JP2004129673A - 新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子rnaに対応するdna並びにネコ免疫不全ウイルスワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 塩基配列が公知のものと異なっているネコ免疫不全ウイルス(feline immunodeficiency virus、FIV)静岡株とそれらより作製されたワクチン、またそれらの外被膜(envelope membrane、env)遺伝子RNAに対応するDNA、それらのDNAの遺伝子組み換えにより作製された発現ベクター、それらベクターを含む菌あるいは動物の細胞等を培養することにより得られる外被膜蛋白質、それらを用いて作製された遺伝子組み換え型ワクチンが、ネコ免疫不全ウイルスに対する新規なワクチンとして有効である。
【選択図】 なし
Description
2mM、NP40 0.45%、ツイーン20 0.45%、プロテネースK 60μg/ml)に分散して、インキュベートし、フェノール抽出、クロロフォルム抽出後、エタノールを加えて染色体DNAを沈澱させ、少量の水を加えてPCR用のDNA溶液とする。インキュベートは56℃で1時間が好ましい。
AプライマーのDNA5’末端側にはいずれも適当な制限酵素の切断認識配列を含ませてPCRの後で塩基配列決定用のベクターに容易に結合できるようにするのがよい。増幅された遺伝子断片は1%の低融点アガロース電気泳動により精製することができる。
A:アラニン
C:システイン
D:アスパラギン酸
E:グルタミン酸
F:フエニルアラニン
G:グリシン
H:ヒスチジン
I:イソロイシン
K:リジン
L:ロイシン
M:メチオニン
N:アスパラギン
P:プロリン
Q:グルタミン
R:アルギニン
S:セリン
T:スレオニン
V:バリン
W:トリプトフアン
Y:チロシン
(1)外被膜遺伝子の増幅
ネコ免疫不全ウイルスの感染を受けたネコから採取された血液中のTリンパ球を遠心分離で沈澱させて、細胞溶解用緩衝液(トリス塩酸(pH8.3)10mM、NaCl 150mM、KCl 50mM、MgCl2
2mM、NP40 0.45%、ツイーン20 0.45%、プロテネースK 60μg/ml)に分散して、56℃で1時間インキュベートし、フェノール抽出、クロロフォルム抽出後、エタノールを加えて染色体DNAを沈澱させ、水50μlを加えてPCR用のDNA溶液とした。
(1)GGGGAATTCAGCGTTTTGTTTCTCCT (+鎖)
GGGCAGCTGGTGCCCAACAATCCCA (−鎖)
(2)GGGGGATCCAATGCAGGTAAGTTTAGAAG
(+鎖)
GGGAAGCTTGCAAGACCAATTTCCAGCA
(−鎖)
(3)GGGAGATCTTATTGTACATTT (+鎖)
GGGAAGCTTCATCATTCCTCCTCT (−鎖)
上記と同様の方法を用いて、ネコ免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子を増幅し、精製した。
上記(1)のようにして例えば、(2)のプライマーのペアを使用して増幅されたネコ免疫不全ウイルスの遺伝子DNA断片の塩基配列を決定する方法は次の通りである。0.5μgの遺伝子断片を制限酵素のBamHI(GGATCC)およびHindIII(AAGCTT)で末端を切断しておき、同じ制限酵素で切断されたM13ファージ2本鎖DNA0.2μgにT4DNAライゲース(宝酒造社製キット)で14℃で2時間以上反応させて結合させ、カルシウムで処理した大腸菌JM109株にDNAを感染させて、37℃で一晩培養して外被膜遺伝子DNA断片を1本鎖DNAとして含むファージプラックを得た。
上記と同様の方法に従ってネコ免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子の塩基配列が図1および図2に示すように決定された。
静岡株ウイルスを持続的に増殖する感染細胞をPBS(0.1Mリン酸緩衝生理食塩水)で5×107 細胞/mlとし、これに2.5%パラフォルムアルデヒドを等量加えて、4℃で24時間振とうさせて、含まれているウイルスを固定不活化した。
実施例2
ネコ免疫不全ウイルス静岡株、TM2株およびペタルマ株単味のワクチンを個々に実施例1と同様にして作製した。これらを等量づつ混合して3価の多価ワクチンを調製した。また、別に3倍の濃度の単味ワクチンを作製して、これらを等量混合することで各株について単味の場合と同じ力価のワクチンを作製した。
実施例3
外被膜遺伝子の全部またはウイルスの感染に重要な働きを持つ領域を部分的に含む組み替え遺伝子発現用のベクターは既に公知となっている手法たとえばバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、酵母等を用いて容易に作製し得る。
−鎖:CTCGGATCCTATCGCTTTTCACTAGGTTTGT
(1817〜1836)
では核内から多角体が消失するので組み換え体ウイルスは容易に区別される。この組み換え体ウイルスを鈍化してBm−N4細胞に感染させ外被膜蛋白質を得た。このものを用いて実施例1(3)記載の方法に従いコンポーネントワクチンを作製した。
試験例
Claims (5)
- ネコ免疫不全ウイルスの外被膜遺伝子を含むDNAであり、請求項2に記載された蛋白質の一部を発現し得るように構築されたことを特徴とする発現用プラスミド、ファージあるいはウイルスのベクターDNA構造物。
- ネコ免疫不全ウイルス外被膜蛋白質の一部であり、請求項3の発現用ベクターDNAを含む菌あるいは動物の細胞の培養によって生産されたことを特徴とする蛋白質。
- 生産された蛋白質が前記請求項2記載の蛋白質であることを特徴とする請求項4記載の蛋白質。
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