JPS62155092A - シヤトルベクタ− - Google Patents
シヤトルベクタ−Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はンヤトルベクター、さらに詳しくは酵母の遺伝
子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制性酸性ホス
ファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホスファター
ゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺伝子という
）を担ってなる酵母と大腸菌の両方で増殖シラるシャト
ルベクターに関する。
子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制性酸性ホス
ファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホスファター
ゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺伝子という
）を担ってなる酵母と大腸菌の両方で増殖シラるシャト
ルベクターに関する。
従来技術
最近、遺伝子工学の研究が活発に行なわれており、各種
の組換えＤＮＡ、さらにそれによる形質転換体の調製が
なされている。それら組換えＤＮＡの調製に際しては、
特定の遺伝子を組込むためのベクターが用いられるが、
そのようなベクターとしては、ある種の微生物、例えば
大腸菌でのみ増殖しうるベクターのほか、２種以上の微
生物、例えば大腸菌と酵母、あるいは微生物（例えば大
腸菌）と動物細胞との双方で増殖しうるいわゆるシャト
ルベクターが用いられる。例えば、ごく最近において、
大腸菌と酵母の両方で増殖しうるシャトルベクターとし
て、インターフェロンの酵母による産生に使用されてい
るアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＥ（１）のプロモ
ーターを利用したものが報告されており、これにＢ型肝
炎つィルスの表面抗原（以下、ＨＢｓ抗原、ＨＢＳＡｇ
もしくは単にＳ抗原という）の蛋白をコードする遺伝子
を接続する方法が採用されている（Ｎａｔｕｒｅ、 ２
９８巻、３４７〜３５０頁（２２Ｊｕｌｙ、１９８２
’）を参照）。
の組換えＤＮＡ、さらにそれによる形質転換体の調製が
なされている。それら組換えＤＮＡの調製に際しては、
特定の遺伝子を組込むためのベクターが用いられるが、
そのようなベクターとしては、ある種の微生物、例えば
大腸菌でのみ増殖しうるベクターのほか、２種以上の微
生物、例えば大腸菌と酵母、あるいは微生物（例えば大
腸菌）と動物細胞との双方で増殖しうるいわゆるシャト
ルベクターが用いられる。例えば、ごく最近において、
大腸菌と酵母の両方で増殖しうるシャトルベクターとし
て、インターフェロンの酵母による産生に使用されてい
るアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＥ（１）のプロモ
ーターを利用したものが報告されており、これにＢ型肝
炎つィルスの表面抗原（以下、ＨＢｓ抗原、ＨＢＳＡｇ
もしくは単にＳ抗原という）の蛋白をコードする遺伝子
を接続する方法が採用されている（Ｎａｔｕｒｅ、 ２
９８巻、３４７〜３５０頁（２２Ｊｕｌｙ、１９８２
’）を参照）。
しかしながら、このＡＤＨｌプロモーターを担ったシャ
Ｉ−／レベクターを使用する方法では、それ［ＨＢｓ遺
伝子を組込んで得られる組換えＤＮＡを用いた形質転換
体では産生されるＥ（ＢＳ蛋白の量が低い。
Ｉ−／レベクターを使用する方法では、それ［ＨＢｓ遺
伝子を組込んで得られる組換えＤＮＡを用いた形質転換
体では産生されるＥ（ＢＳ蛋白の量が低い。
本発明者らは、各種の遺伝子を組込み、さらにそれを発
現させるための新しい大腸菌−酵母シャトルベクターを
得るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌の遺伝子と酵母
の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロ
モーターを担ったシャトルベクターが所望の特性を示し
、そのホスファターゼプロモーターの制御下に各種の遺
伝子を組込んで種々の組換えＤＮＡを調製し、さらにそ
の組換えＤＮＡを酵母に作用させることによって種々の
形質転換酵母が得られることを見い出し、特許出願して
いる。
現させるための新しい大腸菌−酵母シャトルベクターを
得るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌の遺伝子と酵母
の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロ
モーターを担ったシャトルベクターが所望の特性を示し
、そのホスファターゼプロモーターの制御下に各種の遺
伝子を組込んで種々の組換えＤＮＡを調製し、さらにそ
の組換えＤＮＡを酵母に作用させることによって種々の
形質転換酵母が得られることを見い出し、特許出願して
いる。
（特願昭５７−１４５０９３号）。 ゛上記特許出
願におけるシャトルベクターは、酵母側の遺伝子として
ａｒｓｌ（酵母の自律増殖に必要なＤＮＡ配列） 、２
μｏｒｉ Ｃ２１ＪＣ２１Ｊの複製に必要なＤＮＡ配列
）およびＬｅｕ２（ロイシン耐性遺伝子）を有する酵母
ＤＮＡと大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２とを組合せたシ
ャトルベクターｐＡＴ７７およびそれをエキソヌクレア
ーゼＢＡＬ３１で処理してその酸性ホスファターゼ構造
遺伝子の一部または全部もしくはさらに上流の種々の部
分（通常＋１〜−１００ｂｐ）まで除去したもの、例え
ば、−３３ｂｐまで除去したシャトルベクターｐＡＭ８
２が含まれている。このンヤトルベクターｐＡＭ８２
！７）構造は、第１図に示すとおりであって、太線部分
は大腸菌プラスミド１）ＢＲ３２２由来の遺伝子、残部
は酵母の遺伝子である。
願におけるシャトルベクターは、酵母側の遺伝子として
ａｒｓｌ（酵母の自律増殖に必要なＤＮＡ配列） 、２
μｏｒｉ Ｃ２１ＪＣ２１Ｊの複製に必要なＤＮＡ配列
）およびＬｅｕ２（ロイシン耐性遺伝子）を有する酵母
ＤＮＡと大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２とを組合せたシ
ャトルベクターｐＡＴ７７およびそれをエキソヌクレア
ーゼＢＡＬ３１で処理してその酸性ホスファターゼ構造
遺伝子の一部または全部もしくはさらに上流の種々の部
分（通常＋１〜−１００ｂｐ）まで除去したもの、例え
ば、−３３ｂｐまで除去したシャトルベクターｐＡＭ８
２が含まれている。このンヤトルベクターｐＡＭ８２
！７）構造は、第１図に示すとおりであって、太線部分
は大腸菌プラスミド１）ＢＲ３２２由来の遺伝子、残部
は酵母の遺伝子である。
発明の目的
上記のようなシャトルベクターｐＡＭ８２は、１ａの酸
性ホスファターゼプロモーター下流に大腸菌ｐＢＲ３２
２由来の遺伝子が第１図に示される向きに組込まれてい
る。本発明者らは、このシャトルベクターｐＡＭ８２に
ついてさらに研究を重ねるうちに、酸性ホスファターゼ
プロモーター下流領域のｐＢＲ３２２由来の遺伝子部分
が、酸性ホスファターゼプロモーターと逆向きのプロモ
ーター活性を酵母菌体内で示すことを見いだした。
性ホスファターゼプロモーター下流に大腸菌ｐＢＲ３２
２由来の遺伝子が第１図に示される向きに組込まれてい
る。本発明者らは、このシャトルベクターｐＡＭ８２に
ついてさらに研究を重ねるうちに、酸性ホスファターゼ
プロモーター下流領域のｐＢＲ３２２由来の遺伝子部分
が、酸性ホスファターゼプロモーターと逆向きのプロモ
ーター活性を酵母菌体内で示すことを見いだした。
すなわち、このシャトルベクターを用いて所望の遺伝子
を発現させようとした場合、このシャトルベクターの酸
性ホスファターゼプロモーター下流に目的とする遺伝子
を挿入すると上記の逆向きのプロモーター活性の影響に
よって、目的とする遺伝子の発現効率が悪くなることを
知った。そこで、さらに研究を重ね、上記シャトルベク
ターｐＡＭ８２′ｆｒ−適当な制限酵素で処理すること
で、その酸性ホスファターゼプロモーター下流領域の大
腸菌由来の遺伝子を一部分取除くことによって、この領
域由来の該逆向きプロモーター活性を抑え、よシ遺伝子
発現効率の高いシャトルベクターが得られることを知り
、本発明を完成させるに至った。
を発現させようとした場合、このシャトルベクターの酸
性ホスファターゼプロモーター下流に目的とする遺伝子
を挿入すると上記の逆向きのプロモーター活性の影響に
よって、目的とする遺伝子の発現効率が悪くなることを
知った。そこで、さらに研究を重ね、上記シャトルベク
ターｐＡＭ８２′ｆｒ−適当な制限酵素で処理すること
で、その酸性ホスファターゼプロモーター下流領域の大
腸菌由来の遺伝子を一部分取除くことによって、この領
域由来の該逆向きプロモーター活性を抑え、よシ遺伝子
発現効率の高いシャトルベクターが得られることを知り
、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子を
含み、かつ酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモータ
ーを担い、かつ酸性ホスファターゼプロモーターの下流
領域の一部を除去し、より遺伝子発現効率の高いシャト
ルベクターを提供するものである。
含み、かつ酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモータ
ーを担い、かつ酸性ホスファターゼプロモーターの下流
領域の一部を除去し、より遺伝子発現効率の高いシャト
ルベクターを提供するものである。
発明の構成および効果
本発明のシャ） ／ｌ／ベクターは、酵母と大腸菌の両
方の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプ
ロモーターを有し、該酸性ホスファターゼプロモーター
の下流領域の一部、を除去してなることを特徴とし、こ
のプラスミドベクターは酵母と大腸菌との両方で増殖す
ることができ、これを用いて組換えＤＮＡ、さらに形質
転換酵母を調製する場合に、大腸菌を用いて組換えプラ
スミドを調製し、これを酵母の形質転換に利用し、該形
質転換酵母の増殖によって所望の遺伝子産物の量産を図
ることができる。なお、この場合、酵母の形質転換を行
なう段階では大腸菌の遺伝子は除去されてもかまわない
。
方の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプ
ロモーターを有し、該酸性ホスファターゼプロモーター
の下流領域の一部、を除去してなることを特徴とし、こ
のプラスミドベクターは酵母と大腸菌との両方で増殖す
ることができ、これを用いて組換えＤＮＡ、さらに形質
転換酵母を調製する場合に、大腸菌を用いて組換えプラ
スミドを調製し、これを酵母の形質転換に利用し、該形
質転換酵母の増殖によって所望の遺伝子産物の量産を図
ることができる。なお、この場合、酵母の形質転換を行
なう段階では大腸菌の遺伝子は除去されてもかまわない
。
本発明のシャトルベクターにおける酵母の遺伝子として
は、一般に、プラスミドが酵母中で染色体と独立して増
殖するのに必要なＤＮＡ配列、例えば、ａｒｓ １と２
μＯｒｌがあり、所望により、さらに形質転換酵母の
選択マーカーとなる遺伝子が含まれる。この選択マーカ
ーとしては、ロイシン産生遺伝子、ヒヌチジン産生遺伝
子、トリプトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子、
アデニン産生遺伝子などが含まれ、これらの１種または
２種以上が用いられる。
は、一般に、プラスミドが酵母中で染色体と独立して増
殖するのに必要なＤＮＡ配列、例えば、ａｒｓ １と２
μＯｒｌがあり、所望により、さらに形質転換酵母の
選択マーカーとなる遺伝子が含まれる。この選択マーカ
ーとしては、ロイシン産生遺伝子、ヒヌチジン産生遺伝
子、トリプトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子、
アデニン産生遺伝子などが含まれ、これらの１種または
２種以上が用いられる。
大腸菌側の遺伝子としては、大腸菌体内においてプラス
ミドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、例えばＣｏｌ
Ｅ Ｉ系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し
、好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとな
る遺伝子を含む。この選択マーカーの遺伝子としてはア
ンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テト
ラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺
伝子などが挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種
以上が用いられる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアン
ピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有
するｐＢＲ３２２が一般に汎用されている。
ミドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、例えばＣｏｌ
Ｅ Ｉ系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し
、好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとな
る遺伝子を含む。この選択マーカーの遺伝子としてはア
ンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テト
ラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺
伝子などが挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種
以上が用いられる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアン
ピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有
するｐＢＲ３２２が一般に汎用されている。
本発明のシャトルベクターは酵母の抑制性酸性ホスファ
ターゼブロモ−ターを担っていることが特徴であり、こ
の酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスファター
ゼを構成する６ ０．０００ダルトンのポリペプチド（
ｐ６０）のプロモーターである。
ターゼブロモ−ターを担っていることが特徴であり、こ
の酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスファター
ゼを構成する６ ０．０００ダルトンのポリペプチド（
ｐ６０）のプロモーターである。
本発明のシャ） ／Ｌ／ベクターは、前記シャトルベク
ター ｐＡＭ８２（特許昭５７−１４５０９３号、第１
図参照）を適当な制限酵素、例えばＰｖｕ■で処理し、
この部位にＢａｍＨＩ！Ｊンヵーを付加して再び環状プ
ラスミドに戻すことにより得られる。このシャトルベク
ターｆ ｐＯＮＹ１と称する（第２図参照）。同様にＰ
Ｖｕ ＩＩのかわりにＴｔｈｌｌｌ Ｉ、Ｓｎａ Ｉ、
Ｎｄｅ １部位を各々ＢａｍＨ［部位に変換したシャト
ルベクターを各々ｐＯＮＹ２、ｐＯＮＹ３、ｐＯＮＹ４
と称する（第３〜５図参照）。
ター ｐＡＭ８２（特許昭５７−１４５０９３号、第１
図参照）を適当な制限酵素、例えばＰｖｕ■で処理し、
この部位にＢａｍＨＩ！Ｊンヵーを付加して再び環状プ
ラスミドに戻すことにより得られる。このシャトルベク
ターｆ ｐＯＮＹ１と称する（第２図参照）。同様にＰ
Ｖｕ ＩＩのかわりにＴｔｈｌｌｌ Ｉ、Ｓｎａ Ｉ、
Ｎｄｅ １部位を各々ＢａｍＨ［部位に変換したシャト
ルベクターを各々ｐＯＮＹ２、ｐＯＮＹ３、ｐＯＮＹ４
と称する（第３〜５図参照）。
本発明のシャトルベクターｐＯＮＹ１〜４は、通常の制
限酵素、ＸｈＯＩおよびＢａｍＨｌで処理して容易に開
裂させることができ、その部位に種々の遺伝子を組込む
ことにより、各種の組換えプラスミドを調製することが
でき、それをさらに酵母に作用させて種々の形質転換酵
母が得られるため遺伝子工学の分野において広範囲の利
用が図れるものであって産業上利用価備がきわめて高い
。例えば、本発明のシャトルベクターにＨＢＳ遺伝子を
組込んで得られる組換えプラスミドを酵母に作用させて
調製される形質転換酵母は、培養によって大量のＨＢｓ
抗原を産生ずることができ、しかも、かかるＨＢｓ抗原
は免疫学的にヒト血清から得られるものと全く同一であ
るため、Ｂ型肝炎つィルスワクチン用素材として有用で
ある。
限酵素、ＸｈＯＩおよびＢａｍＨｌで処理して容易に開
裂させることができ、その部位に種々の遺伝子を組込む
ことにより、各種の組換えプラスミドを調製することが
でき、それをさらに酵母に作用させて種々の形質転換酵
母が得られるため遺伝子工学の分野において広範囲の利
用が図れるものであって産業上利用価備がきわめて高い
。例えば、本発明のシャトルベクターにＨＢＳ遺伝子を
組込んで得られる組換えプラスミドを酵母に作用させて
調製される形質転換酵母は、培養によって大量のＨＢｓ
抗原を産生ずることができ、しかも、かかるＨＢｓ抗原
は免疫学的にヒト血清から得られるものと全く同一であ
るため、Ｂ型肝炎つィルスワクチン用素材として有用で
ある。
つぎに実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。
的に説明する。
実施例
（１）シャトルベクターｐＡＭ８２の調製酵１１ｎＳ２
８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホスファタ
ーゼを構成する６ ０．０００ダルトンのポリペプチド
（ｐ６０ ）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオチド対
（８Ｋｂ）の制限酵素ＥＣ０Ｒ１断片を大腸菌プラスミ
ドｐＢＲ３２２のＥＣｊＯＲ１部位に挿入して得られる
プラスミドを出発材料とし、これを制限酵素Ｓａｌ■で
切断し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさ
せてｐＢＲ３２２のＳａ工工部部位ら酸性ホスファター
ゼ遺伝子断片の５．２Ｋｂ側を失なったプラスミドｐＡ
Ｔ２５（これはｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子
を含むＥｃ ｏＲ１部位からＳａｌ １部位までの約３
．７に１）の断片の と酵母り性ホスファターゼ遺伝子のＥＱＯＲ１部位から
Ｓａｌ １部位までの約２．８に１）の断片がそれぞれ
対応する末端同士で結合したプラスミドである）を得る
。
８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホスファタ
ーゼを構成する６ ０．０００ダルトンのポリペプチド
（ｐ６０ ）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオチド対
（８Ｋｂ）の制限酵素ＥＣ０Ｒ１断片を大腸菌プラスミ
ドｐＢＲ３２２のＥＣｊＯＲ１部位に挿入して得られる
プラスミドを出発材料とし、これを制限酵素Ｓａｌ■で
切断し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさ
せてｐＢＲ３２２のＳａ工工部部位ら酸性ホスファター
ゼ遺伝子断片の５．２Ｋｂ側を失なったプラスミドｐＡ
Ｔ２５（これはｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子
を含むＥｃ ｏＲ１部位からＳａｌ １部位までの約３
．７に１）の断片の と酵母り性ホスファターゼ遺伝子のＥＱＯＲ１部位から
Ｓａｌ １部位までの約２．８に１）の断片がそれぞれ
対応する末端同士で結合したプラスミドである）を得る
。
つぎに、このｐＡＴ２５のＥｃｏＲ１部位に、プラスミ
ドＹＲＰ７をｇｃｏｉ”＋ を処理することによって得
られるａｒｓｌおよび’ｒｒｐ１遺伝子を含む１，４Ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ断片を挿入してプラスミドｐＡＴ２５を
得る。（このａｒｓ １− Ｔｒｐ Ｉを含む断片は、
そのＴｒｐ ｌ遺伝子内に制限酵素Ｈ：ｌｎｄ Ｉ Ｉ
Ｉの認識部位を１個有する）。
ドＹＲＰ７をｇｃｏｉ”＋ を処理することによって得
られるａｒｓｌおよび’ｒｒｐ１遺伝子を含む１，４Ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ断片を挿入してプラスミドｐＡＴ２５を
得る。（このａｒｓ １− Ｔｒｐ Ｉを含む断片は、
そのＴｒｐ ｌ遺伝子内に制限酵素Ｈ：ｌｎｄ Ｉ Ｉ
Ｉの認識部位を１個有する）。
上記ｐＡＴ２６のＨｊ−ｎｄ［１１部位に、プラスミド
ｐＳＬＥ １をＨｉｎｄ ＩＩＩで処理して得られる酵
母のＬｅｕ２および２μｏｒｊ−を含むＨｉ−ｎｄ［＋
１断片を挿入してシャトルベクターｐＡ Ｔ ７７を得
る。
ｐＳＬＥ １をＨｉｎｄ ＩＩＩで処理して得られる酵
母のＬｅｕ２および２μｏｒｊ−を含むＨｉ−ｎｄ［＋
１断片を挿入してシャトルベクターｐＡ Ｔ ７７を得
る。
上記の方法で得られたｐＡＴ７７（１３ｇ）を５ａｌＩ
−ｃ開裂したのち、２０ｍＭ ） ！Ｊ ヌ−ＨＣｊ！
（ｐＨ８，２）、１２ｍＭＣａＣＪ！２．１２ｍＭ Ｍ
ｇ ＣＩ−２，０，２ＭＮａＣｆ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ
Ｒｉｂ ５０ ｐ”ｌ’ テ０、ＩＵのエキソヌクレ
アーゼＢＡＬ３１ｉ３０秒〜１分間作用させる。ついで
フェノール抽出、エタノール沈殿を行なったのち、Ｘｈ
ＯＩリン下で１２時間結合を行なう。この反応溶液で大
腸菌χ１７７６を形質転換し、得られたアンピシリン耐
性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、各ＤＮ
Ａについてマギサム・ギ／Ｖ ／＜−トの方法（Ｍａｘ
ａｍ、Ａ、＆ Ｇｌｂｅｒｔ。
−ｃ開裂したのち、２０ｍＭ ） ！Ｊ ヌ−ＨＣｊ！
（ｐＨ８，２）、１２ｍＭＣａＣＪ！２．１２ｍＭ Ｍ
ｇ ＣＩ−２，０，２ＭＮａＣｆ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ
Ｒｉｂ ５０ ｐ”ｌ’ テ０、ＩＵのエキソヌクレ
アーゼＢＡＬ３１ｉ３０秒〜１分間作用させる。ついで
フェノール抽出、エタノール沈殿を行なったのち、Ｘｈ
ＯＩリン下で１２時間結合を行なう。この反応溶液で大
腸菌χ１７７６を形質転換し、得られたアンピシリン耐
性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、各ＤＮ
Ａについてマギサム・ギ／Ｖ ／＜−トの方法（Ｍａｘ
ａｍ、Ａ、＆ Ｇｌｂｅｒｔ。
Ｗ、ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、７４，５６０〜５６４を参
照）に従い、塩基配列を調べ、ＢＡＬ３１処理により除
去された酸性ホスファターゼ遺伝子領域を決定する。こ
れら中からホスファターゼ構造遺伝子領域が完全に除去
されたプラスミドｐＡＭ８２を得る。なお、このｐＡＭ
８２をサツカロミセス・セレビシェＡＥ（２２に組込ん
タモのは、サツカロミセス・セレビシェＡＨ２２／ｐＡ
Ｍ８２ （微工研条寄第３１３号）として寄託している
。
照）に従い、塩基配列を調べ、ＢＡＬ３１処理により除
去された酸性ホスファターゼ遺伝子領域を決定する。こ
れら中からホスファターゼ構造遺伝子領域が完全に除去
されたプラスミドｐＡＭ８２を得る。なお、このｐＡＭ
８２をサツカロミセス・セレビシェＡＥ（２２に組込ん
タモのは、サツカロミセス・セレビシェＡＨ２２／ｐＡ
Ｍ８２ （微工研条寄第３１３号）として寄託している
。
（２）シャトルベクター１）ＯＮＹＩの調製上記で得ら
れたプラスミド１）ＡＭ８２（１μｇ）をｐｖｕｎで開
裂したのち、６７ｍＭ ）リス−ＨＣｆ（ｐＨ８，８
）、７．７ｍＭＭｇＣｆ２．１０ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、６，７μＭＥＤＴＡ、１６．６ｍＭ（ＮＨ４
）２Ｓ○４．３３０μＭ ｄＣ，ＴＰ、ｄＡＴＰ、 ｄ
ＧＴＰ、 ｄＴＴＰ、 ５０μｍ中でＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ（ＩＵ）を３７°Ｃ１３０分間反応させる。つい
でフェノール抽出、エタノール沈殿を行なったのち、Ｂ
ａｍＥ（Ｉリンカ−１ｐｍｏｌとＴ、１ＤＮＡリガーゼ
の反応条件下で１２時間結合反応を行なわせる。この反
応溶液で大腸菌χ１７７６を形質転換し、得られたアン
ピシリン耐性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製
し、制限酵素ＸｈＯＩ及びＢａｍ Ｈ［により切断パタ
ーンを分析した結果、第２図に示すようなｐＯＮＹｌが
得られる。
れたプラスミド１）ＡＭ８２（１μｇ）をｐｖｕｎで開
裂したのち、６７ｍＭ ）リス−ＨＣｆ（ｐＨ８，８
）、７．７ｍＭＭｇＣｆ２．１０ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、６，７μＭＥＤＴＡ、１６．６ｍＭ（ＮＨ４
）２Ｓ○４．３３０μＭ ｄＣ，ＴＰ、ｄＡＴＰ、 ｄ
ＧＴＰ、 ｄＴＴＰ、 ５０μｍ中でＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ（ＩＵ）を３７°Ｃ１３０分間反応させる。つい
でフェノール抽出、エタノール沈殿を行なったのち、Ｂ
ａｍＥ（Ｉリンカ−１ｐｍｏｌとＴ、１ＤＮＡリガーゼ
の反応条件下で１２時間結合反応を行なわせる。この反
応溶液で大腸菌χ１７７６を形質転換し、得られたアン
ピシリン耐性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製
し、制限酵素ＸｈＯＩ及びＢａｍ Ｈ［により切断パタ
ーンを分析した結果、第２図に示すようなｐＯＮＹｌが
得られる。
つぎに、上記の方法で得られたシャトルベクターｐＯＮ
Ｙ１を用い、これにＨＢＶＤＮＡをむ 組込を場合を参考例として示す。
Ｙ１を用い、これにＨＢＶＤＮＡをむ 組込を場合を参考例として示す。
参考例
（１）ＨＢＶＤＮＡ の調１
（１）ウィルスＤＮＡの調製
ＨＢＳＡｇ陽性かっＨＢｅＡｇ陽性の供血者（血清型ａ
ｄｒ ）からヒト血漿１ｏ人分のプール７００−をｓ、
ｏ ｏ ｏ ｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を除
去する。これを４°Ｃにて１８．０００ｒｐｍで８時間
遠心分離し、得られた沈査を援Ｎ＃ （１０ｍＭ
ト １） ７ − Ｅ（Ｏｆ 、 Ｑ、１ＭＮ％
ｃｆ 、 １ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７，５）１０ ｍｌ
に再溶解させ、３０％の蔗糖を含有する遠沈管の頂部に
重層させる。これを４°ＣＫて３９．ＯＯＯｒｐｍｆ４
時間遠心分離し、得られた沈査を上記と同じ緩衛液に再
溶解させる。
ｄｒ ）からヒト血漿１ｏ人分のプール７００−をｓ、
ｏ ｏ ｏ ｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を除
去する。これを４°Ｃにて１８．０００ｒｐｍで８時間
遠心分離し、得られた沈査を援Ｎ＃ （１０ｍＭ
ト １） ７ − Ｅ（Ｏｆ 、 Ｑ、１ＭＮ％
ｃｆ 、 １ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７，５）１０ ｍｌ
に再溶解させ、３０％の蔗糖を含有する遠沈管の頂部に
重層させる。これを４°ＣＫて３９．ＯＯＯｒｐｍｆ４
時間遠心分離し、得られた沈査を上記と同じ緩衛液に再
溶解させる。
ついで、のちの操作を容易にするために、ＨＢＶのもつ
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７ｍＭ） リ
ス −ＨＣ、ｉ！ （ｐＨ７，５） 、 ８ ＱｍＭＮ
Ｈ４Ｃ１，２５ｍＭ ＭｇＣ＃２．０．５％（Ｗ／Ｖ％
、以下同じ ） タ − ジ ト − ル ＮＰ−４０
，０，１％ ２− メ ルカブトエタノール、３３０ｔ
ｔＭ（ＤｄｃＴＰ（デオキシシチジントリホスフェ−）
）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリホスフェート）
、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリホスフェート）、
０．５．ｕＭａ 、（３２Ｐ） ｄＴＴＰ （デオキシ
チアミントリホスフェート）の混合液５００μ！中で３
７°Ｃにて３０分間行なう。これにさらにｄＴＴＰを最
終濃度３３０μＭになるように加え、３７°Ｃで３時間
反応させ、これに同容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を
加える。このＤＮＡポリメラーゼ反応より、ＤＮＡ中の
一本鎖部分が修復され、（３２ｐ）ラベル化された材料
を得、これを蔗糖の３０％、２０％および１０％水溶液
を段階的に重層した遠心管の頂部に重層し、４０Ｃにて
３９，０００ ｒｐｍで４．５時間遠心分離する。
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７ｍＭ） リ
ス −ＨＣ、ｉ！ （ｐＨ７，５） 、 ８ ＱｍＭＮ
Ｈ４Ｃ１，２５ｍＭ ＭｇＣ＃２．０．５％（Ｗ／Ｖ％
、以下同じ ） タ − ジ ト − ル ＮＰ−４０
，０，１％ ２− メ ルカブトエタノール、３３０ｔ
ｔＭ（ＤｄｃＴＰ（デオキシシチジントリホスフェ−）
）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリホスフェート）
、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリホスフェート）、
０．５．ｕＭａ 、（３２Ｐ） ｄＴＴＰ （デオキシ
チアミントリホスフェート）の混合液５００μ！中で３
７°Ｃにて３０分間行なう。これにさらにｄＴＴＰを最
終濃度３３０μＭになるように加え、３７°Ｃで３時間
反応させ、これに同容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を
加える。このＤＮＡポリメラーゼ反応より、ＤＮＡ中の
一本鎖部分が修復され、（３２ｐ）ラベル化された材料
を得、これを蔗糖の３０％、２０％および１０％水溶液
を段階的に重層した遠心管の頂部に重層し、４０Ｃにて
３９，０００ ｒｐｍで４．５時間遠心分離する。
ついで、ＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するた
めに、上記で得られた沈査をＩｍｇ／ ？ｙ＋４プロナ
ーゼＥおよび０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液
２００μＬ中で３７°Ｃにて２時間処理したのち、ＤＮ
Ａ１フ工ノール２００μｍで２回抽出し、ついでエーテ
ルで振ってフェノ−ｐ溶媒を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶
液を得る。このＤＮＡは２．５Ｘ１０ Ｃｐｍ／／ｊｇ
（７）比放射活性を示し、制限酵素消化に充分使用
し得る。
めに、上記で得られた沈査をＩｍｇ／ ？ｙ＋４プロナ
ーゼＥおよび０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液
２００μＬ中で３７°Ｃにて２時間処理したのち、ＤＮ
Ａ１フ工ノール２００μｍで２回抽出し、ついでエーテ
ルで振ってフェノ−ｐ溶媒を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶
液を得る。このＤＮＡは２．５Ｘ１０ Ｃｐｍ／／ｊｇ
（７）比放射活性を示し、制限酵素消化に充分使用
し得る。
（、ｕ） ＨＢＶＤＮ Ａ （Ｄ りｃｒ −：／ 化
前記の方法で調製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、
下記のようにしてまずλフアージシャロン１５ＡＤＮＡ
’ｉベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラス
ミドｐＡＣＹＣ１７７をベクターとして再クローン化を
行なう。
前記の方法で調製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、
下記のようにしてまずλフアージシャロン１５ＡＤＮＡ
’ｉベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラス
ミドｐＡＣＹＣ１７７をベクターとして再クローン化を
行なう。
（Ａ）λフアージシャロン１６Ａ宿主−ベクター系によ
るクローン化： ＨＢＶＤＮＡ２”Ｏｎｇ ｋ １０ｍＭ ｌ−！Ｊ
ス −Ｈ（Ｊ （ｐＨ７，４）、７ｍＭ ＭｇＣ
−１２，１００ｍＭ ＮａＣＬ。
るクローン化： ＨＢＶＤＮＡ２”Ｏｎｇ ｋ １０ｍＭ ｌ−！Ｊ
ス −Ｈ（Ｊ （ｐＨ７，４）、７ｍＭ ＭｇＣ
−１２，１００ｍＭ ＮａＣＬ。
７ｍＭ２−メルカプトエタノールの混液２０μ！中にて
制限エンドヌクレアーゼＸｈＯ１により３７０Ｃにて２
時間処理したのち、フェノ−／Ｌ／２００μｍにて抽出
し、抽出ｒｖｃｔエーテｌしで洗浄し、その水層に２倍
容量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。この
ｌ昆２夜１−７０’Ｃで１時間保持したのち１０．００
Ｏｒｐｍにて５分間遠心分離して沈殿するＤＮＡを回
収する。分離した沈査を１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ
７，４）および１ｍＭＥＤＴＡの混液５μｍに溶解させ
る。
制限エンドヌクレアーゼＸｈＯ１により３７０Ｃにて２
時間処理したのち、フェノ−／Ｌ／２００μｍにて抽出
し、抽出ｒｖｃｔエーテｌしで洗浄し、その水層に２倍
容量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。この
ｌ昆２夜１−７０’Ｃで１時間保持したのち１０．００
Ｏｒｐｍにて５分間遠心分離して沈殿するＤＮＡを回
収する。分離した沈査を１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ
７，４）および１ｍＭＥＤＴＡの混液５μｍに溶解させ
る。
ついで、このＨＢＶＤＮＡと等モル量の前記と同様にし
て制限酵素ｘｈｏｔにより開裂されたλフアージシャロ
ン１６ ＡＤＮＡ （Ｘｈｏ Ｉ認識部位を１個所有す
る）とをＴ４ＤＮＡ リガーゼ（５０ｍＭ） リ ス
−Ｅ（Ｃｆ（ｐＨ７，４） 、 １０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２．１０ｍＭジチオスレイトール、１００ μｇ／
ｒｒＬノ牛血清アルブミン、Ｑ、５ｍＭＡＴＰ およ
び０．５μｍ 酵素調製物との混液）１０μｍを用いて
４°Ｃで１８時間反応させ、この反応混合液を前記と同
様にしてフェノール抽出、エーテル処理およびエタノー
ル沈殿に付し、得られた沈査を１０ｍＭ ） リアー−
Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，４）および１ｍＭ ＥＤＴＡ混液１０
μｍ中に溶解させる。
て制限酵素ｘｈｏｔにより開裂されたλフアージシャロ
ン１６ ＡＤＮＡ （Ｘｈｏ Ｉ認識部位を１個所有す
る）とをＴ４ＤＮＡ リガーゼ（５０ｍＭ） リ ス
−Ｅ（Ｃｆ（ｐＨ７，４） 、 １０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２．１０ｍＭジチオスレイトール、１００ μｇ／
ｒｒＬノ牛血清アルブミン、Ｑ、５ｍＭＡＴＰ およ
び０．５μｍ 酵素調製物との混液）１０μｍを用いて
４°Ｃで１８時間反応させ、この反応混合液を前記と同
様にしてフェノール抽出、エーテル処理およびエタノー
ル沈殿に付し、得られた沈査を１０ｍＭ ） リアー−
Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，４）および１ｍＭ ＥＤＴＡ混液１０
μｍ中に溶解させる。
上記のようにしてアニールさせたＤＮＡより、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ ｂ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻、２９９〜３０９を参照）
によりλファージを形成させ、さらに大腸菌αＸ ２３
ｃｍ ）上に〜１０４個のプラークを形成させる。こ
れらのプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持している
ファージによシ形成されたプラークを選び出すために、
前記で調製した３２ｐ−ラベルされたＥ（Ｂ’ＶＤＮＡ
を１０−プとしてプラークハイブリダイゼーションを行
ない（５ｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８０頁、１９７７
を参照）、目的とするファージを複数分離する。
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ ｂ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻、２９９〜３０９を参照）
によりλファージを形成させ、さらに大腸菌αＸ ２３
ｃｍ ）上に〜１０４個のプラークを形成させる。こ
れらのプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持している
ファージによシ形成されたプラークを選び出すために、
前記で調製した３２ｐ−ラベルされたＥ（Ｂ’ＶＤＮＡ
を１０−プとしてプラークハイブリダイゼーションを行
ない（５ｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８０頁、１９７７
を参照）、目的とするファージを複数分離する。
ＣＢ）プラスミドｐＡｃＹｃ１７７ｆベクターとした再
クローン化： 上記（んで得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージに
ついて「生化学実験横座、核酸の化学Ｉ」５４〜６５頁
に記載される方法に従い、大腸菌ＤｐｓｏｓｕｐＦ’？
：感染菌として７７−ジＤＮＡを調製する。得られたＤ
ＮＡを前記の制限酵Ｘｈｏ １の反応条件下で２時間消
化したのち、この反応ｇ！を０．７５％アガロースゲル
電気泳動ニカけ、分離Ｌり３．２Ｋｂ （７） ＨＢＶ
ＤＮＡ ｉ ＤＥＥＡＥ紙（東洋沖紙製）に吸着させて
ベクターＤＮＡと分離し、ついで１Ｍ ＭａＣｆ溶液に
て溶出し、両端がＸｈＯＩ末端となったＥ（ＢＶＤＮＡ
を得る。
クローン化： 上記（んで得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージに
ついて「生化学実験横座、核酸の化学Ｉ」５４〜６５頁
に記載される方法に従い、大腸菌ＤｐｓｏｓｕｐＦ’？
：感染菌として７７−ジＤＮＡを調製する。得られたＤ
ＮＡを前記の制限酵Ｘｈｏ １の反応条件下で２時間消
化したのち、この反応ｇ！を０．７５％アガロースゲル
電気泳動ニカけ、分離Ｌり３．２Ｋｂ （７） ＨＢＶ
ＤＮＡ ｉ ＤＥＥＡＥ紙（東洋沖紙製）に吸着させて
ベクターＤＮＡと分離し、ついで１Ｍ ＭａＣｆ溶液に
て溶出し、両端がＸｈＯＩ末端となったＥ（ＢＶＤＮＡ
を得る。
つぎにプラスミｌ’ ｐＡＣＹＣ１’７’７ ｒ Ｃｈ
ａｎｇ。
ａｎｇ。
Ａ、 Ｃ，Ｙ、 、 Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、 、
Ｊ、 Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、 。
Ｊ、 Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、 。
１３４．１１４１〜１１５６（１９７８）Ｊ （このも
゛のはＸｈｏ Ｉ切断部位を１個所有し、それはカナマ
イシン耐性遺伝子の中に存在する）を同様にＸｈｏｌに
て消化し、その生成物をフェノール抽出、エーテル処理
およびエタノール沈殿により精製する。ついで、ＸｈＯ
Ｉ開裂されたｐＡＣＹＣ１７７、！： ｘｈｏ Ｉ末端
−ＨＢＶＤＮＡ 、！：ｔ−分子比１：５で混合し、前
記Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼの反応条件下に１８時間アニー
ルさせる。
゛のはＸｈｏ Ｉ切断部位を１個所有し、それはカナマ
イシン耐性遺伝子の中に存在する）を同様にＸｈｏｌに
て消化し、その生成物をフェノール抽出、エーテル処理
およびエタノール沈殿により精製する。ついで、ＸｈＯ
Ｉ開裂されたｐＡＣＹＣ１７７、！： ｘｈｏ Ｉ末端
−ＨＢＶＤＮＡ 、！：ｔ−分子比１：５で混合し、前
記Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼの反応条件下に１８時間アニー
ルさせる。
大腸菌χ１７７６の培養液を高木康敬編著「遺伝子操作
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液ｏ１
ｍｊ！に、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μｍを
加えてよく混合させ、０°Ｃで２５分間放置したのち、
アンピシリン（２０μｇ／ｍｌ ）、α−ビオチン（１
μｇ／ｍｉ）、ジアミノピメリン酸（１００μｇ ／−
Ｌ Ｊ、 ）、千シン（２０μｇ／−’）を含有するＬ
−寒天プレート上に塗抹して３７°Ｃで一夜培養する。
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液ｏ１
ｍｊ！に、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μｍを
加えてよく混合させ、０°Ｃで２５分間放置したのち、
アンピシリン（２０μｇ／ｍｌ ）、α−ビオチン（１
μｇ／ｍｉ）、ジアミノピメリン酸（１００μｇ ／−
Ｌ Ｊ、 ）、千シン（２０μｇ／−’）を含有するＬ
−寒天プレート上に塗抹して３７°Ｃで一夜培養する。
出現したコロニーについて、カナマイシン（２０μｇ／
−）を含む寒天グレートとアンピシリン（２０μｇ／７
７ＬＪ）を含む寒天プｖ−トにそれぞれ対応させて塗抹
し、アンピシリンを含むグレートでのみ増殖したコロニ
ーを選択する。
−）を含む寒天グレートとアンピシリン（２０μｇ／７
７ＬＪ）を含む寒天プｖ−トにそれぞれ対応させて塗抹
し、アンピシリンを含むグレートでのみ増殖したコロニ
ーを選択する。
ｐＡＣＹＣ１７７はアンピシリン耐性遺伝子とカナマイ
シン耐性遺伝子を有するが、カナマイシン耐性遺伝子中
にあるＸｈＯ１部位にＨＢＶＤＮＡが挿入されることに
よりカナマイシン耐性が消失される。すなわち、選択さ
れたコロ＝−はｐＡｃＹｃ１７７−ＨＢＶＤＮＡの組換
えＤＮＡを保持している。得られたコロニー数個につい
て、「代謝」第１７巻、第４［バー（！”Ｊ第８１〜８
９頁（１９８０）に記載される方法に従いプラスミドを
調製する。得られたプラスミドをｐＨＢ’Ｖと称す。こ
のｐＥ（ＢＶを制限酵素ＸｈＯＩで処理すると３．Ｂｂ
の全ＨＢＶＤＮＡフラグメントが得られ、またｘｈｏ
ＩとＢａｍＥ（Ｉで処理するとＨＢｓ Ａｇ遺伝子を含
む約１．３Ｋｂのフラグメントが得られる。
シン耐性遺伝子を有するが、カナマイシン耐性遺伝子中
にあるＸｈＯ１部位にＨＢＶＤＮＡが挿入されることに
よりカナマイシン耐性が消失される。すなわち、選択さ
れたコロ＝−はｐＡｃＹｃ１７７−ＨＢＶＤＮＡの組換
えＤＮＡを保持している。得られたコロニー数個につい
て、「代謝」第１７巻、第４［バー（！”Ｊ第８１〜８
９頁（１９８０）に記載される方法に従いプラスミドを
調製する。得られたプラスミドをｐＨＢ’Ｖと称す。こ
のｐＥ（ＢＶを制限酵素ＸｈＯＩで処理すると３．Ｂｂ
の全ＨＢＶＤＮＡフラグメントが得られ、またｘｈｏ
ＩとＢａｍＥ（Ｉで処理するとＨＢｓ Ａｇ遺伝子を含
む約１．３Ｋｂのフラグメントが得られる。
（２）ＨＢＳＡｇ遺伝子発現プラスミドの調製プラスミ
ドｐＨＢＶをＢａｍＨＩ で処理して切断し、そのＨＢ
ｓ Ａｇ遺伝子フラグメント３μｇに対し、２００μＭ
のαＡＴＰ、αＣＴＰＳａＴＴＰおよびａＧＴＰを含む
６７ｍＭ ｌ−リ、ｚ −ＨＣｆ（ｐＨｓ、６）、６．
７ｍＭＭｇＣＪ−２，１０ｍＭ２−メル カ デ ト
エ タ ノ − ル 、 ６．７ μＭ ＥＤＴ
Ａ、 １６．７ｍＭ ＡｍＳＯ４溶液１００μ’中
で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕを３０分間作用さ
せ、ＢａｍＩＩ切断末端を埋める。ついでフェノール抽
出、エタノール沈殿を行なったのち、これとＸｈＯｌリ
ンカ−とを１＝１０の分子比でＴ４ＤＮＡＩＪガーゼに
よる結合反応を行なう。フェノール抽出、エタノール沈
殿ののち、これをさらにｘｈｏ ｔで処理すると両端が
ＸｈＯＩ切断末端となった約１．３ Ｋ ｂのＨＢｓＡ
ｇ遺伝子フラグメントが得られる。このフラグメントと
Ｘｈｏ Ｉで開裂されたシャトルベクターｐＯＮＹ１と
を分子比５：１にてＴ４ＤＮＡ リガーゼによりアニー
ルさせたのち、この反応液で大腸菌χ１７７６を形質転
換してプラスミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミ
ドは、ベクターｐＯＮＹ１のホスファターゼプロモータ
ーの下流にＨＢＳＡｇ遺伝子が正しい向きに挿入された
ものであシ、これをｐＯＮＹ−ｓｉと称する。
ドｐＨＢＶをＢａｍＨＩ で処理して切断し、そのＨＢ
ｓ Ａｇ遺伝子フラグメント３μｇに対し、２００μＭ
のαＡＴＰ、αＣＴＰＳａＴＴＰおよびａＧＴＰを含む
６７ｍＭ ｌ−リ、ｚ −ＨＣｆ（ｐＨｓ、６）、６．
７ｍＭＭｇＣＪ−２，１０ｍＭ２−メル カ デ ト
エ タ ノ − ル 、 ６．７ μＭ ＥＤＴ
Ａ、 １６．７ｍＭ ＡｍＳＯ４溶液１００μ’中
で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕを３０分間作用さ
せ、ＢａｍＩＩ切断末端を埋める。ついでフェノール抽
出、エタノール沈殿を行なったのち、これとＸｈＯｌリ
ンカ−とを１＝１０の分子比でＴ４ＤＮＡＩＪガーゼに
よる結合反応を行なう。フェノール抽出、エタノール沈
殿ののち、これをさらにｘｈｏ ｔで処理すると両端が
ＸｈＯＩ切断末端となった約１．３ Ｋ ｂのＨＢｓＡ
ｇ遺伝子フラグメントが得られる。このフラグメントと
Ｘｈｏ Ｉで開裂されたシャトルベクターｐＯＮＹ１と
を分子比５：１にてＴ４ＤＮＡ リガーゼによりアニー
ルさせたのち、この反応液で大腸菌χ１７７６を形質転
換してプラスミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミ
ドは、ベクターｐＯＮＹ１のホスファターゼプロモータ
ーの下流にＨＢＳＡｇ遺伝子が正しい向きに挿入された
ものであシ、これをｐＯＮＹ−ｓｉと称する。
（３）形質転換酵母の調製
酵母としてサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２ｃａ
ｊＬｅｕ２ ｈ：Ｌｓ４ ｃａｎｌ（ｃｉ、ｒ＋））
（徽工研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（
２％ポリペプトン、１％イーストエキス、２％グルコー
ス）１００ＷＬ１に接種し、３０°Ｃで一晩培養したの
ち、遠心して集菌する。滅菌水２ＱｍＬにて菌体を洗浄
し、ついで１．２Ｍソルビトール ６ ０、０ ０ ０ Ｃ生化学工業製〕の溶液５′ＷＬ
ｆに懸濁させ、３０°Ｃで約３０分間保ち、スフェロプ
ラヌト化する。ついで、スフ二ロプラストを１、 ２
Ｍソルビトール溶液で３回洗浄したのち、２ Ｍ ソ
ル ビ ト ー ／Ｌ／ 、 １ ０ｍＭ Ｃａ
（Ｊ２およ び １０ｍＭ ）すｙ．−ＨＣｆ（ｐＨ７
．５）の溶液０．６？ＰＬＪ−に懸濁させ、その６０μ
ｍずつを小試験管に分注する。これに前記（３）で調製
した組換えプラスミドｐＯＮＹ−Ｓ１５μｇを加え、充
分混合し、さらに０．１Ｍ ＣａＣｆ２ （ ３μｍ’
）ｅ 加ｔ テｌｋ終ｍ度１０ｍＭＣａＣｉ２とし、
室温に５〜１０分間放置する。ついでこれに、２０％ポ
リエチレングリ：ｌ−／ｌ／４０００，ＩＱｍＭ Ｃａ
（Ｊ２ おｊび１０ｍＭ ト リ ス − ＨＯ
Ｊ− （ ｐＨ７．５ ） 溶液 １ｙａＪ ず
つを加えて混合し、室温に約２０分間放置する。
ｊＬｅｕ２ ｈ：Ｌｓ４ ｃａｎｌ（ｃｉ、ｒ＋））
（徽工研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（
２％ポリペプトン、１％イーストエキス、２％グルコー
ス）１００ＷＬ１に接種し、３０°Ｃで一晩培養したの
ち、遠心して集菌する。滅菌水２ＱｍＬにて菌体を洗浄
し、ついで１．２Ｍソルビトール ６ ０、０ ０ ０ Ｃ生化学工業製〕の溶液５′ＷＬ
ｆに懸濁させ、３０°Ｃで約３０分間保ち、スフェロプ
ラヌト化する。ついで、スフ二ロプラストを１、 ２
Ｍソルビトール溶液で３回洗浄したのち、２ Ｍ ソ
ル ビ ト ー ／Ｌ／ 、 １ ０ｍＭ Ｃａ
（Ｊ２およ び １０ｍＭ ）すｙ．−ＨＣｆ（ｐＨ７
．５）の溶液０．６？ＰＬＪ−に懸濁させ、その６０μ
ｍずつを小試験管に分注する。これに前記（３）で調製
した組換えプラスミドｐＯＮＹ−Ｓ１５μｇを加え、充
分混合し、さらに０．１Ｍ ＣａＣｆ２ （ ３μｍ’
）ｅ 加ｔ テｌｋ終ｍ度１０ｍＭＣａＣｉ２とし、
室温に５〜１０分間放置する。ついでこれに、２０％ポ
リエチレングリ：ｌ−／ｌ／４０００，ＩＱｍＭ Ｃａ
（Ｊ２ おｊび１０ｍＭ ト リ ス − ＨＯ
Ｊ− （ ｐＨ７．５ ） 溶液 １ｙａＪ ず
つを加えて混合し、室温に約２０分間放置する。
この混合液Ｑ， ２ｍＪＬずつを４５°Ｃに保温された
再生培地（２２％ソルビトール、２％グルコース、０７
％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％ＹＰＤ、２
０μｇ ／ ｍＪ−ヒスチジン、３％寒天）ｌＱｙｎｊ
！に加え、軽く混合させ、予め準備された１．２Ｍソル
ビトール含有最小培地（０．７％イーストニトロゲンベ
ースアミノ酸、２％グルコース、２０μｇ ／ ｍ Ａ
ヒスチジン、２％寒天）プレートに重層し、固化させた
のち、３０°Ｃで培養してロイシン非要求性酵母のコロ
ニーを得る。このコロニーを２０μｇ ７ｍ １１ヒス
チジンｔ−含ムパルクホルダーミニマルメディウム（Ｔ
Ｏｈｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ ｉ Ｊ． Ｂａｃｈｔｅ
ｒｏｌ． 、 ｌ ｌ ３ 。
再生培地（２２％ソルビトール、２％グルコース、０７
％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％ＹＰＤ、２
０μｇ ／ ｍＪ−ヒスチジン、３％寒天）ｌＱｙｎｊ
！に加え、軽く混合させ、予め準備された１．２Ｍソル
ビトール含有最小培地（０．７％イーストニトロゲンベ
ースアミノ酸、２％グルコース、２０μｇ ／ ｍ Ａ
ヒスチジン、２％寒天）プレートに重層し、固化させた
のち、３０°Ｃで培養してロイシン非要求性酵母のコロ
ニーを得る。このコロニーを２０μｇ ７ｍ １１ヒス
チジンｔ−含ムパルクホルダーミニマルメディウム（Ｔ
Ｏｈｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ ｉ Ｊ． Ｂａｃｈｔｅ
ｒｏｌ． 、 ｌ ｌ ３ 。
７２７〜７３８（１９７３）を参照〕にて培養して形質
転換酵母サツカロミセス・セレビシェＹＰＯＮＹＳｔを
得る。
転換酵母サツカロミセス・セレビシェＹＰＯＮＹＳｔを
得る。
（４）形質転換酵母によるＨＢＳＡｇの製法前記（３）
で得られた形質転換酵母の独立したコロニー１０個ｅ２
ｏβｇ ／ｒｒＬＪ−ヒスチジンヲ含むバルクホルダー
ミニマムメディウム に接種し、３０°Ｃにて対数増殖期まで培養し、ついで
半合成培地ＹＡＳ○（ ０． ０ ５％硫酸マグネシウ
ム、０．５％硫酸アンモニウム、４％グラニユー糖、０
．５％酵母エキス）に殖え継ぎ、さらに２６°Ｃで培養
する。対数増殖期にある菌体を遠心して集菌し、これに
５０ｍＭ！Ｊン酸緩衡液（食塩添加）ｌ′ＷＬｆ、０．
１％トリトンＸ１００．１ｍＭ ＰＭＳＦ （フッ化フ
ェニルメチルスルホニル ズ（０．２５〜Ｑ． ５ ｍｍ直径） ｌ ｒｒＬｌを
加え、４°Ｃで１０分間激しく振動することによシ、菌
体を破壊してＨＢｓ抗原を抽出する。
で得られた形質転換酵母の独立したコロニー１０個ｅ２
ｏβｇ ／ｒｒＬＪ−ヒスチジンヲ含むバルクホルダー
ミニマムメディウム に接種し、３０°Ｃにて対数増殖期まで培養し、ついで
半合成培地ＹＡＳ○（ ０． ０ ５％硫酸マグネシウ
ム、０．５％硫酸アンモニウム、４％グラニユー糖、０
．５％酵母エキス）に殖え継ぎ、さらに２６°Ｃで培養
する。対数増殖期にある菌体を遠心して集菌し、これに
５０ｍＭ！Ｊン酸緩衡液（食塩添加）ｌ′ＷＬｆ、０．
１％トリトンＸ１００．１ｍＭ ＰＭＳＦ （フッ化フ
ェニルメチルスルホニル ズ（０．２５〜Ｑ． ５ ｍｍ直径） ｌ ｒｒＬｌを
加え、４°Ｃで１０分間激しく振動することによシ、菌
体を破壊してＨＢｓ抗原を抽出する。
上記抽出液についてＨＢｓ抗原Ｒ工Ａキット（アボット
社製）によりＨＢｓ抗原活性を測定した。
社製）によりＨＢｓ抗原活性を測定した。
その結果を次の第１表に示す。なお、対照として、シャ
トルベクターｐＡＭ８２を用いて同様に処理して得られ
たデータ（コロニ一番号１４と１５）を合せて示す。こ
の結果から、本発明のシャトルベクターを用いた場合、
従来のシャトルベクターに比し、ＨＢｓ抗原量は顕著に
増大していることが明白である。
トルベクターｐＡＭ８２を用いて同様に処理して得られ
たデータ（コロニ一番号１４と１５）を合せて示す。こ
の結果から、本発明のシャトルベクターを用いた場合、
従来のシャトルベクターに比し、ＨＢｓ抗原量は顕著に
増大していることが明白である。
第 １ 表
第１図は、シャトルベクターｐＡＭ８２の構造を示し、
第２〜５図は、それぞれ本発明のシャトルベクターｐＯ
ＮＹｌ〜４の構造を示す。 第１図 Ｅ；大腸菌由来遺伝子 第２図 プロモーター 第３図 プロモーター 第４図 第５図
第２〜５図は、それぞれ本発明のシャトルベクターｐＯ
ＮＹｌ〜４の構造を示す。 第１図 Ｅ；大腸菌由来遺伝子 第２図 プロモーター 第３図 プロモーター 第４図 第５図
Claims (10)
- （１）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み、かつ酵
母の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域を担い
、その酸性ホスファターゼ形質発現調節領域下流の大腸
菌由来の遺伝子を一部除去していることを特徴とするシ
ャトルベクター。 - （２）除去した大腸菌由来の遺伝子が大腸菌プラスミド
ＰＢＲ３２２のｓａｌ I （６５１）部位からｐｖｕII
（２０６６）部位までの約１．４Ｋｂｐ配列またはこれ
を含む遺伝子配列である前記第（１）項記載のシャトル
ベクター。 - （３）除去した大腸菌由来の遺伝子が大腸菌プラスミド
ｐＢＲ３２２のｓａｌ I （６５１）部位からＴｔｈII
I− I （２２１９）部位までの約１．６Ｋｂｐの配列ま
たはこれを含む遺伝子配列である前記第（１）項記載の
シャトルベクター。 - （４）該抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域が
ホスファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリ
ペプチド（ｐ６０）の形質発現調節領域であり、そのｐ
６０の構造遺伝子の一部または全部もしくはさらにその
上流の種々の部位までが除去されている前記第（１）項
のシャトルベクター。 - （５）酵母の遺伝子がａｒｓ１および２μｏｒｉである
前記第（１）項のシャトルベクター。 - （６）酵母の遺伝子としてａｒｓ１、２μｏｒｉならび
に形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子を有する前
記第（１）項のシャトルベクター。 - （７）該選択マーカーとなる遺伝子がロイシン産生遺伝
子、ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子
、ウラシル産生遺伝子およびアデニン産生遺伝子から選
ばれる１種または２種以上である前記第（６）項のシャ
トルベクター。 - （８）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
ために必要なＤＮＡ配列である前記第（１）項のシャト
ルベクター。 - （９）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
ために必要なＤＮＡ配列ならびに形質転換大腸菌の選択
マーカーとなる遺伝子である前記第（１）項のシャトル
ベクター。 - （１０）該選択マーカーとなる遺伝子が、アンピシリン
耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子か
ら選ばれる１種または２種以上である前記第（９）項の
シャトルベクター。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60299363A JPH0655146B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | シヤトルベクタ− |
| EP86117998A EP0228080A3 (en) | 1985-12-27 | 1986-12-23 | Shuttle vector |
| CA000526236A CA1338380C (en) | 1985-12-27 | 1986-12-23 | Shuttle vector |
| US06/946,329 US4997767A (en) | 1985-12-27 | 1986-12-23 | Yeast shuttle vector |
| KR860011374A KR870006191A (ko) | 1985-12-27 | 1986-12-27 | 셔틀 벡터(Shuttle Vector) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60299363A JPH0655146B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | シヤトルベクタ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62155092A true JPS62155092A (ja) | 1987-07-10 |
| JPH0655146B2 JPH0655146B2 (ja) | 1994-07-27 |
Family
ID=17871585
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60299363A Expired - Lifetime JPH0655146B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | シヤトルベクタ− |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4997767A (ja) |
| EP (1) | EP0228080A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0655146B2 (ja) |
| KR (1) | KR870006191A (ja) |
| CA (1) | CA1338380C (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5936699A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | シヤトルベクタ− |
| US5268273A (en) * | 1990-12-14 | 1993-12-07 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same |
| JPH08201919A (ja) * | 1995-01-31 | 1996-08-09 | Arisawa Mfg Co Ltd | 巻き取りスクリーン |
| US7029911B1 (en) * | 1996-08-07 | 2006-04-18 | The Regents Of The University Of California | AFC1 and RCE1: isoprenylated CAAX processing enzymes |
| US6451572B1 (en) | 1998-06-25 | 2002-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Overexpression of phytase genes in yeast systems |
| US6511699B1 (en) * | 1999-03-31 | 2003-01-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Enzymes with improved phytase activity |
| US6841370B1 (en) | 1999-11-18 | 2005-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase |
| US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
| ES2597503T3 (es) * | 2001-10-31 | 2017-01-19 | Huvepharma Eood | Alimento para animales que contiene fitasa y método |
| WO2004024885A2 (en) * | 2002-09-13 | 2004-03-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve aspergillus phytases |
| US7919297B2 (en) | 2006-02-21 | 2011-04-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase |
| WO2008017066A2 (en) * | 2006-08-03 | 2008-02-07 | Cornell Research Foundation, Inc. | Phytases with improved thermal stability |
| US8192734B2 (en) | 2007-07-09 | 2012-06-05 | Cornell University | Compositions and methods for bone strengthening |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA843275B (en) * | 1983-05-05 | 1984-12-24 | Hoffmann La Roche | Novel vectors for interferon expression |
| EP0170169B1 (en) * | 1984-07-20 | 1991-03-20 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Recombinant dna containing a herpes simplex virus gene or a fragment thereof, yeast transformed with said recombinant dna, and method for the production of herpes simplex virus proteins |
-
1985
- 1985-12-27 JP JP60299363A patent/JPH0655146B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-12-23 EP EP86117998A patent/EP0228080A3/en not_active Withdrawn
- 1986-12-23 US US06/946,329 patent/US4997767A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-23 CA CA000526236A patent/CA1338380C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-27 KR KR860011374A patent/KR870006191A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0228080A2 (en) | 1987-07-08 |
| CA1338380C (en) | 1996-06-11 |
| KR870006191A (ko) | 1987-07-09 |
| US4997767A (en) | 1991-03-05 |
| JPH0655146B2 (ja) | 1994-07-27 |
| EP0228080A3 (en) | 1988-10-26 |
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