FR2857023A1 - Sequences nucleiques et proteiques du virus hxhv et utilisations - Google Patents
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Abstract
Séquences d'acides nucléiques isolées susceptibles d'être obtenue à partir du génome du virus HXHV, en particulier la séquence d'acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO : 4 ou la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, polypeptides codés par les séquences d'acides nucléiques et leurs utilisations.
Description
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L'hépatite est la plus importante des maladies transmissibles. Le mode de transmission est le plus souvent la transfusion, la transplantation d'organes et l'hémodialyse, mais l'hépatite peut également être transmise par ingestion de nourriture ou d'eau contaminée et par contact entre individus.
Les hépatites virales sont induites par divers agents viraux qui se distinguent les uns des autres par leurs génomes et leurs modes de réplication. Les hépatites virales causent des dommages au niveau du foie avec des degrés variables de sévérité. Près d'un milliard de personnes dans le monde souffrent d'hépatites virales. Il existe des risques graves dans les formes chroniques des hépatites qui peuvent évoluer en cirrhose ou hépatocarcinome. Les hépatites virales peuvent être diagnostiquées par mise en évidence de symptômes bien définis, tels que la jaunisse, des taux élevés de transaminases (aspartate transaminase ou AST, alanine transaminase ou ALT, lactate déshydrogénase ou LDH), et des lésions hépatiques. Mais malgré la connaissance de différents virus des hépatites A, B, C, D, E, G et TTV, 5% de toutes les hépatites et 40% des hépatites fulminantes demeurent inexpliquées, d'où l'hypothèse de l'existence de virus inconnus des hépatites. Ces hépatites sans étiologie connue sont aussi bien post-transfusionnelles que sporadiques, chroniques ou fulminantes. Elles sont communément appelées hépatites X.
Les virus des hépatites G (GBV-A, GBV-B, GBV-C) et TTV récemment identifiés ne semblent pas être pathogènes chez l'homme et ne peuvent donc pas expliquer les cas d'hépatites sans étiologie connue ou hépatites X.
A partir d'un cas d'hépatite grave sans étiologie connue, d'un patient chez lequel un traitement à l'interféron a permis de normaliser les transaminases, un nouveau virus dénommé HXHV, associé aux hépatites X, a été décrit. Le génome du virus HXHV est un génome à ADN au
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moins partiellement simple brin qui comprend une ou plusieurs trames de lecture codant pour une ou des protéine(s) ou polyprotéine(s), le génome comprend une séquence nucléotidique susceptible de s'hybrider à la séquence nucléotidique XH ou à la séquence nucléotidique complémentaire de la séquence XH. La séquence XH est représentée dans l'identificateur de séquences de la présente demande en SEQ ID NO : 1. La séquence XH est riche en GC (62%) et présente quatre trames de lecture ouvertes (ORF1, ORF2, ORF3, ORF4). Cette séquence isolée a été caractérisée et aucune homologie de séquences avec l'ADN génomique humain et avec les séquences présentes dans les bases de données n'a été retrouvée. Toutes les informations concernant le virus HXHV sont contenues dans la demande de brevet PCT/FR02/04578 déposée aux noms des demanderesses.
Les présents inventeurs ont maintenant isolé et caractérisé une nouvelle séquence nucléotidique du virus HXHV. Cette séquence, dénommée XH1 est riche en GC (61,2%), ce qui est comparable avec la teneur en GC de la séquence XH isolée précédemment. La séquence XH1 est référencée dans l'identificateur de séquences en SEQ ID NO : 4. La séquence XH1 ne présente aucune homologie ou identité significative avec toutes les séquences disponibles dans les bases de données. Elle présente 5 trames de lecture ouvertes. Les séquences ADN correspondant auxdites trames de lecture ouvertes sont respectivement identifiées en SEQ ID NOs 5 à 9 dans l'identificateur de séquences. Comme il est de nature courante dans le domaine de la virologie, les présents inventeurs ont généré le brin ADN complémentaire de la séquence XH1 et ont également recherché s'il existait de potentielles trames de lecture ouvertes sur le brin ADN complémentaire. Ils ont identifiés 8 trames de lecture ouvertes qui sont respectivement représentées en SEQ ID NOs 10 à 17. Les séquences polypeptidiques correspondant
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auxdites trames de lecture sont respectivement identifiées en SEQ ID NOs : 18 à 30 dans l'identificateur de séquences. Les séquences précitées et leurs fragments sont utilisés pour la détection du virus HXHV.
Ainsi, la présente invention concerne : - une séquence d'acide nucléique susceptible d'être obtenue à partir du génome du virus HXHV, ladite séquence d'acide nucléique comprenant ou consistant en SEQ ID NO : 4.
- un fragment nucléotidique d'ADN isolé comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ADN ou ARN d'au moins 12 nucléotides contigus, de préférence d'au moins 15 ou d'au moins 18 nucléotides contigus, et avantageusement d'au moins 20 ou 21 nucléotides contigus, de la séquence nucléotidique ADN SEQ ID NO : 4 ou de la séquence ADN complémentaire de SEQ ID NO . 4 ; ou d'une séquence nucléotidique qui présente, sur au moins 12 nucléotides contigus, de préférence sur au moins 15 ou au moins 18 nucléotides contigus, et avantageusement sur au moins 20 ou au moins 21 nucléotides contigus, au moins 90%, de préférence au moins 92%, 95% ou au moins 98%, 99% d'homologie ou d'identité par rapport à la séquence représentée en SEQ ID NO : 4 ou par rapport à séquence ADN complémentaire de SEQ ID NO : 4 ; à l'exclusion des fragments qui consistent en une des séquences nucléotidiques suivantes : TAGTCGAGACTCAACCATCGC, CCCGCCCCGCTGATGAAAAG et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences ; ou à la condition que sur 20 nucléotides ou 21 nucléotides contigus ledit fragment nucléotidique d'ADN ne présente pas 100% d'homologie ou d'identité avec un fragment nucléotidique de la séquence référencée SEQ ID NO . 1 ou de la séquence complémentaire de SEQ ID NO . 1. Ledit fragment est en particulier choisi parmi les fragments dont lesdits nucléotides contigus appartiennent à l'un des segments suivants : un segment dont la séquence commence au
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nucléotide 2 et se termine au nucléotide 286 de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 4 et se termine au nucléotide 144 de SEQ ID NO :4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 180 et se termine au nucléotide 1004 de SEQ ID NO :4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 614 et se termine au nucléotide 820 de SEQ ID NO :4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 1228 et se termine au nucléotide 1314 de SEQ ID NO :4 ou les fragments complémentaires ; un segment dont la séquence commence au nucléotide 1283 et se termine au nucléotide 1197 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO :4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 1264 et se termine au nucléotide 1067 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 1209 et se termine au nucléotide 1099 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 819 et se termine au nucléotide 736 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 800 et se termine au nucléotide 6 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 784 et se termine au nucléotide 629 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 610 et se termine au nucléotide 410 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 391 et se termine au nucléotide 221 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou les fragments complémentaires ; et de préférence un fragment comprenant ou consistant en l'une quelconque des séquences SEQ ID NOs : 5 à 17 ou en l'une quelconque des séquences ADN complémentaires de SEQ ID NO . 5 à 17 ; - le produit de transcription la séquence comprenant ou consistant en SEQ ID NO : 4 ou le produit de transcription d'un fragment tel que défini ci-dessus, ou
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le produit de transcription de la séquence comprenant ou consistant en la séquence complémentaire de SEQ ID NO :4 ; - une molécule d'ADN qui comprend ou consiste en une séquence nucléotidique ADN représentée en SEQ ID NO : 4 ou en ce qu'elle comprend au moins un fragment nucléotidique ADN tel que défini ci-dessus ou leurs séquences complémentaires ; - une molécule d' ARN qui comprend ou consiste en une séquence nucléotidique ARN qui est le produit de transcription d'une séquence nucléotidique ADN représentée en SEQ ID NO : 4 ou de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou qui est le produit de transcription d'au moins un fragment tel que défini ci-dessus ou leurs séquences complémentaires.
L'homologie et identité ci-dessus recouvre les équivalents fonctionnels de la séquence SEQ ID NO : 4, c'est à dire les séquences ADN dans lesquelles au moins un codon peut être remplacé par un autre codon tout en codant pour un acide aminé identique. On parle de dégénérescence du code génétique. Ainsi, les codes de l'argininine, de la sérine et de la leucine présentent une dégénérescence d'ordre 6 (c'est à dire qu'il y a six codons différents pour chacune d'elle), tandis que les codes d'autres acides aminés, tels que l'acide glutamique, la glutamine, la tyrosine, l'histidine et quelques autres présentent une dégénérescence d'ordre 2. De tous les acides aminés seuls le tryptophane et la méthionine ont une dégénérescence d'ordre 1. Il est donc clair que pour l'expression d'un polypeptide dont la séquence est représentée en SEQ ID NOs : 18 à 30, on peut utiliser des séquences d'acides nucléiques variantes et fonctionnelles dont les compositions en codons sont différentes de la séquence d'acide nucléique représentée en SEQ ID NO : 4 ou de sa séquence complémentaire.
L'homologie ou identité définie ci-dessus vise également les séquences mutantes du virus HXHV, et en
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particulier celles issues de la variabilité naturelle. En effet, il est bien connu des spécialistes que les virus ont des taux relativement élevés de mutations spontanées ou induites.
L'invention concerne également : - un polypeptide comprenant une séquence polypeptidique codée par une séquence ou par un fragment tel(le) que défini(e) ci-dessus ou par leurs équivalents fonctionnels ou par une séquence nucléotidique qui présente au moins 90% d'homologie ou d'identité, de préférence au moins 95% d'homologie ou d'identité et avantageusement au moins 98% d'homologie ou d'identité par rapport à la séquence représentée en SEQ ID NO : 4 ou par rapport à la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, à la condition que les séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC, CCCGCCCCGCTGATGAAAAG, les séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences soient exclues ; ou à la condition que sur 20 nucléotides ou 21 nucléotides contigus le fragment nucléotidique d'ADN ne présente pas 100% d'homologie ou d'identité avec un fragment nucléotidique de la séquence référencée SEQ ID NO . 1 ou de la séquence complémentaire de SEQ ID NO . 1 ; - un polypeptide dont la séquence polypeptidique comprend ou consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos 18 à 30 ou en une séquence polypetidique fonctionnellement équivalente auxdites séquences ; - un fragment polypeptidique, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence peptidique d'au moins 4 acides aminés, de préférence d'au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, de préférence encore d'au plus 15 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés de l'une quelconque des séquences peptidiques représentées en SEQ ID NO . 18 à 30 ou d'une séquence peptidique fonctionnellement équivalente auxdites séquences SEQ ID NO . 18 à 30 ; étant entendu que
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par séquence peptidique fonctionnellement équivalente on entend une séquence peptidique qui est reconnue par des anticorps dirigés contre le virus HXHV ; - un fragment polypeptidique qui comprend ou qui consiste en une séquence peptidique représentée en l'une quelconque des SEQ ID NOs : 18 à 30 ou une séquence peptidique fonctionnellement équivalente à l'une quelconque des SEQ ID NOs : 18 à 30 ; entendu que par séquence peptidique fonctionnellement équivalente on entend une séquence peptidique qui est reconnue par des anticorps dirigés contre le virus HXHV.
Par "polypeptide", on désigne un peptide, à l'état isolé, présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Les polypeptides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes de synthèse classique, par exemple avec un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules.
Par séquence peptidique fonctionnellement équivalente à une séquence peptidique de référence, on entend une séquence d'acides aminés modifiée par insertion et/ou délétion et/ou substitution et/ou allongement et/ou raccourcissement et/ou modification chimique d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que ces modifications préservent substantiellement voire développent les propriétés immunoréactives de ladite séquence peptidique de référence.
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Ainsi, on entend par séquences fonctionnellement équivalentes des séquences qui conservent les propriétés immunoréactives de SEQ ID Nos 18 à 30 ou de leurs fragments, notamment les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide(s) aminé(s) est ou sont substitué(s) par un ou plusieurs autres acides aminés ; les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide aminé de la série L est remplacé par un acide aminé de la série D, et vice-versa ; les séquences dans lesquelles on a introduit une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions amines, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques ; une modification des liaisons peptidiques telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy.
Par exemple un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans les séquences des polypeptides de l'invention peuvent être substitué(s) par un ou plusieurs autre(s) acide(s) aminé(s) de polarité similaire qui agissent comme des équivalents fonctionnels. Des substitutions pour un acide aminé dans des séquences polypeptiques d'intérêt peuvent être déterminées à partir d'autres membres de la classe auquel l'acide aminé appartient. Par exemple, les acides aminés non polaires (hydrophobes) comprennent l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la valine, la proline, la phénylalanine, la tryptophane, la méthionine. Les acides aminés neutres polaires comprennent la glycine, la sérine, la thréonine, la cystéine, la tyrosine, l'asparagine, la glutamine. Les acides aminés chargés positivement (basiques) comprennent l'arginine, la lysine et l'histidine. Les acides aminés chargés négativement (acides) comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique. D'autres substitutions pour un acide aminé dans des séquences polypeptidiques d'intérêt peuvent être déterminées à partir des informations contenues dans l'article de Kramer A. et al. (Molecular Immunology, Vol.
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32, N 7, pp. 459-465 (1995)). Ces auteurs ont constitué des banques dans lesquelles pour réduire le problème de l'explosion combinatoire du nombre de molécules, ils ont utilisés des groupes d'acides aminés constitués d'acides aminés ayant des propriétés physico-chimiques similaires et ce sont les acides aminés regroupés dans chacun de ces six groupes, listés ci-dessous, qui sont considérés principalement comme équivalents dans la présente invention.
Groupe 1 : alanine, proline, glycine.
Groupe 2 : acide aspartique, acide glutamique.
Groupe 3 : histidine, lysine, arginine.
Groupe 4 : asparagine, glutamine, sérine, thréonine.
Groupe 5 : phénylalanine, tyrosine, tryptophane.
Groupe 6 : isoleucine, leucine, valine, méthionine.
L'équivalence d'une séquence peptidique par rapport à une séquence peptidique de référence peut être définie par son identité ou son homologie, exprimée en pourcentage, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage est déterminé, pour une suite d'un nombre donné d'acides aminés contigus, par alignement des deux séquences, déplacement de l'une par rapport à l'autre, et comparaison des acides aminés dans les deux séquences. Le pourcentage d'identité est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont identiques à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. Le pourcentage d'homologie est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont équivalents à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position.
L'invention concerne aussi une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique ou d'un fragment d'ADN ou d'une molécule d'ADN tels que décrits ci-dessus, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. La cassette d'expression est caractérisée en ce qu'elle est
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fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote, en particulier E. coli ou d'un organisme eucaryote, en particulier les cellules provenant d'animaux tels que les mammifères, les reptiles, les insectes, en particulier les cellules COS, CHO, BHK, PK 15, RK 13 ; les lignées cellulaires humaines de l'ostéosarcorme (cellules 143 B), les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome (du type HepG2) ; les lignées cellulaires d'insecte (par exemple de Spodoptera frugiperda) ; ou eucaryote inférieur, en particulier les cellules de levures, telles que Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces et Pichia, et de préférence choisi parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, Kluveromyces lactis et de Pichia pastoris.
L'invention concerne encore un vecteur comprenant ladite cassette d'expression ; une cellule issue d'un organisme procaryote, eucaryote ou eucaryote inférieur , de préférence un organisme eucaryote ou eucaryote inférieur tel que défini ci-dessus ou un vecteur tel que défini ci-dessus ; et le polypeptide susceptible d'être produit par la cassette d'expression, le vecteur ou la cellule.
L'invention a pour objet un procédé pour préparer un polypeptide ou un fragment polypeptidique tel que défini ci-dessus qui consiste à cultiver une cellule hôte répondant aux définitions précédentes dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence d'acide nucléique ADN telle que définie précédemment ou un fragment nucléotidique ADN tel que défini précédemment ou une molécule d'ADN telle que définie précédemment et, à purifier ledit polypeptide produit jusqu'à un degré de pureté requis.
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L'invention a aussi pour objet un polypeptide immunogène, ledit polypeptide comprenant ou consistant en une séquence polypeptidique ou peptidique telle que définie précédemment. Un tel polypeptide immunogène est utilisé pour la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou de fragments desdits anticorps et l'invention englobe les anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou leurs fragments, étant obtenus par immunisation d'un animal mammifère (lapin, rat, souris) avec un tel peptide immunogène.
La production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux est bien connue de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kôhler G. et Milstein C. (1975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 :495-497 et Galfre G. et al. (1977) Nature, 266 : 522-550 pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G.F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps peuvent également être produits par immunisation de souris, de rat ou de lapins avec les particules virales de HXHV. Pour la production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux, l'immunogène peut être couplé à de l'albumine sérique (peptide SA) ou à l'hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation. Les anticorps sont ensuite criblés pour leur spécificité en utilisant les techniques habituelles, telles que des tests ELISA ou de Western Blot. Pour la production d'anticorps monoclonaux les animaux sont soumis à une injection d'immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund.
Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les
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plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés.
Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quel que soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromatographie d'exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d'anticorps sont criblés dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vitro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier. Il est avantageux d'utiliser des anticorps humanisés. Les formes " humanisées " d'anticorps non humains, par exemple murins, sont des anticorps chimères qui comprennent une séquence minimale dérivée d'une immunoglobuline non humaine. Pour la plupart, les anticorps humanisés sont des immunoglobulines humaines (anticorps récepteur) dans lesquelles des résidus d'une région hypervariable du récepteur sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce donneur (anticorps donneur) non humaine, telle que souris, rat, lapin ou primate non humain, ayant la spécificité, l'affinité et la capacité souhaitées. Dans certains cas, les résidus (FR) de la région Fv de l'immunoglobuline humaine sont remplacés par des résidus correspondants non humains. De plus, les anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus qui ne sont pas trouvés dans l'anticorps receveur ou dans l'anticorps donneur. Ces modifications sont effectuées pour améliorer les performances de l'anticorps. En général, l'anticorps humanisé comprendra au moins et de préférence deux domaines variables, dans lesquels tout ou
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à peu près tout des boucles hypervariables correspondent à une immunoglobuline non humaine et tout ou à peu près tour des régions FR seront celles d'une immunoglobuline humaine. Les anticorps humanisés facultativement pourront aussi comprendre au moins une partie d'une région constante (Fc) d'une immunoglobuline, telle qu'une immunoglobuline humaine (Jones et al., Nature 321 : 522- 525 (1986) ; Reichmann et al., Nature 332 : 323-329 (1988) ; et Presta et al., Curr. Op. Struct. Biol. 2 : 593-596 (1992).
Plus particulièrement, par fragment d'anticorps on entend les fragments F (ab)2, Fab,Fab', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159 : 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : 394-397). Ces fragments d'anticorps et dérivés d'anticorps conservent la capacité de se lier sélectivement à l'antigène cible.
L'anticorps monoclonal ou polyclonal ainsi obtenu ou son fragment est incorporé dans une composition diagnostique qui est utilisée dans un procédé pour détecter au moins un polypeptide ou un fragment peptidique tel que défini précédemment dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec la composition dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.
L'invention a également pour objet une composition diagnostique qui comprend un polypeptide ou un fragment peptidique tel que défini précédemment et un procédé pour détecter des anticorps dirigés contre le virus HXHV ou au moins contre un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention, selon lequel on met en contact un échantillon
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biologique suspecté être ou pouvoir avoir été infecté par le virus HXHV avec la composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. En effet, il est connu que lors d'une infection par un agent viral, l'hôte développe des anticorps dirigés contre cet agent viral (réponse humorale).
La présente invention a aussi pour objet le matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des êtres humains ou des animaux infectés par au moins le virus HXHV et des compositions immunogènes ou vaccinales qui peuvent être utilisées pour produire des vaccins thérapeutiques contre une infection par le virus HXHV et des vaccins prophylactiques pour prévenir une potentielle infection par le virus HXHV, lesdites préparations immunogènes comprenant au moins un polypeptide ou un fragment peptidique naturel, recombinant, ou de synthèse de l'invention associé à un véhicule et/ou un adjuvant et/ou un diluant et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou d'au moins un fragment desdits anticorps de l'invention, spécifique d'au moins un polypeptide ou un fragment peptidique tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique qui administrée à un patient infecté par le virus HXHV a la capacité de réduire voire d'inhiber la prolifération et/ou la réplication du virus. Ces anticorps ou leurs fragments sont appelés anticorps neutralisants.
Par échantillon biologique, on entend par exemple le sang, le sérum, le plasma, les prélèvements tissulaires, tels que les extraits de biopsie du foie.
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Les vaccins préparés sont injectables, c'est-à-dire en solution liquide ou en suspension. En option, la préparation peut aussi être émulsifiée. La molécule antigénique peut être mélangée avec des excipients qui sont pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec l'ingrédient actif. Des exemples d'excipients favorables sont l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol, l'éthanol ou des équivalents et leurs combinaisons. Si désiré, le vaccin peut contenir des quantités mineures de substances auxiliaires comme des agents mouillants ou émulsifiants, des agents qui tamponnent le pH ou des adjuvants comme l'hydroxide d'aluminium, le dipeptide muramyl ou leurs variations. Dans le cas des peptides, leur couplage à une plus grosse molécule (KLH, toxine tétanique) augmente quelquefois l'immunogénicité. Les vaccins sont administrés conventionnellement par injection par exemple intramusculaire. Des formulations additionnelles favorables avec d'autres modes d'administration incluent des suppositoires et quelquefois des formulations orales.
Par " véhicule pharmaceutiquement acceptable on entend les supports et véhicules administrables à l'être humain ou à un animal, tels que décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed., Mack Publishing Co. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est de préférence isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont également données dans Remington's Pharmaceutical Sciences précité.
L'invention a encore pour objet : - une sonde, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence d'acide nucléique ou à un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à une molécule d'ADN ou d'ARN de l'invention ; de préférence,
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une sonde de l'invention comprend au moins 12 nucléotides, et l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence correspondant à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 C sous le Tm ( melting température ) du complexe sonde/ séquence nucléotidique à détecter ; - une amorce, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence d'acide nucléque ou à un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à une molécule d'ADN ou d'ARN de l'invention ; de préférence, une amorce de l'invention comprend au moins 12 nucléotides, et l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence correspondant à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 C sous le Tm ( melting température ) du complexe amorce/ séquence nucléotidique à amplifier et/ou détecter. Les amorces représentées en SEQ ID Nos 32 à 37 sont nouvelles et comme décrit dans la partie expérimentale des couples d'amorces sont utilisés pour l'amplification des acides nucléiques du virus HXHV, lesdits couples d'amorces étant choisis préférentiellement parmi les couples suivants : SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34/ SEQ ID NO : 35, , SEQ ID NO : 36/ SEQ ID NO : 37 ; - un anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence d'acide nucléique ou à un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à une molécule d'ADN ou d'ARN ; - une composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tel que défini ci-dessus ; - un procédé de détection d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon biologique d'un patient suspecté être ou pouvoir avoir été infecté par le
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virus HXHV, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce de l'invention, dans des conditions de stringence déterminées et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN (par exemple comme décrit dans la partie expérimentale de l'invention) ; - un procédé de détection d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps antiacide nucléique, ledit anticorps étant éventuellement marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps.
La production de polynucléotides, sondes ou amorces fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut notamment citer l'utilisation d'enzymes de restriction, et la synthèse chimique sur synthétiseur automatique. Les sondes et amorces susceptibles de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique tel que défini précédemment font partie de cette définition. Il est à la portée de l'homme du métier de définir les conditions de stringence appropriées. Des conditions de stringence caractéristiques sont celles qui correspondent à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 C sous le Tm (" melting température ") de l'hybride à l'étude. On peut ainsi se référer à l'ouvrage de George H.
Keller et Mark M. Manak, DNA PROBES, second édition, Stockton Press, 1993,49 West 24th St., New York, N.Y.
10010 USA. Les conditions de stringence pour discriminer même une seule mutation ponctuelle dans une séquence
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nucléique sont connues depuis au moins les années 1979 ; On peut citer à titre d'exemples Wallace R. B et al., DNA.
Nucleic. Acids. Res. 6, 3543-3557 (1979), Wallace R. B et al., Science, 209,1396-1400 (1980), Itakura K. and Riggs A.D., Science, 209,1401-1405 (1980), Suggs S.V. et al., PNAS, 78,6613-6617 (1981), Wallace R. B et al. DNA.
Nucleic. Acids. Res., 9,3647-3656 (1981), Wallace R. B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9,879-894 (1981) et Conner B.J. etal, PNAS, 80,278-282 (1983). Par ailleurs, on connaît des techniques pour la production d'anticorps anti-acides nucléiques. On peut citer à titre d'exemples Philippe Cros et al., Nucleic Acides Researc, 1994, Vol.
22, N . 15, 2951-2957 ; Anderson, W. F. et al. (1988) Bioessays, 8 (2), 69-74 ; Lee, J. S. et al. (1984) FEBS Lett., 168, 303-306 ; Malfoy, B. et al. (1982) Biochemistry, 21 (22), Stollar, B. D. et al., J. J. (eds) Methods in Enzymology, Academic Press, pp 70- 85 ; Traincard, F. et al. (1989) J. Immunol. Meth., 123, 83-91 et Traincard, F. et al. (1989) Mol. Cell. Probes, 3, 27-38) .
L'invention se rapporte aussi à : - une composition vaccinale comprenant une séquence d'ADN codant pour au moins un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule et/ou un diluant et/ou un excipient approprié et pharmaceutiquement acceptable ; - un oligonucléotide anti-sens ou anti-gène, caractérisé en ce qu'il est capable d'interférer spécifiquement avec la synthèse d'au moins un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention ; - une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide anti-sens ou un oligonucléotide anti-gène ; - un vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un gène d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, ledit gène codant notamment
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- (i) soit au moins pour un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention; - (ii) soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps capable de se fixer à au moins un polypeptide ou fragment peptidique défini en (i) ; - (iii) soit au moins pour une molécule inhibitrice d'au moins un polypeptide ou fragment peptidique défini en (i) ; - (iv) soit au moins pour un ligand ou toute partie d'un ligand capable de se fixer à au moins un polypeptide ou fragment peptidique défini en (i) et/ou d'inhiber sa fonction ; - une composition thérapeutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, un vecteur tel que défini ci-dessus et en ce que ledit gène d'intérêt est placé sous la dépendance d'éléments assurant son expression in vivo ; - un matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou vaccinale, comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique ou par au moins un fragment nucléotidique ou par au moins une molécule d'ADN ou par au moins un vecteur de l'invention, lesdits séquence d'acide nucléique, fragment nucléotidique, molécule d'ADN et gène du vecteur codant in vivo pour au moins un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention ou codant pour au moins tout ou partie d'un anticorps qui est capable de se lier à un polypeptide ou fragment peptidique de l'invention ou codant pour au moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins un polypeptide ou d'un fragment peptidique ;
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une composition thérapeutique ou vaccinale comprenant ledit matériel biologique ; - une cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules d'eucaryotes, telles que les cellules COS, CHO, Vero, BHK, PK 15, RK 13 ; lignées cellulaires humaines de l'ostéosarcorme, les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome, les lignées cellulaires d'insecte ; les cellules d'eucaryotes inférieurs, telles que les cellules de levure, en particulier les cellules issues de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces et Pichia, et de préférence choisi parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, Kluveromyces lactis et de Pichia pastoris ; les cellules de procaryotes, telles que celles issues de E. coli ; lesdites cellules étant transformées par au moins une séquence d'acide nucléique ou par au moins un fragment nucléotidique ou par une molécule d'ADN ou par un vecteur de l'invention; et - une composition pharmaceutique ou vaccinale comprenant une telle cellule.
Les compositions pharmaceutiques définies ci-dessus sont des compositions vaccinales à ADN particulièrement avantageuses, en particulier par rapport aux compositions vaccinales " classiques " à base de protéine recombinante.
En effet, l'utilisation à visée vaccinale de protéines recombinantes est un système lourd et onéreux, notamment parce qu'il exige de très importantes étapes de purification des antigènes recombinants. De plus, une des difficultés rencontrées est d'obtenir une persistance du vaccin suffisamment longue pour maintenir une bonne mémoire immunitaire. Au contraire, la méthode de vaccination par l'ADN, dont les avantages sont inhérents aux propriétés intrinsèques de l'ADN, est simple et peu
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coûteuse et est effectuée simplement par injection intramusculaire ou intradermique. De plus, il convient de noter que : - les vaccins à ADN sont non infectieux/non réplicatifs, - que du fait que l'immunisation par l'ADN est une forme de transfection in vivo, l'antigène viral est exprimé dans les cellules mammifères sous sa conformation native, - comme dans le cas d'une infection virale, une large réponse immune, à la fois humorale et cellulaire est induite, et que - de plus, les vaccins à ADN peuvent facilement être combinés en raison de leur homogénéité physico-chimique.
Enfin, l'invention a pour objet un procédé d'évaluation d'un agent thérapeutique selon lequel on administre à un animal des doses déterminées, en une dose ou en des doses répétées et à des intervalles de temps déterminés, au moins un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention, naturel, recombinant ou de synthèse, ou encore obtenu à partir d'un échantillon biologique éventuellement après un traitement préalable dudit échantillon biologique infecté par le virus HXHV, on prélève un échantillon biologique de l'animal, de préférence du sang ou du sérum et on réalise : - (i) un dosage d'anticorps spécifique(s) du polypeptide ou du fragment polypeptidique ; - (ii) un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre le polypeptide ou le fragment polypeptidique, par exemple par un test d'activation in vitro de cellules lymphocytes T " helper " spécifique(s) du polypeptide ou du fragment polypeptidique.
Figure :
La figure représente le séquençage partiel de la bande d'environ 1,3 Kb. Dans la figure, le positionnement
La figure représente le séquençage partiel de la bande d'environ 1,3 Kb. Dans la figure, le positionnement
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du fragment d'environ 200 paires de bases non séquence est représenté par les symboles (-).Dans la figure, les fragments nucléotidiques indiqués en gras correspondent à des fragments nucléotidiques présentant une homologie ou identité de séquence avec SEQ ID NO . 1 de 100%. Leur positionnement respectifs par rapport à SEQ ID NO . 1 sont les suivants : 253-233,254-273, 273-254.
Exemples
Exemple 1 : Extraction et extension
Les acides nucléiques ont été extraits à partir de 140 fil d'un échantillon de sérum d'un patient caractérisé comme étant HXHV positif par amplifications par PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit dans la demande de brevet PCT/FR02/04578, en utilisant le kit QIAamp Viral mini spin Kit (nom commercial) de la société Qiagen, en suivant le protocole préconisé par le fournisseur.
Exemple 1 : Extraction et extension
Les acides nucléiques ont été extraits à partir de 140 fil d'un échantillon de sérum d'un patient caractérisé comme étant HXHV positif par amplifications par PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit dans la demande de brevet PCT/FR02/04578, en utilisant le kit QIAamp Viral mini spin Kit (nom commercial) de la société Qiagen, en suivant le protocole préconisé par le fournisseur.
Une amorce biotinylée (Comp S6M13-biotin), dont la séquence est représentée ci-dessous, a ensuite été utilisée pour allonger la séquence SEQ ID NO . 1 d'intérêt. L'amorce biotinylée anti-sens utilisée correspond aux nucléotides 494-475 de SEQ ID NO . 1. amorce anti-sens Comp S6M13: 5'-GCACTGCCGAGTTACATGGC-3' (SEQ ID NO : )
Pour l'extension, le kit GENEAmp XL PCR Kit (nom commercial) de la société Roche a été utilisé en respectant le protocole préconisé par le fournisseur.
Pour l'extension, le kit GENEAmp XL PCR Kit (nom commercial) de la société Roche a été utilisé en respectant le protocole préconisé par le fournisseur.
La composition du mélange réactionnel de 50 /il est la suivante :
25 mM Mg(OAC)2 2,4 fil dNTPs 2,5 mM de chaque 4,0 fil amorce Comp S6M13 2,0 fil (20 pico moles)
3. 3X XL Buffer II 15,1 fil rTth ADN polymerase (2 u/ l) 0,5 l (1 u)
Matrice ADN 10 fil
Eau distillée 16 /il
25 mM Mg(OAC)2 2,4 fil dNTPs 2,5 mM de chaque 4,0 fil amorce Comp S6M13 2,0 fil (20 pico moles)
3. 3X XL Buffer II 15,1 fil rTth ADN polymerase (2 u/ l) 0,5 l (1 u)
Matrice ADN 10 fil
Eau distillée 16 /il
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L'extension a été réalisée selon le programme suivant :
Le mélange réactionnel a été chauffé à 92 C pendant 2 minutes et soumis ensuite à 35 cycles, chaque cycle comprenant un chauffage à 92 C pendant 30 secondes, un chauffage à 55 C pendant 30 secondes et un chauffage à 68 C pendant 3 minutes. L'extension finale a été réalisée par chauffage à 68 C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement à 4 C.
Le mélange réactionnel a été chauffé à 92 C pendant 2 minutes et soumis ensuite à 35 cycles, chaque cycle comprenant un chauffage à 92 C pendant 30 secondes, un chauffage à 55 C pendant 30 secondes et un chauffage à 68 C pendant 3 minutes. L'extension finale a été réalisée par chauffage à 68 C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement à 4 C.
Exemple 2 : Capture de l'ADN double brin étendu.
Le produit d'extension obtenu selon le protocole décrit dans l'exemple 1 a été isolé en utilisant le kit Dynabeads Kilobase BINDER (nom commercial) de la société Dynal, en suivant les instructions du fournisseur. Les billes (5 /il) ont premièrement été lavées deux fois dans le tampon Binding Buffer et resuspendues dans 20 l de ce tampon. Un aliquot de 20 /il du produit d'extension a été ajouté et incubé pendant 3 heures à température ambiante sur un rouleau pour conserver les billes en suspension. L'ADN double brin a été purifié par deux lavages avec un tampon de lavage et un lavage à l'eau distillée et les billes ont ensuite été resuspendues dans 20 fil d'esu distillée et conservée à 4 C.
Exemple 3 : Digestion et circularisation.
5 /il de l'ADN double brin, capturé selon l'exemple 2, ont été digérés par l' enzyme BsaWI (NEB), dont le site de clivage correspondait à la position 299 de SEQ ID NO . 1, par chauffage à 60 C pendant 2 heures. L'enzyme a ensuite été inactivée par chauffage à 80 C pendant 20 minutes. Après quoi, le tube a été refroidi lentement et l'ADN digéré a été purifié en utilisant le kit QIA quick PCR purification Kit (nom commercial) de la société Qiagen.
L'ADN purifié a ensuite été soumis a ligation à 4 C pendant une nuit en utilisant la ligase T4 commercialisée
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par la société Roche et la ligation a été achevée par chauffage à 65 C pendant 10 minutes.
Exemple 4 : Amplification.
10 /il du produit de ligation obtenu selon l'exemple 3 ont été utilisés comme matrice pour réaliser une PCR seminichée en utilisant le kit GeneAmp XL PCR Kit (nom commercial) de la société Roche. Les deux tours de PCR ont été réalisés de la même la façon, selon le protocole suivant :
Le mélange réactionnel a été chauffé à 94 C pendant 2 minutes et soumis ensuite à 35 cycles, chaque cycle comprenant un chauffage à 94 C pendant 30 secondes, un chauffage à 47 C pendant 30 secondes et un chauffage à 68 C pendant 3 minutes. Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à un chauffage à 68 C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement à 4 C.
Le mélange réactionnel a été chauffé à 94 C pendant 2 minutes et soumis ensuite à 35 cycles, chaque cycle comprenant un chauffage à 94 C pendant 30 secondes, un chauffage à 47 C pendant 30 secondes et un chauffage à 68 C pendant 3 minutes. Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à un chauffage à 68 C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement à 4 C.
Premier tour de PCR :
Composition du mélange réactionnel (50 l) :
25 mM Mg(OAC)2 2 , 4 l dNTPs 2,5 mM de chaque 4,0 l amorce 1M13 sens (25 M) 1, 0 l amorce CIRC 1 anti-sens (25 M) 1,0 /il
3. 3X XL Buffer II 15,1 l rTth ADN polymerase (2 u/ l) 0,5 l (1 u)
Matrice ADN 10 l
Eau 16 l
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés :
Amorce sens (1M13):
5'-CCCGCCCCGCTGATGAAAAG-3' (SEQ ID NO : 31)
Amorce anti-sens (CIRC 1)
5'-GCGATGGTTGAGTCTCGACTA-3' (SEQ ID NO: 32)
Deuxième tour de PCR :
Composition du mélange réactionnel (50 l) :
25 mM Mg(OAC)2 2 , 4 l
Composition du mélange réactionnel (50 l) :
25 mM Mg(OAC)2 2 , 4 l dNTPs 2,5 mM de chaque 4,0 l amorce 1M13 sens (25 M) 1, 0 l amorce CIRC 1 anti-sens (25 M) 1,0 /il
3. 3X XL Buffer II 15,1 l rTth ADN polymerase (2 u/ l) 0,5 l (1 u)
Matrice ADN 10 l
Eau 16 l
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés :
Amorce sens (1M13):
5'-CCCGCCCCGCTGATGAAAAG-3' (SEQ ID NO : 31)
Amorce anti-sens (CIRC 1)
5'-GCGATGGTTGAGTCTCGACTA-3' (SEQ ID NO: 32)
Deuxième tour de PCR :
Composition du mélange réactionnel (50 l) :
25 mM Mg(OAC)2 2 , 4 l
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dNTPs 2,5 mM de chaque 4,0 l amorce 1M13 sens (25M) 1, 0 l amorce 6BRACE5' anti-sens (25 M) 1,0 l
3. 3X XL Buffer II 15,1 l rTth ADN polymerase (2 u/ l 0,5 l (1 u)
Produit du 1er tour 10 l
Eau 16 l
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés :
Amorce sens (1M13):
5'-CCCGCCCCGCTGATGAAAAG-3' (SEQ ID NO : 31)
Amorce antisens (6BRACE5'):
5'-AGGTAGCAGGCGATATC-3' (SEQ ID NO: 33)
Les localisations des amorces dans la séquence XH (SEQ ID NO . 1) sont respectivement les suivantes : 1M13 : 254-273
CIR 1 : 253-233
6BRACE5' 94-77
Exemple 5 : Electrophorèse sur gel d'agarose et hybridation.
3. 3X XL Buffer II 15,1 l rTth ADN polymerase (2 u/ l 0,5 l (1 u)
Produit du 1er tour 10 l
Eau 16 l
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés :
Amorce sens (1M13):
5'-CCCGCCCCGCTGATGAAAAG-3' (SEQ ID NO : 31)
Amorce antisens (6BRACE5'):
5'-AGGTAGCAGGCGATATC-3' (SEQ ID NO: 33)
Les localisations des amorces dans la séquence XH (SEQ ID NO . 1) sont respectivement les suivantes : 1M13 : 254-273
CIR 1 : 253-233
6BRACE5' 94-77
Exemple 5 : Electrophorèse sur gel d'agarose et hybridation.
Les produits d'amplification obtenus selon l'exemple 4 ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5%. Trois bandes dont les tailles étaient comprises entre 1,2 Kb et 2,5 Kb ont été observées sur le gel.
Les produits amplifiés ont été transférés sur une membrane de nylon Hybond-N+ (nom commercial) (Amersham Biosciences UK limited). La membrane a été hybridée à 42 C pendant une nuit avec le fragment XH complet marqué à son extrémité 3' au 32P (généré en utilisant le kit Ready to Go DNA Labelling beads (nom commercial) de la société Amersham Pharmacia Biotech Inc.). Les lavages suivants ont été réalisés à 65 C . 2X SSC, 15 minutes, deux fois ; 1X SSC, 15 minutes, deux fois ; 0,5X SSC, 15 minutes, deux fois. La membrane a été soumise à autoradiographie à -80 C
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pendant une nuit. Les trois bandes présentaient des signaux faibles sur le film-X après développement.
Exemple 6 : Clonage et séquençage.
Les trois bandes ont respectivement été clonées dans le vecteur pCR2.1-TOPO (Invitrogen).Les clones ont ensuite été criblés par hybridation sur colonies et identifiés en utilisant l'enzymze EcoRI (Gibco BRL). Les clones positifs ont été sélectionnés pour être séquences.
Les résultats du séquençage ont mis en évidence un fragment de 1133 paires de bases. La recherche effectuée dans les banques des bases de données n'a montré aucune homologie de séquences significative. Le fragment de 1133 paires de bases est référencé dans l'identificateur de séquences en SEQ ID NOs : 2 et 3. Il est également représenté à la figure.
Exemple 7 : Répétition
En utilisant le même produit de digestion et de circularisation décrit dans l'exemple 3, une nouvelle amplification a été réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 4, suivi d'une électrophorèse sur gel d'agarose et de la procédure d'hybridation décrites dans l'exemple 5. Dans cet essai, une seule bande dont la taille était d'environ 1,3 Kb a été observée sur le gel.
En utilisant le même produit de digestion et de circularisation décrit dans l'exemple 3, une nouvelle amplification a été réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 4, suivi d'une électrophorèse sur gel d'agarose et de la procédure d'hybridation décrites dans l'exemple 5. Dans cet essai, une seule bande dont la taille était d'environ 1,3 Kb a été observée sur le gel.
Après clonage et séquençage, comme décrit dans l'exemple 6, un fragment de 1133 paires de bases correspondant au fragment décrit dans l'exemple 6 (SEQ ID NOs : 2,3 et figure) a été obtenu.
La pertinence de ce fragment de 1133 paires de bases par rapport au virus HXHV a été vérifiée comme décrit cidessous.
Dû aux limitations inhérentes au séquençage utilisé, la séquence de la bande d'environ 1,3 Kb visualisée sur gel s'est révélée être incomplète. En effet, un fragment d'environ 1300 paires de bases était attendu. Aussi, les
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présents inventeurs ont alors réalisé, avec une nouvelle procédure, un séquençage complet de la bande d'environ 1,3 Kb, comme décrit ci-dessous. La partie non séquencée dans le séquençage initial qui correspond à un fragment d'environ 200 paires de bases est représenté, pour sa localisation, dans la figure par les symboles (-). Le premier fragment séquence est représenté en SEQ ID NO : 2 et le deuxième fragment séquence est représenté en SEQ ID NO : 3 dans l'identificateur de séquences.
Exemple 8 : Pertinence du fragment de 1133 paires de bases.
Pour vérifier la pertinence du fragment de 1133 paires de bases par rapport au virus HXHV, des PCR nichées ont été réalisées en parallèle.
# A partir de fractions obtenues sur gradient de sucrose de 17 sérums, dont 10 étaient positifs pour l'ORF4 du virus HXHV décrite dans la demande de brevet PCT/FR02/04578 et 7 étaient négatifs pour cette même ORF4, les acides nucléiques ont été extraits et des PCR nichées ont été effectuées selon le protocole suivant en utilisant la Taq ADN polymérase de la société Promega :
Le mélange réactionnel a été chauffé à 94 C pendant 5 minutes et soumis ensuite à 35 cycles, chaque cycle comprenant un chauffage à 94 C pendant 45 secondes, un chauffage à 43 C pendant 45 secondes et un chauffage à 72 C pendant 1 minute. Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à un chauffage à 72 C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement à 4 C.
Le mélange réactionnel a été chauffé à 94 C pendant 5 minutes et soumis ensuite à 35 cycles, chaque cycle comprenant un chauffage à 94 C pendant 45 secondes, un chauffage à 43 C pendant 45 secondes et un chauffage à 72 C pendant 1 minute. Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à un chauffage à 72 C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement à 4 C.
Premier tour de PCR :
Composition du mélange réactionnel (50 /il)
Tampon Taq avec MgCl2 10X 5,0 /il dNTPs 10 mM de chaque 2,0 /il amorce XF4 sens (25M) 1, 0 /il amorce XB12 anti-sens (25 M) 1, 0 /il
Composition du mélange réactionnel (50 /il)
Tampon Taq avec MgCl2 10X 5,0 /il dNTPs 10 mM de chaque 2,0 /il amorce XF4 sens (25M) 1, 0 /il amorce XB12 anti-sens (25 M) 1, 0 /il
<Desc/Clms Page number 28>
Taq ADN polymerase (5 u/ l) 0,5 /il
Matrice ADN 10 /il
Eau 30,5 /il
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés :
Amorce sens (XF4):
5' CCTTCTGGAGAGGGATTTC 3' (SEQ ID NO : 34)
Amorce anti-sens (XB12)
5' TGTTACCTGCTACTTCGTGC 3' (SEQ ID NO: 35)
Deuxième tour de PCR :
Composition du mélange réactionnel (50 /il)
Tampon Taq avec MgCl2 10X 5,0 /il dNTPs 10 mM de chaque 2,0 /il amorce XF1 sens (25M) 1, 0 /il amorce XB1 anti-sens (25 M) 1,0 /il
Taq ADN polymerase (5 u/ l) 0,5 /il
Produit du 1er tour 10 /il
Eau 35,5 /il
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés :
Amorce sens (XF1):
5' TAGAGTTGCGAGGCGTGACC 3' (SEQ ID NO : 36)
Amorce antisens (XB1):
5' CCTTATCCAGTGGCTTTTGGC 3' (SEQ ID NO: 37)
Les localisations des amorces dans la séquence SEQ ID 0 : 4 sont respectivement les suivantes :
XF4 : 482-500
XB12 : 1255-1236
XF1 : 944-963
XB1: 1186-1166
Les produits d'amplification obtenus selon l'exemple ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose
Matrice ADN 10 /il
Eau 30,5 /il
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés :
Amorce sens (XF4):
5' CCTTCTGGAGAGGGATTTC 3' (SEQ ID NO : 34)
Amorce anti-sens (XB12)
5' TGTTACCTGCTACTTCGTGC 3' (SEQ ID NO: 35)
Deuxième tour de PCR :
Composition du mélange réactionnel (50 /il)
Tampon Taq avec MgCl2 10X 5,0 /il dNTPs 10 mM de chaque 2,0 /il amorce XF1 sens (25M) 1, 0 /il amorce XB1 anti-sens (25 M) 1,0 /il
Taq ADN polymerase (5 u/ l) 0,5 /il
Produit du 1er tour 10 /il
Eau 35,5 /il
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés :
Amorce sens (XF1):
5' TAGAGTTGCGAGGCGTGACC 3' (SEQ ID NO : 36)
Amorce antisens (XB1):
5' CCTTATCCAGTGGCTTTTGGC 3' (SEQ ID NO: 37)
Les localisations des amorces dans la séquence SEQ ID 0 : 4 sont respectivement les suivantes :
XF4 : 482-500
XB12 : 1255-1236
XF1 : 944-963
XB1: 1186-1166
Les produits d'amplification obtenus selon l'exemple ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose
<Desc/Clms Page number 29>
1,5%. Les produits amplifiés ont été transférés sur une membrane de nylon Hybond-N+ (nom commercial) (Amersham Biosciences UK limited). La membrane a été hybridée à 42 C pendant une nuit avec le produit du 2ème tour de PCR marqué à son extrémité 3' au 32p. Le produit du tour 2 a été purifié avec le kit Qiaqick Gel Extraction Kit (nom commercial) et marqué en utilisant le kit Ready to Go DNA Labelling beads (nom commercial) de la société Amersham Pharmacia Biotech Inc.) Les lavages suivants ont été réalisés à 65 C . 2X SSC, 15 minutes, deux fois ; 1X SSC, 15 minutes, deux fois ; 0,5X SSC, 15 minutes, deux fois.
La membrane a été soumise à autoradiographie à -80 C pendant une nuit.
La bande de taille attendue d'environ 240 paires de bases est retrouvée dans les acides nucléiques amplifiés de 3 fractions sur les 10 qui étaient positives pour l'ORF4 du virus HXHV. Aucune bande n'a été révélée pour les 7 fractions qui étaient négatives pour l'ORF4 du virus HXHV.
# Les acides nucléiques extraits de 15 sérums de patients Non A-E, dont 9 étaient positifs pour l'ORF4 de HXHV et 6 étaient négatifs pour cette même ORF ont été amplifiés par PCR nichée avec le même protocole que celui décrit ci-dessus. Les produits amplifiés obtenus ont ensuite été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose, les membranes ont été hybridées et les bandes ont été révélées par autoradiographie selon le même protocole que celui décrit ci-dessus.
La bande de taille attendue d'environ 240 paires de bases est retrouvée dans les acides nucléiques amplifiés de 3 sérums sur les 9 qui étaient positifs pour l'ORF4 du virus HXHV. Aucune bande n'a été révélée pour les 6 sérums qui étaient négatifs pour l'ORF4 du virus HXHV.
Les résultats obtenus à partir de fractions de sérums et de sérums confirment donc que la séquence de 1133 paires de bases est associée au virus HXHV.
<Desc/Clms Page number 30>
Exemple 9 : Séquençage complet de la bande d'environ 1, 3 Kb.
Les produits PCR ont été purifiés par digestion enzymatique (Enzyme Exosup- nom commercial) . La quantification des acides nucléiques a été réalisée par dosage fluorométrique. La réaction de séquençage a été réalisée grâce à une réaction enzymatique en présence d'une amorce spécifique de la région à séquencer. Les produits ont ensuite été injectés dans le séquenceur Apply Biosystem 3730 XL (nom commercial). La séquence ADN obtenue est une séquence de 1314 paires de bases représentée en SEQ ID NO : 4.
Claims (58)
1. Séquence d'acide nucléique isolée susceptible d'être obtenue à partir du génome du virus HXHV, ladite séquence d'acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO : 4 ou la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4.
2. Séquence d'acide nucléique isolée susceptible d'être obtenue à partir du génome du virus HXHV, ladite séquence d'acide nucléique consistant en la séquence SEQ ID NO : 4 ou en la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4.
3. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique d'au moins 12 nucléotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 4 ou à son complémentaire.
4. Fragment selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence d'au moins 15 nucléotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 4 ou à son complémentaire.
5. Fragment selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence d'au moins 18 nucléotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 4 ou à son complémentaire.
6. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence d'au moins 20 ou 21 nucléotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 4 ou à son complémentaire.
7. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique qui sur au moins 12 nucléotides contigus présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité et avantageusement au moins 98% d'identité avec la SEQ ID NO : 4 ou avec la séquence complémentaire de SEQ ID NO . 4, à l'exclusion des séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC et CCCGCCCCGCTGATGAAAAG et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences.
8. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique qui sur au moins 15 nucléotides contigus présente au moins 90%
<Desc/Clms Page number 32>
d'identité, de préférence au moins 95% d'identité et avantageusement au moins 98% d'identité avec la SEQ ID NO : 4 ou avec la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, à l'exclusion des séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC et CCCGCCCCGCTGATGAAAAG, et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences.
9. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique qui sur au moins 18 nucléotides contigus présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité et avantageusement au moins 98% d'identité avec la SEQ ID NO : 4 ou avec la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, à l'exclusion des séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC et CCCGCCCCGCTGATGAAAAG, et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences.
10. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique qui sur au moins 20 ou 21 nucléotides contigus présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité et avantageusement au moins 98% d'identité avec la SEQ ID NO : 4 ou avec la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, à l'exclusion des séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC et CCCGCCCCGCTGATGAAAAG, et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences.
11. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 2 et se terminant au nucléotide 286 de SEQ ID NO . 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
12. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 4 et se terminant au nucléotide 144 de SEQ ID NO . 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
13. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 180 et se
<Desc/Clms Page number 33>
terminant au nucléotide 1004 de SEQ ID NO . 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
14. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 614 et se terminant au nucléotide 820 de SEQ ID NO . 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
15. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 1228 et se terminant au nucléotide 1314 de SEQ ID NO . 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
16. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 1283 et se terminant au nucléotide 1197 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
17. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 1264 et se terminant au nucléotide 1067 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
18. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 1209 et se terminant au nucléotide 1099 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
19. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 819 et se terminant au nucléotide 736 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
20. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 800 et se terminant au nucléotide 6 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
<Desc/Clms Page number 34>
21. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 784 et se terminant au nucléotide 629 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
22. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 610 et se terminant au nucléotide 410 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
23. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 391 et se terminant au nucléotide 221 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
24. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NOs 5 à 17 ou l'une quelconque des séquences complémentaires des séquences SEQ ID Nos 5 à 17.
25. Produit de transcription d'une séquence telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 et 2 ou d'un fragment tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24.
26. Molécule d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en une séquence telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 et 2 ou un fragment tel que défini à l'une quelconque des revendications 3 à 24.
27. Molécule d'ARN, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en un produit de transcription d'une molécule d'ADN telle que définie à la revendication 26.
28. Polypeptide dont la séquence polypeptidique est codée par une séquence telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 et 2 ou par un fragment tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24.
29. Polypeptide selon la revendication 28, dont la séquence polypeptidique comprend ou consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 18 à 30 ou en une
<Desc/Clms Page number 35>
séquence polypeptidique équivalente à l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 18 à 30 dans laquelle (i) les acides aminés alanine, proline, glycine sont des équivalents, (ii) les acides aminés acide aspartique, acide glutamique sont des équivalents, (iii) les acides aminés histidine, lysine, arginine sont des équivalents, (iv) les acides aminés asparagine, glutamine, sérine, thréonine sont des équivalents, (v) les acides aminés phénylalanine, tyrosine, tryptophane sont des équivalents et (vi) les acides aminés isoleucine, leucine, valine, méthionine sont des équivalents.
30. Fragment peptidique selon la revendication 28, comprenant ou consistant en une séquence peptidique d'au moins 4,5, 6 ou 7 acides aminés et au plus de 15 acides aminés appartenant à l'une quelconque des séquences SEQ ID NOs : 18 à 30 ou à une séquence équivalente à l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 18 à 30 dans laquelle (i) les acides aminés alanine, proline, glycine sont des équivalents, (ii) les acides,aminés acide aspartique, acide glutamique sont des équivalents, (iii) les acides aminés histidine, lysine, arginine sont des équivalents, (iv) les acides aminés asparagine, glutamine, sérine, thréonine sont des équivalents, (v) les acides aminés phénylalanine, tyrosine, tryptophane sont des équivalents et (vi) les acides aminés isoleucine, leucine, valine, méthionine sont des équivalents.
31. Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, ou d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 24, ou d'une molécule d'ADN selon la revendications 26, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression.
32. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon la revendication 31.
33. Cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassette d'expression selon la revendication 31 ou un vecteur d'expression selon la revendication 32.
34. Cellule selon la revendication 33, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un organisme eucaryote, en particulier les
<Desc/Clms Page number 36>
cellules provenant d'animaux tels que les mammifères, les reptiles, les insectes, de préférence les cellules choisies parmi les cellules COS, CHO, Vero, BHK, PK 15, RK 13 ; les lignées cellulaires humaines de l'ostéosarcorme, les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome ; lignées cellulaires d'insecte.
35. Cellule selon la revendication 33, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un organisme eucaryote inférieur, en particulier issue de levures, telles que Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces et Pichia, et de préférence choisi parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, Kluveromyces lactis et de Pichia pastoris.
36. Cellule selon la revendication 33, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un organisme procaryote de préférence E. coli.
37. Polypeptide susceptible d'être produit par une cassette d'expression selon la revendication 31, un vecteur selon la revendication 32, ou une cellule selon l'une quelconque des revendications 33 à 36.
38. Procédé pour préparer un polypeptide selon la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique selon la revendication 30, selon lequel on cultive une cellule hôte telle que définie à l'une quelconque des revendications 33 à 36 dans un milieu de culture approprié, et on purifie ledit polypeptide ou ledit fragment peptidique produit jusqu'à un degré de pureté requis.
39. Polypeptide immunogène comprenant ou consistant en un polypeptide tel que défini à la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique tel que défini à la revendication 30.
40. Anticorps monoclonal ou polyclonal susceptible d'être obtenu par immunisation d'un animal mammifère avec un polypeptide immunogène tel que défini dans la revendication 39.
41. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide tel que défini à la revendication 28
<Desc/Clms Page number 37>
ou 29 ou un fragment polypeptidique tel que défini à la revendication 30.
42. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal tel que défini dans la revendication 40.
43. Procédé pour détecter des anticorps dirigés contre le virus HXHV ou au moins un polypeptide tel que défini à la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique tel que défini dans la revendications 30, selon lequel on met en contact un échantillon biologique d'un patient suspecté être infecté par le virus HXHV avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 41, dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.
44. Procédé pour détecter un polypeptide tel que défini à la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique tel que défini à la revendication 30, dans un échantillon biologique d'un patient suspecté être infecté par le virus HXHV, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 42, dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.
45. Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide tel que défini à la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique tel que défini dans la revendication 30, associé à un véhicule et/ou adjuvant et/ou diluant approprié et/ou à un excipient pharmaceutiquement acceptable.
46. Sonde d'au moins 12 nucléotides, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider à une séquence d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 1 ou 2, ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24, ou à une molécule d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 26 ou 27, l'hybridation étant réalisée dans des conditions de stringence déterminées.
<Desc/Clms Page number 38>
47. Amorce d'au moins 12 nucléotides, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider à une séquence d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 1 ou 2, ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24, ou à une molécule d'ADN ou d'ARN telle que définie dans la revendication 26 ou 27 l'hybridation étant réalisée dans des conditions de stringence déterminées.
48. Amorce selon la revendication 47, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les amorces SEQ ID Nos 32 à 37.
49. Couple d'amorces selon la revendication 47, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un des couples suivants : SEQ ID NO : 31 SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 31 SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34/ SEQ ID NO : 35, , SEQ ID NO : 36/ SEQ ID NO : 37.
50. Anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 1 ou 2, ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24, ou à une molécule d'ADN ou d'ARN telle que définie dans la revendication 26 ou 27.
51. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde ou au moins une amorce ou au moins un couple d'amorces ou un anticorps anti-acide nucléique tel(le) que défini(e) dans les revendications 46,47, 48,49 ou 50.
52. Procédé de détection d'un ADN ou d'un ARN viral, dans un échantillon biologique d'un patient suspecté être infecté par le virus HXHV, selon lequel on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN ou l'ARN, on met en contact ledit ADN ou ARN avec au moins une sonde ou avec au moins une amorce ou avec au moins un couple d'amorces tel(le) que défini(e) dans les revendications 46,47, 48 ou 49, dans des conditions de stringence déterminées, et on détecte la présence d'ADN ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN ou ARN viral avec au moins une sonde telle que définie dans la revendication 46, soit par amplification dudit ADN ou ARN à l'aide d'au moins une amorce telle que définie dans la revendication 47 ou 48 ou
<Desc/Clms Page number 39>
d'au moins un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 49.
53. Procédé de détection d'ADN et/ou d'ARN viral du virus HXHV, selon lequel on prélève un échantillon biologique, tel que du sérum, plasma ou sang d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps anti-acide nucléique tel que défini dans la revendication 50, ledit anticorps étant éventuellement marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps.
54. Composition vaccinale comprenant une séquence d'ADN codant pour au moins un polypeptide tel que défini dans la revendication 28 ou 29 ou codant pour au moins un fragment peptidique tel que défini dans la revendication 30, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule et/ou un diluant et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
55. Vecteur comprenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, ledit gène codant notamment au moins pour un polypeptide ou un fragment peptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 28, 29 et 30.
56. Composition thérapeutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur tel que défini dans la revendication 55 et en ce que ledit gène d'intérêt est placé sous la dépendance d'éléments assurant son expression in vivo.
57. Cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules d'eucaryotes, telles que les cellules COS, CHO, Vero, BHK, PK 15, RK 13 ; les lignées cellulaires humaines de l'ostéosarcorme, les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome, les lignées cellulaires d'insecte ; les cellules d'eucaryotes inférieurs, telles que les cellules de levure, en particulier les cellules issues de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces et Pichia, et de préférence choisi parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, Kluveromyces Iactis et de Pichia pastoris ; les cellules de procaryotes, telles
<Desc/Clms Page number 40>
que celles issues de E. coli ; lesdites cellules étant transformées par au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 ou par au moins un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 24 ou par une molécule d'ADN selon la revendication 26 ou par un vecteur selon la revendication 55.
58. Composition pharmaceutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule telle que définie dans la revendication 57.
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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