JPH06189752A - 組換え水痘ウイルスとその作製法 - Google Patents

組換え水痘ウイルスとその作製法

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JPH06189752A
JPH06189752A JP3191340A JP19134091A JPH06189752A JP H06189752 A JPH06189752 A JP H06189752A JP 3191340 A JP3191340 A JP 3191340A JP 19134091 A JP19134091 A JP 19134091A JP H06189752 A JPH06189752 A JP H06189752A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 水痘ウイルスの遺伝子プロモーターの下流領
域に、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの遺伝子群より選ばれる
１種以上の遺伝子を挿入連係された組換え水痘ウイル
ス、この組換えウイルスのゲノムＤＮＡ、この組換えウ
イルスを有効成分とする生ワクチン、この組換えウイル
スに由来する抗原、およびこの抗原を含有する診断剤。 【効果】 水痘とＢ型肝炎のいずれに対しても優れた免
疫効果を有する多価生ワクチンと、それらの疾病に対す
る多価診断剤が安価に提供される。また、培養が困難な
Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムＤＮＡおよびその発現産物で
ある各種抗原の量産が可能となる。なかでも上記多価生
ワクチンは、予防接種の省力化と経済性の向上をもたら
し、その普及に大きく貢献する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換え水痘ウイルスとそ
の作製法に関するものであり、これより得られる組換え
水痘ウイルスとその抗原並びにゲノムＤＮＡは、ワクチ
ン、免疫学的診断剤、遺伝子診断剤、遺伝子工学試薬等
として利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
略記の説明：ここで使用の各略記はそれぞれ、（ ）内
に記載の用語を意味する：ＶＺＶ（水痘ウイルス）、Ｅ
ＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝
炎ウイルス）、ＮＡＮＢＶ（非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス）、ｔｋ（チミジンキナーゼ）、ｇｐ（糖蛋白）、及
びＨＢｓ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）。
【０００３】ウイルス遺伝子に外来遺伝子又は異種遺伝
子を挿入連係することにより組換えウイルスを作成する
技術、即ち、ウイルスゲノムをウイルスベクターとして
用いる技術は１９７９年頃から、例えば、ＳＶ４０ベク
ターによるウサギβ−グロビンの生産［Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄｏｎ），２２７，１０８−１１４，１９７
９；同上，２７８，３５−４０，１９７９］等におてい
散見される。そして、１９８０年、ＷＨＯ（世界保健機
構）総会が、ワクチンの成果に基づく世界天然痘根絶を
宣言し、種痘の廃止を勧告して以来、種痘の有効成分で
ある弱毒ウイルスとしてのワクチニアウイルスの効用が
世界的に注目かつ再評価されている状況下で、該ウイル
スゲノムを外来遺伝子のクローニング及び発現ベクター
として利用し作出した組換えワクチニアウイルスが報告
された［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳ
Ａ），７９，４９２７−４９３１，１９８２；同上，７
９，７４１５−７４１９，１９８２］。更に、ＷＨＯ特
別諮問グループは、ワクチニアウイルス等のウイルスベ
クターを用いる組換えウイルスワクチンの研究促進計画
を採択した［Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３１２，
２９９，１９８４］。このＷＨＯの提唱は、下記を示唆
するものである：従来使用のプラスミドベクター、ファ
ージベクター、コスミッドベクター等の宿主域は、主に
細菌や酵母等であり、狭いため、斯かる欠点を解消する
目的で高等動物細胞を宿主とする広宿主域のウイルスベ
クター、例えば、ワクチニアウイルスベクターを開発す
る；２種以上の異種抗原や異種ウイルス等の混合からな
る従来の混合ワクチンに代わるものとして、ワクチニア
ウイルスゲノムに外来遺伝子を挿入連係し作製した組換
えウイルスを有効成分として用いる多価ワクチンを開発
する等。上述のＷＨＯの宣言や提唱を契機として、現
在、種々のウイルスベクターに関する基礎研究や開発が
各方面で精力的に展開され、既に膨大なデータが蓄積さ
れている：ウイルスベクターとして、パピローマ、ポリ
オーマ、アデノ、ワクチニア、レトロ、バキュロ、単純
ヘルペス、マレック病、水痘、パルポ、カリフラワーモ
ザイク、タバコモザイク、トマトゴールデンモザイク等
の各ウイルスゲノムが、既に知られている［ウイルス，
３６，１−４１，１９８６；同上，３７，１−４０，１
９８７；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉ
ｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ”，１−１９８ページ，Ｙ．Ｇｌ
ｕｚｍａｎ 及びＳ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ編，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（ＵＳＡ）１９８８年発行；欧州公開公報第３３４５３
０号］。
【０００４】特にここでは、上記ウイルスベクターのう
ち、本発明に関連したＶＺＶベクターについて、以下に
説明する：ＶＺＶは通常その感染性が生細胞内でのみ維
持される細胞依存性ウイルス（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）であり、該ウイルスの分離、試
験管内での培養・継代、及び量産はいずれも困難である
ため、ＶＺＶワクチン及び診断剤の開発は言うに及ば
ず、水痘の病原体としてのＶＺＶの基礎及び臨床研究は
躊躇される傾向にあった。そのため、ＶＺＶの研究は、
本発明者らが１９７５年に細胞遊離（ｃｅｌｌ−ｆｒｅ
ｅ）の、水痘生ワクチン用の弱毒ＶＺＶ岡株を確立する
まで、遅々として進展していなかった（Ｂｉｋｅｎ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ，２３，５３−５５，１９７５； 特公昭
５１−１９０１８；特公昭５３−４１２９２；特公昭５
６−４２１４４）。しかし、上記の弱毒ＶＺＶ岡株を用
いる生ワクチンの開発が契機となり、爾来、世界各地で
ＶＺＶの基礎と臨床並びに応用研究が急速に展開され、
現在では、この弱毒ＶＺＶ岡株を有効成分として用いる
水痘生ワクチンが世界各国で広く実用に供されている
［Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒ Ｖａｒｉｃｅｌｌ
ａ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｌｉｖｅ）Ａｄｏｐｔｅｄ１９８
４：ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅ
ｒｉｅｓ，Ｎｏ．７２５，ｐｐ．１０２−１２４，１９
８５］。また、ＶＺＶの基礎、臨床、診断、疫学等に係
る膨大なデータも既に蓄積されており［“Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ”，ｖｏｌ．２，ｐｐ．２０１１−２０５４，Ｂ．
Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ（ＵＳ
Ａ）１９９０年発行］、就中、ＶＺＶゲノムの構造解析
に関しては、１９８０年代に入り、遺伝子のクローニン
グとその発現、モノクローナル抗体等の技術の開発と普
及に伴い、ＶＺＶゲノムＤＮＡの制限酵素地図や全塩基
配列決定等（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎａｒａｌ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，１７５９−１８１６，１９８
６；同上，６７，１８１７−１８２９，１９８６；ウイ
ルス，３７，７１−８０，１９８７）により、長足の進
歩を遂げている。ところで、上記の文献に基づくＶＺＶ
に関するウイルス学上の主な知見は次の通りである：Ｖ
ＺＶは、エンベロープを有し、分類学的には単純ヘルペ
スウイルス群、即ち、ヘルペスウイルス科アルファヘル
ペス亜科に属する直径が約１８０−２００ｎｍのＤＮＡ
型ウイルスである。そのゲノムは、約１２０ｋｂ（ｋｉ
ｌｏｂａｓｅ）の２本鎖で線状のＤＮＡからなり、ヌク
レオキャブシド内部の直径約７５ｎｍのドーナツ状のコ
アに内在している。該ゲノムＤＮＡは、ユニークな配列
（Ｕ）の長いセグメント（ＵＬ）と短いセグメント（Ｕ
Ｓ）、ＵＬに隣接するｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ
（ＴＲ）配列（ＴＲＬ）とＵＳに隣接の配列（Ｔ
ＲＳ）、及びこれ等の各ＴＲに相補的で塩基配列の方向
が逆向きの２つのｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ（Ｉ
Ｒ）、ＴＲＬに相補的なＩＲＬ、及びＴＲＳに相補的な
ＩＲＳからなっている。そして、これ等の６断片は、
５′から３′末端の方向に、ＴＲＬ・ＵＬ・ＩＲＬ・Ｉ
ＲＳ・ＵＳ・ＴＲＳの順に並んでいる。また、現在、合
計７１個のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅ）が５′末端から順に１から７１まで番号付けされ
ており、これ等の遺伝子のうち、機能が確認または推定
されているものは次の２１ＯＲＦである［尚、下記（数
字）はＯＲＦ番号をそれぞれ意味する］：（４）早期蛋
白、（８）デオキシウリジントリホスファターゼ、（１
０）ｔｒａｎｓ誘導蛋白、（１３）チミジン合成酵素、
（１４）ｇｐＶ、（１８）ポヌクレオチド還元酵素小サ
ブニット、（１９）ポヌクレオチド還元酵素大サブニッ
ト、（２８）ＤＮＡ合成酵素、（２９）ＤＮＡ結合蛋
白、（３１）ｇｐＩＩ、（３６）ｔｋ、（３７）ｇｐＩ
ＩＩ、（４０）キャブシド蛋白、（４８）エキソヌクレ
アーゼ、（６２，７１）早期蛋白、（６３，７０）早期
蛋白、（６６）プロティンキナーゼ、（６７）ｇｐＩ
Ｖ、及び（６８）ｇｐＩをコードする各遺伝子。
【０００５】また、ＶＺＶをウイルスベクターとして使
用し作出された組換えＶＺＶについては、下記が公知で
ある：ＶＺＶのｇｐＩ遺伝子プロモーターの下流領域に
外来遺伝子を挿入連係して得た組換えＶＺＶであり、外
来遺伝子がＥＢＶのｇｐ３５０遺伝子（特開昭６３−１
２２７７又は欧州公開公報第２５１５３４号；特開昭６
３−１４１５８９；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，６１，１７９６−１８０７，１９８７）、外来
遺伝子がＨＢＶのｐｒｅＳ２及びＨＢｓ遺伝子（特開昭
６３−１２２７７又は欧州公開公報第２５１５３４号）
であるもの；ＶＺＶのｇｐＩ遺伝子プロモーターの下流
にＥＢＶｇｐ３５０とｇｐ２２０の各遺伝子を連結した
遺伝子断片を更にＶＺＶのｔｋ遺伝子内に挿入連係し、
斯かるＥＢＶ遺伝子をｔｋとの融合蛋白として発現させ
るよう作製した組換えＶＺＶ［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ［ＵＳＡ］，８４，３８９６−３９００，
１９８７；“ＵＬＣＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｎｅｗ Ｓｅｒｉｅ
ｓ，ｖｏｌ．８４：Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ”，ｐｐ．２３５−２４１，Ｒ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓら
著，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）１９
８８年発行］等。しかし、これ等の組換えＶＺＶはいず
れも、免疫原性が低く、しかも、安全性と有効性が確認
されていない。また、斯かるＶＺＶを抗原として用いワ
クチンや診断剤を市場に乗せる動きは現在、知られてい
ない。従って、組換えＶＺＶは未だ実用の域には到達し
ていないと判断される。
【０００６】その理由としては、ゲノムの長さが通常、
約１０ｋｂである小型ウイルスに比べ、前述の通り、Ｖ
ＺＶは大型であり、その感染性ゲノムは約１２０ｋｂと
極めて長く、斯かるＤＮＡ長鎖は切断され易く不安定で
ある；また、ＶＺＶは本来、熱に極めて不安定な細胞依
存性ウイルスであり、その感染性維持には−６０℃以下
での保存を必須する等、その取扱い、培養、量産等が容
易ではない；更に、ウイルス培養における１細胞当たり
の感染性ウイルス粒子生産数に関し、他のウイルスが通
常、約１０−１００粒子であるのに対し、ＶＺＶの場合
は約０．１個と生産収率が極めて低い；等の理由によ
り、ＶＺＶ培養によるゲノムの量産のみならず、試験研
究段階での使用に耐えるＶＺＶ遺伝子ＤＮＡの調製とク
ローニングは甚だ困難であり、かつ、産業利用上、質と
量共に適格な組換えＶＺＶを選別採取する確率が極めて
低い。換言すれば、組換えＶＺＶ株の確立には、斯かる
著しく困難な条件を克服する必要がある。その結果、産
業上利用の観点から、量産コストに見合った遺伝子発現
機能を有し、しかも、斯かる発現能が継代下で遺伝学的
に安定であり、かつ、生ワクチンの有効成分として適格
な安全性と有効性を兼備した組換えＶＺＶ株の完成は未
だ、実現されていないと考えられる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述のＷ
ＨＯの提唱に呼応すると共に、２０余年にわたり蓄積し
た独自の経験と知識を糧として更に、鋭意試験と試行を
重ね、前述の組換えＶＺＶ株の作出に係る困難を克服
し、産業上利用の観点から、遺伝子発現能と生産量が共
に安定で量産に最適の、優れて有用な組換え弱毒ＶＺＶ
株を確立した。本発明によれば、外来の異種遺伝子を挿
入連係した組換えＶＺＶ岡株とその作出法、並びに斯か
る組換えＶＺＶを培養し製造される多価の生ワクチンや
診断剤等が提供される。以下、その構成につき説明す
る。
【０００８】ウイルスベクターとしてのＶＺＶ株：組換
えＲＮＡ技術が未確立の現状、及び既に確立されている
組換えＤＮＡ技術の適用を考慮すると、ウイルスベクタ
ーの開発では、ＲＮＡ型ウイルスに比べ、ＤＮＡ型ウイ
ルス、例えば、ワクチニアウイルス、ＶＺＶ等の使用の
方が有利である。更に、本発明では、安全性、有効性及
び均質性を併有する組換え生ワクチン株の作出を主な目
的として、ＶＺＶゲノムをベクターとして使用する。本
発明でよれば、ＶＺＶとして、例えば、岡（ＡＴＣＣ
ＶＲ−７９５）、Ｗｅｂｓｔｅｒ（ＡＴＣＣ ＶＲ−９
１６）、Ｅｌｌｅｎ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８６）、Ｙ
Ｓ、ＹＧ、Ｓｃｏｔｔ、河口、Ｄｕｍａｓ等の既存の公
知株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，６７，１８１６−１８２９，１９８６；ウ
イルス，３７，７１−８０，１９８７）の各株や将来分
離されるＶＺＶ株等を随意に使用できる。これ等のＶＺ
Ｖ株のうち、試験研究や製造上での取扱いでの安全性の
確保、及び安全性と有効性とを兼備した生ワクチンや診
断剤の提供等の産業上利用を考慮すると、弱毒ＶＺＶ株
の使用が望ましい。特に、上記の主目的の観点から、弱
毒ＶＺＶ岡株は、水痘生ワクチン株（ＷＨＯ Ｔｅｃｈ
ｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．７２
５，ｐｐ．１０２−１２４，１９８５）として、その安
全性と有効性が世界的に確定かつ公認され、現在、世界
のレベルで使用されている唯一のＤＮＡ型の弱毒ウイル
スであるため、外来遺伝子の発現ベクターとして最適で
ある。
【０００９】ＶＺＶの培養とその細胞の選択：ヒト、サ
ル、モルモット等に由来のＶＺＶ感受性の公知の細胞を
使用できる。これ等の細胞のうち、迷入因子や癌原性因
子の混入の確率、ワクチン用ウイルス株培養の細胞とし
ての適格性、産生ウイルス量等を考慮すると、生ワクチ
ン製造用として公認のヒト２倍体細胞、例えば、ＨＥＬ
２９９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ １３７）、ＭＲＣ−
５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ １７１）、ＷＩ−３８
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ７５）等の使用が望まし
い。細胞培養の増殖と維持両培地、及びウイルス培養培
地として、市販の合成培地、例えば、１９９培地［Ｄｉ
ｆｃｏ社（米国製）］、ＭＥＭ培地［Ｇｉｂｃｏ社（米
国）製］等を使用できる。斯かる培地は使用直前に、約
７％（ｗ／ｖ）のＮａＨＣＯ３水溶液を滴下混合してｐ
Ｈを約６．８−８．０に調整の後、更に、市販のウシ胎
児血清［例えば、Ｆｌｏｗ社（米国）製］を最終濃度が
約２−１５％（ｗ／ｖ）になるよう追加して添加混合
し、培養に供する。ＶＺＶの培養は、予め調製した細胞
培養にそのシードウイルスを接種した後、維持培地を用
いて行う。培養温度は２５−４０℃、好ましくは、３３
−３８℃が推奨される。
【００１０】異種ないしは外来遺伝子を挿入連係するＶ
ＺＶ遺伝子の選択：本発明によれば、理論的には、前述
の７１個の全てのＶＺＶ遺伝子をそれぞれ、異種ないし
は外来遺伝子を挿入連係する部位として使用できる。
尚、斯かる使用上の留意点として、これ等の各遺伝子の
プロモーターが機能できるよう、プロモーターの下流を
占めるＯＲＦ領域に外来遺伝子を挿入連係する；及び翻
訳が円滑に進行するようＶＺＶ遺伝子と外来遺伝子相互
のコドンを破壊することなく挿入連係する等をあげるこ
とができる。また、外来遺伝子が挿入連係された遺伝子
は破壊され本来の機能を発揮しなくなることがあるの
で、ウイルスの感染性や増殖性に影響を及ぼさない遺伝
子で、しかも、多量発現能を有する、プロモーターの強
度の強い遺伝子、例えば、ｔｋ遺伝子やｇｐ遺伝子等の
採用が望ましい。特に、弱毒ＶＺＶ岡株を用いる場合に
は、前述の７１遺伝子のうち、遺伝子１４のｇｐＶ遺伝
子の欠損又は発現機能の低下（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６４，４５４０−４５４８，１９９
０）が知られているため、この遺伝子領域の使用は推奨
できない。しかし、ＶＺＶ野生株のｇｐＶ遺伝子の使用
は可能であり、そのプロモーターの下流に外来遺伝子を
挿入連係することにより、該ｇｐＶをコードする遺伝子
領域の破壊や発現量低下を惹起させることができるの
で、これより得られる組換えＶＺＶは、弱毒ＶＺＶ岡株
に類似の弱毒株として、極めて高い有用性が期待され
る。
【００１１】ＶＺＶ遺伝子内に挿入連係する異種ないし
は外来遺伝子の選択：本発明によれば、理論的には、ウ
イルスベクターとして用いるＶＺＶが本来有する遺伝子
以外の全ての遺伝子を異種ないしは外来遺伝子として使
用できる。例えば、ＶＺＶ以外のウイルス、クラミジ
ア、細菌、原虫、動物細胞、植物細胞等が生産又は保有
の種々の構成成分、生理活性物質、抗原、酵素等の全て
の遺伝子を異種ないしは外来遺伝子として使用できる。
これ等の遺伝子のうち、産業上利用とその必要性を考慮
すると、特に、培養や量産が困難なウイルス、例えば、
ＨＢＶやＮＡＮＢＶ等、また、バイオハザードの確率の
高いウイルス、例えば、ＥＢＶ、エイズウイルス、ヒト
Ｔ細胞白血病ウイルス、腎症候性出血熱ウイルス等の各
遺伝子を外来遺伝子としてＶＺＶゲノムに挿入連係し、
組換えＶＺＶにより発現させると効果的である。但し、
組換えＶＺＶの生ワクチン株としての使用を考慮し、毒
性物質、為害作用物質、毒素等をコードする遺伝子領域
が挿入連係に用いる外来遺伝子中に連座しないよう、細
心の注意を払う必要がある。例えば、ＨＢＶのＰｒｅＳ
１領域と、重合ヒト血清アルブミン・レセプターである
ｐｒｅＳ２の一部領域は共に肝細胞への親和性が知られ
ているので、斯かる領域をコードする遺伝子の近傍を外
来遺伝子として使用する場合には、該当領域を制限酵素
で開裂除去する必要がある。外来遺伝子の使用数に関
し、例えば、ＨＢＶ遺伝子を挿入連係した弱毒組換えＶ
ＺＶは、ＨＢＶとＶＺＶに係る両者の抗原性と免疫原性
を併有し、しかも、弱毒株であるため、Ｂ型肝炎と水痘
に対する同時免疫が可能な２価生ワクチンの有効成分と
して、また、ＨＢＶとＶＺＶ両抗原からなる診断用の２
価抗原として実用に供することができる。ここで付記か
つ特筆すべきは、従来技術では不活化ワクチンとしてし
か提供され得ない抗原、例えば、ＨＢＶ抗原を、本発明
によれば、生ワクチンとして実用に供し得ることであ
る。また、ＨＢＶとＮＡＮＢＶの両遺伝子を併せて弱毒
ＶＺＶゲノムに挿入連係した場合には、ＨＢＶ、ＮＡＮ
ＢＶ及びＶＺＶに係る３者に由来の抗原性と免疫原性を
併有する弱毒組換えＶＺＶが得られる。この様に、ＶＺ
Ｖの増殖性と感染性に支障を来さない範囲内で、１種以
上の外来遺伝子を同時にＶＺＶゲノム内に挿入連係する
ことができる。
【００１２】組換えＶＺＶの作製：次の手順で行う。外
来遺伝子を挿入連係しようとするＶＺＶ遺伝子のクロー
ニンク；外来遺伝子のクローニング；クローニングした
ＶＺＶ遺伝子に外来遺伝子を挿入連係したキメラプラス
ミドの構築；斯かるキメラプラスミドとＶＺＶゲノムと
の間の組換えによる、組換えＶＺＶの作出。以下、この
順序で説明する。
【００１３】（１）ＶＺＶ遺伝子のクローニング：後述
の実施例１に記載の要領でＶＺＶゲノムＤＮＡをその感
染細胞から抽出精製の後、このＤＮＡを制限酵素で消化
し、常法のアガロースゲル電気泳動で分画し調製したＶ
ＺＶ遺伝子ＤＮＡ断片を、市販又は公知のベクターとそ
の宿主（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ著，“Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ”，全２巻，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９８５年発行；
“ＡＴＣＣ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡＭａｔｅ
ｒｉａｌｓ”，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ １９８９年発行）を用
いて、ベクターの制限酵素サイトにクローニングする。
例えば、ＶＺＶのｔｋ遺伝子は、ＶＺＶゲノムを制限酵
素ＳａｃＩで消化して調製したＨ断片（Ｉｎｔｅｒｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ，２９，３０１−３１０，１９８８）を大
腸菌プラスミドーベクターｐＵＣ１２［Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．
２０−７８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（米国）１
９８３年発行］のＳａｃＩサイトに挿入連係の後、これ
を大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３３２３）
に移入して形質転換させることにより、クローニングで
きる。また、この工程の簡略化には、既にクローニング
済みのＶＺＶ遺伝子（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，１８１７−
１８２９，１９８６）を利用できる。
【００１４】（２）外来遺伝子のクローニング：動植物
の組織細胞、摘出した感染組織細胞、培養した細菌細胞
やウイルス感染細胞の、界面活性剤による溶解液、超音
波による破壊液、また、ウイルス培養上清、感染個体の
血液等を出発材料として使用できる。精製手段として、
公知の常法を組合わせて用いることができる。例えば、
ウイルスの場合には、硫安塩析法、低速遠心法、密度勾
配超遠心法等を組合わせて用いることにより、出発材料
から先ずウイルス粒子の精製画分を調製する。斯かる精
製画分からのゲノムＤＮＡやＲＮＡの抽出と精製は、そ
の不可逆的変性を避けるため、ｐＨ３−１０での実施が
望ましく、公知の常法により実施できる。例えば、１０
０℃のＮａＣｌ溶液を用いる熱食塩法、ＳＤＣ（デオキ
シコール酸ナトリウム）やＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）等を用いる洗剤法、２相分配の原理に基づくフェ
ノール抽出法、塩酸グアニジンの濃厚液を用いる塩酸グ
アニジン法、ＮａＯＨ溶液やＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ
３緩衝液等を用い約ｐＨ１０でのアルカリ法、冷エタノ
ールを用いアルコール沈殿法等を適宜組合わせて採用す
ることによりゲノムＤＮＡやＲＮＡを調製できる。尚、
ゲノムがＲＮＡの場合には、逆転写酵素により、これと
相補的なｃＤＮＡに変換する。斯かるＤＮＡは、上記の
（１）と同様の要領で、ベクターの制限酵素サイトにク
ローニングする。尚、この工程を簡略化するため、既に
クローニング済みの外来遺伝子を用いることができる。
例えば、ｐＭ１Ｂ１１［特開昭６３−２２０９８（微工
研条寄第１０８１号）］にクローニングされたＨＢＶの
ｐｒｅＳ１−ｐｒｅＳ２−ＨＢｓ抗原遺伝子、ｐＳ２２
［特開昭６２−２８６９３０（微工研条寄第１０７４
号）］の日本脳炎ウイルスＶ３抗原遺伝子、ｐＮＬＨ４
０２［特開平２−２６５４８１（微工研条寄第２１４６
号）］のエイズウイルス遺伝子、大腸菌ＢＫシリーズ
［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６５，１
１０５−１１１３，１９９１（微工研条寄第２９７１−
２９７６号）］のＮＡＮＢＶ遺伝子等を利用できる。
【００１５】（３）ＶＺＶ−外来遺伝子のキメラプラス
ミドの構築：上述（１）の要領でＶＺＶ遺伝子をクロー
ニングしたベクター内のＶＺＶ遺伝子の下流領域を制限
酵素で開裂し、その開裂サイトに、上記（２）でクロー
ニングした外来遺伝子を制限酵素により消化し調製した
ＤＮＡ断片を挿入連係の後、これを宿主細胞に移入して
形質転換させることにより、ＶＺＶ遺伝子と外来遺伝子
が連係のキメラプラスミドを構築する。尚、この場合、
前述の通り、１種以上の外来遺伝子を挿入連係すること
ができる。
【００１６】（４）組換えＶＺＶの作出：前述のＶＺＶ
ゲノムと上記（３）で調製のキメラプラスミドを同時に
宿主細胞に導入し、これ等の両者の間で、組換えを起こ
させることにより、組換えＶＺＶを作出する。細胞への
ＤＮＡの導入には、公知の常法、例えば、ＤＥＡＥデキ
ストラン法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法等を適用
できる。リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｄｏｇｙ，５２，
４６５−４６７，１９７３）の場合、リン酸イオンとカ
ルシウムイオンの共存下で形成される上記両ＤＮＡの共
沈殿物を調製の後、これを細胞培養に接触させ、コ・ト
ランスフェクションさせる。また、ＶＺＶ親株を事前に
接種して約２−３時間培養した感染細胞に、キメラプラ
スミドＤＮＡのリン酸カルシウム共沈殿物を滴下し接触
させ、該ＤＮＡをＶＺＶ感染細胞に導入することもでき
る。次いで、これ等の細胞を培養し、その培養系でＶＺ
Ｖゲノムとキメラプラスミド両ＤＮＡの間で組換えを起
こさせ、組換えＶＺＶを作出できる。
【００１７】（５）組換えＶＺＶとその培養：本発明に
より得られる種々の組換えＶＺＶクローンはいずれも、
弱毒ＶＺＶ株であり、生ワクチンの有効成分として使用
できる。例えば、ＶＺＶとＨＢＶ両遺伝子の間の組換え
ＶＺＶクローンは、後述の実施例５に開示の通り、ｒＨ
Ｖ岡株シリーズと総称され、命名された次の２０株から
なる：ｒＶＨ１岡株、以下、ｒＶＨ２、ｒＶＨ３、ｒＶ
Ｈ４、ｒＶＨ５、ｒＶＨ６、ｒＶＨ７、ｒＶＨ８、ｒＶ
Ｈ９、ｒＶＨ１０、ｒＶＨ１１、ｒＶＨ１２、ｒＶＨ１
３、ｒＶＨ１４、ｒＶＨ１５、ｒＶＨ１６、ｒＶＨ１
７、ｒＶＨ１８、ｒＶＨ１９、及びｒＶＨ２０の各岡
株。尚、本発明の組換えＶＺＶは、後述の参考例３に記
載の要領で、培養細胞に組換えＶＺＶシードウイルスを
接種し培養できる。その培養上清および感染細胞内に
は、感染性の組換えＶＺＶ粒子以外に、組換えＶＺＶゲ
ノムの発現産物である種々の抗原が生産される。例え
ば、上記のｒＶＨ７岡株を培養すると、組換えＶＺＶ粒
子以外に、その培養上清には分子量が３０ｋ、３５Ｋ等
のＨＢｓポリペプチドが、また、感染細胞細胞内には２
６ｋ、３０Ｋ等のＨＢｓポリペプチドがそれぞれ生産さ
れる。組換えＶＺＶの培養物中に生産される、これ等の
抗原、ウイルス粒子とそのＤＮＡはいずれも、ワクチ
ン、免疫学的診断剤、遺伝子診断剤、又は遺伝子工学試
薬として利用できる。
【００１８】組換えＶＺＶゲノムＤＮＡの制限酵素解
析：公知の常法、例えば、サザン・ブロット法（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，９８，５０３，１９７５）により解析できる。即
ち、ＶＺＶゲノムを制限酵素で消化し調製したＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動で分画し、これ等の画分を
ニトロセルロースフィルター上に移した後、ＲＩ（ラジ
オアイソトープ）で標識のプローブとの間でハイブリダ
イゼーションを行い、上記泳動画分の反応像をラジオオ
ートグラフィーにより解析する。
【００１９】組換えＶＺＶ抗原の測定、検出及び同定：
組換えＶＺＶ培養により生産されるウイルス粒子や各種
抗原の測定、検出及び同定は、免疫学や血清診断で常用
されている公知の方法、例えば、抗体でコートした赤血
球をもちいるＲＰＨＡ（逆受身赤血球凝集反応）法、酵
素で標識した抗体を使用するＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体
免疫アッセイ）又はＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＲＩ
で標識した抗体を用いるＲＩＡ（ラジオ免疫アッセ
イ）、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈ
ｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識した抗体で感染細胞を染色
し蛍光顕微鏡下で抗原の存在を判定する免疫蛍光法、ま
た、ＲＩ標識した培地成分を添加混合の培地中で組換え
ＶＺＶを培養し調製したＲＩ標識抗原と予め作製した抗
体との間の免疫沈降反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動）にかけ分子量の大きさ
により分画の後、その泳動像をオートラジオグフィーで
解析する免疫沈降法等の採用が可能である。尚、この工
程を簡略化するため、市販されている種々の測定キット
を使用できる。また、抗原密度は、公知の常法、例え
ば、密度勾配平衡遠心法により測定できる。抗原粒子の
形状は、電子顕微鏡で観察できる。
【００２０】組換えＶＺＶの感染価の測定：公知の常
法、例えば、感染細胞のラウンディングを指標とするＣ
ＰＥ（細胞変性効果）を光学顕微鏡下で判定するＣＰＥ
法；ニュートラルレッドとアガロースを含有の固形培養
培地を重層した感染細胞の培養により形成される各プラ
ークを１単位とするＰＦＵ（プラーク形成単位）を肉眼
で数えるプラークアッセイ；ホルマリンで固定した感染
細胞をメチレンブルー溶液で染色しＰＦＵを肉眼で数え
るプラークアッセイ；感染細胞が形成するフォーカスの
数、ＦＦＵ（フォーカス形成単位）を光学顕微鏡下で計
数するフォーカス法；等を採用できる。
【００２１】組換えＶＺＶのクローニング：公知の常
法、例えば、感染細胞のクローニングにはフォーカス
法、組換えＶＺＶのクローニングにはプラークアッセイ
が採用できる。フォーカスやプラークの採取には、ガラ
ス製、プラスチック製、金属製等の円筒細管ないしはシ
リンダーを使用できる。クローニングした感染細胞や組
換えＶＺＶは、クローン毎に新鮮な細胞培養に接種し、
ウイルスを培養する。
【００２２】組換えＶＺＶ免疫原性の判定：組換えＶＺ
Ｖを含有の溶液をサル、ウサギ、モルモット、マウス等
の実験小動物の皮下に接種の後、これ等の免疫動物を飼
育管理する。斯かる飼育の間、ウイルス接種後、週又は
月単位で一定期間毎に、例えば、モルモットの場合に
は、その大腿部静脈から約３ｍｌの部分採血を行い、そ
の血中抗体価を測定する。抗体価の測定には、免疫学や
血清診断で常用されている公知の方法、例えば、免疫に
使用した抗原でコートした赤血球を用いるＰＨＡ（受身
赤血球凝集反応）法、既知の一定量の感染ウイルスとそ
の抗血清との間で抗原抗体反応させた後、その感染ウイ
ルス量を５０％中和減少させる抗血清の最高希釈倍数
を、ＣＰＥ法やプラークアッセイにより測定する中和試
験法等を採用できる。
【００２３】組換えＶＺＶを有効成分として含有する生
ワクチンの製造：ヒト２倍体細胞培養を用いて組換えＶ
ＺＶを培養の後、その培養物を、例えば、遠心法により
精製し、組換えＶＺＶ画分を採取する。これにワクチン
安定化剤としてアミノ酸や糖類等の溶液を添加混合て
し、生ワクチン１ドーズ当たりのウイルス含量が１，０
００ＰＦＵ以上になるよう希釈調整し、生ワクチンを製
造する。生ワクチンは、その一部サンプルにつき、厚生
省告示第１９５号に規定の生物学的製剤基準（１９８９
年）、例えば、「乾燥弱毒生水痘ワクチン」、「組換え
沈降Ｂ型肝炎ワクチン（酵母由来）」等に準拠して、安
全性、有効性及び均質性に関する各種試験検定を行い、
そのワクチンとしての適格性を確認・確定の後、使用に
供する。乾燥ワクチンは、約３−３０ｍｌ容のバイヤル
瓶又はアンプル中で凍結乾燥され、気密密閉の状態で提
供され、５℃以下に保存する。斯かるワクチンの使用
は、これに添付の使用書の記載に従い、使用直前に滅菌
蒸留水で乾燥内容物を完全に再溶解した後、例えば、１
ドーズ、０．５ｍｌを皮下に接種する。
【００２４】組換えＶＺＶ抗原を有効成分として含有す
る診断剤の製造：ヒト２倍体細胞培養を用いて組換えＶ
ＺＶを培養の後、その培養物を、例えば、遠心法により
精製し、組換えＶＺＶ抗原画分を採取する。その抗原
を、例えば、ホルマリン、５６℃で加熱等により不活化
した後、抗原蛋白量が１−１０μｇ／ｍｌになるよう、
例えば、ＰＢＳで希釈調整し、診断剤を調製する。斯か
る抗原は、２−５０ｍｌ容のバイヤル瓶又はアンプル中
で密閉され、液状又は乾燥の状態で提供される。斯かる
抗原は、これに添付の使用書の記載に従い、種々の血清
診断、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＰＨＡ等の抗原として、ま
た、抗体の作製に使用できる。尚、乾燥製品の場合に
は、蒸留水で乾燥内容物を完全に再溶解して用いる。以
下、本発明の具体例につき、参考例及び実施例をあげて
説明する。但し、本発明は、斯かる参考例及び実施例に
のみ限定されるものではない。
【００２５】
【参考例】
参考例１ 細胞培養：ヒト２倍体繊維芽細胞、ＭＲＣ−５を３７℃
で培養する。基礎培地としてＭＥＭ培地［Ｇｉｂｃｏ社
（米国）製］を使用する。尚、該基礎培地は使用直前に
７％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３水溶液を添加混合し、増殖
培地はｐＨ７．４、維持培地はｐＨ７．８に各々調整す
る。次いで、市販のウシ胎児血清を最終濃度が、増殖培
地では１０％（ｖ／ｖ）、また、維持培地では３％（ｖ
／ｖ）になるよう追加混合し使用する。
【００２６】参考例２ ＶＺＶ培養：参考例１で得たＭＲＣ−５細胞培養に、Ｖ
ＺＶ岡株（ＡＴＣＣＶＲ−７９５）シードウイルスをＭ
ＯＩ（感染多重度）０．０１にて接種の後、３７℃で３
日間，培養する。培地には、参考例１に記載の維持培地
を使用する。ＶＺＶ培養の間、ＶＺＶの増殖に伴い感染
細胞領域が次第に広がる。ＶＺＶ感染細胞は、検鏡下で
ラウンディングを呈し、いわゆる、ＣＰＥ（細胞変性効
果）として検出できる。従って、斯かるＣＰＥに基づく
感染細胞の広がりを検鏡下で観察することにより、ＶＺ
Ｖ増殖の程度を判定できる。ＣＰＥが細胞培養モノシー
ト全域で認められる時点で、ＶＺＶ培養を終了する。
【００２７】参考例３ 生水痘ワクチン株の培養：生水痘ワクチン株である岡株
（ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｓｅｒ
ｉｅｓ，Ｎｏ．７２５，ｐｐ．１０２−１２４，１９８
５）シードウイルスを、参考例２の記載と同様の要領で
培養する。培養容器として、培養面積２１０ｃｍ２のル
ー瓶５本を使用する。
【００２８】参考例４ ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）の調製：ＮａＣｌを８．
０ｇ、ＫＣＩを０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ
を２．９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ、ＣａＣｌ２を
０．１ｇ、及びＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを０．１ｇ、蒸留
水に溶解して１，０００ｍｌにし、ＰＢＳを調製する。
また、２価のイオン、ＣａＣｌ２とＭｇＣｌ２・６Ｈ２
Ｏとを含まないＰＢＳ（−）も別途に調製する。
【００２９】
【実施例】
実施例１ ＶＺＶゲノムＤＮＡの抽出と調製：参考例３で得た岡水
痘ワクチン株の感染細胞を採取する。即ち、ウイルス培
養終了後、培養液を捨て、０．１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ
−２ＮａのＰＢＳ（−）溶液を１６ｍｌ、各ルー瓶に添
加し感染細胞をルー瓶の内壁面から剥離させた後、これ
等をプールする。次に、３，０００ｒｐｍ、１０分間、
室温で遠心し、感染細胞のペレットを採取する。これ
に、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０［ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社（英国）製］及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎ
ａを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を
３ｍｌを添加し細胞を浮遊させ、室温で３０分間静置し
て細胞を溶解させる。次いで、細胞破片を除去するた
め、３，０００ｇ、２０分間、４℃で遠心し、その上清
を採取する。この操作を３回繰り返し行い、採取した各
上清をプールする。次いで、この上清を、ＳＷ２７ロー
ター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社［米
国］製）にて２７，０００ｒｐｍ、１時間、４℃で遠心
し、ペレットを採取する。そのペレットを、２ｍｌのＴ
Ｅ液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１
ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ］に浮遊させた後、これにＶＺ
Ｖ粒子可溶化液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０），１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ
−２Ｎａ，２００μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｋ，１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ］２ｍｌを添加
混合し、３７℃で一夜、反応させる。反応終了後、等量
の水飽和フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコ
ール（１：１：１）混合液で２回、ＤＮＡの抽出を行
い、水層を採取する。次に、この水層に２倍量の冷エタ
ノールを添加混合の後、−２０℃で一夜、静置しＤＮＡ
を沈殿させる。このＤＮＡは、遠心により回収の後、上
記のＴＥ液２ｍｌに再浮遊し、ＶＺＶゲノムＤＮＡとし
て、爾後の使用に供する。尚、ＤＮＡの濃度は、吸光度
ＯＤ２６０により決定する。
【００３０】実施例２ ＨＢＶのｐｒｅＳ２及びＨＢｓの遺伝子ＤＮＡ断片の調
製：ＨＢＶの亜型ａｄｒ株のｐｒｅＳｌ−ｐｒｅＳ２−
ＨＢｓ遺伝子がｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトにクロ
ーニングされたプラスミドｐＭ１Ｂ１１（特開昭６３−
２２０９８）を制限酵素ＨｐａＩＩで消化する。次い
で、これを０．５％（ｗ／ｖ）アカロースゲル電気泳動
にかけ、ＨｐａＩＩ断片を回収の後、Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼにより両末端を平滑末端にする（図１）。
【００３１】実施例３ ＶＺＶのｔｋ遺伝子ＤＮＡのクローニング：実施例１で
得たＶＺＶゲノムＤＮＡを、制限酵素ＳａｃＩで消化
し、これを０．５％（ｗ／ｖ）アカロースゲル電気泳動
にかけ、Ｈ断片（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，２９，
３０１−３１０，１９８８）を回収する。このＤＮＡ断
片を、ＳａｃＩで開裂したプラスミドｐＵＣ１２（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１０１
巻，２０−７８ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
［米国］１９８３年発行）に挿入連係の後、大腸菌ＪＭ
１０９株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３３２３）に移入し、形
質転換させることにより、プラスミドｐＵＣ１２−ｔｋ
を作製する。更に、ｐＵＣ１２−ｔｋを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＦｏｋＩで消化の後、１．０％（ｗ／ｖ）アカロ
ースゲル電気泳動により回収したＥｃｏＲＩ−ＦｏｋＩ
断片を再度、ｐＵＣ１２にクローニングし、プラスミド
ｐＥＦ６を得た（図１）。
【００３２】実施例４ 組換えＶＺＶ作製用のキメラ・プラスミドの構築：実施
例２で調製のＨｐａＩＩ断片を、実施例３で得たｐＥＦ
６のｔｋ遺伝子のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入連係の後、
これを大腸菌ＪＭ１０９株に移入し形質転換させること
により、キメラ・プラスミドｐＨＨを得た（図１）。ま
た、ＨＢＶ遺伝子ＤＮＡ断片の挿入連係部位の塩基配列
を、７−ＤＥＡＺＡシークエンスキット（宝酒造社製；
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４，
１３１９，１９８８）を用いて決定する。その結果を２
図に示す。このキメラｐＨＨは、ＨＢＶのｐｒｅＳ２−
ＨＢｓ遺伝子ＤＮＡの１，０８０塩基対断片がＶＺＶ遺
伝子のＳａｃＩ−ＦｏｋＩ断片４．８ｋｂの間に挿入連
係されており、ＶＺＶのｔｋ遺伝子の真性のプロモータ
ーとエンハンサーの機能下で、ＶＺＶｔｋ遺伝子の真性
の開始コドンＡＴＧ（メチオニン）とＨＢＶｐｒｅＳ２
のＴＣＣ（セリン）とが連係した状態で転写かつ翻訳さ
れ、ＶＺＶのｔｋ遺伝子の発現に代わり、ＨＢＶのｐｒ
ｅＳ２の２５個のアミノ酸と全ＨＢｓペプチド両遺伝子
を発現する（図１及び図２）。
【００３３】実施例５ 組換えＶＺＶの作製：実施例１で調製のＶＺＶゲノムＤ
ＮＡ（２．５μｇ／ｍｌ）及び実施例４で作製したキメ
ラプラスミドｐＨＨ（２０μｇ／ｍｌ）を、リン酸カル
シウム法（ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４６５−４６７，
１９７３）により、直径６０ｍｍのプラスチック製シャ
ーレで培養のＭＲＣ−５細胞にコ・トランスフェクショ
ンさせる（図１）。次いで、これを培養し、ＶＺＶゲノ
ムの導入により形成される各ＶＺＶフォーカスから、感
染細胞をシリンダーにより釣り上げる。斯かる感染細胞
をフォーカス毎にそれぞれ、２５ｃｍ３のプラスチ製フ
ラスコに培養のＭＲＣ−５細胞に接種し、増殖させる。
同時に、感染細胞の一部をフォーカス別にそれぞれ、カ
バースリップ上に培養のＭＲＣ−５細胞に接種し増殖さ
せた後、これ等を抗ＨＢｓモノクローナル抗体（ＢＭＬ
社［日本］製）を用いる免疫蛍光法で検鏡する。即ち、
各カバースリップ上の細胞を、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食
塩水）で洗浄の後、冷メタノールと冷アセトンの等量混
合液にて−２０℃で５分間、固定し、脱水させる。次
に、マウスの上記モノクローナル抗体、及びＦＩＴＣで
標識の抗マウスＩｇＧ抗体で染色する。染色済みの各標
本につき、蛍光顕微鏡下で蛍光度を指標としてＨＢｓ抗
原産生の有無と強弱を検定する。その結果、合計３５個
のクローン（Ｃｌ−Ｃ３５）のうち、５個が組換えＶＺ
Ｖ候補クローンとして選定された。組換え率は、１４．
５％であった。また、この検定結果に基づき、上述のフ
ラスコ内で増殖させた感染細胞のうち、各組換えＶＺＶ
候補クローンの感染細胞から、細胞遊離のＶＺＶを調製
する。調製した組換えＶＺＶは、使用に供するまで−７
０℃で保存する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａ
ｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６１，２５５−２６９，１９８
２）。次いで、直径６０ｍｍのプラスチック製シャーレ
に培養のＭＲＣ−５細胞を用いて、上記の組換えＶＺＶ
候補のうち蛍光度が最高の１クローン（Ｃ１７）につき
プラークアッセイを行う。尚、プラークアッセイでは、
基礎培地として１９９培地（Ｄｉｆｃｏ社［米国］製）
を用い、参考例１の記載と同様にして調製した維持培地
に、アガロースを最終濃度が０．８％（ｗ／ｖ）になる
よう添加混合して固型培地を調製する。この培地は、感
染細胞モノシートに重層して用いる。感染培養細胞の染
色は、上記の固形培地にニュートラルレッドを最終濃度
０．０１％（ｗ／ｖ）になるよう添加混合し調製した培
地を更に重層して行う。ウイルス接種は、シャーレ当た
り１〜２個のプーラクが形成されるようＶＺＶ濃度を調
整して行う。また、培養は５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス保温
器内で行い、培養温度等の他の条件は、参考例３と同じ
である。出現したプラークを各々、個別に、シリンダー
で釣り上げることにより、組換えＶＺＶをクローニング
する。得られた組換えＶＺＶのうちの１クローン（Ｃ１
７−５）を、未感染細胞５−１０個に対しクローン感染
細胞１個の割合で接種し、細胞から細胞へ１０代継代す
る。そして、継代第１０代の各感染細胞培養からそれぞ
れ、細胞遊離の組換えＶＺＶを調製する。これ等の組換
えＶＺＶにつき、上述と同様に免疫蛍光法で検定し厳選
した結果、ＨＢｓ抗原を産生する細胞遊離の組換えＶＺ
Ｖ（図１）を２０クローン分離した。これ等のクローン
をｒＶＨ岡株シリーズとし、このシリーズを構成する２
０株について、ｒＶＨ１岡株、ｒＶＨ２岡株、ｒＶＨ３
岡株の要領で以下順次、ｒＶＨ４岡株からｒＶＨ２０岡
株まで命名した。また、これ等の２０株では全て、同程
度のＨＢｓ抗原の産生が確認されたため、斯かる組換え
ＶＺＶによるＨＢｓ抗原の産生はいずれも、ウイルス継
代下で遺伝学的に安定かつ良好であると判断される。以
下の実施例では、ｒＶＨ岡株シリーズ中の組換えＶＺＶ
株の代表例として、ｒＶＨ７岡株を使用する。尚、ｒＶ
Ｈ７岡株の親株は、参考例３及び実施例１に記載の通
り、弱毒ＶＺＶの岡水痘生ワクチン株である。
【００３４】実施例６ 組換えＶＺＶ遺伝子ＤＮＡの制限酵素解析：ザザン・ブ
ロツト法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，９８，５０３，１９７５）により行
う。ＶＺＶの親株と組換え株の各ゲノムＤＮＡを実施例
１の記載と同様にして抽出調製の後、各ＤＮＡを制限酵
素ＳａｃＩ（ＳｓｔＩ）で消化して得られるＤＮＡ断片
を、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動で分画
し、泳動済みのゲルをエチジウムブロマイドで染色す
る。次いで、このゲルにニトロセルロースフィルターを
重ね、各ＤＮＡ分画を該フィルターに移し、ＲＩで標識
のプローブによるハイブリダイゼーションを行った後、
ラジオオートグラフィーにかける。尚、プローブとし
て、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識したｐＭ１Ｂ１１及
びｐＨＨの各ＤＮＡを使用する。その結果、親株では本
来のＳａｃＩ−Ｈ断片が、また、組換え株ではＳａｃＩ
−Ｈ′断片がそれぞれ検出された。そのため、ＳａｃＩ
−Ｈ断片はＶＺＶｔｋ遺伝子を含み、組換え株のＨＢｓ
とｔｋ両遺伝子領域にはＳａｃＩサイトがないことを考
慮すると、親株のＳａｃＩ−Ｈ断片が、組換え株ではＳ
ａｃＩ−Ｈ′断片にシフトしたと考えられる。また、親
株のＳａｃＩ−Ｈ断片はｐＨＨプローブだけと反応する
のに対し、組換え株のＳａｃＩ−Ｈ′断片はｐＭ１Ｂ１
１及びｐＨＨ両プローブとそれぞれハイブリダイゼーシ
ョンするため、組換えＶＺＶゲノムのｔｋ遺伝子にはＨ
Ｂｓ遺伝子が挿入されていると判定される。
【００３５】実施例７ ＶＺＶ組換え株の感染細胞で産生されるＨＢｓ抗原の検
出と同定：実施例５で得たｒＶＨ７岡株を、培養面積１
５０ｃｍ２のプスチック製フラスコ５本を用いて、参考
例２に記載と同様にして培養する。その培養上清をプー
ルし、３，０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心する。
感染細胞を、培養フラスコ内壁面からラバーポリースマ
ンで剥離の後、ＰＢＳに浮遊させる。 （１）ＨＢｓ抗原の産生量の測定：上記の遠心上清３５
ｍｌを、更に、２７，０００ｒｐｍで３時間、４℃で遠
心し、ペレットを採取し、これを０．２ｍｌのＰＢＳに
懸濁し、組換え株培養上清画分とする。一方、上記の感
染細胞約１０６個を１ｍｌのＰＢＳに浮遊させ、超音波
（２０ ＫＨｚ，１５０ｍＡ，４秒）で細胞を破壊の
後、３，０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心し、その
上清を採取し、組換え株感染細胞画分とする。両画分に
ついて、抗ＨＢｓ血清でコートした細胞を用いるＲＰＨ
Ａ（逆受身赤血球凝集反応）試験により、ＨＢｓ抗原価
を測定する。ＲＰＨＡには市販の試験キット（ミドリ十
字製）を使用する。また、比較対照として、上記と同様
に約１０６個の細胞から調製した未感染細胞画分及び親
株感染細胞画分、並びに酵母で生産したＨＢｓ抗原（特
開昭６３−２２０９８）をそれぞれ用いる。尚、これ等
の検体は、２倍階段希釈し、測定する。その結果を表１
に示す。表１から、ＶＺＶ組換え株の培養によるＨＢｓ
の産生量は、感染細胞画分では１０μｇ／ｍｌ、培養上
清画分では４μｇ／ｍｌ（濃縮前の、もとの培養上清で
は２３ｎｇ／ｍｌ）であると算出推定される。
【００３６】
【００３７】（２）ＨＢｓ抗原の免疫蛍光法による検
出：実施例５に記載のＨＢｓ抗原のモノクローナル抗体
を用いる免疫蛍光法により、上記の組換え株感染細胞で
のＨＢｓ抗原産生の有無を検定する。その結果、感染細
胞質内でのＨＢｓ抗原の産生が確認された。
【００３８】（３）培養上清のＨＢｓ抗原の電子顕微鏡
による確認：上記の培養上清を５，０００ｒｐｍで２０
分間、遠心の後、その上清にＰＥＧ（ポリエチレングリ
コール）６０００を最終濃度が１０％（ｗ／ｖ）になる
よう添加混合し、沈殿物を形成させる。次いで、低速遠
心により回収した沈殿物ペレットをＴＥＮ液［２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ
−２Ｎａ，１５０ｍＭＮａＣｌ］に浮遊させた後、この
浮遊液を、ＳＷ２７ローターを用いるＣｓＣｌ密度勾配
平衡遠心に２回かける。尚、遠心カラムとして密度１．
１５、１．２５及び１．４ｇ／ｃｍ３からなる不連続勾
配を使用し、このカラムに沈殿物浮遊液を重層の後、２
３，０００ｒｐｍ、２０時間、４℃で遠心する。遠心終
了後、カラムを分画し、ＨＢｓ抗原画分を、上述のＲＰ
ＨＡ試験により決定する。これより得られたＨＢｓ抗原
画分は、ＴＥＮ液と混合し、ＣｓＣｌで密度を１．２ｇ
／ｍ３に調整の後、更に、ＳＷ４１ローターにて、３
３，０００ｒｐｍ、４０時間、４℃で遠心する。遠心終
了後、カラムを分画し、ＨＢｓ抗原画分を採取して希釈
し、これを１０％（ｗ／ｖ）蔗糖クッションの上に重層
の後、ＳＷ４１ローターにて、４０，０００ｒｐｍで３
時間、４℃で遠心する。そのペレットを、ＰＢＳに浮遊
させ、電子顕微鏡で観察する。その結果、最終の精製Ｈ
Ｂｓ画分には、多数の直径２０−３０ｎｍの粒子が検出
された。この結果から、粒子状のＨＢｓ抗原が、感染細
胞から分泌されていると判断される。
【００３９】（４）培養上清のＨＢｓ抗原の密度の測
定：上記の電子顕微鏡による観察で用いた精製ＨＢｓ画
分の一部を、ＳＷ４１ローターにて、３３，０００ｒｐ
ｍ、４℃で４０時間、密度１．２ｇ／ｃｍ３のＣｓＣｌ
密度勾配平衡遠心にて分画する。各画分の体積と重量を
測定し密度を算出すると共に、そのＨＢｓ抗原価をＲＰ
ＨＡ試験で測定する。その結果、ＨＢｓ活性のピークを
示す精製ＨＢｓ画分の密度は、１．２０ｇ／ｃｍ３であ
った（図３）。
【００４０】実施例８ ＶＺＶ組換え株のＶＺＶ及びＨＢｓ両抗原の同定：参考
例１の記載と同様して、直径１００ｍｍのシャーレ３枚
にＭＲＣ−５細胞を培養する。その１枚にはｒＶＨ７岡
株を、他の１枚にはその親株をそれぞれ接種する。残り
１枚の細胞培養は、ウイルスを接種せず、対照抗原の調
製に用いる。そして、これ等の各細胞を、メチオニンを
含有しないＭＥＭ培地に５０μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］
メチオニンとシスティンを添加し調製した基礎培地を用
いて、参考例２の記載と同様に４時間、培養を行う。次
いで、各細胞を剥離し、ＲＩＰＡ緩衝液［２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，及び１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈ
ｙｌ ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｒｕｏｒｉｄｅ］で細胞溶
解の後、３５，０００ｒｐｍで１時間、遠心し、その上
清を採取する。また、培養上清は、３，０００ｒｐｍで
２０分間、遠心し、その上清を採取する。得られた６種
の上清の各々は、抗ＶＺＶモルモツト血清（Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，１５６，４２３−４２６，１９８７）と混合
し、免疫沈降反応させる。各反応系で形成された免疫複
合体は、プロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂ［ファー
マシアＬＫＢ（スウェーデン）製］のカラムクロマトグ
ラフィーにより、それぞれ分離する。ＨＢｓ抗原（特開
昭６３−２２０９８）を用いて作製した抗ＨＢｓウサギ
血清と上記６種の上清と間でも、上記と同様に各免疫複
合体を形成させ、これを分離する。次いで、これ等の免
疫複合体をそれぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した
後、ラジオオートグラフィーを行う。その結果、ＶＺＶ
ポリペプドは、親株及び組換え株の両感染細胞において
同様に検出された。しかし、分子量が２６Ｋと３０Ｋの
両ＨＢｓ抗原は、組換え株の感染細胞内だけに検出され
た。また、これ等の２６Ｋと３０Ｋ両抗原とは対照的
に、組換え株の培養上清では、実施例７に記載の組換え
株の感染細胞が分泌するＨＢｓ抗原が、３０Ｋと３５Ｋ
の両ポリペプチドとして同定された。このことから、感
染細胞内で合成された２６Ｋと３０ＫのＨＢｓ抗原は、
その培養上清に分泌される間に、修飾とプロセッシング
を受け３０Ｋと３５ＫのＨＢｓ抗原になると判定され
る。
【００４１】実施例９ 組換えＶＺＶを有効成分とする生ワクチンの製造：培養
面積２１０ｃｍ２のルー瓶２０本のＭＲＣ−５細胞培養
に、実施例５で得たｒＶＨ７岡株シードウイルスを接種
の後、参考例３の記載と同様にして培養する。培養終了
後、培養液を捨て、各ルー瓶内の感染細胞を２００ｍｌ
のＰＢＳ（−）にて２回洗浄する。次いで、２０ｍｌの
０．０３％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ−３Ｎａを各ルー瓶内の
感染細胞に重層し、細胞をルー瓶内壁面から剥離させ浮
遊させる。各ルー瓶内の感染細胞浮遊液をプールし、
２，０００ｒｐｍにて１０分間、４℃で遠心し、感染細
胞のペレットを採取する。これを１００ｍｌのＰＢＳ
（−）に再浮遊の後、凍結融解を１回、行う。次に、氷
水浴中で超音波処理（２０ＫＨｚ，１５０ｍＡ，０．３
秒／ｍｌ）した後、３，０００ｒｐｍで２０分間、４℃
で遠心し、細胞遊離ウイルスを含有の上清を採取し、こ
れを生ワクチン原液とする。この原液から検定用として
３０ｍｌをサンプリングし、残りの原液７０ｍｌに、Ｐ
ＢＳ（−）に溶解したサッカロース及びゼラチン加水分
解物をワクチン安定化剤として最終濃度が５％（ｗ／
ｖ）及び２．５％（ｗ／ｖ）になるよう添加混合し、１
４０ｍｌの生ワクチン最終バルクを調製する。この最終
バルクから検定用として３０ｍｌをサンプリングの後、
残りバルクを３ｍｌ容のバイヤル瓶に０．５ｍｌずつ分
注し、凍結乾燥の後、窒素ガスを充填しゴム栓で封をし
バイヤル瓶内部を気密密閉する。この生ワクチン小分品
は、４℃で保存し、使用の直前に注射用蒸留水０．５ｍ
ｌを添加し乾燥内容物を完全に溶解し用いる。一方、サ
ンプリングした上記のワクチン原液と最終バルク、及び
小分品２０本につき、検定試験を行う。斯かる検定試験
は、安全性、有効性及び均質姓を確認し、生ワクチンと
しての適格性を確定するため、厚生省告示第１９５号に
規定の生物学的製剤基準（１９８９年）「乾燥弱毒生水
痘ワクチン」に準拠し、かつ、同じく規定の基準「組換
え沈降Ｂ型肝炎ワクチン（酵母由来）」をも考慮し、実
施する。斯かる検定試験の結果、上記の小分品は、その
ウイルス含量が２×１０４ＰＦＵ（プラーク形成単位）
／０．５ｍｌであり、かつ、上記基準に規定の各種試験
に合格したため、適格性を備えた生ワクチンとして爾後
の使用に供する。
【００４２】実施例１０ 診断剤用の組換えＶＺＶ抗原の製造：培養面積２１０ｃ
ｍ２のルー瓶２０本のＭＲＣ−５細胞培養に、実施例５
で得たｒＶＨ７岡株シードウイルスを接種し、参考例３
の記載と同様にして培養する。１日間培養の後、各ルー
瓶の培養液を捨て、各ルー瓶内の感染細胞を２００ｍｌ
のＰＢＳにて２回洗浄する。次いで、フェーノレッドを
抜いた１９９培地［Ｄｉｆｃｏ社（米国）製］を各ルー
瓶に注入し、更に３日間、３７℃で培養を続ける。培養
終了後、各ルー瓶から培養液を採取し、プールする。こ
れを３，０００ｒｐｍにて２０分間遠心し、その上清を
ミニタン限外濾過機ＭＷ１００００［ミリポア（米国）
製］で、体積を１／２０に濃縮する。次に、この濃縮液
を５６℃で３０分間加熱し、ウイルスを不活化する。得
られた不活化濃縮液中の組換えＶＺＶの抗原蛋白含量が
５μｇ／ｍｌになるようＰＢＳで希釈調整し、これを３
ｍｌ容のアンプルに２ｍｌずつ分注の後、熔封し、水痘
及びＢ型肝炎の診断剤として使用に供する。
【００４３】実施例１１ 組換えＶＺＶを有効成分とする組換え生ワクチンの免疫
原性の判定：実施例９で製造した組換え株生ワクチンの
免疫原性を、モルモットを用いて測定する。比較対照と
して、親株生ワクチンである市販の乾燥弱毒生水痘ワク
チン（財団法人阪大微生物病研究会製）、組換え沈降Ｂ
型肝炎ワクチン［特開昭６３−２２０９８よる製造、及
びメルク社（米国）製の両ワクチン］、ＭＲＣ−５未感
染細胞から実施例９と同様の工程を経て調製した対照抗
原の合計５種を使用する。これ等の各ワクチンを３週令
の平均体重２５０ｇのモルモット３匹にそれぞれ皮下接
種する。ワクチン接種は、接種量が組換え株及び親株両
生ワクチンでは、３，０００ＰＦＵ又は２，０００ＰＦ
Ｕ／モルモットになるよう各ワクチンをＰＢＳ（−）で
希釈調整して行う。上記のＢ型肝炎両ワクチンは、ＨＢ
ｓ抗原量１０μｇ／モルモットを接種する。そして、ワ
クチン接種後、４、６及び８週目に、各被接種モルモッ
トの大腿部静脈から部分採血し、その血中抗体価を測定
する。抗体価の測定には、ＶＺＶでは中和試験法（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ ＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，
６１，２５５−２６９，１９８２）を、ＨＢｓではＨＢ
ｓ抗原をコートした細胞を用いるＰＨＡ（受身赤血球凝
集反応）試験キツト（化学及血清療法研究所製）をそれ
ぞれ採用する。その結果を表２及び表３に示す。親株及
び組換え株の両ワクチンは共にＶＺＶ抗体を同レベルに
誘導した。しかし、ＨＢｓ抗体は組換え株ワクチン接種
だけに検出された（表２）。更に、組換え株ワクチンの
ＨＢｓに対する免疫原性は、市販のＢ型肝炎ワクチンと
同じであった（表３）。組換え株ワクチンが保有の、Ｖ
ＺＶ及びＨＢｓ両抗原に対する免疫原性は共に良好であ
ると判定される。
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【発明の効果】
（１）多価生ワクチンの提供：本発明により提供される
組換えＶＺＶ株はＶＺＶ遺伝子と１種以上の外来遺伝子
とを同時に発現する弱毒ウイルスであり、しかも、その
各発現産物は現行のワクチン抗原と同等の免疫原性を保
有しており、また、その発現能はウイルス継代下で遺伝
学的に安定かつ良好であり、更に、この組換えＶＺＶは
生ワクチン株としての安全性と有効性とを兼備している
ため、従来の混合又は不活化ワクチンに代わる多価生ワ
クチン又は多機能生ワクチンの有効成分として実用に供
することができる。 （２）不活化ワクチン抗原の生ワクチンへの変換：従
来、迷入因子混入の危険性、培養、精製等に係る技術的
制約のため、体液性免疫のみを誘導し、その免疫の持続
性の不良が公知であるにも拘らず、不活化ワクチンとし
てしか実用化され得ない抗原を、体液性と細胞性の両免
疫を誘導し、その増強された免疫効果が良好に永続する
生ワクチンに変換し提供することを可能にする。 （３）混合ワクチンの製造コストの低減：従来の混合ワ
クチンは、各ワクチン成分を個別に調製の後、これ等を
混合し製造されたものである。本発明によれば、２種以
上の相互に異種の抗原を、組換えＶＺＶを１回培養する
ことにより、同時に製造できるため、ワクチンの製造コ
ストが極度に低減される。 （４）本発明により、ＨＢＶ、ＮＡＮＢＶ等の培養や量
産が困難な種々の病原体抗原の大量生産が可能になる。 （５）バイオハザードの確率の高い病原体抗原を安全に
製造できる。 （６）本発明による組換えＶＺＶ抗原は、相異なる２種
以上の抗原を有するため、これ等の２種以上の病原体を
１度に判定できる多価診断剤としても有用である。ま
た、該組換えＶＺＶ遺伝子ＤＮＡは、２種以上の異種遺
伝子ＤＮＡからなるキメラプローブとして遺伝子診断に
利用できる。 （７）ＷＨＯのＥＰＩ（免疫拡大計画）に寄与：以上に
加え、ＷＨＯが提唱の混合又は多価ワクチン使用による
接種と被接種両者間での省力化に基づく予防接種の普及
を考慮すると、本発明が、ワクチン製造、防疫と衛生行
政、臨床検査、個人の予防接種等における経済性と省力
化の確保に寄与すると共に、更には、予防接種の普及と
促進の布石となる免疫効果の改善と増強の側面から人類
に多大の福音をもたらすことは明らかである。
【００４７】
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えＶＺＶ構築の順序を示した説明図であ
る。
【図２】ＶＺＶｔｋ遺伝子とＨＢＶｐｒｅＳ２−ＨＢｓ
遺伝子の連係部位のＤＮＡ塩基配列とその由来を示した
説明図である。
【図３】組換えＶＺＶの培養液中に分泌されるＨＢｓ抗
原画分を、更に、ＣｓＣｌ密度勾配平衡遠心法により分
画したＨＢｓ抗原各画分のＨＢｓ活性と密度を示す測定
図である。
【手続補正書】
【提出日】平成４年４月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 組換え水痘ウイルスとその作製法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換え水痘ウイルスとそ
の作製法に関するものであり、これより得られる組換え
水痘ウイルスとその抗原並びにゲノムＤＮＡは、ワクチ
ン、免疫学的診断剤、遺伝子診断剤、遺伝子工学試薬等
として利用できる。
【０００２】
【従来の技術】ウイルス遺伝子に外来遺伝子又は異種遺
伝子を挿入連係することにより組換えウイルスを作成す
る技術、即ち、ウイルスゲノムをクローニングおよび／
または発現ベクターとして用いる技術は１９７９年頃か
ら、例えば、ＳＶ４０ベクターによるウサギβ−グロビ
ンの生産［ Nature (London), 227, 108-114, 1979; 同
上，278, 35-40, 1979］等におてい散見される。そし
て、１９８０年、ＷＨＯ（世界保健機構）総会が、ワク
チンの成果に基づく世界天然痘根絶を宣言し、種痘の廃
止を勧告して以来、種痘の有効成分である弱毒ウイルス
としてのワクチニアウイルスの有効利用が世界的に注目
かつ再評価されている状況下で、該ウイルスゲノムを外
来遺伝子のクローニング及び発現ベクターとして利用す
ることを目的として作出した組換えワクチニアウイルス
が報告された［Proceedings of National Academy of S
ciences (USA),79, 4927-4931,1982; 同上，79, 7415-7
419, 1982 。更に、ＷＨＯ特別諮問グループは、ワクチ
ニアウイルス等のウイルスベクターを用いる組換えウイ
ルスワクチンの研究促進計画を採択した［ Nature (Lon
don), 312, 299, 1984 。このＷＨＯの提唱は、下記を
示唆するものである：従来使用のプラスミドベクター、
ファージベクター、コスミッドベクター等の宿主域は、
主に細菌や酵母等であり、狭いため、斯かる欠点を解消
する目的で高等動物細胞を宿主とする広宿主域のウイル
スベクター、例えば、ワクチニアウイルスベクターを開
発する；２種以上の異種抗原や異種ウイルス等の混合か
らなる従来の混合ワクチンに代わるものとして、ワクチ
ニアウイルスゲノムに２種以上の外来遺伝子を挿入連係
して作製した組換えウイルスを有効成分として用いる多
価ワクチンを開発する等。上述のＷＨＯの宣言や提唱を
契機として、現在、種々のウイルスベクターに関する基
礎研究や開発が各方面で精力的に展開され、既に膨大な
データが蓄積されている。すなわち、このようなウイル
スベクターとして、パピローマ、ポリオーマ、アデノ、
ワクチニア、レトロ、バキュロ、単純ヘルペス、マレッ
ク病、水痘、パルボ、カリフラワーモザイク、タバコモ
ザイク、トマトゴールデンモザイク等の各ウイルスゲノ
ムが、既に知られている［ウイルス，36,1-41,1986; 同
上，37,1-40,1987; “Current Communication in Molec
ular Biology: Viral Vector”,1-198ページ， Y.Gluzm
an 及び S.H.Hughes 編，Cold Spring Harbor Laborat
ory (USA) 1988年発行; 欧州公開公報第 334530 号］。
特にここでは、上記ウイルスベクターのうち、本発明に
関連した水痘ウイスル（以下ＶＺＶと略記する）ベクタ
ーについて、以下に説明する。
【０００３】ＶＺＶは通常その感染性が生細胞内でのみ
維持される細胞依存性ウイルス（ cell-associated vir
us) であり、該ウイルスの分離、試験管内での培養・継
代、及び量産はいずれも困難であるため、ＶＺＶワクチ
ン及び診断剤の開発は言うに及ばず、水痘の病原体とし
てのＶＺＶの基礎及び臨床研究は躊躇される傾向にあっ
た。そのため、ＶＺＶの研究は、本発明者らが1975年に
細胞遊離（cell-free）の、水痘生ワクチン用の弱毒Ｖ
ＺＶ岡株を確立するまで、遅々として進展していなかっ
た（ Biken Journal, 23, 53-55, 1975; 特公昭51-190
18; 特公昭 53-41292;特公昭56-42144）。しかし、上記
の弱毒ＶＺＶ岡株を用いる生ワクチンの開発が契機とな
り、爾来、世界各地でＶＺＶの基礎と臨床並びに応用研
究が急速に展開され、現在では、この弱毒ＶＺＶ岡株を
有効成分として用いる水痘生ワクチンが世界各国で広く
実用に供されている［Requirements for Varicella Vac
cine (Live) Adopted 1984: WHO Technical Report Ser
ies, No.725, pp.102-124,1985 。また、ＶＺＶの基
礎、臨床、診断、疫学等に係る膨大なデータも既に蓄積
されており［“Virology”，vol.2, pp.2011-2054, B.
N. Fieldsら編，RavenPress (USA) 1990年発行］、就
中、ＶＺＶゲノムの構造解析に関しては、１９８０年代
に入り、遺伝子のクローニングとその発現、モノクロー
ナル抗体等の技術の開発と普及に伴い、ＶＺＶゲノムＤ
ＮＡの制限酵素地図作成や全塩基配列決定等（Journal
of Genaral Virology, 67, 1759-1816, 1986; 同上， 6
7, 1817-1829, 1986; ウイルス，37, 71-80, 1987 ）に
より、長足の進歩を遂げている。ところで、上記の文献
に基づくＶＺＶに関するウイルス学上の主な知見は次の
通りである。
【０００４】ＶＺＶは、エンベロープを有し、分類学的
には単純ヘルペスウイルス群、即ち、ヘルペスウイルス
科アルファヘルペス亜科に属する直径が約 180-200 nm
のＤＮＡ型ウイルスである。そのゲノムは、約 120 kb
(kilobase)の２本鎖で線状のＤＮＡからなり、ヌクレオ
キャブシド内部の直径約 75 nmのドーナツ状のコアに内
在している。該ゲノムＤＮＡは、ユニークな配列（Ｕ）
の長いセグメント（ＵL）と短いセグメント（ＵS）、Ｕ
Lに隣接するterminal repeat （ＴＲ）配列（ＴＲL）と
ＵSに隣接の配列（ＴＲS）、及びこれ等の各ＴＲに相補
的で塩基配列の方向が逆向きの２つの inverted repeat
（ＩＲ）、すなわちＴＲLに相補的なＩＲL、及びＴＲS
に相補的なＩＲSからなっている。そして、これ等の６
断片は、５´から３´末端の方向に、ＴＲL・ＵL・ＩＲ
L・ＩＲS・ＵS・ＴＲSの順に並んでいる。また、現在、
合計７１個のＯＲＦ(open reading frame)が５´末端か
ら順に１から７１まで番号付けされており、これ等の遺
伝子のうち、機能が確認または推定されているものは次
の２１ＯＲＦである［尚、下記（数字）はＯＲＦ番号を
それぞれ意味する］：(4) 早期蛋白、(8) デオキシウリ
ジントリホスファターゼ、 (10) ｔｒａｎｓ誘導蛋白、
(13)チミジン合成酵素、(14)糖蛋白（以下ｇｐと略記す
る）Ｖ、(18)ポヌクレオチド還元酵素小サブニット、(1
9)ポヌクレオチド還元酵素大サブニット、(28)ＤＮＡ合
成酵素、(29)ＤＮＡ結合蛋白、(31)ｇｐII、(36)チミジ
ンキナーゼ（以下ｔｋと略記する）、(37)ｇｐIII 、(4
0)キャブシド蛋白、(48)エキソヌクレアーゼ、(62, 71)
早期蛋白、(63, 70)早期蛋白、(66)プロティンキナー
ゼ、(67)ｇｐIV、及び(68)ｇｐＩをコードする各遺伝
子。
【０００５】また、ＶＺＶをウイルスベクターとして使
用し作出された組換えＶＺＶについては、下記が公知で
ある：ＶＺＶのｇｐＩ遺伝子プロモーターの下流領域に
外来遺伝子を挿入連係して得た組換えＶＺＶであり、外
来遺伝子がエプスタイン・バーウイスルのｇｐ350 遺伝
子（特開昭 63-12277 又は欧州公開公報第 251534 号；
特開昭 63-141589; Journal of Virology, 61, 1796-18
07, 1987）、外来遺伝子がＢ型肝炎ウイルス（以下ＨＢ
Ｖと略記する）のｐｒｅＳ２及び表面抗原（以下ＨＢｓ
と略記する）遺伝子（特開昭 63-12277 又は欧州公開公
報第 251534 号）であるもの；ＶＺＶのｇｐＩ遺伝子プ
ロモーターの下流にエプスタイン・バーウイスルのｇｐ
350 とｇｐ220 の各遺伝子を連結した遺伝子断片を更に
ＶＺＶのｔｋ遺伝子内に挿入連係し、エプスタイン・バ
ーウイスル遺伝子をｔｋとの融合蛋白として発現させる
よう作製した組換えＶＺＶ［Proceedings of National
Academy of Science USA , 84, 3896-3900, 1987;“UL
CA Symposia on MolecularBiology; New Series, vol.8
4: Technical Advances of Vaccine Development”，p
p. 235-241, R.W. Ellis ら著，Alan R.Liss, Inc. (US
A) 1988年発行］等。しかし、これ等の組換えＶＺＶは
いずれも、免疫原性が低く、しかも、安全性と有効性が
確認されていない。また、斯かるＶＺＶを抗原として用
いワクチンや診断剤を市場に乗せる動きは現在、知られ
ていない。従って、組換えＶＺＶは未だ実用の域には到
達していないと判断される。
【０００６】その理由として、主に以下の事実を挙げる
ことができる。（１）ゲノムの長さが通常、約 10 kbで
ある小型ウイルスに比べ、前述の通り、ＶＺＶは大型で
あり、その感染性ゲノムは約 120 kb と極めて長く、斯
かるＤＮＡ長鎖は切断され易く不安定である；（２）Ｖ
ＺＶは本来、熱に極めて不安定な細胞依存性ウイルスで
あり、その感染性維持には−６０℃以下での保存を必須
とする等、その取扱い、培養、量産等が容易ではない；
（３）ウイルス培養における１細胞当たりの感染性ウイ
ルス粒子生産数に関し、他のウイルスが通常、約 10-10
0 粒子であるのに対し、ＶＺＶの場合は約 0.1個と生産
収率が極めて低い等である。そしてこれらの理由により
ＶＺＶ培養によるゲノムの量産のみならず、試験研究段
階での使用に耐えるＶＺＶ遺伝子ＤＮＡの調製とクロー
ニングは甚だ困難であり、かつ、産業利用上、質と量共
に適格な組換えＶＺＶを選別採取する確率が極めて低
い。換言すれば、組換えＶＺＶ株の確立には、斯かる著
しく困難な条件を克服する必要がある。
【０００７】本発明は、以上の通りの事情に鑑みてなさ
れたものであり、組換えＶＺＶ株の作出に係る上記の困
難を克服し、産業上利用の観点から、量産コストに見合
った遺伝子発現機能を有し、しかも、斯かる発現能が継
代下で遺伝学的に安定であり、かつ、生ワクチンの有効
成分として適格な安全性と有効性を兼備した組換えＶＺ
Ｖ株と、その作製法を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述のＷ
ＨＯの提唱に呼応すると共に、上記の課題を解決するた
め、２０余年にわたり蓄積した独自の経験と知識を糧と
して更に、鋭意試験と試行を重ね、産業上利用とその必
要性の観点から、特に培養と量産の困難なＨＢＶ遺伝子
の発現能と生産量が共に安定で量産に最適の、優れて有
用な組換えＶＺＶ株を確立した。
【０００９】すなわち、本発明は、ＶＺＶの遺伝子プロ
モーターの下流領域に、ＨＢＶゲノムの遺伝子群から選
ばれる１種以上の遺伝子を挿入連係された組換えＶＺＶ
と、その作製法を提供する。さらに本発明は、上記の組
換えＶＺＶのゲノムＤＮＡ、この組換えＶＺＶを含有す
る生ワクチン、この組換えＶＺＶに由来する抗原、およ
びこの抗原を含有する診断剤をも提供する。以下、その
構成につき説明する。
【００１０】ウイルスベクターとしてのＶＺＶ株：本発
明では、安全性、有効性及び均質性を併有する組換え生
ワクチン株の作出を主な目的とすることから、ＶＺＶゲ
ノムをベクターとして使用する。本発明によれば、ＶＺ
Ｖとして、例えば、岡（ATCCVR-795)、Ｗebster（ATCC
VR-916)、Ｅllen（ATCC VR-586)、ＹＳ、ＹＧ、Ｓcot
t、河口、Ｄumas等の既存の公知株（ Journal of Gener
al Virology, 67, 1816-1829,1986; ウイルス，37, 71-
80, 1987 ）の各株や将来分離されるＶＺＶ株等を随意
に使用できる。これ等のＶＺＶ株のうち、試験研究や製
造上での取扱いでの安全性の確保、並びに安全性と有効
性とを兼備した生ワクチンや診断剤の提供等の産業上利
用を考慮すると、弱毒ＶＺＶ株の使用が望ましい。特
に、上記の主目的の観点から、弱毒ＶＺＶ岡株は、水痘
生ワクチン株（ＷＨＯ Technical Report Series, No.7
25, pp.102-124, 1985）として、その安全性と有効性が
世界的に確定かつ公認され、現在、世界のレベルで使用
されている唯一のＤＮＡ型の弱毒ウイルスであるため、
外来遺伝子の発現ベクターとして最適である。
【００１１】ＶＺＶの培養とその細胞の選択：ヒト、サ
ル、モルモット等に由来のＶＺＶ感受性の公知の細胞を
使用できる。これ等の細胞のうち、迷入因子や癌原性因
子の混入の確率、ワクチン用ウイルス株培養の細胞とし
ての適格性、産生ウイルス量等を考慮すると、生ワクチ
ン製造用として公認のヒト２倍体細胞、例えば、ＨＥＬ
２９９（ATCC No.CCL 137)、ＭＲＣ−５（ATCC No.CCL
171 ）、ＷＩ−３８（ATCC No.CCL 75）等の使用が望ま
しい。また、これらの細胞の増殖と維持両培地、及びウ
イルス培養培地として、市販の合成培地、例えば、１９
９培地［Difco社（米国）製］、ＭＥＭ培地［ Gibco社
（米国）製］等を使用できる。斯かる培地は使用直前
に、約 7％(w/v) のＮａＨＣＯ3水溶液を滴下混合して
ｐＨを約 6.8-8.0に調整の後、更に、市販のウシ胎児血
清［例えば、Flow社（米国）製］を最終濃度が約 2-15
％(w/v) になるよう追加して添加混合し、培養に供す
る。ＶＺＶの培養は、予め調製した培養細胞にそのシー
ドウイルスを接種した後、維持培地を用いて行う。培養
温度は 25-40℃、好ましくは、33-38 ℃が推奨される。
【００１２】ＨＢＶ遺伝子を挿入連係するＶＺＶ遺伝子
の選択：本発明によれば、理論的には、前述の７１個の
全てのＶＺＶ遺伝子をそれぞれ、ＨＢＶ遺伝子を挿入連
係する部位として使用できる。尚、斯かる使用上の留意
点として、これ等の各遺伝子のプロモーターが機能でき
るよう、プロモーターの下流を占めるＯＲＦ領域にＨＢ
Ｖ遺伝子を挿入連係すること、及び翻訳が円滑に進行す
るようＶＺＶ遺伝子と外来遺伝子相互のコドンを破壊す
ることなく挿入連係する等をあげることができる。ま
た、一般に、外来遺伝子が挿入連係された遺伝子は破壊
され本来の機能を発揮しなくなることがあるので、ＨＢ
Ｖを連結する遺伝子プロモーターとしては、ウイルスの
感染性や増殖性に影響を及ぼさず、しかも、多量発現能
を有する、プロモーターの強度の強い遺伝子、例えば、
ｔｋ遺伝子やｇｐ遺伝子等の採用が望ましい。特に、弱
毒ＶＺＶ岡株を用いる場合には、前述の７１遺伝子のう
ち、遺伝子１４のｇｐＶ遺伝子の欠損又は発現機能の低
下（Journal of Virology, 64, 4540-4548, 1990）が知
られているため、この遺伝子領域の使用は推奨できな
い。しかし、ＶＺＶ野生株のｇｐＶ遺伝子の使用は可能
であり、そのプロモーターの下流にＨＢＶ遺伝子を挿入
連係することにより、該ｇｐＶをコードする遺伝子領域
の破壊や発現量低下を惹起させることができるので、こ
れより得られる組換えＶＺＶは、弱毒ＶＺＶ岡株に類似
の弱毒株として、極めて高い有用性が期待される。
【００１３】ＶＺＶ遺伝子内に挿入連係するＨＢＶ遺伝
子の選択：本発明によれば、理論的には、ＶＺＶの増殖
性と感染性に支障を来さない範囲内で、ＨＢＶゲノムの
遺伝子群から選ばれる１種以上の遺伝子を外来遺伝子と
して使用できる。但し、組換えＶＺＶの生ワクチン株と
しての使用を考慮し、毒性物質、為害作用物質、毒素等
をコードする遺伝子領域が外来遺伝子中に連座しないよ
う、細心の注意を払う必要がある。例えば、ＨＢＶのｐ
ｒｅＳ１領域と、重合ヒト血清アルブミン・レセプター
であるｐｒｅＳ２の一部領域は共に肝細胞への親和性が
知られているので、斯かる領域をコードする遺伝子の近
傍を外来遺伝子として使用する場合には、該当領域を制
限酵素で開裂除去する必要がある。このようにしてＨＢ
Ｖ遺伝子を挿入連係した弱毒組換えＶＺＶは、ＨＢＶと
ＶＺＶに係る両者の抗原性と免疫原性を併有し、しか
も、弱毒株であるため、Ｂ型肝炎と水痘に対する同時免
疫が可能な２価生ワクチンの有効成分として、また、Ｈ
ＢＶとＶＺＶ両抗原からなる診断用の２価抗原として実
用に供することができる。ここで付記かつ特筆すべき
は、従来技術では不活化ワクチンとしてしか提供され得
ない抗原、例えば、ＨＢＶ抗原を、本発明によれば、生
ワクチンとして実用に供し得ることである。
【００１４】組換えＶＺＶの作製：次の手順で行う。外
来遺伝子を挿入連係しようとするＶＺＶ遺伝子のクロー
ニング；外来遺伝子のクローニング；クローニングした
ＶＺＶ遺伝子に外来遺伝子を挿入連係したキメラプラス
ミドの構築；斯かるキメラプラスミドとＶＺＶゲノムと
の間の組換えによる、組換えＶＺＶの作出。以下、この
順序で説明する。
【００１５】（１）ＶＺＶ遺伝子のクローニング：後述
の実施例１に記載の要領でＶＺＶゲノムＤＮＡをその感
染細胞から抽出精製の後、このＤＮＡを制限酵素で消化
し、常法のアガロースゲル電気泳動で分画し調製したＶ
ＺＶ遺伝子ＤＮＡ断片を、市販又は公知のベクターとそ
の宿主（ P.H.Pouwels著，“Cloning Vector -A Labora
tory Manual ”，全２巻，Elsevier 1985 年発行；“ A
TCC Recombinant DNA Materials ”，American Type Cu
lture Collection 1989 年発行）を用いて、ベクターの
制限酵素サイトにクローニングする。例えば、ＶＺＶの
ｔｋ遺伝子は、ＶＺＶゲノムを制限酵素ＳａｃＩで消化
して調製したＨ断片（Intervirology,29, 301-310, 198
8）を大腸菌プラスミドーベクターｐＵＣ１２［Methods
in Enzymology, vol.101, pp.20-78, Academic Press
（米国）1983年発行］のＳａｃＩサイトに挿入連係の
後、これを大腸菌ＪＭ１０９株（ATCC No. 53323）に移
入して形質転換させることにより、クローニングでき
る。また、この工程の簡略化には、既にクローニング済
みのＶＺＶ遺伝子（例えば、Journal of General Virol
ogy, 67, 1817-1829, 1986）を利用できる。
【００１６】（２）ＨＢＶ遺伝子のクローニング：摘出
したＨＢＶ感染組織細胞、培養したＨＢＶ感染細胞の、
界面活性剤による溶解液、超音波による破壊液、また、
ウイルス培養上清、感染個体の血液等を出発材料として
使用できる。精製手段として、公知の常法を組合わせて
用いることができる。例えば、硫安塩析法、低速遠心
法、密度勾配超遠心法等を組合わせて用いることによ
り、出発材料から先ずウイルス粒子の精製画分を調製す
る。斯かる精製画分からのゲノムＤＮＡの抽出と精製
は、その不可逆的変性を避けるため、ｐＨ 3-10 での実
施が望ましく、公知の常法により実施できる。例えば、
100 ℃のＮａＣｌ溶液を用いる熱食塩法、ＳＤＣ（デオ
キシコール酸ナトリウム）やＳＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム）等を用いる洗剤法、２相分配の原理に基づくフ
ェノール抽出法、塩酸グアニジンの濃厚液を用いる塩酸
グアニジン法、ＮａＯＨ溶液やＮａ2ＣＯ3−ＮａＨＣＯ
3緩衝液等を用い約ｐＨ 10 でのアルカリ法、冷エタノ
ールを用いアルコール沈殿法等を適宜組合わせて採用す
ることによりゲノムＤＮＡを調製できる。斯かるＤＮＡ
は、上記の（１）と同様の要領で、ベクターの制限酵素
サイトにクローニングする。尚、この工程を簡略化する
ため、既にクローニング済みのＨＢＶ遺伝子を用いるこ
とができる。例えば、ｐＭ１Ｂ１１［特開昭 63-22098
(微工研条寄第1081号）］にクローニングされたＨＢＶ
のｐｒｅＳ１−ｐｒｅＳ２−ＨＢｓ抗原遺伝子等を利用
できる。
【００１７】（３）ＶＺＶ−ＨＢＶ遺伝子のキメラプラ
スミドの構築：上述（１）の要領でＶＺＶ遺伝子をクロ
ーニングしたベクター内のＶＺＶ遺伝子の下流領域を制
限酵素で開裂し、その開裂サイトに、上記（２）でクロ
ーニングしたＨＢＶ遺伝子を制限酵素により消化し調製
したＤＮＡ断片を挿入連係の後、これを宿主細胞に移入
して形質転換させることにより、ＶＺＶ遺伝子とＨＢＶ
遺伝子が連係のキメラプラスミドを構築する。
【００１８】（４）組換えＶＺＶの作出：前述のＶＺＶ
ゲノムと上記（３）で調製のキメラプラスミドを同時に
宿主細胞に導入し、これ等の両者の間で、組換えを起こ
させることにより、組換えＶＺＶを作出する。細胞への
ＤＮＡの導入には、公知の常法、例えば、ＤＥＡＥデキ
ストラン法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法等を適用
できる。リン酸カルシウム法（Virology, 52, 465-467,
1973 ）の場合、リン酸イオンとカルシウムイオンの共
存下で形成される上記両ＤＮＡの共沈殿物を調製の後、
これを細胞培養に接触させ、コ・トランスフェクション
させる。また、ＶＺＶ親株を事前に接種して約２−３時
間培養した感染細胞に、キメラプラスミドＤＮＡのリン
酸カルシウム共沈殿物を滴下し接触させ、該ＤＮＡをＶ
ＺＶ感染細胞に導入することもできる。次いで、これ等
の細胞を培養し、その培養系でＶＺＶゲノムとキメラプ
ラスミド両ＤＮＡの間で組換えを起こさせ、組換えＶＺ
Ｖを作出できる。
【００１９】（５）組換えＶＺＶとその培養：本発明に
より得られる種々の組換えＶＺＶクローンはいずれも、
弱毒ＶＺＶ株であり、生ワクチンの有効成分として使用
できる。例えば、ＶＺＶとＨＢＶ両遺伝子の間の組換え
ＶＺＶクローンは、後述の実施例５に開示の通り、ｒＨ
Ｖ岡株シリーズと総称され、命名された次の２０株から
なる：ｒＶＨ１岡株、以下、ｒＶＨ２、ｒＶＨ３、ｒＶ
Ｈ４、ｒＶＨ５、ｒＶＨ６、ｒＶＨ７、ｒＶＨ８、ｒＶ
Ｈ９、ｒＶＨ１０、ｒＶＨ１１、ｒＶＨ１２、ｒＶＨ１
３、ｒＶＨ１４、ｒＶＨ１５、ｒＶＨ１６、ｒＶＨ１
７、ｒＶＨ１８、ｒＶＨ１９、及びｒＶＨ２０の各岡
株。尚、本発明の組換えＶＺＶは、後述の参考例３に記
載の要領で、培養細胞に組換えＶＺＶシードウイルスを
接種し培養できる。その培養上清および感染細胞内に
は、感染性の組換えＶＺＶ粒子以外に、組換えＶＺＶゲ
ノムの発現産物である種々の抗原が生産される。例え
ば、上記のｒＶＨ７岡株（国際寄託番号）を培養する
と、組換えＶＺＶ粒子以外に、その培養上清には分子量
が 30k、35K 等のＨＢｓポリペプチドが、また、感染細
胞細胞内には 26k、30K 等のＨＢｓポリペプチドがそれ
ぞれ生産される。組換えＶＺＶの培養物中に生産され
る、これ等の抗原、ウイルス粒子とそのＤＮＡはいずれ
も、ワクチン、免疫学的診断剤、遺伝子診断剤、又は遺
伝子工学試薬として利用できる。
【００２０】組換えＶＺＶゲノムＤＮＡの制限酵素解
析：公知の常法、例えば、サザン・ブロット法（Journa
l of Molecular Biology, 98, 503,1975）により解析で
きる。即ち、ＶＺＶゲノムを制限酵素で消化し調製した
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分画し、これ等
の画分をニトロセルロースフィルター上に移した後、Ｒ
Ｉ（ラジオアイソトープ）で標識のプローブとの間でハ
イブリダイゼーションを行い、上記泳動画分の反応像を
ラジオオートグラフィーにより解析する。
【００２１】組換えＶＺＶ抗原の測定、検出及び同定：
組換えＶＺＶ培養により生産されるウイルス粒子や各種
抗原の測定、検出及び同定は、免疫学や血清診断で常用
されている公知の方法、例えば、抗体でコートした赤血
球をもちいるＲＰＨＡ（逆受身赤血球凝集反応）法、酵
素で標識した抗体を使用するＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体
免疫アッセイ）又はＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＲＩ
で標識した抗体を用いるＲＩＡ（ラジオ免疫アッセ
イ）、ＦＩＴＣ（ fluorescein isothiocyanate ）で標
識した抗体で感染細胞を染色し蛍光顕微鏡下で抗原の存
在を判定する免疫蛍光法、また、ＲＩ標識した培地成分
を添加混合の培地中で組換えＶＺＶを培養し調製したＲ
Ｉ標識抗原と予め作製した抗体との間の免疫沈降反応物
をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動）にかけ分子量の大きさにより分画の後、その泳動
像をオートラジオグフィーで解析する免疫沈降法等の採
用が可能である。尚、この工程を簡略化するため、市販
されている種々の測定キットを使用できる。また、抗原
密度は、公知の常法、例えば、密度勾配平衡遠心法によ
り測定できる。抗原粒子の形状は、電子顕微鏡で観察で
きる。
【００２２】組換えＶＺＶの感染価の測定：公知の常
法、例えば、感染細胞のラウンディングを指標とするＣ
ＰＥ（細胞変性効果）を光学顕微鏡下で判定するＣＰＥ
法；ニュートラルレッドとアガロースを含有の固形培養
培地を重層した感染細胞の培養により形成される各プラ
ークを１単位とするＰＦＵ（プラーク形成単位）を肉眼
で数えるプラークアッセイ；ホルマリンで固定した感染
細胞をメチレンブルー溶液で染色しＰＦＵを肉眼で数え
るプラークアッセイ；感染細胞が形成するフォーカスの
数、ＦＦＵ（フォーカス形成単位）を光学顕微鏡下で計
数するフォーカス法；等を採用できる。
【００２３】組換えＶＺＶのクローニング：公知の常
法、例えば、感染細胞のクローニングにはフォーカス
法、組換えＶＺＶのクローニングにはプラークアッセイ
が採用できる。フォーカスやプラークの採取には、ガラ
ス製、プラスチック製、金属製等の円筒細管ないしはシ
リンダーを使用できる。クローニングした感染細胞や組
換えＶＺＶは、クローン毎に新鮮な細胞培養に接種し、
ウイルスを培養する。
【００２４】組換えＶＺＶ免疫原性の判定：組換えＶＺ
Ｖを含有の溶液をサル、ウサギ、モルモット、マウス等
の実験小動物の皮下に接種の後、これ等の免疫動物を飼
育管理する。斯かる飼育の間、ウイルス接種後、週又は
月単位で一定期間毎に、例えば、モルモットの場合に
は、その大腿部静脈から約 3 ml の部分採血を行い、そ
の血中抗体価を測定する。抗体価の測定には、免疫学や
血清診断で常用されている公知の方法、例えば、免疫に
使用した抗原でコートした赤血球を用いるＰＨＡ（受身
赤血球凝集反応）法、既知の一定量の感染ウイルスとそ
の抗血清との間で抗原抗体反応させた後、その感染ウイ
ルス量を50％中和減少させる抗血清の最高希釈倍数を、
ＣＰＥ法やプラークアッセイにより測定する中和試験法
等を採用できる。
【００２５】組換えＶＺＶを有効成分として含有する生
ワクチンの製造：ヒト２倍体細胞培養を用いて組換えＶ
ＺＶを培養の後、その培養物を、例えば、遠心法により
精製し、組換えＶＺＶ画分を採取する。これにワクチン
安定化剤としてアミノ酸や糖類等の溶液を添加混合て
し、生ワクチン１ドーズ当たりのウイルス含量が1,000P
FU 以上になるよう希釈調整し、生ワクチンを製造す
る。生ワクチンは、その一部サンプルにつき、厚生省告
示第１９５号に規定の生物学的製剤基準（1989年）、例
えば、「乾燥弱毒生水痘ワクチン」、「組換え沈降Ｂ型
肝炎ワクチン（酵母由来）」等に準拠して、安全性、有
効性及び均質性に関する各種試験検定を行い、そのワク
チンとしての適格性を確認・確定の後、使用に供する。
乾燥ワクチンは、約 3- 30 ml 容のバイヤル瓶又はアン
プル中で凍結乾燥され、気密密閉の状態で提供され、５
℃以下に保存する。斯かるワクチンの使用は、これに添
付の使用書の記載に従い、使用直前に滅菌蒸留水で乾燥
内容物を完全に再溶解した後、例えば、１ドーズ、0.5
mlを皮下に接種する。
【００２６】組換えＶＺＶ抗原を有効成分として含有す
る診断剤の製造：ヒト２倍体細胞培養を用いて組換えＶ
ＺＶを培養の後、その培養物を、例えば、遠心法により
精製し、組換えＶＺＶ抗原画分を採取する。その抗原
を、例えば、ホルマリンの添加、または56℃で加熱等に
より不活化した後、抗原蛋白量が 1-10 μｇ/ml になる
よう、例えば、ＰＢＳで希釈調整し、診断剤を調製す
る。斯かる抗原は、2-50 ml 容のバイヤル瓶又はアンプ
ル中で密閉され、液状又は乾燥の状態で提供される。斯
かる抗原は、これに添付の使用書の記載に従い、種々の
血清診断、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＰＨＡ等の抗原とし
て、また、抗体の作製に使用できる。尚、乾燥製品の場
合には、蒸留水で乾燥内容物を完全に再溶解して用い
る。
【００２７】以下、本発明の具体例につき、参考例及び
実施例をあげて説明する。但し、本発明は、斯かる参考
例及び実施例にのみ限定されるものではない。
【００２８】
【参考例】 参考例１ 細胞培養：ヒト２倍体繊維芽細胞、ＭＲＣ−５を37℃で
培養した。基礎培地としてＭＥＭ培地［ Gibco社（米
国）製］を使用した。尚、該基礎培地は使用直前に 7％
(w/v)NaHCO3水溶液を添加混合し、増殖培地はｐＨ 7.
4、維持培地はｐＨ7.8 に各々調整した。次いで、市販
のウシ胎児血清を、その最終濃度が増殖培地では10％(v
/v) 、また、維持培地では 3％(v/v) になるよう追加混
合し使用した。 参考例２ ＶＺＶ培養：参考例１で得たＭＲＣ−５細胞培養に、Ｖ
ＺＶ岡株（ ATCC VR-795）シードウイルスをＭＯＩ（感
染多重度）0.01にて接種の後、37℃で３日間,培養し
た。培地には、参考例１に記載の維持培地を使用した。
ＶＺＶ培養の間、ＶＺＶの増殖に伴い感染細胞領域が次
第に広がる。ＶＺＶ感染細胞は、検鏡下でラウンディン
グを呈し、いわゆる、ＣＰＥ（細胞変性効果）として検
出できる。従って、斯かるＣＰＥに基づく感染細胞の広
がりを検鏡下で観察することにより、ＶＺＶ増殖の程度
を判定できる。ＣＰＥが細胞培養モノシート全域で認め
られる時点で、ＶＺＶ培養を終了した。 参考例３ 生水痘ワクチン株の培養：生水痘ワクチン株である岡株
（ WHO Technical Report Series, No.725, pp.102-12
4, 1985）シードウイルスを、参考例２の記載と同様の
要領で培養した。培養容器として、培養面積210 cm２
のルー瓶５本を使用した。 参考例４ ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）の調製：NaClを 8.0ｇ、
KCl を 0.2ｇ、Na2HPO4・12 H2O を 2.9ｇ、KH2PO4を
0.2ｇ、CaCl2を 0.1ｇ、及び MgCl 2・ 6 H2Oを 0.1
ｇ、蒸留水に溶解して1,000 mlにし、ＰＢＳを調製し
た。また、２価のイオン、CaCl2とMgCl2・6H2O とを含
まないＰＢＳ（−）も別途に調製した。
【００２９】
【実施例】 実施例１ ＶＺＶゲノムＤＮＡの抽出と調製：参考例３で得た岡水
痘ワクチン株の感染細胞を採取した。即ち、ウイルス培
養終了後、培養液を捨て、0.1 ％(w/v) EDTA-2NaのＰＢ
Ｓ（−）溶液を16 ml 、各ルー瓶に添加し感染細胞をル
ー瓶の内壁面から剥離させた後、これ等をプールした。
次に、 3,000 rpm、10分間、室温で遠心し、感染細胞の
ペレットを採取した。これに、0.5 ％(v/v) NP40［ BDH
Chemicals社（英国）製］及び 10mM EDTA-2Naを含む 1
0mM Tris-HCl(pH 8.0)を 3mlを添加し細胞を浮遊させ、
室温で30分間静置して細胞を溶解させた。次いで、細胞
破片を除去するため、 3,000g 、20分間、4 ℃で遠心
し、その上清を採取した。この操作を３回繰り返し行
い、採取した各上清をプールした。次いで、この上清
を、SW27ローター（Beckman Instruments 社［米国］
製）にて 27,000 rpm 、１時間、4 ℃で遠心し、ペレッ
トを採取した。そのペレットを、2 mlのＴＥ液［10mMTr
is-HCl(pH8.0), 1mM EDTA-2Na］に浮遊させた後、これ
にＶＺＶ粒子可溶化液［10mM Tris-HCl(pH8.0) , 1％(w
/v)SDS, 10mM EDTA-2Na, 200μg/ml Proteinase K,100
μg/ml RNase A］ 2 ml を添加混合し、37℃で一夜、反
応させた。反応終了後、等量の水飽和フェノール・クロ
ロホルム・イソアミルアルコール(1:1:1) 混合液で２
回、ＤＮＡの抽出を行い、水層を採取した。次に、この
水層に２倍量の冷エタノールを添加混合の後、−20℃で
一夜、静置しＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡは、遠心
により回収の後、上記のＴＥ液 2mlに再浮遊し、ＶＺＶ
ゲノムＤＮＡとして、爾後の使用に供した。尚、ＤＮＡ
の濃度は、吸光度ＯＤ260により決定した。 実施例２ ＨＢＶのｐｒｅＳ２及びＨＢｓの遺伝子ＤＮＡ断片の調
製：ＨＢＶの亜型ａｄｒ株のｐｒｅＳ１−ｐｒｅＳ２−
ＨＢｓ遺伝子がｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトにクロ
ーニングされたプラスミドｐＭ１Ｂ１１（特開昭６３−
２２０９８）を制限酵素ＨｐａII で消化した。次い
で、これを 0.5％(w/v) アカロースゲル電気泳動にか
け、ＨｐａII断片を回収の後、T4 DNAポリメラーゼによ
り両末端を平滑末端にした（図１）。 実施例３ ＶＺＶのｔｋ遺伝子ＤＮＡのクローニング：実施例１で
得たＶＺＶゲノムＤＮＡを、制限酵素ＳａｃＩで消化
し、これを 0.5％(w/v) アカロースゲル電気泳動にか
け、Ｈ断片（Intervirology, 29, 301-310,1988 ）を回
収した。このＤＮＡ断片を、ＳａｃＩで開裂したプラス
ミドｐＵＣ１２（Methods in Enzymology,第 101巻，20
-78 ページ、Academic Press［米国］1983年発行）に挿
入連係の後、大腸菌ＪＭ１０９株（ATCC No. 53323）
に移入し、形質転換させることにより、プラスミドｐＵ
Ｃ１２−ｔｋを作製した。更に、ｐＵＣ１２−ｔｋを制
限酵素ＥｃｏＲＩとＦｏｋＩで消化の後、 1.0％(w/v)
アカロースゲル電気泳動により回収したＥｃｏＲＩ−Ｆ
ｏｋＩ断片を再度、ｐＵＣ１２にクローニングし、プラ
スミドｐＥＦ６を得た（図１）。 実施例４ 組換えＶＺＶ作製用のキメラ・プラスミドの構築：実施
例２で調製したＨＢＶゲノムＤＮＡのＨｐａII断片を、
実施例３で得たｐＥＦ６のｔｋ遺伝子のＨｉｎｃIIサイ
トに挿入連係の後、これを大腸菌ＪＭ１０９株に移入し
形質転換させることにより、キメラ・プラスミドｐＨＨ
を得た（図１）。また、ＨＢＶ遺伝子ＤＮＡ断片の挿入
連係部位の塩基配列を、７−ＤＥＡＺＡシークエンスキ
ット（宝酒造社製；Nucleic Acid Research, 14, 1319,
1988)を用いて決定した。その結果を２図に示す。この
キメラｐＨＨは、ＨＢＶのｐｒｅＳ２−ＨＢｓ遺伝子Ｄ
ＮＡの１，０８０塩基対断片がＶＺＶ遺伝子のＳａｃＩ
−ＦｏｋＩ断片４．８ｋｂの間に挿入連係されており、
ＶＺＶのｔｋ遺伝子の真性のプロモーターとエンハンサ
ーの機能下で、ＶＺＶｔｋ遺伝子の真性の開始コドンＡ
ＴＧ（メチオニン）とＨＢＶｐｒｅＳ２のＴＣＣ（セリ
ン）とが連係した状態で転写かつ翻訳され、ＶＺＶのｔ
ｋ遺伝子の発現に代わり、ＨＢＶのｐｒｅＳ２の２５個
のアミノ酸と全ＨＢｓペプチド両遺伝子を発現する（図
１及び図２）。 実施例５ 組換えＶＺＶの作製：実施例１で調製したＶＺＶゲノム
ＤＮＡ（ 2.5μg／ml）及び実施例４で作製したキメラ
プラスミドｐＨＨ（ 20 μg／ml）を、リン酸カルシウ
ム法（Virology, 52, 465-467, 1973)により、直径６０
mmのプラスチック製シャーレで培養のＭＲＣ−５細胞に
コ・トランスフェクションさせた（図１）。次いで、こ
れを培養し、ＶＺＶゲノムの導入により形成される各Ｖ
ＺＶフォーカスから、感染細胞をシリンダーにより釣り
上げた。斯かる感染細胞をフォーカス毎にそれぞれ、２
５ｃｍ3 のプラスチ製フラスコに培養のＭＲＣ−５細
胞に接種し、増殖させた。同時に、感染細胞の一部をフ
ォーカス別にそれぞれ、カバースリップ上に培養のＭＲ
Ｃ−５細胞に接種し増殖させた後、これ等を抗ＨＢｓモ
ノクローナル抗体（ＢＭＬ社［日本］製）を用いる免疫
蛍光法で検鏡した。即ち、各カバースリップ上の細胞
を、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）で洗浄の後、冷メタ
ノールと冷アセトンの等量混合液にて−20℃で５分間、
固定し、脱水させた。次に、マウスの上記モノクローナ
ル抗体、及びＦＩＴＣで標識された抗マウスＩｇＧ抗体
でこれらの細胞を染色した。染色済みの各標本につき、
蛍光顕微鏡下で蛍光度を指標としてＨＢｓ抗原産生の有
無と強弱を検定した。その結果、合計３５個のクローン
(C1-C35)のうち、５個が組換えＶＺＶ候補クローンとし
て選定された。組換え率は、14.5％であった。また、こ
の検定結果に基づき、上述のフラスコ内で増殖させた感
染細胞のうち、各組換えＶＺＶ候補クローンの感染細胞
から、細胞遊離のＶＺＶを調製した。調製した組換えＶ
ＺＶは、使用に供するまで−70℃で保存した（Journal
of General Virology, 61,255-269, 1982)。次いで、直
径60mmのプラスチック製シャーレに培養のＭＲＣ−５細
胞を用いて、上記の組換えＶＺＶ候補のうち蛍光度が最
高の１クローン(C17) につきプラークアッセイを行っ
た。尚、プラークアッセイでは、基礎培地として１９９
培地（Difco 社［米国］製）を用い、参考例１の記載と
同様にして調製した維持培地に、アガロースを最終濃度
が 0.8％ (w/v)になるよう添加混合して固形培地を調製
した。この培地は、感染細胞モノシートに重層して用い
た。感染培養細胞の染色は、上記の固形培地にニュート
ラルレッドを最終濃度 0.01 ％(w/v) になるよう添加混
合し調製した培地を更に重層して行った。ウイルス接種
は、シャーレ当たり１〜２個のプーラクが形成されるよ
うＶＺＶ濃度を調整して行った。また、培養は５％(v/
v) 炭酸ガス保温器内で行い、培養温度等の他の条件
は、参考例３と同一とした。出現したプラークを各々、
個別に、シリンダーで釣り上げることにより、組換えＶ
ＺＶをクローニングした。得られた組換えＶＺＶのうち
の１クローン(C17-5) を、未感染細胞 5-10 個に対しク
ローン感染細胞１個の割合で接種し、細胞から細胞へ10
代継代した。そして、継代第10代の各感染細胞培養から
それぞれ、細胞遊離の組換えＶＺＶを調製した。これ等
の組換えＶＺＶにつき、上述と同様に免疫蛍光法で検定
し厳選した結果、ＨＢｓ抗原を産生する細胞遊離の組換
えＶＺＶ（図１）を２０クローン分離した。これ等のク
ローンをｒＶＨ岡株シリーズとし、このシリーズを構成
する２０株について、ｒＶＨ１岡株、ｒＶＨ２岡株、ｒ
ＶＨ３岡株の要領で以下順次、ｒＶＨ４岡株からｒＶＨ
20岡株まで命名した。また、これ等の２０株では全て、
同程度のＨＢｓ抗原の産生が確認されたため、斯かる組
換えＶＺＶによるＨＢｓ抗原の産生はいずれも、ウイル
ス継代下で遺伝学的に安定かつ良好であると判断され
る。
【００３０】以下の実施例では、ｒＶＨ岡株シリーズ中
の組換えＶＺＶ株の代表例として、ｒＶＨ７岡株（国際
寄託番号）を使用する。尚、ｒＶＨ７岡株の親株は、参
考例３及び実施例１に記載の通り、弱毒ＶＺＶの岡水痘
生ワクチン株である。 実施例６ 組換えＶＺＶ遺伝子ＤＮＡの制限酵素解析：ザザン・ブ
ロット法（Journal ofMolecular Biology, 98, 503, 19
75)により行った。親株である岡水痘性生ワクチン株と
組換え株の各ゲノムＤＮＡを実施例１の記載と同様にし
て抽出調製の後、各ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩ（Ｓｓｔ
Ｉ）で消化して得られるＤＮＡ断片を、0.8 ％(w/v) ア
ガロースゲル電気泳動で分画し、泳動済みのゲルをエチ
ジウムブロマイドで染色した。次いで、このゲルにニト
ロセルロースフィルターを重ね、各ＤＮＡ分画を該フィ
ルターに移し、ＲＩで標識のプローブによるハイブリダ
イゼーションを行った後、ラジオオートグラフィーにか
けた。尚、プローブとして、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰで標
識したｐＭ１Ｂ１１及びｐＨＨの各ＤＮＡを使用した。
その結果、親株では本来のＳａｃＩ−Ｈ断片が、また、
組換え株ではＳａｃＩ−Ｈ´断片がそれぞれ検出され
た。そのため、ＳａｃＩ−Ｈ断片はＶＺＶｔｋ遺伝子を
含み、組換え株のＨＢｓとｔｋ両遺伝子領域にはＳａｃ
Ｉサイトがないことを考慮すると、親株のＳａｃＩ−Ｈ
断片が、組換え株ではＳａｃＩ−Ｈ´断片にシフトした
と考えられる。また、親株のＳａｃＩ−Ｈ断片はｐＨＨ
プローブだけと反応するのに対し、組換え株のＳａｃＩ
−Ｈ´断片はｐＭ１Ｂ１１及びｐＨＨ両プローブとそれ
ぞれハイブリダイゼーションするため、組換えＶＺＶゲ
ノムのｔｋ遺伝子にはＨＢｓ遺伝子が挿入されていると
判定される。 実施例７ ＶＺＶ組換え株の感染細胞で産生されるＨＢｓ抗原の検
出と同定：実施例５で得たｒＶＨ７岡株を、培養面積15
0 cm2のプスチック製フラスコ５本を用いて、参考例２
に記載と同様にして培養した。その培養上清をプール
し、3,000 rpm で20分間、4 ℃で遠心した。感染細胞
を、培養フラスコ内壁面からラバーポリースマンで剥離
の後、ＰＢＳに浮遊させた。
【００３１】（１）ＨＢｓ抗原の産生量の測定：上記の
遠心上清 35 mlを、更に、27,000 rpmで 3時間、4 ℃で
遠心し、ペレットを採取し、これを 0.2 ml のＰＢＳに
懸濁し、組換え株培養上清画分とした。一方、上記の感
染細胞約106個を１mlのＰＢＳに浮遊させ、超音波（20
KＨz, 150 mA, 4秒）で細胞を破壊の後、3,000 rpmで20
分間、4 ℃で遠心し、その上清を採取し、組換え株感染
細胞画分とした。両画分について、抗ＨＢｓ血清でコー
トした細胞を用いるＲＰＨＡ（逆受身赤血球凝集反応）
試験により、ＨＢｓ抗原価を測定した。ＲＰＨＡには市
販の試験キット（ミドリ十字製）を使用した。また、比
較対照として、上記と同様に約106個の細胞から調製し
た未感染細胞画分及び親株感染細胞画分、並びに酵母で
生産したＨＢｓ抗原（特開昭63-22098）をそれぞれ用い
た。尚、これ等の検体は、２倍階段希釈し、測定した。
その結果を表１に示す。表１から、ＶＺＶ組換え株の培
養によるＨＢｓの産生量は、感染細胞画分では10μg/m
l、培養上清画分では 4μg/ml（濃縮前の、もとの培養
上清では23ng/ml)であると算出推定される。
【００３２】
【表１】
【００３３】（２）ＨＢｓ抗原の免疫蛍光法による検
出：実施例５に記載のＨＢｓ抗原のモノクローナル抗体
を用いる免疫蛍光法により、上記の組換え株感染細胞で
のＨＢｓ抗原産生の有無を検定した。その結果、感染細
胞質内でのＨＢｓ抗原の産生が確認された。 （３）培養上清のＨＢｓ抗原の電子顕微鏡による確認：
上記の培養上清を5,000 rpm で20分間、遠心の後、その
上清にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）6000を最終濃
度が10％(w/v) になるよう添加混合し、沈殿物を形成さ
せた。次いで、低速遠心により回収した沈殿物ペレット
をＴＥＮ液［20 mM Tris-HCl(pH 7.4),1mM EDTA-2Na,15
0mM NaCl］に浮遊させた後、この浮遊液を、SW27ロータ
ーを用いるCsCl密度勾配平衡遠心に２回かけた。尚、遠
心カラムとして密度1.15、1.25及び1.4 g/cm3からなる
不連続勾配を使用し、このカラムに沈殿物浮遊液を重層
の後、23,000 rpm、20時間、 4℃で遠心した。遠心終了
後、カラムを分画し、ＨＢｓ抗原画分を、上述のＲＰＨ
Ａ試験により決定した。これより得られたＨＢｓ抗原画
分は、ＴＥＮ液と混合し、CsClで密度を 1.2g/cm3に調
整の後、更に、SW41ローターにて、33,000 rpm、40時
間、4 ℃で遠心した。遠心終了後、カラムを分画し、Ｈ
Ｂｓ抗原画分を採取して希釈し、これを10％(w/v) 蔗糖
クッションの上に重層の後、SW41ローターにて、40,000
rpmで 3時間、4 ℃で遠心した。そのペレットを、ＰＢ
Ｓに浮遊させ、電子顕微鏡で観察した。その結果、最終
の精製ＨＢｓ画分には、多数の直径20-30 nmの粒子が検
出された。この結果から、粒子状のＨＢｓ抗原が、感染
細胞から分泌されていると判断される。
【００３４】（４）培養上清のＨＢｓ抗原の密度の測
定：上記の電子顕微鏡による観察で用いた精製ＨＢｓ画
分の一部を、SW41ローターにて、33,000rpm 、4 ℃で40
時間、密度1.2 g/cm3のＣｓＣｌ密度勾配平衡遠心にて
分画した。各画分の体積と重量を測定し密度を算出する
と共に、そのＨＢｓ抗原価をＲＰＨＡ試験で測定した。
その結果、ＨＢｓ活性のピークを示す精製ＨＢｓ画分の
密度は、 1.20 g/cm3であった（図３）。 実施例８ ＶＺＶ組換え株のＶＺＶ及びＨＢｓ両抗原の同定：参考
例１の記載と同様して、直径100mm のシャーレ３枚にＭ
ＲＣ−５細胞を培養した。その１枚にはｒＶＨ７岡株
を、他の１枚にはその親株をそれぞれ接種した。残り１
枚の細胞培養は、ウイルスを接種せず、対照抗原の調製
に用いた。そして、これ等の各細胞を、メチオニンを含
有しないＭＥＭ培地に50μＣi/mlの［35Ｓ］メチオニン
とシスティンを添加し調製した基礎培地を用いて、参考
例２の記載と同様に 4時間、培養を行った。次いで、各
細胞を剥離し、ＲＩＰＡ緩衝液［20 mM Tris-HCl(pH 8.
0),1 ％(w/v) Triton X-100, 0.1 ％(w/v) SDS ，150mM
NaCl, 及び 1 mM phenylmethylsulfonyl fruoride ］
で細胞溶解の後、35,000 rpmで 1時間、遠心し、その上
清を採取した。また、培養上清は、3,000 rpm で20分
間、遠心し、その上清を採取した。得られた６種の上清
の各々は、抗ＶＺＶモルモット血清（Virology,156, 42
3-426, 1987）と混合し、免疫沈降反応させた。各反応
系で形成された免疫複合体は、プロティンＡセファロー
スＣＬ−４Ｂ［ファーマシアＬＫＢ（スウェーデン）
製］のカラムクロマトグラフィーにより、それぞれ分離
した。ＨＢｓ抗原（特開昭63-22098）を用いて作製した
抗ＨＢｓウサギ血清と上記６種の上清との間でも、上記
と同様に各免疫複合体を形成させ、これを分離した。次
いで、これ等の免疫複合体をそれぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動した後、ラジオオートグラフィーを行った。
その結果、ＶＺＶポリペプドは、親株及び組換え株の両
感染細胞において同様に検出された。しかし、分子量が
26Kと30K の両ＨＢｓ抗原は、組換え株の感染細胞内だ
けに検出された。また、これ等の 26Kと30K 両抗原とは
対照的に、組換え株の培養上清では、実施例７に記載の
組換え株の感染細胞が分泌するＨＢｓ抗原が、 30Kと35
K の両ポリペプチドとして同定された。このことから、
感染細胞内で合成された 26Kと30K のＨＢｓ抗原は、そ
の培養上清に分泌される間に、修飾とプロセッシングを
受け 30Kと35K のＨＢｓ抗原になると判定される。 実施例９ 組換えＶＺＶを有効成分とする生ワクチンの製造：培養
面積210 cm2のルー瓶20本のＭＲＣ−５細胞培養に、実
施例５で得たｒＶＨ７岡株シードウイルスを接種の後、
参考例３の記載と同様にして培養した。培養終了後、培
養液を捨て、各ルー瓶内の感染細胞を200 mlのＰＢＳ
（−）にて２回洗浄した。次いで、 20m1の 0.03 ％(w/
v) EDTA-3Naを各ルー瓶内の感染細胞に重層し、細胞を
ルー瓶内壁面から剥離させ浮遊させた。各ルー瓶内の感
染細胞浮遊液をプールし、2,000 rpm にて10分間、4 ℃
で遠心し、感染細胞のペレットを採取した。これを100
mlのＰＢＳ（−）に再浮遊の後、凍結融解を１回、行っ
た。次に、氷水浴中で超音波処理( 20 KＨz,150 mA, 0.
3 秒/ml ）した後、3,000 rpm で20分間、4 ℃で遠心
し、細胞遊離ウイルスを含有の上清を採取し、これを生
ワクチン原液とした。この原液から検定用として30mlを
サンプリングし、残りの原液70mlに、ＰＢＳ（−）に溶
解したサッカロース及びゼラチン加水分解物をワクチン
安定化剤として最終濃度が5 ％(w/v) 及び2.5 ％(w/v)
になるよう添加混合し、140ml の生ワクチン最終バルク
を調製した。この最終バルクから検定用として30mlをサ
ンプリングの後、残りバルクを 3ml容のバイヤル瓶に0.
5 mlずつ分注し、凍結乾燥の後、窒素ガスを充填しゴム
栓で封をしバイヤル瓶内部を気密密閉した。この生ワク
チン小分品は、 4℃で保存し、使用の直前に注射用蒸留
水 0.5mlを添加し乾燥内容物を完全に溶解し用いる。一
方、サンプリングした上記のワクチン原液と最終バル
ク、及び小分品20本につき、検定試験を行った。斯かる
検定試験は、安全性、有効性及び均質姓を確認し、生ワ
クチンとしての適格性を確定するため、厚生省告示第１
９５号に規定の生物学的製剤基準（１９８９年）「乾燥
弱毒生水痘ワクチン」に準拠し、かつ、同じく規定の基
準「組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチン（酵母由来）」をも考
慮し、実施した。斯かる検定試験の結果、上記の小分品
は、そのウイルス含量が２×１０4ＰＦＵ（プラーク形
成単位）/0.5mlであり、かつ、上記基準に規定の各種試
験に合格したため、適格性を備えた生ワクチンとして爾
後の使用に供した。 実施例１０ 診断剤用の組換えＶＺＶ抗原の製造：培養面積210 cm2
のルー瓶20本のＭＲＣ−５細胞培養に、実施例５で得た
ｒＶＨ７岡株シードウイルスを接種し、参考例３の記載
と同様にして培養した。１日間培養の後、各ルー瓶の培
養液を捨て、各ルー瓶内の感染細胞を200 mlのＰＢＳに
て２回洗浄した。次いで、フェーノレッドを抜いた１９
９培地［ Difco社（米国）製］を各ルー瓶に注入し、更
に３日間、37℃で培養を続けた。培養終了後、各ルー瓶
から培養液を採取し、プールした。これを 3,000 rpmに
て20分間遠心し、その上清をミニタン限外濾過機ＭＷ10
000 ［ミリポア（米国）製］で、体積を1/20に濃縮し
た。次に、この濃縮液を56℃で30分間加熱し、ウイルス
を不活化した。得られた不活化濃縮液中の組換えＶＺＶ
の抗原蛋白含量が 5μｇ/ml になるようＰＢＳで希釈調
整し、これを 3ml容のアンプルに 2 ml ずつ分注の後、
熔封し、水痘及びＢ型肝炎の診断剤として使用に供し
た。 実施例１１ 組換えＶＺＶを有効成分とする組換え生ワクチンの免疫
原性の判定：実施例９で製造した組換え水痘生ワクチン
株の免疫原性を、モルモットを用いて測定した。比較対
照として、親株生ワクチンである市販の乾燥弱毒生水痘
ワクチン（財団法人阪大微生物病研究会製）、組換え沈
降Ｂ型肝炎ワクチン［特開昭63-22098より製造、及びメ
ルク社（米国）製の両ワクチン］、ＭＲＣ−５未感染細
胞から実施例９と同様の工程を経て調製した対照抗原の
合計５種を使用した。これ等の各ワクチンを３週令の平
均体重 250ｇのモルモット３匹にそれぞれ皮下接種し
た。ワクチン接種は、接種量が組換え株及び親株両生ワ
クチンでは、 3,000 PFU又は2,000 PFU／モルモットに
なるよう各ワクチンをＰＢＳ（−）で希釈調整して行っ
た。上記のＢ型肝炎両ワクチンは、ＨＢｓ抗原量10μｇ
／モルモットを接種した。そして、ワクチン接種後、
４、６及び８週目に、各被接種モルモットの大腿部静脈
から部分採血し、その血中抗体価を測定した。抗体価の
測定には、ＶＺＶでは中和試験法（Journal of General
Virology, 61, 255-269, 1982) を、ＨＢｓではＨＢｓ
抗原をコートした細胞を用いるＰＨＡ（受身赤血球凝集
反応）試験キット（化学及血清療法研究所製）をそれぞ
れ採用した。その結果を表２及び表３に示す。親株及び
組換え株の両ワクチンは共にＶＺＶ抗体を同レベルに誘
導した。しかし、ＨＢｓ抗体は組換え株ワクチン接種だ
けに検出された（表２）。更に、組換え株ワクチンのＨ
Ｂｓに対する免疫原性は、市販のＢ型肝炎ワクチンと同
じであった（表３）。これらの結果から、組換え株ワク
チンが保有の、ＶＺＶ及びＨＢｓ両抗原に対する免疫原
性は共に良好であると判定される。
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
【発明の効果】 （１）多価生ワクチンの提供：本発明により提供される
組換えＶＺＶ株はＶＺＶ遺伝子と１種以上のＨＢＶ遺伝
子とを同時に発現する弱毒ウイルスであり、しかも、そ
の各発現産物は現行のワクチン抗原と同等の免疫原性を
保有しており、また、その発現能はウイルス継代下で遺
伝学的に安定かつ良好であり、更に、この組換えＶＺＶ
は生ワクチン株としての安全性と有効性とを兼備してい
るため、従来の混合又は不活化ワクチンに代わる多価生
ワクチン又は多機能生ワクチンの有効成分として実用に
供することができる。 （２）不活化ワクチン抗原の生ワクチンへの変換：従
来、迷入因子混入の危険性、培養、精製等に係る技術的
制約のため、体液性免疫のみを誘導し、その免疫の持続
性の不良が公知であるにも拘らず、不活化ワクチンとし
てしか実用化され得ない抗原を、体液性と細胞性の両免
疫を誘導し、その増強された免疫効果が良好に永続する
生ワクチンに変換し提供することを可能にする。
【００３８】（３）混合ワクチンの製造コストの低減：
従来の混合ワクチンは、各ワクチン成分を個別に調製の
後、これ等を混合し製造されたものである。本発明によ
れば、２種以上の相互に異種の抗原を、組換えＶＺＶを
１回培養することにより、同時に製造できるため、ワク
チンの製造コストが極度に低減される。 （４）本発明により、培養や量産が困難なＨＢＶ抗原の
大量生産が可能になる。
【００３９】（５）バイオハザードの確率の高い病原体
抗原を安全に製造できる。 （６）本発明による組換えＶＺＶ抗原は、相異なる２種
以上の抗原を有するため、これ等の２種以上の病原体を
１度に判定できる多価診断剤としても有用である。ま
た、該組換えＶＺＶ遺伝子ＤＮＡは、２種以上の異種遺
伝子ＤＮＡからなるキメラプローブとして遺伝子診断に
利用できる。
【００４０】（７）ＷＨＯのＥＰＩ（免疫拡大計画）に
寄与：以上に加え、ＷＨＯが提唱の混合又は多価ワクチ
ン使用による接種と被接種両者間での省力化に基づく予
防接種の普及を考慮すると、本発明が、ワクチン製造、
防疫と衛生行政、臨床検査、個人の予防接種等における
経済性と省力化の確保に寄与すると共に、更には、予防
接種の普及と促進の布石となる免疫効果の改善と増強の
側面から人類に多大の福音をもたらすことは明らかであ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えＶＺＶ構築の順序を示した説明図であ
る。
【図２】ＶＺＶｔｋ遺伝子とＨＢＶｐｒｅＳ２−ＨＢｓ
遺伝子の連係部位のＤＮＡ塩基配列とその由来を示した
説明図である。
【図３】組換えＶＺＶの培養液中に分泌されるＨＢｓ抗
原画分を、更に、ＣｓＣｌ密度勾配平衡遠心法により分
画したＨＢｓ抗原各画分のＨＢｓ活性と密度を示す測定
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/38 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｊ 9015−2Ｊ

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＶＺＶの遺伝子プロモーターの下流領域
    に外来遺伝子を挿入連係することを特徴とする組換えＶ
    ＺＶの作製法。
  2. 【請求項２】 ＶＺＶの遺伝子プロモーターの下流領域
    に外来遺伝子が挿入連係された組換えＶＺＶ。
  3. 【請求項３】 ＶＺＶが岡水痘生ワクチン株である請求
    項２に記載の組換えＶＺＶ。
  4. 【請求項４】 遺伝子プロモーターがＶＺＶのｔｋ遺伝
    子プロモーターである請求項２又は３に記載の組換えＶ
    ＺＶ。
  5. 【請求項５】 外来遺伝子がＨＢＶゲノムの遺伝子群か
    ら選ばれる１種以上の遺伝子である請求項２、３又は４
    に記載の組換えＶＺＶ。
  6. 【請求項６】 ｒＶＨ岡株シリーズを構成する組換えＶ
    ＺＶ株群から選ばれる１クローン以上のウイルス株。
  7. 【請求項７】 請求項２、３、４、５又は６に記載の組
    換えＶＺＶに由来の抗原。
  8. 【請求項８】 請求項２、３、４、５又は６に記載の組
    換えＶＺＶゲノムＤＮＡ。
  9. 【請求項９】 請求項２、３、４、５又は６に記載の組
    換えＶＺＶを免疫を奏する量、含有することを特徴とす
    る生ワクチン。
  10. 【請求項１０】 請求項７に記載の抗原を抗原抗体反応
    を呈する量、含有することを特徴とする診断剤。
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