JP4676063B2 - 弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62とこの遺伝子62を用いる弱毒生水痘ワクチン用ウイルス株の同定方法 - Google Patents
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Description
この出願は、弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62と、この遺伝子62を用いる弱毒生水痘ワクチン用ウイルス株(以下、「弱毒水痘ウイルス株」と記載する)の同定方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願は、弱毒水痘生ワクチンの有効成分として使用されている弱毒水痘ウイルス岡株およびその有効成分として許容し得る弱毒水痘ウイルス株を、その野生型水痘ウイルス岡株(以下、「強毒親株」または「親株」と記載する)や他の野生型水痘ウイルス株と区別することのできる遺伝子62と、この遺伝子62の塩基配列等に基づく弱毒水痘ウイルスの同定方法等に関するものである。
背景技術
水痘・帯状疱疹ウイルス(Varicella−Zoster virus:VZV。以下「水痘ウイルス」または「VZV」と記載する)は、ヒト水痘および帯状疱疹の原因ウイルスであり、その弱毒株である「弱毒水痘ウイルス岡株」(特公昭53−41202号公報;Lancet 2:1288−1290,1974)に由来のウイルスを唯一のシードとして生ワクチンが製造され、世界各国で広く使用されている[Requirements for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984:WHO Technical Report Series,No.725,pp.102−124,1985]。
この弱毒生水痘ワクチンの安全性および有効性は、現在のところ、製造承認された水痘シードウイルスの継代数の制限(シードロットシステム)によって確保されている。すなわち、シードウイルスを連続継代することによって弱毒ウイルスが遺伝的に変化して病原性を回復することの危険性を回避するため、シード承認時の継代数を0代とし、そこから総継代数10代以内のウイルスをワクチンとして用いることが義務づけられている。換言すれば、弱毒生水痘ワクチンの品質管理および品質保証は、各ワクチン製造者によるシードロットシステムの遵守に依存している。
なお、健常児ではこの弱毒生水痘ワクチンの接種によって臨床反応を呈することはないが、被接種者が免疫機能に障害のある者の場合には、希に水痘や帯状疱疹を発症することがある。しかしながら、そのような臨床反応が、ワクチン接種によるものか、あるいは野生型水痘ウイルスの自然感染によるものかは特定不能であった。従って、弱毒生水痘ワクチンのシードウイルスである弱毒水痘ウイルス岡株と他の野生型VZVとの相違を分析することが疫学的に重要となり、そのための方法が幾つか提案されてきた。すなわち、VZVゲノム遺伝子の構造が報告(Joumal of General Virology,67:1759−1816,1986)されて以来、例えば、VZV株間のDNA塩基配列の違い(Joumal of Virology,59:660−668,1986)、制限酵素PstIサイトの有無(Japanese Joumal of Experimental Medicine,59:233−237,1989)、PCR(Polimerase chain reaction)を用いるRFLP(restriction fragment length polymorphism)に基づく判定(Joumal of Virology,66:1016−1020,1992)、上記PstIサイトの有無とPCR産物のRFLPとの組み合わせ(Joumal of Clinical Microbiology,33:658−660,1995)等に基づく方法が報告されてきた。しかしながら、これらの方法はいずれも各々単独では信頼性が低いため、弱毒水痘ウイルス岡株と他の野生株とを正確に区別することは困難であった。
これに対して、この出願の出願人は、弱毒水痘ウイルス岡株と他の水痘ウイルス株(例えば、公知の野生株および自然感染の水痘患者から分離した新鮮野生株等)について広範な遺伝子解析を行い、両者を区別しうる8つの要件を特定するとともに、未知の水痘ウイルスがこれら8要件の全てを満たす場合にのみ、それが生水痘ワクチン用の弱毒水痘ウイルス岡株として許容しうることを見出し、既に特許出願している(WO97/43420号公報。以下、先願発明と記載する)。
この出願人らによる先願発明の方法は、弱毒水痘ウイルス岡株と他の水痘ウイルス株とを区別することは可能であるが、弱毒水痘ウイルス岡株とその親株とを区別することは不可能であった。また8つの指標について全てを検査しなければならないため、判定までに多くの時間と手間を要するという問題も存在した。
この出願の発明者らは、弱毒水痘ウイルス岡株とその親株とを区別しうる方法について鋭意研究を重ねた結果、水痘ウイルスの遺伝子62の変異を検出することによって、弱毒水痘ウイルス岡株と、その親株並びに他の野生型水痘ウイルス株とを簡便かつ確実に区別しうろことを見出した。
この出願の発明は、このような新規な知見に基づいてなされたものであり、弱毒水痘ウイルス岡株に特徴的な遺伝子62を提供することを課題としている。
またこの発明は、上記遺伝子62がコードするタンパク質とそのペプチド、これらを抗原として用いることにより得られる抗体および細胞傷害性Tリンパ球(CTL:cytotoxic T lymphocyte)、並びに上記の遺伝子62を有する弱毒水痘ウイルス株を提供することを課題としている。
さらにこの発明は、遺伝子62の変異の有無を指標とする弱毒水痘ウイルス株の同定方法、この方法によって同定された弱毒ウイルス株をシードウイルスとする弱毒生水痘ワクチンを提供することを課題としている。
発明の開示
この出願は、上記の課題を解決する発明として、以下の各発明を提供する。
(1)配列番号1の塩基配列において、少なくとも以下の(a)〜(d)の塩基置換:
(a)2110番塩基AがG;
(b)3100番塩基AがG;
(c)3818番塩基TがC; および
(d)4006番塩基AがG
を有する弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62。
(2)(a)〜(d)の塩基置換に加え、以下の(e)〜(g)の少なくとも1以上の塩基置換:
(e)1251番塩基AがG;
(f)2226番塩基AがG; および
(g)3657番塩基AがG
を有する前記(1)の弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62。
(3)(a)〜(d)の塩基置換、および(e)〜(g)の少なくとも1以上の塩基置換に加え、以下の(h)〜(o)の少なくとも1以上の塩基置換:
(h)162番塩基TがC;
(i)225番塩基TがC;
(j)523番塩基TがC;
(k)1565番塩基TがC;
(l)1763番塩基TがC;
(m)2652番塩基TがC;
(n)4052番塩基TがC; および
(o)4193番塩基TがC
を有する前記(2)の弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62。
(4)前記(1)から(3)のいずれかの遺伝子62をコードするDNAの断片であって、塩基置換部分を含む10塩基対以上の配列からなるDNA断片。
(5)前記(1)の弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62がコードするタンパク質であって、配列番号1のアミノ酸配列において、少なくとも以下の(A)〜(D)のアミノ酸置換:
(A)628番アミノ酸残基SerがGly;
(B)958番アミノ酸残基ArgがGly;
(C)1197番アミノ酸残基ValがAla; および
(D)1260番アミノ酸残基IleがVal
を有するタンパク質。
(6)(A)〜(D)のアミノ酸置換に加え、以下の(E)〜(H)の少なくとも1以上のアミノ酸置換:
(E)99番アミノ酸残基MetがThr;
(F)446番アミノ酸残基LeuがPro;
(G)512番アミノ酸残基ValがAla; および
(H)1275番アミノ酸残基LeuがSer
を有する前記(5)のタンパク質。
(7)前記(5)または(6)のタンパク質の一部であり、そのアミノ酸置換部分を含む5アミノ酸残基以上の配列からなるペプチド。
(8)前記(5)または(6)のタンパク質、もしくは前記(7)のペプチドを抗原として用いることにより得られた抗体またはCTL。
(9)ウイルスゲノムの遺伝子62が前記(1)から(3)のいずれかの遺伝子62である弱毒水痘ウイルス株。
(10)前記(1)から(3)のいずれかの遺伝子62の塩基置換と同一の塩基置換を有する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
(11)前記(4)のDNA断片がハイブリダイズするゲノムDNAを保有する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
(12)前記(8)の抗体またはCTLによって認識される抗原を産生する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
(13)配列番号1の塩基配列における少なくとも2107番塩基から2229番塩基までのDNA配列を制限酵素NaeIおよびBssHIIで切断し、このDNA配列が2または3断片化される水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
(14)DNA配列が、配列番号2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとし、水痘ウイルスの遺伝子62を鋳型とするPCR法によって調製されたDNA配列である前記(13)の同定方法。
(15)前記(10)から(14)のいずれかの方法によって同定された弱毒水痘ウイルス株。
(16)前記(9)または(15)の弱毒水痘ウイルス株をシードウイルスとする弱毒生水痘ワクチン。
発明を実施するための最良の形態
水痘ウイルスの遺伝子62は、トランスアクチベーション機能(転写をトランスに活性化する機能)を司る遺伝子であって、水痘ウイルスゲノムの全配列(Joumal of General Virology,67:1759−1816,1986)中の塩基番号105142−109242の領域に存在する遺伝子である。この遺伝子62は、図1上段に示したように、転写開始部位(transcription start site)から矢印方向に転写が進行するため、ゲノム全配列の塩基番号109242→105142が“+”ストランドとなる。従って、配列番号1の第1番塩基“A”はこの+ストランドの5’末端塩基(ゲノム全配列の109242番塩基)に対応する。なお、以下の説明においてはゲノム全配列の塩基番号を示す場合があるが、このゲノム全配列に示される遺伝子62の配列は“−”ストランドであるため、配列番号1に示した塩基とは相補的である。
この発明の弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62は、配列番号1の塩基配列において、表1に示した(a)〜(d)の塩基置換を有する遺伝子である。また、この弱毒水痘ウイルス岡株遺伝子62は、上記(a)〜(d)の塩基置換に加え、表1の(e)〜(g)の少なくとも1以上の塩基置換を有する遺伝子、さらには表1の(h)〜(o)の少なくとも1以上塩基置換を有する遺伝子である。
また、この発明の弱毒水痘ウイルスのタンパク質は、上記の遺伝子62がコードするタンパク質であって、配列番号1のアミノ酸配列において、表1に示す(A)〜(D)のアミノ酸置換を有するタンパク質である。また、このタンパク質は、上記(A)〜(D)のアミノ酸置換に加え、表1に示す(E)〜(H)の少なくとも1以上のアミノ酸置換を有するタンパク質である。
このようなアミノ酸置換をもたらす塩基置換を有する遺伝子62を保有する水痘ウイルス岡株は、トランスアクチベーター機能の欠損あるいは減弱によってウイルス粒子形成に必要なタンパク質の発現が全体として低下する結果、弱毒性となるとも考えられる。
このような弱毒水痘ウイルス岡株遺伝子62は、例えば公知の弱毒水痘ウイルス岡株(BIKEN Lot−65:(財)阪大微生物病研究会、またはATCC VR−795)から定法により単離することができる。あるいはまた、後記の方法によって同定された弱毒水痘ウイルス株から単離することもできる。
この発明のDNA断片は、上記の遺伝子62をコードするDNAの断片であって、塩基置換部分を含む10塩基対以上のDNA断片である。このDNA断片は、弱毒水痘ウイルス岡株またはこの発明の方法によって新たに同定された弱毒水痘ウイルス株のゲノムDNAを適当な制限酵素によって切断するなどの方法により得ることができる。このDNA断片は、例えば、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株を強毒親株や他の野生型水痘ウイルス株と区別するためのDNAプローブ等として利用することができる。
また、この発明のタンパク質は、上記の遺伝子62を、例えば大腸菌や酵母などの微生物で発現させることによって得ることができる。すなわち、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNA配列クローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、上記遺伝子62のコード領域を含むDNA断片を挿入結合して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、遺伝子62がコードしているタンパク質を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他のタンパク質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、目的とするタンパク質部分のみを取得することもできる。
これらのタンパク質は、例えば抗体やCTL作成のための抗原として用いることができる。
この発明のペプチドは、上記タンパク質のアミノ酸配列において、そのアミノ酸置換部分を含む5アミノ酸残基以上の配列である。これらのペプチドもまた抗体やCTLを作製するための抗原等として用いることができる。
この発明の抗体は、上記のタンパク質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。また、この発明のCTLも、上記のタンパク質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として公知の方法により得ることができる。これらの抗体およびCTLは、新たに分離された弱毒水痘ウイルス株の同定方法に用いることができる。
この発明の弱毒水痘ウイルス株は、その遺伝子62が、上記の弱毒水痘ウイルス岡株遺伝子62と同様の塩基置換を有する水痘ウイルス株であって、弱毒生水痘ワクチン用ウイルス株として許容しうるウイルス株である。このような新しい弱毒水痘ウイルス株は、上記の塩基置換を有する遺伝子62を保有する水痘ウイルスを選択することにより同定することができる。具体的には、例えば上記のDNA断片または抗体もしくはCTLを用いた方法により、野生型水痘ウイルス株から鑑別することができる。
あるいはまた、この出願によって提供される方法、すなわち、配列番号1の塩基配列における少なくとも2107番塩基から2229番塩基までのDNA配列を制限酵素NaeIおよびBssHIIで切断し、このDNA配列が2または3断片化される水痘ウイルスを選択する方法によって同定することができる。上記のとおり、弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62は、2110番塩基AがGに置換されている。また、2226番塩基AがGに置換されている場合もある。その結果、2110番塩基A→Gの置換によって配列番号1の2107−2112番塩基配列には制限酵素NaeI認識部位(GCCGGC)が形成され、2226番塩基A→Gの置換によって配列番号1の2224−2229配列にBssHII認識部位(GCGCGC)が形成される。従って、少なくとも配列番号1の2107−2229番塩基までのDNA配列を上記2種の制限酵素で切断すれば、そのDNA配列は、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス由来であれば、2または3に断片化される。一方、野生型水痘ウイルスや、弱毒水痘ウイルス岡株の強毒親株に由来するDNA配列の場合には、上記のような塩基置換がないため、上記2種の制限酵素で切断されることはなく1断片のままである。なお、制限酵素で切断するDNA配列は、例えば、配列番号2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとし、同定対象とする水痘ウイルス遺伝子62を鋳型とするPCR法によって調製することができる。
この発明の弱毒生水痘ワクチンは、上記の方法によって同定された新しい弱毒水痘ウイルス株をシードウイルスとして用いることにより製造されたワクチンである。このような生ワクチンは、弱毒水痘ウイルス岡株をシードウイルスとして用いる既存の弱毒生水痘ワクチンと同様にして製造することができる。
実施例
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例1
弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62およびその強毒親株の遺伝子62の塩基配列を決定した。弱毒水痘ウイルス岡株(生ワクチン株)は、BIKEN Lot−65[(財)阪大微生物病研究会]を使用した。強毒親株(野生型水痘ウイルス岡株)は、MRC−5細胞で継代増殖させたものを使用した。
具体的には、先願発明(WO97/43420号公報)の実施例1に記載の方法に従い、弱毒水痘ウイルス岡株および強毒親株からDNAを抽出し、Dumas株の塩基配列(J.Gen,Virol.,67:1759−1816,1986)に基づいてデザインしたプライマーを用いて各遺伝子をPCR法により増幅した。遺伝子62の全長は、3組のプライマー(表2に示したセンスプライマーG62N1、G62N2、G62N3、およびアンチセンスプライマーG62R1、G62R2、G62R3)を用い、それぞれ重複する3断片として増幅した。なお、各センスプライマーはその5’末端にM13フォワード(−38)配列(G62N1−3の1−19番塩基)を接続している。またアンチセンスプライマーはその5’末端にM13リバース配列(G62R1−3の1−20番塩基)を接続している。
PCR反応溶液は、各デオキシヌクレオチド三燐酸200mM、各プライマー0.3μM、極微量の鋳型DNA、2.5UのExTaq(宝酒造社製)を含む50μLのExTaqバッファーを用いた。また、配列番号3および8のプライマーを用いる場合には、上記の組成に6%DMSOを加えた。増幅は、PCR自動化装置(米国Perkin−Elmer社製)を用いて、変性(94℃:1分間)、アニーリング(55℃:1.5分間)、伸長(72℃:2分間)を30サイクル行った。
次いで、PCR精製キット(ドイツQIAGEN GmbH社製)を用いてPCR増幅産物とプライマーとを分離し、精製PCR産物をシークエンジングキット(英国Amersham社製)を用いて配列決定し、DNAシークエンサーModel 4000L(米国LI−COR社製)で分析した。なお、配列決定の際には、蛍光色素IRO−40で標識したM13フォワードプライマーまたはリバースプライマーを用いた。
また、同様の方法により、弱毒水痘ウイルス岡株および強毒親株の遺伝子4、14、61の配列決定も行った。
その結果、遺伝子4、14および61については、弱毒水痘ウイルス岡株と強毒親株との間で塩基配列の違いは認められなかった。一方、表3に示したとおり、遺伝子62については、弱毒水痘ウイルス岡株は15塩基が強毒親株と異なっていた。これらの塩基置換はT→CまたはA→Gであり、8カ所の塩基置換は異なるアミノ酸残基をコードするように2種類の塩基が混在していた(表3のR)。また、弱毒水痘ウイルス岡株と強毒親株の遺伝子62は、Dumas株の遺伝子62とは9塩基が異なっていた。
以上の結果から、弱毒水痘ウイルス岡株と強毒親株とは、それぞれの遺伝子62の配列の相違によって区別しうることが確認された。
実施例2
弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62およびその強毒親株の遺伝子62のそれぞれ全長配列をPCR法により増幅し、クローニングした。
プライマーとして表1のG62NおよびG62Rのオリゴヌクレオチドを用い、反応溶液中に6%DMSOを加え、伸長反応を6分間とした以外は実施例と同一の方法により遺伝子62の全長をPCR法により増幅した。
プライマーは、それぞれ制限酵素XbaIおよびPstI認識部位を有しているため、精製PCR産物をこれらの制限酵素で切断した後、同一酵素で予め開列したpUC19にクローニングした。次いで、これらをE.coli JM109に導入した後、弱毒水痘ウイルス岡株および強毒親株の各々について9個のプラスミドを各形質転換体から抽出し、インサートの配列を決定した。
結果は第1図に示したとおりである。この第1図から明らかなように、弱毒水痘ウイルス岡株の9クローンは、15箇所の塩基のいずれか複数が強毒親株とは異なっていた。特に、塩基番号1251、2110、2226、3100、3667、3818および4006の8塩基は全クローンにおいて異なっていた。一方、強毒親株の9クローンでは上記の15箇所を含め、全て同一の配列であった。
実施例3
種々の水痘ウイルス株の遺伝子62の部分配列のRFLP分析を行った。
弱毒水痘ウイルス岡株および強毒親株は実施例1と同様のものを使用した。その他、水痘ウイルス野生株である河口株、ワクチン未接種の水痘患者5例および帯状疱疹患者5例のそれぞれの水泡液から分離した新鮮野生型ウイルス株10検体を使用した。なお、河口株および患者から分離した野生型水痘ウイルス株はヒトHEL細胞またはMRC−5細胞で2−3代継代の後、使用した。
各水痘ウイルスの遺伝子62は、配列番号2および3のオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法により増幅した。配列番号2のオリゴヌクレオチドは、水痘ウイルス遺伝子62(配列番号1)の1846−1863番塩基に対応するリバースプライマーであり、配列番号3のオリゴヌクレオチドは2609−2620番塩基に対応するフォワードプライマーである。PCR条件は、伸長時間を1分間とした以外は実施例1と同様とした。得られた各PCR産物3μLを、4UのNaeI(宝酒造社製)を37℃、1.5時間反応させて切断し、次いで4UのBssHII(宝酒造社製)を50℃、1.5時間反応させて切断した。切断したDNA断片は、4%アガロースゲル(NuSieve 3:1,FMC BioProducts社製)で電気泳動し、エチジウムブロマイド染色して分析した。
結果は第2図に示したとおりである。この第2図にから明らかなように、弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62由来のPCR産物(レーン1)は、NaeIおよびBssHIIによって3つの断片(402bp、264bp、116bp)に切断された。一方、強毒親株および患者から分離した新鮮野生型ウイルス株のPCR産物(レーン2−13)はこれら制限酵素では切断されることはなく、1断片のままであった。
以上の結果から、水痘ウイルス遺伝子62の少なくとも2107番塩基から2229番塩基までのDNA配列を、制限酵素NaeIおよびBssHIIによって切断し、このDNA配列が2または3断片化される水痘ウイルスを、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルスとして許容されるウイルス株として同定しうることが確認された。
実施例4
遺伝子62発現産物における8カ所のアミノ酸変異とそのトランスアクティベーション活性の関係を分析するため、VZVの各遺伝子のプロモーター配列とクロラムフェニコールトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子とを有するレポータープラスミドと、弱毒水痘ウイルス岡株または強毒親株の遺伝子62を保有するエフェクタープラスミドをコトランスフェクションした細胞においてCATアッセイを行った。
1.材料と方法
1.1 プラスミド
遺伝子4、14、28、29、62および68の各プロモーター領域開始コドンの約750塩基上流の配列を含むレポータープラスミドpIE4−CAT、pgC−CAT、pPol−CAT、pMDBP−CAT、pIE62−CATおよびpgE−CAT構築した。各プロモーター領域の配列は、5’端にNheIまたはBglII部位を有するプライマーを用いたPCR法により弱毒岡株ゲノムから増幅した。PCR条件は、伸長時間を1分間とした以外は実施例1と同様とした。増幅産物をNheIおよびBglIIで切断し、pCAT3−Basicplasmid(米国promega社製)のCAT遺伝子の上流に挿入結合した。
エフェクタープラスミドpPar−G62は強毒親株の遺伝子62クローンを用いて構築した。また弱毒岡株の遺伝子62から得た9個のクローンから、第1図のクローン9(13塩基置換と8アミノ酸置換を有するクローン)を選択し、エフェクタープラスミドpVac−G62を構築した。
1−2.トランスフェクション
CV1細胞を、35−mmプラスチック皿に105細胞/dishの割合で培養し、この細胞にSuperFect(QIAGEN GmbH)を用いたリポフェクションにより各プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション用の各反応溶液には、0.25μgのレポータープラスミドと、様々な量(0−1μg)のエフェクタープラスミドを含めた。また、各トランスフェクションにおいては、ベクターpUC19の添加によってDNAの全量を2.5μgに一定するようにした。全ての実験は、各DNAトランスフェクションにつき少なくとも3回行った。
1−3.CATアッセイ
トランスフェクションから44時間後、細胞の全タンパク質とCAT量を測定した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、溶解バッファー(ドイツ Boehringer Mannheim Corporation社製)で溶解した。各溶出物のCAT濃度は、CAT ELISA Kit(ドイツ Boehringer Mannheim Corporation社製)で決定し、Bio−Radタンパク質試薬(米国 Bio−Rad社製)により決定したタンパク質量に対して標準化した。
2.結果
試験したVZV遺伝子の全てのプロモーターは、ほとんど背景活性を示さなかった。すなわち、エフェクタープラスミドをトランスフェクトしなかった場合には、CATの発現はほとんど観察されなかった。
弱毒岡株由来の遺伝子4プロモーターは、強毒親株および弱毒岡株のそれぞれの遺伝子62発現産物(IE62)によってトランスアクティベートされた(第3図A)。ただし、イフェクタープラスミドが低量の場合には、強毒親株のIE62が弱毒岡株のIE62よりも強い転写活性を示した。すなわち、イフェクタープラスミドが最も低量(0.25μg)の場合には、強毒親株IE62の転写活性は弱毒岡株IE62の7.8倍であり、イフェクタープラスミド量が増加するに従って両者の倍率は小さくなった。
一方、レポータープラスミドpCAT−IE62をトランスフェクトした細胞からは、CAT活性はほとんど検出されなかった(第3図B)。
さらに、VZV遺伝子28および29のそれぞれのプロモーター領域を有するpCAT−PolおよびpCAT−MDBP(第3図CおよびD)、ならびに遺伝子68のプロモーター配列を有するpCAT−gE(第3図E)は、強毒親株および弱毒岡株のIE62によって活性化された。これらのCAT活性の量依存曲線はpCAT−IE4の場合と類似しており、しかも、弱毒岡株IE62に比較して強毒親株IE62のほうが強い活性を示した。特にイフェクタープラスミドが最も低量の場合、強毒親株IE62の活性は、弱毒岡株IE62よりも、各々、7.6倍、5.6倍および1.8倍であった。しかし、遺伝子14のプロモーター領域を有するpCAT−gCをトランスフェクトした細胞ではCAT活性は検出されなかった(第3図F)。
以上の結果から、VZV遺伝子62の発現産物(IE62)は、前初期の遺伝子4(ORF4)、初期の遺伝子28(DNAポリメラーゼ:Pol)および遺伝子29(主要DNA結合タンパク質:MDBP)、ならびに後期の遺伝子68(糖タンパク質E:gE)のプロモーターを活性化することが確認された。しかもより重要な点は、弱毒岡株IE62の転写活性は常に強毒親株IE62よりも低いということである。すなわち、弱毒岡株の遺伝子62における変異がウイルス複製に影響し、このことがVZVの弱毒化を生じさせていると考えられる。
産業上の利用の可能性
この出願の発明によって、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルスとして許容される水痘ウイルス株と、他の野生型水痘ウイルスおよび弱毒水痘ウイルス岡株の強毒親株とを簡便かつ正確に区別することが可能となる。また、この出願の発明によって、生ワクチン用の弱毒水痘ウイルス抗原を大量製造することが可能となる。これらの発明によって、ワクチン製造およびワクチン接種の安全性および有効性がより一層確実なものとなる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第1図の上段は、水痘ウイルス遺伝子62の構成を示した模式図であり、下段は弱毒水痘ウイルス岡株遺伝子62から得た9クローンおよび強毒親株の遺伝子62の配列分析の結果の要約である。
第2図は、次の各水痘ウイルス株遺伝子62PCR産物に対するRFLP分析の結果を示すアガロースゲル電気泳動図である。レーン1:弱毒水痘ウイルス岡株、レーン2:強毒親株、レーン3:河口株、レーン4−8:野生型水痘ウイルス、レーン9−13:野生型帯状疱疹ウイルス。なお、両側のレーンはサイズマーカーである。
第3図は弱毒水痘ウイルス岡株とその強毒親株のそれぞれの遺伝子62産物(IE62)によるVZV各遺伝子プロモーターの活性化を試験した結果である。AはIE4をコードする遺伝子4のプロモーターのエフェクタープラスミド量依存的な活性を示すグラフである。CV1細胞は、一定量(0.25μg)のpCAT−IE4および様々な量のpVac−G62(□)またはpPar−G62(●)をコトランスフェクトされている。以下、BはIE62をコードする遺伝子62、CはDNAポリメラーゼをコードする遺伝子28、Dは主要DNA結合タンパク質(major DNA binding protein:MDBP)をコードする遺伝子29、Eは糖タンパク質C(glycoprotein C:gC)をコードする遺伝子14、FはgEをコードする遺伝子68のそれぞれのプロモーター活性を示すグラフである。
Claims (5)
- 配列番号1の塩基配列において、以下の(a)〜(g)の塩基置換:
(a)2110番塩基AがG;
(b)3100番塩基AがG;
(c)3818番塩基TがC;
(d)4006番塩基AがG
(e)1251番塩基AがG;
(f)2226番塩基AがG;および
(g)3657番塩基AがG
を有する弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62、または前記(a)〜(g)の塩基置換に加え、以下の(h)〜(o)の少なくとも1以上の塩基置換:
(h)162番塩基TがC;
(i)225番塩基TがC;
(j)523番塩基TがC;
(k)1565番塩基TがC;
(l)1763番塩基TがC;
(m)2652番塩基TがC;
(n)4052番塩基TがC;および
(o)4193番塩基TがC
を有する遺伝子62をコードするDNAの断片であって、弱毒水痘ウイルス株を野生型水痘ウイルス株から区別するためのプローブとして使用することのできるDNA断片。 - 配列番号1の塩基配列において、以下の(a)〜(g)の塩基置換:
(a)2110番塩基AがG;
(b)3100番塩基AがG;
(c)3818番塩基TがC;
(d)4006番塩基AがG
(e)1251番塩基AがG;
(f)2226番塩基AがG;および
(g)3657番塩基AがG
を有する遺伝子62、または前記(a)〜(g)の塩基置換に加え、以下の(h)〜(o)の少なくとも1以上の塩基置換:
(h)162番塩基TがC;
(i)225番塩基TがC;
(j)523番塩基TがC;
(k)1565番塩基TがC;
(l)1763番塩基TがC;
(m)2652番塩基TがC;
(n)4052番塩基TがC;および
(o)4193番塩基TがC
を有する遺伝子62の塩基置換と同一の塩基置換を有する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。 - 請求項1のDNA断片がハイブリダイズするゲノムDNAを保有する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
- 配列番号1の塩基配列における少なくとも2107番塩基から2229番塩基までのDNA配列を制限酵素NaeIおよびBssHIIで切断し、このDNA配列が2または3断片化される水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
- DNA配列が、配列番号2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとし、水痘ウイルスの遺伝子62を鋳型とするPCR法によって調製されたDNA配列である請求項4の同定方法。
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