est une séquence en acides aminés d'un peptide synthétique (PEP3H348) dérivé d'un CDR3 de chaîne lourde d'anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID N°10 est une séquence en acides aminés d'un peptide synthétique (PEP1L348) dérivé d'un CDR1 de chaîne légère d'anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID Ncll est une séquence en acides aminés d'un peptide synthétique (PEP2L348) dérivé d'un CDR2 de chaîne légère d'anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348). La séquence SEQ ID N°12 est une séquence en acides aminés d'un peptide synthétique (PEP3L348) dérivé d'un CDR3 de chaîne légère d'anticorps monoclonal anti-VRS (RS-348).
La séquence SEQ ID N°13 est une séquence en acides aminés d1 un CDR1H138 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti- FW (RV-138).
La séquence SEQ ID N°14 est une séquence en acides aminés d' un CD 2H138 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti- I (IV-138).
La séquence SEQ ID N°15 est une séquence en acides aminés d'un CDR3H138 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti- IV (FV-138).
La séquence SEQ IP N°16 est une séquence en acides aminés d'un CDR1L138 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-FV (FV-138).
La séquence SEQ ID N°17 est une séquence en acides aminés d' un CDR2L138 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-RV (RV-138).
La séquence SEQ ID N°18 est une séquence en acides aminés d'un CDR3L138 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-FV (FV-138).
La séquence SEQ ID N°19 est une séquence en acides aminés d'un CDRLH133 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti- IV (RV-133).
La séquence SEQ ID N°20 est une séquence en acides aminés d' un CDR2H133 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti- IV (FV-133).
La séquence SEQ ID N°21 est une séquence en acides aminés d' un CDR3H133 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti- IV (FV-133).
La séquence SEQ ID N°22 est une séquence en acides aminés d' un CDKLL133 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti- IV (IV-133).
La séquence SEQ ID N°23 est une séquence en acides aminés d' un CDR2L133 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti- IV (FV-133).
La séquence SEQ ID N°24 est une séquence en acides aminés d' un CDR3L133 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti- IV (FV-133). La séquence SEQ ID N°25 est une séquence en acides aminés d' un CDR1 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-18E2).
La séquence SEQ ID N°26 est une séquence en acides aminés d' un CDP2 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-18E2).
La séquence SEQ ID N°27 est une séquence en acides aminés d' un CDP3 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-18E2).
La séquence SEQ ID N°28 est une séquence en acides aminés d'un CDR1 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-18B2).
La séquence SEQ ID N°29 est une séquence en acides aminés d'un CDR2 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-18E2).
La séquence SEQ ID N°30 est une séquence en acides aminés d' un CDR3 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-183E2).
La séquence SEQ ID N°31 est une séquence en acides aminés d'un CDR1 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-2B3).
La séquence SEQ ID N°32 est une séquence en acides aminés d' un CDP2 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-2B8).
La séquence SEQ ID N°33 est une séquence en acides aminés d' un CDR3 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-2E8).
La séquence SEQ ID N°34 est une séquence en acides aminés d' un CD RI de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-2B8).
La séquence SEQ ID N°35 est une séquence en acides aminés d'un CDR2 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-2B8).
La séquence SEQ ID N°36 est une séquence en acides aminés d'un CDR3 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-2B8).
La séquence SEQ ID N°37 est une séquence en acides aminés d'un CDR1 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-255).
La séquence SEQ ID N°38 est une séquence en acides aminés d'un CDR2 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-255).
La séquence SEQ ID N°39 est une séquence en acides aminés d'un CDR3 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-255). La séquence SEQ ID N°40 est une séquence en acides aminés d'un CDRl de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-255).
La séquence SEQ ID N°41 est une séquence en acides aminés d'un CDR2 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-255).
La séquence SEQ ID N°42 est une séquence en acides aminés d'un CDR3 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-VRS (RS-255).
La séquence SEQ ID N°43 est une séquence en acides aminés d'un CDRl de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-RV (RV-238).
La séquence SEQ ID N°44 est une séquence en acides aminés d' un CDR2 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-FV (FV-238).
La séquence SEQ ID N°45 est une séquence en acides aminés d' un CDR3 de chaîne lourde d'un anticorps monoclonal anti-RV (RV-238).
La séquence SEQ ID N°46 est une séquence en acides aminés d' un CDRl de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-FV (FV-238).
La séquence SEQ ID N°47 est une séquence en acides aminés d' un CDR2 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti-RV (RV-238).
La séquence SEQ ID N°48 est une séquence en acides aminés d'un CDR3 de chaîne légère d'un anticorps monoclonal anti- IV (IV-238).
La séquence SEQ ID N°49 est la séquence 60-75 en acides aminés de la protéine VP6 de Rotavirus.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFO MATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Université de ≥mrgogne ( B) FUE: Esplanade Erasme (C) VILLE: DIJON
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 21000
(G) TELEPHONE: 03 80 39 50 00
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Nouveaux moyens pour le diagnostic, la prévention et le traitement vis-à-vis de contaminations ou d' infections par des virus à tropisme muqueux.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 49 (iv) FOFME DECHIFFRAELE PAR ORDINATEUR (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk { B) ORDINATEUR Iffl PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version 1.30 (OEB)
(2) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 5 acides aminés ( ) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR1H348
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Asn Tyr Ala Val His 1 5
(3) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 16 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI- SENS: NON
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP (v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CD 2H3 8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Ala Leu Met Pro 1 5 10 15
(4) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR 14 acides aminés
( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3H3 8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Asp Pro Asp Tyr Tyr Asp Asn Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10
(5) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 17 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRENS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR1L348
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Asn Thr Arg Thr Arg Lys Asn Tyr 1 5 10 15
Leu Ala (6) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 7 acides amin s ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR2L348
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser 1 5
(7) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 8 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3L348
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Lys Gin Ser Tyr Asn Leu Phe Thr 1 5
(8) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 14 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: PEP1H3 8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Cys Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Ala Val His Trp Val Cys 1 5 10
(9) INFO MATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 19 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGU ATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: PEP2H348
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Cys Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Ala Leu Met 1 5 10 15
Pro Arg Cys
(10) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 23 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: PEP3H3 8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Cys Ala Arg Asp Pro Asp Tyr Tyr Asp Asn Tyr Phe Tyr Ala Met Asp 1 5 10 15
Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Cys 20 (11) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 17 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vii) SOUPCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: PEP1L348
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Asn Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 15
Cys
(12) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 19 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGU ATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: PEP2L348
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Cys Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Pro Asp 1 5 10 15
Arg Phe Cys
(13) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR 18 acides aminés ( ]__) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (vii) SOURCE IMMEDIATE:
[B) CLONE: PEP3L348
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Cys Tyr Tyr Lys Gin Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 1 5 10 15
Lys Cys (14) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR 5 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRENS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON (v) TYPE DE FRAGMENT: interne (vii) SOUPCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: CDR1H138
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Ser His Trp Ile Glu 1 5
(15) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 17 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBFE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
< B) CLONE: CDR2H138
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Glu Ile Phe Pro Gly Arg Ile Ile Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15
Gly
(16) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 8 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOUPCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3H138
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Glu Gly Ala Tyr Gly Asn His Val 1 5
(17) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR 16 acides aminés
( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( E) CLONE: CDR1L138
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
Arg Ser Ser Gin Ser Ile Val His Ser Asn Gly Ala Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15
(18) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR 7 acides aminés
( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOUPCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR2L138
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5
(19) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 9 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3L138
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
Phe Gin Gly Ser His Val Pro Arg Thr 1 5
(20) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 5 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOUPCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR1H133
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
Ser Tyr Trp Ile His 1 5
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP (21) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 17 acides aminés ( E) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI- SENS: NON (v) TYPE DE FRAGMENT: interne (vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR2H133
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr His Tyr Asp Glu Lys Phe Phe 1 5 10 15
Thr
(22) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 13 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI- SENS: NON (v) TYPE DE FRAGMENT: interne (vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3H133
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
Ser Tyr Arg Asn Asp Asp Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 (23) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 16 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS- NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
[B) CLONE: CDR1L133
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
Ser Ser Ser Gin Ser Leu Val His Arg Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15
(24) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 7 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
{B) CLONE: CDP2L133
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5
(25) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 9 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3L133
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
Ser Gin Ser Thr His Val Pro Leu Thr 1 5
(26) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 5 acides aminés ( 1E§ TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
{ B) CLONE: CDR1H18E2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
Asn Tyr Ala Val His 1 5
(27) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 16 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
( C) NOM BRE DE BRINS:
(D) CONFIGU RATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii ) SOU RCE IMMEDIATE:
( 9 CLONE: CD R2H18 E2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Ala Leu Met 1 5 10 15
Pro
(28) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 14 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( E) CLONE: CDR3H18E2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27:
Asp Pro Asp Tyr Tyr Asp Asn Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10
(29) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 10 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR1L18K
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28:
Ser Ala Arg Ser Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 (30) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 7 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR2L1812
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29:
Asp Thr Phe Lys Leu Ala Ser 1 5
(31) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 30:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 9 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) H YPOTHET I QUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3L18E2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30:
Phe Gin Gly Ser Glu Phe Pro Leu Thr 1 5
(32) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 31:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 5 acides aminés ( B) TYPE: acide a iné
(C) NO BRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CD R1H2 B8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31:
Ser Tyr Asp Ile Ser 1 5
(33) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 32:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 16 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: CDR2H2BB
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 32:
Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe
1 5 10
Met Ser
15 (34) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 33:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 9 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CD R3H2 B8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 33:
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP Arg Thr Gly Thr Gly Pro Phe Ala Tyr 1 5
(35) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 34:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 17 acides aminés ( B) TYPE: acide a iné
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR1L2B8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 34:
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15
Met His
(36) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 35:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 7 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR2L2B3
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 35:
Leu Val Cys Asp Leu Glu Ser 1 5
(37) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 36:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 8 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3L2 B8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 36:
Gin His Ile Arg Gin Pro Tyr Thr 1 5
(38) INFOIMATIONStPOUR LA SEQ ID NO: 37:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 5 acides aminés ( ___) TYPE: acide aminé
( C) NOM BRE DE BRINS:
( D) CONFIGU RATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOUPCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR1H255
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 37:
Ser Phe Gly Met His 1 5
(39) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 38:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 17 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
( C) NOM BRE DE BRINS:
( D) CONFIGU RATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
( vii ) SOU RCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CD R2H255 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 38:
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 1 5 10 15
Lys Gly
(40) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 39:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 9 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOUPCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3H255
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 39:
Ser Arg Leu Arg Thr Val Met Asp Tyr 1 5
(41) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 40:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 17 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR1L255
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 40:
Arg Ala Ser Gin Pro Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15
Xaa Xaa
(42) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 7 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR2L255
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 41:
Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser 1 5
(43) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 42:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 9 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGU ATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3L255
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 42:
Leu Gin Tyr Ala Ser Ser Pro Phe Thr 1 5
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP (44) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 43:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 5 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
( C) NOM BRE DE BRINS:
(D) CONFIGU RATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR1H238
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 43: sp Tyr Ala Met His 1 5
(45) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 44:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 17 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
( C) NOM BRE DE BRENS:
( D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii ) SOU RCE IMMEDIATE:
{ B) CLONE: CD R2H238
(xi ) DESC RIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 44:
Val Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 1 5 10 15
Lys Gly (46) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 45:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 5 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
{ B) CLONE: CDR3H238
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 45:
Leu Leu Phe Pro Tyr 1 5
(47) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 46:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 11 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( E) CLONE: CDR1L238
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 46:
Arg Ala Ser Gin Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser 1 5 10
(48) INFOFMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 47:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 7 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI- SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR2L238
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 47:
Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser 1 5
(49) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 48:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 9 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: CDR3L238
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 48:
Leu Gin Tyr Ala Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5
(50) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 49:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR 17 acides aminés ( B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
( B) CLONE: Rotavirus VP6 seq 60-75
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 49:
Asn Glu Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Gly 1 5 10 15

Claims

REVENDICATIONS
1. Peptides caractérisés en ce qu'ils sont essentiellement constitués par une séquence d' acides aminés capable de reconnaître, selon une réaction de type antigène- anticorps, au moins un épitope d'un virus à tropisme muqueux, impliqué dans les infections provoquées par un tel virus.
2. Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont capables d'exercer une activité de neutralisation de l'infection virale et, le cas échéant, d'inhiber la fusion entre cellules infectées et non infectées, ou entre cellules et virus, et/ou d'exercer un effet protecteur par voie passive ou active et/ou d'inhiber la transcription du virus à tropisme muqueux.
3. Peptides selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils sont capables d'inhiber une étape essentielle de la multiplication virale.
4. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, caractérisés en ce qu'ils présentent une spécificité de sous -groupe viral en neutralisation.
5. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence d'acides aminés possédant les propriétés d'un CDR d'anticorps anti -virus à tropisme muqueux.
6. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisés en ce qu'ils comprennent essentiellement une ou plusieurs séquence (s) d'acides aminés qui correspond (correspondent chacune) à celle d'un CDR d'un anticorps anti- virus à tropisme muqueux, tel qu'un CDR d' un anticorps anti-VRS ou un anticorps anti-RV.
7. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils présentent des propriétés de type antigène-anticorps avec VRS.
8. Peptides selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'ils sont capables de réagir avec l' épitope 205-225 et/ou 255-278 de la protéine F de VRS.
9. Peptides selon la revendication 7 ou 8, caractérisés en ce qu'ils sont capables in vitro d'exercer une activité de neutralisation d'une infection de cellules par VRS, et/ou d' inhiber la fusion entre cellules infectées par VRS et cellules non infectées, ou la fusion entre cellules et VRS.
10. Peptides selon la revendication 7 à 9, caractérisés en ce qu'ils sont capables in vivo, notamment lorsqu'ils sont administrés par voie intranasale, d'exercer un effet protecteur par voie passive contre une infection à VRS.
11. Peptides selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisés en ce qu'ils correspondent à, ou constituent des analogues de régions de CDR, et notamment de CDR3, d' anticorps monoclonaux à spécificité VRS, de sous- groupe A ou B
12. Peptides selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisés en ce qu'ils présentent une taille comprise entre 5 et 50 acides aminés environ, de préférence comprise entre 10 et 30 acides aminés environ.
13. Peptides selon l'une quelconque des revendication 7 à 12, caractérisés en ce qu'ils répondent aux séquences d'acides aminés SEQ ID N°l à SEQ ID N°12 et SEQ ID N°25 à SEQ ID N°42.
14. Peptides selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisés en ce qu'ils répondent essentiellement aux séquences d'acides aminés SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°9.
15. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisés en ce qu'ils présentent des propriétés de type antigène-anticorps avec FV.
16. Peptides selon la revendication 15, caractérisés en ce qu'ils dérivent d'anticorps capables de réagir avec le site III et/ou IV de la protéine VP6 de RV.
17. Peptides selon la revendication 15 ou 16, caractérisés en ce qu'ils correspondent à, ou sont des analogues de régions CDR d' anticorps monoclonaux à spécificité RV.
18. Peptides selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisés en ce qu'ils comprennent essentiellement au moins une séquence d' acides aminés choisie parmi le groupe constitué par les séquences SEQ ID N°13 à SEQ ID N°27, et SEQ ID N°43 à SEQ ID N°48.
19. Peptides selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisés en ce qu'ils sont greffés en lieu et place des CDR d' i munoglobulines IgG ou IgA.
20. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisés en ce qu'ils présentent sous forme linéai e ou forme cyclisée.
21. Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre les peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 20.
22. Acides nucléiques caractérisés en ce qu'ils comprennent les ADN comportant l'information génétique correspondant aux peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, avantageusement les ADN capables de coder pour les peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ainsi que les ARN, notamment les ARNm, et les ADNc correspondants.
23. Vecteurs de transfert et d'expression tels que cosmide, plasmide, phage, virus animal ou végétal renfermant des acides nucléiques selon la revendication 22 et cellules hôtes contenant de tels vecteurs.
24. Procédé d'obtention de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'on opère par voie de synthèse, ou selon les techniques du génie génétique en utilisant les acides nucléiques ou les vecteurs ou les cellules hôtes selon les revendications 22 ou 23.
25. Compositions de diagnostic, caractérisées en ce qu'elles comprennent pour détecter la présence d'un virus à tropisme muqueux, en particulier de FV ou VRS chez l'homme ou l'animal,- d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, ou pour mettre en évidence une réponse immunitaire, d'au moins un anticorps selon la revendication 21, ou un ligand équivalent, le peptide, l' anticorps ou le ligand, étant associé à un marqueur de la réaction de détection, tel qu'un radiomarqueur ou un marqueur enzymatique et, le cas échéant, à un véhicule approprié pour réaliser le diagnostic.
26. Méthode de diagnostic in vitro de contamination ou d'une infection par un virus à tropisme muqueux, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- la mise en contact d'un échantillon biologique, tel qu' un fluide corporel, avec
. pour détecter la présence du virus chez l'homme ou l'animal, d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, ou une composition de diagnostic selon la revendication 25, dans des conditions permettant la mise en évidence d'une réaction du type anti gène- anti co rps , ou
. pour mettre en évidence une réponse immunitaire, avec au moins un anticorps anti -pepti de selon la revendication
14, un ligand se fixant au peptide, ou une composition de diagnostic les renfermant selon la revendication 25, et la révélation de la réaction produite lorsque l'antigène viral est présent.
27. Kits pour le diagnostic d'une contamination ou d'une infection par un virus à tropisme muqueux caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un peptide selon l'une
" quelconque des revendications 1 à 20, ou un anticorps anti- peptide selon la revendication 21, ou un ligand, et les réactifs appropriés pour la réaction de détection, notamment des marqueurs et des solvants.
28. Compositions pharmaceutiques possédant des propriétés anti -virales , caractérisées en ce qu'elles renferment au moins un peptide à propriétés anti -virales selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.
29. Compositions selon la revendication 28, caractérisées en ce qu' elles peuvent être administrées par voie intranasale.
30. Compositions selon la revendication 28 ou 29, caractérisées en ce qu'elles possèdent des propriétés anti-VRS et renferment au moins un peptide répondant à l' une des séquences SEQ ID N°7 à SEQ ID N°12 et tout particulièrement à la séquence SEQ ID N°9.
31. Compositions vaccinales caractérisées en ce qu' elles renferment une quantité efficace d' anticorps selon la revendication 14, dirigés contre les peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, ou de ligands équivalents en association avec un véhicule approprié.
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