JPH06153962A - Ｐ３１修飾蛋白質をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明はワクチンとして有用なＢ型肝炎ウイル
ス表面抗原の製造に有用なＤＮＡおよび形質転換体を提
供する。 【効果】Ｐ３１修飾蛋白質はＨＢＶ感染の診断のための
抗原およびＨＢＶの予防のためのワクチンとして用いる
ことができる。 【構成】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質のトリ
プシン様プロテアーゼ感受性部位を不感受性化せしめる
ように修飾したＢ型肝炎ウイルス表面抗原活性および重
合ヒト血清アルブミン結合能を有するＰ３１修飾蛋白質
をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡならびに当該ＤＮ
Ａを保持する形質転換体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はワクチンとして有用な新
規Ｐ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡおよびそれを保
持する形質転換体に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Ｂ型
肝炎は、特に熱帯アフリカ、東南アジアおよび極東にお
いて多発するウイルス性疾患であり、慢性肝炎や肝硬
変、さらには原発生肝ガンの原因にもなることが疫学的
に示唆されている。病因は、ＤＮＡウイルスの１種であ
るＢ型肝炎ウイルス(Hepatitis B virus; 以下、ＨＢ
Ｖと略称する)で、それは直径42nmの球状粒子で発見者
の名を冠してデン(Dane)粒子と呼ばれる。その外層に
は、ＨＢＶ表面抗原(以下、HBsAgと略称する)があり、
その抗原性の違いによってadr, adw,ayr, ayw などのサ
ブタイプに分けられているが、日本で見いだされるのは
adw型および adr型である。Ｂ型肝炎患者の血中には、
デン粒子のほかに小型粒子や管状粒子が検出され、これ
らの粒子にはデン粒子と同じ型のHBsAgが認められてい
る。ウイルスの表在性抗原に対する抗体がそのウイルス
の感染を防御することは他のウイルスでも知られてお
り、ＨＢＶの場合にもHBsAgをもとにＢ型肝炎に対する
ワクチンの製造が考えられる。ところが、ＨＢＶはヒト
やチンパンジーにしか感染せず、培養細胞への感染の試
みは成功していない。そのためHBsAgはヒト感染者血中
からの入手に限定されており、得られた小型粒子などは
診断用試薬の材料としての需要を満たしても、ワクチン
の大量の製造のためには不十分な状態である。

【０００３】分子生物学の最近の進歩により非細菌性の
蛋白質をコードするＤＮＡを細菌に導入し、形質転換さ
せることが可能になってきた。この遺伝子組み換えの技
術を応用し、HBsAg構造遺伝子(以下、HBsAg遺伝子と略
称する)を細菌内で発現させることができれば、ＨＢＶ
感染の危険性のないHBsAgを大量に調製することが可能
になり、Ｂ型肝炎ワクチンの実用化への道が開かれる。
現在知られている４種のサブタイプすなわちadw, adr,
ayw, ayr のうち、欧米に多いayw型についてはHBsAg遺
伝子の存在部位およびその塩基配列が決定され〔Galibe
rt, F. ら, Nature, 281, 646(1979); Charnay, P. ら,
Nucleic AcidsRes., 7, 335(1979)〕, 雑種蛋白質とし
て大腸菌内での発現が報告されている〔Charnay, P.ら,
Nature, 286, 893(1980); Edman, J. C. ら, Nature,
291, 503(1981)〕。

【０００４】また、日本で多く見出されている adw型お
よび adr型については、本発明者らの一部はHBsAg遺伝
子を含むＤＮＡの創製に成功し、当該遺伝子のＤＮＡ塩
基配列ならびにゲノム上の位置を決定し、さらにこの組
み換えＤＮＡを含有する形質転換体を培養してHBsAgを
大量生産する途を開いた(特開昭58−194897号公報, 特
開昭58−201796号公報, 特開昭59−74985号公報)。

【０００５】最近、Machida, A. ら〔Gastroenterolog
y, 85, 268(1983); 同誌, 86, 910(1984)〕 によって示
されたように、Ｂ型肝炎ウイルスe 抗原陽性の患者血漿
から得られたHBsAg小型粒子中には、従来同定されてい
たＰ−Ｉ(分子量22〜24キロ・ダルトン), Ｐ−II(分子
量２５〜29.5キロ・ダルトン)などの主要ペプチドに加
えて〔Peterson, D. L. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 7 4, 1530(1977)〕,Ｐ31蛋白質(分子量31キロ・ダル
トン)とＰ35蛋白質(Ｐ31に糖が結合した複合蛋白で分子
量35キロ・ダルトン)が存在していることが証明され
た。Ｐ31はＰ−ＩのＮ末端にpre-Ｓ領域の55個のアミノ
酸残基が付加したもので、この領域中に重合ヒト血清ア
ルブミン(poly−ＨＳＡ)の受容体が存在していることも
明らかにされている。さらに上記1984年の報告で、上記
Ｐ−31蛋白質が糖鎖を有することも明らかにされてい
る。一方、肝細胞表面にもpoly-ＨＳＡおよびその受容
体があることから、poly−ＨＳＡを介してデン粒子が肝
細胞に付着し増殖がおこると考えられている。従って、
デン粒子上のpoly−ＨＳＡ受容体がＰ31に対する抗体で
マスクされれば、該粒子は肝細胞と結合できなくなりＨ
ＢＶ感染がより有効に予防できると期待されている。

【０００６】一方、Ｐ31を各種のプロテアーゼ、例えば
トリプシンで限定分解すると、選択的にＰ31のＮ末端側
より48番目のアルギニンの部位で切断され、分子量28K
ダルトンの蛋白質(Ｐ28)が生成される。またＰ31遺伝子
を酵母内で発現させた場合にも、その遺伝子産物は菌体
内に多量に存在するトリプシン様プロテアーゼによって
分解されてＰ28が生成される傾向がある〔図１〕。この
Ｐ28以外に、Ｐ31のＮ末端側より16と18番目のアルギニ
ンや177と196番目のリジンは酵母中に存在するトリプシ
ン様プロテアーゼによって分解され、 30, 21, 19Kダル
トンなどの蛋白質が生成される可能性がある。

【０００７】先にもふれたように、Ｂ型肝炎ウイルスe
抗原陽性の患者血漿から得られたHBsAg小型粒子中に
は、Ｐ−ＩおよびＰ−IIなどの主要ペプチドに加え、Ｐ
31蛋白質とＰ35蛋白質(Ｐ31に糖が結合した複合蛋白質
で分子量３５キロ・ダルトン)が存在している〔Stibbe,
W. ら, J. Virol., 46, 626( 1983)〕。特に感染力を
有するDane粒子と呼ばれるＨＢＶ本体は、その表面抗原
としてＰ−Ｉ,Ｐ−IIの他に、Ｐ31蛋白質やＰ35蛋白質
を有している。ＨＢＶの感染を防御するためのワクチン
として望ましいものは、Dane粒子の持つ表面抗原の種類
をできるだけ多くそなえているものである。すなわち、
Ｐ−ＩやＰ−IIの他に、Ｐ31蛋白質やＰ35蛋白質がワク
チンに含まれていることが望ましい。組換えＤＮＡ技術
によるＢ型肝炎ウイルスに対するワクチンの製造の試み
は、現在世界中でなされているが、上記の条件を満たし
たものは、動物細胞を使ったMichel, M. L. ら〔Proc.
Natl.Acad. Sci. U.S.A., 81, 7708(1984); Bio/Techno
logy, 3,561(1985)〕の報告のみである。しかし、彼ら
は動物細胞を宿主として使用しているため、コストが非
常に高くなる欠点を有している。

【０００８】

【課題を解決するための手段および作用】本発明は(1)
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ31蛋白質のトリプシン様プ
ロテアーゼ感受性部位の少なくとも１ケ所を不感受性化
せしめるように修飾したＢ型肝炎ウイルス表面抗原活性
および重合ヒト血清アルブミン結合能を有するＰ31修飾
蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ，(2) Ｂ型
肝炎ウイルス表面抗原Ｐ31蛋白質のトリプシン様プロテ
アーゼ感受性部位の少なくとも１ケ所を不感受性化せし
めるように修飾したＢ型肝炎ウイルス表面抗原活性およ
び重合ヒト血清アルブミン結合能を有するＰ31修飾蛋白
質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する形質
転換体，および(3) Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ31蛋白
質のトリプシン様プロテアーゼ感受性部位の少なくとも
１ケ所を不感受性化せしめるように修飾したＢ型肝炎ウ
イルス表面抗原活性および重合ヒト血清アルブミン結合
能を有するＰ31修飾蛋白質をコードするＤＮＡおよびＢ
型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ25蛋白質をコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡを保持する形質転換体を培養すること
を特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ31蛋白質の
トリプシン様プロテアーゼ感受性部位の少なくとも１ケ
所を不感受性化せしめるように修飾したＢ型肝炎ウイル
ス表面抗原活性および重合ヒト血清アルブミン結合能を
有するＰ31修飾蛋白質およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原
Ｐ25蛋白質の製造法を提供するものである。

【０００９】本発明のＰ31修飾蛋白質をコードするＤＮ
Ａは、いずれのサブタイプ(adr, adw, ayr, ayw)のもの
であってもよく、たとえばそれらは下記の方法によって
調製することができる。特開昭59−74985号公報またはN
ucleic Acids Res., 11, 1747(1983)に記載されている
3.19kbの adr型ＨＢＶ・ＤＮＡが組み込まれたプラスミ
ドpBR322−BamHI/HBr330(pHBr330と略称)を制限酵素Eco
RIとBamHIで２重消化すると、pre−Ｓ領域の一部を含む
1398bpのＤＮＡ断片を得ることができる。この断片に

【化１】 の配列を含む適当なアダプターを結合させることによっ
てＰ31をコードするＤＮＡを作製し、適当なベクターに
挿入する。他のサブタイプのＰ31をコードするＤＮＡも
上記と同様な方法で調製することができる。トリプシン
様プロテアーゼ感受性部位の一つであるＰ31のＮ末端側
より48番目のアルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を
欠損、あるいは他のアミノ酸またはペプチド鎖に置換し
たＰ31修飾蛋白質をコードするＤＮＡを作製するには、
たとえば次のような方法で行なえばよい。

【００１０】adr型Ｐ31遺伝子の場合には、〔図２〕に
示されるようにＮ末端側より48番目のアルギニンをコー
ドする領域に制限酵素XhoI認識部位が存在する。従って
Ｐ31遺伝子をXhoIで切断した後、エキソヌクレアーゼた
とえばヌクレアーゼBAL31でアルギニンをコードする領
域を除去するか、あるいはXhoI切断部位をＤＮＡポリメ
ラーゼ・ラージ・フラグメントで修復した後、適当なリ
ンカーを挿入することによってアルギニンのコドンを消
去することができる。その中で遺伝子の読み枠(フレー
ム)が正しく保たれて(in phase)いるものを選び出せば
よい。また、Ｐ31修飾蛋白質をコードするＤＮＡは化学
合成したものでもよい。その際、48番目のアルギニンま
たはそれを含むペプチド鎖をコードする配列を欠損させ
るか、あるいは他のアミノ酸またはペプチドをコードす
るコドンに置換して、読み枠を正しく保つように合成す
ればよい。

【００１１】また、〔図５〕に示されたプラスミドpBR
−Sal−6を制限酵素SalIとXbaIで分解して得られる267b
pＤＮＡ断片を、ベクターＭ13 mp11のSalI−XbaI部位
に挿入し、 これを大腸菌ＪＭ103(Pharmacia P-L Bioche
micals)に感染させる。成育後、ブロス中に放出された
Ｍ13ファージをポリエチレングリコールで沈澱させ、つ
いでフェノール処理によってＭ13ファージ１本鎖ＤＮＡ
を得ることができる。次に、Ｐ31のＮ末端側より48番目
のアルギニンのコドンAGGを、例えばグルタミンのコド
ンCAGに変換するためのプライマー例えばd⁵′(CCCAGTCT
GCGAGAAG)³′を化学合成によって作製することができ
る。このプライマーと先に調製したＭ13ＤＮＡとを混合
し、ＤＮＡポリメラーゼＩラージ・フラグメントの作用
によって２本鎖にしたのち、Ｔ4ＤＮＡリガーゼの作用
によって環状化することができる。この環状ＤＮＡを大
腸菌ＪＭ103に導入し、放出されてくるＭ13ファージＤ
ＮＡをフィルターに転移させたのち、³²Ｐで標識した該
合成プライマーを用いてプラーク・ハイブリダイジーシ
ョン〔Maniatis, T. ら Molecular Cloning, A Laborat
ory Mannual,Cold Spring Harbor Laboratory, P. 312
(1982)〕を行う。強いシグナルが検出されたファージか
らＤＮＡを調製し、制限酵素SalI−XbaIで分解して267b
pＤＮＡ断片を得ることができる。該断片をプラスミドp
BR−Sal−6の267bpSalI−XbaI断片と置換すればＰ31修
飾蛋白質をコードするＤＮＡ(修飾Ｐ31遺伝子)が得られ
る。

【００１２】なお、adw型およびadyw型のＰ31をコード
するＤＮＡ上にはXhoI認識部位が存在しないため、修飾
Ｐ31遺伝子は上述の site−directed mutagenesis〔Smi
th,M. and Gillam, S., Genetic Engineering 3, 1(198
1)〕の手法によって作製することができる。HBsAg遺伝
子の全体または一部を含むプラスミドＤＮＡ、コスミド
ＤＮＡ、ファージＤＮＡなどをsite-directed mutagene
sisのための鋳型ＤＮＡとして用いることができる。Ｍ1
3ファージやφX174ファージは、 １本鎖ＤＮＡが容易に
調製できるので、鋳型ＤＮＡとしてより望ましい。例え
ばＭ13ファージやφX174ファージにHBsAg遺伝子の全体
または一部が組み込まれたものを使用する時は、ブロス
中に存在するファージ粒子をポリエチレングリコールで
沈澱させ、フェノール処理で除蛋白を行い、ついでエタ
ノール沈澱を行いファージ粒子内にあった１本鎖ＤＮＡ
を得ることができる。また鋳型ＤＮＡとしてHBsAg遺伝
子の全体または一部が組み込まれた２本鎖のプラスミド
ＤＮＡやコスミドＤＮＡを用いる時は、２本鎖ＤＮＡを
100℃で１分から10分、 望ましくは３分から５分熱処理
した後、氷水で急冷し１本鎖ＤＮＡに変性させて使用す
ることができる。

【００１３】site-directed mutagenesisのためのプラ
イマーは、変換しようとするＤＮＡ配列を持ち、鋳型Ｄ
ＮＡとハイブリダイズしてＤＮＡ合成時のプライマーと
して機能しうるものであれば、どのようなＤＮＡ配列の
ものでもよい。またプライマーの作製は、どのような方
法でもよいが、化学合成で適当な配列の１本鎖ＤＮＡを
作ることが望ましい。このようなプライマーと先に調製
した１本鎖ＤＮＡとを混合し、ＤＮＡポリメラーゼＩラ
ージ・フラグメントの作用によって２本鎖ＤＮＡに修復
した後Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用によって環状化するこ
とができる。この環状ＤＮＡを大腸菌に導入した後ラジ
オアイソトープで標識したプライマーをプローブに用い
て、プラーク・ハイブリダイゼイション〔Maniatis, T,
ら Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Cold
Spring Harbor Laboratoy, P.312(1982)〕や、 コロニー
・ハイブリダイゼイション〔同P.326〕を行い、目的と
する変異体を選び出すことができる。このようにして得
られたプラークやコロニーからファージＤＮＡやプラス
ミドＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを用いて修飾Ｐ31遺伝子
を作製することができる。

【００１４】Ｎ末端側より48番目のアルギニンを含むア
ミノ酸またはペプチドを欠損させる場合、48番目のアル
ギニンのみを欠損させるようにＤＮＡを構築してもよ
く、また48番目のアルギニンを含むペプチドを欠損させ
るように構築してもよい。欠損させるペプチドは、 該ペ
プチドが欠損してもHBsAg活性および重合ヒト血清アル
ブミンとの結合能を保持できるものであれば、いかなる
大きさであってもよいが、Ｎ末端側より26〜55番目のペ
プチド鎖内で48番目のアルギニンを含むペプチドを欠損
させたものが好ましく、44〜49番目のペプチド鎖内で48
番目のアルギニンを含むペプチドを欠損させたものがさ
らに好ましい。また、48番目のアルギニンまたはそれを
含むペプチドを欠損させ、アルギニン, リジン以外のア
ミノ酸, ペプチド鎖を付加させてもよく、付加させるペ
プチド鎖内のアミノ酸数は１〜50個程度、好ましくは１
〜４個程度である。上述のsite−directed mutagenesis
の手法により、Ｎ末端側より16および18番目のアルギニ
ン, 177および196番目のリジンをリジン, アルギニン以
外のアミノ酸のコドンに置換して修飾Ｐ31遺伝子を作製
することができる。

【００１５】上記のトリプシン様プロテアーゼ感受性部
位のなかで、少なくともＰ31のＮ末端側より48番目のア
ルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を修飾することが
好ましく、Ｐ31のＮ末端側より48番目のアルギニンまた
はそれを含むペプチド鎖のみを修飾することがさらに好
ましい。上記の付加または置換に用いられるリジン, ア
ルギニン以外のアミノ酸のコドンとしては、たとえばア
スパラギン, アスパラギン酸, アラニン, イソロイシ
ン, グリシン, グルタミン, グルタミン酸, システィ
ン, セリン, チロシン, トリプトファン, スレオニン,
バリン, ヒスチジン, フェニルアラニン, プロリン,メ
チオニン,ロイシンなどのコドンがあげられる。このＰ3
1修飾蛋白質をコードするＤＮＡを各種宿主(例、大腸
菌, 枯草菌, 酵母, 動物細胞)で機能するプロモーター
領域の３'末端に挿入することにより、修飾Ｐ31をコー
ドするＤＮＡを発現させうる組み換えＤＮＡを構築する
ことができる。

【００１６】プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ
が結合することによってmRNA合成を開始させるのに必要
な部位を含む領域であれば、いかなるものであってもよ
い。たとえば大腸菌を宿主として用いる場合、修飾Ｐ31
をコードするＤＮＡを大腸菌で機能しうるプロモーター
領域の３'末端に挿入すれば、修飾Ｐ31をコードするＤ
ＮＡを発現しうる組み換えＤＮＡが構築できる。たとえ
ば、特開昭58−201796号公報に記載の発現用ベクターpT
RP601, pTRP771などに、修飾Ｐ31をコードするＤＮＡを
Ｔ4ＤＮＡリガーゼの作用により挿入する。この反応液
を用いて、大腸菌(例、Ｃ600株, 294株, Ｗ3110株, Ｒ
Ｒ1株, ＰＲ13株など)を公知の方法〔Cohen, S. N. ら,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)〕もし
くはそれに準ずる方法によって形質転換する。使用する
プロモーターは、trpプロモーター(trp−p)に限定する
必要はなく、たとえばrecAプロモーター〔特開昭59−65
099号〕, lacプロモーター, λＰ_L プロモーターなどを
使用してもよい。

【００１７】上記のようにして得られたＰ31修飾蛋白質
をコードするＤＮＡを含む新規な組み換えプラスミドＤ
ＮＡを保持する形質転換体は、たとえばアンピシリン耐
性,テトラサイクリン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を
表現形として選ぶことができる。これらの耐性株の中か
らＰ31修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有する新規な
組み換えプラスミドＤＮＡを保持する菌株を探し出すに
は、たとえば次の手法が用いられる。前述したアダプタ
ーの一方の鎖, ⁵′AATTCCACTGCATTGTAT³′ をＴ4ポリヌ
クレオチド・キナーゼによってγ−³²P−ATP を用いて
放射性同位元素で標識し、これを探針(プローブ)とし
て、それ自体公知のコロニー・ハイブリダイゼーション
法〔Grunstein, M. and Hogness, D. S., Proc. Natl.
Acad. Sci.USA, 72, 3961(1975)〕 によって、すでに得
た薬剤耐性の形質転換体の中から陽性を示すクローンを
確実に探し出すことができる。このようにして選択され
た形質転換体をそれ自体公知の培地で培養する。培地と
しては、例えばＬブロス, ペナセイ(Penassay)ブロスお
よびグルコース, カザミノ酸を含むＭ−９培地〔Mille
r, J., Experiments in Molecular Genetics, 431−433
(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)〕
が挙げられる。ここに、必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、たとえば3β−インドリルアクリ
ル酸のような薬剤を加えることができる。

【００１８】該形質転換体の培養は通常15〜43℃, 好ま
しくは28〜40℃で２〜24時間, 好ましくは４〜16時間行
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
として、たとえば酵母を利用するときは、酵母形質転換
体を次のように作製することができる。大腸菌−酵母シ
ャトル・ベクターYEp13〔Broach, J. R.ら, Gene, 8, 1
21(1979)〕, pSH15とpSH19〔Harashima, S. ら, Mol. C
ell.Biol., 4, 771(1984)〕に、酵母プロモーター領域,
たとえば抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子プロモータ
ー領域〔Meyhack, B. ら, EMBO J., 6, 675(1982)〕,
グリセルアルデヒド 3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
のプロモーター領域〔Holland, J. P. and Holland, M.
J., J.Biol. Chem, 255, 2596(1980)〕, あるいは３−
ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター領域
〔Dobson, M. J. ら, Nucleic Acids Res., 10, 2625(1
982)〕を挿入したのち、その直後にＰ31修飾蛋白質をコ
ードするＤＮＡをＴ4ＤＮＡリガーゼの作用によって結
合させる。またＰ31修飾蛋白質をコードするＤＮＡの直
後に、転写を終結させる信号(ターミネーター)を挿入
し、Ｐ31修飾蛋白質の生産量を増大させることもでき
る。ターミネーターとしては、たとえば３−ホスホグリ
セリン酸キナーゼ遺伝子やグリセルアルデヒド ３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などの３'−非翻訳領域が
使用できる。この反応液を用いて、前述の宿主大腸菌を
前述のCohenらの方法によって形質転換する。このよう
にして得られたＰ31修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含
む新規な組み換えＤＮＡを保持する形質転換体は、たと
えばアンピシリン耐性を表現型として選ぶことができ
る。この耐性株の中からＰ31修飾蛋白質をコードするＤ
ＮＡをもつ新規な組み換えプラスミドＤＮＡを保持する
菌株を探し出すには、前述の方法が同様に用いられる。

【００１９】このようにして選択された形質転換体から
プラスミドＤＮＡをアルカリ抽出法〔Birnboim, H. C.
and Doly, J., Nucleic Acids. Res., 7, 1513(1979)〕
によって単離し、 これを用いて酵母、 たとえばロイシン
要求性のサッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces c
erevisiae),たとえばAH22R^-(leu2 his4 can1 cir⁺ pho8
0)〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1(1983)〕ある
いはAH22R^-より誘導されたK33−7B(pho80−AH22, pho8
−2)またはK33−8D(pho80−AH22, pho8−2 trp1)を、公
知の方法〔Hinnen, A. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 75, 1927(1978)〕またはそれに準ずる方法によって
形質転換する。宿主としての酵母はこれらに限定される
ことはないが、サッカロミセス・セレビシェが好まし
い。得られた酵母の形質転換体は、それ自体公知の培地
で培養する。培地としては、たとえばBurkholder 最小
培地〔Bostian, K. L. ら, Proc. Natl. Acad. Sci.US
A, 77, 4505(1980)〕が挙げられる。酵母の形質転換体
の培養は通常15℃〜40℃, 好ましくは24℃〜37℃で10〜
96時間, 好ましくは24〜72時間行い、必要により通気や
撹拌を加えることもできる。

【００２０】宿主として、たとえば枯草菌, 動物細胞を
使用する場合においては枯草菌, 動物細胞で機能しうる
プロモーター領域の３'末端にＰ31修飾蛋白質をコード
するＤＮＡを挿入し、自体公知の方法により、該組み換
えＤＮＡで宿主を形質転換させ、形質転換体を培養する
ことにより、Ｐ31修飾蛋白質を製造することができる
が、宿主としては酵母がより好ましい。生成物の修飾Ｐ
31活性は、たとえば試料をブロムシアンで活性化された
セルロース・ペーパーに結合させたのち、オーストリア
II−125(ダイナボット社製)の¹²⁵Ｉ−抗HBsAg抗体と反
応させるdirect immunoassay法〔Fujisawa, Y. ら, Nuc
leic Acids Res., 11, 3581(1983)〕によって測定する
ことができる。培養後、公知の方法で菌体を集め、大腸
菌の形質転換体の場合には菌体を尿素, 塩酸グアニジン
などの蛋白変性剤を含む緩衝液に懸濁し、冷所で撹拌し
たのち、遠心分離により修飾Ｐ31を含む上澄液を得る方
法、あるいは緩衝液に懸濁し、超音波処理、リゾチーム
および(または)凍結融解によって菌体を破壊したのち、
遠心分離により修飾Ｐ31を含む上澄液を得る方法などが
適宜用い得るが、例えば菌体を集めて緩衝液に懸濁し、
リゾチームを加えてホモジナイズして溶菌後、尿素(３
〜10M)を含む緩衝液を加え撹拌(０〜10℃で0.5〜８時
間)後、遠心分離して上澄を得る方法が好ましい。

【００２１】酵母の形質転換体の場合にはザイモリエー
ス〔キリンビール(株)製〕による溶菌あるいはガラスビ
ースなどによる機械的破砕によって菌体を破壊する。こ
こへ、トリトンＸ−100, デオキシコーレートなどの界
面活性剤, 尿素あるいは塩酸グアニジンなどの蛋白変性
剤を加えることによって修飾Ｐ31をより有利に抽出する
ことができる。修飾Ｐ31抽出液を、10mM EDTAと１mMジ
イソプロピルフルオロ燐酸等のプロテアーゼ阻害剤を含
む10mMリン酸緩衝液で平衡化したDEAE-ToyopearlやButy
l-Toyopearlを用いるクロマトグラフイー処理に付すこ
とができる。また、修飾Ｐ31の分離・精製は、アフィニ
ティークロマトグラフイー処理によって効率的に実施す
ることができる。これらのカラムに吸着した修飾Ｐ31
は、適切に設定した濃度の塩を含む緩衝液を用いて溶出
することができる。修飾Ｐ31を含む溶出画分を集め、所
望により限界ろ過等により濃縮することができる。上記
抽出液からのＰ31修飾蛋白質の分離, 精製は、アフィニ
ティークロマトグラフィー処理を含む精製工程により行
われる。

【００２２】アフィニティークロマトグラフィーとし
て、重合ヒト血清アルブミン(poly−HSA)をリガンドと
するアフィニティークロマトグラフィーやHBsAgに対す
る抗体、とりわけモノクローナル抗体を用いる抗体カラ
ム処理が挙げられる。poly−HSAをリガンドとするアフ
ィニティークロマトグラフィーはＰ31修飾蛋白質の精製
に極めて有利に用いられる。アフィニティークロマトグ
ラフィーの担体としてフォルミルセルロファイン（生化
学工業）， アフィゲル−15(バイオラッド社)などが用
いられ、とりわけフォルミルセルロファインが好まし
い。poly−HSAはヒト血清アルブミンを架橋剤(例えばグ
ルタルアルデヒド)を用いて重合することにより製造で
きる。これを上記担体に、例えば還元剤(NaCNBH₃など)
を用いて結合させ、所望により洗浄し担体とpoly−HSA
の結合物を得て、これを通常カラムに詰めて使用する。

【００２３】Ｐ31蛋白質をpoly−HSAをリガンドとする
アフィニティークロマトグラフィーにより精製するに
は、前記Ｐ31含有溶液(菌体抽出上澄)を、緩衝液〔リン
酸緩衝液など〕で平衡化した上記カラムに吸着させ、緩
衝液で溶出する。該緩衝液には界面活性剤(Tween 20な
ど)または蛋白変性剤(尿素)などを適量加えて使用で
き、これら添加物の種類や濃度を組合せ、適切な溶出液
として用いることができる。Ｐ31蛋白質を含む溶出画分
を集め、所望により限外ろ過等により濃縮する。該濃縮
を、セファクリールＳ−300などを用いるゲルろ過処理
に付すことができる。修飾Ｐ31はvoid volume付近に溶
出される。各種クロマトグラフイーによって得られる修
飾Ｐ31を含む画分は、さらに、ショ糖グラジエント超遠
心, 塩化セシウムグラジエント超遠心などの精製工程で
精製することができる。Ｐ31修飾蛋白質およびＰ25蛋白
質を製造するために用いられるＰ31修飾蛋白質をコード
するＤＮＡは上記のＤＮＡがあげられ、上記の方法に従
って作製することができる。

【００２４】サブタイプadw型Ｐ25蛋白質をコードする
ＤＮＡ(Ｐ25遺伝子)もまた特開昭５８−１９４８９７号
公報または、Nucleic Acids Res., 11, 1747(1983)に記
載されている3.2kbのadw型ＨＢＶ・ＤＮＡが組み込まれ
たプラスミドpHBV933から得ることができる。pHBV933か
ら分離したadw型Ｐ25遺伝子を大腸菌で直接発現させう
る発現プラスミドpTRP SS-6〔Fujisawa, Y. ら, Nuclei
c Acids Res. 11, 3581(1983)〕をClaIとPstIで２重消
化を行うと、Ｐ25遺伝子を含む0.82kbＤＮＡ断片を得る
ことができる。他のサブタイプのＰ25をコードするＤＮ
Ａも上記と同様な方法で調製することができる。このＤ
ＮＡ断片に適当なリンカーを付加し、ベクターに組み込
むことができる。なかでも、修飾Ｐ31とＰ25は異なるサ
ブタイプであるものが好ましく、修飾Ｐ31がadr型であ
りＰ25がadw型であるものがさらに好ましい。このＰ31
修飾蛋白質をコードするＤＮＡと、Ｐ25蛋白質をコード
するＤＮＡを各種宿主(例、大腸菌, 枯草菌, 酵母, 動
物細胞)で機能するプロモーター領域の３'末端にそれぞ
れ挿入することにより、修飾Ｐ31をコードするＤＮＡ
と、Ｐ25蛋白質をコードするＤＮＡを同時に発現させう
る組み換えＤＮＡを構築することができる。

【００２５】プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ
が結合することによってmRNA合成を開始させるのに必要
な部位を含む領域であれば、いかなるものであってもよ
い。たとえば大腸菌を宿主として用いる場合、修飾Ｐ31
をコードするＤＮＡおよびＰ25をコードするＤＮＡを大
腸菌で機能しうるプロモーター領域の３'末端に挿入す
れば、修飾Ｐ31およびP25をコードするＤＮＡを発現し
うる組み換えＤＮＡが構築できる。この組み換えＤＮＡ
を用いて、大腸菌(例、Ｃ600株, 294株, Ｗ3110株, Ｒ
Ｒ1株, ＰＲ13株など)を公知の方法〔Cohen, S. N. ら,
Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)〕もしく
はそれに準ずる方法によって形質転換する。使用するプ
ロモーターは、trpプロモーター(trp−p)に限定する必
要はなく、たとえばrecAプロモーター〔特開昭59−6509
9号〕, lacプロモーター, λＰ_L プロモーターなどを使
用してもよい。上記のようにして得られたＰ31修飾蛋白
質をコードするＤＮＡおよびＰ25蛋白質をコードするＤ
ＮＡを含む新規な組み換えプラスミドＤＮＡを保持する
形質転換体は、たとえばアンピシリン耐性,テトラサイ
クリン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を表現形として選
ぶことができる。これらの耐性株の中からＰ31修飾蛋白
質をコードするＤＮＡおよびＰ25蛋白質をコードするＤ
ＮＡを含有する新規な組み換えプラスミドＤＮＡを保持
する菌株は前述の方法により探し出すことができる。

【００２６】宿主として、たとえば酵母を利用するとき
は、酵母形質転換体を次のように作製することができ
る。大腸菌−酵母シャトル・ベクターYEp13〔Broach,
J. R.ら, Gene, 8, 121(1979)〕, pSH15とpSH19〔Haras
hima, S. ら, Mol. Cell. Biol., 4, 771(1984)〕に、
酵母プロモーター領域,たとえば抑制性酸性ホスファタ
ーゼ遺伝子プロモーター領域〔Meyhack, B. ら, EMBO
J., 6, 675(1982)〕, グリセルアルデヒド 3−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域〔Holland,
J. P. and Holland, M.J., J. Biol. Chem, 255, 2596
(1980)〕, あるいは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺
伝子のプロモーター領域〔Dobson, M. J. ら, Nucleic
Acids Res., 10, 2625(1982)〕を２つ(異種または同種)
挿入したのち、その一方の直後にＰ31修飾蛋白質をコー
ドするＤＮＡを、他の一方の直後にＰ25蛋白質をコード
するＤＮＡをＴ4ＤＮＡリガーゼの作用によって結合さ
せる。前述と同様に、ターミネーターをＰ31修飾蛋白質
をコードするＤＮＡおよび／またはＰ25蛋白質をコード
するＤＮＡの直後に挿入してもよい。この反応液を用い
て、前述の宿主大腸菌を前述のCohenらの方法によって
形質転換する。このようにして得られたＰ31修飾蛋白質
をコードするＤＮＡおよびＰ25蛋白質をコードするＤＮ
Ａを含む新規な組み換えＤＮＡを保持する形質転換体
は、たとえばアンピシリン耐性を表現型として選ぶこと
ができる。この耐性株の中からＰ31修飾蛋白質をコード
するＤＮＡおよびＰ25蛋白質をコードするＤＮＡをもつ
新規な組み換えプラスミドＤＮＡを保持する菌株は、た
とえばプラスミドＤＮＡをアルカリ抽出法〔Birnboim,
H. C. and Doly, J., Nucleic Acids Res., 7, 1513
(1979)〕によって単離した後、種々の制限酵素を作用さ
せた時に生ずるＤＮＡ断片の大きさをアガロースゲル電
気泳動などで解析することにより、確実に探し出すこと
ができる。

【００２７】このようにして選択された形質転換体から
プラスミドＤＮＡをアルカリ抽出法〔Birnboim, H. C.
and Doly, J., Nucleic Acids. Res., 7, 1513(1979)〕
によって単離し、これを用いて酵母、たとえばロイシン
要求性のサッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces c
erevisiae)，たとえばAH22R^-(leu2 his4 can1 cir⁺ pho
80)〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1(1983)〕ある
いはAH22R^-より誘導されたK33−7B(pho80−AH22, pho8
−2)またはK33−8D(pho80−AH22, pho8−2 trp1)を、公
知の方法〔Hinnen, A. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 75, 1927(1978)〕またはそれに準ずる方法によって
形質転換する。宿主としての酵母はこれらに限定される
ことはないが、サッカロミセス・セレビシェが好まし
い。宿主として、たとえば枯草菌, 動物細胞を使用する
場合においては枯草菌, 動物細胞で機能しうるプロモー
ター領域の３'末端にＰ31修飾蛋白質をコードするＤＮ
ＡおよびＰ25蛋白質をコードするＤＮＡを挿入し、自体
公知の方法により、該組み換えＤＮＡで宿主を形質転換
させ、形質転換体を培養することにより、Ｐ31修飾蛋白
質およびＰ25蛋白質を製造することができるが、宿主と
しては酵母がより好ましい。

【００２８】生成物の修飾Ｐ31およびＰ25の活性は、た
とえばオーストリアII−125(ダイナボット社製)あるい
はオースザイムII(アボット社製)によって測定すること
ができる。得られた形質転換体は上記のＰ31修飾蛋白質
をコードするＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを保持
する形質転換体の場合と同様にして培養することができ
る。また、修飾Ｐ31およびＰ25の抽出は上記の修飾Ｐ31
の場合と同様にして行なうことができる。抽出液からの
修飾Ｐ31およびＰ25の分離, 精製はたとえばゲルろ過,
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー, イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー, 超遠心, 抗HBsAg抗
体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより行う
ことができる。修飾Ｐ31ＤＮＡ産物とＰ25ＤＮＡ産物を
Western blottingで分析すると、酵母を宿主にした場合
には、38〜37kダルトンの蛋白(Ｐ37)と25kダルトンの蛋
白(Ｐ25)が検出される。このＰ37は、31kダルトン蛋白
に糖鎖が結合したものでありpoly−ＨＳＡ受容体とHBsA
g活性を保持している。Ｐ25は、HBsAg活性を保持してい
る。また、酵母から抽出されたＰ37とＰ25は凝集体とし
て存在している。複数の抗原遺伝子が挿入された本発明
のプラスミドを保持する形質転換体は単独の遺伝子が挿
入されたプラスミドを保持するものより、抗原生産量が
顕著に上昇するという有利性がある。

【００２９】本発明のＰ31修飾蛋白質およびＰ37とＰ25
は、公知のＨＢＶ感染者の血液を原料にして製造された
HBsAg小型粒子と同様の生物活性を有し、該HBsAg小型粒
子と同様にしてＨＢＶ感染の診断のための抗原およびＨ
ＢＶの予防のためのワクチンとして用いることができ
る。なお、本願明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commissio
n on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
次に挙げる。またアミノ酸に関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。

【００３０】ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ＲＮＡ リボ核酸 mRNA メッセンジャーRNA Ａ アデニン Ｔ チミン Ｇ グアニン Ｃ シトシン dATP デオキシアデノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ アデノシン三リン酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸

【００３１】ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ ジチオスレイトール Gly グリシン Ala アラニン Val バリン Leu ロイシン Ile イソロイシン Ser セリン Thr スレオニン Cys システィン 1/2Cys ハーフシスチン Met メチオニン Glu グルタミン酸

【００３２】Asp アスパラギン酸 Lys リジン Arg アルギニン His ヒスチジン Phe フェニルアラニン Tyr チロシン Trp トリプトファン Pro プロリン Asn アスパラギン Gln グルタミン Ap^r アンピシリン耐性遺伝子 Tc^r テトラサイクリン耐性遺伝子 ars１ オートノマス・レプリケーション・シークエ
ンス１(autonomous replication sequence １) ＩＲ インバーテッド・リピート(inverted repea
t)

【００３３】(4) 実施例および発明の効果 以下に参考例および実施例を示して本発明をさらに具体
的に説明するが本発明はこれらに限定されるべきもので
はない。

【００３４】参考例１ 酵母抑制性酸性ホスファターゼ
・プロモーター(PHO5−P)を含有する発現用ベクターの
作製 酵母Saccharomyces cerevisiae S288C株由来の抑制性酸
性ホスファターゼ遺伝子(PHO5)と構成性酸性ホスファタ
ーゼ遺伝子(PHO3)を含む7.9kb ＤＮＡ断片を含む大腸菌
プラスミド(pJA1)〔Kramer, R. A, and Anderson, N, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 6541(1980)〕, 50μg
に20ユニットの制限酵素BamHI〔宝酒造(株)製〕と20ユ
ニットの制限酵素SalI〔宝酒造(株)製〕を100μl の反
応液〔10mMTris−HCl(pH 8.0),７mM MgCl₂, 100mM NaC
l, ２mM ２−メルカプトエタノール〕中で37℃, ３時間
作用させた後、1.0％アガロース(Sigma 社製)・スラブ
ゲルを用いて緩衝液〔100mM Tris−HCl, 100mM ホウ酸,
２mM EDTA(pH 8.3)〕中,140V, ２時間電気泳動にかけ
た。泳動後、0.63kb ＤＮＡ断片を含むゲル片を透析チ
ューブ内に封入し、泳動用緩衝液内に沈め、該ＤＮＡ断
片をゲルから電気的に溶出した〔McDonell, M. W. ら,
J. Mol. Biol, 110, 119(1977)〕。透析チューブ内液を
フェノール抽出さらにエーテル抽出した後、NaClを0.2M
になるように加え、つづいて２倍量の冷エタノールを加
えて−20℃でＤＮＡを沈澱させた。

【００３５】１μgのプラスミドpSH19 に２ユニットの
制限酵素BamHIと２ユニットの制限酵素SalIを20μl の
反応液〔10mM Tris−HCl(pH 8.0), ７mM MgCl₂, 100mM
NaCl,２mM ２−メルカプトエタノール〕中で37℃, ２時
間作用させた後、該反応液を0.8％アガロース・スラブ
ゲルを用いて上述の条件下で電気泳動にかけた。泳動
後、8.0kb ＤＮＡ断片を上述の方法によってゲルから分
取し、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを
沈澱させた〔図１２〕。該8.0kbＤＮＡ断片400ngと前記
0.63kbＤＮＡ断片200ngとを混合し、20μl の反応液〔6
6mM Tris−HCl(pH 7.6), 6.6mM MgCl₂, 10mMジチオスレ
イトール, １mM ATP, ２ユニットのＴ4ＤＮＡリガーゼ
(宝酒造(株)製)〕中、14℃で一夜作用させてＤＮＡを結
合させた。この反応液を用いて大腸菌294株を前記Cohen
らの方法に従って形質転換した。アンピシリン耐性を指
標として選択された形質転換体の中から、プラスミドＤ
ＮＡを前記アルカリ抽出法によって単離し、分子量と制
限酵素による分解パターンを調べ、pSH19のBamHI−Sal
Ｉ部位に、pJA1から単離された0.63kbＤＮＡ断片が挿入
されたプラスミドpPHO12を分離した〔図１２〕。

【００３６】３μgのプラスミドpPHO12ＤＮＡに２ユニ
ットの制限酵素SalＩを20μl の反応液〔10mM Tris−HC
l(pH 7.5)，７mM MgCl₂,175mM NaCl, 0.2M EDTA, ７mM
２−メルカプトエタノール〕中で37℃, ２時間作用させ
た後、フエノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを
沈澱させた。このＤＮＡ, ３μgに12ユニットのBAL31ヌ
クレアーゼ(Bethesda Research Laboratories社製)を50
μl の反応液〔20mM Tris−HCl(pH 8.1), 12mM CaCl₂,
12mM MgCl₂，１mM EDTA〕中で30℃, ２分間作用させた
後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈
澱させた〔図１２参照〕。200ngのXhoIリンカーd(CCTCG
AGG)〔New England BioLabs社製〕に３ユニットのＴ４
ポリヌクレオチド・キナーゼ〔宝酒造(株)製〕を50μl
の反応液〔50mM Tris−HCl(pH 7.6), 10mM MgCl₂, 10mM
２−メルカプトエタノール, 100μM ATP〕中で37℃,
１時間作用させて、５′末端をリン酸化した。40ngの
５′末端がリン酸化されたXhoIリンカー〔５′−Ｐ−d
(CCTCGAGG)〕と400ngの前述のBAL−31で処理されたpPHO
12ＤＮＡとを混合し、前述の条件下でＴ4ＤＮＡリガー
ゼの作用で結合させた。この反応液を用いて大腸菌294
株をCohenらの方法に従って形質転換した。アンピシリ
ン耐性を指標として選択された形質転換体の中から、プ
ラスミドＤＮＡを前記アルカリ抽出法によって単離し、
BamHIとXhoIによる２重消化物の大きさが0.55kbである
プラスミドpPHO17を選択した。BAL−31ヌクレアーゼ処
理によって、PHO5の開始コドンATGの上流20bpが除去さ
れたことが、Dideoxynucleo-tide法〔Sanger, F. ら, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)〕による
ＤＮＡ塩基配列の分析によって明らかになった〔図１２
参照〕。

【００３７】次に、該プラスミドpPHO17, ２μgに４ユ
ニットの制限酵素XhoI〔宝酒造(株）製〕を２０μlの反
応液〔６mM Tris−HCl(pH 7.9), 150mM NaCl, ６mM MgC
l₂, ６mM ２−メルカプトエタノール〕中で37℃, ２時
間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノール
でＤＮＡを沈澱させた。該ＤＮＡ１μgに５ユニットの
ＤＮＡポリメラーゼＩ ラージ・フラグメント(New Eng
land BioLabs社製)を30μl の反応液〔40mM リン酸カリ
ウム緩衝液(pH 7.5), 6.6mM MgCl₂, １mM ２−メルカプ
トエタノール, 33μM dATP, 33μM dGTP,33μM dTTP, 3
3μM dCTP〕中で12℃, 30分間作用させて、接着末端を
平滑末端にした後、フェノールで除蛋白し、冷エタノー
ルでＤＮＡを沈澱させた。該ＤＮＡ断片500ngと、前述
の条件下でリン酸化されたSalＩリンカー〔５′−Ｐ−d
(GGTCGACC)〕(New England BioLabs社製), 50ngとを混
合し、前述の条件下でＴ4ＤＮＡリガーゼの作用で結合
させた。この反応液を用いて大腸菌294株をCohenらの方
法に従って形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換
体の中から、プラスミドpPHO17のXhoI部位がSalI部位に
変換したプラスミドpPHO17−１を取得した〔図１２参
照〕。

【００３８】参考例２ 酵母ホスホグリセリン酸キナー
ゼ・プロモーター(PGK−P)を含有する発現用ベクターの
作製 ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子(PGK)のクロー
ニング Cryer, D. R. らの方法〔Methods in Cell Biology, Vo
l. XII, P.39〜44(1975)〕によって調整されたSaccharo
myces cerevisiae協会３号株(ＩＦＯから入手できる)の
染色体ＤＮＡ, 350μgに200ユニットの制限酵素HindIII
〔宝酒造(株)製〕を１mlの反応液〔10mM Tris−HCl(pH
7.5), ７mM MgCl₂, 60mM NaCl〕中37℃, ３時間作用さ
せた後、１％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１
に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、アガロー
スゲルを分割することによりＤＮＡ断片を大きさの順に
１から10の画分に分けた。各画分のアガロースゲル片を
それぞれ透析チューブに封入し、参考例１に記載の条件
下でゲル片からＤＮＡを電気的に溶出した。溶出液をフ
ェノール処理した後、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈
澱させた。各画分からのＤＮＡ 0.5μgを１％アガロー
ス・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電気
泳動を行った後、ニトロセルロースフィルター(Schleic
her and Schull社製)にSouthernの方法〔Southern, E.
M., J. Mol. Biol., 98, 503(1975)〕に従ってＤＮＡを
吸着させた。PGK〔Dobson, M. J.ら, Nucleic Acids Re
s, 10, 2625(1982)〕のＮ末端側からの５個のアミノ酸
をコードするオリゴヌクレオチドに相補な５′−TGAAGA
TAAAGACAT−３′をCrea, R. ら〔Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 75, 5765(1978)〕の方法によって合成し、該オ
リゴヌクレオチド１μgに10μCiのγ−〔³²Ｐ〕ATP(Ame
rsham社製)と10ユニットのＴ4ポリヌクレオチド・キナ
ーゼとを30μl の反応液〔50mM Tris−HCl(pH7.6), 10m
M MgCl₂, 10mM２−メルカプトエタノール〕中で37℃, 3
0分間作用させ、５′末端を³²Ｐで標識した。該反応液
に200mM EDTA(pH 8.0)を10μl 添加し、１容量のフェノ
ールで除蛋白した後、TEN緩衝液〔10mM Tris−HCl(pH
8.0), 200mM NaCl, １mM EDTA〕で平衡化したセファロ
ース4Ｂ(Pharmacia社製)・カラム(0.25×25cm)にかけて
void volume付近に溶出される標識された該オリゴヌク
レオチドを集め、PGK遺伝子をスクリーニングするため
のプローブとして用いた。上記のニトロセルロースフィ
ルターと該プローブを用いて前記Southernの方法でブロ
ッティングを行ったところ、プローブは、2.6kb〜2.9kb
ＤＮＡ断片が含まれる分画番号３の試料と強くハイブリ
ダイズした。

【００３９】次に、クローニング・ベクターpTR262〔Ro
berts, T. M. ら, Gene, 12, 123(1980)〕, 10μgに10
ユニットの制限酵素HindIIIを50μlの反応液〔10mM Tri
s−HCl(pH 7.5), ７mM MgCl₂, 60mM NaCl〕中で37℃,
２時間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノ
ールでＤＮＡを沈澱させた(HindIII 消化pTR262)。 Hind
III消化pTR262 0.1μgと分画番号３のＤＮＡ0.2μgとを
混合し、参考例１に記載の条件下でＴ4ＤＮＡリガーゼ
の作用によって結合させた。該反応液を用いて大腸菌DH
1〔Maniatis, T. ら, Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory, 254〜255(1982)〕を形質転換さ
せ、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体約1300個を
得た。この中からPGK遺伝子を含有する形質転換体を、
上述の³²Ｐ標識合成プローブを用いるコロニー・ハイブ
リダイゼーション〔Suggs, S. V. ら,Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 78, 6613(1981)〕によって選択した。オ
ートラジオグラフィーで強いシグナルが認められた形質
転換体から、前述のアルカリ抽出法によってプラスミド
pPKT3を単離し、HindIIIで分解したところ2.95kbＤＮＡ
のインサートが検出され、Southernの方法で調べると該
インサートは該プローブとハイブリすることが確認され
た。

【００４０】 PGKプロモーター断片の単離 プラスミドpPKT3ＤＮＡ 50μgに50ユニットの制限酵素H
indIIIを100μl の反応液〔10mM Tris−HCl(pH 7.5),
７mM MgCl₂, 60mM NaCl〕中で37℃, ２時間作用させた
後、１％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記
載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、2.95kbＤＮＡ
断片を参考例１に記載の方法によってゲルから分取した
〔図１３参照〕。該2.95kbＤＮＡ断片５μgに５ユニッ
トの制限酵素SalＩを20μl の反応液〔10mM Tris−HCl
(pH 7.5), ７mM MgCl₂, 175mM NaCl, ７mM ２−メルカ
プトエタノール〕中で37℃, ３時間作用させた後、1.2
％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条
件下で電気泳動にかけた。泳動後、2.1kbＤＮＡ断片を
参考例１に記載の方法によつてゲルから分取した。該2.
1kbＤＮＡ断片0.5μgと、プラスミドpBR322のHindIII−
SalＩ消化によって得られた3.74kbＤＮＡ0.5μgとを混
合し、参考例１に記載の条件下でＴ4ＤＮＡリガーゼの
作用によって結合させた。該反応液を用いて大腸菌DH1
を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体から所
望するプラスミドpPKT101を取得した〔図１３参照〕。

【００４１】次に、PGK遺伝子の構造遺伝子領域を取り
除くために、まず該プラスミドpPKT101 ＤＮＡ 10μgに
10ユニットの制限酵素SalＩを30μl の反応液〔10mM Tr
is−HCl(pH 7.5), ７mM MgCl₂, 175mM NaCl, 0.2M EDT
A,７mM ２−メルカプトエタノール〕中で37℃, ３時間
作用させ、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮ
Ａを沈澱させた(SalＩ消化pPKT101)。つづいて、 SalＩ
消化pPKT101 １μgに１０ユニットのBAL31ヌクレアーゼ
を20μl の反応液〔20mM Tris−HCl(pH 8.1), 12mM CaC
l₂, 12mM MgCl₂, １mM EDTA〕中で室温, ５分間作用さ
せた後、直ちに１容量のフェノールを加えて反応を停止
させ、冷エタノールでＤＮＡを沈澱させた(BAL消化pPKT
101)。参考例１に記載されたリン酸化XhoIリンカー50ng
とBAL消化pPKT101 0.2μgを混合し、 参考例１に記載の
条件下でＴ4ＤＮＡリガーゼの作用によつて結合させ
た。その後、該反応液で大腸菌DH1を形質転換させ、ア
ンピシリン耐性を示す形質転換体の中から、 pPKT101のS
alＩサイトからプロモーター領域の方向へ0.69kbが除か
れたプラスミドpPKT567を得た。 Dideoxynucleotide法に
よってＤＮＡ塩基配列を調べたところ、pPKT567ではBAL
31の作用によってPGK構造遺伝子と５′−近傍領域−24
までが除かれたことが証明された〔図１３参照〕。

【００４２】 発現用ベクターの構築 大腸菌−酵母シャトル・ベクターpSH19 ５μgに６ユニ
ットの制限酵素SalＩを20μl の反応液〔10mM Tris−HC
l(pH 7.5), ７mM MgCl₂, 175mM NaCl, 0.2mM EDTA, ７m
M ２−メルカプトエタノール〕中で37℃, ２時間作用さ
せた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールで沈澱さ
せた。該ＤＮＡ １μgにＤＮＡポリメラーゼＩ ラージ
・フラグメントを参考例１に記載の条件下で作用させ、
SalＩの接着末端を平滑末端に変えた。該ＤＮＡ断片500
ngと参考例１に記載されたリン酸化XhoIリンカー50ngと
を混合し、参考例１に記載の条件下でＴ4ＤＮＡリガー
ゼの作用によって結合させた。該反応液で大腸菌DH1を
形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体の中か
ら、pSH19のSalＩ部位がXhoI部位に転換したプラスミド
pSH19−１を保持する形質転換体を得た〔図１３参
照〕。該プラスミドpSH19−１ＤＮＡ15μgに24ユニット
の制限酵素HindIIIを100μlの反応液〔10mM Tris−HCl
(pH 7.5), ７mM MgCl₂, 60mM NaCl〕中で37℃, 10分間
作用させた後、直ちに0.2M EDTAを10μl 添加し反応を
停止させた。反応液を、0.7％アガロース・スラブゲル
を用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけ、Hi
ndIIIで１箇所切断された8.3kbＤＮＡ断片を参考例１に
記載の方法でゲルから分取した。該8.3kbＤＮＡ断片３
μgに10ユニットの制限酵素XhoI〔宝酒造(株)製〕を30
μl の反応液〔10mM Tris−HCl(pH 7.5), ７mM MgCl₂,
100mM NaCl, ７mM ２−メルカプトエタノール〕中で37
℃, ２時間作用させた後、0.7％アガロース・スラブゲ
ルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動を行っ
た。泳動後、7.7kbＤＮＡ断片を参考例１に記載の方法
によってゲルから分取した〔図１３参照〕。

【００４３】参考例２のに記載のプラスミドpPKT567
ＤＮＡ10μgに、各10ユニットの制限酵素HindIIIとXhoI
とを50μl の反応液〔50mM Tris−HCl(pH 7.6), 50mM N
aCl,１mM ジチオスレイトール, 10mM MgCl₂〕中で37℃,
２時間作用させた後、1.2％アガロース・スラブゲルを
用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動を行い、1.40
kbＤＮＡ断片をゲルから分取した〔図１３参照〕。該1.
40kbＤＮＡ断片0.2μgと上述の7.7kbＤＮＡ断片0.5μg
とを混合し、参考例１に記載の条件下でＴ4ＤＮＡリガ
ーゼの作用によって結合させた。該反応液で大腸菌DH1
を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体の中か
ら、所望するプラスミドpPKT700を保持する形質転換体
を取得した。次に、参考例１に記載した方法に従って、
該プラスミドpPKT700のXhoI部位がSalＩ部位に変換され
たプラスミドpPKT700−１を作製した〔図１３参照〕。

【００４４】参考例３ 酵母グリセルアルデヒド３−リ
ン酸脱水素酵素・プロモーター(GLD−P)を含有する発現
用ベクターの作製 グリセルアルデヒド ３−リン酸脱水素酵素遺伝子
(GLD)のクローニング GLDのうちのpgap491〔Holland, J. P. ら, J. Biol. Ch
em, 258, 5291(1983)〕のＮ末端側からの５個のアミノ
酸をコードするオリゴヌクレオチドに相補な５′−AGCA
ACTCTAACCAT−３′を前述のCrea, R. らの方法によって
合成し、参考例２のに記載の方法に従って³²Ｐで標識
し、プローブとして用いた。参考例２のに記載したニ
トロセルロースフィルターと該プローブを用いてSouthe
rnブロッティングを行ったところ、プローブは2.0〜2.3
kbＤＮＡ断片が含まれる分画番号７の試料と強くハイブ
リダイズした。参考例２のに記載されたHindIII消化p
TR262 0.1μgと分画番号７のＤＮＡ0.2μgとを混合し、
参考例１に記載の条件下でＴ4ＤＮＡリガーゼの作用に
よって結合させた。該反応液を用いて、参考例２のに
記載した方法で大腸菌DH1を形質転換させ、テトラサイ
クリン耐性形質転換体約1200個を取得し、コロニー・ハ
イブリダイゼーションによって³²Ｐ標識プローブと強く
ハイブリする形質転換体を分離した。この形質転換体か
ら前述のアルカリ抽出法によってプラスミドpGLD9を単
離し、HindIIIで分解したところ、2.2kbインサートＤＮ
Ａが検出され、Southernの方法で調べると、このインサ
ートＤＮＡは該プローブとハイブリすることが確認され
た〔図１４参照〕。

【００４５】 ＧＬＤプロモーター断片の単離 プラスミドpGLD9ＤＮＡ 100μgに50ユニットの制限酵素
HindIIIを200μl の反応液〔10mM Tris−HCl(pH 7.5),
７mM MgCl₂, 60mM NaCl〕中で37℃, ３時間作用させた
後、1.0％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に
記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、2.2kbＤＮ
Ａ断片を参考例１に記載の方法によってゲルから分取し
た。該2.2kbＤＮＡ断片10μgに10ユニットの制限酵素Hi
nfI〔宝酒造(株)製〕を50μl の反応液〔10mM Tris−HC
l(pH 7.5), ７mM MgCl₂, 100mMNaCl, ７mM ２−メルカ
プトエタノール〕中で37℃, ２時間作用させた後、ＧＬ
Ｄ用プローブを用いてSouthernの方法によってハイブリ
ダイゼーションを行ったところ、 該プローブは0.5kbＤ
ＮＡ断片と結合した〔図１４参照〕。

【００４６】該0.5kbＤＮＡ断片５μgに、各10ユニット
の制限酵素HhaI〔宝酒造(株)製〕とTaqI(New England B
iolabs 社製)とを３０μl の反応液〔１０mＭ Ｔris−
ＨＣl(pＨ７.５), ５０mＭ ＮaＣl, １０ mＭ ＭgＣl₂,
１mＭ ジチオスレイト−ル〕中で３７℃, ３時間作用
させた後、１.5％アガロース・スラブゲルを用いて参考
例１に記載された条件下で電気泳動にかけた。泳動後、
0.36kbＤＮＡ断片を参考例1に記載の方法によってゲル
から分取した〔図１４参照〕。該0.36kbＤＮＡ断片１μ
gにＤＮＡポリメラーゼＩ ラージ・フラグメントを参
考例１に記載の条件下で作用させ、TaqIの接着末端を平
滑末端に変えた。次に、この断片１μgと参考例１に記
載されたリン酸化XhoIリンカー50ngとを混合し、参考例
１に記載の条件下でＴ4ＤＮＡリガーゼを作用させて結
合させた。反応後、過剰量のXhoIを加え37℃, ４時間作
用させ、次に参考例２のに記載した条件下でセフアロ
ーズ４Ｂ・カラムを用いてリンカーの結合した0.36kbＤ
ＮＡ断片を分離した。

【００４７】一方、上述の2.2kbＤＮＡ10μgにＤＮＡポ
リメラーゼＩ ラージ・フラグメントを参考例１に記載
の条件下で作用させ、接着末端を平滑末端に変えた後、
参考例１に記載された条件下でリン酸化されたBamHIリ
ンカー〔５′−Ｐ−d(CGCGGATCCGCG)〕(New England Bi
oLabs社製)50ngを参考例１に記載の条件下でＴ4ＤＮＡ
リガーゼの作用により結合させた。反応後、20ユニット
のBamHIを加えて、37℃,３時間作用させ、次に参考例２
のに記載した条件下でセフアローズ４Ｂ・カラムを用
いてリンカーの結合した2.2kbＤＮＡ断片を分離した。
該ＤＮＡ断片６μgに２ユニットの制限酵素HhaIを50μl
の反応液〔10mM Tris−HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 10mM
MgCl₂, １mM ジチオスレイトール〕中で37℃, ２時間
作用させた後、1.0％アガロース・スラブゲルを用いて
参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、
0.75kbＤＮＡ断片を参考例１に記載の方法によってゲル
から分取した〔図１４参照〕。

【００４８】 発現用ベクターの構築 参考例２のに記載のプラスミドpSH19−１ ＤＮＡ10μ
gに各10ユニットの制限酵素BamHIとXhoIとを50μl の反
応液〔10mM Tris−HCl(pH 7.5), ７mM MgCl₂,100mM NaC
l, ７mM ２−メルカプトエタノール〕中で37℃, ２時間
作用させた後、1.0％アガロース・スラブゲルを用いて
参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、
8.0kbのＤＮＡ断片を参考例１に記載の方法によってゲ
ルから分取した。該8.0kbＤＮＡ断片500ng, 参考例３の
に記載の0.36kbＤＮＡ断片200ngおよび0.75kbＤＮＡ
断片200ngとを混合し、参考例１に記載の条件下でＴ4Ｄ
ＮＡリガーゼの作用により結合させた。該反応液を用い
て大腸菌DH1を形質転換させ、アンピシリン耐性形質転
換体の中から３種のＤＮＡ断片が結合したプラスミドpG
LD906を保持する形質転換体を分離した。次に、参考例
１に記載した方法に従って、該プラスミドpGLD906のXho
I部位がSalＩ部位に変換されたプラスミドpGLD906−１
を作製した〔図１４参照〕。

【００４９】参考例４ adr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗
原Ｐ31遺伝子を発現する組み換えＤＮＡ分子の構築およ
び該ＤＮＡ分子による大腸菌の形質転換 特開昭59−74985号公報およびNucleic Acids Res. 11,
1747(1983)に記載されているプラスミドpBR322−BamHI/
HBr330ＤＮＡ(pHBr330とも略す)は、特開昭58−201796
号公報に記載されている参考例１の方法によって調製し
た。該プラスミドpHBr330 50μgに各20ユニットの制限
酵素EcoRI〔宝酒造(株)製〕とBamHIとを100μl の反応
液〔100mM Tris−HCl(pH 7.5), ７mM MgCl₂, 50mM NaC
l, ７mM ２−メルカプトエタノール〕中で37℃, ３時間
反応させた後、1.0％アガロース・スラブゲルを用いて
参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、
1.4kbＤＮＡ断片を参考例１に記載の方法によってゲル
から分取した〔図１５参照〕。２μgのプラスミドpBR32
2ＤＮＡに各２ユニットの制限酵素BamHIとClaI(New Eng
land BioLabs社製)とを20μl の反応液〔10mM Tris−HC
l(pH 8.0), ７mM MgCl₂, 100mM NaCl, ２mM ２−メルカ
プトエタノール〕中で37℃，２時間反応させた後、0.8
％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条
件下で電気泳動にかけた。泳動後、4.01kbＤＮＡ断片を
参考例１に記載の方法によってゲルから分取した。

【００５０】500ngの前記4.01kbＤＮＡ断片, 500ngの前
記1.4kbＤＮＡ断片および参考例１で記載の方法によっ
て５′末端がリン酸化された合成アダプター d

【化２】 リガーゼの作用によって結合させた。なお、上記アダプ
ターはトリエステル法〔Crea, R. ら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 75, 5765(1978)〕を用いて化学合成され
た。この反応液を用いて大腸菌294株を形質転換させ、
アンピシリン耐性の形質転換体から前記３種のＤＮＡが
結合したプラスミドpHBrＰ31ＤＮＡが得られた〔図１５
参照〕。

【００５１】１μgのプラスミドpHBrＰ31ＤＮＡに２ユ
ニットの制限酵素BamHIを20μl の反応液〔10mM Tris−
HCl(pH 8.0), ７mM MgCl₂, 100mM NaCl, ２mM ２−メル
カプトエタノール〕中で37℃, ２時間作用させた後、フ
ェノールで除蛋白し、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈
澱させた(BamHI消化pHBrＰ31)。500ngのBamHI消化pHBr
Ｐ31にＤＮＡポリメラーゼＩ ラージ・フラグメント
を、参考例１に記載の条件下で作用させて、接着末端を
平滑末端にした後、フェノールで除蛋白し、冷エタノー
ルでＤＮＡを沈澱させた。該ＤＮＡ断片300ngと、参考
例１に記載の方法で５′末端がリン酸化されたPstIリン
カー〔５′−Ｐ−d(GCTGCAGC)〕(New England BioLabs
社製)50ngとを参考例１に記載の条件下でＴ4ＤＮＡリガ
ーゼの作用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌
294株を形質転換させ、形質転換体を参考例１に記載の
方法によって調べ、プラスミドpHBrＰ31のBamHI部位がP
stI部位に変換したプラスミドpHBrＰ31−17を分離した
〔図１５参照〕。

【００５２】該pHBrＰ31−17 50μgに各20ユニットの制
限酵素ClaIとPstI〔宝酒造(株)製〕とを100μl の反応
液〔20mM Tris−HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 50mM (NH₄)
₂SO₄〕中で37℃, ３時間作用させた後、反応液を1.0％
アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件
下で電気泳動にかけた。泳動後、1.42kbＤＮＡ断片を参
考例１に記載の方法でゲルから分取した。特開昭58−20
1796号公報およびNucleic Acids Res., 11, 3581(1983)
に記載の発現用ベクターpTRP771 50μgに制限酵素ClaI
とPstIとを前記100μl の反応液中で同一条件下で反応
させた後、反応液を1.0％アガロース・スラブゲルを用
いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動
後、3.3kbＤＮＡ断片を参考例１に記載の方法でゲルか
ら分取した。200ngの該1.42kbＤＮＡ(Ｐ31をコードする
ＤＮＡ)と500ngの3.3kbＤＮＡとを参考例１に記載の条
件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用によって結合させた。
該反応液を用いて大腸菌294株を形質転換させ、参考例
１の方法に従って該Ｐ31をコードするＤＮＡが発現用ベ
クターに挿入されたプラスミドpTRP Ｐ31−Rを保持する
大腸菌株(294/pTRP Ｐ31−R)を分離した〔図１５参
照〕。また、プラスミドpTRPＰ31−Rを用いて、大腸菌Ｃ
600を形質転換し、大腸菌Ｃ600/pTRPＰ31−Rを得た。

【００５３】参考例５ adr型Ｂ型肝炎ウイルスの表面
抗原Ｐ31遺伝子を発現する酵母用組み換えＤＮＡ分子の
構築および該ＤＮＡ分子による酵母の形質転換 参考例４に記載されたプラスミドpHBrＰ31ＤＮＡ,
50μgに各20ユニットの制限酵素ClaIとBamHIとを100μl
の反応液〔100mM Tris−HCl(pH 8.0), ７mM MgCl₂, 10
0mM NaCl, ２mM ２−メルカプトエタノール〕中で37℃,
３時間作用させた後、反応液を1.0％アガロース・スラ
ブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にか
けた。泳動後、1.42kbＤＮＡ断片を参考例１に記載の方
法でゲルから分取した。２μgの該1.42kbＤＮＡ断片に
ＤＮＡポリメラーゼＩ ラージ・フラグメントを参考例
１に記載の条件下で作用させて接着末端を平滑末端にし
た後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを
沈澱させた。該ＤＮＡ1.5μgと参考例１に記載のリン酸
化SalIリンカー, 50ngとを参考例１に記載の条件下でＴ
４ＤＮＡリガーゼの作用により結合させた。該反応液に
10ユニットの制限酵素SalIを添加し、37℃, ３時間作用
させて接着末端を生成させた。反応後、フェノールで除
蛋白し、試料を参考例２のに記載された条件下でセフ
ァローズ４Ｂ・カラムにかけ、void volume付近に溶出
されてくる1.43kbＤＮＡ断片(adr型Ｐ31をコードするＤ
ＮＡ)を含む画分を集め、冷エタノールで該ＤＮＡを沈
澱させた〔図１６参照〕。

【００５４】１μgの参考例１に記載された発現用ベク
ターpPHO17−１ＤＮＡに２ユニットの制限酵素SalIを20
μl の反応液〔６mM Tris−HCl(pH 7.5), ６mM MgCl₂,
150mM NaCl, ６mM ２−メルカプトエタノール〕中で37
℃, ２時間作用させ、次に0.1ユニットのアルカリ性ホ
スファターゼを添加して65℃, 30分間反応を続けた。反
応後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールを加えてＤ
ＮＡを沈澱させた(SalI消化pPHO17−１)。次に、200ng
の前記1.43kbＤＮＡ断片と200ngのSalI消化pPHO17−１
とを、参考例１に記載の条件下でＴ4ＤＮＡリガーゼの
作用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌294株
を形質転換させ、形質転換体を参考例１に記載された方
法によって調べ、adr型Ｐ31をコードするＤＮＡを含む
1.43kbＤＮＡ断片がPHO ５プロモーターと順方向に挿入
されたプラスミドpPHO Ｐ31−Rを保持する菌株(Escheri
chia coli 294/pPHO Ｐ31−R)を分離した。この形質転
換体よりアルカリ抽出法によって分離された該プラスミ
ドpPHO Ｐ31−Rを用いて酵母宿主Saccharomyces cerevi
siae AH22R^-を前述のHinnenらの方法で形質転換させ、
該プラスミドを保持する酵母形質転換体(AH22R^-/pPHO
Ｐ31−R)を分離した〔図１６参照〕。

【００５５】参考例６ ＧＬＤプロモーターを持つ外来
遺伝子発現ベクターを用いたＰ25遺伝子発現プラスミド
の構築 特願昭５９−１９３７６５号(昭和５９年９月１３日付
提出)〔特開昭６１−７０９８９号公報〕に添付の実施
例に記載のプラスミドpPHO17-58 ５μgを10ユニットの
制限酵素XhoIで消化した後、サブタイプadw型のＰ25遺
伝子を含む0.82kbのＤＮＡ断片を参考例１に記載のアガ
ロース・スラブゲル電気泳動法で分取した。該ＤＮＡ0.
5μgと参考例３で記載の外来遺伝子発現プラスミドpGLD
906-1をXhoIで消化したＤＮＡ0.1μgを混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させた後、大腸菌ＤＨ１を形
質転換させ、アンピシリン耐性を示す組換え体を得た。
該組換え体の中から、Ｐ25遺伝子がＧＬＤプロモーター
と順方向に挿入されたプラスミドpGLDＰ25−Wを得た
〔図２１〕。

【００５６】実施例１ adr型Ｐ31遺伝子の48番目のア
ルギニンコドンが欠失した修飾Ｐ31遺伝子の作製 プラスミドpTRPＰ31−R 1.0μgに２ユニットの制限酵素
XhoI(ニッポンジーン社製)を15μl の反応液〔50mM Tri
s-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM ジチオ
スレイトール〕中で37℃, ２時間作用させた後、フェノ
ールで除蛋白し、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱さ
せた。該ＤＮＡに2.5ユニットのＳ₁ヌクレアーゼ〔Beth
esda Research Laboratories社製〕を20μl の反応液
〔３０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．６），
５０ｍＭ ＮａＣｌ， １mM ZnSO₄, ５％グリセロー
ル〕中で室温、30秒間作用させ、直ちにフェノールで除
蛋白し、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させた。該
ＤＮＡと50ngの５′末端がリン酸化されたBamHIリンカ
ー〔５′−P−d(CCGGATCCGG)〕(Bethesda Research Lab
oratories社製)とを混合し、20μl の反応液〔66mM Tri
s-HCl(pH 7.6), 6.6mM MgCl₂, 10mM ジチオスレイトー
ル, １mM ＡＴＰ, ２ユニットのＤＮＡリガーゼ(New En
gland Biolabs社製)〕中、14℃で一夜作用させてＤＮＡ
を結合させた。該反応液に10ユニットのBamHI〔ニッポ
ンジーン社製〕を加え、37℃, ２時間作用させた後、該
反応液を0.8％アガロース・スラブゲルを用いて緩衝液
〔100mM Tris-HCl, 100mM ホウ酸, ２mM EDTA(pH 8.
3)〕中、140V, ２時間電気泳動にかけた。泳動後、BamH
Iリンカーが付加した3.1kbおよび1.6kbＤＮＡ断片を含
むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動用緩衝液内に
沈め、ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出した〔McDone
ll, M. W. ら, J. Mol. Biol., 110 119(1977)〕。透析
チューブ内液をフェノール抽出さらにエーテル抽出した
後、NaClを0.2M になるように加え、つづいて２倍量の
冷エタノールを加えて該ＤＮＡ断片を沈澱させた。該Ｄ
ＮＡ断片を環状ＤＮＡにするため、前記条件下Ｔ4ＤＮ
Ａリガーゼを作用させた。該反応液に５ユニットの制限
酵素XhoIを加え、37℃, ２時間作用させた後、該反応液
を用いて大腸菌ＤＨ１〔Maniatis, T. ら, Molecular C
loning, Cold Spring Harbor Laboratory, 254〜255(19
82)〕を形質転換させ、テトラサイクリン耐性を示す組
換え体を得た。該組換え体の中からXhoI部位がBamHI部
位に変換し、adr型Ｐ31遺伝子の48番目のアルギニンコ
ドンが欠失したプラスミドpTRPＰ31−Raを得た。該プラ
スミドの変異部分の配列を〔図３〕に示す。

【００５７】制限酵素XhoIで消化したプラスミドpTRPＰ
31−R 1.0μgに５ユニットのエキソヌクレアーゼBal 31
(Bethesda Research Laboratories社製)を20μl の反応
液〔20mM Tris-HCl(pH 8.1), 12mM CaCl₂, 12mM MgCl₂,
１mM EDTA〕中で室温, ３秒間作用させ、直ちにフェノ
ールで除蛋白し、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱さ
せた。該ＤＮＡを環状ＤＮＡにするため、前記条件下Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを作用させた。つぎに制限酵素XhoIを
作用させた後、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ１を形質転
換させ、テトラサイクリン耐性を示す組換え体を得た。
該組換え体の中から、Ｐ31遺伝子の読み枠(フレーム)が
正しく保たれているものを選び出すため、コロニーイム
ノアッセイ〔David J. K. ら, Methods in Enzymology,
79, 622〜630(1981)〕で抗HBsAg抗体と反応するクロー
ンを選択した。その結果、当該クローンとして、pTRPＰ
31−RbとpTRPＰ31−Rcを得た。該プラスミドの変異部分
の配列を、Ｍ13ダイデオキシ法〔善岡克次ら, 細胞工
学, １, 79〜87(1982)〕で解析した結果を〔図４〕に示
す。

【００５８】実施例２ 修飾Ｐ31遺伝子の大腸菌におけ
る発現 実施例１で記載のpTRPＰ31−Ra, pTRPＰ31−RbおよびpT
RPＰ31−Rcを用いて、大腸菌294株およびＣ600株を形質
転換させ、294/pTRPＰ31−Ra, 294/pTRPＰ31−Rb, 294/
pTRPＰ31−Rc, Ｃ600/pTRPＰ31−Ra, Ｃ600/pTRPＰ31−
Rb, Ｃ600/pTRPＰ31−Rc を得た。各形質転換体を、2.0
％グルコース, 1.0％カザミノ酸を含むＭ−9培地で、37
℃, ８時間培養した後、菌体を集め、緩衝液〔30mM Tri
s-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl, 5mM EDTA〕で洗浄した。菌
体を10mM Tris-HCl(pH 8.0), ５mM EDTA, １mMフェニル
メチルスルホニルフルオライド, ５mg/mlリゾチームか
らなる溶菌液に懸濁し溶菌した。 該溶菌液に最終濃度７
Ｍになるように塩酸グアニジンを添加し、37℃で２時間
インキュベーションした。溶菌液を室温で15,000rpm, 1
5分間遠心分離にかけて上澄液を得た。この上澄液の一
定量を臭化シアンで活性化したろ紙片にスポットした。
このろ紙片を５％グリシン溶液〔５％グリシン, 50mM T
ris-HCl(pH 8.0), 0.5M NaCl, 0.1％ Triton X-100〕に
16時間浸した後、洗浄溶液〔50mM Tris-HCl(pH 8.0),
0.5M NaCl, 0.1％Triton X-100, 0.2％BovineSerumAlbu
min〕で十分に洗った。該ろ紙片を¹²⁵Ｉ−抗HBsAgモノ
クローナル抗体(10⁶cpm/ml)と３時間反応させた後、洗
浄溶液で十分に洗った。風乾後、このろ紙片の放射能を
γ線カウンターで測定することにより、抗原量を算出し
た。その結果を〔表１〕に示すが、生成量はブロス１リ
ットルあたりとして計算された。なお、アッセイの標準
品としては、HBsAgＰ31精製標品を用いた。

【表１】 ───────────────────────── 形質転換体 HBsAg (mg/lブロス) ───────────────────────── Escherichia coli 294/pTRPＰ31-Ra 1.5 Escherichia coli 294/pTRPＰ31-Rb 1.8 Escherichia coli 294/pTRPＰ31-Rc 2.0 Escherichia coli Ｃ600/pTRPＰ31-Ra 2.3 Escherichia coli Ｃ600/pTRPＰ31-Rb 2.6 Escherichia coli Ｃ600/pTRPＰ31-Rc 2.4 ─────────────────────────

【００５９】実施例３ PHO−５プロモーターを持つ外
来遺伝子発現ベクターを用いた修飾Ｐ31遺伝子発現プラ
スミドの構築と、該プラスミドによる酵母の形質転換 プラスミドpPHOＰ31−R, ５μgに10ユニットの制限酵素
SalI(ニッポンジーン社製)を30μl の反応液〔50mM Tri
s-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM ジチオ
スレイトール〕中で37℃, ２時間作用させた後、Ｐ31遺
伝子を含む1.42kbＤＮＡ断片を、前記条件下、アガロー
ス・スラブゲルで分離し、ゲルから該ＤＮＡを回収し
た。該ＤＮＡ0.5μgと制限酵素SalIで消化したpBR322,
0.1μgを混合し、Ｔ4ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
た後、大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、アンピシリン耐性
を示す組換え体を得た。該組換え体の中からpBR322のSa
lI部位に、adr型Ｐ31遺伝子を含む1.42kbＤＮＡ断片が
組み込まれたプラスミドpBR-Sal-6を得た〔図５〕。

【００６０】pBR-Sal-6, 20μgに10ユニットの制限酵素
EcoRI(ニッポンジーン社製)を50μlの反応液〔50mM Tr
is-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM ジチ
オスレイトール〕中で、37℃, 10分間作用 (部分分解)
させた後、該プラスミド中に２箇所存在するEcoRI部位
のうち１箇所だけが切断された5.78kbＤＮＡ断片を前記
条件下、アガロース・スラブゲルで分離し、該ＤＮＡ断
片を回収した〔図５〕。該5.78kbＤＮＡ ２μgに４ユニ
ットの制限酵素XbaI(ニッポンジーン社製)を20μl の反
応液〔50mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 10mM MgCl
₂, １mM ジチオスレイトール〕中、37℃, ２時間作用さ
せ、該反応液をアガロース・スラブゲル電気泳動にか
け、5.53kbＤＮＡを分取した〔図５〕。pTRPＰ31-Ra ５
μgを10ユニットのEcoRI, 10ユニットのXbaIで消化し、
５％ポリアクリルアミド・スラブゲルを用いて、緩衝液
〔100mM Tris-HCl, 100mM ホウ酸, ２mM EDTA(pH 8.
3)〕中、150V, １時間電気泳動にかけた。泳動後、0.25
kbＤＮＡ断片を回収した。また、pTRPＰ31-Rb, pTRPＰ3
1-Rcについても同様の操作を行い、それぞれの0.25kbＤ
ＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡ断片0.05μgに前記5.53k
bＤＮＡ0.1μgを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合させた後、大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、アンピシ
リン耐性を示す組換え体を得た。該組換え体の中からpT
RPＰ31-Ra由来の0.25kbＤＮＡ断片が組み込まれたプラ
スミドpBR-Sal-6a, pTRPＰ31-Rb由来の0.25kbＤＮＡ断
片が組み込まれたプラスミドpBR-Sal-6b，およびpTRPＰ
31-Rc由来の0.25kbＤＮＡ断片が組み込まれたプラスミ
ドpBR-Sal-6cを得た〔図５〕。

【００６１】pBR-Sal-6a ５μgに10ユニットの制限酵素
SalIを作用させた後、改良Ｐ31遺伝子を含む1.42kbＤＮ
Ａ断片を前記条件下、アガロース・スラブゲルで分断
し、ゲルから該ＤＮＡを回収した。該ＤＮＡ0.2μgとプ
ラスミドpPHO17-1をSalIで消化したＤＮＡ0.1μgを混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた後、大腸菌
ＤＨ１を形質転換させ、アンピシリン耐性を示す組換え
体を得た。該組換え体の中から修飾Ｐ31遺伝子が、PHO
−５プロモーターと順方向に挿入されたプラスミドpPHO
Ｐ31-Raを得た。同様の方法でpBR-Sal-6bからSalI消化
で得られる1.42kbＤＮＡ断片がpPHO17-1に順方向に挿入
されたプラスミドpPHOＰ31-Rbと、pBR-Sal-6cからSalI
消化で得られる1.42kbＤＮＡ断片がpPHO17-1に順方向に
挿入されたプラスミドpPHOＰ31-Rcを得た〔図５〕。 pPHOＰ31-Ra, pPHOＰ31-RbおよびpPHOＰ31-Rcを用い
て、それぞれ酵母宿主サッカロミセス・セレビシェAH22
R^-を形質転換し、 形質転換体(AH22R^-/pPHOＰ31−Ra, AH
22R^-/pPHOＰ31−Rb, およびAH22R^-/pPHOＰ31-Rc)を取得
した。

【００６２】実施例４ ＧＬＤプロモーターを持つ外来
遺伝子発現ベクターを用いた修飾Ｐ31遺伝子発現プラス
ミドの構築と、該プラスミドによる酵母の形質転換 プラスミドpGLD906-1をSalIで消化したＤＮＡ0.1μg
と、実施例３で記載したpBR-Sal-6a由来の1.42kbＤＮＡ
断片0.2μgを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
させた後、大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、アンピシリン
耐性を示す組換え体を得た。該組換え体の中から、修飾
Ｐ31遺伝子がＧＬＤプロモーターと順方向に挿入された
プラスミドpGLDＰ31-Raを得た。同様の方法で実施例３
で記載のpBR-Sal-6b由来の1.42kbＤＮＡ断片がpGLD906-
1に順方向に挿入されたプラスミドpGLDＰ31-Rbと、同じ
く実施例３で記載のpBR-Sal-6c由来の1.42kbＤＮＡ断片
がpGLD906-1に順方向に挿入されたプラスミドpGLDＰ31-
Rcを得た〔図６〕。pGLDＰ31-Ra, pGLDＰ31-Rb, および
pGLDＰ31-Rcを用いて、それぞれ酵母宿主サッカロミセ
ス・セレビシェAH22R^-を形質転換し、 形質転換体(AH22R
^-/pGLDＰ31-Ra, AH22R^-/pGLDＰ31-Rb, およびAH22R^-/pG
LDＰ31-Rc)を取得した。

【００６３】実施例５ 修飾Ｐ31遺伝子の酵母における
発現 実施例３および４で得られた修飾Ｐ31遺伝子発現プラス
ミドを含む各酵母形質転換体を、Burkholderおよびその
低リン酸培地で、30℃, ２日間培養した後、菌体を集
め、生理食塩水で洗浄した〔図７〕。Miyanohara, A.
ら〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1(1983)〕の方
法に従って菌体をZymolyase〔生化学工業(株)製〕によ
ってスフェロプラストにした後、スフェロプラストに0.
1％トリトンＸ−100を添加して修飾Ｐ31を抽出した。溶
菌液を室温で15,000rpm, 15分間遠心分離にかけて上澄
液を得た。 この上澄液のＰ31活性をオースザイムII〔ア
ボット(株)製〕を用いて測定した。その結果を〔表２〕
に示すが、Ｐ31の生成量はブロス１リットルあたりとし
て計算された。

【表２】 ────────────────────────────── 酵母形質転換体 修飾Ｐ31(μg/lブロス) ────────────────────────────── Saccharomyces cerevisiae AH22R^-/pPHOＰ31-Ra 259 〃 〃 AH22R^-/pPHOＰ31-Rb 548 〃 〃 AH22R^-/pPHOＰ31-Rc 1391 〃 〃 AH22R^-/pGLDＰ31-Ra 950 〃 〃 AH22R^-/pGLDＰ31-Rb 950 〃 〃 AH22R^-/pGLDＰ31-Rc 1402 ──────────────────────────────

【００６４】実施例６ Ｐ31修飾蛋白質粒子の製造 実施例３で作製した酵母組み換え体AH22R^-/pPHOＰ31-Rb
を５％のグルコースを含むBurkholderの低リン酸培地
で、30℃, ２日間培養した後、菌体を集め0.85％NaClで
洗浄した。湿菌体20gを、８mgのザイモリエース60000を
含む10mMリン酸カリウム緩衝液(ＫＰＢ)pH 7.4, 10mM E
DTA-１mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)
14mM ２−メルカプトエタノール, 80mlに懸濁し室温で
３時間インキュベーションし、溶菌した。該溶菌液を５
℃で8000rpm, 10分間遠心分離にかけて細胞膜および壁
片を含む沈澱物を得た。この沈澱物を80mlの10mMＫＰＢ
(pH7.4)-10mM EDTA-１mM PMSFに懸濁したのち、５℃で8
000rpm, 10分間遠心分離にかけて残渣を得た。該沈澱物
を再び10mM ＫＰＢ(pH 7.4)-10mM EDTA-１mM PMSFに懸
濁し、遠心分離によって沈澱物を得た。細胞膜および壁
片から成る該沈澱物を、80mlの10mM ＫＰＢ(pH 7.4)-10
mM EDTA-１mM PMSF-0.1％Triton X−100に懸濁して５℃
で２時間撹拌することによってＰ31修飾蛋白質を抽出し
た。該懸濁液を５℃で8000rpm, 10分間遠心分離にかけ
て上澄液を得た。この抽出液中におけるＰ31修飾蛋白質
の含量は約５〜10％であった。

【００６５】該抽出液80mlを、10mM ＫＰＢ(pH 7.4)-10
mM EDTAで平衡にしたDEAE-トヨパール(東洋曹達工業製)
カラム(1.2×6.5cm)にかけた後、0.1M NaClを含む10mM
ＫＰＢ(pH 7.4)-10mM EDTAでカラムを十分洗浄した。Ｐ
31修飾蛋白質を、NaCl濃度を漸進的に上昇させることに
よって溶出させた。得られた修飾Ｐ31溶出画分を限外ろ
過膜を用いて濃縮した後、該濃縮液を、0.1MＫＰＢ(pH
7.4)-0.1M NaCl-10mM EDTAで平衡にしたセファクリール
S−300(ファルマシア社製)カラム(1.7×77cm)を用いて
ゲルろ過に付した。void volumeに溶出されてきたＰ31
修飾蛋白質を、Beckman SW41用遠心チューブ中に作製さ
れた５〜40％のCsClグラジエントに重層し、５℃で40,0
00rpm, 16時間遠心にかけた。修飾Ｐ31画分を、10mM Ｋ
ＰＢ(pH 7.4)-10mM EDTAに透析した後、標品を上述のSW
41用遠心チューブ中に作製された５〜30％の蔗糖グラジ
エントに重層し、５℃で38,000rpm, ６時間遠心にかけ
た。遠心後、Ｐ31修飾蛋白質の画分を集めて、該標品を
還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけたところ、分子量37kダルトンの主バンドを示し
た。

【００６６】実施例７ プラスミドpTB553及びpTB555の
構築 pTRPＰ31-R及びpTRPＰ31-RbのＤＮＡ各々10μgに100ユ
ニットのEcoRIメチラーゼ(ニューイングランドバイオラ
ボ社製)を50μl の反応液〔50mM Tris-HCl(pH 7.5), １
mM EDTA, ５mM DTT, 50μM Ｓ−アデノシル−メチオニ
ン〕中で37℃, １時間作用させた。EcoRIメチラーゼを6
5℃ ５分間の熱処理によって失活させたのち、エタノー
ル沈澱によりＤＮＡを回収した。このプラスミドに30ユ
ニットの制限酵素ClaIとPstIを80μl の反応液〔10mM T
ris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, １mM DTT, 50mM NaCl〕
中で37℃, １時間作用させた後、アガローススラブゲル
電気泳動で分離し、Ｐ31遺伝子および修飾Ｐ31遺伝子を
含む1.4kbＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ２μgに４ユニ
ットのＴ4−ＤＮＡポリメラーゼ(ＰＬ社製)を30μlの反
応液〔33mM Tris-acetate(pH 7.9), 66mM K-acetate, 1
0mM Mg-acetate, 100μg/ml BSA, 0.5mM DTT, 0.2mM dN
TP〕と37℃, ５分間作用させた。0.2M EDTA(pH 7)を４
μl 加えて、反応を停止させフェノール−クロロホルム
(１:１)で抽出後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収
した。これら末端を平滑化したＤＮＡ断片２μgを15μl
のライゲーション緩衝液〔66mM Tris-HCl(pH 7.6), 6.
6mM MgCl₂, 10mM DTT, 66μM ATP〕に溶解し、 ５′末端
をリン酸化した0.2μgのEcoRIリンカー〔５′−Ｐ−d(G
GAATTCC)〕と、 ２ユニットのＴ4ＤＮＡリガーゼとを混
合し、14℃で17時間反応させた。リガーゼを65℃ 10分
間の熱処理によって失活させたのち、５倍量の蒸留水を
加えて、さらに制限酵素EcoRIの反応液〔50mM Tris-HCl
(pH 8), 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM メルカプトエ
タノール, 100μg/mlBSA〕中30ユニットのEcoRIで３時
間処理した。セファロース４Ｂカラム(0.5cm直径, 15cm
長さ)でリンカー部分と、リンカーを結合したＰ31ＤＮ
Ａを分離し、エタノール沈澱によりEcoRIリンカー結合
Ｐ31ＤＮＡを回収した。

【００６７】一方、特願昭60−133490号〔特開昭６１−
６３２８２号公報〕の明細書に記載のプラスミドpTB106
のＩＬ−２遺伝子領域の５′末端側のPstI切断部位及び
３′末端側のBamHI切断部位をEcoRIに変換し、ＩＬ−２
遺伝子領域を除去したpTB389を制限酵素EcoRIで切断
し、５′末端のリン酸基をアルカリ性ホスファターゼ処
理により除去した。EcoRIリンカー結合1.4kbＰ31ＤＮＡ
断片を、pTB389ＤＮＡEcoRI断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを作用させて、ＳＶ40プロモーターを含む動物
細胞形質転換用プラスミドpTB553(Ｐ31)及びpTB555(修
飾Ｐ31)を構築した。〔図８〕

【００６８】実施例８ プラスミドpTB556及びpTB558の
構築 特願昭60−133490号〔特開昭６１−６３２８２号公報〕
の明細書に記載のプラスミドpTB348のBamHI断片0.95kb
とプラスミドpTB399のBamHI断片3.8kbをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより結合したpTB491を制限酵素HindIIIとPstIで
切断し、1.1kbのDHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)ＤＮＡを
分離した。また、トリ肉腫ウイルス(ＡＳＶ)のＬＴＲが
クローニングされたλＹ73−11Ａ〔北村ら, ネイチャ
ー, 第297巻, 205−208頁(1982)〕のHindIII, SacI, 0.
9kbＤＮＡ断片をＳ１ヌクレアーゼで処理し、HindIIIリ
ンカーを結合させ、pTB106のHindIII切断部位に挿入
し、pTB308を構築した。さらにこのプラスミドのASVLTR
の上流のHindIII切断部位を欠失させた(pTB311)のち、
制限酵素XhoIとHindIIIで切断して、ＳＶ40のプロモー
ター領域を除いた(pTB313)のち、制限酵素BstXIで切断
して0.3kbの断片を除き、２連結のASVLTRを一連結にし
たpTB401を構築した。このプラスミドを制限酵素SalIと
PstIで切断し、0.8kbのASVLTRを含む断片を得た。上
記、DHFRＤＮＡを含む、1.1kbのHindIII, PstI断片と、
ASVLTRを含む0.8kbのSalI, PstI断片を、pTB553またはp
TB555を制限酵素HindIIIとSalIで切断した断片と混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させて、pTB556(Ｐ31)及
びpTB558(修飾Ｐ31)を構築した。〔図９〕，〔図１
０〕，〔図１１〕これらのプラスミドは、ＡＳＶのＬＴ
ＲをプロモーターとするＤＨＦＲ遺伝子とＳＶ40複製開
始領域をプロモーターとするＰ31遺伝子または修飾Ｐ31
遺伝子を同方向に連結した構造をしている。

【００６９】実施例９ 動物細胞の形質転換 ファルコンシャーレ(直径６cm)に10％牛胎児血清を含む
イーグルＭＥＭ培地を入れ、マウスＴＫ欠損Ｌ細胞を37
℃で一晩培養した。培養後、この細胞(７×10⁵個/ディ
ッシュ)に対して、プラスミドpTK61(ヘルペス シムプ
レックス ウイルス(ＨＳＶ)のＴＫ遺伝子を含む3.5kb
BamHI ＤＮＡ断片をpBR322にクローニングした組み換え
体を有する大腸菌株ＬＥ578〔ジーン, 第7巻, 第335〜3
42頁(1979); Dr. エンキストより分与〕よりプラスミド
を単離し、ＴＫ遺伝子を含む２kbPvuII断片〔プロシー
ジング・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンスUS
A,第78巻, 1441〜1445頁(1981)〕をpBR322にリクローニ
ングしたもの)0.2μgとそれぞれ10μgのpTB553, pTB555
ＤＮＡとをグラハムらの方法〔ビロロジー, 第52巻, 4
56〜467頁(1973)〕に従って混合, 接種した。４時間37
℃で培養後、新たな培地に替えて一夜培養し、翌日１０
％牛胎児血清を含むＨＡＴ培地(15μg/mlヒポキサンチ
ン, １μg/mlアミノプテリン, ５μg/mlチミジン, 0.25
μg/mlグリシンを含むＭＥＭ培地)に替えて、３７℃で
培養を続けた。３〜４日に一度培養液の交換を行って培
養を続けると、約２〜３週間後にＴＫ⁺となった細胞が
増殖してコロニーを形成した。プラスミドpTB556 及び
pTB558については、DHFR^- ＣＨＯ細胞〔ウルラウブら,
プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミーサイエ
ンスUSA, 第77巻, 4216〜4220頁(1980)〕を５％牛胎児
血清を含むハムＦ12培地にて培養し、シャーレあたり１
μgのプラスミドをグラハムらの方法(前出)に準じて遺
伝子感染した。２日後に、10％透析牛胎児血清及び35μ
g/mlプロリンを含むダルベッコ改変ＭＥＭ培地で液替を
行なって、以後この選択培地で培養を続けると約２〜３
週間後に、ＤＨＦＲ⁺となって増殖した細胞がコロニー
を形成した。

【００７０】実施例10 形質転換体のクローニング 実施例９で得た形質転換細胞のクローニングを、それぞ
れの細胞につき、公知の方法(例えばリミテッド ダイ
リューション法)に従っておこなった。クローニング終
了後は、Ｌ(ＴＫ⁺)細胞のクローンは10％牛胎児血清を
含むイーグルＭＥＭ培地, ＣＨＯ(ＤＨＦＲ⁺)細胞のク
ローンは、５％牛胎児血清及び35μg/mlのプロリンを含
むダルベッコ改変ＭＥＭ培地にて培養した。分離された
各クローンの細胞の培養上清中のHBsAg活性をオースリ
アII−125(ダイナボット社製)によって測定した。その
結果を〔表３〕に示す。

【表３】

【００７１】実施例11 修飾Ｐ31遺伝子産物のエンド−
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ処理 実施例６で記載のサッカロミセス・セレビシエAH22R^-/p
PHOＰ31-Rbの湿菌体0.1gを、0.5mlの7.5M尿素, 10mM Ｋ
ＰＢ(pH 7.4), 10mM EDTA, １mM PMSFに懸濁し、直径0.
45〜0.5mmのガラスビーズ１gを加え、ミキサー(大洋化
学, オートマチツクミキサー)で激しく振とうし菌体を
破壊した。該液を５℃で12,000rpm, 10分間遠心分離に
かけて、上澄液を得た。該上澄液0.2mlに等量の0.2M ２
−メルカプトエタノール, 0.4％ＳＤＳ, 100mM クエン
酸ナトリウム緩衝液(pH 5.5)を加え、95℃で５分間熱処
理を行い、抽出液中の蛋白分解酵素を欠活させた。該液
0.4mlに0.8mlの冷エタノールを加え、氷上で15分間放置
した後、５℃で12,000rpm, 10分間遠心分離にかけ、沈
澱物を得た。該沈澱物を0.2mlの50mM クエン酸緩衝液(p
H 5.5)に懸濁し、その0.1mlに、0.05ユニットのエンド
−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ(生化学工業)
を加え、37℃で２時間反応させた。該反応標品と未反応
標品を還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけ、蛋白質をニトロセルロース膜にトランス
ブロット装置(Bio-Rad社)を用いて写し取り、パーオキ
シダーゼで標識した抗HBsAg抗体(オースザイムII, アボ
ットラボラトリーズ)と、イミュン・ブロット アッセイ
キット(Bio-Rad社)を用いてHBsAgを検出した結果、反
応標品の方は、Ｐ31遺伝子産物が、34kダルトンに変化
していた。HBsAgに対するモノクローナル抗体を用いて
も同様の結果を得た。このことは、実施例６で記載の37
kダルトンの修飾Ｐ31遺伝子産物には糖鎖が付加してお
り、その糖鎖の一部は、エンド−β−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼＨで切断されることを示している。

【００７２】実施例12 adr型Ｐ31遺伝子の16番目と18
番目のアルギニン・コドンを、グルタミン・コドンに変
換した修飾Ｐ31遺伝子の作製 実施例３で記載のプラスミドpBR-Sal-6c, 10μgを20μl
の反応液〔50mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 10mM
MgCl₂, １mM ジチオスレイトール〕中、20ユニットのSa
lIと20ユニットのXbaIを加え、37℃, ２時間反応を行
い、反応液を５％ポリアクリルアミド・スラブゲル電気
泳動にかけた。泳動後0.25kbpのＤＮＡ断片を含むゲル
片を透析チューブ内に封入し、実施例１に記載の方法
で、0.25kbpＤＮＡ断片を回収した。ファージベクター
・Ｍ13mp11〔Messing, J., Methods in Enzymol., 101,
20(1983)〕の２本鎖ＤＮＡ0.2μgを20μl の反応液〔5
0mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM
ジチオスレイトール〕中、２ユニットのSalIと２ユニッ
トのXbaIで２時間反応を行い、該ＤＮＡをSalI部位とXb
aI部位で開環させた。該反応液に65℃, ５分間の熱処理
を加え、制限酵素を失活させた。該ＤＮＡ0.01μgに上
記の0.25kbpのＤＮＡ断片0.5μgを加え、10μlの反応液
中、Ｔ4ＤＮＡリガーゼの作用で両ＤＮＡを連結させた
後、Messing, J.の方法〔Methods in Enzymol., 101, 2
0(1983)〕で大腸菌JM103に導入し、プラーク(溶菌斑)を
作らせた。白色プラークの中からＭ13mp11に、上記0.25
kbpＤＮＡ断片がクローニングされたＭ13mp11-101を得
た。

【００７３】Ｍ13mp11−101のファージ粒子から、Messi
ng, J. の方法でファージＤＮＡ(１本鎖ＤＮＡ)を調製
した。該１本鎖ＤＮＡを用いて以下の方法でOligonucle
otide-directed Mutagenesis〔Smith, M., Gilliam,
S., Genetic Engineering, 3, 1(1981)〕を行った。Ｍ1
3mp11-101の１本鎖ＤＮＡ１μgにフォスフォトリエステ
ル法で化学合成し、さらにＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて５′末端をリン酸化したＤＮＡ, ５′−Ｐ−
d(AGGCCTTGCACTTGGGGATCTAG)から成るプライマー18ngを
加え、10μlの反応液〔10mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM Mg
Cl₂〕中、90℃,５分間の熱処理を行った後、室温で30分
間放置し、アニーリングを行った。該反応液に10μlの
反応液〔10mM Tris-HCl(pH7.5), １mM ＡＴＰ, 10mM Mg
Cl₂, １mMdＡＴＰ, １mM dＣＴＰ, １mM dＧＴＰ, １mM
dＴＴＰ, 10mM ＤＴＴ, ２ユニットＤＮＡポリメラー
ゼＩ・ラージフラグメント〔宝酒造(株)製〕, 0.5ユニ
ットＴ４ＤＮＡリガーゼ〕を加え、室温で16時間反応さ
せ、１本鎖ＤＮＡを２本鎖ＤＮＡに修復した。該反応液
を用いて、上記 Messing, J. の方法で大腸菌JM103を形
質転換し、プラークを形成させた。得られたプラークの
中から上記の合成プライマーと同一の配列を含むファー
ジＤＮＡを選択するために、プラークハイブリダイゼイ
ション〔Benton, W. D., Davis, R. W., Science, 196,
180(1977)〕を行った。前述の化学合成したＤＮＡ d(A
GGCCTTGCACTTGGGGATCTAG) １μgを20μCi のγ−
〔³²Ｐ〕ＡＴＰ〔Amersham社製〕と５ユニットのＴ４−
ポリヌクレオチドキナーゼ〔宝酒造(株)製〕を用いて30
μl の反応液〔50mMTris-HCl(pH7.6)10mM MgCl₂, 10mM
２−メルカプトエタノール〕中、37℃, 30分間反応さ
せ、ＤＮＡの５′末端を³²Ｐで標識した。該反応液に等
量のフェノールを加え、除蛋白を行った後、ＴＥＮ緩衝
液〔10mM Tris-HCl(pH8.0), 200mM NaCl, １mMＥＤＴ
Ａ〕で平衡化したセファロース４Ｂ(Pharmacia社製)カ
ラム(0.25×25cm)にかけて、はじめに溶出される³²Ｐで
標識された合成ＤＮＡを回収し、プラークハイブリダイ
ゼイションのためのプローブとした。プラークハイブリ
ダイゼイションの方法は、Benton, W.D., Davis, R. W
の方法に従った。約4000プラークについて調べた結果、
３６個のプラークが、プローブとハイブリダイズした。
その中の１つのプラークから、ファージＤＮＡを分離
し、実施例１に記載のＭ13ダイデオキシ法でＤＮＡ塩基
配列を解析した結果、Ｐ31遺伝子のArg16とArg18のコド
ンが、両方ともGlnのコドンに変換していることが確認
された。該ファージをＭ13mp11-102と名付けた。

【００７４】Ｍ13mp11−102の２本鎖ＤＮＡ20μgを、40
ユニットのEcoRIと40ユニットのXbaIで100μl の反応液
〔50mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 10mM MgCl₂,
１mMジチオスレイトール〕中、37℃, ２時間作用させた
後、該反応液を５％ポリアクリルアミド・スラブゲル電
気泳動にかけ、230bpのＤＮＡ断片を分取し、ゲルから
該ＤＮＡを回収した。該ＤＮＡ断片0.05μgに、実施例
２に記載のpBR-Sal-6由来の5.53kb ＤＮＡ断片0.1μgを
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた合成、
大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、アンピシリン耐性を示す
組換え体を得た。該組換え体の中からＭ13mp11−102由
来の230bpＤＮＡ断片が組み込まれたプラスミドpBR-Sal
-6dを得た〔図１７〕。該プラスミドが持つ修飾Ｐ31遺
伝子は、プロテアーゼによって切断を受けやすいArg48
が欠失し、またArg16とArg18がともにGlnに変換した遺
伝子である。

【００７５】実施例13 ＧＬＤプロモーターを持つ外来
遺伝子発現ベクターを用いた修飾Ｐ31遺伝子発現プラス
ミドの構築と、該プラスミドによる酵母の形質転換 実施例12で記載のプラスミドpBR-Sal-6d ５μgに10ユ
ニットのSalIを作用させた後、修飾Ｐ31遺伝子が含まれ
る1.42kb ＤＮＡ断片を、アガロース・スラブゲル電気
泳動で分離し、ゲルから該ＤＮＡを回収した。該ＤＮＡ
0.2μgと参考例３で記載のプラスミド、pGLD906-１をSa
lIで消化したＤＮＡ0.1μgを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて結合させた後、大腸菌ＤＨ１を形質転換さ
せ、アンピシリン耐性の組換え体を得た。該組換え体の
中から修飾Ｐ31遺伝子がＧＬＤプロモーターと順方向に
挿入されたプラスミドpGLDＰ31-Rdを得た〔図１８〕。p
GLDＰ31-Rdを用いて酵母宿主サッカロミセス・セレビシ
エ AH22R^-を形質転換し、ロイシン非要求性の形質転換
体(AH22R^-/pGLDＰ31−Rd)を取得した。

【００７６】実施例14 修飾Ｐ31遺伝子の下流に、ＰＧ
Ｋターミネーターを接続させた修飾Ｐ31遺伝子発現プラ
スミドの構築と、該プラスミドによる酵母の形質転換 参考例２に記載のホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)
遺伝子が組込まれたプラスミドpPKT３は、ＰＧＫ遺伝子
の３′−非翻訳領域を約290bp含んでいる。該領域内に
メッセンジャーＲＮＡの合成が終結するターミネーター
があることが、Hitzeman, R. A. らによって明らかにさ
れている〔Nucleic Acids Res., 10, 7791〜7808(198
2)〕。修飾Ｐ31遺伝子の転写の終結を速やかに行わせる
ために、ＰＧＫ遺伝子の３′−非翻訳領域を修飾Ｐ31遺
伝子の直後に接続させることを行った。プラスミドpPKT
３, 60μgに50ユニットの制限酵素ClaIと50ユニットの
制限酵素HindIIIを100μlの反応液〔10mM Tris-HCl(pH
7.5), 50mM NaCl, 10mM MgCl₂〕中で37℃, ５時間作用
させた後、５％ポリアクリルアミド・スラブゲルを用い
て緩衝液〔100mM Tris-HCl, 100mM ホウ酸, ２mM ＥＤ
ＴＡ(pH 8.3)〕中、150V,２時間電気泳動にかけた。泳
動後、0.28kb ＤＮＡ断片を含むゲル片を透析チューブ
内に封入し、参考例１に記載の方法で、0.28kb ＤＮＡ
断片をゲル片から溶出し、フェノール抽出とエーテル抽
出を行った後、エタノールを加え該ＤＮＡを回収した。
上記0.28kbＤＮＡ断片は、ＰＧＫ遺伝子の３′−非翻訳
領域のうち、ストップコドンからの20bpが欠損している
ため、欠損しているＤＮＡ配列を化学合成し

【化３】 前述のCrea, R.らの方法によって合成し、参考例１に記
載された条件下で５′側をリン酸化した。

【００７７】実施例12で記載のプラスミドpBR-Sal-6d,
10μgに10ユニットの制限酵素SalIと、10ユニットの制
限酵素AhaIIIを50μlの反応液〔50mM Tris-HCl( pH7.
5), 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM ジチオスレイトー
ル〕中、37℃, ２時間作用させた後、該反応液を0.8％
アガロース・スラブゲル電気泳動にかけ、修飾Ｐ31遺伝
子を含む0.85kb のＤＮＡ断片を分取し、ゲルから該Ｄ
ＮＡを回収した。プラスミドpBR322を制限酵素HindIII
とSalIで消化して得られる3.74kb ＤＮＡ断片0.2μg
と、上記の0.28kb ＤＮＡ断片(ＰＧＫ遺伝子のターミネ
ーターを含む)0.05μg, 上記のリン酸化した化学合成Ｄ
ＮＡ50ng, および上記の0.85kb ＤＮＡ断片(修飾Ｐ31遺
伝子を含む)0.1μgを混合し、参考例１に記載の条件下
でＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて結合させた。該反応
液を用いて大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、アンピシリン
耐性形質転換体の中から４種のＤＮＡ断片が結合したプ
ラスミドpBR-Sal-6dT を保持する形質転換体を分離し
た。次に参考例１に記載した方法に従って、該プラスミ
ドpBR-Sal-6dT のHindIII部位がSalI部位に変換された
プラスミドpBR-Sal-6dTSを作製した。

【００７８】pBR-Sal-6dTS, ５μgに10ユニットの制限
酵素 SalIを30μl の反応液〔50mM Tris-HCl(pH7.5), 1
00mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM ジチオスレイトール〕中
で37℃, ２時間作用させた後、修飾Ｐ31遺伝子とＰＧＫ
ターミネーターを含む1.15kbＤＮＡ断片を、前記条件
下、アガロース・スラブゲルで分離し、ゲルから該ＤＮ
Ａを回収した。該ＤＮＡ0.5μgと、プラスミドpGLD906-
1をSalIで消化したＤＮＡ0.1μgを混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させた後、大腸菌ＤＨ１を形質転
換させ、アンピシリン耐性を示す組換え体を得た。該組
換え体の中から、修飾Ｐ31遺伝子−ＰＧＫターミネータ
ーがＧＬＤプロモーターと順方向に挿入されたプラスミ
ド pGLDＰ31−RdTを得た〔図１９〕。pGLDＰ31−RdT を
用いて、酵母宿主サッカロミセス・セレビシエAH22R^-を
形質転換し、形質転換体(AH22R^-/pGLDＰ31−RdT)を取得
した。

【００７９】実施例15 修飾Ｐ31遺伝子の酵母における
発現 実施例13および14で得られた修飾Ｐ31遺伝子発現プラス
ミドを含む酵母形質転換体を５mlの培養液〔１リットル
あたり、K₂HPO₄ ３g, グルコース30g, アスパラギン４
g, Ｌ−ヒスチジン100mg, ＫＩ 0.1mg, MgSO₄・7H₂O 50
0mg, CaCl₂・2H₂O 330mg, CuSO₄・5H₂O 0.4mg, Fe
SO₄・7H₂O 2.5mg, MnSO₄・4H₂O 0.4mg, (NH₄)₃PO₄・
12MoO₃・3H₂O 0.2mg, ZnSO₄・7H₂O 3.1mg, イノシト
ール10mg, チアミン0.2mg, ピリドキシン0.2mg, Ca-パ
ントテン酸0.2mg, ナイアシン0.2mg, ビオチン0.002mg
を含む〕中で30℃で１日間振とう培養を行った後、その
２mlを18mlの新鮮培地〔１リットルあたり、KH₂PO₄ 300
mg, ショ糖50g, アスパラギン４g, Ｌ−ヒスチジン100m
g, KCl 1.5g, KI 0.1mg, MgSO₄・7H₂O 500mg, CaCl₂・2
H₂O 330mg, グルコース10g, トリス-マレイン酸(pH6.5)
25mM, CuSO₄・5H₂O 0.4mg, FeSO₄・7H₂O 2.5mg, MnSO₄
・4H₂O 0.4mg, (NH₄)₃PO₄・12MoO₃・3H₂O 0.2mg, ZnSO₄
・7H₂O 3.1mg, イノシトール10mg, チアミン0.2mg, ピ
リドキシン0.2mg, Ca-パントテン酸0.2mg, ナイアシン
0.2mg, ビオチン0.002mgを含む〕に移し、さらに30℃で
２日間振とう培養を行った。菌体を遠心で集めた後、実
施例５に記載の方法で菌体抽出液を得、Ｐ31活性を測定
した。その結果AH22R^-/pGLDＰ31−RdのＰ31産生量は、
ブロス１mlあたり29μg と計算された。また、AH22R^-/p
GLDＰ31−RdTのＰ31産生量は、ブロス１mlあたり47μg
と計算された。

【００８０】実施例16 菌体からの抽出 実施例15記載の方法で培養し、−20℃で凍結して得た酵
母S.cerevisiae AH22R^-/pGLDＰ31-Rd の凍結保存菌体１
kgを7.5M尿素-10mM エチレンジアミン四ナトリウム塩
(ＥＤＴＡ)-２mM フェニルメチルスルホニルフルオライ
ド(ＰＭＳＦ)-0.1mM (p−アミジノフェニル)メタンスル
ホニルフルオライド塩酸塩(P−APMSF)-10mM リン酸ナト
リウムを含む緩衝液(pH7.5)4000mlに均一に懸濁した。
この懸濁液をダイノーミルＫＤＬ型ボールミル(ＷＡＢ
社, バーゼル, スイス)により流速4000ml/hrおよびガラ
スビース0.50〜0.75mmで処理し、細胞を連続的に破壊し
た。抽出効率を高める為にこの操作を２回繰り返した。
この抽出液を13900×gで30分間遠心して上清5500mlを得
た。HBsAg濃度はオースザイム(AUSZYME)により4.2μg/m
lであった。 ポリエチレングリコールによる分画 上記で得た上清に0.5倍量の33％ 濃度(W/W)ポリエチレ
ングリコール6000(ＰＥＧ−6000)をゆっくり添加し、13
900×gで30分間遠心してHBsAg画分を沈澱として回収し
た。得られた沈澱物を7.5M尿素-10mM ＥＤＴＡ-２mM Ｐ
ＭＳＦ-0.1mM P-APMSF-10mM リン酸ナトリウムを含む緩
衝液(pH7.5)1000mlに溶解し、最終濃度が0.2Mになるよ
うに食塩を添加した。この溶液に0.25倍量の33％ 濃度
(W/W)のＰＥＧ−6000を添加したのち、13900×gで30分
間遠心し、上清を得た。得られた上清に0.5倍量の33％
濃度(W/W)のＰＥＧ−6000をさらに添加したのち、13900
×gで30分間遠心して沈澱物を集めた。この沈澱物を5.0
M 尿素-0.145M 食塩-５mM ＥＤＴＡ−１mM ＰＭＳＦ-0.
05mM P-APMSF-10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)120
mlに溶解した。

【００８１】 セファクリルＳ−300によるゲルろ過 上記で得た溶解液を5.0M 尿素-５mM ＥＤＴＡ−１mM Ｐ
ＭＳＦ-0.05mM P-APMSF-10mM リン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.5)で平衡化したセファクリルＳ−300(ファルマシ
ア社, スエーデン)カラム(５×102cm, 2000ml)に負荷
し、同一緩衝液で溶出して、カラムの排除容積で溶出さ
れてくる画分240mlを集めた。 超遠心分離 次にBeckman SW−28用超遠心チューブに、40％セシウム
クロライド(CsCl)-５Ｍ尿素-２mM ＥＤＴＡ-１mM ＰＭ
ＳＦ-0.05mM P-APMSF-10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.
4)8.5ml, 30％CsCl-５Ｍ尿素-２mM ＥＤＴＡ-１mM ＰＭ
ＳＦ-0.05mM P-APMSF-10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.
4)8.5mlおよび上記溶解液20mlを重層し、28000rpm, ４
℃で16時間超遠心を行いHBsAgを密度1.2付近に濃縮・精
製した。 ハイドロキシルアパタイトカラム 超遠心により濃縮・精製されたＨＢｓＡｇ画分を0.05mM
P-APMSFを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に対
して一昼夜透析し、上記緩衝液で平衡化したハイドロキ
シルアパタイトカラム(2.5×10cm, 50ml)に通してHBsAg
を吸着させ、カラムを上記平衡化緩衝液で洗浄した。次
いで0.05mM P-APMSFを含む50mM リン酸カリウム緩衝液
(pH7.0)300mlと0.05mM P-APMSFを含む600mM リン酸カリ
ウム緩衝液(pH7.0)300mlとによる直線濃度勾配溶出法に
よりHBsAgを溶出した。 HBsAg画分を分取し、ＰＢＳに対
して透析後、除菌ろ過してHBsAg蛋白濃度65μg/mlのHBs
Ag精製標品液42mlを得た。上記溶液10mlを1.18mg/mlの
濃度Alum液55mlと４℃３時間混合し、HBsAgをAlumに吸
着させることによりHBsAg 10μg/mlのワクチン65mlを調
製した。

【００８２】実施例１７ 修飾Ｐ３１遺伝子の下流に、
ＰＧＫタ−ミネ−タ−を接続させた修飾Ｐ３１遺伝子発
現プラスミドの構築と、該プラスミドによる酵母の形質
転換 実施例３で記載のプラスミドpＢＲ−Ｓal−６c, １０μ
gに１０ユニットの制限酵素Ｓal Ｉと、１０ユニットの
制限酵素Ｘba Ｉを５０μlの反応液〔５０mＭＴris−Ｈ
Ｃl(pＨ７.５), １００mＭ ＮaＣl, １０mＭ ＭgＣl₂
１mＭジチオスレイト−ル〕中、３７℃, ２時間作用さ
せた後、該反応液を５％ポリアクリルアミド・スラブゲ
ル電気泳動にかけた。泳動後、０.２５kb ＤＮＡ断片を
含むゲル片を透析チュ−ブ内に封入し、参考例１に記載
の方法でＤＮＡ断片をゲル片から溶出し、フェノ−ル抽
出とエ−テル抽出を行った後、エタノ−ル沈澱を行って
該ＤＮＡを回収した。実施例１４で記載のプラスミドp
ＢＲ−Ｓal−６dＴ, ３μgに５ユニットの制限酵素Ｓal
Ｉと、５ユニットの制限酵素Ｘba Ｉを２０μlの反応
液〔５０mＭＴris−ＨＣl(pＨ７.５), １００mＭ Ｎa
Ｃl, １０mＭ ＭgＣl₂, １mＭジチオスレイト−ル〕
中、３７℃, ２時間作用させた後、該反応液を０.８％
アガロ−ス・スラブゲル電気泳動にかけ、４.６５kb Ｄ
ＮＡ断片を分取し、ゲルから該ＤＮＡを上記の方法で回
収した。

【００８３】前記の０.２５kb ＤＮＡ断片０.０５μg
と、４.６５kb ＤＮＡ断片０.２μgを混合し、参考例１
に記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガ−ゼを作用させて結合
させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ１を形質転換さ
せ、アンピシリン耐性を示す形質転換体の中から、上記
２種類のＤＮＡ断片が結合したプラスミドpＢＲ−Ｓal
−６cＴを保持する形質転換体を分離した。次に参考例
１に記載した方法に従って、該プラスミドpＢＲ−Ｓal
−６cＴの ＨindIII部位がＳal Ｉ部位に変換されたプ
ラスミドpＢＲ−Ｓal−６cＴＳを作製した。pＢＲ−Ｓa
l−６cＴＳ, ５μgに１０ユニットの制限酵素Ｓal Ｉを
３０μl の反応液〔５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.５),
１００mＭ ＮaＣl, １０mＭ ＭgＣl₂, １mＭジチオス
レイト−ル〕中で３７℃, ２時間作用させた後、１.１
５kbＤＮＡ断片を前記条件下アガロ−ス・スラブゲルで
分離し、ゲルから該ＤＮＡを回収した。該ＤＮＡ０.５
μgと、プラスミドpＧＬＤ ９０６−１のＳal Ｉ消化Ｄ
ＮＡ, ０.１μgを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼを用いて
結合させた後、大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、アンピシ
リン耐性を示す組換え体を得た。該組換え体の中から、
修飾Ｐ３１遺伝子−ＰＧＫタ−ミネ−タ−がＧＬＤプロ
モ−タ−と順方向に挿入されたプラスミドpＧＬＤ Ｐ３
１−ＲcＴを得た〔図２０〕。pＧＬＤ Ｐ３１−ＲcＴを
用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２Ｒ^-
を形質転換し、形質転換体(ＡＨ２２Ｒ^-／pＧＬＤ Ｐ３
１−ＲcＴ)を取得した。

【００８４】実施例１８ 修飾Ｐ３１遺伝子の酵母にお
ける発現 実施例１７で得られた修飾Ｐ３１遺伝子発現プラスミド
を含む酵母形質転換体を５mlの培養液〔１リットルあた
り、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ３g, グルコ−ス３０g, アスパラギン
４g, Ｌ−ヒスチジン１００mg, ＫＩ ０.１mg, ＭgＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ ５００mg, ＣaＣl₂・２Ｈ₂Ｏ ３３０mg, Ｃ
uＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０.４mg, ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２.５m
g, ＭnＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ０.４mg, (ＮＨ₄)₃ＰＯ₄・１２
ＭoＯ₃・３Ｈ₂Ｏ ０.２mg, ＺnＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３.１m
g, イノシト−ル１０mg, チアミン０.２mg, ピリドキシ
ン０.２mg, Ｃa−パントテン酸０.２mg, ナイアシン０.
2mg, ビオチン０.００２mgを含む〕中で３０℃で１日間
振とう培養を行った後、その２mlを１８mlの新鮮培地
〔１リットルあたり、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３００mg, ショ糖
５０g, アスパラギン４g, Ｌ−ヒスチジン１００mg, Ｋ
Ｃl １.５g, ＫＩ０.１mg, ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ５００m
g, ＣaＣl₂・２Ｈ₂Ｏ ３３０mg, グルコ−ス１０g, ト
リス−マレイン酸(pＨ６.５)２５mＭ, ＣuＳＯ₄・５Ｈ₂
Ｏ ０.４mg,ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２.５mg, ＭnＳＯ₄・４
Ｈ₂Ｏ ０.４mg, (ＮＨ₄)₃ＰＯ₄・１２ＭoＯ₃・３Ｈ₂Ｏ
０.２mg, ＺnＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３.１mg, イノシト−ル１
０mg, チアミン０.２mg, ピリドキシン０.２mg, Ｃa−
パントテン酸０.２mg, ナイアシン０.２mg, ビオチン
０.００２mgを含む〕に移し、さらに３０℃で２日間振
とう培養を行った。菌体を遠心で集めた後、実施例５に
記載の方法で菌体抽出液を得、Ｐ３１活性を測定した。
その結果ＡＨ２２Ｒ^-／pＧＬＤＰ３１−ＲcＴのＰ３１
産生量は、ブロス１mlあたり１７.８μgと計算された。

【００８５】実施例１９ 菌体からの抽出 実施例１８記載の方法で培養し、−２０℃で凍結して得
た酵母Ｓ.cerevisiaeＡＨ２２Ｒ^-／pＧＬＤ Ｐ３１−Ｒ
cＴの凍結保存菌体５００gを ０.１％ポリオキシエチ
レン(２０)ソルビタンモノオレエ−ト(Tween ８０)−
７.５Ｍ尿素−１０mＭエチレンジアミン四ナトリウム塩
(ＥＤＴＡ)−２mＭフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド(ＰＭＳＦ)−０.１mＭ(p−アミジノフェニル)メタ
ンスルホニルフルオライド塩酸塩(Ｐ−ＡＰＭＳＦ)−１
００mＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液(pＨ７.２)２５
００mlに均一に懸濁した。この懸濁液をダイノ−ミルＫ
ＤＬ型ボ−ルミル(ＷＡＢ社, バ−ゼル, スイス)により
流速４０００ml／hrおよびガラスビ−ス０.５０〜０.７
５mmで処理し、細胞を連続的に破壊した。抽出効率を高
める為にこの操作を２回繰り返した。この抽出液を１３
９００×gで３０分間遠心して上清３３００mlを得た。
ＨＢsＡg濃度はオ−スザイム(ＡＵＳＺＹＭＥII)により
３４.６μg／mlであった。

【００８６】 ポリエチレングリコ−ルによる分画 上記で得た上清に０.６５倍量の３３％濃度(Ｗ／Ｗ)ポ
リエチレングリコ−ル６０００(ＰＥＧ−６０００)をゆ
っくり添加し、pＨを６.０に調整したのち３０分間撹拌
してから、１３９００×gで３０分間遠心してＨＢsＡg
画分を沈澱として回収した。得られた沈澱物を７.５Ｍ
尿素−１０mＭ ＥＤＴＡ−２mＭ ＰＭＳＦ−０.１mＭ
Ｐ−ＡＰＭＳＦ−１００mＭリン酸ナトリウムを含む緩
衝液(pＨ７.２)１０００mlに溶解し、pＨを７.０に調整
したのち最終濃度が０.３０Ｍになるように食塩を添加
した。この溶液に０.２５倍量の３３％濃度(Ｗ／Ｗ)の
ＰＥＧ−６０００を添加し、３０分後に１３９００×g
で３０分間遠心し、上清を得た。得られた上清に０.２
９倍量の３３％濃度(Ｗ／Ｗ)のＰＥＧ−６０００をさら
に添加し、pＨを６.０に調整して、３０分間撹拌を続け
たのち、１３９００×gで３０分間遠心して沈澱物を集
めた。この沈澱物を５.０Ｍ 尿素−０.１４５Ｍ食塩−
５mＭ ＥＤＴＡ−１mＭ ＰＭＳＦ−０.０５mＭ Ｐ−Ａ
ＰＭＳＦ−１０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ７.５)
１２０mlに溶解した。

【００８７】 セファクリルＳ−３００によるゲルろ
過 上記で得た溶解液を５.０Ｍ 尿素−０.１４５Ｍ 食塩−
５mＭ ＥＤＴＡ−１mＭ ＰＭＳＦ− ０.０５mＭ Ｐ−
ＡＰＭＳＦ−１０mＭ リン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.
０)で平衡化したセファクリルＳ−３００(ファルマシア
社, スエ−デン)カラム(５×１０２cm, ２０００ml)に
負荷し、同一緩衝液で溶出して、カラムの排除容積で溶
出されてくる画分２４０mlを集めた。 抗体カラム 次に上記で得た溶出液２４０mlを０.１４５Ｍ食塩−５m
Ｍ ＥＤＴＡ−０.１mＭ Ｐ−ＡＰＭＳＦ−１０mＭ リン
酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.０)で５倍に希釈し、同一緩
衝液で平衡化したマウス由来の抗ＨＢsＡg抗体(国際出
願ＰＣＴ／ＪＰ８５／００１６１の参考例１〜３に記
載)〔特願昭６１−４０９２号：昭和６１年１月１０日
提出〕を結合させたホルミル−セルロファインカラム２
００mlを通過させた。次いでＨＢsＡgを吸着させたカラ
ムを１Ｍチオシアン酸アンモニウム−１０mＭリン酸ナ
トリウム緩衝液(pＨ６.０)で洗浄したのち、４Ｍチオシ
アン酸アンモニウム−１０mＭリン酸ナトリウム緩衝液
(pＨ６.０)で溶出した。約３００mlの溶出液を４０mlに
まで濃縮した。

【００８８】 セファクリルＳ−４００によるゲルろ
過 上記で得た濃縮液を５.０Ｍ尿素−０.１４５Ｍ食塩−５
mＭ ＥＤＴＡ−１mＭＰＭＳＦ−０.０５mＭ Ｐ−ＡＰＭ
ＳＦ−１０mＭ リン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.０)で平
衡化したセファクリルＳ−４００(ファルマシア社, ス
エ−デン)カラム(５×１０２cm, ２０００ml)に負荷
し、同一緩衝液で溶出して、ＨＢsＡg画分１８６mlを集
めた。溶出液を１２０mlまで濃縮した。 超遠心分離 次にBeckman ＳＷ−２８用超遠心チュ−ブに、４０％セ
シウムクロライド(ＣsＣl)−５Ｍ尿素−２mＭ ＥＤＴＡ
−１mＭ ＰＭＳＦ−０.０５mＭ Ｐ−ＡＰＭＳＦ−１０m
Ｍ リン酸カリウム緩衝液(pＨ７.4)８.５ml, ３０％Ｃs
Ｃl−５Ｍ尿素−２ mＭ ＥＤＴＡ−１mＭ ＰＭＳＦ−
０.０５mＭ Ｐ−ＡＰＭＳＦ−１０mＭリン酸カリウム緩
衝液 (pＨ７.４)８.５mlおよび上記濃縮液２０mlを重層
し、２８０００rpm, ４℃で１６時間超遠心を行いＨＢs
Ａgを密度１.２付近に濃縮・精製した。上記超遠心によ
り濃縮, 精製されたＨＢsＡg画分をＰＢＳに対して透析
後、除菌ろ過してＨＢsＡg蛋白濃度２５０μg／mlのＨ
ＢsＡg精製標品液５０mlを得た。

【００８９】実施例２０ 実施例１６で得たＨＢsＡgについて以下の性質を調べ
た。 (１) ラエムリ 〔Ｎature, ２２７,６８０(１９７
０)〕に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル
電気泳動を行ったあと、銀染色を行なった結果、該ＨＢ
sＡg蛋白質は分子量約３７０００ダルトンおよび３４０
００ダルトンにバンドを示した。 (２) Ｎ末端アミノ酸配列 該ＨＢsＡg蛋白質７４.２μgに気相プロテイン シ−ク
エネ−タ−(アプライド・バイオシステシ−クエネ−タ
−(アプライド・バイオシステムズ社製４７０Ａ型、ア
メリカ)を用いる自動エドマン分解法を適用して、Ｎ末
端アミノ酸配列を分析した。フェニルチオビダントイン
アミノ酸 (ＰＴＨ−アミノ酸)はミクロパックＳＰ−Ｏ
ＤＳカラム(バリアン社製, アメリカ)を用いる高速液
体クロマトグラフィ−により同定した。各ステップで検
出されたＰＴＨ−アミノ酸を〔表４〕に示す。

【００９０】

【表４】 表中Ｘについては未決定である。 (３) 電子顕微鏡観察 該ＨＢsＡgの粒子を日本電子の１２００Ｅ型電子顕微鏡
で観察した結果、１９.１±２.０nmの粒子が観察され
た。なお、実施例１９で得たＨＢsＡgについても同様な
性質であった。

【００９１】実施例21 サブタイプadr型の修飾Ｐ31遺
伝子とサブタイプadw型のＰ25遺伝子を同時に発現させ
るプラスミドの構築１ 実施例３で記載のサブタイプadr型の修飾Ｐ31遺伝子発
現プラスミドpPHOＰ31-Rc 30μgに60ユニットの制限酵
素SalIを100μl の反応液〔50mM Tris-HCl(pH 7.5), 10
0mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM ジチオスレイトール〕中
で37℃, 10分間作用(部分分解)させた後、該プラスミド
上に２箇所存在するSalI部位のうち、１箇所だけが切断
された9.7kbＤＮＡ断片を参考例１で記載の方法でアガ
ロース・スラブゲルで分離し、該ＤＮＡ断片を回収し
た。このＤＮＡ断片２μgに４ユニットの制限酵素ScaI
(New England Biolabs社製)を20μlの反応液〔10mM Tri
s-HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM ジチオ
スレイトール〕中、37℃, ２時間作用させ、該反応液を
アガロース・スラブゲル電気泳動にかけ、6.85kbＤＮＡ
を分取した。特願昭５９−１９３７６５号〔特開昭６１
−７０９８９号公報〕に添付の明細書に記載のサブタイ
プadw型のＰ25遺伝子発現プラスミドpPHO17-5820μgに4
0ユニットの制限酵素BamHI(ニッポンジーン社製)と40ユ
ニットのHindIII(ニッポンジーン社製)を100μl の反応
液〔10mM Tris-HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 10mM MgCl₂,
１mM ジチオスレイトール〕中で37℃, ２時間作用させ
た後、該反応液をアガロース・スラブゲル電気泳動にか
け、5.5kbＤＮＡを分取した。つぎにこのＤＮＡ断片２
μgを30μｌ の反応液〔40mM リン酸カリウム緩衝液(pH
7.5), 6.6mM MgCl₂, １mM ２−メルカプトエタノール,
33μM dＡＴＰ, 33μM dＧＴＰ, 33μM dＴＴＰ, 33μ
M dＣＴＰ〕中で、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩ
ラージ・フラグメント(New England Biolabs社製)を用
いてＤＮＡ断片の両端の１本鎖部分を２本鎖に修復し
た。次に、50ngの５′末端がリン酸化されたSalIリンカ
ー〔５′-P-d(GGTCGACC)〕(New England Biolabs社製)
と、 上記の両末端が修復されたＤＮＡ断片２μgを、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを作用させ、連結させた。該反応液を
フェノール抽出さらにエーテル抽出した後、NaClを0.2
Ｍになるように加え、つづいて２倍量の冷エタノールを
加えて−20℃でＤＮＡを沈澱させた。該ＤＮＡ断片２μ
gに10ユニットの制限酵素SalIと、 ４ユニットの制限酵
素ScaIを30μl の反応液〔50mM Tris-HCl(pH 7.5), 10m
M NaCl, 10mM MgCl₂, １ｍＭジチオスレイトール〕中、
３７℃, ３時間作用させた後、該反応液をアガロース・
スラブゲル電気泳動にかけ、4.2kbＤＮＡ断片を分取し
た。上記の6.85kbＤＮＡ断片(pPHOＰ31-Rc由来)0.5μg
と、 4.2kbＤＮＡ断片(pPHO17-58由来)0.5μgとを、 20μ
l の反応液中でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用で連結させ
た。この反応液を用いて大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、
アンピシリン耐性を示すコロニーの中から、ミニスクリ
ーニング法〔Birnboim, H. C. and Doly, J.,Nucleic A
cids Res., 7, 1513(1979)〕で、 pPHO3125を選択した
〔図２２〕。

【００９２】実施例22 サブタイプadr型の修飾Ｐ31遺
伝子とサブタイプadw型のＰ25遺伝子を同時に発現させ
るプラスミドの構築２ 参考例６で記載のサブタイプadw型のＰ25遺伝子発現プ
ラスミドpGLDＰ25−W30μgに50ユニットの制限酵素XhoI
(ニッポンジーン社製)を100μlの反応液〔50mM Tris-HC
l(pH 7.5), 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, １mM ジチオスレ
イトール〕中で37℃, 10分間作用(部分分解)させた後、
該プラスミド上に２箇所存在するXhoI部位のうち、 １箇
所だけが切断された10.2kbＤＮＡ断片を参考例１で記載
の方法でアガロース・スラブゲルで分離し、該ＤＮＡ断
片を回収した。このＤＮＡ断片４μgに４ユニットの制
限酵素ScaIを作用させ、 生じたＤＮＡ断片をアガロース
・スラブゲルで分離し、 7.3kbＤＮＡ断片を分取した。
該7.3kbＤＮＡ断片１μgに、実施例２１に記載の方法で
ＤＮＡポリメラーゼＩラージ・フラグメントを作用さ
せ、XhoIで切断された一端の１本鎖ＤＮＡを２本鎖ＤＮ
Ａに修復した。実施例４で記載のサブタイプadr型の修
飾Ｐ31遺伝子発現プラスミドpGLDＰ31-Rc 20μgに40ユ
ニットの制限酵素ScaIと、 40ユニットの制限酵素BamHI
を100μlの反応液〔10mM Tris-HCl(pH 7.5), 50mM NaC
l, 10mM MgCl₂, １mM ジチオスレイトール〕中で、37
℃, ２時間作用させた後、該反応液をアガロース・スラ
ブゲル電気泳動にかけ、5.4kbＤＮＡ断片を分取した。
該5.4kbＤＮＡ断片１μgに、実施例２１に記載の方法で
ＤＮＡポリメラーゼＩラージ・フラグメントを作用さ
せ、BamHIで切断され一端の１本鎖ＤＮＡを２本鎖ＤＮ
Ａに修復した。上記の7.3kbＤＮＡ断片(pGLDＰ25−W由
来)0.5μgと、 5.4kbＤＮＡ断片(pGLDＰ31-Rc由来)0.5μ
gとを、 20μlの反応液中でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用で
連結させた。この反応液を用いて大腸菌ＤＨ１を形質転
換させ、アンピシリン耐性を示すコロニーの中から、ミ
ニスクリーニング法で、pGLD2531を選択した〔図２
３〕。

【００９３】実施例23 pPHO 3125 およびpGLD 2531に
よる酵母の形質転換と該形質転換体によるHBsAgの産生 実施例２１で記載のpPHO 3125 10μgを用いて、 公知の
方法〔Hinnen, A. ら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
5, 1927(1978)〕によってサッカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae)AH22R^- を形質転換し、 ロ
イシン非要求性を示す形質転換体AH22R^-/pPHO 3125を得
た。 また実施例２２で記載のpGLD 253110μgを用いて、
同様の方法でAH22R^-/pGLD 2531を得た。上記のサブタイ
プadr型修飾Ｐ31遺伝子とサブタイプadw型Ｐ25遺伝子を
同時に発現させるプラスミドを含む各酵母形質転換体
を、 Burkholderおよびショ糖５％を含むその低リン酸培
地で、 30℃,２日間培養した後、菌体を集め、生理食塩
水で洗浄した。

【００９４】Miyanohara, A. ら〔Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 80,1(1983)〕の方法に従って菌体をZymolyase
〔生化学工業(株)製〕によってスフェロプラストにした
後、スフェロプラストに0.1％トリトンX−100を添加し
てHBsAgを抽出した。 溶菌液を室温で15,000rpm, 15分間
遠心分離にかけて上澄液を得た。 この上澄液のHBsAg活
性をオースザイムII〔アボット(株)製〕を用いて測定し
た。 その結果を〔表５〕に示すが、HBsAgの生成量はブ
ロス１リットルあたりとして計算された。

【表５】 ────────────────────────────── 酵母形質転換体 HBsAg(μg/lブロス) ────────────────────────────── Saccharomyces cerevisiae AH22R^-/pPHO 3125 8000 Saccharomyces cerevisiae AH22R^-/pGLD 2531 10000 ────────────────────────────── 該上清液20μlを還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド・スラブゲル電気泳動〔Laemmli, U. K., Nature,
227, 680(1970)〕にかけ、蛋白質をニトロセルロース膜
にトランスブロット装置(Bio−Rad社)を用いて写し取
り、パーオキシダーゼで標識した抗HBsAg抗体〔オース
ザイムII, アボット(株)製〕と、イミュン・ブロット
アッセイ キット(Bio−Rad社)を用いてHBsAgを検出し
た結果、AH22R^-/pPHO 3125の抽出液では、37kダルトン
(＋微量の34kダルトン)のHBsAg蛋白と、 25kダルトンのH
BsAg蛋白が、約１対９の量比で検出された。またAH22R^-
/pGLD2531の抽出液では、37kダルトン(＋微量の34kダル
トン)と25kダルトンのそれぞれのHBsAg蛋白は、ほぼ等
量で検出された。

【００９５】実施例24 サブタイプadr型の修飾Ｐ31遺
伝子とサブタイプadw型のＰ25遺伝子を同時に発現させ
るプラスミドの構築３ 参考例３に記載のプラスミドpGLD906−１、１２μgに１
０ユニットのＢamＨＩと１０ユニットのXhoIを加え５０
μlの反応液〔５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ7.5)，100mＭ
ＮaＣl, １０mＭ ＭgＣl₂, １mＭジチオスレイトール〕
中、３７℃で３時間作用させた後、該反応液を前記条件
下、１％アガロース・スラブゲル電気泳動にかけた。泳
動後、GLDプロモーターを含む1.1kbＤＮＡ断片を参考例
１に記載の方法で回収した。特開昭６１−７０９８９号
公報に記載のプラスミドpPHO17-58、１５μgに１５ユニ
ットのXhoIと１５ユニットのＡhaIIIを加え、５０μlの
反応液〔５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ7.5),１００mＭ Ｎa
Ｃl,１０mＭ ＭgＣl₂, １mＭジチオスレイトール〕中、
３７℃で３時間作用させた後、該反応液を前記条件下、
1.2％アガロース・スラブゲル電気泳動にかけた。泳動
後、サブタイプadw型のＰ25遺伝子を含む0.69kbＤＮＡ
断片を回収した。

【００９６】実施例１７に記載のプラスミドpBR-Sal-6c
T １０μgに、８ユニットのＨindIIIと８ユニットのＡ
haIIIを加え、３０μlの反応液〔１０mＭ Ｔris−ＨＣl
(pＨ7.5), ５０mＭ ＮaＣl, １０mＭ ＭgＣl₂, １mＭジ
チオスレイトール〕中、３７℃で３時間作用させ、該反
応液を５％ポリアクリルアミド・スラブゲル電気泳動に
かけた。泳動後、PGKターミネーターを含む0.29kbＤＮ
Ａ断片を回収した。プラスミドpBR322、 ３μgに８ユニ
ットのＨindIIIと８ユニットのＢamＨＩを加え、２０μ
lの反応液〔１０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ7.5), ５０mＭ
ＮaＣl, １０mＭ ＭgＣl₂, １mＭジチオスレイトール〕
中、３７℃で２時間作用させ、該反応液を0.8％アガロ
ース・スラブゲル電気泳動にかけた。泳動後4.02kbＤＮ
Ａ断片を回収した。上記の操作で得られた４種のＤＮＡ
断片(GLDプロモーターを含む1.1kbＤＮＡ断片0.1μg, a
dw型Ｐ25遺伝子を含む0.69kbＤＮＡ断片0.1μg, PGKタ
ーミネーターを含む0.29kbＤＮＡ断片0.03μg, およびp
BR322由来の4.02kbＤＮＡ断片0.2μg)を混合し、２０μ
lの反応液〔６６mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ7.6), 6.6mＭ Ｍ
gＣl₂,１０mＭジチオスレイトール, １mＭＡＴＰ〕中、
２００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて１４℃で
１６時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌Ｄ
Ｈ１を形質転換させ、アンピシリン耐性を示す組換え体
を得た。該組換え体の中から、GLDプロモーターとＰ25
遺伝子とPGKターミネーターが予想通りに結合したプラ
スミドpSC-HBw１を得た。〔図２４〕

【００９７】プラスミドpSC-HBw１ ５μgを、２０μlの
反応液中、４ユニットのＨindIIIで３７℃, ３時間消化
し、6.1kbＤＮＡ断片を得た。次に該ＤＮＡ断片５μgを
３０μlの反応液〔４０mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ7.
5), 6.6mＭ ＭgＣl₂, １mＭ２−メルカプトエタノール,
３３μＭdＡＴＰ, ３３μＭdＧＴＰ, ３３μＭdＴＴ
Ｐ, ３３μＭdＣＴＰ〕中で５ユニットのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ・ラージフラグメントを用いてＤＮＡ断片の両
端の１本鎖部分を２本鎖に修復した。該ＤＮＡ断片に、
５′末端がリン酸化されたＢglIIリンカー〔５′−CAGA
TCTG−３′〕(New England BioLabs社製)１００ngを加
え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて両者を連結させた後、
エタノールを２倍量加えてＤＮＡを沈澱させた。該ＤＮ
Ａに８ユニットのＢamＨＩと、２０ユニットのＢglIIを
加え、３０μlの反応液〔５０mＭＴris−ＨＣl(pＨ7.
5), １００mＭ ＮaＣl, １０mＭ ＭgＣl₂, １mＭジチオ
スレイトール〕中、３７℃で５時間反応させた。該反応
液を１％アガロース・スラブゲル電気泳動にかけ、2.1k
bＤ断片を分取した。実施例１７に記載のプラスミドpGL
DP31-RcTをＢamＨＩで消化した１１kbＤＮＡ断片0.2μg
と、上記2.1kbＤＮＡ断片0.2μgを混合し、２０μlの反
応液〔６６mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ7.6), 6.6mＭ ＭgＣ
l₂, １０mＭジチオスレイトール, １mＭＡＴＰ〕中、１
００ユニットのＴ4ＤＮＡリガーゼを加えて１４℃, １
６時間反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ１を
形質転換させ、アンピシリン耐性を示す組換え体を得
た。該組換え体の中から、プラスミドpGLD25T31cTを得
た。〔図２４〕

【００９８】実施例25 pGLD25T31cTによる酵母の形質
転換と該形質転換体によるHBsAgの産生 実施例２４で記載のpGLD25T31cT １０μgを用いて、酵
母サッカロミセス・セレビシエAH22R^-を形質転換し〔Hi
nnen, A. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927
(1978)〕、 形質転換体(AH22R^-/pGLD25T31cT)を取得し
た。上記の酵母形質転換体を５mlの培養液〔１リットル
あたり、K₂HPO₄ ３g, グルコース３０g, アスパラギン
４g, Ｌ−ヒスチジン１００mg, ＫＩ 0.1mg, MgSO₄・7H
₂O ５００mg, CaCl₂・2H₂O ３３０mg, CuSO₄・5H₂O 0.4
mg, FeSO₄・7H₂O 2.5mg, MnSO₄・4H₂O 0.4mg,(NH₄)₃P
O₄・12MoO₃・3H₂O 0.2mg,ZnSO₄・7H₂O 3.1mg,イノシ
トール１０mg, チアミン0.2mg, ピリドキシン0.2mg, Ca
−パントテン酸0.2mg, ナイアシン0.2mg, ビオチン0.00
2mgを含む〕中で３０℃で１日間振とう培養を行った
後、その２mlを１８mlの新鮮培地〔１リットルあたり、
K₂HPO₄３００mg, ショ糖５０g, アスパラギン４g, Ｌ−
ヒスチジン１００mg, KCl 1.5g, ＫＩ 0.1mg, MgSO₄・
7H₂O ５００ mg, CaCl₂・2H₂O ３３０mg, グルコース
１０g, トリス−マレイン酸(pＨ6.5)25mＭ, CuSO₄・5H₂
O 0.4mg, FeSO₄・7H₂O2.5mg, MnSO₄・4H₂O 0.4mg,
(NH₄)₃PO₄・12MoO₃・3H₂O 0.2mg, ZnSO₄・7H₂O3.1mg,
イノシトール１０mg, チアミン0.2mg, ピリドキシン0.2
mg, Ca−パントテン酸0.2mg, ナイアシン0.2mg, ビオチ
ン0.002mgを含む〕に移し、さらに３０℃で２日間振と
う培養を行った。菌体を遠心で集め、生理食塩水で洗滌
した。

【００９９】Miyanohara, A. ら〔Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 80, 1(1983)〕の方法に従って菌体をZymolyas
e〔生化学工業(株)製〕によってスフェロプラストにし
た後、スフェロプラストに0.1％トリトンＸ−１００を
添加してHBsAgを抽出した。溶菌液を室温で15,000rpm,
１５分間遠心分離にかけて上澄液を得た。この上澄液の
HBsAg活性をオースザイムII〔アボット(株)製〕を用い
て測定した。その結果ブロス１リットルあたり、２０mg
から３０mgのHBsAgを産生していることが判明した。菌
体１５mgを１００μlのサンプル緩衝液 〔Laemmli, U.
K., Nature, 277, 680(1970)〕に懸濁し、１００℃で１
０分間処理した後、上清液３０μlをSDS−ポリアクリル
アミド・スラブゲル電気泳動(Laemmli, U. K., Nature,
277, 680(1970))にかけた。蛋白質をニトロセルロース
膜にトランスブロット装置(Bio-Rad社)を用いて写し取
り、パーオキシダーゼで標識した抗HBsAg抗体〔オース
ザイムII, アボット(株)製〕と、イミュン・ブロット・
アッセイ・キット〔Bio-Rad社〕を用いてHBsAgを検出し
た結果、３７kダルトン, ３４kダルトン, ２５kダルト
ンの蛋白質が抗HBsAg抗体と反応した。各微生物および
動物細胞の寄託機関への寄託およびその受託番号は〔表
６〕に示すとおりである。

【０１００】表中、ＩＦＯは財団法人発酵研究所を、Ｆ
ＲＩは日本国通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所を、E．coliはEscherichia coliを、S. cerevisiaeは
Saccharomyces cerevisiaeを表わす。ＦＥＲＭ ＢＰ番
号はブダペスト条約に基づく寄託の受託番号を表わす。

【表６】 ────────────────────────── 寄託株 IFO FRI (IFO) (FERM) ────────────────────────── E.coli 294 14171 E.coli 294/pTRP P31-R 14355 BP-802 E.coli C600 14410 BP-808 E.coli C600/pTRP P31-R 14425 BP-807 S.cerevisiae AH22R^- 10134 BP-804 S.cerevisiae AH22R^-/pPHO P31-R 10135 BP-805 S.cerevisiae AH22R^-/pPHO P31-Ra 10154 BP-1060 S.cerevisiae AH22R^-/pGLD P31-RdT 10172 BP-1066 S.cerevisiae AH22R^-/pGLD P31-Rb 10155 BP-1061 S.cerevisiae AH22R^-/pGLD P31-Rc 10156 BP-1062 S.cerevisiae AH22R^-/pGLD P31-Rd 10169 BP-1063 S.cerevisiae AH22R^-/pGLD P31-RcT 10206 BP-1059 S.cerevisiae AH22R^-/pPHO 17-58 10137 BP- 854 S.cerevisiae AH22R^-/pPHO 3125 10171 BP-1065 S.cerevisiae AH22R^-/pGLD 2531 10170 BP-1064 S.cerevisiae AH22R^-/pGLD 25T31cT 10208 BP-1073 C-P31-558-1 50058 ────────────────────────── なお、E.coli 294は公知である〔Backman, Kら, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174(1974)〕。

【０１０１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８４６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus） 配列： ATG CAG TGG AAT TCC ACA ACA TTC CAC CAA GCT CTG CTA GAT CCC AGA 48 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg GTG AGG GGC CTA TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCC GGA ACA GTA 96 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val AAC CCT GTT CCG ACT ACT GCC TCA CCC ATA TCG TCA ATC TTC TCG AGG 144 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg ACT GGG GAC CCT GCA CCG AAC ATG GAG AAC ACA ACA TCA GGA TTC CTA 192 Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu GGA CCC CTG CTC GTG TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC 240 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile CTC ACA ATA CCA CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT TTT 288 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe CTA GGG GGA GCA CCC ACG TGT CCT GGC CAA AAT TCG CAG TCC CCA ACC 336 Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCT TGT CCT CCA ATT TGT CCT GGC TAT CGC 384 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg TGG ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC ATA TTC CTC TTC ATC CTG CTG CTA 432 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu TGC CTC ATC TTC TTG TTG GTT CTT CTG GAC TAC CAA GGT ATG TTG CCC 480 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro GTT TGT CCT CTA CTT CCA GGA ACA TCA ACC ACC AGC ACG GGG CCA TGC 528 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys AAG ACC TGC ACG ATT CCT GCT CAA GGA ACC TCT ATG TTT CCC TCT TGT 576 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys TGC TGT ACA AAA CCT TCG GAC GGA AAC TGC ACT TGT ATT CCC ATC CCA 624 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro TCA TCC TGG GCT TTC GCA AGA TTC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GTC CGT 672 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg TTC TCC TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG TTC GTA GGG 720 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT TCA GTT ATA TGG ATG ATG TGG TAT TGG 768 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp GGG CCA AGT CTG TAC AAC ATC TTG AGT CCC TTT TTA CCT CTA TTA CCA 816 Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro ATT TTC TTT TGT CTT TGG GTA TAC ATT TAA 846 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile

【０１０２】配列番号：２ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus） 配列： CCC ATA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ACT GGG GAC CCT GCA CCG 42 Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro 配列番号：３ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 一部合成DNA 配列： CCC ATA TCG TCA ATC TTC CCG GAT CCG GGG TCG AGG ACT GGG GAC CCT 48 Pro Ile Ser Ser Ile Phe Pro Asp Pro Gly Ser Arg Thr Gly Asp Pro GCA CCG ５
４ Ａｌａ Ｐｒｏ

【０１０３】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 一部合成ＤＮＡ 配列： CCC ATA TCG TGG ACT GGG GAC CCT GCA CCG 30 Pro Ile Ser Trp Thr Gly Asp Pro Ala Pro 配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 一部合成DNA 配列： CCC ATA TCT GGG GAC CCT GCA CCG 24 Pro Ile Ser Gly Asp Pro Ala Pro

【０１０４】配列番号：６ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CGATACAATG CAGTGG 16 配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGGCCTTGCA CTTGGGGATC TAG 23

【０１０５】配列番号：８ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CCCAGTCTGC GAGAAG 16 配列番号：９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AATTCCACTG CATTGTAT 18

【０１０６】配列番号：１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TGAAGATAAA GACAT 15 配列番号：１１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGCAACTCTA ACCAT 15

【０１０７】配列番号：１２ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CGCGGATCCG CG 12 配列番号：１３ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CCGGATCCGG １０

【０１０８】配列番号：１４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： AAATTGAATT AATTGAATTG AAAT 24

【図面の簡単な説明】

【図１】はウェスタン・ブロッティング(Western blott
ing)による遺伝子産物の分析結果を示す。図中、レーン
１は大腸菌Ｃ600/pTRPＰ31-Rの菌体抽出液の、レーン２
は大腸菌Ｃ600/pTRPＰ31-Rの菌体抽出液をトリプシン処
理したものを、レーン３はサッカロミセス・セレビシエ
AH22R^-/pPHO Ｐ31-Rの菌体抽出液の分析結果を示す。

【図２】はadr型HBsAgＰ31の塩基配列(上)およびアミノ
酸配列(下)を示す。

【図３】はpTRPＰ31-Raの変更部分の塩基配列（上）お
よびアミノ酸配列（下）を示す。

【化４】

【図４】はpTRPＰ31-RbおよびpTRPＰ31-Rcの変更部の塩
基配列(上)およびアミノ酸配列を示す。図中、斜線は欠
損部分を示す。

【図５】はpPHO Ｐ31-Ra, pPHO Ｐ31-RbおよびpPHO Ｐ3
1-Rcの構築図を示す。図中、Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｈ，Ｓおよび
ＸbはそれぞれBamHI, ClaI, EcoRI, HindIII,SalIおよ
びＸbaＩを示す。

【図６】はpGLDＰ31-Ra, pGLDＰ31-RbおよびpGLDＰ31-R
cの構築図を示す。

【図７】はサッカロミセス・セレビシエAH22R^-/pPHO Ｐ
31-Ra(レーン１), AH22R^-/pPHO Ｐ31-Rb(レーン２), AH
22R^-/pPHO Ｐ31-Rc(レーン３)およびAH22R^-/pPHO Ｐ31-
R(レーン４)の菌体抽出液のウェスタン・ブロッティン
グによる分析結果を示す。

【図８】はpTB553およびpTB555の構築図を示す。

【図９】はpTB556およびpTB558の構築図を示す。

【図１０】はpTB556およびpTB558の構築図を示す。

【図１１】はpTB556およびpTB558の構築図を示す。

【図１２】はpPHO 17-1の構築図を示す。

【図１３】はpPKT700-1の構築図を示す。

【図１４】はpGLD906-1の構築図を示す。

【図１５】はpTRPＰ31-Rの構築図を示す。

【図１６】はpPHO Ｐ31-Rの構築図を示す。

【図１７】はプラスミドpBR-Sal-6d の構築図を示す。

【図１８】はプラスミドpGLDＰ31-Rd の構築図を示す。

【図１９】はプラスミドpGLDＰ31-RdT の構築図示す。

【図２０】はプラスミドpGLDＰ31-RcTの構築図を示す。

【図２１】はpGLD P25-Wの構築図を示す。

【図２２】はpPHO 3125の構築図を示す。

【図２３】はpGLD 2531の構築図を示す。

【図２４】はpGLD 25T31cTの構築図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/29 ＡＤＹ 9284−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (31)優先権主張番号 特願昭61−128918 (32)優先日 昭61(1986)６月２日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 藤井 朋子 大阪府豊中市緑丘３丁目25番９号

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質の
   トリプシン様プロテアーゼ感受性部位の少なくとも１ケ
   所を不感受性化せしめるように修飾したＢ型肝炎ウイル
   ス表面抗原活性および重合ヒト血清アルブミン結合能を
   有するＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
   ＤＮＡ。
2. 【請求項２】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質の
   Ｎ末端から４８番目のアルギニンまたはそれを含むペプ
   チド鎖を欠損あるいはアルギニンおよびリジン以外のア
   ミノ酸またはペプチド鎖に置換したＰ３１修飾蛋白質を
   コードするＤＮＡを含有する請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質の
   Ｎ末端から４８番目のアルギニンまたはそれを含むペプ
   チド鎖を欠損あるいはアルギニンおよびリジン以外のア
   ミノ酸またはペプチド鎖に置換し、さらにＢ型肝炎ウイ
   ルス表面抗原Ｐ３１蛋白質のＮ末端から１６番目と１８
   番目のアルギニンをアルギニンおよびリジン以外のアミ
   ノ酸に置換したＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを
   含有する請求項１記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質の
   Ｎ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖内で４８番目の
   アルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるいは
   アルギニンおよびリジン以外の１〜４個のアミノ酸に置
   換したＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
   請求項１記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質の
   Ｎ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖内で４８番目の
   アルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるいは
   ＴｒｐもしくはＰro−Ａsp−Ｐro−Ｇlyに置換したＰ３
   １修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有する請求項１記
   載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質の
   Ｎ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖内で４８番目の
   アルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるいは
   ＴｒｐもしくはＰro−Ａsp−Ｐro−Ｇlyに置換し、Ｐ３
   １蛋白質のＮ末端から１６番目および１８番目のアルギ
   ニンをグルタミンに置換したＰ３１修飾蛋白質をコード
   するＤＮＡを含有する請求項１記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質の
   Ｎ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖内で４８番目の
   アルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損させたＰ
   ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有する請求項１
   記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質の
   Ｎ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖を欠損させたＰ
   ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有する請求項１
   記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】adr 型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋
   白質のＮ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖を欠損さ
   せたＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有する請
   求項１記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】酵母プロモーターの直後にＰ３１修飾蛋
    白質をコードするＤＮＡを結合させた請求項１記載のＤ
    ＮＡ。
11. 【請求項１１】プラスミドｐＧＬＤ Ｐ３１−Ｒc また
    はプラスミドｐＧＬＤＰ３１−ＲcＴである請求項１記
    載のＤＮＡ。
12. 【請求項１２】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のトリプシン様プロテアーゼ感受性部位の少なくとも１
    ケ所を不感受性化せしめるように修飾したＢ型肝炎ウイ
    ルス表面抗原活性および重合ヒト血清アルブミン結合能
    を有するＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有す
    るＤＮＡを保持する形質転換体。
13. 【請求項１３】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のＮ末端から４８番目のアルギニンまたはそれを含むペ
    プチド鎖を欠損あるいはアルギニンおよびリジン以外の
    アミノ酸またはペプチド鎖に置換したＰ３１修飾蛋白質
    をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する請求項
    １２記載の形質転換体。
14. 【請求項１４】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のＮ末端から４８番目のアルギニンまたはそれを含むペ
    プチド鎖を欠損あるいはアルギニンおよびリジン以外の
    アミノ酸またはペプチド鎖に置換し、さらにＢ型肝炎ウ
    イルス表面抗原Ｐ３１蛋白質のＮ末端から１６番目と１
    ８番目のアルギニンをアルギニンおよびリジン以外のア
    ミノ酸に置換したＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡ
    を含有するＤＮＡを保持する請求項１２記載の形質転換
    体。
15. 【請求項１５】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のＮ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖内で４８番目
    のアルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるい
    はアルギニンおよびリジン以外の１〜４個のアミノ酸に
    置換したＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有す
    るＤＮＡを保持する請求項１２記載の形質転換体。
16. 【請求項１６】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のＮ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖内で４８番目
    のアルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるい
    はＴｒｐもしくはＰro−Ａsp−Ｐro−Ｇlyに置換したＰ
    ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを
    保持する請求項１２記載の形質転換体。
17. 【請求項１７】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のＮ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖内で４８番目
    のアルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損あるい
    はＴｒｐもしくはＰro−Ａsp−Ｐro−Ｇlyに置換し、Ｐ
    ３１蛋白質のＮ末端から１６番目および１８番目のアル
    ギニンをグルタミンに置換したＰ３１修飾蛋白質をコー
    ドするＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する請求項１２記
    載の形質転換体。
18. 【請求項１８】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のＮ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖内で４８番目
    のアルギニンまたはそれを含むペプチド鎖を欠損させた
    Ｐ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ
    を保持する請求項１２記載の形質転換体。
19. 【請求項１９】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のＮ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖を欠損させた
    Ｐ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ
    を保持する請求項１２記載の形質転換体。
20. 【請求項２０】adr 型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１
    蛋白質のＮ末端から４４〜４９番目のペプチド鎖を欠損
    させたＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
    ＤＮＡを保持する請求項１２記載の形質転換体。
21. 【請求項２１】宿主が酵母である請求項１２記載の形質
    転換体。
22. 【請求項２２】酵母プロモーターの直後にＰ３１修飾蛋
    白質をコードするＤＮＡを結合させたＤＮＡを保持する
    請求項１２記載の形質転換体。
23. 【請求項２３】サッカロミセス・セレビシェＡＨ２２Ｒ
    ^-／ｐＧＬＤ Ｐ３１−Ｒc またはサッカロミセス・セ
    レビシェＡＨ２２Ｒ^-／ｐＧＬＤ Ｐ３１−ＲcＴである
    請求項１２記載の形質転換体。
24. 【請求項２４】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のトリプシン様プロテアーゼ感受性部位の少なくとも１
    ケ所を不感受性化せしめるように修飾したＢ型肝炎ウイ
    ルス表面抗原活性および重合ヒト血清アルブミン結合能
    を有するＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡおよびＢ
    型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ２５蛋白質をコードするＤＮ
    Ａを保持する請求項１記載のＤＮＡ。
25. 【請求項２５】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のトリプシン様プロテアーゼ感受性部位の少なくとも１
    ケ所を不感受性化せしめるように修飾したＢ型肝炎ウイ
    ルス表面抗原活性および重合ヒト血清アルブミン結合能
    を有するＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡおよびＢ
    型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ２５蛋白質をコードするＤＮ
    Ａを含有するＤＮＡを保持する請求項１２記載の形質転
    換体。
26. 【請求項２６】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋白質
    のトリプシン様プロテアーゼ感受性部位の少なくとも１
    ケ所を不感受性化せしめるように修飾したＢ型肝炎ウイ
    ルス表面抗原活性および重合ヒト血清アルブミン結合能
    を有するＰ３１修飾蛋白質をコードするＤＮＡおよびＢ
    型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ２５蛋白質をコードするＤＮ
    Ａを含有するＤＮＡを保持する形型質転換体を培養する
    ことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原Ｐ３１蛋
    白質のトリプシン様プロテアーゼ感受性部位の少なくと
    も１ケ所を不感受性せしめるように修飾したＢ型肝炎ウ
    イルス表面抗原活性および重合ヒト血清アルブミン結合
    能を有するＰ３１修飾蛋白質およびＢ型肝炎ウイルス表
    面抗原Ｐ２５蛋白質の製造法。