JPH0745514B2 - 新規蛋白質およびその製造法 - Google Patents

新規蛋白質およびその製造法

Info

Publication number
JPH0745514B2
JPH0745514B2 JP61193833A JP19383386A JPH0745514B2 JP H0745514 B2 JPH0745514 B2 JP H0745514B2 JP 61193833 A JP61193833 A JP 61193833A JP 19383386 A JP19383386 A JP 19383386A JP H0745514 B2 JPH0745514 B2 JP H0745514B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
protein
arginine
hepatitis
surface antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP61193833A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS63109795A (ja
Inventor
幸夫 藤沢
康明 伊藤
紀 西村
朋子 藤井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Publication of JPS63109795A publication Critical patent/JPS63109795A/ja
Publication of JPH0745514B2 publication Critical patent/JPH0745514B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/005—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/70—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi
    • C12N2830/702—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi yeast
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/94—Saccharomyces

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明にワクチンとして有用な新規蛋白質およびその製
造法に関する。
（２）従来の技術および発明が解決しようとする問題点 Ｂ型肝炎は、特に熱帯アフリカ、東南アジアおよび極東
において多発するウィルス性疾患であり、慢性肝炎や肝
硬変、さらには原発生肝ガンの原因にもなることが疫学
的に示唆されている。病因は、DNAウイルスの１種であ
るＢ型肝炎ウィルス（Hepatitis B virus;以下、HBVと
略称する）で、それは直径42nmの球状粒子で発見者の名
を冠してデン（Dane）粒子と呼ばれる。その外層には、
HBV表面抗原（以下、HBsAgと略称する）があり、その抗
原性の違いによってadr,adw,ayr,aywなどのサブタイプ
に分けられているが、日本で見いだされるのはadwおよ
びadr型である。
Ｂ型肝炎患者の血中には、デン粒子のほかに小型粒子や
管状粒子が検出され、これらの粒子にはデン粒子と同じ
型のHBsAgが認められている。ウィルスの表在性抗原感
染を防御することは他のウイルスでも知られており、HB
Vの場合にもHBsAgをもとにＢ型肝炎に対するワクチンの
製造が考えられる。ところが、HBVはヒトやチンパンジ
ーにしか感染せず、培養細胞への感染の試みは成功して
いない。そのためHBsAgはヒト感染者血中からの入手に
限定されており、得られた小型粒子などは診断用試薬の
材料としての需要を満たしても、ワクチンの大量の製造
のためには不十分な状態である。
分子生物学の最近の進歩により非細菌性の蛋白質をコー
ドするDNAを細菌に導入し、形質転換させることが可能
になってきた。この遺伝子組み換えの技術を応用し、HB
sAg構造遺伝子（以下、HBsAg遺伝子と略称する）を細菌
内で発現させることができれば、HBV感染の危険性のな
いHBsAgを大量に調整することが可能になり、Ｂ型肝炎
ワクチンの実用化への道が開かれる。
現在知られている４種のサブタイプすなわちadw,adr,ay
w、ayrのうち、欧米に多いayw型についてはHBsAg遺伝子
の存在部位およびその塩基配列が決定され［Galibert,
F,ら,Nature,281,646（1979）;Charnay,P.ら,Nucleic A
cids Res.,7,335（1979）］，雑種蛋白質として大腸菌
内での発現が報告されている［Charnay,P.ら,Nature,28
6,893（1980）;Edman,J.C.ら,Nature,291,503（198
1）］。
また、日本で多く見出されているadw型およびabr型につ
いては、本発明者らの一部はHBsAg遺伝子を含むDNAの創
製に成功し、当該遺伝子のDNA塩基配列ならびにゲノム
上の位置を決定し、さらにこの組み換えDNAを含有する
形質転換体を培養してHBsAgを大量生産する途を開いた
（特開昭58−184897号公報，特開昭58−201796号公報，
特開昭59−74985号公報）。
最近、Machida,A.ら［Gastroenterology,85,268（198
3）；同誌，86,910（1984）］によって示されたよう
に、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原陽性の患者血漿から得られ
たHBsAg小型粒子中には、従来同定されていたＰ−Ｉ
（分子量22〜24キロ・ダルトン）,P−II（分子量25〜2
9.5キロ・ダクトン）などの主要ペプチドに加えて［Pet
erson,D.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74,1530（197
7）］,P31蛋白質（分子量31キロ・ダルトン）とP35蛋白
質（P31に糖が結合した複合蛋白で分子量35キロ・ダル
トン）が存在していることが証明された。P31はＰ−Ｉ
のＮ末端にpre−Ｓ領域の55個のアミノ酸残基が付加し
たもので、この領域中に重合ヒト血清アルブミン（poly
−HSA）の受容体が存在していることも明らかにされて
いる。さらに上記1984年の報告で、上記Ｐ−31蛋白質が
糖鎖を有することも明らかにされている。一方、肝細胞
表面にもpoly−HSAおよびその受容体があることから、p
oly−HSAを介してデン粒子が肝細胞に付着し増殖がおこ
ると考えられている。従って、デン粒子上のpoly−HSA
受容体がP31に対する抗体でマスクされれば、該粒子は
肝細胞と結合できなくなりHBV感染より有効に予防でき
ると期待されている。
一方、P31を各種のプロテアーゼ、例えばトリプシンで
限定分解すると、選択的にP31のＮ末端側より48番目の
アルギニンの部位で切断され、分子量が28Kダルトンの
蛋白質（P28）が生成される。またP31遺伝子を酵母内で
発現させた場合にも、その遺伝子産物は菌体内に多量に
存在するトリプシン様プロテアーゼによって分解されて
P28が生成される傾向がある（第１図）。このP28以外
に、P31のＮ末端側より16と18番目のアルギニンや177と
196番目のリジンは酵母中に存在するトリプシン様プロ
テアーゼによって分解され、30,21,19Kダルトンなどの
蛋白質が生成される可能性がある。
先にもふれたように、Ｂ型肝炎ウィルスｅ抗原陽性の患
者血漿から得られたHBsAg小型粒子中には、Ｐ−Ｉおよ
びＰ−IIなどの主要ペプチドに加え、P31蛋白質とP35蛋
白質（P31に糖が結合した複合蛋白質で分子量35キロ・
ダルトン）が存在している［Stibbe,W.ら,J.Virol.,46,
626（1983）］。特に感染力を有するDane粒子と呼ばれ
るHBV本体は、その表面抗原としてＰ−I,P−IIの他に、
P31蛋白質やP35蛋白質を有している。HBVの感染を防御
するためのワクチンとして望ましいものは、Dane粒子の
持つ表面抗原の種類をできるだけ多くそなえているもの
である。すなわち、Ｐ−ＩやＰ−IIの他に、P31蛋白質
やP35蛋白質がワクチンに含まれていることが望まし
い。組換えDNA技術によるＢ型肝炎ウイルスに対するワ
クチンの製造の試みは、現在世界中でなされているが、
上記の条件を満たしたものは、動物細胞を使ったMiche
l,M.L.ら［Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,7708（198
4）;Bio/Technology,3,561（1985）］等の報告のみであ
る。しかし、彼らは動物細胞を宿主として使用している
ため、コストが非常に高くなる欠点を有している。
（３）問題点を解決するための手段および作用 本発明は （１）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質のＮ末端か
ら48番目のアルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠
損あるいはアルギニンおよびリジン以外のアミノ酸また
はペプチド鎖に置換した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原活
性および重合ヒト血清アルブミン結合能を有するP31修
飾蛋白質、および （２）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質のＮ末端か
ら48番目のアルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠
損あるいはアルギニンおよびリジン以外のアミノ酸また
はペプチド鎖に置換した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原活
性および重合ヒト血清アルブミン結合能を有するP31修
飾蛋白質をコードするDNAを含有するDNAを保持する形質
転換体を培養し、培養物中にP31修飾蛋白質を生成せし
め、これを採取することを特徴とするP31修飾蛋白質の
製造法を提供するものである。
本発明のP31修飾蛋白質をコードするDNAは、いずれのサ
ブタイプ（adr,adw,ayr,ayw）のものであってもよく、
たとえばそれらは下記の方法によって調製することがで
きる。
特開昭59−74985号公報またはNucleic Acids Res.,11,1
747（1983）に記載されている3.19kbのadr型HBV・DNAが
組み込まれたプラスミドpBR322−BamHl/HBr330（pHBr33
0と略称）を制限酵素EcoRIとBamHIで２重消化すると、p
re−Ｓ領域の一部を含む1398bpのDNA断片を得ることが
できる。この断片に の配列を含む適当なアダプターを結合させることによっ
てP31をコードするDNAを作製し、適当なベクターに挿入
する。
他のサブタイプのP31をコードするDNAも上記と同様な方
法で調製することができる。
トリプシン様プロテアーゼ感受性部位の一つであるP31
のＮ末端側より48番目のアルギニンまたはそれを含むペ
プチド鎖を欠損、あるいは他のアミノ酸またはペプチド
鎖に置換したP31修飾蛋白質をコードするDNAを作製する
には、たとえば次のような方法で行なえばよい。
adr型P31遺伝子の場合には、第２図に示されるようにＮ
末端側より48番目のアルギニンをコードする領域に制限
酵素XhoI認識部位が存在する。従ってP31遺伝子をXhoI
で切断した後、エキソヌクレアーゼたとえばヌクレアー
ゼBAL31でアルギニンをコードする領域を除去するか、
あるいはXhoI切断部位をDNAポリメラーゼ・ラージ・フ
ラグメントで修復した後、適当なリンカーを挿入するこ
とによってアルギニンのコドンを消去することができ
る。その中で遺伝子の読み枠（フレーム）が正しく保た
れて（in phase）いるものを選び出せばよい。
また、P31修飾蛋白質をコードするDNAは化学合成したも
のでもよい。その際、48番目のアルギニンまたはそれを
含むペプチド鎖をコードする配列を欠損させるか、ある
いは他のアミノ酸またはペプチドをコードするコドンに
置換して、読み枠を正しく保つように合成すればよい。
また、第５図に示されたプラスミドpBR−Sal−６を制限
酵素SalIとXbaIで分解して得られる257bpDNA断片を、ベ
クターM13 mp11のSalI−XbaI部位に挿入し、これを大腸
菌JM103（Pharmacia P−L Biochemicals）に感染させ
る。成育後、ブロス中に放出されたM13ファージをポリ
エチレングリコールで沈澱させ、ついでフェノール処理
によってM13ファージ１本鎖DNAを得ることができる。
次に、P31のＮ末端側より48番目のアルギニンのコドンA
GGを、例えばグルタミンのコドンCAGに変換するための
プライマー例えばD5′（CCCAGTCGCGAGAAG）3′を化学合
成によって作製することができる。このプライマーと先
に調製したM13DNAとを混合し、DNAポリメラーゼＩラー
ジ、フラグメントの作用によって２本鎖にしたのち、T4
DNAリガーゼの作用によって環状化することができるこ
の環状DNAを大腸菌JM103に導入し、放出されてくるM13
ファージDNAをフィルターに転移させたのち、32Ｐで標
識した該合成プライマーを用いてプラーク・ハイブリダ
イジーション［Maniatis,T,ら Molecular Cloning,A L
aboratory Manneal,Cold Spring Harbor Laboratory,P.
312（1982）］を行う。強いシグナルが検出されたファ
ージからDNAを調製し、制限酵素SalI−XbaIで分解して2
67bpDNA断片を得ることができる。該断片をプラスミドp
BR−Sal−６の267bpSalI−XbaI断片と置換すればP31修
飾蛋白質をコードするDNA（修飾P31遺伝子）が得られ
る。
なお、adw型およびadyw型のP31をコードするDNA上にはX
hoI認識部位が存在しないため、修飾P31遺伝子は上述の
site−directed mutagenesis［smith,M.and Gillam,
S.,Genetic Engineering 3,1（1081）］の手法によって
作製することができる。
HBsAg遺伝子の全体または一部を含むプラスミドDNA、コ
スミドDNA、ファージDNAなどをsite−directed mutagen
esisのための鋳型DNAとして用いることができる。M13フ
ァージやφX174ファージは、１本鎖DNAが容易に調製で
きるので、鋳型DNAとしてより望ましい。例えばM13ファ
ージやφX174ファージにHBsAg遺伝子の全体または一部
が組み込まれたものを使用する時は、ブロス中に存在す
るファージ粒子をポリエチレングルコールで沈澱させ、
フェノール処理で除蛋白を行い、ついでエタノール沈澱
を行いファージ粒子内にあった一本鎖DNAを得ることが
できる。また鋳型DNAとしてHBsAg遺伝子の全体または一
部が組み込まれた２本鎖のプラスミドDNAやコスミドDNA
を用いる時は、２本鎖DNAを100℃で１分から10分、望ま
しくは３分から５分熱処理した後、氷水で急冷し１本鎖
DNAに変性させて使用することができる。
site−directed mutagenesisのためのプライマーは、変
換しようとするDNA配列を持ち、鋳型DNAとハイブリダイ
ズしてDNA合成時のプライマーとして機能しうるもので
あれば、どのようなDNA配列のものでもよい。またプラ
イマーの作製は、どのような方法でもよいが、化学合成
で適当な配列の１本鎖DNAを作ることが望ましい。
このようなプライマーと先に調製した１本鎖DNAと混合
し、DNAポリメラーゼＩラージ・フラグメントの作用に
よって２本鎖DNAに修復した後T4DNAリガーゼの作用によ
って環状化することができる。この環状DNAを大腸菌に
導入した後ラジオアイソトープで標識したプライマーを
プローブに用いて、プラーク・ハイブリダイゼイション
［Maniatis,T,ら Molecular Cloning,A Laboratory Ma
nnual,Cold Spring Harbor Laboratoy,P.312（1982）］
や、コロニー・ハイブリダイゼイション［同P.326］を
行い、目的とする変異体を選び出すことができる。この
ようにして得られたプラークやコロニーからファージDN
AやプラスミドDNAを調製し、該DNAを用いて修飾P31遺伝
子を作製することができる。
Ｎ末端側より48番目のアルギニンを含むアミノ酸または
ペプチドを欠損させる場合、48番目のアルギニンのみを
欠損させるようにDNAを構築してもよく、また48番目の
アルギニンを含むペプチドを欠損させるように構築して
もよい。欠損させるペプチドは、該ペプチドが欠損して
もHBsAg活性および重合ヒト血清アルブミンとの結合能
を保持できるものであれば、いかなる大きさであっても
よいが、Ｎ末端側より26〜55番目のペプチド鎖内で48番
目のアルギニンを含むペプチドを欠損させたものが好ま
しく、44〜49番目のペプチド鎖内で48番目のアルギニン
を含むペプチドを欠損させたものがさらに好ましい。
また、48番目のアルギニンまたはそれを含むペプチドを
欠損させ、アルギニン，リジン以外のアミノ酸，ペプチ
ド鎖を付加させてもよく、付加させるペプチド鎖内のア
ミノ酸数は１〜50個程度、好ましくは１〜４個程度であ
る。
上述のsite−directed mutagenesisの手法により、Ｎ末
端側より16および18番目のアルギニン,177および196番
目のリジンをリジン，アルギニン以外のアミノ酸のコド
ンに置換して修飾P31遺伝子を作製することができる。
上記のトリプシン様プロテアーゼ感受性部位のなかで、
少なくともP31のＮ末端側より48番目のアルギニンまた
はそれを含むペプチド鎖を修飾することが好ましく、P3
1のＮ末端側より48番目のアルギニンまたはそれを含む
ペプチド鎖のみを修飾することがさらに好ましい。
上記の付加または置換に用いられるリジン，アルギニン
以外のアミノ酸のコドンとしては、たとえばアスパラギ
ン，アスパラギン酸，アラニン，イソロイシン，グリシ
ン，グルタミン，グルタミン酸，システィン，セリン，
チロシン，トリプトファン，スレオニン，バリン，ヒス
チジン，フェニルアラニン，プロリン，メチニオン，ロ
イシンなどのコドンがあげられる。
このP31修飾蛋白質をコードするDNAを各種宿主（例、大
腸菌，枯草菌，酵母，動物細胞）で機能するプロモータ
ー領域の３′末端に挿入することにより、修飾P31をコ
ードするDNAを発現させうる組み換えDNAを構築すること
ができる。
プロモーター領域は、RNAポリメラーゼが結合すること
によってmRNA合成を開始させるのに必要な部位を含む領
域であれば、いかなるものであってもよい。
たとえば大腸菌を宿主として用いる場合、修飾P31をコ
ードするDNAを大腸菌で機能しうるプロモーター領域の
３′末端に挿入すれば、修飾P31をコードするDNAを発現
しうる組み換えDNAが構築できる。たとえば、特開昭58
−201796号公報に記載の発現用ベクターpTRP601,pTRP77
1などに、修飾P31をコードするDNAをT4DNAリガーゼの作
用により挿入する。この反応液を用いて、大腸菌（例、
C600株,294株,W3110株,RR1株,PR13株など）を公知の方
法［Cohen,S.N.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110（1
972）］もしくはそれに準ずる方法によって形質転換す
る。
使用するプロモーターは、trpプロモーター（trp−ｐ）
に限定する必要はなく、たとえばreaAプロモーター［特
開昭59−65099号］,lacプロモーター，λPLプロモータ
ーなどを使用してもよい。
上記のようにして得られたP31修飾蛋白質をコードするD
NAを含む新規な組み換えプラスミドDNAを保持する形質
転換体は、たとえばアンピシリン耐性，テトラサイクリ
ン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を表現形として選ぶこ
とができる。これらの耐性株の中からP31修飾蛋白質を
コードするDNAを含有する新規な組み換えプラスミドDNA
を保持する菌株を探し出すには、たとえば次の手法が用
いられる。前述したアダプターの一方の鎖，5′AATTCCA
CTGCATTGRAT3′をT4ポリヌクレオチド・キナーゼによっ
てγ−32P−ATPを用いて放射性同位元素で標識し、これ
を探針（プローブ）として、それ自体公知のコロニー・
ハイブリダイゼーション法［Grunstein,M.and Hogness,
D,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72,3961（1975）］によ
って、すでに得た薬剤耐性の形質転換体の中から陽性を
示すクローンを確実に探し出すことができる。
このようにして選択された形質転換体をそれ自体公知の
培地で培養する。培地としては、例えばＬベロス，ペナ
セイ（Penassay）ブロスおよびグルコース，カザミノ酸
を含むＭ−９培地［Miller,J.,Experiments in Molecul
ar Genetics,431.433（Cold Spring Harbor Laborator
y,New York,1972）］が挙げられる。ここに、必要によ
りプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３
β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることが
できる。
該形質転換体の培養は通常15〜43℃，好ましくは28〜40
℃で２〜４時間，好ましくは４〜16時間行い、必要によ
り通気や攪拌を加えることもできる。
宿主として、たとえば酵母を利用するときは、酵母形質
転換体を次のように作製することができる。大腸菌−酵
母シャトル・ベクターYEp13［Broach,J.R.ら,Gene8,121
（1979）］,pSH15とpSH19［Harashima,S.ら,Mol.Cell.B
iol.,4,771（1984）］に、酵母プロモーター領域，たと
えば抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子プロモーター領域
［Meyhack,B.ら,EMBO J.,6,675（1982）］，グリセルア
ルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモー
ター領域［Holland,J,P.and Holland,M.J.,J.Biol.Che
m,255,2596（1980）］，あるいは３−ホスホグリセリン
酸キナーゼ遺伝子のプロモーター領域［Dohson,M.J.ら,
Nucleic Acids Res.,10,2625（1982）］を挿入したの
ち、その直後にP31修飾蛋白質をコードするDNAをT4DNA
リガーゼの作用によって結合させる。またP31修飾蛋白
質をコードするDNAの直後に、転写を終結させる信号
（ターミネーター）を挿入し、P31修飾蛋白質の生産量
を増大させることもできる。ターミネーターとしては、
たとえば３−ホスホグセリン酸キナーゼ遺伝子やグリセ
ルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子など
の３′−非翻訳領域が使用できる。この反応液を用い
て、前述の宿主大腸菌を前述のCohenらの方法によって
形質転換する。このようにして得られたP31修飾蛋白質
をコードするDNAを含む新規な組み換えDNAを保持する形
質転換体は、たとえばアンピシリン耐性を表現型として
選ぶことができる。この耐性株の中からP31修飾蛋白質
をコードするDNAをもつ新規な組み換えプラスミドDNAを
保持する菌株を探し出すには、前述の方法が同様に用い
られる。
このようにして選択された形質転換体からプラスミドDN
Aをアルカリ抽出法［Birnboin,H.C.and Doly,J.,Nuclei
c Acids.Res.,7,1513（1979）］によって単離し、これ
を用いて酵母、たとえばロイシン要求性のサッカロミセ
ス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae），たとえ
ばAH22R-（leu2 his4 can1 cir+ pho80）［Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,80,1（1983）］あるいはAH22R-より誘導さ
れたK33−7B（pho80−AH22,pho8−２）またはK33−8D
（pho80−AH22,pho8−2trp1）を、公知の方法［Hinnen,
A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1927（1978）］また
はそれに準ずる方法によって形質転換する。宿主として
の酵母はこれらに限定されることはないが、サッカロミ
セス・セレビシェが好ましい。
得られた酵母の形質転換体は、それ自体公知の培地で培
養する。培地としては、たとえばBurkholder最小培地
［Bostian,K.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4505（1
980）］が挙げられる。
酵母の形質転換体は培養は通常15℃〜40℃，好ましくは
24℃〜37℃で10〜96時間，好ましくは24〜72時間行い、
必要により通気や攪拌を加えることもできる。
宿主として、たとえば枯草，動物細菌を使用する場合に
おいては枯草菌，動物細胞を使用する場合においては枯
草菌・動物細胞で機能しうるプロモーター領域の３′末
端にP31修飾蛋白質をコードするDNAを挿入し、自体公知
の方法により、該組み換えDNAを宿主を形質転換させ、
形質転換体を培養することにより、P31修飾蛋白質を製
造することができるが、宿主としては酵母がより好まし
い。
生成物の修飾P31活性は、たとえば試料をブロムシアン
で活性化されたセルロース・ペーパーに結合させたの
ち、オーストリアII−125（ダイナボット社）の125I−
抗HBsAg抗体と反応させるdirect immunoassay法［Fujis
awa,Y.ら,Nucleic Acids Res.,11,3581（1983）］によ
って測定することができる。
培養後、公知の方法で菌体を集め、大腸菌の形質転換体
の場合には菌体を尿素，塩酸グアニジンなどの蛋白変性
剤を含む緩衝液に懸濁し、冷所で攪拌したのち、遠心分
離により修飾P31を含む上澄液を得る方法、あるいは緩
衝液に懸濁し、超音波処理、リゾチームおよび（また
は）凍結融解によって菌体を破壊したのち、遠心分離に
より修飾P31を含む上澄液を得る方法などが適宜用い得
るが、例えば菌体を集めて緩衝液に懸濁し、リゾチーム
を加えてホモジナイズして溶菌後、尿素（３〜10M）を
含む緩衝液を加え攪拌（０〜10℃で0.5〜８時間）後、
遠心分離して上澄を得る方法が好ましい。
酵母の形質転換体の場合にはザイモリエース［キリンビ
ール（株）製］による溶菌あるいはガラスビースなどに
よる機械的破砕によって菌体を破壊する。ここへ、トリ
トンＸ−100,デオキシコーレートなどの界面活性剤，尿
素あるいは塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を加えるこ
とによって修飾P31をより有利に抽出することができ
る。
修飾P31抽出液を、10mM EDTAと1mMジイソプロピルフル
オロ燐酸等のプロテアーゼ阻害剤を含む10mMリン酸緩衝
液で平衡化したDEAE−ToyopearlやButyl−Toyopearlを
用いるクロマトグラフイー処理に付すことができる。ま
た、修飾P31の分離・精製は、アフィニティークロマト
グラフイー処理によって効率的に実施することができ
る。これらのカラムに吸着した修飾P31は、適切に設定
した濃度の塩を含む緩衝液を用いて溶出することができ
る。修飾P31を含む溶出画分を集め、所望により限界ろ
過等により濃縮することができる。
上記抽出液からのP31修飾蛋白質の分離，精製は、アフ
ィニティークロマトグラフィー処理を含む精製工程によ
り行われる。
アフィニティークロマトグラフィーとしては、重合ヒト
血清アルブミン（poly−HSA）をリガンドとするアフィ
ニティークロマトグラフィーやHBsAgに対する抗体、と
りわけモノクローナル抗体を用いる抗体カラム処理が挙
げられる。
poly−HSAをリガンドとするアフィニティークロマトグ
ラフィーはP31修飾蛋白質の精製に極めて有利に用いら
れる。
アフィニティークロマトグラフィーの担体としてフォル
ミルセルロファイン（生化学工業），アフィゲル−15
（バイオラッド社）などが用いられ、とりわけフォルミ
ルセルロファインが好ましい。
poly−HSAはヒト血清アルブミンを架橋剤（例えばグル
タルアルデヒド）を用いて重合することにより製造でき
る。これを上記担体に、例えば還元剤（NaCNBH3など）
を用いて結合させ、所望により洗浄し担体とpoly−HSA
の結合物を得て、これを通常カラムに詰めて使用する。
P31蛋白質をpoly−HSAをリガンドするアフィニティーク
ロマトグラフィーにより精製するには、前記P31含有溶
液（菌体抽出上澄）を、緩衝液［リン酸緩衝液など］で
平衡化した上記カラムに吸着させ、緩衝液で溶出する。
該緩衝液には界面活性剤（Tween 20など）または蛋白変
性剤（尿素）などを適量加えて使用でき、これら添加物
の種類や濃度を組合せ、適切な溶出液として用いること
ができる。
P31蛋白質を含む溶出画分を集め、所望により限外ろ過
等により濃縮する。
該濃縮を、セルファクリールＳ−300などを用いるゲル
ろ過処理に付すことができる。修飾P31はvoid volume付
近に溶出される。
各種クロマトグラフイーによって得られる修飾P31を含
む画分は、さらに、ショ糖グラジエント超遠心，塩化セ
シウムグラジエント超遠心などの精製工程で精製するこ
とができる。
本発明のP31修飾蛋白質は、公知のHBV感染者の血液を原
料にして製造されたHBsAg小型粒子と同様の生物活性を
有し、該HBsAg小型粒子と同様にしてHBV感染の診断のた
めの抗原およびHBVの予防のためのワクチンとして用い
ることができる。
なお、本願明細書および図面において、塩基やアミノ酸
などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commisson on
Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙
げる。またアミノ酸に関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
DNA デオキシリボ核酸 RNA リボ核酸 mRNA メッセンジャーRNA Ａ アデニン Ｔ チミン Ｇ グアニン Ｃ シトシン dATP デオキシアデノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 SDS ドデジル硫酸ナトリウム DTT ジチオスレイトール Gly グリシン Ala アラニン Val バリン Leu ロイシン Ile イソロイシン Ser セリン Thr スレオニン Cys システィン 1/2Cys ハーフシスチン Met メチオニン Glu グルタミン酸 Asp アスパラギン酸 Lys リジン Arg アルギニン His ヒスチジン Phe フェニルアラニン Tyr チロシン Trp トリプトファン Pro プロリン Asn アスパラギン Gln グルタミン Aprアンピリシン耐性遺伝子 Txrテトラサイクリン耐性遺伝子 ars1 オートノマス・レプリケーション・シークエ
ンス１（autonomous replication sequence 1） IR インデーテッド・リピート（inverted rep
erat） （４）実施例および発明の効果 以下に参考例および実施例を示して本発明をさらに具体
的に説明するが本発明はこれらに限定されるべきもので
はない。
参考例１ 酵母抑制性酸性ホスファターゼ・プロモータ
ー（PHO5−Ｐ）を含有する発現用ベクターの作製 酵母Saccharomyces serevisiae S288C株由来の抑制性酸
性ホスファターゼ遺伝子（PHO5）と構成性酸性ホスファ
ターゼ遺伝子（PHO3）を含む7.9kbDNA断片を含む大腸菌
プラスミド（pJA1）［Kramer,R.A,and Anderson,N,Pro
c,Natal.Acad.Sci.USA,77,6541（1980）］,50μｇに20
ユニットの制限酵素BamHI［宝酒造（株）製］と20ユニ
ットの制限酵素SalI［宝酒造（株）製］を100μｌの反
応液［10mMTris−HCl（pH8.0）,7mM Mgcl2,100nM NaCl,
2nM2−メルカプトエタノール］中で37℃,3時間作用させ
た後、1.0％アガロース（Sigma社製））・スラブゲルを
用いて緩衝液［100mMTris−HCl,100mMホウ酸,2mM EDTA
（pH8.3）］中,140V,2時間電気泳動にかけた。泳動後、
0.63kbのDNA断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入
し、泳動用緩衝液内に沈め、該DNA断片をゲルから電気
的に溶出した［McDonell,M.W.ら,J.Mol・Biol,110,119
（1977）］。透析チューブ内液をフェノール抽出さらに
エーテル抽出した後、NaClを0.2Mになるように加え、つ
づいて２倍量の冷エタノールを加えて−20℃でDNAを沈
澱させた。
１μｇのプラスミドpSH19に２ユニットの制限酵素BamHI
と２ユニットの制限酵素SalIを20μｌの反応液［10mM T
ris−Hcl（pH8.0）,7mM Mgcl2,100mM NaCl,2mM2−メル
カプトエタノール］中で37℃,2時間作用させた後、該反
応液を0.8％アガロース・スラブゲルを用いて上述の条
件下で電気泳動にかけた。泳動後、8.0kbDNA断片を上述
の方法によってゲルから分取し、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールでDNAを沈澱させた（第10図参照）。
該8.0kbDNA断片400ngと前記0.63kbDNA断片200ngとを混
合し、20μｌの反応液［66mMTris−Hcl（pH7.6）,6.6mM
MgCl2,10mMジチオスレイトール,1mMATP,2ユニットのT4
DNAリガーゼ（宝酒造（株）製）］中、14℃で一夜作用
させてDNAを結合させた。この反応液を用いて大腸菌294
株を前記Cohenらの方法に従って形質転換した。アンピ
シリン耐性を指標として選択された形質転換体の中か
ら、プラスミドDNAを前記アルカリ抽出法によって単離
し、分子量と制限酵素による分解パターンを調べ、pSH1
9のBamHI−SalI部位に、pJA1から単離された0.63kbDNA
断片が挿入されたプラスミドpPHO12を分離した（第10図
参照）。
３μｇのプラスミドpPHO12DNAに２ユニットの制限酵素S
alIを20μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,7mM M
gCl2,175mM NaCl,0.2MEDTA,7mM2−メルカプトエタノー
ル］中で37℃,2時間作用させた後、フエノールで除蛋白
し、冷エタノールでDNAを沈澱させた。このDNA,3μｇに
12ユニットのBAL31ヌクレアーゼ（Bethesda Research L
aboratories社製）を50μｌの反応液［20mM Tris−HCl
（pH8.1）,12mMCaCl2,12mMMgCl2,1mM EDTA］中で30℃,2
分間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノー
ルでDNAを沈澱させた（第10図参照）。
200ngのXhoIリンカーｄ（CCTCGAGG）［New England Bio
Labs社製］に３ユニットのT4ポリヌクレオチド・キナー
ゼ［宝酒造（株）製］を50μｌの反応液［50mMTris−HC
l（pH7.6）,10mMMgCl2,10mM2−メルカプトエタノール,1
00μMATP］中で37℃,1時間作用させて、５′末端をリン
酸化した。
40ngの５′末端がリン酸化されたXhoIリンカー［５′−
Ｐ−ｄ（CCTCGAGG）］と400ngの前述のBAL−31で処理さ
れたpPHO12DNAとを混合し、前述の条件下でT4DNAリガー
ゼの作用で結合させた。この反応液を用いて大腸菌294
株をCohenらの方法に従って形質転換した。アンピシリ
ン耐性を指標として選択された形質転換体の中から、プ
ラスミドDNAを前記アルカリ抽出法によって単離し、Bam
HIとXhoIによる２重消化物の大きさが0.55kbであるプラ
スミドpPHO17を選択した。BAL−31ヌクレアーゼ処理に
よって、PHO5の開始コドンATGの上流20bpが除去された
ことが、Dideoxynucleotide法［Sanger,F.ら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,74,5463（1977）］によるDNA塩基配列
の分析によって明らかになった（第10図参照）。
次に、該プラスミドpPHO17,2μｇに４ユニットの制限酵
素XhoI［宝酒造（株）製］を20μｌの反応液［6mMTris
−HCl（pH7.9）,150mMNaCl,6mM MgCl2,6mM2−メルカプ
トエタノール］中で37℃,2時間作用させた後、フェノー
ルで除蛋白し、冷エタノールでDNAを沈澱させた。
該DNA1μｇに５ユニットのDNAポリメラーゼＩ ラージ
・フラグメント（New England BioLabs社製）を30μｌ
の反応液［40mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）,6.6mMM
gCl2,1mM2−メルカプトエタノール,33μMdATP,33μMdGT
P,33μMdTTP.33μMdCTP］中で12℃,30分間作用させて、
接着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白し、
冷エタノールでDNAを沈澱させた。該DNA断片400ngと、
前述の条件下でリン酸化されたSalIリンカー［５′−Ｐ
−ｄ（GGTCGACC）］（New England BioLabs社製）,50ng
とを混合し、前述の条件下でT4DNAリガーゼの作用で結
合させた。この反応液を用いて大腸菌294株をCohenらの
方法に従って形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転
換体の中から、プラスミドpPHO17のXhoI部位がSalI部位
に変換したプラスミドpPHO17−１を取得した（第10図参
照）。
参考例２ 酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ・プロモー
ター（PGK−Ｐ）を含有する発現用ベクターの作製 ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（PGK）のクロ
ーニング Cryer,D.R.らの方法［Methods in Cell Biology,Vol.XI
I,39〜44（1975）］によって調整されたSaccharomyces
cerevisiae協会３号株（IFOから入手できる）の染色体D
NA,350μｇに200ユニットの制限酵素HindIII［宝酒造
（株）製］を1mlの反応液［10mMTris−HCl（pH7.5）,7m
MMgCl2,60mMNaCl］中37℃,3時間作用させた後、１％ア
ガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下
で電気泳動をかけた。泳動後、アガロースゲルを分割す
ることによりDNA断片を大きさの順に１から10の画分に
分けた。各画分のアガロースゲル片をそれぞれ透析チュ
ーブに封入し、参考例１に記載の条件下でゲル片からDN
Aを電気的に溶出した。溶出液をフェノール処理した
後、冷エタノールを加えてDNAを沈澱させた。各画分か
らのDNA0.5μｇを１％アガロース・スラブゲルを用いて
参考例１に記載の条件下で電気泳動を行った後、ニトロ
セルロースフィルター（Schleicher and Schull社製）
にSouthernの方法［Southern,E.M.,J.Mo1.Biol.,98,503
（1975）］に従ってDNAを吸着させた。PGK［Dobson,M.
J.ら,Nucleic Acids Res,10,2625（1982）］のＮ末端側
からの５個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド
に相補な５′−TGAAGATAAAGACAT−３′をCrea,R.ら［Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,75,5765（1978）］の方法によっ
て合成し、該オリゴヌクレオチド１μｇに10μCiのγ［
32P］ATP（Amersham社製）と10ユニットのT4ポリヌクレ
オチド・キナーゼとを30μｌの反応液［50mMTris−HCl
（pH7.6）,10mMMgCl2,10mM2−メルカプトエタノール］
中で37℃,30分間作用させ、５′末端を32Pで標識した。
該反応液に200mMEDTA（pH8.0）を10μｌ添加し、１容量
のフェノールで除蛋白した後、TEN緩衝液［10mMTris−H
Cl（pH8.0）,200mMNaCl,1mMEDTA］で平衡化したセファ
ロース4B（Pharmacia社製）・カラム（0.25×25cm）に
かけてvoid volume付近に溶出される標識された該オリ
ゴヌクレオチドを集め、PGK遺伝子をスクリーニングす
るためのプローブとして用いた。上記のニトロセルロー
スフィルターと該プローブを用いて前記Southernの方法
でブロッティングを行ったところ、プローブは、2.6kb
〜2.9kbDNA断片が含まれる分画番号３の試料と強くハイ
ブリダイズした。
次に、クローニング・ベクターpTR262［Roberts,T.M.
ら,Gene,12,123（1980）］,10μｇに10ユニットの制限
酵素HindIIIを50μｌの反応液［10mMTris−HCl（pH7.
5）,7mMMgCl2,60mMNaCl］中で37℃,2時間作用させた
後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでDNAを沈澱
させた（HindIII消化pTR262）。HindIII消化pTR262 0.1
μｇと分画番号３のDNA0.2μｇとを混合し、参考例１に
記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用によって結合させ
た。該反応液を用いて大腸菌DH1［Maniatis,T.ら,Molec
ular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,254〜25
5（1982）］を形質転換させ、テトラサイクリン耐性を
示す形質転換体約1300個を得た。
この中からPGK遺伝子を含有する形質転換体を、上述の
32P標識合成プローブを用いるコロニー・ハイブリダイ
ゼーション［Suggs,S.V.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
8,6613（1981）］によって選択した。オートラジオグラ
フィーで強いシグナルが認められた形質転換体から、前
述のアルカリ抽出法によってプラスミドpPKT3を単離
し、HindIIIで分解したところ2.95kbDNAのインサートが
検出され、Southernの方法で調べると該インサートは該
プローブとハイブリすることが確認された。
PGKプロモーター断片の単離 プラスミドpPKT3DNA50μｇに50ユニットの制限酵素Hind
IIIを100μｌの反応液［10mMTris−HCl（pH7.5）,7mMMg
Cl2,60mMNaCl］中で37℃,2時間作用させた後、１％アガ
ロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で
電気泳動にかけた。泳動後、2.95kbDNA断片を参考例１
に記載の方法によってゲルから分取した（第11図参
照）。
該2.95kbDNA断片５μｇに５ユニットの制限酵素SalIを2
0μｌの反応液［10mMTris−HCl（pH7.5）,7mMMgCl2,175
mM NaCl,7mM2−メルカプトエタノール］中で37℃,3時間
作用させた後、1.2％アガロース・スラブゲルを用いて
参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、
2.1kbDNA断片を参考例１に記載の方法によつてゲルから
分取した。該2.1kbDNA断片0.5μｇと、プラスミドpBR32
2のHindIII−SalI消化によって得られた3.74kbDNA0.5μ
ｇとを混合し、参考例１に記載の条件下でT4DNAリガー
ゼの作用によって結合させた。該反応液を用いて大腸菌
DH1を形質転換させ、アンピシニン耐性の形質転換体か
ら所望するプラスミドpPKT101を取得した（第11図参
照）。
次に、PGK遺伝子の構造遺伝子領域を取り除くために、
まず該プラスミドpPKT101DNA10μｇに10ユニットの制限
酵素SalIを30μｌの反応液［10mMTris−HCl（pH7.5）,7
mMMgCl2,175mMNaCl,0.2MEDTA,7mM2−メルカプトエタノ
ール］中で37℃,3時間作用させ、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールでDNAを沈澱させた（SalI消化pPKT10
1）。つづいて、SalI消化pPKT101 1μｇに10ユニットの
BAL31ヌレクアーゼを20μｌの反応液［20mMTris−HCl
（pH8.1）,12mMCaCl2,12mMMgCl2,1mMEDTA］中で室温,5
分間作用させた後、直ちに１容量のフェノールを加えて
反応を停止させ、冷エタノールでDNAを沈澱させた（BAL
消化pPKT101）。参考例１に記載されたリン酸化XhoIリ
ンカー50ngとBAL消化pPKT1010.2μｇを混合し、参考例
１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用によつて結合
させた。その後、該反応液を大腸菌DH1を形質転換さ
せ、アンピシリン耐性を示す形質転換体の中から、pPKT
101のSalIサイトからプロモーター領域の方向へ0.69kb
が除かれたプラスミドpPKT567を得た。Dideoxynuleotid
e法によってDNA塩基配列を調べたところ、pPKT567ではB
AL31の作用によってPGK構造遺伝子と５′−近傍領域−2
4までが除かれたことが証明された（第11図参照）。
発現用ベクターの構築 大腸菌−酵母シャトル・ベクタ−pSH19 5μｇに６ユニ
ットの制限酵素SalIを20μｌの反応液［10mMTris−HCl
（pH7.5）,7mMMgCl2,175mMNaCl,0.2mMEDTA,7mM2−メル
カプトエタノール］中で37℃,2時間作用させ、フェノー
ルで除蛋白し、冷エタノールで沈澱させた。該DNA1μｇ
にDNAポリメラーゼＩ ラージ・フラグメントを参考例
１に記載の条件下で作用させ、SalIの接着末端を平滑末
端に変えた。該DNA断片500ngと参考例１に記載された酸
化XhoIリンカー50ngとを混合し、参考例１に記載の条件
下でT4DNAリガーゼの作用によって結合させた。該反応
液で大腸菌DH1を形質転換させ、アンピシリン耐性の形
質転換体の中から、pSH19のSalI部位がXhoI部位に転換
したプラスミドpSH19−１を保持する形質転換体を得た
（第11図参照）。
該プラスミドpSH19−1DNA15μｇに24ユニットの制限酵
素HindIIIを100μｌの反応液［10mMTris−HCl（pH7.
5）,7mMMgCl2,60mMNaCl］中で37℃,10分間作用させた
後、直ちに0.2MEDTAを10μｌ添加し反応を停止させた。
反応液を、0.7％アガロース・スラブゲルを用いて参考
例１に記載の条件下で電気泳動にかけ、HindIIIで１箇
所切断された8.3kbDNA断片を参考例１に記載の方法でゲ
ルから分取した。該8.3kbDNA断片３μｇに10ユニットの
制限酵素XhoI［宝酒造（株）製］を30μｌの反応液［10
mMTris−HCl（pH7.5）,7mMMgCl2,100mMNaCl,7mM2−メル
カプトエタノール］中で37℃,2時間作用させた後、0.7
％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条
件下で電気泳動を行った。泳動後、7.7kbDNA断片を参考
例１に記載の方法によってゲルから分取した（第11図参
照）。
参考例２のに記載のプラスミドpPKT567DNA10μｇに、
各10ユニットの制限酵素HindIIIとXhoIとを50μｌの反
応液［50mMTris−HCl（pH7.6）,50mMNaCl,1mMジチオス
レイトール,10mMMgCl2］中で37℃,2時間作用させた後、
1.2％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載
の条件下で電気泳動を行い、1.40kbDNA断片をゲルから
分取した（第11図参照）。
該1.40kbDNA断片0.2μｇと上述の7.7kbDNA断片0.5μｇ
とを混合し、参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼ
の作用によって結合させた。該反応液で大腸菌DH1を形
質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体の中から、
所望するプラスミドpPKT700を保持する形質転換体を取
得した。次に、参考例１に記載した方法に従って、該プ
ラスミドpPKT700のXhoI部位がSalI部位に変換されたプ
ラスミドpPKT700−１を作製した（第11図参照）。
参考例３ 酵母グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵
素・プロモーター（GLD−Ｐ）を含有する発現用ベクタ
ーの作製 グリセルアルデヒド ３−リン酸脱水素酵素遺伝子
（GLD）のクローニング GLDのうちのpgap491［Holland,J.P.ら,J.Biol.Chem,25
8,5291（1983）］のＮ末端側からの５個のアミノ酸をコ
ードするオリゴヌクレオチドに相補な５′−AGCAACTCTA
ACCAT−３′を前述のCrea,R.らの方法によって合成し、
参考例２のに記載の方法に従って32Ｐで標識し、プロ
ーブとして用いた。参考例２のに記載したニトロセル
ロースフィルターと該プローブを用いてSouthernブロッ
ティングを行ったところ、プローブは2.0〜2.3kbDNA断
片が含まれる分画番号７の試料と強くハイブリダイズし
た。
参考例２のに記載されたHindIII消化pTR262 0.1μｇ
と分画番号７のDNA0.2μｇとを混合し、参考例１に記載
の条件下でT4DNAリガーゼの作用によって結合させた。
該反応液を用いて参考例２のに記載した方法で大腸菌
DH1を形質転換させ、テトラサイクリン耐性形質転換体
約1200個を取得し、コロニー・ハイブリダイゼーション
によって32Ｐ標識プローブと強くハイブリする形質転換
体を分離した。この形質転換体から前述のアルカリ抽出
法によってプラスミドpGLD9を単離し、HindIIIで分解し
たところ、2.2kbインサートDNAが検出され、Southernの
方法で調べると、このインサートDNAは該プローブとハ
イブリすることが確認された（第12図参照）。
GLDプロモーター断片の単離 プラスミドpGLD9DNA100μｇに50ユニットの制限酵素Hin
dIIIを200μｌの反応液［10mMTris−HCl（pH7.5）,7mMM
gCl2,60mMNaCl］中で37℃,3時間作用させた後、1.0％ア
ガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下
で電気泳動にかけた。泳動後、2,2kbDNA断片を参考例１
に記載の方法によってゲルから分取した。該2.2kbDNA断
片10μｇに10ユニットの制限酵素HinfI［宝酒造（株）
製］を50μｌの反応液［10mMTris−HCl（pH7.5）,7mMMg
Cl2,100mM NaCl,7mM 2−メルカプトエタノール］中で37
℃,2時間作用させた後、GLD用プローブを用いてSouther
nの方法によってハイブリダイゼーションを行ったこと
ろ、該プローブは0.5kbDNA断片と結合した（第12図参
照）。
該0.5kbDNA断片５μｇに、各10ユニットの制限酵素HhaI
［宝酒造（株）製］とTaqI（New England Biolabs社
製）とを30μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,50
mM NaCl,10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール］中で37
℃,3時間作用させた後、1.5％アガロース・スラブゲル
を用いて参考例１に記載された条件下で電気泳動にかけ
た。泳動後、0.36kbDNA断片を参考例１に記載の方法に
よってゲルから分取した（第12図参照）。
該0.36kbDNA断片１μｇにDNAポリメラーゼＩ ラージ・
フラグメントを参考例１に記載の条件下で作用させ、Ta
qIの接着末端を平滑末端に変えた。次に、この断片１μ
ｇと参考例１に記載されたリン酸XhoIリンカー50ngとを
混合し、参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼを作
用させて結合させた。反応後、過剰量のXhoIを加え37
℃,3時間作用させ、次に参考例２のに記載した条件下
でセフアローズ4B・カラムを用いてリンカーの結合した
0.36kbDNA断片を分離した。
一方、上述の2.2kbDNA10μｇにDNAポリメラーゼＩ ラ
ージ・フラグメントを参考例１に記載の条件下で作用さ
せ、接着末端を平滑末端に変えた後、参考例１に記載さ
れた条件下でリン酸化されたBamHIリンカー［５′Ｐ−
ｄ（CGCGGATCCCGCG）］（New England BioLabs社製）50
ngを参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用に
より結合させた。反応後、20ユニットのBamHIを加え
て、37℃,3時間作用させ、次に参考例２のに記載した
条件下でセフアローズ4B・カラムを用いてリンカーの結
合した2.2kbDNA断片を分離した。該DNA断片６μｇに２
ユニットの制限酵素HhaIを50μｌの反応液［10mMTris−
HCl（pH7.5）,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM ジチオスレイ
トール］中で37℃,2時間作用させた後、1.0％アガロー
ス・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電気
泳動にかけた。泳動後、0.75kbDNA断片を参考例１に記
載の方法によってゲルから分取した（第12図参照）。
発現用ベクターの構築 参考例２のに記載のプラスミドpSH19−1 DNA10μｇに
各10ユニットの制限酵素BamHIとXhoIとを50μｌの反応
液［10mMTris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,100mM NaCl,7m
M2−メルカプトエタノール］中で37℃,2時間作用させた
後、1.0％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に
記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、8.0kbのDNA
断片を参考例１に記載の方法によってゲルから分取し
た。
該8.0kbのDNA断片500ng,参考例３のに記載の0.36kbDN
A断片200ngおよび0.75kbDNA断片200ngとを混合し、参考
例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用により結合
させた。該反応液を用いて大腸菌DH1を形質転換させ、
アンピシリン耐性形質転換体の中から３種のDNA断片が
結合したプラスミドpGLD906を保持する形質転換体を分
離した。次に、参考例１に記載した方法に従って、該プ
ラスミドpGLD906のXhoI部位がSalI部位に変換されたプ
ラスミドpGLD906−１を作製した（第12図参照）。
参考例４ adr型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原P31遺伝子を
発現する組み換えDNA分子の構築および該DNA分子による
大腸菌の形質転換 特開昭59−74985号公報およびNucleic Acids Res.11,17
47（1983）に記載されているプラスミドpBR322−BamHI/
HBr330DNA（pHBr330とも略す）は、特開昭58−201796号
公報に記載されている参考例１の方法によって調製し
た。該プラスミドpHBr330 50μｇに各20ユニットの制限
酵素EcoRI［宝酒造（株）製］とBamHIとを100μｌの反
応液100mM Tris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,50mM NaCl,7
mM2−メルカプトエタノール］中で37℃,3時間反応させ
た後、1.0％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１
に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、1.4kbDNA
断片を参考例１に記載の方法によってゲルから分取した
（第13図参照）。
２μｇのプラスミドpBR322DNAに各２ユニットの制限酵
素BamHIとClaI（New England BioLabs社製）とを20μｌ
の反応液［10mMTris−HCl（pH8.0）,7mM MgCl2,100mM N
aCl,2mM 2−メルカプトエタノール］中で37℃,2時間反
応させた後、0.8％アガロース・スラブゲルを用いて参
考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、4.
01kbDNA断片を参考例１に記載の方法によってゲルから
分取した。
500ngの前記4.01kbDNA断片,500ngの前記1.4kbDNA断片お
よび参考例１で記載の方法によって５′末端がリン酸化
された合成アダプターｄ とを参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用に
よって結合させた。なお、上記アダプターはトリエステ
ル法［Crea,R.ら,Proc.Nafl.Acad.Sci.USA,75,5765（19
78）］を用いて化学合成された。この反応液を用いて大
腸菌294株を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転
換体から前記３種のDNAが結合したプラスミドpHBrP31DN
Aが得られた（第13図参照）。
１μｇのプラスミドpHBrP31DNAに２ユニットの制限酵素
BamHIを20μｌの反応液［10mMTris−HCl（pH8.0）,7mM
MgCl2,100mM NaCl,2mM 2−メルカプトエタノール］中で
37℃,2時間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エ
タノールを加えてDNAを沈澱させた（BamHI消化pHBrP3
1）。
500ngのBamHI消化pHBrP31にDNAポリメラーゼＩ ラージ
・フラグメントを、参考例１に記載の条件下で作用させ
て、接着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールでDNAを沈澱させた。該DNA断片300ng
と、参考例１に記載の方法で５′末端がリン酸化された
PstIリンカー［５′Ｐ−ｄ（GCTGCAGC）］（New Englan
d Biolabs社製）50ngとを参考例１に記載の条件下でT4D
NAリガーゼの作用により結合させた。該反応液を用いて
大腸菌294株を形質転換させ、形質転換体を参考例１に
記載の方法によって調べ、プラスミドpHBrP31のBamHI部
位がPstI部位に変換したプラスミドpHBrP31−17を分離
した（第13図参照）。
該pHBrP31−17 50μｇに各20ユニットの制限酵素ClaIと
PstI［宝酒造（株）製］とを100μｌの反応液［10mMTri
s−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,50mM(NH4)2SO4］中で37
℃,3時間作用させた後、反応液を1.0％アガロース・ス
ラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動に
かけた。泳動後、1.42kbDNA断片を参考例１に記載の方
法でゲルから分取した。
特開昭58−201796号公報およびNucleic Acids Res.,11,
13581（1983）に記載の発現用ベクターpTRP771 50μｇ
に制限酵素ClaIとPstIとを前記100μｌの反応液中で同
一条件下で反応させた後、反応液を1.0％アガロース・
スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動
にかけた。泳動後、3.3kbDNA断片を参考例１に記載の方
法でゲルから分取した。
200ngの該1.42kbDNA（P31をコードするDNA）と500ngの
3.3kbDNAとを参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼ
の作用によって結合させた。該反応液を用いて大腸菌29
4株を形質転換させ、参考例１の方法に従って該P31をコ
ードするDNAが発現用ベクターに挿入されたプラスミドp
TRP P31−Ｒを保持する大腸菌株（294/pTRPP 31−Ｒ）
を分離した（第13図参照）。
また、プラスミドpTRP P31−Ｒを用いて、大腸菌C600を
形質転換し、大腸菌C600/pTR P31−Ｒを得た。
参考例５ adr型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原P31遺伝子
を発現する酵母用組み換えDNA分子の構築および該DNA分
子による酵母の形質転換 参考例４に記載されたプラスミドpHBrP31DNA,50μ
ｇに各ユニットの制限酵素ClaIとBamHIとを100μｌの反
応液［100mMTris−HCl（pH8.0）,7mM MgCl2,100mM NaC
l,2mM 2−メルカプトエタノール］中で37℃,3時間作用
させた後、反応液を1.0％アガロース・スラブゲルを用
いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動
後、1.42kbDNA断片を参考例１に記載の方法でゲルから
分取した。
２μｇの該1.42kbDNA断片にDNAポリメラーゼＩ ラージ
・フラグメントを参考例１に記載の条件下で作用させて
接着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白し、
冷エタノールでDNAを沈澱させた。該DNA1.5μｇと参考
例１に記載のリン酸化SalIリンカー,50ngとを参考例１
に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用により結合させ
た。該反応液に10ユニットの制限酵素SalIを添加し、37
℃,3時間作用させて接着末端を生成させた。反応後、フ
ェノールで除蛋白し、試料を参考例２のに記載された
条件下でセファローズ4B・カラムにかけ、void volume
付近に溶出されてくる1.42kbDNA断片（adr型P31をコー
ドするDNA）を含む画分を集め、冷エタノールで該DNAを
沈澱させた（第14図参照）。
１μｇの参考例１に記載された発現用ベクターpPHO17−
1DNAに２ユニットの制限酵素SalIを20μｌの反応液［6m
M Tris−HCl（pH7.5）,6mM MgCl2,150mM NaCl,6mM 2−
メルカプトエタノール］中で37℃,3時間作用させ，次に
0.1ユニットのアルカリ性ホスファターゼを添加して65
℃,30分間反応を続けた。反応後、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールを加えてDNAを沈澱させた（SalI消化p
PHO17−１）。
次に、200ngの前記1.43kbDNA断片と200ngのSalI消化pPH
O17−１とを、参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼ
の作用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌294
株を形質転換させ、形質転換体を参考例１に記載された
方法によって調べ、adr型P31をコードするDNAを含む1.4
3kbDNA断片がPHO5プロモーターと順方向に挿入されたプ
ラスミドpPHO P31−Ｒを保持する菌株（Escherichia co
li 294/pPHO P31−Ｒ）を分離した。この形質転換体よ
りアルカリ抽出法によって分離された該プラスミドpPHO
P31−Ｒを用いて酵母宿主Saccharomyces cerevisiae A
H22R-を前述のHinnenらの方法で形質転換させ、該プラ
スミドを保持する酵母形質転換体（AH22R-/pPHOP31−
Ｒ）を分離した（第14図参照）。
参考例６ GLDプロモーターを持つ外来遺伝子発現ベク
ターを用いたP25遺伝子発現プラスミドの構築。
特願昭59−193765号（昭和59年９月13日付提出）［特開
昭61−70989号公報］に添付の実施例に記載のプラスミ
ドpPHO17−585μｇを10ユニットの制限酵素XhoIで消化
した後、 サブタイプadw型のP25遺伝子を含む0.82kbのDNA断片を
参考例１に記載のアガロース・スラブゲル電気泳動法で
分取した。該DNA0.5μｇと参考例３で記載の外来遺伝子
発現プラスミドpGLD906−１をXhoIで消化したDNA0.1μ
ｇを混合し、T4DNAリガーゼを用いて結合させた後、大
腸菌DH1を形質転換させ、アンピシリン耐性を示す組換
え体を得た。該組換え体の中から、P25遺伝子がGLDプロ
モーターと順方向に挿入されたプラスミドpGLDP25−Ｗ
を得た（第19図）。
実施例１ adr型P31遺伝子の48番目のアルギニンコドン
が欠失した修飾P31遺伝子の作製 プラスミドpTRP31−R1.0μｇに２ユニットの制限酵素Xh
oI（ニッポンジーン社製）を15μｌの反応液［50mM Tri
s−HCl（pH7.5）,100mM ,NaCl,10mM MgCl2,1mMジチオス
レイトール］中で37℃,2時間作用させた後、フェノール
で除蛋白し、冷エタノールを加えてDNAを沈澱させた。
該DNAに2.5ユニットのS1ヌクレアーゼ［Bethesda Resea
rch Laboratories社製］を20μｌの反応液［30mM酢酸ナ
トリウム緩衝液（pH4.6）,50mM NaCl,1mMZnSO4,5％グリ
セロール］中で室温、30秒間作用させ、直ちにフェノー
ルで除蛋白し、冷エタノールを加えてDNAを沈澱させ
た。該DNAと50ngの５′末端がリン酸化されたBamHIリン
カー［５′−Ｐ−ｄ（CCGGATCCGG）］（Bethesda Resea
rch Laboratories社製）とを混合し、20μｌの反応液
［66mM Tris−HCl（pH7.6）,6.6mMMgCl2,10mMジチオス
レイトール,1mM ATP,2ユニットのDNAリガーゼ（New Eng
land Biolabs社製）］中、14℃で一夜作用させてDNAを
結合させた。該反応液に10ユニットのBamHI［ニッポン
ジーン社製］を加え、37℃,2時間作用させた後、該反応
液を0.8％アガロース・スラブゲルを用いて緩衝液［100
mM Tris−HCl,100mM ホウ酸,2mM EDTA（pH8.3）］中、1
40V,2時間電気泳動にかけた。泳動後、BamHIリンカーが
付加した3.1kbおよび1.6kbDNA断片を含むゲル片を透析
チューブ内に封入し、泳動用緩衝液内に沈め、DNA断片
をゲルから電気的に溶出した［McDonell,M.W.ら,J.Mol.
biol.,110119（1977）］。透析チューブ内液をフェノー
ル抽出さらにエーテル抽出した後、NaClを0.2Mになるよ
うに加え、つづいて２倍量の冷エタノールを加えて該DN
A断片を沈澱させた。該DNA断片を環状DNAにするため、
前記条件下T4DNAリガーゼを作用させた。該反応液に５
ユニットの制限酵素XhoIを加え、37℃,2時間作用させた
後、該反応液を用いて大腸菌DH1［Maniatis,T,ら,Molec
ular Clonig,Cold Spring Harbor Laboratory,254〜255
（1982）］を形質転換させ、テトタサイクリン耐性を示
す組換え体を得た。該組換え体の中からXhoI部位がBamH
I部位に変換し、adr型P31遺伝子の48番目のアルギニン
コドンが欠失したプラスミドpTRP31−Raを得た。該プラ
スミドの変異部分の配列を第３図に示す。
制限酵素XhoIで消化したプラスミドpTRP31−R1.0μｇに
５ユニットのエキソヌクレアーゼBal31（Bethesda Rese
arch Laboratories社製）を20μｌの反応液［20mM Tris
−HCl（pH8.1）,12mM ,CaCl2,12mMMgCl2,1mM EDTA］中
で室温,3秒間作用させ、直ちにフェノールで除蛋白し、
冷エタノールを加えてDNAを沈澱させた。該DNAを環状DN
Aにするため、前記条件下T4DNAリガーゼを作用させた。
つぎに制限酵素XhoIを作用させた後、該反応液を用いて
大腸菌DH1を形質転換させ、テトラサイクリン耐性を示
す組換え体を得た。該組換え体の中から、P31遺伝子の
読み枠（フレーム）が正しく保たれているものを選び出
すため、コロニーイムノアッセイ［David J.K.ら,Metho
ds in Enzymology,79,622〜630（1981）］で抗HBsAg抗
体と反応するクローンを選択した。その結果、当該クロ
ーンとして、pTRPP31−RbとpTRPP31−Rcを得た。該プラ
スミドの変異部分の配列を、M13ダイデオキシ法［善岡
克次ら，細胞工学，1,79〜87（1982）］で解析した結果
を第４図に示す。
実施例２ 修飾P31遺伝子の大腸菌における発現実施例
１で記載のpTRPP31−Ra,pTRPP31−RbおよびpTRPP31−Rc
を用いて、大腸菌294株およびC600株を形質転換させ、2
94/pTRPP31−Ra,294/pTRPP31−Rb,294/pTRPP31−Rc,C60
0/pTRPP31−Ra,C600/pTRPP31−Rb,C600/pTRPP31−Rcを
得た。
各形質転換体を、2.0％グルコース,1.0％カザミノ酸を
含むＭ−９培地で、37℃,8時間培養した後、菌体を集
め、緩衝液［30mM Tris−HCl（pH8.0）,50mM ,NaCl,5mM
EDTA］で洗浄した。菌体を10mM Tris−HCl（pH8.0）,5
mM EDTA,1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド,5
μg/mlリゾチームからなる溶菌液に懸濁し溶菌した。該
溶菌液に最終濃度7Mになるように塩酸グアニジンを添加
し、37℃で２時間インキュベーションした。溶菌液を室
温で15,000rpm,15分間遠心分離にかけて上澄液を得た。
この上澄液の一定量を臭化シアンで活性化したろ紙片に
スポットした。このろ紙片を５％グリシン溶液［５％グ
リシン,50mM Tris−HCl（pH8.0）,0.5mM ,NaCl,0.1％Tr
itonX−100］に16時間浸した後、洗浄溶液［50mM Tris
−HCl（pH8.0）,0.5mM ,NaCl,0.1％TritonX−100,0.2％
Bovine Serum Albumin］で十分洗った。該ろ紙片を125I
−抗HBsAgモノクローナル抗体（106cpm/ml）と３時間反
応させた後、洗浄溶液で十分に洗った。風乾後、このろ
紙片の放射能をγ線カウンターで測定することにより、
抗原量を算出した。その結果を第１表に示すが、生成量
はブロス１あたりとして計算された。なお、アッセイ
の標準品としては、HBsAgP31精製標品を用いた。
実施例３ PHO−５プロモーターを持つ外来遺伝子発現
ベクターを用いた修飾P31遺伝子発現プラスミドの構築
と、該プラスミドによる酵母の形質転換。
プラスミドpPHP31−R,5μｇに10ユニットの制限酵素Sal
I（ニッポンジーン社製）を30μｌの反応液［50mM Tris
−HCl（pH7.5）,100mM NaCl,10mM MgCl2,1mMジチオスレ
イトール］中で37℃,2時間作用させた後、P31遺伝子を
含む1.42kbDNA断片を、前記条件下、アガロース・スラ
ブゲルで分離し、ゲルから該DNAを回収した。該DNA0.5
μｇと制限酵素SalIで消化したpBR322,0.1μｇを混合
し、T4DNAリガーゼを用いて結合させた後、大腸菌DH1を
形質転換させ、アンピシリン耐性を示す組換え体を得
た。該組換え体の中からpBR322のSalI部位に、adr型P31
遺伝子を含む1.42kbDNA断片が組み込まれたプラスミドp
BR−Sal−６を得た（第５図）。
pBR−Sal−6,20μｇに10ユニットの制限酵素EcoRI（ニ
ッポンジーン社製）を50μｌの反応液［50mM Tris−HCl
（pH7.5）,100mM NaCl,10mM MgCl2,1mMジチオスレイト
ール］中で37℃,10分間作用（部分分解）させた後、該
プラスミド中に２箇所存在するEcoRI部位のうち１箇所
だけを切断された5.78kbDNA断片を前記条件下、アガロ
ース・スラブゲルで分離し、該DNA断片を回収した（第
５図）。該5.78kbDNA 2μｇに４ユニットの制限酵素Xba
l（ニッポンジーン社製）を20μｌの反応液［50mM Tris
−HCl（pH7.5）,100mM NaCl,10mM MgCl2,1mMジチオスレ
イトール］中、37℃,2時間作用させ、該反応液をアガロ
ース・スラブゲル電気泳動にかけ、5.53kbDNAを分取し
た（第５図）。
pTRPP31−Ra 5μｇを10ユニットのEcoRI,10ユニットのX
balで消化し、５％ポリアクリルアミド・スラブゲルを
用いて、緩衝液［100mM Tris−HCl,100mM ホウ酸,2mM
EDTA（pH8.3）］中、150V,1時間電気泳動をかけた。泳
動後、0.25kbDNA断片を回収した。また、pTRPP31−Rb,p
TRPP31−Rcについても同様の操作を行い、それぞれの0.
25kbDNA断片を回収した。該DNA断片0.05μｇに前記5.53
kbDNA0.1μｇを混合し、T4DNAリガーゼを用いて結合さ
せた後、大腸菌DH1を形質転換させ、アンピシリン耐性
を示す組換え体を得た。該組換え体の中からpTRPP31−R
a由来の0.25kbDNA断片が組み込まれたプラスミドpBR−S
al−6a,pTRPP31−Rb由来の0.25kbDNA断片が組み込まれ
たプラスミドpBR−Sal−6b,およびpTRPP31−Rc由来の0.
25kbDNA断片が組み込まれたプラスミドpBR−Sal−6cを
得た。（第５図）。
pBR−Sal−6a 5μｇに10ユニットの制限酵素SalIを作用
させた後、改良P31遺伝子を含む1.42kbDNA断片を前記条
件下、アガロース・スラブゲルで分断し、ゲルから該DN
Aを回収した。該DNA0.2μｇとプラスミドpPHO17−１をS
alIで消化したDNA0.1μｇを混合し、T4DNAリガーゼを用
いて結合させた後、大腸菌DH1を形質転換させ、アンピ
シリン耐性を示す組換え体を得た。該組換え体の中から
修飾P31遺伝子が、PHO−５プロモーターと順方向に挿入
されたプラスミドpPHOP31−Raを得た。同様の方法でpBR
−Sal−6bからSalI消化で得られる1.42kbDNA断片がpPHO
17−１に順方向に挿入されたプラスミドpTRPP31−Rb
と、pBR−Sal−6cからSalI消化で得られる1.42kbDNA断
片がpPHO17−１に順方向に挿入されたプラスミドpPHOP3
1−Rcを得た（第５図）。
pPHOP31−Ra,pPHOP31−RbおよびpPHOP31−Rcを用いて、
それぞれ酵母宿主サッカロミセス・セレビシェAH22R-を
形質転換し、形質転換体（AH22R-/pPHOP31−Ra,AH22R-/
pPHOP31−Rb,およびAH22R-/pPHOP31−Rc）を取得した。
実施例４ GLDプロモーターを持つ外来遺伝子発現ベク
ターを用いた修飾P31遺伝子発現プラスミドの構築と、
該プラスミドによる酵母の形質転換。
プラスミドpGLD906−１をSalIで消化したDNA0.1μｇ
と、実施例３で記載したpBR−Sal−6a由来の1.42kbDNA
断片0.2μｇを混合し、T4DNAリガーゼを用いて結合させ
た後、大腸菌DH1を形質転換させ、アンピシリン耐性を
示す組換え体を得た。該組換え体の中から、修飾P31遺
伝子がGLDプロモーターと順方向に挿入されたプラスミ
ドpGLDP31−Raを得た。同様の方法で実施例３で記載のp
BR−Sal−6a由来の1.42kbDNA断片がpGLD906−１に順方
向に挿入されたプラスミドpGLDP31−Rbと、同じく実施
例３で記載のpBR−Sal−6c由来の1.42kbDNA断片がpGLD9
06−１に順方向に挿入されたプラスミドpGLDP31−Rcを
得た（第６図）。
pGLDP31−Ra,pGLDP31−Rb,およびpGLDP31−Rcを用い
て、それぞれ酵母宿主サッカロミセス・セレビシェAH22
R-を形質転換し、形質転換体（AH22R-/pGLDP31−Ra,AH2
2R-/pGLDP31−Rb,およびAH22R-/pGLDP31−Rc）を取得し
た。
実施例５ 修飾P31遺伝子の酵母における発現 実施例３および４で得られた修飾P31遺伝子発現プラス
ミドを含む各酵母形質転換体を、Burk−holderおよびそ
の低リン酸培地で、30℃,2日間培養した後、菌体を集
め、生理食塩水で洗浄した（第７図）。
Miyanohara,A,ら［Proc.Natl,Acad.Sci.USA,80,1（198
3）］の方法に従って菌体をZymolyase［生化学工業
（株）製］によってスフェロプラストにした後、スフェ
ロプラストに0.1％トリトンＸ−100を添加して修飾P31
を抽出した。溶菌液を室温で15,000rpm,15分間遠心分離
にかけて上澄液を得た。この上澄液のP31活性をオース
ザイムII［アボット（株）製］を用いて測定した。その
結果を第２表に示すが、P31の生成量はブロス１あた
りとして計算された。
実施例６ P31修飾蛋白質粒子の製造 実施例３で作製した酵母組換え体AH22R-/pGLDP31−Rbを
５％のグルコースを含むBurkholderの低リン酸培地で、
30℃,2日間培養した後、菌体を集め0.85％NaClで洗浄し
た。湿菌体20gを、8mgのザイモリエース60000を含む10m
M リン酸カリウム緩衝液（KPB）pH7.4,10mM EDTA−1mM
フェニルメチルスルホニルオライド（PMSF）14mM2−メ
ルカプトエタノール,80mlに懸濁し室温で３時間インキ
ュベーションし、溶菌した。該溶菌液を５℃で8000rpm,
10分間遠心分離にかけて細胞膜および壁片を含む沈澱物
を得た。この沈澱物を80mlの10mMKPB（pH7.4）−10mM E
DTA−1mM PMSFに懸濁したのち、５℃で8000rpm,10分間
遠心分離にかけて残渣を得た。該沈澱物を再び10mMKPB
（pH7.4）−10mM EDTA−1mM PMSFに懸濁し、遠心分離に
よって沈澱物を得た。細胞膜および壁片から成る該沈澱
物を、80mlの10mMKPB（pH7.4）−10mM EDTA−1mM PMSF
−0.1％TrirtonX−100に懸濁して５℃で２時間攪拌する
ことによってP31修飾蛋白質を抽出した。該懸濁液を５
℃で8000rpm,10分間遠心分離にかけて上澄液を得た。こ
の抽出液中におけるP31修飾蛋白質の含量は約５〜10％
であった。
該抽出液80mlを、10mMKPB（pH7.4）−10mM EDTAで平衡
にしたDEAE−トヨパール（東洋曹達工業製）カラム（1.
25×6.5cm）にかけた後、0.1MNaClを含む10mMKPB（pH7.
4）−10mM EDTAでカラムを十分洗浄した。P31修飾蛋白
質を、NaCl濃度を漸進的に上昇させることによって溶出
させた。
得られた修飾P31溶出画分を限外ろ過膜を用いて濃縮し
た後、該濃縮液を、0.1MKPB（pH7.4）−0.1MNaCl−10mM
EDTAで平衡にしたセファクリールＳ−300（ファルマシ
ア社製）カラム（1.7×77cm）を用いてゲルろ過に付し
た。void volumeに溶出されてきたP31修飾蛋白質を、Be
ckman SW41用遠心チューブ中に作製された５〜40％のCs
Clグラジエントに重層し、５℃で40,000rpm,16時間遠心
にかけた。
修飾P31画分を、10mMKPB（pH7.4）−10mM EDTAに透析し
た後、標品を上述のSW41用遠心チューブ中に作製された
５〜30％の蔗糖グラジエントに重層し、５℃で38,000rp
m,6時間遠心にかけた。
遠心後、P31修飾蛋白質の画分を集めて、該標品を還元
条件下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
たところ、分子量37kダルトンの主バンドを示した。
実施例７ プラスミドpTB553及びpTB553の構築pTRPP31
−Ｒ及びpTRPP31−RbのDNA各々10μｇに100ユニットのE
coRIメチラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社製）
を50μｌの反応液［50mM Tris−HCl（pH7.5）,1mM EDT
A,5mM DTT,50μMS−アデノシル−メチオニン］中で37
℃,1時間作用させた。EcoRIメチラーゼを65℃５分間の
熱処理によって失活させたのち、エタノール沈澱により
DNAを回収した。このプラスミドに30ユニットの制限酵
素ClalとPstIを80μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.
5）,10mM MgCl2,1mM DTT,50mMNaCl］中で37℃,1時間作
用させた後、アガローススラブゲル電気泳動で分離し、
P31遺伝子および修飾P31遺伝子を含む1.42kbDNA断片を
得た。このDNA2μｇに４ユニットのT4−DNAリガーゼ（P
L社製）を30μｌの反応液［33mM Tris−acetate（pH7.
9）,66mM K−acetate,10mM Mg−acetate,100μg/ml BS
A,0.5mM DTT,0.2mM dNTP］と37℃,5分間作用させた。0.
2mM EDTA（pH7）を４μｌ加えて、反応を停止させフェ
ノールクロロホルム（1:1）で抽出後、エタノール沈澱
によりDNAを回収した。これら末端を平滑化したDNA断片
２μｇを15μｌのライゲーション緩衝液［66mM Tris−H
Cl（pH7.6）,6.6mM MgCl2,10mM DTT,66μM ATP］に溶解
し、５′末端をリン酸化した0.2μｇのEcoRIリンカー
［５′−Ｐ−ｄ（GGAATTCC）］と、２ユニットのT4DNA
リガーゼとを混合し、14℃で17時間反応させた。リガー
ゼを65℃10分間の熱処理によって失活させたのち、５倍
量の蒸留水を加えて、さらに制限酵素EcoRI反応液［50m
M Tris−HCl（pH8）,100mM NaCl,10mM MgCl2,1mMメルカ
プトエタノール,100μg/ml BSA］中30ユニットのEcoRI
で３時間処理した。セファロース4Bカラム（0.5cm直径,
15cm長さ）でリンカー部分と、リンカーを結合したP31D
NAを分離し、エタノール沈澱によりEcoRIリンカー結合P
31DNAを回収した。
一方、特願昭60−133490号［特開昭61−63282号公報］
の明細書に記載のプラスミドpTB106のIL−２遺伝子領域
の５′末端側のPstI切断部位及び３′末端側のBamHI切
断部位をEcoRIに変換し、IL−２遺伝子領域を除去したp
TB389を制限酵素EcoRIで切断し、５′未満のリン酸基を
アルカリ性ホスファターゼ処理により除去した。
EcoRIリンカー結合1.4kbP31DNA断片を、pTB389DNAEcoRI
断片と混合し、T4DNAリガーゼを作用させて、SV40プロ
モーターを含む動物細胞形質転換用プラスミドpTB553
（P31）及びpTB555（修飾P31）を構築した。（第８図） 実施例８ プラスミドpTB556及びpTB558の構築 特願昭60−133490号［特開昭61−63282号公報］の明細
書に記載のプラスミドpTB384のBamHI断片0.95kbとプラ
スミドpTB399のBamHI断片38kbをT4DNAリガーゼにより結
合したpTB491を制限酵素HindIIIとPstIで切断し、1.1kb
のDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）DNAを分離した。
また、トリ肉腫ウィルス（ASV）のLTRがクローニングさ
れたλY73−11A［北村ら，ネイチャー，第297巻,205−2
08頁（1982）］のHindIII、Sacl,0.9kbDNA断片をS1ヌレ
クアーゼで処理し、HindIIIリンカーを結合させ、pTB10
6のHindIII切断部位に挿入し、pTB308を構築した。さら
にこのプラスミドのASVLTRの上流のHindIII切断部位を
欠失させた（pTB311）のち、制限酵素XhoIとHindIIIで
切断して、SV40のプロモーター領域を除いた（pTB313）
のち、制限酵素BstXIで切断して0.3kbの断片を除き、２
連結のASVLTRを一連結にしたがpTB401を構築した。この
プラスミドを制限酵素SalIとPstIで切断し、0.8kbのASV
LTRを含む断片を得た。
上記、DHFRDNAを含む、1.1kbのHindIII,PstI断片と、AS
VLTRを含む0.8kbのSalI,PstI断片を、pTB553またはpTB5
55を制限酵素HindIIIとSalIで切断した断片と混合し、T
4DNAリガーゼを作用させて、pTB556（P31）及びpTB558
（修飾P31）を構築した。（第９図）これらのプラスミ
ドは、ASVのLTRをプロモーターとするDHFR遺伝子とSV40
複製開始領域をプロモーターとするP31遺伝子または修
飾P31遺伝子を同方向に連結した構造をしている。
実施例９ 動物細胞の形質転換 ファルコンシャーレ（直径6cm）に10％牛胎児血清を含
むイーグルMEM培地を入れ、マウスTK欠損Ｌ細胞を37℃
で一晩培養した。培養後、この細胞（７×105個／ディ
ッシュ）に対して、プラスミドpTK61（ヘルペス シム
プレックス ウィルス（HSV）のTK遺伝子を含む3.5kb B
amHI DNA断片をpBR322にクローニングした組み換え体を
有する大腸菌株LE578［ジーン，第７巻，第335〜342頁
（1979）;Dr.エンキストより分与］よりプラスミドを単
離し、TK遺伝子を含む2kb PvuII断片［プローシージン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンスUSA,第
78巻,1441〜1445頁（1981）］をpBR322にリクローニン
グしたもの）0.2μｇとそれぞれ10μｇのpTB553,pTB555
DNAとをグラハムらの方法［ビロロジー，第52巻,456〜
467頁（1973）］に従って混合，接種した。４時間37℃
で培養後、新たな培地に替えて一夜培養し、翌日10％牛
胎児血清を含むHAT培地（15μg/mlヒポキサンチン,1μg
/mlアミノプテリン,5μg/mlチミジン,0.25μg/mlグリシ
ンを含むMEM培地）に替えて、37℃で培養を続けた。３
〜４日に一度培養液の交換を行って培養を続けると、約
２〜３週間後にTK+となった細胞が増殖してコロニーを
形成した。
プラスミドpTB556及びpTB558については、DHFR-CHO細胞
［ウルラウブら，プロシージング・オブ・ナショナル・
アカデミーサイエンスUSA,第77巻,4216〜4220頁（198
0）］を５％牛胎児血清を含むハムF12培地にて培養し、
シャーレあたり１μｇのプラスミドをグラハムの方法
（前出）に準じて遺伝子感染した。２日後に、10％透析
牛胎児血清及び35μg/mlプロリンを含むダルベッコ改変
MEM培地で液替を行なって、以後この選択培地で培養を
続けると約２〜３週間後に、DHFR+となって増殖した細
胞がコロニーを形成した。
実施例10 形質転換体のクローニング 実施例９で得た形質転換細胞のクローニングを、それぞ
れの細胞につき、公知の方法（例えばリミテッド ダイ
リューション法）に従っておこなった。クローニング終
了後は、Ｌ（TK+）細胞のクローンは10％牛胎児血清を
含むイーグルMEM培地,CHO（DHFR+）細胞のクローンは、
５％牛胎児血清及び35μg/mlのプロリンを含むダルベッ
コ改変MEM培地にて培養した。分離された各クローンの
細胞の培養上清中のHBsAg活性をオースリアII−125（ダ
イナボット社製）によって測定した。その結果を第３表
に示す。
実施例11 修飾P31遺伝子産物のエンド−β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼＨ処理 実施例６で記載のサッカロミセス・セレビシエAH22R-/p
PHOP31−Rbの湿菌体0.1gを、0.5mlの7.5M尿素,10mMKPB
（pH7.4）,10mM EDTA,1mMPMSFに懸濁し、直径0.45〜0.5
mmのガラスビーズ1gを加え、ミキサー（大洋化学，オー
トマチツクミキサー）で激しく振とうし菌体を破壊し
た。該液を５℃で12,000rpm,10分間遠心分離にかけて、
上澄液を得た。該上澄液0.2mlに等量の0.2M2−メルカプ
トエタノール,0.4％SDS,100mMクエン酸ナトリウム緩衝
液（pH5.5）を加え、95℃で５分間熱処理を行い、抽出
液中の蛋白分解酵素を欠活させた。該液0.4mlに0.8mlの
冷エタノールを加え、氷上で15分間放置した後、５℃で
12,000rpm.10分間遠心分離にかけ、沈澱物を得た。該沈
澱物を0.2mlの50mMクエン酸緩衝液（pH5.5）に懸濁し、
その0.1mlに、0.05ユニットのエンド−β−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼＨ（生化学工業）を加え、37℃で
２時間反応させた。該反応標品と未反応標品を還元条件
下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、蛋
白質をニトロセルロース膜にトランスブロット装置（Bi
o−Rad社）を用いて写し取り、パーオキシダーゼで標識
した抗HBsAg抗体（オースザイムII,アボットラボラトリ
ーズ）と、イミュン・ブロット アッセイ キット（Bi
o−Rad社）を用いてHBsAgを検出した結果、反応標品の
方は、P31遺伝子産物が、34kダルトンに変化していた。
HBsAgに対するモノクローナル抗体を用いても同様の結
果を得た。このことは、実施例６で記載の37kダルトン
の修飾P31遺伝子産物には糖鎖が付加しており、この糖
鎖の一部は、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼＨで切断されることを示している。
実施例12 adr型P31遺伝子の16番目と18番目のアルギニ
ン・コドンを、グルタミン・コドンに変換した修飾P31
遺伝子の作製 実施例３で記載のプラスミドpBR−Sal−6c,10μｇを20
μｌの反応液［50mM Tris−HCl（pH7.5）,100mM NaCl,1
0mM MgCl2,1mMジチオスレイトール］中、20ユニットのS
alIと20ユニットのXbalを加え、37℃,2時間反応を行
い、反応液を５％ポリアクリルアミド・スラブゲル電気
泳動にかけた。泳動後0.25kbpのDNA断片を含むゲル片を
透析チューブ内に封入し、実施例１に記載の方法で、0.
25kbDNA断片を回収した。ファージベクター・M13mp11
［Messing,J.,Methods in Enzymol.,101,20（1983）］
の２本鎖DNA0.2μｇを20μｌの反応液［50mM Tris−HCl
（pH7.5）,100mM NaCl,10mM MgCl2,1mMジチオスレイト
ール］中、２ユニットのSalIと２ユニットのXbalで２時
間反応を行い、該DNAをSalI部位とXbaI部位で開環させ
た。該反応液に65℃,5分間の熱処理を加え、制限酵素を
失活させた。該DNA0.01μｇに上記の0.25kbpのDNA断片
0.5μｇを加え、10μｌの反応液中、T4DNAリガーゼの作
用で両DNAを連結させた後、Messing,J.の方法［Methods
in Enzymol.,101,20（1983）］で大腸菌JM103に導入
し、プラーク（溶菌斑）を作らせた。白色プラークの中
からM13mp11に、上記0.25kbpDNA断片がクローニングさ
れたM13mp11−101を得た。
M13mp11−101のファージ粒子から、Messing,J.の方法で
ファージDNA（１本鎖DNA）を調製した。該１本鎖DNAを
用いて以下の方法でOligonucleotide−directed Mutage
nesis［Smith,M.,Gilliam,S.,Gentic Engineering,3,1
（1981）］を行った。M13mp11−101の１本鎖DNA1μｇに
フォスフォトリエステル法で化学合成し、さらにT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて５′未満をリン酸化した
DNA,5′−Ｐ−ｄ（AGGCCTTGCACTTGGGGATCTAG）から成る
プライマー10ngを加え、10μｌの反応液［10mM Tris−H
Cl（pH7.5）,10mM MgCl2］中、90℃,5分間の熱処理を行
った後、室温で30分間放置し、アニーリングを行った。
該反応液10μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,1m
M ATP,10mM MgCl2,1mM dATP,1mM dCTP,1mM dGTP,1mM dT
TP,10mMDTT,2ユニットDNAポリメラーゼI,ラージフラグ
メント［宝酒造（株）製］,0.5ユニットT4DNAリガー
ゼ］を加え、室温で16時間反応させ、１本鎖DNAを２本
鎖DNAに修復した。該反応液を用いて、上記Messing,Jの
方法で大腸菌JM103を形質転換し、プラークを形成させ
た。得られたプラークの中から上記の合成プイラマーと
同一の配列を含むファージDNAを選択するために、プラ
ークハイブリダイゼイーション［Benton,W.D.,Davis,R.
W.,Science,196,180（1977）］を行った。前述の化学合
成したDNAd（AGGCCTTGCACTTGGGGATCTAG）１μｇを20μC
iのγ［32P］ATP［Amersham社製］と５ユニットのT4−
ポリヌクレオチドキナーゼ［宝酒造（株）製］を用いて
30μｌの反応液［50mM Tris−HCl（pH7.6）,10mM MgC
l2,10mM 2−メルカプトエタノール］中、37℃,30分間反
応させ、DNAの５′末端を32Pで標識した。該反応液に等
量のフェノールを加え、除蛋白を行った後、TEN緩衝液
［10mM Tris−HCl（pH8.0）,200mM NaCl,1mMEDTA］で平
衡化したセファロース4B（Pharmacia社製）カラム（0.2
5×25cm）にかけて、はじめに溶出される32Pで標識され
た合成DNAを回収し、プラークハイブリダイゼーション
のためのプローブとした。プラークハイブリダイゼーシ
ョンの方法は、Benton,W.D.,Davis,R,Wの方法に従っ
た。約4000プラークについて調べた結果、36個のプラー
クが、プローブとハイブリダイズした。その中の１つの
プラークから、ファージDNAを分離し、実施例１に記載
のM13ダイデオキシ法でDNA塩基配列を解析した結果、P3
1遺伝子のArg16とArg18のコドンが、両方ともGlnのコド
ンに変換していることが確認された。該ファージをM13m
p11−102と名付けた。
M13mp11−102の２本鎖DNA20μｇを、40ユニットのEcoRI
と40ユニットのXbaIで100μｌの反応液［50mM Tris−HC
l（pH7.5）,100mM NaCl,10mM MgCl2,1mMジチオスレイト
ール］中、37℃,2時間作用させた後、該反応液を５％ポ
リアクリルアミド・スラブゲル電気泳動にかけ、230bp
のDNA断片を分取し、ゲルから該DNAを回収した。該DNA
断片0.05μｇに、実施例２に記載のpBR−Sal−６由来の
5.53kbDNA断片0.1μｇを混合し、T4DNAリガーゼを用い
て結合させた合成、大腸菌DH1を形質転換させ、アンピ
シリン耐性を示す組換え体を得た。該組換え体の中から
M13mp11−102由来の230bpDNA断片が組み込まれたプラス
ミドpBR−Sal−6dを得た（第15図）。該プラスミドが持
つ修飾P31遺伝子は、プロテアーゼによって切断を受け
やすいArg48が欠失し、またArg16とArg18がともにGlnに
変換した遺伝子である。
実施例13 GLDプロモーターを持つ外来遺伝子発現ベク
ターを用いた修飾P31遺伝子発現プラスミドの構築と、
該プラスミドによる酵母の形質転換 実施例12で記載のプラスミドpBR−Sal−6d 5μｇに10ユ
ニットのSalIを作用させた後、修飾P31遺伝子が含まれ
る1.42kbDNA断片を、アガロース・スラブゲル電気泳動
で分離し、ゲルから該DNAを回収した。該DNA0.2μｇと
参考例３で記載のプラスミド、pGLD906−１をSalIで消
化したDNA1.0μｇを混合し、T4DNAリガーゼを用いて結
合させた後、大腸菌DH1を形質転換させ、アンピシニン
耐性の組換え体を得た。該組換え体の中から修飾P31遺
伝子がGLDプロモーターと順方向に挿入されたプラスミ
ドpGLDP31−Rdを得た（第16図）。
pGLDP31−Rdを用いて酵母宿主サッカロミセス・セレビ
シエAH22R-を形質転換し、ロイシン非要求性の形質転換
体（AH22R-/pGLDP31−Rd）を取得した。
実施例14 修飾P31遺伝子の下流に、PGKターミネーター
を接続させた修飾P31遺伝子発現プラスミドの構築と、
該プラスミドによる酵母の形質転換。
参考例２に記載のホスホグセリン酸キナーゼ（PGK）遺
伝子が組込まれたプラスミドpPKT3は、PGK遺伝子の３′
−非翻訳領域を約290bp含んでいる。該領域内にメッセ
ンジャーRNAの合成が終結するターミネーターがあるこ
とが、Hitzeman,R.A.らによって明らかにされている［N
ucleic Acid Res.,10,7791〜7808（1982）］。修飾P31
遺伝子の転写の終結を速やかに行わせるために、PGK遺
伝子の３′−非翻訳領域を修飾P31遺伝子の直後に接続
させることを行った。
プラスミドpPKT3,60μｇに50ユニットの制限酵素ClaIと
50ユニットの制限酵素HindIIIを100μｌの反応液［10mM
Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,10mM MgCl2］中で37
℃,5時間作用させた後、５％ポリアクリルアミド・スラ
ブゲルを用いて緩衝液［100mM Tris−HCl,100mMホウ酸,
2mMEDTA（pH8.3）中、150V,2時間電気泳動にかけた。泳
動後、0.28kbDNA断片を含むゲル片を透析チューブ内に
封入し、参考例１に記載の方法で、0.28kbDNA断片をゲ
ル片から溶出し、フェノール抽出とエーテル抽出を行っ
た後、エタノールを加え該DNAを回収した。
上記0.28kbDNA断片は、PGK遺伝子の３′−非翻訳領域の
うち、ストップコドンからの0pbが欠損しているため、
欠損しているDNA配列を化学合成した。すなわち、 の配列からなるDNAを前述のCrea,R,らの方法によって合
成し、参考例１に記載された条件下で５′側をリン酸化
した。
実施例12で記載のプラスミドpBR−Sal−6d,10μｇに10
ユニットの制限酵素SalIと、10ユニットの制限酵素AhaI
IIを50μｌの反応液［50mM Tris−HCl（pH7.5）,100mM
NaCl,10mM MgCl2,1mMジチオスレイトール］中、37℃,2
時間作用させた後、該反応液を0.8％アガロース・スラ
ブゲル電気泳動にかけ、修飾P31遺伝子を含む0.85kbのD
NA断片を分取し、ゲルから該DNAを回収した。
プラスミドpBR322を制限酵素HindIIIとSalIで消化して
得られる3.74kbDNA断片0.2μｇと、上記の0.28kbDNA断
片（PGK遺伝子のターミネーターを含む）0.5μg,上記の
リン酸化した化学合成DNA50ng,および上記の0.85kbDNA
断片（修飾P31遺伝子を含む）0.1μｇを混合し、参考例
１に記載の条件下でT4DNAリガーゼを作用させて結合さ
せた。該反応液を用いて大腸菌DH1を形質転換させ、ア
ンピシリン耐性形質転換体の中から４種のDNA断片が結
合したプラスミドpBR−Sal−6dTを保持する形質転換体
を分離した。次に参考例１に記載した方法に従って、該
プラスミドpBR−Sal−6dTのHindIII部位がSalI部位に変
換されたプラスミドpBR−Sal−6dTSを作製した。
pBR−Sal−6dTS,5μｇに10ユニットの制限酵素SalIを30
μｌの反応液［50mM Tris−HCl（pH7.5）,100mM NaCl,1
0mM MgCl2,1mMジチオスレイトール］中で37℃,2時間作
用させた後、修飾P31遺伝子とPGKターミネーターを含む
1.15kbDNA断片を、前記条件下、アガロース・スラブゲ
ルで分離し、ゲルから該DNAを回収した。該DNA0.5μｇ
と、プラスミドpGLDP906−１をSalIで消化したDNA0.1μ
ｇを混合し、T4DNAリガーゼを用いて結合させた後、大
腸菌DH1を形質転換させ、アンピシリン耐性を示す組換
え体を得た。該組換え体の中から、修飾P31遺伝子−PGK
ターミネーターがGLDプロモーターと順方向に挿入され
たプラスミドpGLDP31−RdTを得た（第17図）。
pGLDP31−RdTを用いて、酵母宿主サッカロミセス・セレ
ビシエAH22R-を形質転換し、形質転換体（AH22R-/pGLDP
31−RdT）を取得した。
実施例15 修飾P31遺伝子の酵母における発現 実施例13および14で得られた修飾P31遺伝子発現プラス
ミドを含む酵母形質転換体を5mlの培養液［１あた
り、K2HPO43g,グリコース30g,アスパラギン4g,L−ヒス
チジン100mg,KI0.1mg,MgSO4・7H2O 500mg,CaCl2・2H2O
330mg,CuSO4・5H2O 0.4mg,FeSO5・7H2O 2.5mg,MnSO4・4
H2O 0.4mg,(NH4)3PO4・12MoO3・3H2O 0.2mg,ZnSO4・7H2
O 3.1mg,イノシトール10mg,チアミン0.2mg,ピリドキシ
ン0.2mg,Ca−パントテン酸0.2mg,ナイアシン0.2mg,ビチ
オン0.002mgを含む］中で30℃で１日間振とう培養を行
った後、その2mlを18mlの新鮮培地［１あたり、KH2PO
4 300mg,ショ糖50g,アスパラギン4g,L−ヒスチジン100m
g,KCl1.5g,KI0.1mg,MgSO4・7H2O 500mg,CaCl2・2H2O 33
0mg,グルコース10g,トリス−マレイン酸（pH6.5）25mM,
CuSO4・5H2O 0.4mg,FeSO5・7H2O 2.mg,MnSO4・4H2O 0.4
mg,(NH4)3PO4・12MoO3・3H2O 0.2mg,ZnSO4・7H2O 3.1m
g,イノシトール10mg,チアミン0.2mg,ピリドキシン0.2m
g,Ca−パントテン酸0.2mg,ナイアシン0.2mg,ビチオン0.
002mgを含む］に移し、さらに30℃で２日間振とう培養
を行った。菌体を遠心で集めた後、実施例５に記載の方
法で菌体抽出液を得、P31活性を測定した。その結果AH2
2R-/pGLDP31−RdのP31産生量は、ブロス1mlあたり29μ
ｇと計算された。
また、AH22R-/pGLDP31−RdTのP31産生量は、ブロス1ml
あたり47μｇと計算された。
実施例16 菌体からの抽出 実施例15記載の方法で培養し、−20℃で凍結して得た酵
母S.cerevisiae AH22R-/pGLDP31−Rdの凍結保存菌体1kg
を7.5M尿素−10mMエチレンジアミン四ナトリウム塩（ED
TA）−2mMフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMS
F）−0.1mM（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニル
フルオライド塩酸塩（Ｐ−APMSF）−10mMリン酸ナトリ
ウムを含む緩衝液（pH7.5）4000mlに均一に懸濁した。
この懸濁液をダイノーミルKDL型ボールミル（WAB社，バ
ーゼル，スイス）により流速4000ml/hrおよびガラスビ
ース0.50〜0.75mmで処理し、細胞を連続的に破壊した。
抽出効率を高める為にこの操作を２回繰り返した。この
抽出液を13900×ｇで30分間遠心して上清5500mlを得
た。HBsAg濃度はオースザイム（AUSZYME）により4.2μg
/mlであった。
ポリエチレングリコールによる分画 上記で得た上清に0.5倍量の33％濃度（W/W）ポリエチレ
ングリコール6000（PEG−6000）をゆっくり添加し、139
00×ｇで30分遠心してHBsAg画分を沈澱して回収した。
得られた沈澱物を7.5M尿素−10mMEDTA−2mMPMSF−0.1mM
P−APMSF−10mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液（pH7.
5）1000mlに溶解し、最終濃度が0.2Mになるように食塩
を添加した。この溶液に0.25倍量の33％濃度（W/W）のP
EG−6000を添加したのち、13900×ｇで30分間遠心し、
上清を得た。得られた上清に0.5倍量の33％濃度（W/W）
のPEG−6000をさらに添加したのち、13900×ｇで30分間
遠心して沈澱物を集めた。この沈澱物を5.0M尿素−0.14
5M食塩−5mMEDTA−1mMPMSF−0.05mMP−APMSF−10mMリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）120mlに溶解した。
セファクリルＳ−300によるゲルろ過 上記で得た溶解液を5.0M尿素−5mMEDTA−1mMPMSF−0.05
mMP−APMSF−10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で
平衡化したセファクリルＳ−300（ファルマシア社，ス
エーデン）カラム（５×102cm,2000ml）に負荷し、同一
緩衝液で溶出して、カラムの排除容積で溶出されてくる
画分240mlを集めた。
超遠心分離 次にBeckman SW−28用超遠心チューブに、40％セシウム
クロライド（CsCl）−5M尿素−2mMEDTA−1mMPMSF−0.05
mMP−APMSF−10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）8.5m
l,30％CsCl−5M尿素−2mMEDTA−1mMPMSF−0.05mMP−APM
SF−10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）8.5mlおよび上
記溶解液20mlを重層し、28000rpm,4℃で16時間超遠心を
行いHBsAgを密度1.2付近に濃縮・精製した。
ハイドロキシルアパタイトカラム 超遠心により濃縮・精製されたHBsAg画分を0.05mMP−AP
MSFを含む50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に対して
一昼夜透析し、上記緩衝液で平衡化したハイドロキシル
アパタイトカラム（2.5×10cm,50ml）に通してHBsAgを
吸着させ、カラムを上記平衡化緩衝液で洗浄した。
次いで0.05mMP−APMSFを含む50mMリン酸カリウム緩衝液
（pH7.0）300mlと0.05mMP−APMSFを含む600mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH7.0）300mlとによる直線濃度勾配溶出
法によりHBsAgを溶出した。HBsAg画分を分取し、PBSに
対して透析後、除菌ろ過してHBsAg蛋白濃度65μg/mlのH
BsAg精製標品液42mlを得た。
上記溶液10mlを1.18mg/mlの濃度Alum液55mlと４℃３時
間混合し、HBsAgをAlumに吸着させることによりHBsAg10
μg/mlのワクチン65mlを調製した。
実施例17 修飾P31遺伝子の下流に、PGKターミネーター
を接続させた修飾P31遺伝子発現プラスミドの構築と、
該プラスミドによる酵母の形質転換。
実施例３で記載のプラスミドpBR−Sal−6c,10μｇに10
ユニットの制限酵素SalIと、10ユニットの制限酵素XbaI
を50μｌの反応液［50mM Tris−HCl（pH7.5）,100mM Na
Cl,10mM MgCl21mMジチオスレイトール］中、37℃,2時間
作用させた後、該反応液を５％ポリアクリルアミド・ス
ラブゲル電気泳動にかけた。泳動後、0.25kbDNA断片を
含むゲル片を透析チューブ内に封入し、参考例１に記載
の方法でDNA断片をゲル片から溶出し、フェノール抽出
とエーテル抽出を行った後、エタノール沈澱を行って該
DNAを回収した。
実施例14で記載のプラスミドpBR−Sal−6dT,3μｇに５
ユニットの制限酵素SalIと、５ユニットの制限酵素XbaI
を20μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,100mM Na
Cl,10mM MgCl2,1mMジチオスレイトール］中、37℃,2時
間作用させた後、該反応液を0.8％アガロース・スラブ
ゲル電気泳動にかけ、4.65kbDNA断片を分取し、ゲルか
ら該DNAを上記の方法で回収した。
前記の0.25kbDNA断片0.05μｇと、4.65kbDNA断片0.2μ
ｇを混合し、参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼ
を作用させて結合させた。該反応液を用いて大腸菌DH1
を形質転換させ、アンピシリン耐性を示す形質転換体の
中から、上記２種類のDNA断片が結合したプラスミドpBR
−Sal−6cTを保持する形質転換体を分離した。次に参考
例１に記載した方法に従って、該プラスミドpBR−Sal−
6cTのHindIII部位がSalI部位に変換されたプラスミドpB
R−Sal−6cTSを作製した。
pBR−Sal−6cTS,5μｇに10ユニットの制限酵素SalIを30
μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,100mM NaCl,1
0mM MgCl2,1mMジチオスレイトール］中、37℃,2時間作
用させた後、1.15kbDNA断片を前記条件下アガロース・
スラブゲルで分離し、ゲルから該DNAを回収した。該DNA
0.5μｇと、プラスミドpGLD906−１のSalI消化DNA,0.1
μｇを混合し、T4DNAリガーゼを用いて結合させた後、
大腸菌DH1を形質転換させ、アンピシリン耐性を示す組
換え体を得た。該組換え体の中から、修飾P31遺伝子−P
GKターミネーターがGLDプロモーターと順方向に挿入さ
れたプラスミドpGLDP31−RcTを得た（第18図）。
pGLDP31−RcTを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシ
エAH22R-を形質転換し、形質転換体（AH22R-/pGLDP31−
RcT）を取得した。
実施例18 修飾P31遺伝子の酵母における発現 実施例17で得られた修飾P31遺伝子発現プラスミドを含
む酵母形質転換体を5mlの培養液［１あたり、K2HPO43
g,グルコース30g,アスパラギン4g,L−ヒスチジン100mg,
KI0.1mg,MgSO4・7H2O 500mg,CaCl2・2H2O 330mg,CuSO4
・5H2O 4.0mg,FeSO4・7H2O 2.5mg,MnSO4・4H2O 0.4mg,
(NH4)3PO4・12MoO3・3H2O 0.2mg,ZnSO4・7H2O 3.1mg,イ
ノシトール10mg,チアミン0.2mg,ピリドキシン0.2mg,Ca
−パントテン酸0.2mg,ナイアシン0.2mg,ビチオン0.002m
gを含む］中で30℃で１日間振とう培養を行った後、そ
の2mlを18mlの新鮮培地［１あたり、KH2PO4300mg,シ
ョ糖50g,アスパラギン4g,L−ヒスチジン100mg,KC11.5g,
KI0.1mg,MgSO4・7H2O 500mg,CaCl2・2H2O 330mg,グルコ
ース10g,トリス−マレイン酸（pH6.5）25mM,CuSO4・5H2
O 4.0g,FeSO4・7H2O 2.mg,MnSO4・4H2O 0.4mg,(NH4)3PO
4・12MoO3・3H2O 0.2mg,ZnSO4・7H2O 3.1mg,イノシトー
ル10mg,チアミン0.2mg,ピリドキシン0.2mg,Ca−パント
テン酸0.2mg,ナイアシン0.2mg,ビチオン0.002mgを含
む］に移し、さらに30℃で２日間振とう培養を行った。
菌体を遠心で集めた後、実施例５に記載の方法で菌体抽
出液を得、P31活性を測定した。その結果AH22R-/pGLDP3
1−RcTのP31産生量は、ブロス1mlあたり17.8μｇと計算
された。
実施例19 菌体からの抽出 実施例18記載の方法で培養し、−20℃で凍結して得た酵
母S.cerevisiae AH22R-/pGLDP31−RcTの凍結保存菌体50
0gを0.1％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオ
レエート（Tween 80）−7.5M尿素−10mMエチレンジアミ
ン四ナトリウム塩（EDTA）−2mMフェニルメチルスルホ
ニルフルオライド（PMSF）−0.1mM（ｐ−アミジノフェ
ニル）メタンスルホニルフルオライド塩酸塩（Ｐ−APMS
F）−100mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液（pH7.2）250
0mlに均一に懸濁した。この懸濁液をダイノーミルKDL型
ボールミル（WAB社，バーゼル，スイス）により流速400
0ml/hrおよびガラスビース0.50〜0.75mmで処理し、細胞
を連続的に破壊した。抽出効率を高める為にこの操作を
２回繰り返した。この抽出液を13900×ｇで30分間遠心
して上清3300mlを得た。HBsAg濃度はオースザイム（AUS
ZYMEII）により34.6μg/mlであった。
ポリエチレングリコールによる分画 上記で得た上清に0.65倍量の33％濃度（W/W）ポリエチ
レングリコール6000（PEG−6000）をゆっくり添加し、p
Hを6.0に調整したのち30分間攪拌してから、13900×ｇ
で30分間遠心してHBsAg画分を沈澱として回収した。得
られた沈澱物を7.5M尿素−10mMEDTA−2mMPMSF−0.1mMP
−APMSF−100mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液（pH7.
2）1000mlに溶解し、pHを7.0に調整したのち最終濃度が
0.30Mになるように食塩を添加した。この溶液に0.25倍
量の33％濃度（W/W）のPEG−6000を添加し、30分後に13
900×ｇで30分間遠心し、上清を得た。得られた上清に
0.29倍量の33％濃度（W/W）のPEG−6000をさらに添加
し、pHを6.0に調整して、30分間攪拌を続けたのち、139
00×ｇで30分間遠心して沈澱物を集めた。この沈澱物を
5.0M尿素−0.145食塩−5mMEDTA−1mMPMSF−0.05mMP−AP
MSF−10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）120mlに溶
解した。
セファクリルＳ−300によるゲルろ過 上記で得た溶解液を5.0M尿素−0.145食塩−5mMEDTA−1m
MPMSF−0.05mMP−APMSF−10mMリン酸ナトリウムを含む
緩衝液（pH6.0）で平衡化したセファクリルＳ−300（フ
ァルマシア社，スエーデン）カラム（５×102cm,2000m
l）に負荷し、同一緩衝液で溶出して、カラムの排除容
積で溶出されてくる画分240mlを集めた。
抗体カラム 次に上記で得た溶出液240mlを0.145食塩−5mMEDTA−0.1
mMP−APMSF−10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）で
５倍に希釈し、同一緩衝液で平衡化したマウス由来の抗
HBsAg抗体（国際出願PCT−JP85/00161の参考例１〜３に
記載）［特願昭61−4092号：昭和61年１月10日提出］を
結合させたホルミル−セルトファインカラム200mlを通
過させた。次いでHBsAgを吸着させたカラムを1Mチオシ
アン酸アンモニウム−10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH
6.0）で洗浄したのち、4Mチオシアン酸アンモニウム−1
0mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）で溶出した。約30
0mlの溶出液を40mlにまで濃縮した。
セファクリルＳ−400によるゲルろ過 上記で得た濃縮液を5.0M尿素−0.145M食塩−5mMEDTA−1
mMPMSF−0.05mMP−APMSF−10mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH6.0）で平衡化したセファクリルＳ−400（ファルマ
シア社，スエーデン）カラム（５×102cm,2000ml）に負
荷し、同一緩衝液で溶出して、HBsAg画分186mlを集め
た。溶出液を120mlまで濃縮した。
超遠心分離 次にBeckman SW−28用超遠心チューブに、40％セシウム
クロライド（CsCl）−5M尿素−2mMEDTA−1mMPMSF−0.05
mMP−APMSF−10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）8.5m
l,30％CsCl−5M尿素−2mMEDTA−1mMPMSF−0.05mMP−APM
SF−10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）8.5mlおよび上
記濃縮液20mlを重層し、28000rpm,4℃で16時間超遠心を
行いHBsAgを密度1.2付近に濃縮・精製した。
上記超遠心により濃縮，精製されたHBsAg画分をPBSに対
して透析濃縮、除菌ろ過してHBsAg蛋白濃度250μg/mlの
HBsAg精製標品液50mlを得た。
実施例20 実施例16で得たHBsAgについて以下の性質を調べた。
（１）ラエムリ［Nature,227,680（1970）］に準じてSD
S−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動を行ったあ
と、銀染色を行なった結果、該HBsAg蛋白質は分子量約3
7000ダルトンおよび34000ダルトンにバンドを示した。
（２）Ｎ末端アミノ酸配列 該HBsAg蛋白質74.2μｇに気相プロテインシークエネー
ター（アプライド・バイオシステシークネーター（アプ
ライド・バイオシステムズ社製470A型、アメリカ）を用
いる自動エドマン分解法を適用して、Ｎ末端アミノ酸配
列を分析した。フェニルチオビダントインアミノ酸（PT
H−アミノ酸）はミクロパックSP−O DSカラム（バリア
ン社製，アメリカ）を用いる高速液体クトマトグラフィ
ーにより固定した。各ステップで検出されたPTH−アミ
ノ酸を第４表に示す。
（３）電子顕微鏡観察 該HBsAgの粒子を日本電子の1200E型電子顕微鏡で観察し
た結果、19.1±2.0nmの粒子が観察された。
なお、実施例19で得たHBsAgについても同様な性質であ
った。
各微生物および動物細胞の寄託機関への寄託およびその
受託番号を第５表に示すとおりである。
表中、IFOは財団法人醗酵研究所を、FRIは日本国通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所を、E.coliはEsch
erichia coliを、S.cerevisiaeはSaccharomyces cerevi
siaeを表わす。FERM BP番号はベダペスト条約に基づく
寄託の受託番号を表わす。
【図面の簡単な説明】
第１図はウェスタン・ブロティング（Western blottin
g）による遺伝子産物の分析結果を示す。図中、レーン
１は大腸菌C600/pTRPP31−Ｒの菌体抽出液の、レーン２
は大腸菌C600/pTRPP31−Ｒの菌体抽出液をトリプシン処
理したものを、レーン３はサッカロミセス・セレビシエ
AH22R-/pPHOP31−Ｒの菌体抽出液の分析結果を示す。 第２図はadr型HBsAgP31の塩基配列（上）およびアミノ
酸配列（下）を示す。 第３図はpTRPP31−Raの変更部分の塩基配列（上）およ
びアミノ酸配列（下）を示す。図中、斜線は欠損部分を は付加部を示す。 第４図はpTRPP31−RbおよびpTRPP31−Rcの変更部の塩基
配列（上）およびアミノ酸配列を示す。図中、斜線は欠
損部分を示す。 第５図はpPHOP31−Ra,pPHOP31−RbおよびpPHOP31−Rcの
構築図を示す。図中、B,C,E,H,SおよびXbはそれぞれBam
HI,ClaI,EcoRI,HindIII,SalIおよびXbaIを示す。 第６図はpGLDP31−Ra,pGLDP31−RbおよびpGLDP31−Rcの
構築図を示す。 第７図はサッカロミセス・セレビシエAH22R-/pPHOP31−
Ra（レーン１），AH22R-/pPHOP31−Rb（レーン２），AH
22R-/pPHOP31−Rc（レーン３）およびAH22R-/pPHOP31−
Ｒ（レーン４）の菌体抽出液のウェスタン・ブロッティ
ングによる分析結果を示す。 第８図はpTB553およびpTB555の構築図を示し、第９図は
pTB556およびpTB558の構築図を示す。 第10図はpPHO17−１の構築図を示し、第11図はpPKT700
−１の構築図を示す。 第12図はpGLD906−１の構築図を示し、第13図はpTRPP31
−Ｒの構築図を示す。 第14図はpPHOP31−Ｒの構築図を示す。 第15図中はプラスミドpBR−Sal−6dの構築図を、第16図
はプラスミドpGLDP31−Rdの構築図を、第17図はプラス
ミドpGLDP31−RdTの構築図を、第18図はプラスミドpGLD
P31−RcTの構築図を示す。
フロントページの続き 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６０ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６１ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５９ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８５４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７３

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質のＮ
    末端から48番目のアルギニンまたはそれを含むペプチド
    鎖を欠損あるいはアルギニンおよびリジン以外のアミノ
    酸またはアルギニンおよびリジン以外のアミノ酸からな
    るペプチド鎖に置換した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原活
    性および重合ヒト血清アルブミン結合能を有するP31修
    飾蛋白質。
  2. 【請求項２】さらにＢ型肝炎ウイルス表面抗原P31のＮ
    末端から16番目と18番目のアルギニンをアルギニンおよ
    びリジン以外のアミノ酸に置換した、特許請求の範囲第
    １項記載のP31修飾蛋白質。
  3. 【請求項３】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質のＮ
    末端から44〜49番目のペプチド鎖内で48番目のアルギニ
    ンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるいはアルギニ
    ンおよびリジン以外の１〜４個のアミノ酸に置換した、
    特許請求の範囲第１項記載のP31修飾蛋白質。
  4. 【請求項４】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質のＮ
    末端から44〜49番目のペプチド鎖内で48番目のアルギニ
    ンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるいはTrpもし
    くはPro−Asp−Pro−Glyに置換した、特許請求の範囲第
    １項記載のP31修飾蛋白質。
  5. 【請求項５】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質のＮ
    末端から44〜49番目のペプチド鎖内で48番目のアルギニ
    ンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるいはTrpもし
    くはPro−Asp−Pro−Glyに置換し、P31蛋白質のＮ末端
    から16番目および18番目のアルギニンをグルタミンに置
    換した、特許請求の範囲第１項記載のP31修飾蛋白質。
  6. 【請求項６】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質のＮ
    末端から44〜49番目のペプチド鎖内で48番目のアルギニ
    ンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損させた、特許請求
    の範囲第１項記載のP31修飾蛋白質。
  7. 【請求項７】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質のＮ
    末端から44〜49番目のペプチド鎖を欠損させた、特許請
    求の範囲第１項記載のP31修飾蛋白質。
  8. 【請求項８】adr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質
    のＮ末端から44〜49番目のペプチド鎖を欠損させた、特
    許請求の範囲第１項記載のP31修飾蛋白質。
  9. 【請求項９】酵母で製造された特許請求の範囲第１項記
    載のP31修飾蛋白質。
  10. 【請求項１０】サッカロミセス・セレビシェAH22R-/pGL
    D P31−Rcまたはサッカロミセス・セレビシュAH22R-/p
    GLD P31−RcTで製造され、adr型Ｂ型肝炎ウイルス表面
    抗原P31蛋白質のＮ末端から44〜49番目のペプチド鎖を
    欠損させた、特許請求の範囲第１項記載のP31修飾蛋白
    質。
  11. 【請求項１１】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質の
    Ｎ末端から48番目のアルギニンまたはそれを含むペプチ
    ド鎖を欠損あるいはアルギニンおよびリジン以外のアミ
    ノ酸またはアルギニンおよびリジン以外のアミノ酸から
    なるペプチド鎖に置換した、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
    活性および重合ヒト血清アルブミン結合能を有するP31
    修飾蛋白質をコードするDNAを含有するDNAを保持する形
    質転換体を培養し、培養物中にP31修飾蛋白質を生成せ
    しめ、これを採取することを特徴とするP31修飾蛋白質
    の製造法。
  12. 【請求項１２】さらにＢ型肝炎ウイルス表面抗原P31の
    Ｎ末端から16番目と18番目のアルギニンをアルギニンお
    よびリジン以外のアミノ酸に置換した、特許請求の範囲
    第11項記載の製造法。
  13. 【請求項１３】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質の
    Ｎ末端から44〜49番目のペプチド鎖内で48番目のアルギ
    ニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるいはアルギ
    ニンおよびリジン以外の１〜４個のアミノ酸に置換し
    た、特許請求の範囲第11項記載の製造法。
  14. 【請求項１４】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質の
    Ｎ末端から44〜49番目のペプチド鎖内で48番目のアルギ
    ニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるいはTrpも
    しくはPro−Asp−Pro−Glyに置換した、特許請求の範囲
    第11項記載の製造法。
  15. 【請求項１５】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質の
    Ｎ末端から44〜49番目のペプチド鎖内で48番目のアルギ
    ニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるいはTrpも
    しくはPro−Asp−Pro−Glyに置換し、P31蛋白質のＮ末
    端から16番目および18番目のアルギニンをグルタミンに
    置換した、特許請求の範囲第11項記載の製造法。
  16. 【請求項１６】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質の
    Ｎ末端から44〜49番目のペプチド鎖内で48番目のアルギ
    ニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損させた、特許請
    求の範囲第11項記載の製造法。
  17. 【請求項１７】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質の
    Ｎ末端から44〜49番目のペプチド鎖を欠損させた、特許
    請求の範囲第11項記載の製造法。
  18. 【請求項１８】adr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白
    質のＮ末端から44〜49番目のペプチド鎖を欠損させた、
    特許請求の範囲第11項記載の製造法。
  19. 【請求項１９】形質転換体が酵母である特許請求の範囲
    第11項記載の製造法。
  20. 【請求項２０】形質転換体がサッカロミセス・セレビシ
    ェAH22R-/pGLD P31−Rcまたはサッカロミセス・セレビ
    シェAH22R-/pGLD P31−RcTであり、製造されるP31修飾
    蛋白質がadr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31蛋白質のＮ
    末端から44〜49番目のペプチド鎖を欠損させた蛋白質で
    ある、特許請求の範囲第18項記載の製造法。
JP61193833A 1985-08-20 1986-08-18 新規蛋白質およびその製造法 Expired - Fee Related JPH0745514B2 (ja)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP60-183344 1985-08-20
JP18334485 1985-08-20
JP409186 1986-01-10
JP61-4090 1986-01-10
JP61-4091 1986-01-10
JP409086 1986-01-10
JP61-128918 1986-06-02
JP12891886 1986-06-02

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP11028993A Division JPH0777557B2 (ja) 1985-08-20 1993-05-12 Ｐ３１修飾蛋白質をコードするｄｎａ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS63109795A JPS63109795A (ja) 1988-05-14
JPH0745514B2 true JPH0745514B2 (ja) 1995-05-17

Family

ID=27454006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61193833A Expired - Fee Related JPH0745514B2 (ja) 1985-08-20 1986-08-18 新規蛋白質およびその製造法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4983520A (ja)
EP (1) EP0235430A1 (ja)
JP (1) JPH0745514B2 (ja)
KR (1) KR940010866B1 (ja)
CN (1) CN1022113C (ja)
CA (1) CA1290713C (ja)
MY (1) MY103035A (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5182195A (en) * 1987-11-13 1993-01-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for increasing gene expression using protease deficient yeasts
GB8821049D0 (en) * 1988-09-08 1988-10-05 Health Lab Service Board Method & composition for treatment & prevention of viral infections
EP0365172A3 (en) * 1988-10-05 1991-03-27 Takeda Chemical Industries, Ltd. Assay for anti-pre s antibody
EP0384058A1 (en) * 1989-02-09 1990-08-29 Development Center For Biotechnology Isolation of hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells
JP3026029B2 (ja) * 1991-04-26 2000-03-27 財団法人阪大微生物病研究会 組換え水痘ウイルスとその作製法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2480779B2 (fr) * 1979-08-30 1986-07-18 Anvar Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur
US4650674A (en) * 1984-07-05 1987-03-17 Genentech, Inc. Synergistic cytotoxic composition
EP0171908A3 (en) * 1984-07-11 1987-07-15 Takeda Chemical Industries, Ltd. Hepatitis b virus surface antigen and production thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA1290713C (en) 1991-10-15
CN86106260A (zh) 1987-04-08
US4983520A (en) 1991-01-08
EP0235430A1 (en) 1987-09-09
KR940010866B1 (ko) 1994-11-18
KR870002265A (ko) 1987-03-30
CN1022113C (zh) 1993-09-15
JPS63109795A (ja) 1988-05-14
MY103035A (en) 1993-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3069907B2 (ja) 新規な抗原物質及びその製法
JP2525438B2 (ja) ファクタ―８：ｃの製造方法
US6306625B1 (en) Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast
JP2511394B2 (ja) 酵母菌中でのｂ型肝炎表面抗原の製造
EP0522030B1 (en) Hepatitis b vaccine
JP2634371B2 (ja) 脊椎動物細胞内でｂ型肝炎表面抗原をコードするｄｎａを発現するベクター
EP0171908A2 (en) Hepatitis B virus surface antigen and production thereof
JPS6362198B2 (ja)
EP0156242A2 (en) Lyophilized hepatitis B vaccine
DK166357B (da) Partikler med immunogene egenskaber svarende til hbs antigen samt vektorer og animalske celler til produktion af saadanne partikler
JPH0759595B2 (ja) 酵母内でｂ型肝炎ウイルス蛋白を生産する方法
JPS6155950B2 (ja)
PL153902B1 (en) Method of producing polypeptide containing sequences of amonoacids of animal interferon
CN107353347A (zh) 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法
JPH06172393A (ja) 宿主炭水化物含量が減少したＨＢｓＡｇエスケープ変異体ワクチン
NO833198L (no) Fremstilling av hepatit-b-virus vaksine
JPH0745514B2 (ja) 新規蛋白質およびその製造法
US5164485A (en) Modified hepatitis B virus surface antigen P31 and production thereof
JPS5974985A (ja) 新規ｄｎａ
US5851823A (en) Hepatitis B vaccine
EP0288198A2 (en) Production of Peptide
JPS6170989A (ja) 組み換えｄｎａおよびその用途
US6103519A (en) Antigens and methods therefor
Han et al. Expression, purification and characterization of the hepatitis B virus entire envelope large protein in Pichia pastoris
JPH06153962A (ja) Ｐ３１修飾蛋白質をコードするｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees