JPH0655146B2 - シヤトルベクタ− - Google Patents
シヤトルベクタ−Info
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- JPH0655146B2 JPH0655146B2 JP60299363A JP29936385A JPH0655146B2 JP H0655146 B2 JPH0655146 B2 JP H0655146B2 JP 60299363 A JP60299363 A JP 60299363A JP 29936385 A JP29936385 A JP 29936385A JP H0655146 B2 JPH0655146 B2 JP H0655146B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はシャトルベクター、さらに詳しくは酵母の遺伝
子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制性酸性ホス
ファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホスファター
ゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺伝子とい
う）を担ってなる酵母と大腸菌の両方で増殖しうるシャ
トルベクターに関する。
子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制性酸性ホス
ファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホスファター
ゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺伝子とい
う）を担ってなる酵母と大腸菌の両方で増殖しうるシャ
トルベクターに関する。
従来技術 最近、遺伝子工学の研究が活発に行なわれており、各種
の組換えＤＮＡ、さらにそれによる形質転換体の調製が
なされている。それら組換えＤＮＡの調製に際しては、
特定の遺伝子を組込むためのベクターが用いられるが、
そのようなベクターとしては、ある種の微生物、例えば
大腸菌でのみ増殖しうるベクターのほか、２種以上の微
生物、例えば大腸菌と酵母、あるいは微生物（例えば大
腸菌）と動物細胞との双方で増殖しうるいわゆるシャト
ルベクターが用いられる。例えば、ごく最近において、
大腸菌と酵母の両方で増殖しうるシャトルベクターとし
て、インターフェロンの酵母による産生に使用されてい
るアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH1）のプロモーター
を利用したものが報告されており、これにＢ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原（以下、HBs抗原、HBsAgもしくは単にＳ
抗原という）の蛋白をコードする遺伝子を接続する方法
が採用されている（Nature，298巻、347〜350頁（22Jul
y，1982）を参照）。しかしながら、このＡＤＨ１プロ
モーターを担ったシャトルベクターを使用する方法で
は、それにHBs遺伝子を組込んで得られる組換えＤＮＡ
を用いた形質転換体では産生されるHBs蛋白の量が低
い。
の組換えＤＮＡ、さらにそれによる形質転換体の調製が
なされている。それら組換えＤＮＡの調製に際しては、
特定の遺伝子を組込むためのベクターが用いられるが、
そのようなベクターとしては、ある種の微生物、例えば
大腸菌でのみ増殖しうるベクターのほか、２種以上の微
生物、例えば大腸菌と酵母、あるいは微生物（例えば大
腸菌）と動物細胞との双方で増殖しうるいわゆるシャト
ルベクターが用いられる。例えば、ごく最近において、
大腸菌と酵母の両方で増殖しうるシャトルベクターとし
て、インターフェロンの酵母による産生に使用されてい
るアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH1）のプロモーター
を利用したものが報告されており、これにＢ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原（以下、HBs抗原、HBsAgもしくは単にＳ
抗原という）の蛋白をコードする遺伝子を接続する方法
が採用されている（Nature，298巻、347〜350頁（22Jul
y，1982）を参照）。しかしながら、このＡＤＨ１プロ
モーターを担ったシャトルベクターを使用する方法で
は、それにHBs遺伝子を組込んで得られる組換えＤＮＡ
を用いた形質転換体では産生されるHBs蛋白の量が低
い。
本発明者らは、各種の遺伝子を組込み、さらにそれを発
現させるための新しい大腸菌−酵母シャトルベクターを
得るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌の遺伝子と酵母
の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロ
モーターを担ったシャトルベクターが所望の特性を示
し、そのホスファターゼプロモーターの制御下に各種の
遺伝子を組込んで種々の組換えＤＮＡを調製し、さらに
その組換えＤＮＡを酵母に作用させることによって種々
の形質転換酵母が得られることを見い出し、特許出願し
ている。（特願昭５７−１４５０９３号）。
現させるための新しい大腸菌−酵母シャトルベクターを
得るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌の遺伝子と酵母
の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロ
モーターを担ったシャトルベクターが所望の特性を示
し、そのホスファターゼプロモーターの制御下に各種の
遺伝子を組込んで種々の組換えＤＮＡを調製し、さらに
その組換えＤＮＡを酵母に作用させることによって種々
の形質転換酵母が得られることを見い出し、特許出願し
ている。（特願昭５７−１４５０９３号）。
上記特許出願におけるシャトルベクターは、酵母側の遺
伝子としてars1（酵母の自律増殖に必要なＤＮＡ配
列）、２μori（２μｍＤＮＡの複製に必要なＤＮＡ配
列）およびLeu2（ロイシン耐性遺伝子）を有する酵母Ｄ
ＮＡと大腸菌プラスミドpBR322とを組合せたシャトルベ
クターpAT77およびそれをエキソヌクレアーゼＢＡＬ３
１で処理してその酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部
または全部もしくはさらに上流の種々の部分（通常＋１
〜−100bp）まで除去したもの、例えば、−33bpまで除
去したシャトルベクターpAM82が含まれている。このシ
ャトルベクターpAM82の構造は、第１図に示すとおりで
あって、太線部分は大腸菌プラスミドpBR322由来の遺伝
子、残部は酵母の遺伝子である。
伝子としてars1（酵母の自律増殖に必要なＤＮＡ配
列）、２μori（２μｍＤＮＡの複製に必要なＤＮＡ配
列）およびLeu2（ロイシン耐性遺伝子）を有する酵母Ｄ
ＮＡと大腸菌プラスミドpBR322とを組合せたシャトルベ
クターpAT77およびそれをエキソヌクレアーゼＢＡＬ３
１で処理してその酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部
または全部もしくはさらに上流の種々の部分（通常＋１
〜−100bp）まで除去したもの、例えば、−33bpまで除
去したシャトルベクターpAM82が含まれている。このシ
ャトルベクターpAM82の構造は、第１図に示すとおりで
あって、太線部分は大腸菌プラスミドpBR322由来の遺伝
子、残部は酵母の遺伝子である。
発明の目的 上記のようなシャトルベクターpAM82は、酵母の酸性ホ
スファターゼプロモーター下流に大腸菌pBR322由来の遺
伝子が第１図に示される向きに組込まれている。本発明
者らは、このシャトルベクターpAM82についてさらに研
究を重ねるうちに、酸性ホスファターゼプロモーター下
流領域のpBR322由来の遺伝子部分が、酸性ホスファター
ゼプロモーターと逆向きのプロモーター活性を酵母菌体
内で示すことを見いだした。
スファターゼプロモーター下流に大腸菌pBR322由来の遺
伝子が第１図に示される向きに組込まれている。本発明
者らは、このシャトルベクターpAM82についてさらに研
究を重ねるうちに、酸性ホスファターゼプロモーター下
流領域のpBR322由来の遺伝子部分が、酸性ホスファター
ゼプロモーターと逆向きのプロモーター活性を酵母菌体
内で示すことを見いだした。
すなわち、このシャトルベクターを用いて所望の遺伝子
を発現させようとした場合、このシャトルベクターの酸
性ホスファターゼプロモーター下流に目的とする遺伝子
を挿入すると上記の逆向きのプロモーター活性の影響に
よって、目的とする遺伝子の発現効率が悪くなることを
知った。そこで、さらに研究を重ね、上記シャトルベク
ターpAM82を適当な制限酵素で処理することで、その酸
性ホスファターゼプロモーター下流領域の大腸菌由来の
遺伝子を一部分取除くことによって、この領域由来の該
逆向きプロモーター活性を抑え、より遺伝子発現効率の
高いシャトルベクターが得られることを知り、本発明を
完成させるに至った。
を発現させようとした場合、このシャトルベクターの酸
性ホスファターゼプロモーター下流に目的とする遺伝子
を挿入すると上記の逆向きのプロモーター活性の影響に
よって、目的とする遺伝子の発現効率が悪くなることを
知った。そこで、さらに研究を重ね、上記シャトルベク
ターpAM82を適当な制限酵素で処理することで、その酸
性ホスファターゼプロモーター下流領域の大腸菌由来の
遺伝子を一部分取除くことによって、この領域由来の該
逆向きプロモーター活性を抑え、より遺伝子発現効率の
高いシャトルベクターが得られることを知り、本発明を
完成させるに至った。
すなわち、本発明は、酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子を
含み、かつ酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモータ
ーを担い、かつ酸性ホスファターゼプロモーターの下流
領域の一部を除去し、より遺伝子発現効率の高いシャト
ルベクターを提供するものである。
含み、かつ酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモータ
ーを担い、かつ酸性ホスファターゼプロモーターの下流
領域の一部を除去し、より遺伝子発現効率の高いシャト
ルベクターを提供するものである。
発明の構成および効果 本発明のシャトルベクターは、酵母と大腸菌の両方の遺
伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモー
ターを有し、該酸性ホスファターゼプロモーターの下流
領域の一部を除去してなることを特徴とし、このプラス
ミドベクターは酵母と大腸菌との両方で増殖することが
でき、これを用いて組換えＤＮＡ、さらに形質転換酵母
を調製する場合に、大腸菌を用いて組換えプラスミドを
調製し、これを酵母の形質転換に利用し、該形質転換酵
母の増殖によって所望の遺伝子産物の量産を図ることが
できる。なお、この場合、酵母の形質転換を行なう段階
では大腸菌の遺伝子は除去されてもかまわない。
伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモー
ターを有し、該酸性ホスファターゼプロモーターの下流
領域の一部を除去してなることを特徴とし、このプラス
ミドベクターは酵母と大腸菌との両方で増殖することが
でき、これを用いて組換えＤＮＡ、さらに形質転換酵母
を調製する場合に、大腸菌を用いて組換えプラスミドを
調製し、これを酵母の形質転換に利用し、該形質転換酵
母の増殖によって所望の遺伝子産物の量産を図ることが
できる。なお、この場合、酵母の形質転換を行なう段階
では大腸菌の遺伝子は除去されてもかまわない。
本発明のシャトルベクターにおける酵母の遺伝子として
は、一般に、プラスミドが酵母中で染色体と独立して増
殖するのに必要なＤＮＡ配列、例えば、ars1と２μori
があり、所望により、さらに形質転換酵母の選択マーカ
ーとなる遺伝子が含まれる。この選択マーカーとして
は、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生遺伝子、トリ
プトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子、アデニン
産生遺伝子などが含まれ、これらの１種または２種以上
が用いられる。
は、一般に、プラスミドが酵母中で染色体と独立して増
殖するのに必要なＤＮＡ配列、例えば、ars1と２μori
があり、所望により、さらに形質転換酵母の選択マーカ
ーとなる遺伝子が含まれる。この選択マーカーとして
は、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生遺伝子、トリ
プトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子、アデニン
産生遺伝子などが含まれ、これらの１種または２種以上
が用いられる。
大腸菌側の遺伝子としては、大腸菌体内においてプラス
ミドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、例えばCol E
I系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好ま
しくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺伝
子を含む。この選択マーカーの遺伝としてはアンピシリ
ン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイク
リン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子など
が挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種以上が用
いられる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアンピシリン
耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するpBR3
22が一般に汎用されている。
ミドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、例えばCol E
I系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好ま
しくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺伝
子を含む。この選択マーカーの遺伝としてはアンピシリ
ン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイク
リン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子など
が挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種以上が用
いられる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアンピシリン
耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するpBR3
22が一般に汎用されている。
本発明のシャトルベクターは酵母の抑制性酸性ホスファ
ターゼプロモーターを担っていることが特徴であり、こ
の酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスファター
ゼを構成する60,000ダルトンのポリペプチド(p60)のプ
ロモーターである。
ターゼプロモーターを担っていることが特徴であり、こ
の酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスファター
ゼを構成する60,000ダルトンのポリペプチド(p60)のプ
ロモーターである。
本発明のシャトルベクターは、前記シャトルベクターpA
M82（特許昭57−145093号、第１図参照）を適当な制限
酵素、例えばPvu IIで処理し、この部位にBam H Iリン
カーを付加して再び環状プラスミドに戻すことにより得
られる。このシャトルベクターをpONY1と称する（第２
図参照）。同様にPvu IIのかわりにTth111 I、Sna I、N
de I部位を各々BamH I部位に変換したシャトルベクター
を各々pONY2、pONY3、pONY4と称する（第３〜５図参
照）。
M82（特許昭57−145093号、第１図参照）を適当な制限
酵素、例えばPvu IIで処理し、この部位にBam H Iリン
カーを付加して再び環状プラスミドに戻すことにより得
られる。このシャトルベクターをpONY1と称する（第２
図参照）。同様にPvu IIのかわりにTth111 I、Sna I、N
de I部位を各々BamH I部位に変換したシャトルベクター
を各々pONY2、pONY3、pONY4と称する（第３〜５図参
照）。
本発明のシャトルベクターpONY1〜４は、通常の制限酵
素、Xho IおよびBam H Iで処理して容易に開裂させるこ
とができ、その部位に種々の遺伝子を組込むことによ
り、各種の組換えプラスミドを調製することができ、そ
れをさらに酵母に作用させて種々の形質転換酵母が得ら
れるため遺伝子工学の分野において広範囲の利用が図れ
るものであって産業上利用価値がきわめて高い。例え
ば、本発明のシャトルベクターにHBs遺伝子を組込んで
得られる組換えプラスミドを酵母に作用させて調製され
る形質転換酵母は、培養によって大量のHBs抗原を産生
することができ、しかも、かかるHBs抗原は免疫学的に
ヒト血清から得られるものと全く同一であるため、Ｂ型
肝炎ウイルスワクチン用素材として有用である。
素、Xho IおよびBam H Iで処理して容易に開裂させるこ
とができ、その部位に種々の遺伝子を組込むことによ
り、各種の組換えプラスミドを調製することができ、そ
れをさらに酵母に作用させて種々の形質転換酵母が得ら
れるため遺伝子工学の分野において広範囲の利用が図れ
るものであって産業上利用価値がきわめて高い。例え
ば、本発明のシャトルベクターにHBs遺伝子を組込んで
得られる組換えプラスミドを酵母に作用させて調製され
る形質転換酵母は、培養によって大量のHBs抗原を産生
することができ、しかも、かかるHBs抗原は免疫学的に
ヒト血清から得られるものと全く同一であるため、Ｂ型
肝炎ウイルスワクチン用素材として有用である。
つぎに実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。
的に説明する。
実施例 (1)シャトルベクターpAM82の調製 酵母S288C DNAバンクより得られた抑制性酸性ホスファ
ターゼを構成する60,000ダルトンのポリペプチド（p6
0）の遺伝子を含む約8000ヌクレオチド対（8Kb）の制限
酵素EcoR I断片を大腸菌プラスミドpBR322のEcoR I部位
に挿入して得られるプラスミドを出発材料とし、これを
制限酵素Sal Iで切断し、さらにT4DNAリガーゼにより再
アニールさせてpBR322のSal I部位から酸性ホスファタ
ーゼ遺伝子断片の5.2Kb側を失なったプラスミドpAT25
（これはpBR322のアンピシリン耐性遺伝子を含むEcoR I
部位からSal I部位までの約3.7Kbの断片と酵母菌の酸性
ホスファターゼ遺伝子のEcoR I部位からSal I部位まで
の約2.8Kbの断片がそれぞれ対応する末端同士で結合し
たプラスミドである）を得る。
ターゼを構成する60,000ダルトンのポリペプチド（p6
0）の遺伝子を含む約8000ヌクレオチド対（8Kb）の制限
酵素EcoR I断片を大腸菌プラスミドpBR322のEcoR I部位
に挿入して得られるプラスミドを出発材料とし、これを
制限酵素Sal Iで切断し、さらにT4DNAリガーゼにより再
アニールさせてpBR322のSal I部位から酸性ホスファタ
ーゼ遺伝子断片の5.2Kb側を失なったプラスミドpAT25
（これはpBR322のアンピシリン耐性遺伝子を含むEcoR I
部位からSal I部位までの約3.7Kbの断片と酵母菌の酸性
ホスファターゼ遺伝子のEcoR I部位からSal I部位まで
の約2.8Kbの断片がそれぞれ対応する末端同士で結合し
たプラスミドである）を得る。
つぎに、このpAT25のEcoR I部位に、プラスミドYRP7をE
coR I処理することによって得られるars1およびTrp1遺
伝子を含む1.4KbのEcoR I断片を挿入してプラスミドpAT
26を得る。（このars1−Trp1を含む断片は、そのTrp1遺
伝子内に制限酵素Hind IIIの認識部位を１個有する）。
coR I処理することによって得られるars1およびTrp1遺
伝子を含む1.4KbのEcoR I断片を挿入してプラスミドpAT
26を得る。（このars1−Trp1を含む断片は、そのTrp1遺
伝子内に制限酵素Hind IIIの認識部位を１個有する）。
上記pAT26のHind III部位に、プラスミドpSLE1をHind I
IIで処理して得られる酵母のLeu2および２μoriを含むH
ind III断片を挿入してシャトルベクターpAT77を得る。
IIで処理して得られる酵母のLeu2および２μoriを含むH
ind III断片を挿入してシャトルベクターpAT77を得る。
上記の方法で得られたpAT77（１μｇ）をSal Iで開裂し
たのち、20mMトリス−HCl(pH8.2)、12mMCaCl2、12mM Mg
Cl2、0.2M NaCl、1mM EDTA溶液50μ中で0.1Ｕのエキ
ソヌクレアーゼBAL31を30秒〜１分間作用させる。つい
でフェノール抽出、エタノール沈殿を行なったのち、Xh
o Iリンカー１ピコモルとT4DNAリガーゼの反応条件下で
１２時間結合を行なう。この反応溶液で大腸菌χ1776を
形質転換し、得られたアンピシリン耐性の形質転換体よ
りプラスミドDNAを調製し、各DNAについてマキサム・ギ
ルバートの方法（Maxam,A. ＆ Gilbert,W.pro.N.A.
S.,74,560〜564を参照）に従い、塩基配列を調べ、BAL3
1処理により除去された酸性ホスファターゼ遺伝子領域
を決定する。これら中からホスファターゼ構造遺伝子領
域が完全に除去されたプラスミドpAM82を得る。なお、
このpAM82をサッカロミセス・セレビシエAH22に組込ん
だものは、サッカロミセス・セレビシエAH22／pAM82
（微工研条寄第313号）として寄託している。
たのち、20mMトリス−HCl(pH8.2)、12mMCaCl2、12mM Mg
Cl2、0.2M NaCl、1mM EDTA溶液50μ中で0.1Ｕのエキ
ソヌクレアーゼBAL31を30秒〜１分間作用させる。つい
でフェノール抽出、エタノール沈殿を行なったのち、Xh
o Iリンカー１ピコモルとT4DNAリガーゼの反応条件下で
１２時間結合を行なう。この反応溶液で大腸菌χ1776を
形質転換し、得られたアンピシリン耐性の形質転換体よ
りプラスミドDNAを調製し、各DNAについてマキサム・ギ
ルバートの方法（Maxam,A. ＆ Gilbert,W.pro.N.A.
S.,74,560〜564を参照）に従い、塩基配列を調べ、BAL3
1処理により除去された酸性ホスファターゼ遺伝子領域
を決定する。これら中からホスファターゼ構造遺伝子領
域が完全に除去されたプラスミドpAM82を得る。なお、
このpAM82をサッカロミセス・セレビシエAH22に組込ん
だものは、サッカロミセス・セレビシエAH22／pAM82
（微工研条寄第313号）として寄託している。
(2)シャトルベクターpONY1の調製 上記で得られたプラスミドpAM82（１μｇ）をPvu IIで
開裂したのち、67mMトリス−HCl(pH8.8)、7.7mM MgC
l2、10mM2−メルカプトエタノール、6.7μMEDTA、16.6m
M(NH4)2SO4、330μＭ dCTP、dATP、dGTP、dTTP、50μ
中でT4DNAポリメラーゼ（1U）を37℃、30分間反応さ
せる。ついでフェノール抽出、エタノール沈殿を行なっ
たのち、Bam H Iリンカー1pmolとT4DNAリガーゼの反応
条件下で１２時間結合反応を行なわせる。この反応溶液
で大腸菌χ1776を形質転換し、得られたアンピシリン耐
性の形質転換体よりプラスミドDNAを調製し、制限酵素X
ho I及びBam H Iにより切断パターンを分析した結果、
第２図に示すようなpONY1が得られる。
開裂したのち、67mMトリス−HCl(pH8.8)、7.7mM MgC
l2、10mM2−メルカプトエタノール、6.7μMEDTA、16.6m
M(NH4)2SO4、330μＭ dCTP、dATP、dGTP、dTTP、50μ
中でT4DNAポリメラーゼ（1U）を37℃、30分間反応さ
せる。ついでフェノール抽出、エタノール沈殿を行なっ
たのち、Bam H Iリンカー1pmolとT4DNAリガーゼの反応
条件下で１２時間結合反応を行なわせる。この反応溶液
で大腸菌χ1776を形質転換し、得られたアンピシリン耐
性の形質転換体よりプラスミドDNAを調製し、制限酵素X
ho I及びBam H Iにより切断パターンを分析した結果、
第２図に示すようなpONY1が得られる。
つぎに、上記の方法で得られたシャトルベクターpONY1
を用い、これにHBVDNAを組込む場合を参考例として示
す。
を用い、これにHBVDNAを組込む場合を参考例として示
す。
参考例 (1)HBVDNAの調製 (i)ウイルスDNAＮＯ調製 HBs Ag陽性かつHBe Ag陽性の供血者（血清型adr）から
ヒト血漿１０人分のプール700mlを5,000rpmで２０分間
遠心分離し、不溶物を除去する。これを４℃にて18,000
rpmで８時間遠心分離し、得られた沈査を緩衡液（10mM
トリス−HCl、0.1M NaCl、1mM EDTA；pH7.5）１０mlに
再溶解させ、30％の庶糖を含有する遠沈管の頂部に重層
させる。これを４℃にて39,000rpmで４時間遠心分離
し、得られた沈査を上記と同じ緩衡液に再溶解させる。
ヒト血漿１０人分のプール700mlを5,000rpmで２０分間
遠心分離し、不溶物を除去する。これを４℃にて18,000
rpmで８時間遠心分離し、得られた沈査を緩衡液（10mM
トリス−HCl、0.1M NaCl、1mM EDTA；pH7.5）１０mlに
再溶解させ、30％の庶糖を含有する遠沈管の頂部に重層
させる。これを４℃にて39,000rpmで４時間遠心分離
し、得られた沈査を上記と同じ緩衡液に再溶解させる。
ついで、のちの操作を容易にするために、HBVのもつDNA
ポリメラーゼによる反応を、67mMトリス−HCl(pH7.5)、
80mM NH4Cl、25mM MgCl2、0.5％（w/v％、以下同じ）タ
ージトールＮＰ−40、0.1％２−メルカプトエタノー
ル、330μＭのdCTP（デオキシシチジントリホスフェー
ト）、dGTP（デオキシグアノシントリホスフェート）、
dATP（デオキシアデノシントリホスフェート）、0.5μ
Ｍα・〔32P〕dTTP（デオキシチアミントリホスフェー
ト）の混合液500μ中で37℃にて30分間行なう。これ
にさらにdTTPを最終濃度330μＭになるように加え、37
℃で３時間反応させ、これに同容量の100mM EDTA溶液を
加える。このDNAポリメラーゼ反応より、DNA中の一本鎖
部分が修復され、〔32P〕ラベル化された材料を得、こ
れを庶糖の30％、20％および10％水溶液を段階的に重層
した遠心管の頂部に重層し、４℃にて39,000rpmで4.5時
間遠心分離する。
ポリメラーゼによる反応を、67mMトリス−HCl(pH7.5)、
80mM NH4Cl、25mM MgCl2、0.5％（w/v％、以下同じ）タ
ージトールＮＰ−40、0.1％２−メルカプトエタノー
ル、330μＭのdCTP（デオキシシチジントリホスフェー
ト）、dGTP（デオキシグアノシントリホスフェート）、
dATP（デオキシアデノシントリホスフェート）、0.5μ
Ｍα・〔32P〕dTTP（デオキシチアミントリホスフェー
ト）の混合液500μ中で37℃にて30分間行なう。これ
にさらにdTTPを最終濃度330μＭになるように加え、37
℃で３時間反応させ、これに同容量の100mM EDTA溶液を
加える。このDNAポリメラーゼ反応より、DNA中の一本鎖
部分が修復され、〔32P〕ラベル化された材料を得、こ
れを庶糖の30％、20％および10％水溶液を段階的に重層
した遠心管の頂部に重層し、４℃にて39,000rpmで4.5時
間遠心分離する。
ついで、DNAに強く結合している蛋白質を消化するため
に、上記で得られた沈査を1mg／mlプロナーゼＥおよび
0.2％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液200μ中で37℃
にて２時間処理したのち、DNAをフェノール200μで２
回抽出し、ついでエーテルで振ってフェノール溶媒を除
去するとHBVDNA溶液を得る。このDNAは2.5×106cpm／μ
ｇの比放射活性を示し、制限酵素消化に充分使用し得
る。
に、上記で得られた沈査を1mg／mlプロナーゼＥおよび
0.2％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液200μ中で37℃
にて２時間処理したのち、DNAをフェノール200μで２
回抽出し、ついでエーテルで振ってフェノール溶媒を除
去するとHBVDNA溶液を得る。このDNAは2.5×106cpm／μ
ｇの比放射活性を示し、制限酵素消化に充分使用し得
る。
(ii)HBVDNAのクローン化 前記の方法で調製された環状二本鎖のHBVDNAを、下記の
ようにしてまずλファージシャロン16ADNAをベクターと
してクローン化し、さらに公知のプラスミドpACYC177を
ベクターとして再クローン化を行なう。
ようにしてまずλファージシャロン16ADNAをベクターと
してクローン化し、さらに公知のプラスミドpACYC177を
ベクターとして再クローン化を行なう。
(A)λファージシャロン16A宿主−ベクター系によるクロ
ーン化： HBVDNA20ngを10mMトリス−HCl(pH7.4)、7mM MgCl2、100
mM NaCl、7mM 2−メルカプトエタノールの混液20μ中
にて制限エンドヌクレアーゼXho Iにより37℃にて２時
間処理したのち、フェノール200μにて抽出し、抽出
液をエーテルで洗浄し、その水層に２倍容量の冷エタノ
ールを加えてDNAを沈殿させる。この混液を−70℃で１
時間保持したのち10,000rpmにて５分間遠心分離して沈
殿するDNAを回収する。分離した沈査を10mMトリス−HCl
(pH7.4)および1mM EDTAの混液５μに溶解させる。つ
いで、このHBVDNAと等モル量の前記と同様にして制限酵
素Xho Iにより開裂されたλファージシャロン16ADNA（X
ho I認識部位を１個所有する）とをT4DNAリガーゼ（50m
Mトリス−HCl(pH7.4)、10mM MgCl2、10mMジチオスレイ
トール、100μｇ／ml牛血清アルブミン、0.5mM ATPおよ
び0.5μ酵素調製物との混液）10μを用いて４℃で1
8時間反応させ、この反応混合液を前記と同様にしてフ
ェノール抽出、エーテル処理およびエタノール沈殿に付
し、得られた沈査を10mMトリス−HCl(pH7.4)および1mM
EDTA混液10μ中に溶解させる。
ーン化： HBVDNA20ngを10mMトリス−HCl(pH7.4)、7mM MgCl2、100
mM NaCl、7mM 2−メルカプトエタノールの混液20μ中
にて制限エンドヌクレアーゼXho Iにより37℃にて２時
間処理したのち、フェノール200μにて抽出し、抽出
液をエーテルで洗浄し、その水層に２倍容量の冷エタノ
ールを加えてDNAを沈殿させる。この混液を−70℃で１
時間保持したのち10,000rpmにて５分間遠心分離して沈
殿するDNAを回収する。分離した沈査を10mMトリス−HCl
(pH7.4)および1mM EDTAの混液５μに溶解させる。つ
いで、このHBVDNAと等モル量の前記と同様にして制限酵
素Xho Iにより開裂されたλファージシャロン16ADNA（X
ho I認識部位を１個所有する）とをT4DNAリガーゼ（50m
Mトリス−HCl(pH7.4)、10mM MgCl2、10mMジチオスレイ
トール、100μｇ／ml牛血清アルブミン、0.5mM ATPおよ
び0.5μ酵素調製物との混液）10μを用いて４℃で1
8時間反応させ、この反応混合液を前記と同様にしてフ
ェノール抽出、エーテル処理およびエタノール沈殿に付
し、得られた沈査を10mMトリス−HCl(pH7.4)および1mM
EDTA混液10μ中に溶解させる。
上記のようにしてアニールさせたDNAより、in vitroパ
ッケージング操作（Methods in Enzymology、68巻、299
〜309を参照）によりλファージを形成させ、さらに大
腸菌DP50supFを指示菌としてＬ−寒天平板（23cm×23c
m）上に〜104個のプラークを形成させる。これらのプラ
ークのうちからHBVDNAを維持しているファージにより形
成されたプラークを選び出すために、前記で調製した32
P−ラベルされたHBVDNAをプローブとしてプラークハイ
ブリダイゼーションを行ない（Science、196巻、180
頁、1977を参照）、目的とするファージを複数分離す
る。
ッケージング操作（Methods in Enzymology、68巻、299
〜309を参照）によりλファージを形成させ、さらに大
腸菌DP50supFを指示菌としてＬ−寒天平板（23cm×23c
m）上に〜104個のプラークを形成させる。これらのプラ
ークのうちからHBVDNAを維持しているファージにより形
成されたプラークを選び出すために、前記で調製した32
P−ラベルされたHBVDNAをプローブとしてプラークハイ
ブリダイゼーションを行ない（Science、196巻、180
頁、1977を参照）、目的とするファージを複数分離す
る。
(B)プラスミドpACYC177をベクターとした再クローン
化： 上記(A)で得られたHBVDNAを保持するファージについて
「生化学実験構座、核酸の化学Ｉ」54〜65頁に記載され
る方法に従い、大腸菌DP50supFを感染菌としてファージ
DNAを調製する。得られたDNAを前記の制限酵Xho Iの反
応条件下で２時間消化したのち、この反応液を0.75％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、分離した3.2KbのHBVDNA
をDEAE紙（東洋紙製）に吸着させてベクターDNAと分
離し、ついで1M NaCl溶液にて溶出し、両端がXho I末端
となったHBVDNAを得る。
化： 上記(A)で得られたHBVDNAを保持するファージについて
「生化学実験構座、核酸の化学Ｉ」54〜65頁に記載され
る方法に従い、大腸菌DP50supFを感染菌としてファージ
DNAを調製する。得られたDNAを前記の制限酵Xho Iの反
応条件下で２時間消化したのち、この反応液を0.75％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、分離した3.2KbのHBVDNA
をDEAE紙（東洋紙製）に吸着させてベクターDNAと分
離し、ついで1M NaCl溶液にて溶出し、両端がXho I末端
となったHBVDNAを得る。
つぎにプラスミドpACYC177「Chang,A.C.Y.,Cohen,S.N.,
J.Bacleriol.,134,1141〜1156(1978)」（このものはXho
I切断部位を１個所有し、それはカナマイシン耐性遺伝
子の中に存在する）を同様にXho Iにて消化し、その生
成物をフェノール抽出、エーテル処理およびエタノール
沈殿により精製する。ついで、Xho I開裂されたpACYC17
7とXho I末端−HBVDNAとを分子比１：５で混合し、前記
T4DNAリガーゼの反応条件下に18時間アニールさせる。
J.Bacleriol.,134,1141〜1156(1978)」（このものはXho
I切断部位を１個所有し、それはカナマイシン耐性遺伝
子の中に存在する）を同様にXho Iにて消化し、その生
成物をフェノール抽出、エーテル処理およびエタノール
沈殿により精製する。ついで、Xho I開裂されたpACYC17
7とXho I末端−HBVDNAとを分子比１：５で混合し、前記
T4DNAリガーゼの反応条件下に18時間アニールさせる。
大腸菌χ1776の培養液を高木康敬編著「遺伝子操作実験
法」第161項に記載の方法で調製された菌液0.1mlに、上
記アニールされたDNA調製物10μを加えてよく混合さ
せ、０℃で25分間放置したのち、アンピシリン（20μｇ
／ml）、α−ビオチン（１μｇ／ml）、ジアミノピメリ
ン酸（100μｇ／ml）、チシン（20μｇ／ml）を含有す
るＬ−寒天プレート上に塗抹して37℃で一夜培養する。
出現したコロニーについて、カナマイシン（20μｇ／m
l）を含む寒天プレートとアンピシリン（20μｇ／ml）
を含む寒天プレートにそれぞれ対応させて塗抹し、アン
ピシリンを含むプレートでのみ増殖したコロニーを選択
する。
法」第161項に記載の方法で調製された菌液0.1mlに、上
記アニールされたDNA調製物10μを加えてよく混合さ
せ、０℃で25分間放置したのち、アンピシリン（20μｇ
／ml）、α−ビオチン（１μｇ／ml）、ジアミノピメリ
ン酸（100μｇ／ml）、チシン（20μｇ／ml）を含有す
るＬ−寒天プレート上に塗抹して37℃で一夜培養する。
出現したコロニーについて、カナマイシン（20μｇ／m
l）を含む寒天プレートとアンピシリン（20μｇ／ml）
を含む寒天プレートにそれぞれ対応させて塗抹し、アン
ピシリンを含むプレートでのみ増殖したコロニーを選択
する。
pACYC177はアンピシリン耐性遺伝子とカナマイシン耐性
遺伝子を有するが、カナマイシン耐性遺伝子中にあるXh
o I部位にHBVDNAが挿入されることによりカナマイシン
耐性が消失される。すなわち、選択されたコロニーはpA
CYC177−HBVDNAの組換えDNAを保持している。得られた
コロニー数個について、「代謝」第17巻、第４「リパー
ゼ」第81〜89頁（1980）に記載される方法に従いプラス
ミドを調製する。得られたプラスミドをpHBVと称す。こ
のpHBVを制限酵素Xho Iで処理すると3.2Kbの全HBVDNAフ
ラグメントが得られ、またXho IとBam H Iで処理すると
HBs Ag遺伝子を含む約1.3Kbのフラグメントが得られ
る。
遺伝子を有するが、カナマイシン耐性遺伝子中にあるXh
o I部位にHBVDNAが挿入されることによりカナマイシン
耐性が消失される。すなわち、選択されたコロニーはpA
CYC177−HBVDNAの組換えDNAを保持している。得られた
コロニー数個について、「代謝」第17巻、第４「リパー
ゼ」第81〜89頁（1980）に記載される方法に従いプラス
ミドを調製する。得られたプラスミドをpHBVと称す。こ
のpHBVを制限酵素Xho Iで処理すると3.2Kbの全HBVDNAフ
ラグメントが得られ、またXho IとBam H Iで処理すると
HBs Ag遺伝子を含む約1.3Kbのフラグメントが得られ
る。
(2)HBs Ag遺伝子発現プラスミドの調製 プラスミドpHBVをBam H Iで処理して切断し、そのHBs A
g遺伝子フラグメント３μｇに対し、200μＭのαATP、
αCTP、αTTPおよびαGTPを含む67mMトリス−HCl(pH8.
6)、6.7mM MgCl2、10mM2−メルカプトエタノール、6.7
μM EDTA、16.7mM AmSO4溶液100μ中で、T4DNAポリメ
ラーゼ0.2Uを30分間作用させ、Bam H I切断末端を埋め
る。ついでフェノール抽出、エタノール沈殿を行なった
のち、これとXho Iリンカーとを１：10の分子比でT4DNA
リガーゼによる結合反応を行なう。フェノール抽出、エ
タノール沈殿ののち、これをさらにXho Iで処理すると
両端がXho I切断末端となった約1.3KbのHBs Ag遺伝子フ
ラグメントが得られる。このフラグメントとXho Iで開
裂されたシャトルベクターpONY1とを分子比５：１にてT
4DNAリガーゼによりアニールさせたのち、この反応液で
大腸菌χ1776を形質転換してプラスミドDNAを調製す
る。得られたプラスミドは、ベクターpONY1のホスファ
ターゼプロモーターの下流にHBs Ag遺伝子が正しい向き
に挿入されたものであり、これをpONY−S1と称する。
g遺伝子フラグメント３μｇに対し、200μＭのαATP、
αCTP、αTTPおよびαGTPを含む67mMトリス−HCl(pH8.
6)、6.7mM MgCl2、10mM2−メルカプトエタノール、6.7
μM EDTA、16.7mM AmSO4溶液100μ中で、T4DNAポリメ
ラーゼ0.2Uを30分間作用させ、Bam H I切断末端を埋め
る。ついでフェノール抽出、エタノール沈殿を行なった
のち、これとXho Iリンカーとを１：10の分子比でT4DNA
リガーゼによる結合反応を行なう。フェノール抽出、エ
タノール沈殿ののち、これをさらにXho Iで処理すると
両端がXho I切断末端となった約1.3KbのHBs Ag遺伝子フ
ラグメントが得られる。このフラグメントとXho Iで開
裂されたシャトルベクターpONY1とを分子比５：１にてT
4DNAリガーゼによりアニールさせたのち、この反応液で
大腸菌χ1776を形質転換してプラスミドDNAを調製す
る。得られたプラスミドは、ベクターpONY1のホスファ
ターゼプロモーターの下流にHBs Ag遺伝子が正しい向き
に挿入されたものであり、これをpONY−S1と称する。
(3)形質転換酵母の調製 酵母としてサッカロミセス・セレビシエAH22〔a leu2 h
is4 can1(Cir+)〕（微工研条寄第312号）を用い、これ
をYPD培地（２％ポリペプトン、１％イーストエキス、
２％グルコース）100mlに接種し、30℃で一晩培養した
のち、遠心して集菌する。滅菌水20mlにて菌体を洗浄
し、ついで1.2Mソルビトールおよび100μｇ／mlチモリ
アーゼ60,000〔生化学工業製〕の溶液５mlに懸濁させ、
30℃で約30分間保ち、スフェロプラスト化する。つい
で、スフェロプラストを1.2Mソルビトール溶液で３回洗
浄したのち、２Ｍソルビトール、10mM CaCl2および10mM
トリス−HCl(pH7.5)の溶液0.6mlに懸濁させ、その60μ
ずつを小試験管に分注する。これに前記(3)で調製し
た組換えプラスミドpONY−S1 5μｇを加え、充分混合
し、さらに0.1M CaCl2（３μ）を加えて最終濃度10mM
CaCl2とし、室温に５〜10分間放置する。ついでこれ
に、20％ポリエチレングリコール4000、10mM CaCl2およ
び10mMトリス−HCl(pH7.5)溶液１mlずつを加えて混合
し、室温に約20分間放置する。この混合液0.2mlずつを4
5℃に保温された再生培地（22％ソルビトール、２％グ
ルコース、0.7％イーストニトロゲンベースアミノ酸、
２％YPD、20μｇ／mlヒスチジン、３％寒天）10mlに加
え、軽く混合させ、予め準備された1.2Mソルビトール含
有最小培地（0.7％イーストニトロゲンベースアミノ
酸、２％グルコース、20μｇ／mlヒスチジン、２％寒
天）プレートに重層し、固化させたのち、30℃で培養し
てロイシン非要求性酵母のコロニーを得る。このコロニ
ーを20μｇ／mlヒスチジンを含むバルクホルダーミニマ
ルメディウム（Tohe,A.et al；J.Bachterol.,113,727〜
738(1973)を参照〕にて培養して形質転換酵母サッカロ
ミセス・セレビシエYPONY S1を得る。
is4 can1(Cir+)〕（微工研条寄第312号）を用い、これ
をYPD培地（２％ポリペプトン、１％イーストエキス、
２％グルコース）100mlに接種し、30℃で一晩培養した
のち、遠心して集菌する。滅菌水20mlにて菌体を洗浄
し、ついで1.2Mソルビトールおよび100μｇ／mlチモリ
アーゼ60,000〔生化学工業製〕の溶液５mlに懸濁させ、
30℃で約30分間保ち、スフェロプラスト化する。つい
で、スフェロプラストを1.2Mソルビトール溶液で３回洗
浄したのち、２Ｍソルビトール、10mM CaCl2および10mM
トリス−HCl(pH7.5)の溶液0.6mlに懸濁させ、その60μ
ずつを小試験管に分注する。これに前記(3)で調製し
た組換えプラスミドpONY−S1 5μｇを加え、充分混合
し、さらに0.1M CaCl2（３μ）を加えて最終濃度10mM
CaCl2とし、室温に５〜10分間放置する。ついでこれ
に、20％ポリエチレングリコール4000、10mM CaCl2およ
び10mMトリス−HCl(pH7.5)溶液１mlずつを加えて混合
し、室温に約20分間放置する。この混合液0.2mlずつを4
5℃に保温された再生培地（22％ソルビトール、２％グ
ルコース、0.7％イーストニトロゲンベースアミノ酸、
２％YPD、20μｇ／mlヒスチジン、３％寒天）10mlに加
え、軽く混合させ、予め準備された1.2Mソルビトール含
有最小培地（0.7％イーストニトロゲンベースアミノ
酸、２％グルコース、20μｇ／mlヒスチジン、２％寒
天）プレートに重層し、固化させたのち、30℃で培養し
てロイシン非要求性酵母のコロニーを得る。このコロニ
ーを20μｇ／mlヒスチジンを含むバルクホルダーミニマ
ルメディウム（Tohe,A.et al；J.Bachterol.,113,727〜
738(1973)を参照〕にて培養して形質転換酵母サッカロ
ミセス・セレビシエYPONY S1を得る。
(4)形質転換酵母によるHBs Agの製法 前記(3)で得られた形質転換酵母の独立したコロニー10
個を20μｇ／mlヒスチジンを含むバルクホルダーミニマ
ムメディウム10mlに接種し、30℃にて対数増殖期まで培
養し、ついで半合成培地YASO（0.05％硫酸マグネシウ
ム、0.5％硫酸アンモニウム、４％グラニユー糖、0.5％
酵母エキス）に殖え継ぎ、さらに26℃で培養する。対数
増殖期にある菌体を遠心して集菌し、これに50mMリン酸
緩衡液（食塩添加）１ml、0.1％トリトンX100、1mM PMS
F（フッ化フェニルメチルスルホニル、C6H5CH2SO2F）お
よびガラスビーズ（0.25〜0.5mm直径）１mlを加え、４
℃で10分間激しく振動することにより、菌体を破壊して
HBs抗原を抽出する。
個を20μｇ／mlヒスチジンを含むバルクホルダーミニマ
ムメディウム10mlに接種し、30℃にて対数増殖期まで培
養し、ついで半合成培地YASO（0.05％硫酸マグネシウ
ム、0.5％硫酸アンモニウム、４％グラニユー糖、0.5％
酵母エキス）に殖え継ぎ、さらに26℃で培養する。対数
増殖期にある菌体を遠心して集菌し、これに50mMリン酸
緩衡液（食塩添加）１ml、0.1％トリトンX100、1mM PMS
F（フッ化フェニルメチルスルホニル、C6H5CH2SO2F）お
よびガラスビーズ（0.25〜0.5mm直径）１mlを加え、４
℃で10分間激しく振動することにより、菌体を破壊して
HBs抗原を抽出する。
上記抽出液についてHBs抗原RIAキット（アボット社製）
によりHBs抗原活性を測定した。
によりHBs抗原活性を測定した。
その結果を次の第１表に示す。なお、対照として、シャ
トルベクターpAM82を用いて同様に処理して得られたデ
ータ（コロニー番号14と15）を合せて示す。この結果か
ら、本発明のシャトルベクターを用いた場合、従来のシ
ャトルベクターに比し、HBs抗原量は顕著に増大してい
ることが明白である。
トルベクターpAM82を用いて同様に処理して得られたデ
ータ（コロニー番号14と15）を合せて示す。この結果か
ら、本発明のシャトルベクターを用いた場合、従来のシ
ャトルベクターに比し、HBs抗原量は顕著に増大してい
ることが明白である。
第１図は、シャトルベクターpAM82の構造を示し、第２
〜５図は、それぞれ本発明のシャトルベクターpONY1〜
４の構造を示す。
〜５図は、それぞれ本発明のシャトルベクターpONY1〜
４の構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (6)
- 【請求項１】酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み、
かつ酵母の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域
を担ったプラスミドベクターであって、該酵母の抑制性
酸性ホスファターゼ形質発現調節領域の下流に組み込ま
れた大腸菌の遺伝子が、大腸菌プラスミドpBR322に由来
する(i)アンピシリン耐性遺伝子および(ii)大腸菌体内
において増殖するために必要なＤＮＡ配列を含む遺伝子
断片であり、かつプラスミドpBR322由来のSal I(651)部
位からPvu II(2066)部位までの約1.4kbpの配列もしくは
これを含む配列が除去された遺伝子断片であることを特
徴とするシャトルベクター。 - 【請求項２】該大腸菌の遺伝子が、プラスミドpBR322由
来のSal I(651)部位からPvu II(2066)部位までの約1.4k
bpの配列を含むSal I(651)部位からTth III−I(2219)部
位までの約1.6kbpの配列が除去された遺伝子断片である
前記第(1)項記載のシャトルベクター。 - 【請求項３】該抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節
領域がホスファターゼを構成する60,000ダルトンのポリ
ペプチド(p60)の形質発現調節領域であり、そのｐ６０
の構造遺伝子の全部およびその上流の一部までが除去さ
れている前記第(1)項記載のシャトルベクター。 - 【請求項４】該酵母の遺伝子が、ars1および２μoriで
ある前記第(1)項記載のシャトルベクター。 - 【請求項５】該酵母の遺伝子が、ars1、２μoriおよび
形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子を有する前記
第(1)項記載のシャトルベクター。 - 【請求項６】該酵母の選択マーカーとなる遺伝子が、ロ
イシン産生遺伝子、ヒスチジン産生遺伝子、トリプトフ
ァン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子およびアデニン産
生遺伝子から選ばれる１種または２種以上である前記第
(5)項記載のシャトルベクター。
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| JP60299363A JPH0655146B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | シヤトルベクタ− |
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