ES2597503T3 - Alimento para animales que contiene fitasa y método - Google Patents

Alimento para animales que contiene fitasa y método Download PDF

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Abstract

Método de reducción de la razón de pienso con respecto a aumento de peso de un animal monogástrico alimentando al animal con un producto alimenticio en el que el producto alimenticio comprende hexakisfosfato de mio-inositol, comprendiendo el método la etapa de alimentar al animal con el producto alimenticio en combinación con una fitasa de E. coli expresada en levadura, en el que la razón de pienso con respecto a aumento de peso del animal se reduce, en el que el animal es una especie aviar.

Description

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piensos puede incluir la fitasa y el portador y ningún componente adicional. La composición de aditivo para piensos puede mezclarse con el pienso para obtener una mezcla de pienso final con desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 2000 unidades de fitasa/kilogramo del pienso.
Por tanto, se ilustra un producto alimenticio que comprende una fuente de hexakisfosfato de mio-inositol, una fitasa expresada en levadura y un portador. Adicionalmente, se proporciona un método de mejora del valor nutricional de un producto alimenticio consumido por un animal monogástrico en el que el producto alimenticio comprende hexakisfosfato de mio-inositol en el que el método comprende las etapas de secar por pulverización una fitasa seleccionada del grupo que consiste en AppA derivada de Escherichia coli, AppA2 derivada de Escherichia coli y un mutante dirigido al sitio de AppA derivada de Escherichia coli, mezclar la fitasa con un portador y, opcionalmente, otros componentes, para producir una composición de aditivo para piensos para complementar un producto alimenticio con la fitasa, mezclar la composición de aditivo para piensos con el producto alimenticio y alimentar al animal con el producto alimenticio complementado con la composición de aditivo para piensos.
En este contexto, el portador puede ser cualquier portador adecuado para preparar una composición de aditivo para piensos conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, cascarilla de arroz, harinilla de trigo, un polisacárido (por ejemplo, almidones específicos), un monosacárido, aceite mineral, grasa vegetal, lípidos hidrogenados, carbonato de calcio, gelatina, leche desnatada en polvo, fitato y otros compuestos que contienen fitato, una mezcla de base, y similares. Una mezcla de base comprende normalmente la mayoría de los componentes, incluyendo vitaminas y minerales, de una mezcla de pienso final excepto por la combinación de pienso (por ejemplo, harina de maíz y harina de soja). La fitasa para su uso en la composición de aditivo para piensos es preferiblemente AppA derivada de E. coli, AppA2 derivada de E. coli o un mutante dirigido al sitio de AppA derivada de E. coli.
La composición de aditivo para piensos que contiene la fitasa secada por pulverización y un portador y, opcionalmente, otros componentes, se mezcla con la mezcla de pienso final para obtener un pienso con un número predeterminado de unidades de fitasa/kilogramo del pienso (por ejemplo, de aproximadamente 50 a aproximadamente 2000 unidades de fitasa/kilogramo del pienso). Antes de combinarse con el portador, la fitasa secada por pulverización se somete a ensayo para determinar la actividad fitasa para determinar la cantidad de polvo secado que va a combinarse con el portador para obtener una composición de aditivo para piensos con un número predeterminado de unidades de fitasa/gramo del portador. El portador que contiene fitasa se combina entonces con la mezcla de pienso final para obtener una mezcla de pienso final con un número predeterminado de unidades de fitasa/kilogramo del pienso. Por consiguiente, la concentración de fitasa en la composición de aditivo para piensos es mayor que la concentración de fitasa en la mezcla de pienso final.
Según la invención el producto alimenticio se alimenta en combinación con la fitasa expresada en levadura a pollos, pavos (pavipollos (es decir, primeras varias semanas tras la eclosión) y animales más mayores), patos y faisanes, cualquier otra especie aviar, animales mantenidos en cautividad (por ejemplo, animales de zoo) o animales domésticos.
Los animales monogástricos agrícolas se alimentan normalmente con composiciones de pienso para animales que comprenden productos vegetales que contienen fitato (por ejemplo, la harina de maíz y harina de soja contienen fitato (hexakisfosfato de mio-inositol)) como forma de almacenamiento principal de fosfato y, por tanto, es ventajoso complementar el pienso con fitasa. Por consiguiente, los productos alimenticios que pueden complementarse con fitasa según la invención incluyen pienso para animales agrícolas y pienso para aves de corral, y cualquier producto alimenticio para una especie aviar.
En el caso de un pienso para animales alimentado a animales monogástricos, puede usarse cualquier combinación de pienso para animales conocida en la técnica según la presente invención tal como harina de colza, harina de semilla de algodón, harina de soja y harina de maíz, pero la harina de soja y harina de maíz se prefieren particularmente. La combinación de pienso para animales se complementa con la fitasa expresada en levadura, pero pueden añadirse opcionalmente otros componentes a la combinación de pienso para animales. Los componentes opcionales de la combinación de pienso para animales incluyen azúcares e hidratos de carbono complejos tales como monosacáridos tanto solubles en agua como insolubles en agua, disacáridos y polisacáridos. Componentes de aminoácido opcionales que pueden añadirse a la combinación de pienso son arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, tirosina etilo HCl, alanina, ácido aspártico, glutamato de sodio, glicina, prolina, serina, cisteína etilo HCl, y análogos, y sales de los mismos. Vitaminas que pueden añadirse opcionalmente son tiamina HCl, riboflavina, piridoxina HCl, niacina, niacinamida, inositol, cloruro de colina, pantotenato de calcio, biotina, ácido fólico, ácido ascórbico y vitaminas A, B, K, D, E, y similares. También pueden añadirse minerales, componentes proteicos, incluyendo proteína obtenida de harina de carne o harina de pescado, huevo líquido o en polvo, componentes solubles de pescado, concentrado de proteína de suero lácteo, aceites (por ejemplo, aceite de soja), almidón de maíz, calcio, fosfato inorgánico, sulfato de cobre, sal y caliza. Puede añadirse cualquier componente de medicamento conocido en la técnica a la combinación de pienso para animales tal como antibióticos.
Las composiciones de pienso también pueden contener enzimas distintas de la fitasa expresada en levadura. Enzimas a modo de ejemplo son proteasas, celulasas, xilanasas y ácido fosfatasas. Por ejemplo, la desfosforilación completa del fitato puede no lograrse por la fitasa sola y la adición de una ácido fosfatasa puede dar como resultado
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una liberación de fosfato adicional. Puede añadirse una proteasa (por ejemplo, pepsina), por ejemplo, para escindir la fitasa expresada en levadura para potenciar la actividad de la fitasa. Una fitasa tratada con proteasa de este tipo puede presentar una capacidad potenciada para aumentar la biodisponibilidad de fosfato a partir de fitato, para reducir la razón de pienso con respecto a aumento de peso, para aumentar la masa ósea y el contenido en mineral, y para aumentar el peso del huevo o número de huevos puestos para una especie aviar en comparación con fitasa expresada en levadura intacta. Adicionalmente, pueden usarse combinaciones de fitasas, tal como cualquier combinación que pueda actuar de manera sinérgica aumentando la biodisponibilidad de fosfato a partir de fitato, o pueden usarse fragmentos proteolíticos de fitasas o combinaciones de fragmentos proteolíticos. En este sentido, el gen de fitasa expresado en levadura podría usarse para producir un producto truncado directamente para su uso en el método de la presente invención.
También pueden añadirse antioxidantes al producto alimenticio, tal como una composición de pienso para animales, para impedir la oxidación de la proteína fitasa usada para complementar el producto alimenticio. La oxidación puede impedirse por la introducción de antioxidantes que se producen de manera natural, tales como beta-caroteno, vitamina E, vitamina C y tocoferol o de antioxidantes sintéticos tales como hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, butilhidroquinona terciaria, galato de propilo o etoxiquina al producto alimenticio. También pueden añadirse compuestos que actúan de manera sinérgica con antioxidantes tales como ácido ascórbico, ácido cítrico y ácido fosfórico. La cantidad de antioxidantes incorporada de esta manera depende de requisitos tales como formulación del producto, condiciones de envío, métodos de envasado y vida útil de almacenamiento deseada.
Según un método de la presente invención, el producto alimenticio, tal como un pienso para animales, se complementa con cantidades de la fitasa expresada en levadura suficientes para aumentar el valor nutricional del producto alimenticio. Por ejemplo, en una realización, el producto alimenticio se complementa con menos de 2000 unidades (U) de la fitasa expresada en levadura por kilogramo (kg) del producto alimenticio. Esta cantidad de fitasa es equivalente a añadir aproximadamente 34 mg de la fitasa a un kg del producto alimenticio (aproximadamente el 0,0034% p/p). En otra realización, el producto alimenticio se complementa con menos de 1500 U de la fitasa expresada en levadura por kg del producto alimenticio. Esta cantidad de fitasa es equivalente a añadir aproximadamente 26 mg de la fitasa a un kg del producto alimenticio (aproximadamente el 0,0026% p/p). En otra realización, el producto alimenticio se complementa con menos de 1200 U de la fitasa expresada en levadura por kg del producto alimenticio. Esta cantidad de fitasa es equivalente a añadir aproximadamente 17 mg de la fitasa a un kg del producto alimenticio (aproximadamente el 0,0017% p/p). En otra realización el producto alimenticio, tal como una composición de pienso para animales, se complementa con de aproximadamente 50 U/kg a aproximadamente 1000 U/kg de la fitasa expresada en levadura (es decir, de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 14,3 mg/kg o de aproximadamente el 0,00007% a aproximadamente el 0,0014% (p/p)). En aún otra realización el producto alimenticio se complementa con de aproximadamente 50 U/kg a aproximadamente 700 U/kg de la fitasa expresada en levadura (es decir, de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente el 0,00007% a aproximadamente el 0,001% (p/p)). En todavía otra realización el producto alimenticio se complementa con de aproximadamente 50 U/kg a aproximadamente 500 U/kg de la fitasa expresada en levadura (es decir, de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 7 mg/kg o de aproximadamente el 0,00007% a aproximadamente el 0,007% (p/p)). En aún otra realización, el producto alimenticio se complementa con de aproximadamente 50 U/kg a aproximadamente 200 U/kg de la fitasa expresada en levadura (es decir, de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 2,9 mg/kg o de aproximadamente el 0,00007% a aproximadamente el 0,0003% (p/p)). En cada una de estas realizaciones se entiende que “kg” se refiere a kilogramos del producto alimenticio, tal como la composición de pienso final en el caso de una combinación de pienso para animales (es decir, el pienso en la composición como mezcla final). Además, una unidad (U) de actividad fitasa se define como la cantidad de enzima requerida para producir 1 mmol de fosfato inorgánico por minuto a partir de 1,5 mmol/l de fitato de sodio a 37ºC y a un pH de 5,5.
La fitasa expresada en levadura puede mezclarse con el producto alimenticio, tal como un pienso para animales (es decir, la composición de pienso como mezcla final), antes de alimentar al animal con el producto alimenticio o la fitasa puede alimentarse al animal con el producto alimenticio sin mezclado previo. Por ejemplo, la fitasa puede añadirse directamente a un producto alimenticio no tratado, peletizado o procesado de otra forma, tal como un pienso para animales, o la fitasa puede proporcionarse por separado del producto alimenticio en, por ejemplo, un bloque mineral, una píldora, una formulación de gel, una formulación líquida o en el agua para beber. Según la invención, alimentar al animal con el producto alimenticio “en combinación con” la fitasa significa alimentar el producto alimenticio mezclado con la fitasa o alimentar el producto alimenticio y la fitasa por separado sin mezclado previo.
La fitasa expresada en levadura puede usarse en una forma no encapsulada o encapsulada para alimentar al animal
o para su mezcla con una combinación de pienso para animales. La encapsulación protege a la fitasa frente a la descomposición y/u oxidación antes de su ingestión por el animal (es decir, la encapsulación aumenta la estabilidad de la proteína) y proporciona un producto seco para una alimentación más fácil al animal o para un mezclado más fácil con, por ejemplo, una combinación de pienso para animales. La fitasa expresada en levadura puede protegerse de esta manera, por ejemplo, recubriendo la fitasa con otra proteína o cualquier otra sustancia que se sabe en la técnica que es un agente de encapsulación eficaz tal como polímeros, ceras, grasas y aceites vegetales hidrogenados. Por ejemplo, la fitasa puede encapsularse usando una técnica reconocida en la técnica tal como una técnica de encapsulación con alginato de Na2+ en la que la fitasa se recubre con alginato de Na2+ seguido por
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conversión en alginato de Ca2+ en presencia de iones Ca2+ para la encapsulación. Alternativamente, la fitasa puede encapsularse mediante una técnica reconocida en la técnica tal como granulación (es decir, atomización de un líquido en estado fundido y enfriamiento de las gotitas para formar una perla). Por ejemplo, la fitasa puede granularse en copos de semilla de algodón hidrogenada o aceite de soja hidrogenado para producir un producto seco. La fitasa puede usarse en una forma totalmente no encapsulada, una forma totalmente encapsulada o pueden añadirse mezclas de fitasa no encapsulada y encapsulada al producto alimenticio, tal como una composición de pienso para animales, o alimentarse directamente al animal sin mezclado previo con el producto alimenticio. Cualquier fitasa para su uso según el método de la presente invención puede tratarse de manera similar.
Según el método de la presente invención, el producto alimenticio que contiene fitasa puede administrarse a animales por vía oral en un producto alimenticio, tal como un pienso para animales, o en un bloque mineral o en el agua para beber, pero puede utilizarse cualquier otro método de administración eficaz conocido por los expertos en la técnica (por ejemplo, una forma de píldora). El producto alimenticio que contiene fitasa expresada en levadura puede administrarse a los animales durante cualquier periodo de tiempo que sea eficaz para aumentar la biodisponibilidad de fosfato a partir de fitato, para reducir la razón de pienso con respecto a aumento de peso, o para aumentar la masa ósea y el contenido en mineral del animal. Por ejemplo, en el caso de una composición de pienso alimentada a un animal monogástrico, la composición de pienso que contiene fitasa expresada en levadura puede alimentarse al animal diariamente durante toda la vida del animal. Alternativamente, la composición de pienso que contiene fitasa puede alimentarse al animal durante un periodo de tiempo más corto. Los periodos de tiempo para alimentar el producto alimenticio que contiene fitasa a los animales no son limitativos y debe apreciarse que puede usarse cualquier periodo de tiempo que se determina que es eficaz para potenciar la nutrición de los animales administrando el producto alimenticio que contiene fitasa.
EJEMPLO 1
COMPOSICIÓN DE COMBINACIÓN DE PIENSO PARA ANIMALES
La composición de la mezcla de piensos para pollos (es decir, la composición de pienso sin fitasa) fue tal como sigue:
Tabla 1. Composición de la combinación de pienso para animales usada en ensayos en pollos y cerdos.
Componente
Ensayos en pollos Ensayo en cerdos
Harina de maíz
hasta 100,0 hasta 100,0
Maíz
50,89 61,35
Harina de soja, sin cáscara
39,69 31,19
Aceite de soja
5,00 3,00
Caliza, molida
1,67 1,06
Sal
0,40 --
Mezcla de vitaminas para pollos
0,20 --
Mezcla de vitaminas para cerdos
- 0,20
Mezcla de oligoelementos para pollos
0,15 --
Mezcla de oligovitaminas para cerdos
- 0,35
Cloruro de colina (60%)
0,20 --
Premezcla de antibióticos para cerdos (CSP)
- 0,50
Premezcla de bacitracina
0,05 --
Sulfato de cobre
- 0,08
L-Lisina HCl, calidad para alimentación
- 0,17
DL-Metionina, calidad para alimentación
0,20 0,05
EJEMPLO 2
PREPARACIÓN DE FITASA
Se inocularon cultivos simiente en levadura en medio de crecimiento con Pichia pastoris X33 transformada con o bien AOX1-appA, pGAP-appA2 o bien mutante AOX1-U. Se hicieron crecer los cultivos simiente a 30ºC durante aproximadamente 24 horas hasta que se alcanzó una DO600 de aproximadamente 50. Entonces se usaron los cultivos simiente para inocular fermentadores (procedimiento discontinuo) que contenían medio de crecimiento FM22 estéril que contenía glucosa al 5%. Se diluyeron los cultivos simiente de 24 horas de aproximadamente 1:25 a aproximadamente 1:50 en el medio de crecimiento FM-22. Se incubaron los cultivos de levadura de manera aerobia en los fermentadores a 30ºC con control del pH a 6,0 (usando NH2OH) y con alimentación de glucosa continua hasta que los cultivos alcanzaron una OD600 de aproximadamente 400 (aproximadamente 36 horas).
Para recoger las fitasas del medio de cultivo, se enfriaron rápidamente los cultivos de levadura hasta 8ºC. Se separaron las células del medio de cultivo mediante centrifugación y mediante microfiltración. Las fitasas estaban puras al 70-80% en el medio de cultivo y se prepararon para su combinación con un portador como aditivo para
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piensos tal como sigue.
Se concentró el medio libre de células que contenía las fitasas secretadas mediante ultrafiltración (límite de exclusión de 10.000 PM). Se transfirieron los materiales retenidos en la ultrafiltración (el 7-5% de sólidos) a recipientes estériles para el secado por pulverización. Se secaron por pulverización los materiales retenidos usando técnicas convencionales conocidas en la técnica y se recogió el polvo resultante (el 4-6% de humedad).
Se realizaron pruebas microbiológicas del polvo y se sometió a ensayo el polvo para determinar la actividad fitasa. Se usó la actividad fitasa del polvo (unidades de actividad fitasa/mg de polvo) para determinar la cantidad de polvo secado que iba a combinarse con harinilla de trigo (es decir, el portador) para obtener una mezcla de fitasa/portador con un número predeterminado de unidades de fitasa/gramo del portador. Se mezcló el polvo de fitasa secado con la harinilla de trigo y se envasó en recipientes a prueba de humedad. Se mezcló la harinilla de trigo que contenía fitasa con una combinación de pienso para animales según se necesitase para obtener una mezcla de pienso final con un número predeterminado de unidades de fitasa/kg del pienso (de aproximadamente 400 a aproximadamente 1000 U/kg).
EJEMPLO 3
COMPOSICIÓN DE ADITIVO PARA PIENSOS
Las siguientes composiciones son a modo de ejemplo de composiciones de aditivo para piensos que pueden mezclarse con una combinación de pienso para animales, tal como la combinación de pienso para animales descrita en el ejemplo 1, para obtener una mezcla de pienso final con, por ejemplo, de aproximadamente 50 U de fitasa/kilogramo de la mezcla de pienso final a aproximadamente 2000 U de fitasa/kilogramo del pienso. Las composiciones de aditivo para piensos descritas a continuación no son limitativas y debe apreciarse que puede usarse cualquier composición de aditivo para pienso que contenga fitasa que se determina que es eficaz para potenciar el valor nutricional del pienso para animales. Se muestran composiciones de aditivo para piensos a modo de ejemplo para una composición de aditivo para piensos que contiene 600 unidades de fitasa/gramo de la composición de aditivo para piensos o 5000 unidades de fitasa/gramo de la composición de aditivo para piensos.
600 unidades de fitasa/gramo
5000 unidades de fitasa/gramo
(porcentaje en peso)
(porcentaje en peso)
Cascarilla de arroz
82,64 76,35
Carbonato de calcio
15,00 15,00
Aceite
1,5 1,5
Enzima
0,86 7,15
Trigo molido Carbonato de calcio Aceite Enzima
600 unidades de fitasa/gramo (porcentaje en peso) 82,64 15,00 1,5 0,86 5000 unidades de fitasa/gramo (porcentaje en peso) 76,35 15,00 1,5 7,15
EJEMPLO 4
PROTOCOLO DE ALIMENTACIÓN
Se alimentaron pollos usando el protocolo descrito en Biehl, et al. (J. Nutr. 125:2407-2416 (1995)). En resumen, se realizaron los ensayos pollos macho y hembra del cruce de machos de New Hampshire y hembras Columbian y se realizaron en una sala de laboratorio controlada ambientalmente con 24 horas de iluminación fluorescente. Desde el día 0 hasta el día 7 tras la eclosión, se alimentaron los pollos con una dieta basal del 23% de proteína en bruto, harina de maíz-soja enriquecida con metionina tal como se describió anteriormente en el ejemplo 1. En el día 8, se pesaron los pollos, se anillaron en las alas y se asignaron aleatoriamente a tratamientos experimentales. Cinco jaulas de tres o cuatro pollos por jaula recibieron cada tratamiento dietético durante un periodo de alimentación experimental de 13 días, y los pollos tenían un peso inicial promedio de 80 a 100 gramos.
A lo largo del periodo de alimentación de 13 días, se confinaron los pollos en baterías para pollos controladas termostáticamente, y también se usaron bebederos y comederos de acero inoxidable. Se emprendieron estas etapas para evitar la contaminación mineral del entorno. Estaban libremente disponibles dietas y agua desionizada destilada a lo largo del periodo de alimentación.
Se sometieron a ayuno los cerdos durante 12 antes del comienzo de cada ensayo, se alimentaron con las dietas experimentales durante 23 días, y se sometieron a ayuno durante 12 horas tras completarse cada ensayo. Se
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T1
T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
R1
303 392 434 434 426 389 450 474 465 397
R2
330 462 448 454 429 430 425 449 472 396
R3
336 391 445 458 446 425 428 445 464 397
R4
350 416 432 424 432 420 441 464 449 386
R5
335 388 421 467 425 389 453 461 483 420
Media
331f 410c 436c 447abc 432cd 411de 439bc 459ab 467a 399c
g/p/d
25,5 31,5 33,5 34,4 33,2 31,6 33,8 35,3 35,9 30,7
EEM agrupado = 7 LSD = 21 Aumento/pienso (g/kg)
T1
T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
R1
611 718 726 740 738 729 742 742 720 678
R2
665 618 703 741 738 749 741 727 738 692
R3
696 708 736 730 719 736 743 722 736 671
R4
668 700 715 733 731 733 738 738 743 715
R5
665 717 721 710 742 688 691 730 749 710
Media
661c 692b 720a 731a 734a 727a 731a 732a 737a 691b
EEM agrupado = 10 LSD = 28 Peso de tibia seco (mg/p)
T1
T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
R1
659 804 883 981 892 787 914 1059 1106 757
R2
655 769 891 977 907 918 873 997 1083 759
R3
713 751 878 1008 901 820 905 964 1065 726
R4
740 742 931 925 823 809 923 1083 1096 729
R5
714 866 942 841 809 931 1036 1132 764 714
Media
698g 756f 890d 967c 873dc 829e 909d 1028b 1096a 747f
EEM agrupado = 16 LSD = 45 Cenizas de tibia (mg/p)
T1
T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
R1
232 307 406 492 434 345 439 590 617 278
R2
215 315 415 507 445 435 420 546 600 305
R3
259 300 406 520 435 382 451 523 604 284
R4
237 297 442 462 392 372 454 590 616 267
R5
242 277 396 471 432 373 471 548 642 316
Media
237h 299g 413e 490c 428de 381f 447d 559b 616a 290g
10 EEM agrupado = 10
imagen9
imagen10
imagen11
imagen12
Curva patrón de KH2PO4: Y = cenizas de tibia (mg)
X = ingesta de P complementaria o equivalente (g) Y = 257,1 + 299,0 X r2 = 0,88
5 Para actividad fitasa de 500 U/kg (cálculos de ejemplo usando la media de tratamiento de cenizas de tibia)
% de P biodisponible Natuphos®: (293 -257,1)/299,0 = 0,120 g de P de 433 g de FI = 0,030% Ronozyme®: (266 -257,1)/299,0 = 0,030 g de P de 424 g de FI = 0,007% Mutante U: (467 -257,1)/299,0 = 0,702 g de P de 499 g de FI = 0,141% AppA: (437 -257,1)/299,0 = 0,602 g de P de 487 g de FI = 0,124% AppA2: (448 -257,1)/299,0 = 0,638 g de P de 513 g de FI = 0,124%
Resultados de ANOVA (cálculo realizado para cada jaula de cuatro aves; leyenda del tratamiento en la página previa)
10 P biodisponible (%)
4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
R1
0,017 0,034 0,037 0,051 0,047 0,062 0,076 -- 0,097 0,117 0,136 0,133
R2
0,031 0,026 0,058 0,057 0,049 0,086 0,072 -0,026 0,071 0,145 0,134 0,137
R3
0,034 0,017 0,005 0,052 0,069 0,061 0,101 0,028 0,098 0,150 0,105 0,124
R4
0,020 0,043 0,030 0,060 0,045 0,053 0,071 0,006 0,104 0,163 0,128 0,106
R5
0,024 0,018 0,040 0,034 0,038 0,071 0,082 0,017 0,070 0,128 0,117 0,120
Media
0,025 0,027 0,034 0,051 0,050 0,066 0,080 0,006 0,088 0,140 0,124 0,124
EEM agrupado = 0,006 LSD = 0,018
Contrastes
Significación (valor de P)
Respuesta lineal a Natuphos® (grupos de tratamiento 5 (tto) 4-10)
0,001
Respuesta cuadrática a Natuphos®
0,208
500 U/kg de Natuphos® (tto 5) frente a 500 U/kg de fitasas expresadas
0,001
en levadura (tto 13-15)
500 U/kg de Natuphos® (tto 5) frente a 500 U/kg de Ronozyme® (tto 11)
0,031
500 U/kg de Ronozyme® (tto 11) frente a 500 U/kg de fitasas expresadas
0,001
en levadura (tto 13-15)
300 U/kg de mutante U (tto 12) frente a 500 U/kg de mutante U (tto 13)
0,001
500 U/kg de mutante U (tto 12) frente a 500 U/kg de AppA (tto 14)
0,074
5
10
15
20
25
500 U/kg de mutante U (tto 12) frente a 500 U/kg de AppA2 (tto 15) 0,074 Regresión lineal múltiple: Y = ceniza de tibia (mg)
X = ingesta de fitasa (U) Y = 263,462 + 0,144 (Natuphos®) + 0,014 (Ronozyme®) + 0,823 (mutante U) + 0,711 (AppA) + 0,718 (AppA2) R2 = 0,93
Actividad fitasa relativa Razón (%) Eq. a 500 U/kg de Natuphos®
Ronozyme®: (0,014/0,144)*100 = 10 50 Mutante U: (0,823/0,144)*100 = 572 2860 AppA: (0,711/0,144)*100 = 494 2470 AppA2: (0,718/0,144)*100= 499 2495
A 500 U/kg, las enzimas expresadas en levadura (mutante U, AppA y AppA2) eran más eficaces que Natuphos® o Ronozyme® (ambas enzimas se expresan en sistemas de expresión fúngicos) en la mejora de las respuestas in vivo sometidas a prueba. Por ejemplo, el mutante U, AppA y AppA2 eran cuatro veces más eficaces que Natuphos® en la liberación de fosfato (véase la figura 3).
EJEMPLO 11
EFECTOS IN VIVO DE FITASAS EXPRESADAS EN LEVADURA EN POLLOS
El procedimiento fue tal como se describió en el ejemplo 8 excepto porque los pollos tenían un peso inicial promedio de 83 gramos, y los grupos de tratamiento fueron los siguientes:
GRUPOS DE TRATAMIENTO:
1.
Dieta basal (el 0,10% de P; el 0,75% de Ca)
2.
Igual que 1 + el 0,05% de P de KH2PO4
3.
Igual que 1 + el 0,10% de P de KH2PO4
4.
Igual que 1 + el 0,15% de P de KH2PO4
5.
Igual que 1 + 500 U/kg de fitasa Natuphos® (lote 1)
6.
Igual que 1 + 500 U/kg de fitasa Natuphos® (lote 2)
7.
Igual que 1 + 1000 U/kg de fitasa Natuphos® (lote 2)
8.
Igual que 1 + 500 U/kg de fitasa Ronozyme® (lote 1)
9.
Igual que 1 + 500 U/kg de fitasa Ronozyme® (lote 2)
10.
Igual que 1 + 1000 U/kg de fitasa Ronozyme® (lote 2)
11.
Igual que 1 + 500 U/kg de fitasa mutante U
12.
Igual que 1 + 500 U/kg de fitasa AppA
13.
Igual que 1 + 500 U/kg de fitasa AppA2
14. Igual que 1 + 500 U/kg de AppA2 + fitasa con promotor novedoso (AppA2/p) Las tablas son tal como se marca en el ejemplo 8. Se midieron los efectos in vivo de la complementación con fitasa
descrita en el ejemplo 8 y los resultados fueron los siguientes: Aumento de peso (g/p)
T1
T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
R1
152 252 295 299 215 235 241 223 256 254 325 308 322 314
R2
199 238 290 332 206 210 256 237 212 243 312 316 309 306
R3
163 257 297 347 235 254 250 215 218 246 324 309 313 335
R4
176 262 288 330 242 250 288 228 195 223 329 318 310 317
R5
190 257 295 356 193 230 288 218 214 259 306 307 314 317
Media
176 253 293 333 218 236 265 224 219 245 319 312 314 318
g/p/d
12,6 18,1 20,9 23,8 15,6 16,9 18,9 16,0 15,6 17,5 22,8 22,3 22,4 22,7
EEM agrupado = 7 LSD = 19 Ingesta de pienso (g/p)
T1
T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
R1
279 373 431 424 347 386 352 359 284 321 435 429 447 424
R2
335 352 407 441 333 340 375 363 325 368 395 441 427 465
R3
291 374 419 472 369 400 381 330 348 367 439 459 440 472
R4
292 386 400 457 366 370 405 358 328 356 451 473 421 441
R5
344 374 427 483 341 370 450 336 344 394 425 420 449 445
Media
308 372 417 455 351 373 393 349 326 361 429 444 437 449
g/p/d
22,0 26,6 29,8 32,5 25,1 26,6 28,1 24,9 23,3 25,8 30,6 31,7 31,2 32,1
EEM agrupado = 10 LSD = 28 Aumento/pienso (g/kg)
T1
T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
R1
544 674 684 705 618 608 684 621 676 793 747 718 719 742
R2
593 676 713 752 617 616 682 653 651 659 790 716 722 657
R3
558 686 709 736 636 635 656 650 626 671 737 673 713 708
R4
601 680 720 723 662 677 711 637 594 627 729 673 737 719
R5
551 685 690 737 565 622 641 649 624 658 721 732 700 712
Media
569 680 703 731 620 632 675 642 634 682 745 702 718 708
EEM agrupado = 13 LSD = 37
21
Peso de tibia seco (mg/p)
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
R1
671 886 1048 1002 919 840 912 825 891 831 1117 1041 1057 1091
R2
815 -- 1003 1298 752 765 906 865 756 916 1113 1152 1041 1070
R3
730 884 1036 1296 849 942 937 864 849 816 1154 1017 1130 1220
R4
698 911 931 1232 802 901 918 837 807 872 1163 1165 1047 1078
R5
773 929 1037 1266 793 845 867 768 825 962 1044 1054 1130 1140
Media
737 903 1011 1219 823 859 908 832 826 879 1118 1086 1081 1120
EEM agrupado = 27 LSD = 77 Ingesta de P complementaria (g)
1
2 3 4
R1
0 0,187 0,431 0,636
R2
0 0,176 0,407 0,661
R3
0 0,187 0,419 0,708
R4
0 0,193 0,400 0,685
R5
0 0,187 0,427 0,724
Media
0d 0,186c 0,417b 0,683a
Cenizas de tibia (mg/p)
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
R1
174 255 381 367 254 230 246 239 253 224 415 385 404 411
R2
197 279 343 483 199 198 244 242 200 249 395 425 357 353
R3
185 279 361 486 238 261 276 230 228 231 410 370 389 454
R4
175 287 315 459 220 262 282 222 210 244 416 455 371 396
R5
183 261 335 481 211 229 264 202 222 262 383 380 406 431
Media
183 272 347 455 224 236 262 227 223 242 404 403 385 409
EEM agrupado = 12 LSD = 32 Cenizas de tibia (%)
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
R1
25,88 28,82 36,31 36,67 27,60 27,39 26,91 29,01 28,42 26,99 37,15 37,03 38,24 37,64
R2
24,20 -- 34,21 37,18 26,51 25,89 26,86 27,97 26,44 27,16 35,49 36,90 34,33 32,98
R3
25,43 31,61 34,87 37,53 28,06 27,75 29,52 26,65 26,85 28,35 35,54 36,34 34,40 37,22
R4
25,04 31,53 33,85 37,22 27,42 29,15 30,73 26,46 26,03 27,97 35,76 39,09 35,43 36,71
R5
23,72 28,11 32,27 38,02 26,61 27,17 30,41 26,26 26,88 27,22 36,67 36,02 35,99 37,80
Media
24,85 30,02 34,30 37,32 27,24 27,47 28,89 27,27 26,92 27,54 36,12 37,08 35,68 36,47
EEM agrupado = 0,57
imagen13
imagen14
R2
1785 1698 1734 1855 1694
R3
1690 1665 1775 1724 1824
R4
1688 1745 1739 1823 1760
media
1716 1725 1733 1798 1746
EEM agrupado = 26 LSD = 78 Pesos corporales de 4 semanas (g: media de 12 gallinas)
T1
T2 T3 T4 T5
R1
1566 1802 1763 1769 1748
R2
1558 1734 1816 1860 1723
R3
1633 1707 1744 1769 1850
R4
1615 1749 1762 1827 1757
media
1593 1748 1771 1806 1770
EEM agrupado = 21 LSD = 64 Pesos corporales de 12 semanas (g: media de 12 gallinas)
T1
T2 T3 T4 T5
R1
- 1876 1831 1792 1781
R2
- 1791 1775 1856 1791
R3
- 1800 1765 1806 1933
R4
- 1853 1814 1876 1815
media
- 1830 1796 1833 1830
EEM agrupado = 24 LSD = 74 Tratamientos:
10 1. Dieta basal de harina de maíz-soja deficiente en P (el 0,10% de pa; el 3,8% de Ca; el 17% de CP)
2.
Como 1 + el 0,10% de Pi de KH2PO4
3.
Como 1 + 150 U/kg de fitasa r-AppA2
4.
Como 1 + 300 U/kg de fitasa r-AppA2
5. Como 1 + 10.000 U/kg de fitasa r-AppA2 15 Ingesta de pienso (g/gallina/d)1
T1
T2 T3 T4 T5
R1
89 118 122 115 116
imagen15
imagen16
Composición química
Proteína en bruto, %h
22,6
Fósforo total, %h
0,42
Fósforo disponible, %i
0,10
Calcio, %i
0,75
ME, kcal/kgi
3123
a Suministrado lo siguiente por kilogramo de dieta completa: Fe, 75 mg (FeSO4H2O); Zn, 100 mg (ZnO); Mn, 75 mg
(MnO); Cu, 8 mg (CuSO4H2O); I, 0,35 mg (CaI2); Se, 0,3 mg (Na2SeO3); NaCl, 3 g. b Suministrado lo siguiente por kilogramo de dieta completa: Fe, 90 mg (FeSO4H2O); Zn, 100 mg (ZnO); Mn, 20 mg (MnO); Cu, 8 mg (CuSO4H2O); I, 0,35 mg (CaI2); Se, 0,3 mg (Na2SeO3); NaCl, 3 g.
5 c Suministrado lo siguiente por kilogramo de dieta completa: acetato de retinilo, 1,514 µg; colecalciferol, 25 µg; acetato de DL--tocoferilo, 11 mg; complejo de bisulfito de sodio-menadiona, 2,3 mg; niacina, 22 mg; D-Capantotenato, 10 mg; riboflavina, 4,4 mg; vitamina B12, 11 µg.
d Suministrado lo siguiente por kilogramo de dieta completa; acetato de retinilo, 2,273 µg; colecalciferol, 16,5 µg; acetato de DL--tocoferilo, 88 mg; menadiona, 4,4 mg (complejo de bisulfito de sodio-menadiona); niacina, 33 mg; 10 D-Ca-pantotenato, 24,2 mg; riboflavina, 8,8 mg; vitamina B12, 35 µg; cloruro de colina, 319 mg. e Proporcionados 50 mg de bacitracina por kilogramo de dieta completa. f Proporcionados 55 mg de mecadox por kilogramo de dieta completa. g Proporcionados 38 mg de roxarsona por kilogramo de dieta completa. h Analizado (AOAC, 1999). 15 i Calculado (NRC, 1994; NRC, 1998). Valoración de biodisponibilidad de fósforo relativa en pollos afectados por dos enzimas fitasa diferentes (ensayo en pollos 1)a.
Dieta
Aumento de peso, g Aumento/pienso, g/kg Cenizas de tibia P biodisponible, %
%
mg
1. Dieta basal
259e 617d 28,1f 264f -
2. Como 1 + el 0,05% de Pi(KH2PO4)
290d 654c 32,2d 311e -
3. Como 1 + el 0,10% de Pi(KH2PO4)
323c 639cd 36,4c 414d -
4. Como 1 + 500 FTU/kg de Natuphos®
289d 666c 30,0c 293c 0,027d
5. Como 1 + 500 FTU/kg de ECP
346c 656c 37,8c 448c 0,124c
EEM agrupado
6 10 0,5 10 0,006
a Los valores son medias de cinco jaulas de cuatro pollos macho alimentados con las dietas experimentales durante el periodo de 8 a 22 d tras la eclosión; el peso inicial promedio fue de 91 g.
b La regresión lineal de cenizas de tibia (mg) para las dietas1 a 3 como función de la ingesta de P complementaria
(g) fue Y = 257,1 ± 9,8 + 299,0 ± 30,7 X (r2 = 0,88); las concentraciones de P biodisponible (rendimientos de P equivalentes) para las dietas 4 y 5 se determinaron calculando la ingesta de P biodisponible equivalente (g) a partir de la curva patrón, dividiendo esto entre la ingesta de pienso (g) y multiplicando por 100.
c,d,e,f Las medias dentro de una columna con distintos superíndices son diferentes, P <0,05.
Biodisponibilidad de fósforo relativa en pollos alimentados con enzimas fitasa diferentes (ensayo en pollos 2)a.
Dieta
Aumento de peso, g Aumento/pienso, g/kg Cenizas de tibia P biodisponible, %
%
mg
1. Dieta basal
176k 569k 24,9k 183k -
2. Como 1 + el 0,05% de Pi(KH2PO4)
253hi 680h 30,0h 272h -
3. Como 1 + el 0,10% de Pi(KH2PO4)
293g 703fgh 34,3g 347g -
4. Como 1 + el 0,15% de Pi(KH2PO4)
333f 731ef 37,3e 455e -
5. Como 1 + 500 FTU/kg de Natuphos®c
218j 620j 27,2j 224j 0,026g
6. Como 1 + 500 FTU/kg de Natuphos®d
236ij 632j 27,5ij 236ij 0,032fg
7. Como 1 + 1.000 FTU/kg de Natuphos®d
265i 675gh 28,9hi 262hi 0,048f
8. Como 1 + 500 FTU/kg de Ronozyme®
219i 634j 26,9j 223j 0,028g
9. Como 1 + 1.000 FTU/kg de Ronozyme®
245i 682gh 27,5ij 242hij 0,038fg
10. como 1 + 500 FTU/k de ECP
318ef 708fgh 36,5ef 409f 0,125e
EEM agrupado
7 10 0,6 12 0,006
a Los valores son medias de cinco jaulas de cuatro pollos macho alimentados con las dietas experimentales durante el periodo de 8 a 22 d tras la eclosión; el peso inicial promedio fue de 83 g.
b La regresión lineal de cenizas de tibia (mg) para las dietas 1 a 4 como función de la ingesta de P complementaria
10 (g) fue Y = 187,9 ± 8,7 + 393,4 ± 21,2 X (r2 = 0,95); las concentraciones de P biodisponible (rendimientos de P equivalentes) para las dietas 4-11 se determinaron calculando la ingesta de P biodisponible equivalente (g) a partir de la curva patrón, dividiendo esto entre la ingesta de pienso (g) de la jaula y multiplicando por 100.
c La enzima era del mismo lote que se usó para el ensayo en pollos 1.
d La enzima era de un lote distinto del que se usó para el ensayo en pollos 1.
15 e,f,z,h.i,j,k Las medias dentro de una columna con distintos superíndices son diferentes, P <0,05.
El efecto del nivel de actividad sobre la eficacia de liberación de fósforo de fitasa de E. coli en pollos (ensayo en pollos 3)a.
Dieta
Aumento de peso, g Aumento/pienso, g/kg Cenizas de tibia P biodisponible, %b
mg
1. Dieta basal
219h 661c 237i –
2. Como 1 + 0,05% de Pi(KH2PO4)
283fg 692d 299h –
3. Como 1 + el 0,10% de Pi(KH2PO4)
314c 720c 413g –
4. Como 1 + el 0,15% de Pi(KH2PO4)
327de 731c 490c –
5. Como 1 + 500 FTU/kg de ECP
321dc 731c 447f 0,125c
6. Como 1 + 1.000 FTU/kg de ECP
335cd 732c 559d 0,183d
7. Como 1 + 1.500 FTU/kg de ECP
344c 737c 616c 0,211c
8. Como 1 + 500 FTU/kg de Natuphos®
276g 691d 290h 0,037f
EEM agrupado
6 10 12 0,005
a Los valores son medias de cinco jaulas de cuatro pollos macho alimentados con las dietas experimentales durante el periodo de 8 a 22 d tras la eclosión; el peso inicial promedio fue de 97 g.
b La regresión lineal de cenizas de tibia (mg) para las dietas 1 a 4 como función de la ingesta de P complementaria
(g) fue Y = 232,0 ± 6,9 + 389,9 ± 16,7 X (r2 = 0,97); las concentraciones de P biodisponible (rendimientos de P equivalentes) para las dietas 5 a 8 se determinaron calculando la ingesta de P biodisponible equivalente (g) de la curva patrón, dividiendo esto entre la ingesta de pienso (g) de la jaula, y multiplicando por 100.
c,d,e,f,s,h,i Las medias dentro de una columna con distintos superíndices son diferentes, P <0,05.
Combinar las fitasas 3 y 6 no produce efectos sinérgicos en la liberación de Pi en pollos alimentados con una dieta de harina de soja y maíz (ensayo en pollos 4)a.
Dieta
Aumento de Aumento/pienso, Cenizas de tibia P biodisponible, %b
peso, g
g/kg % mg
1. Dieta basal
137g 610g 25,4g 134h –
2. Como 1 + el Pi(KH2PO4)
0,05% de 191ef 678dc 29,0f 198fg –
3. Como 1 + el Pi(KH2PO4)
0,10% de 225d 712d 32,8e 253e –
4. Como 1 + el Pi(KH2PO4)
0,15% de 276c 762c 36,3d 339d –
5. Como 1 + 500 FTU/kg de Natuphos®
192ef 624fg 28,0f 187g 0,041g
6. Como 1 + 500 FTU/kg de Ronozyme®
182f 655cf 27,7f 188g 0,047fg
7. Como 1 + 500 FTU/k de ECP
272c 760c 37,0d 343d 0,153d
8. Como 5 + 6
211dc 693dc 28,3f 212fg 0,064ef
9. Como 5 + 7
282c 763c 37,8d 360d 0,162d
10. Como 1 + 1.000 FTU/kg de Natuphos®
217d 703d 29,0f 217f 0,067c
11. Como 1 + 1.000 FTU/kg de Ronozyme ®
201def 666ef 27,9f 194fg 0,050efg
12. Como 1 + 1.000 FTU/kg de ECP
292c 758c 41,1c 433c 0,206c
EEM agrupado
9 15 0,6 10 0,007
a Los valores son medias de cinco jaulas de cuatro pollos macho alimentados con las dietas experimentales durante el periodo de 8 a 22 d tras la eclosión; el peso inicial promedio fue de 68 g.
b La regresión lineal de cenizas de tibia (mg) para las dietas 1 a 4 como función de la ingesta de P complementaria
(g) fue Y = 138,6 ± 4,9 + 371,3 ± 14,7 X (r2 = 0,97); las concentraciones de P biodisponible (rendimientos de P equivalentes) para las dietas 5 a 8 se determinaron calculando la ingesta de P biodisponible equivalente (g) de la curva patrón, dividiendo esto entre la ingesta de pienso (g) de la jaula y multiplicando por 100.
c,d,e,f,g Las medias dentro de una columna con distintos superíndices son diferentes, P <0,05.
Efecto de fitasa de E. coli sobre el rendimiento de gallinas ponedoras desde la semana 1-4.a
Dieta
Peso inicial de gallina, g Peso de gallina de 4 semanas, g Ingesta de pienso, g/d Producción de huevos, %b Peso del huevo, g
1. Dieta basal deficiente en P
1716 1593 90 54,0 61,0
2. Como 1 + el 0,10% de Pi
1725 1748 122 84,8 64,2
3. Como 1 + 150 FTU/kg de ECP
1733 1771 119 83,7 63,8
4. Como 1 + 300 FTU/kg de ECP
1798 1806 119 82,3 65,4
5. Como 1 + 10.000 FTU/kg de ECP
1746 1770 123 85,9 65,1
EEM agrupado
26 21c 2c 1,6c 0,7c
a Los datos son medias de cuatro réplicas de 12 gallinas para las 4 primeras semanas del periodo de estudio.
b La producción de huevos (%) se analizó usando la covarianza; los datos presentados son medias de mínimos cuadrados. c Dieta 1 frente a dietas 2-5, P <0,01. Efecto de fitasa de E. coli sobre el rendimiento de gallinas ponedoras desde la semana 5-12a.
Dieta Peso de gallina de Ingesta de pienso, Producción de Peso del huevo, g 4 semanas, g g/d huevos, %b
2. Como 1 + el 0,10% de
1830 120 80,5 64,0
Pi
3. Como 1 + 150 FTU/kg
1796 118 80,6 64,1
de ECP
4. Como 1 + 300 FFU/kg
1833 116 77,2 65,5
ECP
5. Como
1 + 10.000 1830 120 81,2 64,8
FTU/kg de ECP
EEM agrupado
24 2 2,5 0,5c
5 a Los datos son medias de cuatro réplicas de 12 gallinas desde las semanas 5 hasta la12 del periodo de estudio. La
dieta 1 se eliminó del estudio debido a una producción de huevos escasa. b La producción de huevos (%) se analizó usando la covarianza; los datos presentados son medias de mínimos cuadrados.
c Dieta 3 frente a dietas 4 y 5, P <0,01. 10 Efecto de fitasa de E. coli sobre el rendimiento de gallinas ponedoras desde la semana 1-12a.
Pesos de gallina
Ingesta de pienso, g/d Producción de huevos, %b Peso del huevo, g
Dieta
Inicial 4 semanas 12 semanas
1. Dieta basal deficiente en P
1716 1593 - 90 53,8 61,0
2. Como 1 + el 0,10% de Pi
1725 1748 1830 121 81,2 64,1
3. Como 1 + 150 FTU/kg de ECP
1733 1771 1796 118 80,7 64,1
4. Como 1 + 300 FTU/kg de ECP
1798 1806 1833 117 77,8 65,5
5. Como 1 + 10.000 FTU/kg de ECP
1746 1770 1830 121 82,9 64,8
EEM agrupado
26 21c 24 2c 2,1c 0,7c
a Los datos son medias de cuatro réplicas de 12 gallinas. Los datos son medias para las 4 primeras semanas para la dieta 1, pero para todas las 12 semanas para las dietas 2-5.
imagen17

Claims (1)

  1. imagen1
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