TW210354B - - Google Patents
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Description
210354 A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(3 ) 發明領域: 本發明僳為構築一種重組水痘帶狀&疹病毒之方法, 依此製得之重組水痘帶狀成疹病毒及其抗原與基因組DNA, 可應用為一種疫苗、免疫診斷試劑、基因診斷試劑及基因 工程試劑。 先前技藝: 將外來基因或異基因插入病毒基因中以構築重組病毒 的技術,亦卽,使用病毒基因組作為選殖和/或表現載醱 的技術已自1979年開始進行,例如用SV40作為病毒載體以 産生兔子乙型球蛋白(rabbit /3 -globulin) [Nature( London) , 2 7 7, 1 0 8 - 1 1 4, 1 9 7 9, ibid. , 2 78 , 35-40, 1979]。在1980年,世界衛生组織(WHO)大會宣告天花之根 絶是建立在疫苗成功的結果且建議該接種之廢止。此後, 這種以減毒病毒形成疫苗之有效成分的牛痘病毒( vaccinia virus)的有效使用已吸引全世界廣泛注意且目 -前已被重新評估。如此環境下,以利用該病毒基因組作為 外來基因選殖和表現載髏為目的而創造的重組牛痘病毒已 被報告[Proceedings of National Academy of Science ( USA) , 79, 4 9 2 7 - 49 3 1 , 1 9 8 2 ; ibid., 7 9, 7 4 1 5 - 7 4 1 9 , 1982]。此外,WHO的ad hoc諮詢小組採用一個應用牛痘病 毒等作載體的重組病毒疫苗之研究促進計耋。[NatUre( London), 312, 299, 1984]。此 WHO 的計畫建議:開發一 種病毒載體如牛痘病毒載體具有較廣的宿主範圍,可利用 較高等動物細胞為宿主,著眼於解決習知使用的質體( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂- 線< 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙) 3 81. 5. 20,000(H) 2103¾4 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明4 ) plasmid)載體嗤菌體(phage)載體、黏接質體(cosmid) 載髏具有狹窄宿主範圍(主要是細菌及酵母菌)的缺點;及 開發一種作為有效成分的多價疫苗,其是利用經插入至少 二種外來基因於牛痘病毒基因體而構築成的重組病毒以取 代習知包含二或多種抗原或異病毒之組合疫苗。以上述 WHO的宣告和建議作為起始點,關於病毒載體的基礎研究 及發展已在各領域被積極進行,也因此,已累積大量的數 據。更待別地,病毒基因組已知作為病毒載髏者包括例如 :乳頭狀瘤病(papillomavirus)、多瘤病毒( polyomavirus)、腺病毒(adenovirus)、反轉錄病毒( retrovirus)、空泡病毒(vacuolovirus)、單純施彥病毒( herpes simplex virus)、馬立克病病·毒(Marek's disease virus)、水痘病毒(varicella virus)、小 DNA病 毒(parvovirus)、花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)、草花葉病毒(tobaccomosaic virus)和蕃 ίδ 金 色花葉病毒(tomato golden mosaic virus) [Virus, 36, 1-41, 1986; ibid., 37, 1-40, 1987; ^ Current Communication in Molecular Biology ^ Viral Vector, ’’PP. 10 19 8, Y . Olusman and S.H. Hughes (ed. ) , Cold Spring Harbor Laboratory(USA)pub. 1988,歐洲專利公 開持許公報第334,530號]。 於上列病毒載髏中,和本發明有關的水痘帶狀濟疹病 毒(以下縮寫為"V Z V ")敘述如下。 VZV通常是細胞結合病毒,其感染性只能在活細胞中 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· '可_ 本紙張尺度遑用中國a家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙) 4 81. 5. 20.000(H) 2i〇^4 A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明七) 維持,故很難在試管中加以分離而進行次培養及大量生産 。因此一般考量的方向不只閼於致力於發展一種VZV疫苗 和診斷試劑,而且關於VZV作為水痘致病原的基礎和臨床 研究的努力。也因此對於VZV研究的進步十分缓慢,直到 由本發明者在1975年建立活水痘疫苗所用的減毒VZV之去 除細胞(cell-free )Oka株。(Biken Journal, 23, 53-55 ,1975;日本專利公報第51-19,018號;日本專利公報第 53-41,292號;日本專利公報第56-42,144號。利用上述減 毒VZV Oka株所發展出之活疫苗的優點,對VZV基礎及臨床 研究及應用研究之努力已在世界各地積極進行。使用減毒 VZV之Oka株作為活性成分之活水痘疫苗,目前已在世界廣 泛使用[Requirements for Varicella Vaccine(Live) Adopted 1984; WHO Technical Report Series, No. 725 ,pp. 1 0 2 - 1 2 4, 1 9 8 5 ]。已累積大量關於VZV之基礎、臨 床、診斷及免疫的數據['' Virology, "vol. 2, pp. 20 1 1 - 2 0 5 4, B.N. -Fields, e t a 1 . ( e d. ) , Raven Press( U S A ) , p u b . 1 9 9 0 ]。特別是自1 9 8 0年代初期經由限制圖譜 和全部鹼基定序決定VZV基因组DNA,以及其基因選®表現 及單株抗體等技術之發展擴充,更使VZV基因組結構分析 跨了一大步。(Journal of General Virology, 67, 1759 -1816, 1986; ibid., 67, 1817-1829, 1986; Virus, 37 ,7卜80, 1987)。一些由上述參考資料提及的關於VZV的 主要病毒學發現如下所述。 VZV具有一餾外套,為DNA型病毒,歸羼於單純無疹病 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂. 線< 本紙張尺度遑用中困B家標準(CNS)甲4規格(210x297公澄) 5 81. 5. 20,000(H) A6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明) 毒群即 hprpp<tviridae. a 1 phaherphesv ir inae ,且直徑約 180至200nm。此基因组包括一値具約120千核Ϊ酸(kb)之 雙鏈線形DNA,且包含於核殼髏(nucleocapsid)中直徑約 75ηι之圈胼形核心中。此基因組DNA包括一傭含有長片段( Ul)和短片段(Us)之》待序列(U), —掴分別鄰接於Ul和Us 的含TRl和TRs之末绱重複序列(TR),以及一値含各互補於 TRl和TRs的IRl和IRs之倒置重覆序列(IR)。此六値片段由 5端至3端依序排列為TRl、Ul, IRl、 IRs、Us及TRs。目前 ,金數 710RFs(開放性编閲架構(〇Pen reading frames)) 由5,端開始以1至71编號,從這些基因中,下列21値0RF的 功用已披確定或估計。[括弧中數字表示01?1?的缳號]:(4) 早期蛋白,(8)去氣尿核甘三磷酸酶,(10)反位可誘發性 蛋白,(13)胸腺嘧啶合成酶,(14)耱蛋白(後文缩寫為w gP - ) V , (18)聚核苷酸還原酶小次單位,(19)聚核f酸 邇原醮大次單位,(28)DHA連接08, (29)DNA结合蛋白,( 30)gpl, (36)胸腺嘧啶瀲酶(後文缩寫為(37)gP I, (40)蛋白層蛋白,(48)外核酸(62, 71)早期蛋白 ,(63, 70)早期蛋白,(66)蛋白激酶,(67)gpIV 及(68)gp. I 〇 下列使用VZV作為病毒載鼸而構築之VZV重組體為己知 :插入一外來基因於VZV之gpl起動子基因下游區域所得 的一個重組VZV,此外來基因為愛潑斯垣_巴爾病毒( EpsteU-Bar^ virus)之gp350(日本專利公開待許公報第 12,277/88號或歐洲專利公開特許公報第251,534號,曰本 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂· 線- 冬紙張尺度遑用中國國家標準(CNS) T4規格(210x297公龙) 6 81. 5. 20,〇〇〇(H) 扒 0¾54 五、發明説明(7 )
專利公開待許公報第141,589/88號;journai 0f Virology, 61, 1 7 9 6 - 1 8 6 7, 1 9 8 7 ); —値以 b 型肝炎病骞 P「eS2(以下缩寫為'* HBV")和表面抗原(以下縮寫為w HBs")基因(日本專利公開特許公報第12 ,277/88號或歐洲 專利公開特許公報第251,534號)作外來基因;將愛潑斯坦 -巴爾病毒之gp300和gp220基因結合於VZV gpl起動子基 因下游,且進一步將所得基因片段插入VZV tk基因,以製 備出重组VZV,致使這些愛潑斯坦-巴爾病毒可表現具tk之 融合蛋白[Proceedings of National Academy 〇f Science [US A] , 8 4, 3896 -3 900, 1 98 7; ^ ULCA
Symposia on Moleaular Biology; New Series, vol. 84 ί Technical Advances of Vaccine Development, H PP. 23 5 -2 4 1 , by R.W.Ellis, at a 1. , Alan R · Liss , Inc. (USA)pub. 1988]。然而,所有這些重组VZV具低免疫 原性,且其安全性及有效性尚未被確定。尚未有以這些 VZV作抗原製備出任何疫苗或診斷試-劑的市場企圖報告。 這些重組VZV也尚未到達實際應用的層次。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可料想到的理由如下:(1 )和一般具約1 〇 k b基因組長 度的小尺寸病毒相比,VZV具有約120kb之非常長的感染性 基因組長度,如此長的DNA鍵易斷裂而因此不穩定;(2)由 於VZV原來為细胞依賴性病毒,對熱十分不穩定,須保存 在低於-60t之溫度下,以保持感染能力,且其操作、培 養及大量生産均屬不易;及(3)其他病毒在病赛培養時, 每値細胞製造的感染性病毒顆粒數均為1〇至1〇0個,而vzv 本紙張尺度通用中a Η家標準(CNS)甲4規格(210X297公釐) 7 81. 5. 20.000(H) A 6 B6 五、發明説明(8 ) 卻低到約0. 1値顆粒,造成極低産量。由於這些理由,製 備或選殖不止適用於藉VZV培養以大量生産基因組,且亦 適用於試驗及研究階段之VZV基因組DNA,是非常困難的, 且筛選一値合格於工業使用,且質量均佳的重组VZV的可 能性非常低。即建立一摘重組VZV需要克服這些十分困難 的狀況。 發明概述: 本發明的目的在於提供構築一種新的重組VZV的方法, 使其具對所插入基因的高度表現能力且後代仍具有此能力 之遣傳穩定性,且作為安全而有效的活疫苗之成分。更特 別的是,由實用觀點來看,本發明的目的是提供一種播帶 有在其他宿主載髏糸统中相當困難去培養及量産的HBV基 因的重組VZV之構築方法。 本發明提供一種構築重組VZV之方法,其包括由HBV基 因組之基因群中選出至少一種基因插於VZV之起動子基因 下-游區域。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明也提供一種含有上述重組VZV之活疫苗、——種 得自此重組VZV之抗原、此重組VZV之基因组DNA,及含有 此抗原或基因組DNA之診斷試劑。 圖示簡要說明: 第1圖為本發明之重組VZV之構築圖示。方法A為VZV DHA與嵌合質髏DNA(PHH)之共同轉染,且B為以IFA試驗進 行重組篩選;第2圖為HBV PreS2-HBs基因和VZV tk基因和 這些基因重組後之DNA鹼基序列的圖示。標示:Stas, 本紙張尺度逍用中困Η家樣準(CNS)甲4規格(210x297公捷) 8 81. 5. 20,000(H) A6 B6 五、發明説明(9 ) P r* e S 2基因之起始密碼子;S t a 15 = , Η B s基因之起始密碼子; S t a * * s , V Ζ V t k基因之起始密碼子;T e r , Η B s基因之終止 密碼子;X s , V Ζ V t k基因之鹺基;X ’, Τ 4 D Η Α聚合_作用 端之鹼基;及X+, HBs基因之鹼基;第3圔為以本發明之重 組VZV感染細胞所分泌之HBs之純化。被感染細胞所分泌之 HBs抗原經濃縮及CsCl衡定離心。經測定其體積重量而偵 測各液份之密度(·),經RPHA試驗來分析HBs抗原(〇)之 效價。 本發明詳細說明: 本發明的特色及較佳具體實例如下。 V 7. V抶作為病塞戧餺 本發明之主要目的為創造出具優良安全性、有效性及 一致性之重組活疫苗,且以VZV基因組為載塍。依本發明, 任何存在已知的 VZV株 Oka(AtCC VR-795)、 Webster(ATCC VR-916)、 EllenUTCC VR-586)、 YS、 YG、 SC011、 Kawaguchi^ Dumas (Journal of General Virology, 6 7-, 1816-1829, 1986; Vi「us, 37, 71-80, 1987)及其他被分 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 離的VZV株均可適用。在這些VZV株中,較佳之減毒VZV株 為,於試驗、研究及生産操作具高度安全性,及適於工業 使用,包括提供兼具安全性及有效性活疫苗和診斷試劑。 特別由上述本發明的主要目的觀之,此減毒VZV之Oka株為 唯一已被建立且全世界公認其優良安全性和有效性的DNA 型減毒病毒,且目前為世界通用,其最適合於本發明。 V7.V的摈蕃及細_的篩蓰 本紙張尺度遑用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙) 9 81. 5. 20.000(H) A 6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明(1(J 任何得自人類、猴子及天竺鼠之習知對VZV有敏感性 的細胞均可使用。這些細胞中,考盧其混合異常及致瘙因 子的可能性、培養病毒株以製疫苗的合適性以及産生病毒 的品質後,較理想為使用如HEL299 UTCC No. CCL 137)、 MRC-5(ATCCHo. CCL 171)及 WI-38(ATCC No· CCL 75)等 公認用於生産活疫苗之人類雙套染色K細胞。至於細胞繁 殖及維持及培養病毒時所使用之培餐基,可使用市售可購 得之合成培養基如199培餐基[Difco CO. (USA)製造],或 MEM培養基[Gibco Co. (USA)製造]。逭種培餐用的培餐基 可以經由滴加及混合約7¾ (w/v)的NaHC〇3水溶液以辋整pH 至約6.8到8.0,然後在臨使用前加入胎牛血清[例如Flow Co. (USA)所製造者]使终潘度到逹約2到15¾ U/v)。當接 種種子病毒於前述製備的培蓍細胞後,將VZV培養於維持 培養基中。建議培餐溫度為25至40C之範匾間,最好為33 至381C的範園内。 寐檯被HBV某闵插人的VZV基因__ 理論上,依本發明,所有上述71種VZV基因各均可作 為HBV基因插入的部分。.在此用法中須注意的是將HBV基因 插入位於其起動子基因之下游的0RF匾域,以利於起動子 基因之作用,以及插入時不會破壊VZV基因及外來基因彼 此的密碼子以確保轉譯順暢。一般而言,當外來基因插入 時病毒基因可能受破壞而不能發揮原來功能,所以作為組 合HBV基因的起動子基因須採用不會影鬱病毒感染性及繁 殖性且具強起動子能力之高度表現者,如tk或gp基因。持 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度通用中HH家標準(CNS)甲4規格(210父297公龙) 10 81. 5_ 20,000(H) A 6 B6 五、發明説明(11) 別當應用減毒VZV之Oka株作病毒載體時,已知spV基因( 第十四値0RF)的表現能力已缺失或分解(《Journal of Virology, 64, 4540-4548, 1990),故不能建議此基因區 域為插入座。但使用野生型VZV的gpv基因為可行;將一 値HBV基因插入其起動子基因下游,可能會造成該spV编 碼之基因區域的破壞或降低表現量。如此獲得的重組VZV 期待可表現似減毒VZV Oka株這種減毒株的高度利用性。 蕺摆栝人VZV某因組的HBV基因 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 理論上,依本發明,使用選自HBV基因組之基因群之 一或多種基因作為插入的外來基因,而不會影響破壞VZV 的增殖及感染力是可能的。然而必須小心的是,在使用重 組VZV作為活疫苗時,要避免基因區域编碼毒性物質或外 來基因含有害物質或毒素。例如,HBV的preSl區域及preS 2區域之一部分均聚合成人類血清白蛋白接受器,已知對 肝細胞有高度趨向性:因此當使用接近编碼任何這些區域 之基因之部分作為外來基因時,必須藉由限制酶去除該區 域。如此,這個插人HBV基因之重組VZV兼具HBV及VVZ的抗 原性及免疫性。由於其為減毒株,實際上可應用作為雙價 活疫苗的有效成分,以同時提供對抗B型肝炎及水痘的免 疫性,且作為診斷HBV與VZV二者的雙價抗原。在此應特別 注意的是,本發明中,像HBV抗原這種於習知技術中只作 為去活性疫苗的抗原,現已可實際應用於活疫苗。 重甜V7.V的搆链 此方法可經下列頃序步驟完成:選殖將插入外來基因 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙) 81. 5. 20.000(H) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 11 A 6 Π 6 經濟部屮央槛準局β工消#合作社印製 五、發明説明1(2 ) 的VZV基因;選殖外來基因;製備插入外來基因的VZV基因 所形成的嵌合質體;重組此嵌合質體與VZV基因組以構築 重組VZV。這些步驟依序敘述如下。 (1) VZV基因的選殖:將得自依後述實例1之方法感染 之細胞之VZV基因組DNA予以萃取及純化後,經限制酶切割 ,藉習知瓊脂凝膠電泳法分级分離DNA片段,再選殖於市 售可購得或習知宿主一載體条統(P.H. Powels, w Cloning Vector-- A Laboratory Manual, ^ 2 v o 1 s ., Elsevier, 1 9 8 5; '' ATCC Recombinant DNA Materials, "American Type Culture Collection, 1989)。選殖 VZV tk基因為可行的,例如經限制酶( Intervirology, 29, 301-310, 1988)切割 VZV基因組以製 備Η片段插人E.Coli質髏載體PUC12[Methods in Enzymology, ν ο 1 . 10 1, p p. 2 0 - 7 8, Academic Press( USA), 1 9 8 3 ]然後將質髏放入 E.coli JM109 株(ATCC Ho. 53323)中以進行轉化作用。可利用一種已選殖成之VZV基 因(M®.JournalofGene「alVir*ology,67,1817-1 8 2 9 , 1 9 8 6 )以簡化此方法。 (2) HBV基因之選殖:含去垢劑或超音波處理之經HBV 感染組織萃取細胞溶液或培養的HBV感染細胞,病毒培養 或感染體之血液的上清液皆可用作起始材料。利用已知方 法之組合可純化此材料。病毒顆粒之純化部分可先由經由 例如硫酸氨鹽析法、低速離心,和/或超高速離心速度梯 度的組合處理起始材料而製備。由此已純化部分萃取及純 本紙張尺度逍用中SB家標毕(CNS)f 4規格(2]0χ2ί)7公龙) 81. 6. 10,000¾ (II) 12 (請先閲讀背而之注意事項孙填寫本頁) A 6 Π 6 經濟部中央槛準局A工消伢合作杜印奴 五、發明説明(i 3) 化基因組DNA最好在pH3至10下進行以避免其不可逆變性, 同時可依習知的方法進行。基因體DNA可經採用下列方法 的適當組合而製備,如用NaCl溶液在100它下處理的熱/塩 法,使用SDC(去氣臛酸鈉)或SDS(硫酸十二酯鈉)的去垢劑 法、基於二相分布原理的酚萃取法,利用氡化胍濃縮液的 氛化胍法,利用NaOH溶液或Na2C〇3-NaHC〇3缓衝溶液在pH 值約10下進行的篇液法、和/或利用冰酒精的酒精沈澱法 。此DNA可依上述(1)相同方法選殖。為了簡化此過程,可 使用已選殖之HBV基因。例如可使用經選殖入pMIBII[日本 專利公開待許公報第22,098/88號(Biken No. 1081)]的 HBV preSl-preS2-HBs抗原基因。 (3) VZV-HBV基因嵌合質醱之製備:由上述(1)中製備 質體載體之VZV基因的下游區域經限制酶切割後,由上述( 2)選殖得到的HBV基因之DNA片段插入該質體載體的限制座 ,同時將此質體轉染入宿主細胞以進行轉化作用。如此由 VZV基因及HBV基因銜接構築成一値嵌合質體。 (4) 重組VZV之構築:經同時引介上述(1)之VZV基因組 之DNA片段及上述(3)製備之嵌合質體進入宿主細胞以造成 其重組而構築重組VZV。為了引介此DNA片段及嵌合質體 D N A人宿主細胞,任何習知方法包括D E A E葡聚醏法,電穿 孔法和/或磷酸鈣法均可應用。在磷酸鈣法(\Mrology, 52, 465-467, 1973)的例子中,兩種DNA的共同沈澱是在 磷離子和鈣離子共同存在下産生,然後此共同沈澱和細胞 接觸以進行共同轉染。將造酸縛與嵌f質體 13 本紙張尺度逍用中a B家楳準(CNS) T 4規格(210x297公龙) 81. 6. 10,000張(H) (請先閲讀背而之注意事項#项寫本頁 附件 經濟部中央螵準局員工消费合作社印轚 2l〇^4 丨似伽叫1 ::_ 五、發明説明(14) 澱滴加入先前已接種V Z V親代株二到三小時的被感染细胞, 使二者得Μ接觸,而將該DNA引入VZV感染組胞。然後,藉 培養這些细胞製造重組VZV,且在此培養系统中,於VZVV 基因體DN Α及嵌合質體DN Α間引起重組。 (5)重組VZV及其培養:本發明中所使用之各種重組 VZV株均是減毒VZV株且可應用為活疫苗之有效成分。例如 ,後述實施例6揭示VZV和HBV基因之重組VZV株遣傳上命名 為rVH Oka株条,包括下列二十種命名株:rVHl Oka株, 和 r V Η 2 , r* V Η 3 , r V Η 4 , r V Η 5,r V Η 6,r V Η 7 , r V Η 8,r V Η 9 , rVHIO, rVHll, rVH 12 , rVH 1 3 , rVH 1 4 , rVH15 , rVH16, rVH17, rVH18, rVH19 及 rVH20 Oka 株。本發明之重組^7 可藉如後述實腌例1相同方法,將重組VZV種病毒接種於培 養细胞而得,並依相同方法培養。此培養上清液及感染細 胞,除了產生感染性重組VZV顆粒外,各種抗原亦為重組 VZV基因組之表現產物。例如培養上述rVH7 Oka株[收納於 1992年4月15日之動物细胞培養歐洲收集中心(ECACC),編 列為 rVH17-5’Oka’株(Provisional Accession No. V92041523)]時,除了分子量為8x l〇4-l〇5kd之VZV抗原核 蛋白外[此抗原核蛋白係在培養上清液和感染细胞兩者中 製得。此VZV抗原核蛋白之分子量(即8X 104-105kd)相當 於120kbp之VZV染色體組所表規之蛋白質和其中DNA分子之 總分子量。亦即,8xi04kd-10skd (總分子量)=8xl〇4kd( 120kbp DNA之分子垦)+0.4x 104kd(所表現蛋白質之分子 量),上式中,DNA和所表現蛋白質之分子量係根據一般方 法所估計。]。培養之上清液中有分子量30kd和35kd之HBs 多肽產生,而感染细胞中有26kd和30kd之HBs多肽產生。 在重組VZV培養產物中所生產之所有抗原及病毒顆粒及其 DHA均可用為疫苗、免疫診斷試劑、一般診斷試劑或基因 工程試劑。 讀细V7.V革因組DNA^ 刦酷分析 可Μ習知方法如南方墨點法(Journal of Molecular (請先閱讀背面之;£意事項再填寫本頁) i裝. 訂. 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) ΐ 4规格(210 X 297公;$ ) 14 (修正頁) 82.3. 40,000
經濟部中央標準局負工消費合作社印製附件三. 五、發明説明(1 4 ) 澱滴加入先前已接種VZV親代株二到三時的被感染细胞, 使二者得Μ接觸,而將該DNA引入VZV/g染組胞。然後,藉 ί 培養這些细胞製造fiffiVZV,且在y培養系統中,於v Ζ V V 基因體D N A及嵌合質體D N A間引起/組。 (5)重組\zV及其培養:本f明中所使用之各種重組 VZV株均是減\卩2乂株且可應用,/為活疫苗之有效成分。例如 ,後述實施例6\|示VZV和HB)/基因之重組VZV株遺傳上命名 為r V Η 0 k a株糸,\包括下列/十種命名株:r V Η 1 0 k a株, 和 rVH2,r*VH3, rV«.4, rV#, rVH6,rVH7,rVH8, rVH9, rVHIO, rVHll, rVHl2,/vH13, rVH14, rVH15, rVH16, r V H 1 7 , r V H 1 8 , r V H 1 9 g r V H 2 0 0 k a 株。本發明之重組 V Z V 可藉如後述實施例1相/fe\方法,將重組VZV種病毒接種於培 養细胞而得,並依相Μ方^培養。此培養上清液及感染细 胞,除了產生感染重組V 顆粒外,各種抗原亦為重組 V Z V基因組之表現產/物。例如导養上述rVH7 Oka株[收納於 1992年4月15日之_物细胞培養、歐洲收集中心(E C A C C ),編 列為 rVH17-5’Oka/’株(Provisional Accession Ν ο . S V92041523)]時,,除了分子量為8x 104-105kd之VZV抗原核 ί 蛋白外[此抗原$蛋白係在培養上清液和感染细胞兩者中 製得。此▽2乂抗_核蛋白之分子量(即8x 104-105kd)相當 於120kbp之VZV~色體組所表現之蛋白質和其中DNA分子之 總分子量]。培/養之上清液中有分子量30kd和35kd之HBs多 肽產生,而感染细胞中有26kd和30kd之HBs多肽產生。在 重組V Z V培養產物中所生產之所有抗原及病毒顆粒及其’D N A 均可用為疫苗、免疫診斷試劑、一般診斷試劑或基因工程 試劑。 重組V Z V基W朗D Ν A夕眼削_分析 可以習知方法如南方墨點法(J 〇 u r n a 1 〇 f Μ ο 1 e c u 1 a r (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 訂. I,.線. 本紙張尺度通用中國國家標準(CNS)甲4規格mo x 297 ) 1 4 (. ί女正頁)82·3· 4〇,0〇〇 _Π6_ 五、發明説明(15) Biology, 98, 503, 1975)進行分析。更特定地,以限制 法部 泳値 電 一 膠將 凝 , 糖後 脂然 瓊 。 由上 可膜 段維 片纖 NA化 5硝 到 轉 移 可 分 部 些 VZ這 割 -切離 酶分 之 備 製 而 組 因 基 化 雜 行 4|6 進 針 採 〇 的像 劑顯 示的 指應 作反 —析 分 後 m: 理 處 術 影 R 顯 含射 値放 1 動 與 自 分在 素 位 同 性 射 放 ί
tglt S 趾組 亩 0 75 測 掐 宙 潮 鹿 杭 偵 定 測 之 原 抗 種 各 及 粒 顆 毒 病 的 生 産 養 培 血 Η 用 及RP使 學之 , 疫體法 免抗η) 於覆10 t rm 月夕 a 應胞in 常细ut 通球gl 、血ag 知紅 e 習用h 何使ve 任如 s 藉例as 可’ P 定行ed 鑑進rs 及法ve 測方re 的 斷 診 淸 (請先閲讀背而之注意事項再塥寫本頁) 的 體 抗 之 e e π • 1 標as 素 酵 示 或 裝. η a 之 體 抗 之 示 標 I R 用 使 法 訂_
S 示 標 \7 鹽 酸 気 硫 異 光 螢 /ί\ C T Ti F 用 使 法 存 之 原 抗 定 決 鏡 徹 顯組RI 光重生 螢在産 以面以 後方分 然一成 , , 基 色括養 染包培 胞法的 細澱示 染沈標 慼疫RI 將免著 體此合 抗,混 之在入 中 基 養 培 的 另 原 抗 的 示 標 線- 經濟部中央橾準局C5工消费合作杜印製 配移此 再之析 ,1)分 應ge來 反 e 術 澱id相 沈anl照 疫yl射 免cr放 -J/aift 進01自 者-P以 兩DS後 使(S然 E , G , 體PA離 抗S-分 之 S 以 備在加 製量來 前子同 先分不 以同度 面不程 方合動 測定 之衡 得 度 購梯 可度 售密 m 如 何例 任 , 用定 使測 可法 , 方 程知 過習 此以 化可 簡度 了 密 為原 。抗 像 〇 呈組 泳劑 電 量 形 外 之 子 粒 原 抗 察 觀 鏡 撤 顯 子 電 經細 可重 〇 法 測 的 袢 感 染 感 被 察 觀 鏡 微 顯 學 光 以 法 方 知 習 列 下 何 任 用 採 可 本紙張尺度边用中S B家標準(CNS) Ή規格(210x297公龙) 81. 6. 10,000張(II) A 6 Π 6 21MM. 五、發明説明ί 6 ) 細胞變圓的情形,以決定其CPE(cell dematuration effect)的CPE法;病毒斑分析包括在含有中性红及瓊脂糖 的固.態培養基上培養感染細胞,所形成的每値病毒斑為一 單位,目測計算PFU (病毒斑形成單位);此病毒斑分析包 括,將感染細胞以福馬林固定後以甲基藍溶液染色,目測 計算PFU;及經光學顯微鏡計算感染細胞所形成焦點的數 目之焦點法或計算FFU(focus-fo「ming unit)。 重绀 任何習知的方法均可採用,例如選殖感染細胞的焦點 法及選殖重組VZV的病毒斑分析法。欲採樣焦點及病毒斑, 可使用任何玻璃、塑膠及金靥精密直筒試管或量筒。將選 殖慼染細胞及重組VZV接種至新的細胞培養中,以利每株 病毒的培養。 (請先閱讀背而之注意事項再项离本頁) DH 金 ihu 1
析 分 之 袢 & A 鼠 老 及 z a V Μ 組竺 重天 有 、 含子 將兔 子 猴 如 物 防 驗 實 型 小 於 射 注 下 皮 液 溶 之 物 33 的 疫 免 被 些 這 殖 繁 後 然 經濟部中央榀準局β工消费合作杜印製 測 的 價 效 體 抗 ο 價 效 體 抗 液 血 其 量 測 間 ,1 - Β 期 3 殖約 繁大 後血 毒取 病脈 射靜 注股 物 動 由 隔 間 定 固 値 某 或 月 每 週 每 用 使 如 例 行 進SS 法pa 方A( 的PH 斷之 診胞 清細 血球 及血 疫紅 免之 於原 用抗 常用 知疫 習 免 採以 可覆 量塗
e V 6 h 法 法 方 之 驗 試 和 中 行 進 間 清 血斑 抗毒 其病 及或 毒法 病PE 量: 定 之 知 已 在 及 以 藉 可 價 效 毒 病 量 毒 病 低 降 及 和 中 .\1\1 倉 得 0 數 析倍 分釋 稀 大 最 之 清 血 抗 為 者 81. 6. 10,000張(H) 本紙5JL尺度边用中a Η家標毕(CNS)肀4規格(210x297公;¢) 16 210354 經濟部中央標準局Α工消伢合作社印製 五、發明説明Q 了) 含重甜VZV作為有效成分夕活疮Μ夕牛産 利用人類雙套體細胞培養重組V Ζ V後,以例如離心法 純化所得培養物,並收集重組VZV的部分。添加並混合胺 基酸和糖類溶液於此收集部分,將所得溶液稀釋以調整病 毒含量,至每劑活疫苗至少有1,000PFU,由此製得活疫苗 。活疫苗樣本並進行各種關於安全性、有效性及一致性的 試驗,係依據日本衛生福利部在通報No. 195所規定的生 物産物最低條件(1989),包括w乾狀減毒活水痘疫苗〃 及"重組沈澱B型肝炎疫苗(來自酵母菌)",以確定及建 立疫苗使用前之合格性。每個疫苗於約3至30ml的小玻璃 瓶或注射用小瓶中真空冷凍乾燥。將其密封並貯存於 以下。此疫苗應遵照手册中之指示:使用前以無菌蒸餾水 將乾燥成分完全還原,並以每劑量0.5ml進行皮下接種。 含重紺V7.V杭鹿作為有效成分的診斷試割牛産 以人類雙套體細胞培養重組VZV後,所得細胞以如離 心的方法純化並收集重組V Z V抗原分液。經如加入福馬林 或56C加熱等方法將抗原去活性後,將其以如PBS進行稀 釋及校正,製備抗原蛋白含量在1至10wg/ml之診斷試劑。 此抗原以液狀或乾燥狀密封於2至50ml體積的小玻璃瓶或 注射用小瓶中。此抗原可用為各種血清診斷技術如ELISA 及PHA及生産抗體時之抗原。若是乾燥狀産品,使用前須 以蒸餾水將之完全還原。 發明成效: (1)提供多價活疫苗:本發明提供的重組VZV株為可同 (請先閲讀背而之注意事項#蜞寫本頁) 裝· 訂· 線· 本紙張尺度逍用中a Η家標準(CNS)肀4規格(210x29/公:it) 81. 6. 10,000張(Η) 17 210354 Λ 6 Π 6 五、發明説明& 8 ) CBB 種1 少 至 及 因 基 至疫 甚免 , 的 毒等 病同 毒原 減抗 的 苗 因疫 基的 V ί Β 用 Tt 使 前 百 和 有 具 物 産 Z 見 V 袞 個表 1 個 現一 表每 時 , 表重際 其此實 。 且 可 性而此 代 毒 病 在 力 能VZ 現組 殖 繁 代 的 性 全 安 有 具 苗 疫 活 價 多 作 用 有 及 有 效 3 或 因 意纟合 滿«混λ ^ 0 令 習 疫 且 代 活 定U取 穩¾可 作0 ^ S ^ ^ 中:«成 苗 疫 活 bb 销 功 多 的 苗 疫 性 活 去 因 原 抗 頚 分TS I 種 些 有 苗 疫 活 為 原 抗 苗 疫 性 活 去 變 轉 只能 前不 先且 ,疫 故免 之液 制體 限發 術誘 技只 的 苗 化疫 約些 養這 培 , 及外 以此 險 , 危苗 的疫 子性 因活 發去 偶為 為用 活的 為度 作程 原意 抗·滿 此至 用 長 應延 明有 發具 本且 ,疫 面免 方胞 一 細 另及 〇液 性體 疫發 免誘 其可 持其 保 , 期苗 長疫 力 疫 免 造 製 之 苗 疫 合 組 知 習 本 成 産 生 之 苗 疫 合 組 低 降 IT Z 分 V 成組 各重 備養 製培 別藉 分以 偽可 明 發 本 於 由 〇 分 成 備 製 各 合 混 後 然 如 原 抗 同 不 種 多 或二 出 備 製 便 次 低 最 至 降 本 成 産 生 苗 疫 使 此 造 裂 量 大 能 原 抗 (請先間讀背而之注意事項Λ-填寫本頁) 裝- 訂- 線. 經濟部屮央榀準局员工消许合作社印製 原 抗 的 原 病 性 險 HB危 的物 産生 量高 或抗 養對 培産 以生 難地 使全 明安 發以 本可 能組, 3 原此 抗 。 同劑 不試 種斷 多診 或價 二 多 有的 具原 原病 抗種 Z 多 "'或 二 定 決 效 有 時 同 為 作 組 f 一 3 的 明 發 本 探 合 嵌 之 A Η D 因 基 異 Mia 種 多 或 2 括 包 為 作 可 亦 A Η D 髏 因 基 之 斷 診 傳 遣 供 針 對 述 上 如 獻 頁 的 及 進 增 類 人 對 '•*3 然 必 苗 疫 畫 價 計多 展 的 拓供 力提 疫明 免發 1(本 P E , 的述 HO所 本紙法尺度边用中a a家標準(CNS) Τ4規格(210x297公龙) 81. 6. 10,000¾ (II) 18 21035^ 五、發明説明(19) 加強免疫效果帶來相當的益處,也有利於疫苗生産之經濟 優勢與人力節省、健康衛生管理、臨床試驗以及悃人接種 。因此,經由使用組合或多價疫苗,本發明對WHO拓展促 進疫苗接種的計畫有卓越頁獻。 現在,本發明藉實施例加以詳細說明。但應注意本發 明並不限於這些實施例。 下列實施例所使用之磷缓衝鹽溶液(PBS),其製法如 下:將 8.0g NaCl, 0.2g KC1, 2.9g Na 2 ΗP04 · 1 2 Η 20 , 0.2 gKH2P〇4, O.lg CaCl2 及 O.lg MKI2· 6H2O 溶於蒸餾 水並校正其體積至1000ml。PBS(-)則分開製備,其不含 雙價離子 CaCl2 及 MgCl2· 6H2〇。 (接次頁) ...............·(.......^.....玎· · . λ (請先閲誚背而之注意事項#项筠本頁) 經濟部中央橾準局兵工消伢合作杜印製 81. 6. 10,000¾ (II) 本紙张尺度边用中8困家標準(〇阳)肀4規格(210><297公龙) Λ 6 Π 6 210354 五、發明説明(2 0) 啻掄例1 水宿病垂夕谅赛 於371C培養人類雙套醱缕維母細胞MRC-5作為VZV的培 養宿主。使用Μ Ε Μ培養基[G i b c 〇 C 〇 . ( U S A )所生産]作為基 本培餐基。臨使用前,加人7¾ (w/v)NaHC〇3水溶液與該培 養基混合,將繁殖用培養基pH值校正至7.4,維持用培養 基為7.8。然後,進一步添加市售可購得之胎牛血清並混 合,使繁殖用培養基之终灌度為10% (v/v),維持用培養 基為 3 % ( v / v )。V Z V 0 K a 株(A T C C V R - 7 9 5 )種病毒以 0 . 0 1 Μ0Ι(感染複數)接種於上述培養之MRC-5細胞,並於37它下 培養3天。此培養使用維持用培養基。VZV培養期間,感染 細胞區域隨VZV之增殖而逐漸擴大。在顯撤鏡下可觀察到 一値VZV感染細胞,由CPE(細胞病變作用)而變画。因此, 由顯徹鏡所觀察到因CPE導致的感染細胞之擴大可決定VZV 繁殖之程度。當整層細胞所有區域均觀察到CPE時,VZV培 養便告完成。 '
相似地,亦培養為活水痘g苗株之OKa株(WHO
Technical Report Series, No. 725, p p. 1 0 2 - 1 2 4, 1985 )種病毒。以五個各具210cm2的培養區域的瓶子為培養容 器。此OKa水痘疫苗株係使用於下列所有例子中。 啻掄例2 VZV某因甜泠靱碏 收集由實施例1所得之經OKa水痘疫苗株感染之細胞。 較待別是,病毒培養完成後,丢棄培養液,加入1 6 m 1含 (請先閲讀背而之注意事項#项寫本頁) 裝· 線. 經濟部屮央標準局貝工消#合作社印3i 本紙張尺度边用中a a家標準(CNS)<f 4規怙(210x297公;¢) 20 81. 6. 10,000張(Ιί) Λ 6 _Η_6_ 五、發明説明(2ΐ) 0.1% U/v)EDTA-2Na的PBS(—)溶液於培養瓶,被感染細 胞由内壁表面分離,然後將之匯集。所匯集細胞於室溫 3,0 0 0「pm下離心十分鐘,收集感染細胞沈積。如此收集的 細胞加入 3ml含 0.5% (v/v)NP40[BDH Chemicals Co.(UK) 所生産]及 10mM EDTA-2Na的 IObM Tris-HCl(pH: 8.0)以懸 浮細胞,並於空溫靜置30分鐘使細胞溶解。然後,為了除 去細胞殘片,此溶液於4lC3,000rpm下離心20分鐘,並收 集上清液。此操作循環重複三次,匯集上清液。然後,此 上清液於4Ό , 27,000rpm下以SW27轉子(Beckman
Instruments Co.[USA]生産)離心一小時以回收沈積。這 些沈積以 2ml TE溶液[10mM Tris-HCl(pH:8.0), ΙπΜ EDTA-2Na]使懸浮。然後,將 2ml溶解液[IObM Tris-HCl( pH : 8.0), 1% (w/v)SDS, 1OmM EDTA-2Ha, 2 0 0 w g/m1蛋 白_i(,及100wg/ffll RNase A]加入此懸浮液,37t隔夜 下進行反應。完成反應後,以等量的水-飽合酚-氣仿-異 戊醇(1: 1: 1)混合液對DNA萃取二次,並收集其水層。然 (請先閲請背而之注意事項#蜞筠本頁) 經濟部中央標準局CJ:工消赀合作杜印製 後在 液 溶’ 得後 所集 將收 , 心 醇離 乙經 冰。 的澱 量沈 倍NA ) 二 合 混 並 入 加 中 層 水 此 於
成 造 以 夜 隔 靜 置 下 V 組 因 基 V Z V 為 作 供 提 〇 物定 産決 ,來 之度 浮收 懸吸 1 ο m 6 2 2 液OD 溶藉 E T 度 述濃 上NA 以D 0此 r D 之 將 及 型 亞 座 備 製 之 段 片 之— 株體 d 質 5 之 P 第 入報 殖公 選許 因特 基開 BS公 -H利 S2專 re本 -P日 本紙張尺度逍用中Η國家it準(CNS)T4規格(210x29/公;《:) 2 1 81. 10,000張(Π) Λ 6 Π 6 210354 五、發明説明(2 2) (請先閲請背而之注悉事項洱填寫本頁) 22,098/88號)以限制gi Hpa_I I切割。然後,經由0.5% w/v) 瓊脂糖凝膠電泳,收集ILoJ I片段後,此片段兩端以T4DNA 聚合使成齊平末端。 審掄例4 V7V t &某闵:> 葙箝 由實施例2所得之VZV基因組DMA以限制_ S_ajc_I切割, 所得之片段經0.5¾ (w/v)琪脂糖凝脂電泳,收集Η片段( Intervirology, 29, 301-310, 1988)。將此DNA片段插入 質體 p U C 1 2 ( M e t h 〇 d s i η E n z y m ο 1 〇 g y,v ο 1 . 1 0 1 , P P * 2 0- 78, Academic Press[USA], 1983)之 S a c I 座,然後轉移至 _ E . c ο 1 i J Μ 1 0 9 ( A T C C H ο . 5 3 3 2 3 ),而製成質體 P U C 1 2 - t k。 此外,以限制酶EeoR I及EjlLI切割P U C 1 2 - t k後,經1 . 〇 % ( w/v)瓊脂糖凝膠霜泳收集RcoR I - E_o_LI片段,並再次選殖於 PUC12,由此得到質髏pEF6(參見第1圖)。 謇掄例5 批嫌链重紐VZV:>嵌会暫艚的靱備 經濟部中央標準局β工消仲合作社印姐 將實施例3製得之HBV基因組DNA的iL£_a_I I片段插人實施 例4製得之pEF6 tk基因的HincI I座後,將其轉移入E.coli JM109株而得嵌合質體PHH(參見第1圖)。所插人的HBV基因 的連接部分的鹼基序列,經由7-DEAZA定序劑組(Takara Shuzo Co.生産;Nucleic Acid Research, 14, 1319, 1988)定序。結果示於第2圖。在此嵌合pHH中,將HBV的 PreS2-HBs基因的1,080鹼基片段插人並連接於VZV基因的 S_a_c_I - ΕϋΙ 4.8kb片段與HBV preS2的實際起始密碼子ATG ( 81. 6. 10,000¾ (H) 本紙張尺度边用中囲困家標準(CNS)甲4規格(210X297公龙) 22 2i〇3 經濟部中央櫺準而Α工消"合作杜印製 五、發明説明(2 3) 甲硫胺酸)及TCC(絲胺酸)之間,在連接情況下,在VZV tk 基因實際起動子及加強子之作用下,進行轉錄及轉譯。在 VZV.tk基因表現處,HBV preS2的25値胺基酸及所有HBs肽 基因均披表現(參見第1圖和第2圖)。 奮旃例fi 重甜V Z V的斛備 由實施例2製備的VZV基因組DNA(2.5wg/ml)和實施例 5製備的嵌合質體pHH(20w g/ml)以磷酸鈣法(Virology, 5 2 , 4 6 5 - 4 6 7 , 1 9 7 3 )共同轉染至培養於直徑6 0 m Π之塑膠培 養皿的MRC-5細胞(見第一圖)。然後,培養共同轉染的産 物,從VZV基因組引入造成的每一 VZV焦點,以圓筒移取感 染細胞。將這些感染細胞接種於培餐於25(:〇13塑_瓶的MRC -5細胞,使每値焦點繁殖。同時,對毎値焦點的部分感染 細胞接種於在蓋玻片上培養的MRC-5細胞使生長,然後以 使用抗HBs單株抗體(BML Co.[日本]生産)的免疫螢光法, 以顯徹鏡分析。更恃定的,每値蓋玻片上的細胞以PBS沖 洗,以等量冰甲醇及冰丙酮的混合液於-20 °C固定5分鐘。 然後,這些細胞以上述老鼠單株抗體及FITC標示的抗老鼠 IgG抗體進行染色。毎個如此染色的樣本經螢光顯徹鏡觀 察,以螢光度作為其HBS抗原性及強度出現的指示劑。結 果,全部35株(C1-C35)中之5株被篩選為重組VZV可用株。 重組率為14.5%。由於此試驗結果,去除細胞的VZV可由 上述瓶中增殖的感染細胞中,含有重組VZV可用株的感染 細胞中製得。將此製得之重組VZV貯存於- 7010直到其實際 本紙5fc尺度逍用中國Η家楳準(CNS)肀4規格(210x297公龙) 81 6 10 000¾ (II) 2 3 ' (請先閲請背而之注意事項再填寫本頁) 210354 Λ 6 η 6 經沭部屮央櫺準局员工消许合作社印製 五、發明説明& 4) 使用時(Journal of General Virology, 61, 255-269, 1 9 8 2 )。然後,利用培養於60mm直徑塑膠培養皿之MRC-5細 胞,.以上述重組VZV可用株中具最高度螢光之單獨株(C17) 進行病毒斑分析。此痗毒斑分析使用培養基199(Difco Co. [USA]生産)。於與實施例1相同之方法製得之維持培養 基中,加入並混以瓊脂糖,使最終漉度為0.8¾ (w/v),而 製得固態培養基。此培養基係用於覆蓋單層感染細胞。藉 由加入並混合中性紅於此固態培養基,且使最終濃度為 0.01¾ (w/v),將慼染培養細胞染色,進一步覆蓋上述製 得之培養基。校正VZV濃度至每値培養皿可形成一到二値 病毒斑後,接種病毒。此培養物孵育於5% U/v)C〇2氣箱 中,其他條件同實施例1。以小國筒分別釣取每個表現的 病毒斑以選殖VZV。所得之重組VZV中之一株(C17-5)以一 個感染細胞株對5至10値未感染細胞的比例接種,如此連 缅細胞傳遞十代。從第十代毎一艏感染細胞培養中,製備 去除細胞的重組VZV。經免疫螢光試驗對這些重組VZV直接 篩選,結果分離出20値可産生HBs抗原之去除細胞重組VZV 株(圖1)。這些株屬於rVH Oka株条,構成此条的二十株依 序命名為rVHl Oka株,rVH2 Oka株及rVH3 Oka株及自rVH4 Oka株至rVH20 Oka株。所有這二十株經確定為産生相似量 HBs抗原,這些重組VZV之抗原産物在病毒連鑛培養上被認 為具遣傳上穩定性且令人滿意。 下面例子中,rVH7 Oka株(rVH17-5 Oka株,ECACC provisional accession No. V92041523)屬於 rVH Oka株 (請先閲讀背而之注意事項洱项寫本頁) 裝- 訂- 本紙張尺度逍用中國困家榣準(CNS) TM規格(210X297公龙) 81. 6. 10,000ft (II) 24 A 6 Π 6 210354 五、發明説明(25) (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 条,為重組VZV株的典型例子。rVH7 Oka株的親代株為減 毒VZV之Oka水痘活疫苗,如實施例1和2所述。 窨施例7 重紺VZV某闵紐DHA:>限制膣分析 此分析以南方墨點法(Journal of Molecular Biology, 98, 503, 1975)進行。依實施例2同法萃取並製 經濟部中央櫺準局β工消伢合作杜印51 備為親代株及重組VZV之Oka水痘活疫苗株的基因組DNA, 以限制_ SacI ( kU )切割每一 D N A而得到D N A片段,以0 . 8 % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離,然後所得凝膠以溴化乙錠 染色。然後,將硝化纖維膜置於凝膠頂端,將每一個DNA 部分移轉至膜上。經RI標示的探針雜化後,進行自動放射 顯影術。以[ct -23P]dCTP標示的pMIBII及pHH作為探針。 結果,在親代株偵測到原始的- H片段,而在重組VZV 株偵測到Sao- Η ’片段。因為- Η片段含有VZV tk基因, 而且在重組VZV株的HBs及tk基因區域沒有Sac I座出現,故 親代株的- Η片段被認為轉移到重組株的kiLl - Η ’片段 。由於親代株的S_a_c_I - Η片段只和ρ Η Η探針作用,重組株的 Sac Τ - Η ’片段則分別和ρ Μ I B I I及ρ Η Η雜化。因此Η B s基因確 定己插入重組VZV基因組之tk基因。 審旆例8 感染重紹V7.V抶紬朐所産牛HBs抗展:> (自測及確亩 使用5値培養區域為150cm的塑膠瓶,依實施例1之方 法,培養由實施例6得到的r V Η 7 0 k a株。匯集所得之培養 上清液,並在4C 3,000rpm下離心20分鐘。感染細胞以橡 81. 6. 10,000¾ (11) 本紙張尺度边用中a國家楳準(CHS)IM規格(210x297公龙) 25 2i〇糾 五、發明説明(2 3 膠刮勺由培養瓶内壁表面除下,並以PBS懸浮之。 (1)所生産的HBs抗原量的測量:35ml上述上清液經4 C , .2 7,0 0 0 r p m進一步離心3小時,收集沈積並以0 . 2 m 1 PBS懸浮之,成為重組株的培養上清液部分。相對的,上 述約106感染細胞以lml PBS懸浮之。以超音波(20kHz, 150mA, 4秒)破壊細胞後,懸浮液於4t、3,000rpm離心20 分鐘,收集所得的上清液,作為重組株的感染部分。以使 用包覆抗HBs血清之細胞之RPHA(reverse passive heaagglutination)法測量上述兩部分的HBs抗原效價。此 試驗使用市售可購得之試驗劑組(Midori Juli Co.[ Japan]生産)。為了作為對照,也使用未感染細胞部分及 由約106細胞製備來的親代株感染細胞部分,進行同上的 試驗由酵母素産生的HB3抗原(日本專利公開特許公報第 2 2,0 9 8 / 8 3號)。這些樣本經二階段稀釋以進行测量。結果 示於表1。由表1可估計,重組VZV株培養的感染細胞部分, 所産生的HBs量為lOws/ml,而培養上清液部分則為4/ig/ m 1 (濃縮前原始培養上清液為2 3 n g / m 1 )。 (請先閲讀背而之注意事項-14填寫本頁) 裝- 線< 經濟部中央櫺準局GX工消赀合作杜印製 本紙張尺度边用中a a家楳準(CNS)肀4規格(210X297公;¢) 81. 10,000張(H) 26 Λ 6 η 6 五、發明説明(2 表 1 以R Ρ Η Α試驗測定重組V Ζ V 感染培養所表現的HBs抗原 抗 原 RPHA值U) 未慼染細胞部分(1〇6細胞/ ml) 1 親代株VZV感染細胞部分(1〇6細胞/ml) 1 重組V Z V感染培養上清液(濃縮1 7 5倍) 2 5 重組VZV感染細胞部分(106細胞/ml) 26 酵母菌産生的HBs抗原( 2 5 0 w g/m 1 ) 2 1 (請先閲請背而之注意亊項孙塡寫本頁) 經濟部中央榀準局KX工消许合作社印製 (註)*抗原最大稀釋倍數顯示RPHA陽性反應強度。 (2) 以免疫螢光法偵測HBs抗原:在上述重組VZV感染 細胞中,以使用如實施例6所述之HBs抗原之單株抗體之免 疫螢光法偵測任何製得之HBs抗原之存在。結果可確定在 感染的細胞質産生HBs抗原。 (3) 以電子顯徹鏡確定培養上清液中之HBs抗原之:上 述培養上清液於5,000rpin離心20分鐘,然後加入並混合以 PEG(聚乙二醇)6,000,使此上清液最終濃度為10¾ (w/v), 以形成沈澱。然後,經低速離心收集的沈澱沈積以TEfUS [ 20mM Tris-HCl(pH: 7.4), 1mM EDTA-2Na, 150mM NaCl] 懸浮之,然後此上清液以S W 2 7轉子經C s C 1密度梯度衡定離 心二次。在離心管中所使用之不連續梯度包括1.15, 1.25 及1 . 4 g / c m 3之密度,沈澱懸浮液覆蓋於C s C 1溶液上,於4 本紙張尺度边用中a Η家楳準(CNS)f 4規格(210X297公龙) 81 6 10 000張(H) 27 ' 經濟部屮央標準局CX工消许合作社印奴 Λ (5 _ Π 6_ 五、發明説明(2 9 t: , 2 3 , 0 0 0 r p m下離心2 0小時。離心完成後,區分C s C 1溶 液,以上述RPHA試驗決定HBs抗原部分。得到的HBs抗原部 分與TEN液混合,以CsCl校正密度至1.2g/Cm3後,進一步 以S W 4 1轉子在4 t、3 3 , 0 0 0 r p m下離心4 0小時。離心完成後 ,區分CsCl溶液。取樣及稀釋HBs抗原部分,覆蓋於10 % ( w / v )蔗糖墊座,以S W 4 1轉子於4 1C 4 0,0 0 0 r p m下離心1 0 3小 時。得到之沈積以PBS懸浮,並以電子顯撤鏡觀察。結果, 在最终純化的HBs部分偵測到許多直徑為20至30nm的顆粒 。由此結果判斷,感染細胞可分泌顆粒形的HBs抗原。 (4 )培養上清液中Η B s抗原密度的測量:使用於上述電 子顯撤鏡觀察的純化HBs部分的一部分,以SW41轉子4TC、 3 3 , 0 0 0 r p m、4 0分鐘、1 . 2 s / c m 3密度的C s C 1密度梯度衡定 離心區分。測量體積重量計算每部分的密度,同時,以 RPHA試驗測量HBs抗原效價,結果顯示純化的HBs部分密度 為1.20g/cm3,代表HBs活性之高峰(見第3圖)。 啻旃例9 重甜V7, V^:>V7. V巧HBs杭鹿夕鑑亩 MRC-5細胞同實施例1之方法培養於直徑ΙΟΟπιβ的培養 皿。三個培養皿之一接種rVH7 Oka株,而其親代株接種於 其餘培養皿之其中之一。最後一培養皿的細胞培養不接種 病毒,用為製備對照組抗原。這些細胞同實施例1用加有 50w Ci/ral[35S]甲硫胺酸及絲胺酸的不含甲硫胺酸MEM培 養基的基本培養培養4小時。然後,除下這些細胞,溶於 RIPA缓衝溶液[20mM Tris-HC1(PH: 8二£), 1% (w/v) 2 8 本紙淮尺度边用中國a家楳準(CNS) 規格(210x297公处) 81. 6. 10,000¾ (II) (請先閲請背而之注意事項丹填寫本頁) 裝- 訂· 線- 210354 Λ 6 1)6 經濟部中央標準局EX工消伢合作杜印iu 五、發明説明(2 g) Triton x-100, 0.1% (w/v)SDB, 150mM NaCl;及 ImM氣化 苯甲磺醯]後,於35,OOOrpm離心一小時。將其上清液取樣 。上清液於3,OOOrpm離心20分鐘以收集其上淸液。六種上 清液每種以抗VZV天竺鼠血清(Virology, 156, 423-426, 1987)以造成免疫沈澱反應。這些反應糸統形成的免疫複 合物,値別以含蛋白 A Cepharose CL-4B[Phamacia LKB( 瑞典)製造]的管柱層析加以分離。利用HBs抗原(曰本專利 公開特許公報第22,098/88號)製得之抗HBs兔子血清,和 這六種上清液所形成的免疫複合物,也同樣形成,並加以 分離。然後,每一種這些免疫複合物,於SDS-PAGE電泳後 ,進行自動放射顯影。結果,同時於親代株及重組株的慼 染細胞中偵測到V Z V多肽。只在重組株的慼染細胞偵測到 26k及30k的HBs抗原。在重組株的培養上淸液中,如實施 例8所述之重組株感染細胞分泌的HBs抗原,被鑑定為30k 及35k多肽。由此鑑定可判斷,於感染細胞中合成的26k及 30k HBs抗原,在分泌釋於培養上·丨ΐ液時,已進行修飾及 剪接而變成30k及35k的HBs抗原。 富旃例1 0 含重甜VZV作為有放成分的沃疮苗:> 餺诰 將實施例6得到的rVH7 Oka株種病毒接種於培養於二 十個各具210cm2培養區域的瓶子的MRC-5細胞,如實施例 1進行培養。完成培養後,除去培養基,瓶中的感染細胞 以 2 0 0 m 1 P B S (—)清洗二次:然後加 2 0 m 1 0 . 0 3 % ( w / v ) EDTA-3Na於瓶中之感染細胞,將細胞由瓶子内壁分離並懸 (請先閲請背而之注意事項#填寫本頁) 裝. 本紙张尺度逍用中a Η家«準(CNS)甲4規格(210x297公:¢) 81. 6. 10,000張(H) 29 經濟部中央標準局κι:工消t合作杜印製 Λ 6 __Π6___ 五、發明説明? 0 ) 浮。匯集瓶中的感染細胞懸浮液,於4t、2,000rpn下離 心十分鐘,收集感染細胞的沈積。此沈積於100ml PBS ( — )中再次懸浮,進行冷凍-溶解一次。然後,經冰浴中超音 波處理(20kHz, 150nA, 0.3 秒 / ml)後,於 4t:、 3,000rpm 下離心20分鐘。製備含去除細胞病毒的上清液,作為活疫 苗的原始病毒懸浮液。從此原始病毒懸浮液中,取樣30ml 作為測試,加入並混合蔗糖及明膠溶於P B S (—)的水解産 物,而剩餘70ml的原始病毒懸浮液作為疫苗穩定劑,使最 终濃度為5 % U/v)及2.5 % U/v),製成最終體積為140ml 之活疫苗。由最終體積活疫苗中取樣30ml以測試後,其餘 每0.5ml裝入容積3m丨的小瓶中。冷凍乾燥後,瓶子充以氮 氣並塞以橡皮塞密封。這些活疫苗分裝瓶貯存於臨 使用前加入注射用蒸餾水0.5il以完全還原此乾燥成分。 相對的,經取樣的原始病毒愍浮液,最終體積及分裝産物 2 0瓶進行各種測試。此測試依日本衛生福利部通報N 〇 . 1 9 5 所規定的生物産物最低條件 ''乾燥減毒活水痘疫苗〃及參 考同一通報的另一項標準,重組沈澱B型肝炎疫苗(源於酵 母菌)加以進行以確認其安全性,有效性及一致性以建立 活疫苗的合格性。這些測試的結果,上述分裝産物,其病 毒含量為2X 104PFU/0_5ml,並合格於標準所指定的各種 測試。因此其可實際使用並作為適用活疫苗。 窨施例1 1 作為診斷試商I的葷組VZV抗展夕Φ奋 將實施例6所得的rVH7 Oka株種病毒接種於二十個各 本紙張尺度逍用中a困家谣準(CNS)肀4規怙(210x297公釐) 3 〇 81. 6. 10,000¾ (H) (請先閲讀背而之注意事項洱塡寫本頁) 裝· 訂· 線- 2103^4 Λ 6 η 6 經濟部屮央榀準局A工消t合作社印製 五、發明説明会1) 具210cm2培養區域的瓶子的MRC-5細胞,如實施例1進行培 養。完成培養一天後,丟棄培養液,瓶中的感染細胞以 200 il的PBS(—)清洗二次。然後,將除去酚红的培養基 199[Difco (:〇.(1^4)生産]倒人這些瓶中,再於37七谢續 培養三天。培養完成後,由瓶中取樣培養液並匯集。然後 培養液於3,OOOrpm下離心20分鐘,經Minitan超濾膜 MW10000[Millpore(USA)生産]濃縮上清液,使離心體積為 1/20。然後,此濃縮液於56 =加熱30分鐘,將病毒去活化 。此液以PBS稀釋,使如此得到的重組VZV抗原蛋白含量為 5 w g/ml ,所得液髏每2 m 1倒入容量3 m 1的注射用小瓶。此 注射用小瓶經熔化封瓶作水痘及B型肝炎的診斷試劑。 啻旃例1 2 含重甜VZV作為有效成分的重紐活疮苗申疮袢分析 以天竺鼠測量實施例10所生産的重組水痘活疫苗之免 疫性。使用下列五種疫苗作為對照:市售可購得之為親代 疫苗之乾狀減毒活水痘疫苗(由大阪大學撤生物疾病研究 基金會製備)、重組沈澱B型肝炎疫苗[—種傜由曰本專利 公開待許公報第22,098/83所生産,其他則由Merck Co.( USA)所生産]以及經相似於實施例10之過程,由MRC-5未感 染細胞製得作為對照的抗原。這些疫苗每種均皮下注射於 3週大、平均重量250g的三隻天竺鼠。重組株及親代株疫 苗以PBS( —)稀釋,使注射劑量為3,000PFU或2,000PFU /劑 量。接種B型肝炎疫苗,以得到l〇wg /動物的HBs抗原。疫 苗注射後四、六及八週後,由每隻接動物的股靜脈部分 3 1 本紙張尺度边用十JS®家標準(CNS)T4規格(210x297公龙) 81. 6.】0,000張(|〇 (請先閲讀背而之注意氺項#堝寫本頁) 裝< 線- Λ 6 Π 6 五、發明説明& 2 ) 收集血液,以測量血中抗醱效價。為了測量抗體效價, VZV採用中和試驗方法(Journal of General Virology, 61, .2 55-269, 1982),而HBs使用包覆有HBs抗原細胞的 PHA(passive hemaggloutination)試驗劑組(化學及血清 治療研究實驗室所生産)。结果示於表2及3。親代株及重 組株疫苗誘發VZV抗體程度相同,而HBs抗體只能在重組株 疫苗接種(見表2)時偵测到。進一步,重組株疫苗對抗HBs 的免疫性和市售可購得的B型肝炎疫苗相等(見表3)。由這 些結果判斷,此重組株疫苗有優良的抗VZV及HBs抗原的免 疫性。 (請先閲讀背而之注意事項Λ-塡寫本頁) 裝· -線· 經濟部中央櫺準局员工消伢合作杜印製 本紙5良尺度边用中8»家樣準(〔奶)肀4規格(210父297公;《:) 81. 6. 10,000張(II) 5 3 10 0^ 66 ΛΠ 五、發明説明§ 3 ) 表 2 經VZV親代株及重組株疫苗免疫之天 竺鼠抗VZV及HBs抗原的抗體反應 免疫原 抗- VZV 抗-HBs抗原 抗醱 效價 抗體效價 VZV-HBs重組株疫苗 檢體No . 1 8 8 No . 2 4 4 No . 3 8 4 VZV親株疫苗 檢體Ν ο . 4 4 <1 No . 5 8 〈1 No . 6 8 <1 未感染細胞抗原為對 眧 •/V»、 檢體No . 7 〈1 <1 No . 8 〈1 <1 No . 9 <1 < 1 經濟部+央櫺準局β工消#合作社印製 (註1)疫苗皮下注射量:2,000PF1J去除細胞的病毒/動物。 (註2 )抗體效價的測量:經由疫苗接種四週後收集血液。 (註3)測量抗體效價的方法:VZV採用中和試驗,HBs採用 PHAo (註4)數字:免疫兔子血清顯示陽性抗體反應的最大稀釋 倍數。 81. 6. 10,000張(!1) (請先閲讀背而之注意事項洱埙舄本頁) 本紙5fc尺度边用中a Η家樣準(CHS) T4規格(210x297公;《:) 4 5 3 ο12 6 6 ΛΠ 五、發明説明色4 ) 表 3 經接種重組VZV株疫苗與現有抗HBs重 組H Bs疫苗的天竺鼠免疫反應之比較
免疫原 試驗1=* 試賒2 5: 4迥 ~~6~Ί@~ 8 週 4週 V Z卜Η B s重組疫苗 檢體No . 1 0 32 64 64 32 No . 1 1 32 64 64 32 NO . 1 2 64 64 64 128 明礬沈澱的B型肝炎疫 苗 撿體Ho . 1 3 32 32 32 128 No . 1 4 128 128 128 32 HO . 1 5 32 32 32 64 VZV親代株疫苗 檢體Ν ο . 1 6 <1 <1 〈1 NT No . 1 7 〈1 <1 <1 NT NO . 1 8 <1 <1 <1 NT (請先閱請背而之注意事項孙塥寫本頁) 裝· 訂- 線· 經濟部中央櫺準局EX工消件合作杜印製 (註1)皮下注射疫苗之量: *試驗1,用重組HBs疫苗(日本專利特許公報N0.22, 0 9 3 / 8 8 ) , lOwg HBs抗原 / 動物; *試驗2,用重組HBs疫苗(Merck生産),10;ug HBs抗 原/動物; *試驗1和2中,使用V Z V重組和V Z V親代株疫苗,3 0 0 0 PFI)除去細胞病毒/動物。 (註2)抗髏效價的測量:免疫後如表中經過數週期間取樣 血液,根據PH A測量。 (註3)數字··免疫兔子血清頭示陽性抗體反應的最大稀釋 倍數。 (詳4 ) H T : 剃試_砭廉-__ 本紙张尺度边用中國Η家標準(CNS)T4規格(210x29/公;¢) 81. 6. 10,000張(H) 34
Claims (1)
- 第8 1 1 0 4 0 1 1號專利申請案 申請專利範圍修正本 (82年6月18日) 1. 一種構築重組水痘帶狀適瘆病毒之方法,該水痘帶狀 魂疹病毒具有至少一種選自其胸腺嘧啶激酶基因之下游 區域中之Β型肝炎病毒基因組之基因群中之基因,該方 法包括: 製備具有該順序之胸腺嘧啶激酶基因與Β型肝炎病 毒基因之嵌合質體;Μ及 共同轉染OKa水痘疫苗株與該嵌合質體至人類二倍 體细胞培養,係由此含有胸腺嘧啶激酶基因之該疫苗· 株之基因組DNA中之順序區,一致地重組至嵌合質體中 之胸腺嘧啶激酶基因與B型肝炎病毒基因之順序區。 2. —種免疫原蛋白,基本上係由藉申請專利範圍第1項之 方法構築重組水痘帶狀疱疹病毒所得之Η B s抗原及/或 VZV抗原所組成,其中該HBs抗原係26kd, 30kd及35kd之 HBs多肽中之至少一種,Μ及VZV抗原係8x 104-105kd之 核蛋白。 3 .如申請專利範圍第2項之免疫原蛋白,其中重組水痘帶 狀:庖珍病毒為「VH17-5(ECACC V92041523)。 4 . 一種用於活體外之測試Η Β V及/或V Z V抗體之診斷試劑, 該診斷試劑包含如申請專利範圍第2或3項之免疫原蛋 白,免疫原蛋白含量為足Μ使此免疫原蛋白表現抗原 -抗體反應者。 甲 4(210X 297 公寿)
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