JP4455764B2 - 固体フィターゼ組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
フィチン酸の抗栄養素効果を低減するために動物飼料にフィターゼを添加することはよく知られている。例えば、ＷＯ９８／２８４０８及びＷＯ９８／２８４０９を参照のこと。
【０００２】
本発明は乳酸起源、例えばコーン・スチープ・リカー（ＣＳＬ）で安定化された固体フィターゼ組成物及びその製造方法に関連する。
【０００３】
発明の背景
尿素、グリセロール又はソルビトールを有する液体フィターゼ製剤の安定化はＷＯ ９３／１６１７５に開示されている。
塩安定化固体フィターゼ組成物はＥＰ０７５８０１８Ａ１に開示されている。
【０００４】
植物種子、穀物粒及びマメ類が動物飼料の通常の成分である。このような飼料の一部はフィチン酸、そして往々にして内因性フィターゼ酵素をも含む。
【０００５】
本出願人により実施された研究によると、動物飼料内の内因性フィターゼ活性は約０．５単位／ｇという極めて低いレベルである。
例えば上記の最初の２つのＷＯ文献によると、補助フィターゼを飼料に加えることで、飼料中のフィターゼ活性は０．０１〜２０単位／ｇの範囲となる。
【０００６】
発明の概要
本発明は（ａ）フィターゼ活性を有する酵素；及び（ｂ）乳酸起源；を含んで成る固体フィターゼ組成物に関連し、ここで当該組成物のフィターゼ活性は２０単位／ｇ以上である。
【０００７】
発明の詳細な説明
本明細書において、「フィターゼ活性を有する酵素／又はポリペプチド」又は「フィターゼ」なる語には、フィチン酸又はその任意の塩（フィテート）からの無機リン酸塩の遊離を及ぼすことのできる任意の酵素が挙げられる。
【０００８】
フィチン酸はミオ−イノシトール１，２，３，４，５，６−ヘキサキス二水素リン酸塩（又は略してミオ−イノシトールヘキサキスホスフェート）である。何らかのことわりのない限り、「フィチン酸」又は「フィテート」は同義に又はランダムに使用している。
【０００９】
本明細書において、「単位」とは酵素、特にフィターゼ活性の単位を意味する。フィターゼ活性を決定するための任意の方法を利用してよい。
【００１０】
好適な態様において、一単位のフィターゼ活性は下記の条件下で１分間に１μmol の無機オルトリン酸塩を遊離する酵素の量として定義する：実際の酵素の至適ｐＨの＋／−１ｐＨ単位の範囲内のｐＨ；実際の酵素の至適温度の＋／−２０℃の範囲内の温度；基質としてフィチン酸又はその任意の塩の適当な濃度での使用。
【００１１】
好ましくは、この基質は０．００５mole／ｌの濃度のドデカ−フィチン酸ナトリウムとする。
好ましくは、ｐＨは至適ｐＨの＋／−０．５ｐＨ単位の範囲内とする；より好ましくは、ｐＨは至適ｐＨとする。
好ましくは、温度は至適温度の＋／−１０℃の範囲内とする；より好ましくは、温度は至適温度とする。
好ましくは、至適ｐＨ及び至適温度は基質としてのフィチン酸ナトリウムの利用に関連する。
【００１２】
別の好適な態様において、フィターゼ活性は１単位のＦＹＴで決定される。１ＦＹＴは下記の条件下で１分間で１μmol の無機オルトリン酸塩を遊離する酵素の量である：ｐＨ５．５；温度３７℃；基質フィチン酸ナトリウム（Ｃ6Ｈ6Ｏ24Ｐ6Ｎａ12）０．００５０mol／ｌ。
【００１３】
更なる好適な態様において、フィターゼ活性はＦＴＵアッセイを利用して測定する。
ＦＹＴ−及びＦＴＵ−アッセイは実験部でより詳しく説明する。
【００１４】
好適な態様において、本発明の固体組成物のフィターゼ活性は２５，５０，１００，２５０，５００，７５０以上、又は１０００単位／ｇでさえもある。
【００１５】
任意的に、当該固体組成物のフィターゼ活性は１００，０００単位／ｇ以下、より好ましくは７５，０００単位／ｇ以下、更により好ましくは５０，０００単位／ｇ以下、又は４０，０００単位／ｇ以下、又は２５，０００単位／ｇ以下、又は更には１０，０００単位／ｇ以下、最も好ましくは５，０００単位／ｇ以下である。
【００１６】
フィターゼ活性の好適な範囲は２５〜１００，０００、２５〜７５，０００，３５〜５０，０００、又は５０〜４０，０００単位／ｇ；より好ましくは１００〜２５，０００単位／ｇ：更により好ましくは５００〜１０，０００単位／ｇ；最も好ましくは１０００〜５０００単位／ｇである。
【００１７】
本明細書においては、フィターゼ活性を有する任意の酵素を使用してよい。
【００１８】
フィターゼは植物及び微生物に由来する。微生物のうちで、フィターゼ産生細菌及びフィターゼ産生真菌が知られている。植物界からは、例えば小麦−ぬかフィターゼが知られている（Ｔｈｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｌ（１９６２）、１６６−１７１）。ユリの花粉由来のアルカリ性フィターゼがＢａｒｒｉｅｎｔｏｓらＰｌａｎｔ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６（１９９４）、１４８９−１４９５により発表されている。
【００１９】
細菌のうちで、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｐａｖｅｒ ａｎｄ Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ，１９８２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５１：１１０２−１１０８）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，１９７０，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２３：１２０７−１２２０）由来のフィターゼが発表されている。更にまた、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のフィターゼがＧｒｅｉｎｅｒら（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３０３，１０７−１１３，１９９３）により精製及び特性決定されている。
【００２０】
フィターゼ産生酵母、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｎａｙｉｎｉら、１９８４，Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ １７：２４−２６）も発表されている。しかしながら、この酵素はおそらくはミオ−イノシトールモノホスファターゼである（Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉら、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２，２６３−３０３）。ＡＵ−Ａ−２４８４０／９５は酵母シュワンニマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）のフィターゼのクローニング及び発現を発表している。
【００２１】
子嚢菌網（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の真菌門に主に属するフィターゼ産生糸状菌の発表がある。特に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のフィターゼ産生子嚢菌網、例えばアスペルギルス、テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）についてのいくつかの文献がある（Ｙａｍａｄａら、１９８６、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３２２：１２７５−１２８２）。また、アスペルギルス・ニガー変種アワモリ（Ａ，ｎｉｇｅｒ ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）由来のフィターゼ遺伝子のクローニング及び発現も発表されている（Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎら、１９９３，Ｇｅｎｅ １３３：５５−６２）。ＥＰ０，４２０，３５８はアスペルギルス・フィキューム（Ａ，ｆｉｃｕｕｍ）（ニガー）のフィターゼのクローニング及び発現を発表している。ＥＰ０，６８４，３１３子嚢菌網マイセリオフソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びアスペルギルス・テレウスのフィターゼのクローニング及び発現を述べている。
【００２２】
担子菌網の門の菌類に由来するフィターゼがＷＯ９８／２８４０９及びＷＯ９８／２８４０８に開示されている。
改変フィターゼ又はフィターゼ変異体が当業界公知の方法により、特にＥＰ０８９７０１０，ＥＰ０８９７９８５，ＰＣＴ／ＤＫ９９／００１５３及びＰＣＴ／ＤＫ９９／００１５４に開示の方法により入手できる。これらの４つの特許出願のいずれかに開示のフィターゼも本発明の組成物において利用できうる。
【００２３】
固体又は乾燥組成物は０．０１〜１．０μｍ、又は好ましくは約１〜１０００μｍ、又は〜１２００μｍ、又は〜１５００μｍ、又は最大２０００μｍの範囲のサイズの易流動性粒子を含んで成る、好ましくはそれらから本質的に成る、又はそれらから成る粒状物質である。
【００２４】
好ましくは、固体又は乾燥フィターゼ組成物は、例えばスプレードライ、スプレー冷却（プリリング）により液体フィターゼ濃縮物から調製されうる組成物、又は任意のタイプの顆粒である。
スプレードライの場合、液体フィターゼ濃縮物に添加する更なる成分の必要はない。
【００２５】
スプレー冷却の場合、溶融性成分、例えばヤシ油（及び／又はその他の溶融性植物油又は脂肪）、水添加ヤシ油（及び／又はその他の水添加植物油）、獣脂、水添加獣脂、又はワックスがマトリックスとして機能する。あるとしたなら、フィターゼ及びその他の成分を溶融した溶融性成分に導入し、そしてその溶融物を粒子形式条件下、典型的にはスプレードライタワーの中で固化させる。
【００２６】
しかしながら、多くの用途、例えば動物飼料にとって、顆粒が様々な理由のために通常好ましい。一の理由はそれらが飼料成分と容易に混合されうること、又は好ましくはビタミンやミネラルの如きその他の所望の飼料添加剤を含むプレミックスの成分を形成するからである。
【００２７】
酵素顆粒の粒子サイズは好ましくはその混合物のその他の成分のそれと適合性なものとする。これは酵素を例えば動物飼料に組込むための安全且つ便利な手段を提供する。
【００２８】
粒子のサイズは粒子の最大線形寸法としてよい。従って、例えば実質的に球形の粒子（例えば実質的に球形の顆粒）の場合、注目の粒子サイズは粒子の直径であろう。
【００２９】
凝集顆粒及び凝集粉末は高剪断ミキサー（例えばＬｏｄｇｉｅ）において凝集技術を利用して調製してよく、その際１又は複数種の充填材及び酵素が共凝集して顆粒を形成する。
【００３０】
吸収性顆粒は吸収されるべき／酵素によりコーティングされるべき１又は複数種の担体材料のコアを有することにより調製される。
【００３１】
典型的な充填材は塩類、例えば硫酸二ナトリウム及びリグノスルホン酸カルシウムである。その他の充填材はシリカ、石膏、カオリン、タルク、珪酸マグネシウムアルミニウム及びセルロースファイバーである。任意的に、結合剤、例えばデキストリンを凝集顆粒に含ませる。
【００３２】
典型的な担体材料は適当な粒子サイズを有する粒状コアから成ってよい。この担体は水溶性又は水溶性であってよく、例えばカッサバ又はコムギの形態の例えばデンプン、又は糖類（例えばスクロース又はラクトース）、又は塩（例えば塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウム）であってよい。
【００３３】
任意的に、これらの顆粒はコーティング混合物でコーティングする。かかる混合物はコーティング剤、好ましくは疎水性コーティング剤、例えば水添加ヤシ油及び牛獣脂を含んで成り、そして所望するならその他の添加剤、例えば炭酸カルシウム又はカオリンを含んで成る。
【００３４】
ＷＯ９７／３９１１６は酵素含有顆粒の形態における本発明の固体組成物の作製のための好適な方法を開示する。特に、その詳細な説明の中の表題ｃｏｒｅｓ，ｂｉｎｄｅｒｓ，ｆｉｌｌｅｒｓ，ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒｓ，ｆｉｂｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｓｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔｓ，ｃｏａｔｉｎｇ ｌａｙｅｒｓ，ｅｎｚｙｍｅｓ，ｏｔｈｅｒ ａｄｊｕｎｃｔ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｃｓの章を参照のこと（これらの事は引用することで本明細書に組入れる）。しかしながら、ＷＯ９７／３９１１６は乳酸起源の固体組成物への合体を開示していない。
【００３５】
フィターゼ顆粒を調製する好適な方法は実施例３を参照されたい。
【００３６】
本発明の好適な固体組成物は酵素組成物である。好適な組成物は濃縮されており、即ち２０単位／ｇ以上の活性である。従って、固体酵素組成物の概念は、特に、限定することなく、スプレードライ酵素調整品、酵素顆粒、例えば凝集顆粒及び吸収性顆粒、コーティング化及び非コーティング化、並びに動物飼料用の酵素含有プレミックスを含んで成る。
【００３７】
液体酵素（フィターゼ）濃縮物は例えば下記の通りにして調製できうる：酵素起源、典型的にはフィターゼ含有発酵ブロスを一次分離工程にかけ（例えばデカンター、遠心分離機又はフィルタープレスを使用して）、次いで第二精製濾過及び／又は細菌濾過工程にかける。最後に、液体を例えば超限外濾過を利用して濃縮し、次いで細菌濾過する。典型的な乾燥物質含有量は１０〜３０％、好ましくは１５〜２５％、より好ましくは１７〜２２％の範囲にある。
【００３８】
本明細書において、単数形は「１又は複数」又は「一以上」を包括している。これは本発明の組成物の以下の必須又は任意成分に適用される：フィターゼ、乳酸起源、ＣＳＬ、デンプン、二糖、充填剤、担体。
【００３９】
何らかのことわりのない限り、乾燥物質含有量についての％表示は全て重量／重量である。好ましくは、「単位／ｇ」も乾燥物質含有量に関連する。乾燥物質含有量は当業界公知の任意の方法、例えば屈折測定計又は水分を放出するためのオーブン中での乾燥により決定できうる。
【００４０】
何らかのことわりのない限り、「以上」は一般に「≧」を意味し、「最大」又は「以下」は「≦」を意味する。
【００４１】
本発明において、「乳酸起源」又は「乳酸調製品」は乳酸又は任意の乳酸塩、即ち、任意のその塩の化合物を含んで成る任意の組成物をいう（乳酸は２−ヒドロキシプロパン酸である）。同様に、本明細書でいう「乳酸」には任意の乳酸塩が含まれる。このような表現は乳酸起源、乳酸のそのもの、及びその乾燥物質部分について同義に利用する。
【００４２】
乳酸起源の非限定的な例示は下記の通りである：比較的純粋な化学化合物としての乳酸及び乳酸塩（即ち、純度７０％、８０％、９０％以上）；やや不純な物質としての乳酸及び乳酸塩（即ち、純度５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％以上）；５％以上、好ましくは１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７０％、８０％、９０％以上の量の乳酸を含んで成る任意の天然又は合成組成物。
【００４３】
本発明の固体酵素組成物は好ましくは最大２０％、好ましくは最大１５％、より好ましくは最大１０％、更により好ましくは最大９，８，７，６，５，４，３，２，１，０．７５又は０．５％の乳酸を含んで成る。乳酸の含有量は好ましくは０．００１％以上、好ましくは０．００２，０．００４，０．００６，０．００８，０．０１，０．０２，０．０４，０．０６，０．０８，０．１，０．１２，０．１４，０．１６，０．１８，０．２，０．２２，０．２４，０．２６，０．２８又は０．３％以上とする。乳酸含有量の好適な範囲は０．０１〜１０％、０．０２〜９％、０．０３〜８％，０．０４〜７％、０．０５〜６％、０．０６〜７％、０．０７〜６％、０．０８〜５％、０．０９〜４％、又は０．１〜３％である。
【００４４】
乳酸のための任意のアッセイを利用することができる。好適な乳酸アッセイはＳＩＧＭＡに由来する：（１）アッセイキットカタログＮｏ．７３５−１０（酵素アッセイ：オキシダーゼの存在下で乳酸塩をピルビン酸塩及び過酸化水素へと分解）；又は（２）アッセイキットカタログＮｏ．８２６−Ａ及び８２６−Ｂ（紫外線、終点：乳酸脱水素酵素及びＮＡＤの存在下で乳酸塩をピルビン酸へと変換）。
【００４５】
好適な乳酸起源はコーン・スチープ・リカー又はＣＳＬである。ＣＳＬは市販の製品である。例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｋｓ，１９９６，第４版、Ｉｎｄｅｘ ｎｏ．２５９８参照のこと。それはコーン・スチープ水の濃縮により得られる粘性の黄色味がかった又は濃茶色の液体である。その乾燥物質含有量は通常４５〜５５％、好ましくは４８〜５２％である。そのｐＨは３〜５、好ましくは３．５〜４．５の範囲内にある。そのタンパク質含有量（乾燥物質）は典型的には３０〜５０％、好ましくは３５〜４５％である。酸度（乳酸として）は典型的には１０〜３０％（乾燥物質）、好ましくは１２〜２５％である。
【００４６】
本明細書で用いる「ＣＳＬ」とは製品そのまま、又はその乾燥物質部を意味する。
【００４７】
好適な態様において、本発明の固体組成物は０．０１〜１５％、好ましくは０．１〜１０％、より好ましくは１〜５％のＣＳＬを含んで成る。
【００４８】
ＣＳＬ含有量の分析のためには任意の方法を利用してよい。ＣＳＬのフィンガープリンティング及び定量のための好適なＨＰＬＣ法を実施例８に示す。別の好適な方法はヘッドスペースガスクロマトグラフィー（ＨＳ−ＧＣ）であり、好ましくはマススペクトル（ＭＳ）と併用する。
【００４９】
好適な態様において、本発明の固体組成物は更にデンプン起源を、典型的には０．１〜２０％、より好ましくは０．２〜１０％、更により好ましくは１〜５％の量で含んで成る。
【００５０】
デンプン起源の概念はアルファ−１，４−又はアルファ−１，６−結合により相互連結されたグルコース単位を含んで成る任意の天然又は合成多糖類を含む。純度は好ましくは１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０以上又は１００％である。好適なデンプン起源はコムギデンプンであり、それは市販の製品である。「デンプン起源」なる語には前述のＷＯ９７／３９１１６の表題「Ｃｏｒｅｓ」の章に記載のデンプン及び修飾デンプンが挙げられる。
【００５１】
別の好適な態様において、本発明の固体組成物は更に二糖類を、好ましくは０．０１〜１５％、より好ましくは０．１〜１０％、更により好ましくは１〜５％の量で含んで成る。
【００５２】
二糖類の概念には、任意の天然又は合成二糖類が含まれ、モノマー及び結合の型は問わない。かかる二糖類の例はマルトース、ラクトース、セロビオース、スクロース、トレハロースである（非限定例）。好ましくは、これらの二糖類は純度１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０以上又は９０％以上でさえもある。好適な二糖類はラクトース及びトレハロース（アルファ−Ｄ−グルコース アルファ−Ｄ−グルコピラノシド、α−１，１−結合）である。
【００５３】
本発明の方法において、全ての工程、例えば請求項１４に記載の工程は、同時に又は順次に行ってよい。例えば、工程（ｉ）及び（ii）は順次に、又は好ましくは同時に（乳酸起源及びフィターゼを混合してから担体にスプレーする）；工程（iii）及び（iv）は同時に、又は順次に、好ましくは同時に、同一の装置内で行う。これは請求項１２の「一緒に」に適用される。
【００５４】
本発明の更なる好適な態様は下記の通りである：
フィターゼ活性を有する少なくとも一種の酵素及びコーン・スチープ・リカー（ＣＳＬ）を含んで成る固体組成物（ここでこの組成物のフィターゼ活性は２０〜５０，０００単位／ｇの範囲にある）。ＣＳＬの好適な量は０．０１〜１５％（乾燥物質含有量及びｗ／ｗ）の範囲内にある。好ましくは、この組成物は更にコムギデンプン（ＷＳ）を、好ましくは０．０１〜２０％（乾燥物質含有量及びｗ／ｗ）の範囲内の量で含んで成る。
【００５５】
２０〜５０，０００単位／ｇの範囲のフィターゼ活性を有する顆粒組成物の調製方法（ここでこの方法は（ｉ）液体フィターゼを担体上にスプレーし；（ii）ＣＳＬをこの担体上にスプレーし；（iii） 混合し；そして（iv）乾燥する工程を含んで成る。
【００５６】
２０〜５０，０００単位／ｇの範囲のフィターゼ活性を有するスプレードライ固体組成物の調製方法（この方法は、ＣＳＬを液体フィターゼ濃縮物に添加し、それからそれを乾燥させる工程を含んで成る）。
【００５７】
本実施例で調製した固体フィターゼ組成物の活性は貯蔵前は１０００〜３０００FTU／ｇ の範囲にある。
【００５８】
実施例１
ＦＹＴアッセイ
１０μｌの希釈酵素サンプル（０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０，ｐＨ５．５に希釈）を０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０，ｐＨ５．５中の２５０μｌの５mMのフィチン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨはフィチン酸ナトリウムの溶解後に調整；基質は予め加熱しておく）に加え、そして３７℃で３０分インキュベーションする。反応を２５０μｌの１０％のＴＣＡで停止させ、そして遊離リン酸塩を１００mlのモリブデン酸試薬中の７．３ｇのＦｅＳＯ4 ５００μｌ（２５０mlに希釈した８mlのＨ2ＳＯ4中の２．５ｇの（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ）の添加により測定する。７５０nmでの吸収を９６穴マイクロタイタープレート中の２００μｌのサンプルで測定する。基質及び酵素ブランクを含ませる。リン酸標準曲線も含ませる（０〜２mMのリン酸塩）、１ＦＹＴは所定の条件で１μmol のリン酸塩／min 遊離させる酵素の量に相当する。
【００５９】
ＦＴＵアッセイ
１ＦＴＵは標準の条件（３７℃、ｐＨ５．５；反応時間６０分、そして５mMのフィチン酸の出発濃度）で、１分当り１μmol のリン酸に相当するリン酸塩を遊離させる酵素の量と定義する。
１ＦＴＵ＝１ＦＹＴ
【００６０】
ＦＴＵアッセイは動物飼料プレミックス等の複雑な組成物のフィターゼ活性測定に好ましい。
【００６１】
試薬／基質
飼料等のための抽出バッファー
このバッファーはＰＯ4 −標準品の調製及びプレミックスサンプルの更なる希釈のためにも使用する。
【００６２】
０．２２Ｍの酢酸バッファー、Ｔｗｅｅｎ２０入り、ｐＨ５．５
１リットル当り３０ｇの酢酸ナトリウム三水和物（ＭＷ＝１３６．０８ｇ／ mol）、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ４６２６７及び１リットル当り０．１ｇのＴｗｅｅｎ２０，例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ２２１８４を秤量する。
酢酸ナトリウムを脱鉱水に溶解する。
Ｔｗｅｅｎ２０を加え、そしてｐＨ酢酸で５．５０±０．０５に調整する。
脱鉱水を全容量に至るまで加える。
【００６３】
プレミックス用の抽出バッファー
０．２２Ｍの酢酸バッファー、Ｔｗｅｅｎ２０，ＥＤＴＡ，ＰＯ4 3-，ＢＳＡ入り
１リットル当り３０ｇの酢酸ナトリウム三水和物、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ６２６７
１リットル当り０．１ｇのＴｗｅｅｎ２０、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ２２１８４
１リットル当り３０ｇのＥＤＴＡ、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ８４１８
１リットル当り２０ｇのＮａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、 例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ６５８０
１リットル当り０．５ｇのＢＳＡ（牛血清アルブミン）、例えばＳｉｇｍａ Ａｒｔ Ａ−９６４７
【００６４】
これらの成分を脱鉱水に溶かし、そしてｐＨを酢酸で５．５０±０．０５に調整する。
脱鉱水を全容量に至るまで添加する。
ＢＳＡは安定ではなく、そしてバッファーを使用する回に加えなくてはならない。
【００６５】
５０ mM のＰＯ 4 3- ストック溶液
０．６８１ｇのＫＨ2ＰＯ4（ＭＷ＝１３６．０９ｇ／ mol）、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ４８７３を秤量し、そしてＴｗｅｅｎ入りの１００mlの０．２２Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５に溶解する。
貯蔵安定性：冷蔵庫の中で１週間
【００６６】
０．２２Ｍの酢酸バッファー、ｐＨ５．５、Ｔｗｅｅｎなし
このバッファーはフィチン酸基質の製造のために使用する。
１５０ｇの酢酸ナトリウム三水和物（ＭＷ＝１３６．０８）、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ６２６７を秤量し、そして脱鉱水に溶かし、そしてｐＨを酢酸で５．５０±０．０５に調整する。
脱鉱水を５０００mlとなるまで添加する。
貯蔵安定性：室温で１週間
【００６７】
フィチン酸基質：５ mM のフィチン酸
フィチン酸の容積を使用バッチの水含有量を差し引いて計算する。
水含有量が例えば８．４％なら、以下の通りとなる：
【数１】
【００６８】
フィチン酸（Ｎａ−塩）（ＭＷ＝９２３．８ｇ／ mol）、例えばＳｉｇｍａ Ｐ−８８１０を秤量し、そして０．２２Ｍの酢酸バッファー（Ｔｗｅｅｎなし）に溶解する。（希釈）酢酸の添加は溶解速度を上げる。
ｐＨを酢酸で５．５０±０．０５に調整する。
０．２２Ｍの酢酸バッファーを全容量に至るまで添加する。
【００６９】
２１．７％の硝酸溶液
停止溶液用
１部の濃（６５％）硝酸を２部の脱鉱水に混合する。
【００７０】
モリブデン酸試薬
停止溶液用
１００ｇのヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物（ＮＨ4）6ＭＯ7Ｏ24 ・４Ｈ2Ｏ 、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ １１８２を鉱鉱水に溶解する。１０mlの２５％のＮＨ3 を加える。
脱鉱水を１リットルとなるまで添加する。
【００７１】
０．２４％のバナジン酸アンモニウム
Ｂｉｅ ＆ Ｂｅｒｎｔｓｅｎより購入
【００７２】
モリブデン酸／バナジン酸停止溶液
１部のバナジン酸塩溶液（０．２４％のバナジン酸ナトリウム）＋１部のモリブデン酸溶液を混合する。２部の２１．７％の硝酸溶液を添加する。
この溶液は使用の２時間以内に調整し、そしてボトルはアルミ箔でラッピングする。
【００７３】
サンプル
凍結サンプルを冷蔵庫の中で一夜解凍する。
飼料サンプルのためのサンプルサイズ：少なくとも７０ｇ、好ましくは１００ｇ。
【００７４】
飼料サンプル
サンプルサイズの１０倍に相当するバッファーの添加を可能とする溶液容積を選定する。例えば、１００ｇをＴｗｅｅｎ入りの１０００mlの０．２２Ｍ酢酸バッファーに溶解する。ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ１参照。最も近い溶液容積にする。
【００７５】
サンプルサイズが約１００ｇなら、全てのサンプルをコーヒーグラインダーで粉砕し、次いで風袋計量したビーカーに入れる。サンプル重量を記録する。非ペレット化サンプルを粉砕する必要はない。もしサンプルが取り扱うには大きすぎるなら、それを約１００ｇの部へと分割する。
【００７６】
磁石をビーカーに入れ、そしてＴｗｅｅｎ入りの０．２２Ｍの酢酸バッファーを加える。
サンプルを９０分かけて抽出する。
抽出後、サンプルを３０分放置して飼料を沈降させる。５mlのサンプルをピペットで抜き取る。サンプルを溶液の水面下２〜３cmで取り、そして遠心用ガラスに入れ、蓋でカバーする。
サンプルを４０００rpm で１０分遠心分離する。
【００７７】
プレミックスサンプル
サンプル重量の１０倍に相当するバッファーの添加を可能にする溶液容積を選定する。最も近い溶液容積にする。
サンプルを秤量したなら（５０〜１００ｇ）、全てのサンプルを風袋計量したビーカーに入れる。サンプル重量を記録する。サンプルが取り扱うのに大きすぎるなら、それを約１００ｇの部へと分割する。
磁石をビーカーに入れ、そしてＴｗｅｅｎ、ＥＤＴＡ及びＰＯ4 3- 入りの０．２２Ｍの酢酸バッファーを添加する。
サンプルを６０分かけて抽出する。
抽出後、サンプルを３０分放置し、プレミックスを沈降させる。５mlのサンプルをピペットで抜き取る。サンプルは溶液の水面下２〜５cmで取り、そして遠心ガラスに入れ、蓋でカバーする。
サンプルを４０００rpm で１０分遠心分離する。
【００７８】
分析
飼料サンプルの抽出物を直接分析する。
プレミックスの抽出物を約１．５FTU／ｇ に希釈する（Ａ415 （メインサンプル）＜１．０）。
Ｔｗｅｅｎ２０入りの０．２２Ｍの酢酸バッファーを希釈のために用いる。
【００７９】
メインサンプル
抽出及び遠心分離してサンプル由来の２×１００mlの上清液を標線付きガラス試験管に入れ、そして磁石を各試験管に入れる。
全てのサンプルの準備が整ったら、それらを撹拌湯浴に入れる。温度：３７℃。
３．０mlの基質を加える。
基質を添加してから正確に３０分インキュベーションする。
サンプルを湯浴から取り出し、そして２．０mlの停止溶液を加える（基質を添加してから正確に６０分後）。
サンプルを１分以上撹拌する。
飼料サンプルを４０００rpm で１０分遠心分離する（プレミックスサンプルは遠心分離の必要がない）。
【００８０】
ブラインドサンプル
抽出及び遠心分離したサンプル由来の１００mlの上清液を標線付きガラス試験管に入れ、そして磁石を各試験管に入れる。
２．０mlの停止溶液をサンプルに加える。
３．０mlの基質をサンプルに加える。
サンプルを室温で６０分インキュベーションする。
飼料サンプルを４０００rpm で１０分遠心分離する（プレミックスサンプルは遠心分離の必要がない）。
【００８１】
標準品
８つの標準品各々から２×１００mlを取り、更に４×１００mlの０．２２Mの酢酸バッファー（試薬ブラインド）も用意する。
全てのサンプルのＡ415 を測定する。
【００８２】
計算
FTU ／ｇ＝μmol ＰＯ4 3- ／（min ×ｇ（サンプル））
Ｃｇのサンプルを秤量する（粉砕後）。
１００μｌを抽出及び遠心分離サンプルからとる。
ＰＯ4 3- 標準曲線は直線状である。
ＰＯ4 3- 標準品の回帰曲線から、サンプルの実際の濃度がわかる（mMの濃度）：
【数２】
ｔ＝インキュベーション時間、分
Ｖｏｌ：サンプル容積、リットル＝０．０００１ リットル
１０００：mmolからμmol に至る換算計数
【数３】
Ｃ＝サンプルの秤量グラム数
Ｆｐ＝採取サンプルと全サンプル（抽出後）との関係
例えば：１０００mlから０．１００mlとると、Ｆｐ＝１０００／０．１００＝１００００
下記の値を挿入した換算式：
ｔ＝６０
Ｖｏｌ＝０．０００１ ｌ
Ｆｐ＝１００００
【数４】
【００８３】
実施例２
濃液体フィターゼ調製品の調製
ペニオフォラ・ライチイ（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ ｌｙｃｉｉ）由来のフィターゼをＷＯ９８／２８４０８に本質的に記載の通りにしてアルペルギルス・オリザ（Ａ，ｏｒｙｚａｅ）の中で発現させ、そして発酵及び精製する。得られる液体フィターゼ濃縮物は１８％の乾燥物質含有量のＵＦ（限外濾過）濃縮物である。ｐＨを５に調整する。
【００８４】
実施例３
フィターゼ顆粒の調製
１．５％のＣＳＬの入ったコーティング化フィターゼ顆粒を下記の通りに調製する：
以下の組成を有する粉末組成物１４．６８kg：
０．７５ｇのカオリン、Ｓｐｅｓｗｈｉｔｅ，Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｌａｇ
１．８０kgの繊維セルロース、Ａｃｂｏｃｅｌ ＢＳ２００
１１．２３kgの微粉砕硫酸ナトリウム
０．９０kgの炭水化物結合剤、Ｔａｃｋｉｄｅｘ Ｇ１５５（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）
をＬｏｄｉｇｅミキサーＦＭ５０の中で混合し、そして１．６８kgの水、０．６２５kgのコーン・スチープ・リカー（Ａｍｙｌｕｍ Ｎ．Ｖ．より供給の濃縮コーン・スチープ・リカー（ＣＣＳＬ）、乾燥物質含量４８％）及び０．８４kgのフィターゼ濃縮物（１８％の乾燥物質含有量）（実施例２記載の通りに調製）から成る３．１５kgのスプレー用液体をスプレーする。スプレーの最中及び後に、この湿った混合物を米国特許第４，１０６，９９１号のＥｘａｍｐｌｅ１に記載の通りにして、多数のセットのナイフによる圧縮及び粉砕力にかける。
【００８５】
このまだコーティングを施していない原料顆粒中のＣＳＬのパーセンテージを下記の通りに計算する：
０．６２５ｘ０．４８／（１４．６８＋０．６２５ｘ０．４８＋０．８４ｘ０．１８）＝０．３００／（１４．６８＋０．３０＋０．６７２）＝０．３００／１５．６５２＝１．９１７％〜２％。
【００８６】
顆粒を流動床で３％未満の水分含量へと乾かし、以下の粒度分布を有する明色顆粒を得た：
１０．５％＞１１００μｍ（マイクロメーター）
９２．０％＞３００μｍ
８．０％＜３００μｍ
【００８７】
最後に顆粒をふるいにかけ、３００μｍ〜１１００μｍの粒子範囲を有する製品を得、そして６kgの顆粒を８０℃にて、
９％の完全水添加ヤシ油、次いで２２．５％のカオリン、Ｓｐｅｓｗｈｉｔｅ（１００ｇのコーティング材料中の乾燥物質含有量：２２．５ｇ＋９ｇ＝３１．５ｇ）で、米国特許第４，１０６，９９１号、Ｅｘａｍｐｌｅ２２に記載の通りにしてコーティングする。
【００８８】
得られる最終製品、コーティング化顆粒中のＣＳＬの含量は出発顆粒のＣＳＬ含量と比較して以下の通りに減少する：１．９１７％／１．３１５＝１．４５８％〜１．５％。
【００８９】
この顆粒をふるいにかけ、３００μｍ〜１２００μｍの粒子範囲を有する製品を得る。
【００９０】
下記に利用するコントロール顆粒を、ＣＳＬを添加しないことを除き、上記の通りに調製する。
コムギデンプン及びラクトース又はトレハロースを更に含んで成る顆粒を対応の方式で調製する。
【００９１】
実施例４
プレミックス中のフィターゼ顆粒の貯蔵安定性
以下の表１に示すフィターゼ顆粒を実施例３に従って調製する。「コントロール」は実施例３の方法に従って調製したが、ＣＳＬの添加していないフィターゼ顆粒を意味する。
【００９２】
顆粒を各バイヤルの中に直接秤量する。顆粒の正確な重量を記録する。これらのバイヤルに清浄なタオルをかけ、そして室温で一夜放置する。
【００９３】
プレミックスＥＮＧＡ １−０２／Ｎｏｒｄｋｏｒｎ、製品番号０１５３８４ Ａｒｔｉｋｅｌ Ｎｒ．８２５９（２５kgドラム）をＬｏｄｉｇｅミキサーの中でプレミックス成分の均一な分布を確保しながら混合し、そしてプラスチックバッグの中にバッグ当り約３kgのプレミックスで充填する。
【００９４】
プレミックスの組成は以下の通りである（キロ当り）：
５００００００ＩＥ ビタミンＡ
１００００００ＩＥ ビタミンＤ３
１３３３３ mg ビタミンＥ
１０００ mg ビタミンＫ３
７５０ mg ビタミンＢ１
２５００ mg ビタミンＢ２
１５００ mg ビタミンＢ６
７６６６ mcg ビタミンＢ１２
１２３３３ mg ナイアシン
３３３３３ mcg ビオチン
３００ mg 葉酸
３０００ mg Ｃａ−Ｄ−パントテネート
１６６６ mg Ｃｕ
１６６６６ mg Ｆｅ
１６６６６ mg Ｚｎ
２３３３３ mg Ｍｎ
１３３ mg Ｃｏ
６６ mg Ｉ
６６ mg Ｓｅ
５．８ ％ カルシウム
２５ ％ ナトリウム
【００９５】
５０ｇ±１ｇのプレミックスを各バイヤルに入れ、そしてこれらのバイヤルをスクリュー蓋で閉じる。プレミックスを５０ｇに相当する容量を供するように調整した調節可能シリンダー「スクープ」を用いて添加する。これらのバイヤルを、顆粒がプレミックスの中で均一に分布されるまで手動で混合する。
【００９６】
各顆粒について１００％の活性レベルと規定する０週サンプル（閉じたバイヤル）をサンプル調製の完了直後に凍結する。３０℃で保存するサンプルは再度蓋を開ける。開放バイヤルを、サンプル中の約１０％の水分に相当する４３％のｒＨに水で調整した１リットルのグリセロールを含むプラスチック箱に入れる（糖スケールで測定すると６２％の屈折計乾燥物質）。プラスチック箱の蓋を強力テープでシールする。これは、水分活性が１３週間の試験期間全体にわたり０．４３であることを意味する。
【００９７】
貯蔵期間の満了後、サンプルをグリセロール箱から取り出し、スクリュー蓋で閉じ、そして凍結する。
【００９８】
サンプルを冷蔵庫（５℃）の中で一夜かけて解凍してから分析する。
−１８℃で貯蔵した０週サンプル及び３０℃で貯蔵した対応のサンプルを同日に分析し、日間差及び人間差を排除する。
結果を以下の表１に示す：ＣＳＬ＝コーン・スチープ・リカー及びＷＳ＝コムギデンプン。
２％のＣＳＬ、３％のＣＳＬ及び２％ＣＳＬ＋５％のＷＳを含むフィターゼ顆粒は似かよった性能を示す。
【００９９】
【表１】
【０１００】
実施例５
飼料中のフィターゼ顆粒の貯蔵安定性
以下の表２に表示のフィターゼ顆粒を実施例３に従って調製する。「コントロール」は実施例３の通常の標準方法に従って調製したが、ＷＳもＣＳＬも二糖類も添加していないフィターゼ顆粒を示す。
【０１０１】
飼料中の顆粒のサンプルはＢｉｏｔｅｋｎｏｌｏｇｉｓｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，Ｋｏｌｄｉｎｇ，Ｄｅｎｍａｒｋにて調製する。
【０１０２】
飼料の組成は以下の通りである：
７４．０％のコムギ
２０．７％のローストダイズケーキ
５．０％のダイズ油
０．３％のＰｒｅｍｉｘ Ｅｎｇａ １−０２／Ｎｏｒｄｋｏｒｎ
【０１０３】
飼料をフィターゼ顆粒の添加前に≦１０％の水分含有量へと乾かす。
顆粒バッチを飼料に供給し、そしてこの混合物を６５℃でペレット化する。
この飼料ペレットをサンプル分割し、そして１００mlのサンプルバイヤルに充填する。
各顆粒について１００％の活性レベルと規定する０週サンプルをスクリュー蓋で閉じ、そして−１８℃で保存する。
【０１０４】
３０℃で保存するサンプルは閉じない。開放バイヤルを、サンプル中の約１０％の水分に相当する４３％のｒＨに水で調整した１リットルのグリセロールを含むプラスチック箱に入れる（糖スケールで測定すると６２％の屈折計乾燥物質）。プラスチック箱の蓋を強力テープでシールする。このことは、水分活性が１３週間の試験期間全体にわたり０．４３であることを意味する。
【０１０５】
貯蔵期間の満了後、サンプルをグリセロール箱から取り出し、スクリュー蓋で閉じ、そして凍結する。サンプルを冷蔵庫（５℃）の中で一夜かけて解凍し、分析する。
均一性試験のためのサンプルを分析するまで＋５℃で冷蔵保存する。
【０１０６】
マッシュ飼料、６５℃に加熱した飼料及び添加酵素抜きの飼料ペレットは全て予想通り約０．５FTU／ｇ を含んだ。
【０１０７】
酵素添加した及び６５℃に加熱したマッシュ飼料のサンプル５つを均一性について分析する。相対標準偏差は２％〜１１％である。従って、均一性は許容できる。
【０１０８】
飼料ペレットのサンプル５つを均一性について試験する。相対標準偏差は２〜１０％である。従って、均一性は許容できる。
【０１０９】
貯蔵安定性を１３週間後に測定する。−１８℃で貯蔵した０週サンプル及び３０℃で貯蔵した対応のサンプルを日間差及び人間差を排除するために同日に分析する。
【０１１０】
フィターゼ残留活性測定値の結果を以下の表２に示す（残留活性の計算前に内因活性を総活性から差し引く）；ＣＳＬ＝コーン・スチープ・リカー、そしてＷＳ＝コムギデンプン。
【０１１１】
２％のＣＳＬ、３％のＣＳＬ及び２％のＣＳＬ＋５％のＷＳを含むフィターゼ顆粒は似かよった性能を示す。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
実施例６
フィターゼ顆粒自体：顆粒収率及び貯蔵安定性
実施例２の液体濃縮物を実施例３の方法に従って実験用固体フィターゼ組成物を調製するために用いた。
第一顆粒実験では、二糖ラクトースを２％の量で３％の乳酸起源コーン・スチープ・リカー（ＣＳＬ）と一緒に加えた。
第二顆粒実験では、３％のコムギデンプン（ＷＳ）を、第一実験の２成分に加え、適用した。
第三顆粒実験では、２％の量の二糖トレハロース及び３％のＷＳを、３％の乳酸起源ＣＳＬと一緒に添加した。
【０１１４】
得られる顆粒自体の顆粒収率及び貯蔵安定性に対する効果を検討する。
【０１１５】
顆粒収率は、顆粒単位の中に入り込んだ液体濃縮物のフィターゼ単位に対する、顆粒単位から遊出して製品中に残留するフィターゼ単位として計算する。
【０１１６】
得られるフィターゼ顆粒組成物自体の貯蔵安定性は下記のやや厳しい条件を利用して検討する：４週、４０℃及び６０％の相対湿度。
【０１１７】
その結果を以下の表３に示す。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
実施例７
その他のフィターゼの顆粒組成物の貯蔵安定性
液体フィターゼ濃縮物及び固体組成物（即ち、顆粒）をＥＰ０８９７０１０に記載のいわゆる共通（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）フィターゼを用い、実施例２及び３の教示に従って調製した。
【０１２０】
顆粒実験は本質的に実施例６に記載の通りにして実施した。しかしながら、貯蔵安定性のため、サンプルを３０℃でも貯蔵する。結果を以下の表４に示す。
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
実施例８
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用するＣＳＬの特性決定
様々な供給者（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ，４ Ｒｕｅ Ｐａｔｏｕ，Ｆ−５９０２２ Ｌｉｌｌｅ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ；Ｓｔａｒａｌ ｓ．ａ．，Ｚ．Ｉ．ＥＴ Ｐｏｒｔｕａｉｒｅ，Ｂ．Ｐ．３２，Ｆ−６７３９０ Ｍａｒｃｋｏｌｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ；及びＣｅｒｅｓｔａｒ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ Ａ／Ｓ，Ｓｋｏｖｌｙｔｏｆｔｅｎ ３３，ＤＫ−２８４０ Ｈｏｌｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）由来のＣＳＬの様々なバッチからのサンプル１５個を下記の通りに試験する。
【０１２３】
Ｃａｒｒｅｚ−沈殿
５．０ｇのＣＳＬを１００mlのフラスコに秤量する。４０mlのＭＱ水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑフィルターで濾過した脱鉱水）を加え、そして７０℃で１５分、２００rpm で振盪しながらインキュベーションする。１２mlのＣａｒｒｅｚ−Ｉ−溶液（カリウム−ヘキサフルオロ鉄（II）−三水和物）を加え、そして振盪する。１２mlのＣａｒｒｅｚ−II−溶液（硫酸亜鉛−ｔ水和物）を加え、そして振盪する。２０mlの０．５ＮのＮａＯＨを加え、振盪する。冷却し、ＭＱ水を１００ml加え、振盪する。この調製品１０mlをバイヤルに移し、そして４０００rpm で１０分遠心分離する。その上清液をＨＰＬＣ分析のために０．５μｍのフィルターで濾過する。サンプルブラインド（ＭＱ水及びＣａｒｒｅｚ溶液）を含む、各サンプルを２回分析する。
【０１２４】
クロマトグラフィーパラメーター
カラム： Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−１８−ＤＢ，
Ｎｏ．０８８８７７ＡＥ
ディテクター：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤＭ６Ａ−ダイオードアレー
２２０nm〜３５０nm
データー分析：データー分析のため、２６０nmでのインテグレーションから
得られるピークを使用
ポンプ： ＨＰ １０８０ グラジェントポンプ
溶出液： Ａ）ＭＱ−水
Ｂ）３０％ ＭｅＯＨ
Ｃ）６０％ ＭｅＯＨ
Ｄ）９０％ ＭｅＯＨ
勾配： ０ min Ａ
１５ min Ａ
３５ min Ｂ
５０ min Ｃ
６０ min Ｃ
６５ min Ｄ
７０ min Ｄ
７５ min Ｃ
８０ min Ｂ
８５ min Ａ
９０ min Ａ
【０１２５】
ＨＰＬＣにより分析したＣＳＬの１５のサンプルについての分散統計の結果を以下の表５に示す：
【０１２６】
【表５】
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
表５の％ＳＤ行において、特徴的なピークを添数字（１，２，３…９，１０）で表示する。以下、これらのピークをピーク−１、ピーク−２、ピーク−３、…、ピーク−９、ピーク−１０とそれぞれ呼ぶ。１０個のピークのグループ全体をピーク１−１０と呼ぶ。サブグループを似たように表示する。例えば、５つのピーク番号１〜５についてはピーク−１−５、ピーク−１、ピーク−３及びピーク−５についてはピーク−１，３，５、等と呼ぶ。かくして、サンプル中のこれらのピークの１又は複数の存在はＣＳＬの存在を示唆する。好適な態様において、これらのピークのうちの１，２，３，４，５，６，７，８，９又は１０個全ての存在がＣＳＬの存在を示唆する。より好適な態様において、５，７，８又は１０ピークの存在がＣＳＬの存在を示唆する。５ピークの存在が最も好ましい。
【０１２９】
未知含有量のＣＳＬのサンプルの場合、適当な希釈率は単純な試行錯誤技術を利用して思い出せる。
【０１３０】
上記の定性方法は標準バッチとなる、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓにより命名されたバッチと比較することにより定量化できうる。Ｒｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓからの特に好適な標準ＣＳＬバッチはＳＯＬＵＬＹＳ（登録商標）Ｌ ４８ Ｌ ＣＡＳ Ｎｏ．６６０７１−９４−１，ＥＩＮＥＣＳ：２６６−１１３−４である。
発明の分野
フィチン酸の抗栄養素効果を低減するために動物飼料にフィターゼを添加することはよく知られている。例えば、ＷＯ９８／２８４０８及びＷＯ９８／２８４０９を参照のこと。
【０００２】
本発明は乳酸起源、例えばコーン・スチープ・リカー（ＣＳＬ）で安定化された固体フィターゼ組成物及びその製造方法に関連する。
【０００３】
発明の背景
尿素、グリセロール又はソルビトールを有する液体フィターゼ製剤の安定化はＷＯ ９３／１６１７５に開示されている。
塩安定化固体フィターゼ組成物はＥＰ０７５８０１８Ａ１に開示されている。
【０００４】
植物種子、穀物粒及びマメ類が動物飼料の通常の成分である。このような飼料の一部はフィチン酸、そして往々にして内因性フィターゼ酵素をも含む。
【０００５】
本出願人により実施された研究によると、動物飼料内の内因性フィターゼ活性は約０．５単位／ｇという極めて低いレベルである。
例えば上記の最初の２つのＷＯ文献によると、補助フィターゼを飼料に加えることで、飼料中のフィターゼ活性は０．０１〜２０単位／ｇの範囲となる。
【０００６】
発明の概要
本発明は（ａ）フィターゼ活性を有する酵素；及び（ｂ）乳酸起源；を含んで成る固体フィターゼ組成物に関連し、ここで当該組成物のフィターゼ活性は２０単位／ｇ以上である。
【０００７】
発明の詳細な説明
本明細書において、「フィターゼ活性を有する酵素／又はポリペプチド」又は「フィターゼ」なる語には、フィチン酸又はその任意の塩（フィテート）からの無機リン酸塩の遊離を及ぼすことのできる任意の酵素が挙げられる。
【０００８】
フィチン酸はミオ−イノシトール１，２，３，４，５，６−ヘキサキス二水素リン酸塩（又は略してミオ−イノシトールヘキサキスホスフェート）である。何らかのことわりのない限り、「フィチン酸」又は「フィテート」は同義に又はランダムに使用している。
【０００９】
本明細書において、「単位」とは酵素、特にフィターゼ活性の単位を意味する。フィターゼ活性を決定するための任意の方法を利用してよい。
【００１０】
好適な態様において、一単位のフィターゼ活性は下記の条件下で１分間に１μmol の無機オルトリン酸塩を遊離する酵素の量として定義する：実際の酵素の至適ｐＨの＋／−１ｐＨ単位の範囲内のｐＨ；実際の酵素の至適温度の＋／−２０℃の範囲内の温度；基質としてフィチン酸又はその任意の塩の適当な濃度での使用。
【００１１】
好ましくは、この基質は０．００５mole／ｌの濃度のドデカ−フィチン酸ナトリウムとする。
好ましくは、ｐＨは至適ｐＨの＋／−０．５ｐＨ単位の範囲内とする；より好ましくは、ｐＨは至適ｐＨとする。
好ましくは、温度は至適温度の＋／−１０℃の範囲内とする；より好ましくは、温度は至適温度とする。
好ましくは、至適ｐＨ及び至適温度は基質としてのフィチン酸ナトリウムの利用に関連する。
【００１２】
別の好適な態様において、フィターゼ活性は１単位のＦＹＴで決定される。１ＦＹＴは下記の条件下で１分間で１μmol の無機オルトリン酸塩を遊離する酵素の量である：ｐＨ５．５；温度３７℃；基質フィチン酸ナトリウム（Ｃ6Ｈ6Ｏ24Ｐ6Ｎａ12）０．００５０mol／ｌ。
【００１３】
更なる好適な態様において、フィターゼ活性はＦＴＵアッセイを利用して測定する。
ＦＹＴ−及びＦＴＵ−アッセイは実験部でより詳しく説明する。
【００１４】
好適な態様において、本発明の固体組成物のフィターゼ活性は２５，５０，１００，２５０，５００，７５０以上、又は１０００単位／ｇでさえもある。
【００１５】
任意的に、当該固体組成物のフィターゼ活性は１００，０００単位／ｇ以下、より好ましくは７５，０００単位／ｇ以下、更により好ましくは５０，０００単位／ｇ以下、又は４０，０００単位／ｇ以下、又は２５，０００単位／ｇ以下、又は更には１０，０００単位／ｇ以下、最も好ましくは５，０００単位／ｇ以下である。
【００１６】
フィターゼ活性の好適な範囲は２５〜１００，０００、２５〜７５，０００，３５〜５０，０００、又は５０〜４０，０００単位／ｇ；より好ましくは１００〜２５，０００単位／ｇ：更により好ましくは５００〜１０，０００単位／ｇ；最も好ましくは１０００〜５０００単位／ｇである。
【００１７】
本明細書においては、フィターゼ活性を有する任意の酵素を使用してよい。
【００１８】
フィターゼは植物及び微生物に由来する。微生物のうちで、フィターゼ産生細菌及びフィターゼ産生真菌が知られている。植物界からは、例えば小麦−ぬかフィターゼが知られている（Ｔｈｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｌ（１９６２）、１６６−１７１）。ユリの花粉由来のアルカリ性フィターゼがＢａｒｒｉｅｎｔｏｓらＰｌａｎｔ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６（１９９４）、１４８９−１４９５により発表されている。
【００１９】
細菌のうちで、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｐａｖｅｒ ａｎｄ Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ，１９８２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５１：１１０２−１１０８）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，１９７０，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２３：１２０７−１２２０）由来のフィターゼが発表されている。更にまた、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のフィターゼがＧｒｅｉｎｅｒら（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３０３，１０７−１１３，１９９３）により精製及び特性決定されている。
【００２０】
フィターゼ産生酵母、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｎａｙｉｎｉら、１９８４，Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ １７：２４−２６）も発表されている。しかしながら、この酵素はおそらくはミオ−イノシトールモノホスファターゼである（Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉら、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２，２６３−３０３）。ＡＵ−Ａ−２４８４０／９５は酵母シュワンニマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）のフィターゼのクローニング及び発現を発表している。
【００２１】
子嚢菌網（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の真菌門に主に属するフィターゼ産生糸状菌の発表がある。特に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のフィターゼ産生子嚢菌網、例えばアスペルギルス、テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）についてのいくつかの文献がある（Ｙａｍａｄａら、１９８６、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３２２：１２７５−１２８２）。また、アスペルギルス・ニガー変種アワモリ（Ａ，ｎｉｇｅｒ ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）由来のフィターゼ遺伝子のクローニング及び発現も発表されている（Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎら、１９９３，Ｇｅｎｅ １３３：５５−６２）。ＥＰ０，４２０，３５８はアスペルギルス・フィキューム（Ａ，ｆｉｃｕｕｍ）（ニガー）のフィターゼのクローニング及び発現を発表している。ＥＰ０，６８４，３１３子嚢菌網マイセリオフソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びアスペルギルス・テレウスのフィターゼのクローニング及び発現を述べている。
【００２２】
担子菌網の門の菌類に由来するフィターゼがＷＯ９８／２８４０９及びＷＯ９８／２８４０８に開示されている。
改変フィターゼ又はフィターゼ変異体が当業界公知の方法により、特にＥＰ０８９７０１０，ＥＰ０８９７９８５，ＰＣＴ／ＤＫ９９／００１５３及びＰＣＴ／ＤＫ９９／００１５４に開示の方法により入手できる。これらの４つの特許出願のいずれかに開示のフィターゼも本発明の組成物において利用できうる。
【００２３】
固体又は乾燥組成物は０．０１〜１．０μｍ、又は好ましくは約１〜１０００μｍ、又は〜１２００μｍ、又は〜１５００μｍ、又は最大２０００μｍの範囲のサイズの易流動性粒子を含んで成る、好ましくはそれらから本質的に成る、又はそれらから成る粒状物質である。
【００２４】
好ましくは、固体又は乾燥フィターゼ組成物は、例えばスプレードライ、スプレー冷却（プリリング）により液体フィターゼ濃縮物から調製されうる組成物、又は任意のタイプの顆粒である。
スプレードライの場合、液体フィターゼ濃縮物に添加する更なる成分の必要はない。
【００２５】
スプレー冷却の場合、溶融性成分、例えばヤシ油（及び／又はその他の溶融性植物油又は脂肪）、水添加ヤシ油（及び／又はその他の水添加植物油）、獣脂、水添加獣脂、又はワックスがマトリックスとして機能する。あるとしたなら、フィターゼ及びその他の成分を溶融した溶融性成分に導入し、そしてその溶融物を粒子形式条件下、典型的にはスプレードライタワーの中で固化させる。
【００２６】
しかしながら、多くの用途、例えば動物飼料にとって、顆粒が様々な理由のために通常好ましい。一の理由はそれらが飼料成分と容易に混合されうること、又は好ましくはビタミンやミネラルの如きその他の所望の飼料添加剤を含むプレミックスの成分を形成するからである。
【００２７】
酵素顆粒の粒子サイズは好ましくはその混合物のその他の成分のそれと適合性なものとする。これは酵素を例えば動物飼料に組込むための安全且つ便利な手段を提供する。
【００２８】
粒子のサイズは粒子の最大線形寸法としてよい。従って、例えば実質的に球形の粒子（例えば実質的に球形の顆粒）の場合、注目の粒子サイズは粒子の直径であろう。
【００２９】
凝集顆粒及び凝集粉末は高剪断ミキサー（例えばＬｏｄｇｉｅ）において凝集技術を利用して調製してよく、その際１又は複数種の充填材及び酵素が共凝集して顆粒を形成する。
【００３０】
吸収性顆粒は吸収されるべき／酵素によりコーティングされるべき１又は複数種の担体材料のコアを有することにより調製される。
【００３１】
典型的な充填材は塩類、例えば硫酸二ナトリウム及びリグノスルホン酸カルシウムである。その他の充填材はシリカ、石膏、カオリン、タルク、珪酸マグネシウムアルミニウム及びセルロースファイバーである。任意的に、結合剤、例えばデキストリンを凝集顆粒に含ませる。
【００３２】
典型的な担体材料は適当な粒子サイズを有する粒状コアから成ってよい。この担体は水溶性又は水溶性であってよく、例えばカッサバ又はコムギの形態の例えばデンプン、又は糖類（例えばスクロース又はラクトース）、又は塩（例えば塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウム）であってよい。
【００３３】
任意的に、これらの顆粒はコーティング混合物でコーティングする。かかる混合物はコーティング剤、好ましくは疎水性コーティング剤、例えば水添加ヤシ油及び牛獣脂を含んで成り、そして所望するならその他の添加剤、例えば炭酸カルシウム又はカオリンを含んで成る。
【００３４】
ＷＯ９７／３９１１６は酵素含有顆粒の形態における本発明の固体組成物の作製のための好適な方法を開示する。特に、その詳細な説明の中の表題ｃｏｒｅｓ，ｂｉｎｄｅｒｓ，ｆｉｌｌｅｒｓ，ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒｓ，ｆｉｂｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｓｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔｓ，ｃｏａｔｉｎｇ ｌａｙｅｒｓ，ｅｎｚｙｍｅｓ，ｏｔｈｅｒ ａｄｊｕｎｃｔ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｃｓの章を参照のこと（これらの事は引用することで本明細書に組入れる）。しかしながら、ＷＯ９７／３９１１６は乳酸起源の固体組成物への合体を開示していない。
【００３５】
フィターゼ顆粒を調製する好適な方法は実施例３を参照されたい。
【００３６】
本発明の好適な固体組成物は酵素組成物である。好適な組成物は濃縮されており、即ち２０単位／ｇ以上の活性である。従って、固体酵素組成物の概念は、特に、限定することなく、スプレードライ酵素調整品、酵素顆粒、例えば凝集顆粒及び吸収性顆粒、コーティング化及び非コーティング化、並びに動物飼料用の酵素含有プレミックスを含んで成る。
【００３７】
液体酵素（フィターゼ）濃縮物は例えば下記の通りにして調製できうる：酵素起源、典型的にはフィターゼ含有発酵ブロスを一次分離工程にかけ（例えばデカンター、遠心分離機又はフィルタープレスを使用して）、次いで第二精製濾過及び／又は細菌濾過工程にかける。最後に、液体を例えば超限外濾過を利用して濃縮し、次いで細菌濾過する。典型的な乾燥物質含有量は１０〜３０％、好ましくは１５〜２５％、より好ましくは１７〜２２％の範囲にある。
【００３８】
本明細書において、単数形は「１又は複数」又は「一以上」を包括している。これは本発明の組成物の以下の必須又は任意成分に適用される：フィターゼ、乳酸起源、ＣＳＬ、デンプン、二糖、充填剤、担体。
【００３９】
何らかのことわりのない限り、乾燥物質含有量についての％表示は全て重量／重量である。好ましくは、「単位／ｇ」も乾燥物質含有量に関連する。乾燥物質含有量は当業界公知の任意の方法、例えば屈折測定計又は水分を放出するためのオーブン中での乾燥により決定できうる。
【００４０】
何らかのことわりのない限り、「以上」は一般に「≧」を意味し、「最大」又は「以下」は「≦」を意味する。
【００４１】
本発明において、「乳酸起源」又は「乳酸調製品」は乳酸又は任意の乳酸塩、即ち、任意のその塩の化合物を含んで成る任意の組成物をいう（乳酸は２−ヒドロキシプロパン酸である）。同様に、本明細書でいう「乳酸」には任意の乳酸塩が含まれる。このような表現は乳酸起源、乳酸のそのもの、及びその乾燥物質部分について同義に利用する。
【００４２】
乳酸起源の非限定的な例示は下記の通りである：比較的純粋な化学化合物としての乳酸及び乳酸塩（即ち、純度７０％、８０％、９０％以上）；やや不純な物質としての乳酸及び乳酸塩（即ち、純度５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％以上）；５％以上、好ましくは１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７０％、８０％、９０％以上の量の乳酸を含んで成る任意の天然又は合成組成物。
【００４３】
本発明の固体酵素組成物は好ましくは最大２０％、好ましくは最大１５％、より好ましくは最大１０％、更により好ましくは最大９，８，７，６，５，４，３，２，１，０．７５又は０．５％の乳酸を含んで成る。乳酸の含有量は好ましくは０．００１％以上、好ましくは０．００２，０．００４，０．００６，０．００８，０．０１，０．０２，０．０４，０．０６，０．０８，０．１，０．１２，０．１４，０．１６，０．１８，０．２，０．２２，０．２４，０．２６，０．２８又は０．３％以上とする。乳酸含有量の好適な範囲は０．０１〜１０％、０．０２〜９％、０．０３〜８％，０．０４〜７％、０．０５〜６％、０．０６〜７％、０．０７〜６％、０．０８〜５％、０．０９〜４％、又は０．１〜３％である。
【００４４】
乳酸のための任意のアッセイを利用することができる。好適な乳酸アッセイはＳＩＧＭＡに由来する：（１）アッセイキットカタログＮｏ．７３５−１０（酵素アッセイ：オキシダーゼの存在下で乳酸塩をピルビン酸塩及び過酸化水素へと分解）；又は（２）アッセイキットカタログＮｏ．８２６−Ａ及び８２６−Ｂ（紫外線、終点：乳酸脱水素酵素及びＮＡＤの存在下で乳酸塩をピルビン酸へと変換）。
【００４５】
好適な乳酸起源はコーン・スチープ・リカー又はＣＳＬである。ＣＳＬは市販の製品である。例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｋｓ，１９９６，第４版、Ｉｎｄｅｘ ｎｏ．２５９８参照のこと。それはコーン・スチープ水の濃縮により得られる粘性の黄色味がかった又は濃茶色の液体である。その乾燥物質含有量は通常４５〜５５％、好ましくは４８〜５２％である。そのｐＨは３〜５、好ましくは３．５〜４．５の範囲内にある。そのタンパク質含有量（乾燥物質）は典型的には３０〜５０％、好ましくは３５〜４５％である。酸度（乳酸として）は典型的には１０〜３０％（乾燥物質）、好ましくは１２〜２５％である。
【００４６】
本明細書で用いる「ＣＳＬ」とは製品そのまま、又はその乾燥物質部を意味する。
【００４７】
好適な態様において、本発明の固体組成物は０．０１〜１５％、好ましくは０．１〜１０％、より好ましくは１〜５％のＣＳＬを含んで成る。
【００４８】
ＣＳＬ含有量の分析のためには任意の方法を利用してよい。ＣＳＬのフィンガープリンティング及び定量のための好適なＨＰＬＣ法を実施例８に示す。別の好適な方法はヘッドスペースガスクロマトグラフィー（ＨＳ−ＧＣ）であり、好ましくはマススペクトル（ＭＳ）と併用する。
【００４９】
好適な態様において、本発明の固体組成物は更にデンプン起源を、典型的には０．１〜２０％、より好ましくは０．２〜１０％、更により好ましくは１〜５％の量で含んで成る。
【００５０】
デンプン起源の概念はアルファ−１，４−又はアルファ−１，６−結合により相互連結されたグルコース単位を含んで成る任意の天然又は合成多糖類を含む。純度は好ましくは１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０以上又は１００％である。好適なデンプン起源はコムギデンプンであり、それは市販の製品である。「デンプン起源」なる語には前述のＷＯ９７／３９１１６の表題「Ｃｏｒｅｓ」の章に記載のデンプン及び修飾デンプンが挙げられる。
【００５１】
別の好適な態様において、本発明の固体組成物は更に二糖類を、好ましくは０．０１〜１５％、より好ましくは０．１〜１０％、更により好ましくは１〜５％の量で含んで成る。
【００５２】
二糖類の概念には、任意の天然又は合成二糖類が含まれ、モノマー及び結合の型は問わない。かかる二糖類の例はマルトース、ラクトース、セロビオース、スクロース、トレハロースである（非限定例）。好ましくは、これらの二糖類は純度１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０以上又は９０％以上でさえもある。好適な二糖類はラクトース及びトレハロース（アルファ−Ｄ−グルコース アルファ−Ｄ−グルコピラノシド、α−１，１−結合）である。
【００５３】
本発明の方法において、全ての工程、例えば請求項１４に記載の工程は、同時に又は順次に行ってよい。例えば、工程（ｉ）及び（ii）は順次に、又は好ましくは同時に（乳酸起源及びフィターゼを混合してから担体にスプレーする）；工程（iii）及び（iv）は同時に、又は順次に、好ましくは同時に、同一の装置内で行う。これは請求項１２の「一緒に」に適用される。
【００５４】
本発明の更なる好適な態様は下記の通りである：
フィターゼ活性を有する少なくとも一種の酵素及びコーン・スチープ・リカー（ＣＳＬ）を含んで成る固体組成物（ここでこの組成物のフィターゼ活性は２０〜５０，０００単位／ｇの範囲にある）。ＣＳＬの好適な量は０．０１〜１５％（乾燥物質含有量及びｗ／ｗ）の範囲内にある。好ましくは、この組成物は更にコムギデンプン（ＷＳ）を、好ましくは０．０１〜２０％（乾燥物質含有量及びｗ／ｗ）の範囲内の量で含んで成る。
【００５５】
２０〜５０，０００単位／ｇの範囲のフィターゼ活性を有する顆粒組成物の調製方法（ここでこの方法は（ｉ）液体フィターゼを担体上にスプレーし；（ii）ＣＳＬをこの担体上にスプレーし；（iii） 混合し；そして（iv）乾燥する工程を含んで成る。
【００５６】
２０〜５０，０００単位／ｇの範囲のフィターゼ活性を有するスプレードライ固体組成物の調製方法（この方法は、ＣＳＬを液体フィターゼ濃縮物に添加し、それからそれを乾燥させる工程を含んで成る）。
【００５７】
本実施例で調製した固体フィターゼ組成物の活性は貯蔵前は１０００〜３０００FTU／ｇ の範囲にある。
【００５８】
実施例１
ＦＹＴアッセイ
１０μｌの希釈酵素サンプル（０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０，ｐＨ５．５に希釈）を０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０，ｐＨ５．５中の２５０μｌの５mMのフィチン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨはフィチン酸ナトリウムの溶解後に調整；基質は予め加熱しておく）に加え、そして３７℃で３０分インキュベーションする。反応を２５０μｌの１０％のＴＣＡで停止させ、そして遊離リン酸塩を１００mlのモリブデン酸試薬中の７．３ｇのＦｅＳＯ4 ５００μｌ（２５０mlに希釈した８mlのＨ2ＳＯ4中の２．５ｇの（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ）の添加により測定する。７５０nmでの吸収を９６穴マイクロタイタープレート中の２００μｌのサンプルで測定する。基質及び酵素ブランクを含ませる。リン酸標準曲線も含ませる（０〜２mMのリン酸塩）、１ＦＹＴは所定の条件で１μmol のリン酸塩／min 遊離させる酵素の量に相当する。
【００５９】
ＦＴＵアッセイ
１ＦＴＵは標準の条件（３７℃、ｐＨ５．５；反応時間６０分、そして５mMのフィチン酸の出発濃度）で、１分当り１μmol のリン酸に相当するリン酸塩を遊離させる酵素の量と定義する。
１ＦＴＵ＝１ＦＹＴ
【００６０】
ＦＴＵアッセイは動物飼料プレミックス等の複雑な組成物のフィターゼ活性測定に好ましい。
【００６１】
試薬／基質
飼料等のための抽出バッファー
このバッファーはＰＯ4 −標準品の調製及びプレミックスサンプルの更なる希釈のためにも使用する。
【００６２】
０．２２Ｍの酢酸バッファー、Ｔｗｅｅｎ２０入り、ｐＨ５．５
１リットル当り３０ｇの酢酸ナトリウム三水和物（ＭＷ＝１３６．０８ｇ／ mol）、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ４６２６７及び１リットル当り０．１ｇのＴｗｅｅｎ２０，例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ２２１８４を秤量する。
酢酸ナトリウムを脱鉱水に溶解する。
Ｔｗｅｅｎ２０を加え、そしてｐＨ酢酸で５．５０±０．０５に調整する。
脱鉱水を全容量に至るまで加える。
【００６３】
プレミックス用の抽出バッファー
０．２２Ｍの酢酸バッファー、Ｔｗｅｅｎ２０，ＥＤＴＡ，ＰＯ4 3-，ＢＳＡ入り
１リットル当り３０ｇの酢酸ナトリウム三水和物、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ６２６７
１リットル当り０．１ｇのＴｗｅｅｎ２０、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ２２１８４
１リットル当り３０ｇのＥＤＴＡ、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ８４１８
１リットル当り２０ｇのＮａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、 例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ６５８０
１リットル当り０．５ｇのＢＳＡ（牛血清アルブミン）、例えばＳｉｇｍａ Ａｒｔ Ａ−９６４７
【００６４】
これらの成分を脱鉱水に溶かし、そしてｐＨを酢酸で５．５０±０．０５に調整する。
脱鉱水を全容量に至るまで添加する。
ＢＳＡは安定ではなく、そしてバッファーを使用する回に加えなくてはならない。
【００６５】
５０ mM のＰＯ 4 3- ストック溶液
０．６８１ｇのＫＨ2ＰＯ4（ＭＷ＝１３６．０９ｇ／ mol）、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ４８７３を秤量し、そしてＴｗｅｅｎ入りの１００mlの０．２２Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５に溶解する。
貯蔵安定性：冷蔵庫の中で１週間
【００６６】
０．２２Ｍの酢酸バッファー、ｐＨ５．５、Ｔｗｅｅｎなし
このバッファーはフィチン酸基質の製造のために使用する。
１５０ｇの酢酸ナトリウム三水和物（ＭＷ＝１３６．０８）、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ６２６７を秤量し、そして脱鉱水に溶かし、そしてｐＨを酢酸で５．５０±０．０５に調整する。
脱鉱水を５０００mlとなるまで添加する。
貯蔵安定性：室温で１週間
【００６７】
フィチン酸基質：５ mM のフィチン酸
フィチン酸の容積を使用バッチの水含有量を差し引いて計算する。
水含有量が例えば８．４％なら、以下の通りとなる：
【数１】
フィチン酸（Ｎａ−塩）（ＭＷ＝９２３．８ｇ／ mol）、例えばＳｉｇｍａ Ｐ−８８１０を秤量し、そして０．２２Ｍの酢酸バッファー（Ｔｗｅｅｎなし）に溶解する。（希釈）酢酸の添加は溶解速度を上げる。
ｐＨを酢酸で５．５０±０．０５に調整する。
０．２２Ｍの酢酸バッファーを全容量に至るまで添加する。
【００６９】
２１．７％の硝酸溶液
停止溶液用
１部の濃（６５％）硝酸を２部の脱鉱水に混合する。
【００７０】
モリブデン酸試薬
停止溶液用
１００ｇのヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物（ＮＨ4）6ＭＯ7Ｏ24 ・４Ｈ2Ｏ 、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ １１８２を鉱鉱水に溶解する。１０mlの２５％のＮＨ3 を加える。
脱鉱水を１リットルとなるまで添加する。
【００７１】
０．２４％のバナジン酸アンモニウム
Ｂｉｅ ＆ Ｂｅｒｎｔｓｅｎより購入
【００７２】
モリブデン酸／バナジン酸停止溶液
１部のバナジン酸塩溶液（０．２４％のバナジン酸ナトリウム）＋１部のモリブデン酸溶液を混合する。２部の２１．７％の硝酸溶液を添加する。
この溶液は使用の２時間以内に調整し、そしてボトルはアルミ箔でラッピングする。
【００７３】
サンプル
凍結サンプルを冷蔵庫の中で一夜解凍する。
飼料サンプルのためのサンプルサイズ：少なくとも７０ｇ、好ましくは１００ｇ。
【００７４】
飼料サンプル
サンプルサイズの１０倍に相当するバッファーの添加を可能とする溶液容積を選定する。例えば、１００ｇをＴｗｅｅｎ入りの１０００mlの０．２２Ｍ酢酸バッファーに溶解する。ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ１参照。最も近い溶液容積にする。
【００７５】
サンプルサイズが約１００ｇなら、全てのサンプルをコーヒーグラインダーで粉砕し、次いで風袋計量したビーカーに入れる。サンプル重量を記録する。非ペレット化サンプルを粉砕する必要はない。もしサンプルが取り扱うには大きすぎるなら、それを約１００ｇの部へと分割する。
【００７６】
磁石をビーカーに入れ、そしてＴｗｅｅｎ入りの０．２２Ｍの酢酸バッファーを加える。
サンプルを９０分かけて抽出する。
抽出後、サンプルを３０分放置して飼料を沈降させる。５mlのサンプルをピペットで抜き取る。サンプルを溶液の水面下２〜３cmで取り、そして遠心用ガラスに入れ、蓋でカバーする。
サンプルを４０００rpm で１０分遠心分離する。
【００７７】
プレミックスサンプル
サンプル重量の１０倍に相当するバッファーの添加を可能にする溶液容積を選定する。最も近い溶液容積にする。
サンプルを秤量したなら（５０〜１００ｇ）、全てのサンプルを風袋計量したビーカーに入れる。サンプル重量を記録する。サンプルが取り扱うのに大きすぎるなら、それを約１００ｇの部へと分割する。
磁石をビーカーに入れ、そしてＴｗｅｅｎ、ＥＤＴＡ及びＰＯ4 3- 入りの０．２２Ｍの酢酸バッファーを添加する。
サンプルを６０分かけて抽出する。
抽出後、サンプルを３０分放置し、プレミックスを沈降させる。５mlのサンプルをピペットで抜き取る。サンプルは溶液の水面下２〜５cmで取り、そして遠心ガラスに入れ、蓋でカバーする。
サンプルを４０００rpm で１０分遠心分離する。
【００７８】
分析
飼料サンプルの抽出物を直接分析する。
プレミックスの抽出物を約１．５FTU／ｇ に希釈する（Ａ415 （メインサンプル）＜１．０）。
Ｔｗｅｅｎ２０入りの０．２２Ｍの酢酸バッファーを希釈のために用いる。
【００７９】
メインサンプル
抽出及び遠心分離してサンプル由来の２×１００mlの上清液を標線付きガラス試験管に入れ、そして磁石を各試験管に入れる。
全てのサンプルの準備が整ったら、それらを撹拌湯浴に入れる。温度：３７℃。
３．０mlの基質を加える。
基質を添加してから正確に３０分インキュベーションする。
サンプルを湯浴から取り出し、そして２．０mlの停止溶液を加える（基質を添加してから正確に６０分後）。
サンプルを１分以上撹拌する。
飼料サンプルを４０００rpm で１０分遠心分離する（プレミックスサンプルは遠心分離の必要がない）。
【００８０】
ブラインドサンプル
抽出及び遠心分離したサンプル由来の１００mlの上清液を標線付きガラス試験管に入れ、そして磁石を各試験管に入れる。
２．０mlの停止溶液をサンプルに加える。
３．０mlの基質をサンプルに加える。
サンプルを室温で６０分インキュベーションする。
飼料サンプルを４０００rpm で１０分遠心分離する（プレミックスサンプルは遠心分離の必要がない）。
【００８１】
標準品
８つの標準品各々から２×１００mlを取り、更に４×１００mlの０．２２Mの酢酸バッファー（試薬ブラインド）も用意する。
全てのサンプルのＡ415 を測定する。
【００８２】
計算
FTU ／ｇ＝μmol ＰＯ4 3- ／（min ×ｇ（サンプル））
Ｃｇのサンプルを秤量する（粉砕後）。
１００μｌを抽出及び遠心分離サンプルからとる。
ＰＯ4 3- 標準曲線は直線状である。
ＰＯ4 3- 標準品の回帰曲線から、サンプルの実際の濃度がわかる（mMの濃度）：
【数２】
Ｖｏｌ：サンプル容積、リットル＝０．０００１ リットル
１０００：mmolからμmol に至る換算計数
【数３】
Ｆｐ＝採取サンプルと全サンプル（抽出後）との関係
例えば：１０００mlから０．１００mlとると、Ｆｐ＝１０００／０．１００＝１００００
下記の値を挿入した換算式：
ｔ＝６０
Ｖｏｌ＝０．０００１ ｌ
Ｆｐ＝１００００
【数４】
実施例２
濃液体フィターゼ調製品の調製
ペニオフォラ・ライチイ（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ ｌｙｃｉｉ）由来のフィターゼをＷＯ９８／２８４０８に本質的に記載の通りにしてアルペルギルス・オリザ（Ａ，ｏｒｙｚａｅ）の中で発現させ、そして発酵及び精製する。得られる液体フィターゼ濃縮物は１８％の乾燥物質含有量のＵＦ（限外濾過）濃縮物である。ｐＨを５に調整する。
【００８４】
実施例３
フィターゼ顆粒の調製
１．５％のＣＳＬの入ったコーティング化フィターゼ顆粒を下記の通りに調製する：
以下の組成を有する粉末組成物１４．６８kg：
０．７５ｇのカオリン、Ｓｐｅｓｗｈｉｔｅ，Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｌａｇ
１．８０kgの繊維セルロース、Ａｃｂｏｃｅｌ ＢＳ２００
１１．２３kgの微粉砕硫酸ナトリウム
０．９０kgの炭水化物結合剤、Ｔａｃｋｉｄｅｘ Ｇ１５５（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）
をＬｏｄｉｇｅミキサーＦＭ５０の中で混合し、そして１．６８kgの水、０．６２５kgのコーン・スチープ・リカー（Ａｍｙｌｕｍ Ｎ．Ｖ．より供給の濃縮コーン・スチープ・リカー（ＣＣＳＬ）、乾燥物質含量４８％）及び０．８４kgのフィターゼ濃縮物（１８％の乾燥物質含有量）（実施例２記載の通りに調製）から成る３．１５kgのスプレー用液体をスプレーする。スプレーの最中及び後に、この湿った混合物を米国特許第４，１０６，９９１号のＥｘａｍｐｌｅ１に記載の通りにして、多数のセットのナイフによる圧縮及び粉砕力にかける。
【００８５】
このまだコーティングを施していない原料顆粒中のＣＳＬのパーセンテージを下記の通りに計算する：
０．６２５ｘ０．４８／（１４．６８＋０．６２５ｘ０．４８＋０．８４ｘ０．１８）＝０．３００／（１４．６８＋０．３０＋０．６７２）＝０．３００／１５．６５２＝１．９１７％〜２％。
【００８６】
顆粒を流動床で３％未満の水分含量へと乾かし、以下の粒度分布を有する明色顆粒を得た：
１０．５％＞１１００μｍ（マイクロメーター）
９２．０％＞３００μｍ
８．０％＜３００μｍ
【００８７】
最後に顆粒をふるいにかけ、３００μｍ〜１１００μｍの粒子範囲を有する製品を得、そして６kgの顆粒を８０℃にて、
９％の完全水添加ヤシ油、次いで２２．５％のカオリン、Ｓｐｅｓｗｈｉｔｅ（１００ｇのコーティング材料中の乾燥物質含有量：２２．５ｇ＋９ｇ＝３１．５ｇ）で、米国特許第４，１０６，９９１号、Ｅｘａｍｐｌｅ２２に記載の通りにしてコーティングする。
【００８８】
得られる最終製品、コーティング化顆粒中のＣＳＬの含量は出発顆粒のＣＳＬ含量と比較して以下の通りに減少する：１．９１７％／１．３１５＝１．４５８％〜１．５％。
【００８９】
この顆粒をふるいにかけ、３００μｍ〜１２００μｍの粒子範囲を有する製品を得る。
【００９０】
下記に利用するコントロール顆粒を、ＣＳＬを添加しないことを除き、上記の通りに調製する。
コムギデンプン及びラクトース又はトレハロースを更に含んで成る顆粒を対応の方式で調製する。
【００９１】
実施例４
プレミックス中のフィターゼ顆粒の貯蔵安定性
以下の表１に示すフィターゼ顆粒を実施例３に従って調製する。「コントロール」は実施例３の方法に従って調製したが、ＣＳＬの添加していないフィターゼ顆粒を意味する。
【００９２】
顆粒を各バイヤルの中に直接秤量する。顆粒の正確な重量を記録する。これらのバイヤルに清浄なタオルをかけ、そして室温で一夜放置する。
【００９３】
プレミックスＥＮＧＡ １−０２／Ｎｏｒｄｋｏｒｎ、製品番号０１５３８４ Ａｒｔｉｋｅｌ Ｎｒ．８２５９（２５kgドラム）をＬｏｄｉｇｅミキサーの中でプレミックス成分の均一な分布を確保しながら混合し、そしてプラスチックバッグの中にバッグ当り約３kgのプレミックスで充填する。
【００９４】
プレミックスの組成は以下の通りである（キロ当り）：
５００００００ＩＥ ビタミンＡ
１００００００ＩＥ ビタミンＤ３
１３３３３ mg ビタミンＥ
１０００ mg ビタミンＫ３
７５０ mg ビタミンＢ１
２５００ mg ビタミンＢ２
１５００ mg ビタミンＢ６
７６６６ mcg ビタミンＢ１２
１２３３３ mg ナイアシン
３３３３３ mcg ビオチン
３００ mg 葉酸
３０００ mg Ｃａ−Ｄ−パントテネート
１６６６ mg Ｃｕ
１６６６６ mg Ｆｅ
１６６６６ mg Ｚｎ
２３３３３ mg Ｍｎ
１３３ mg Ｃｏ
６６ mg Ｉ
６６ mg Ｓｅ
５．８ ％ カルシウム
２５ ％ ナトリウム
【００９５】
５０ｇ±１ｇのプレミックスを各バイヤルに入れ、そしてこれらのバイヤルをスクリュー蓋で閉じる。プレミックスを５０ｇに相当する容量を供するように調整した調節可能シリンダー「スクープ」を用いて添加する。これらのバイヤルを、顆粒がプレミックスの中で均一に分布されるまで手動で混合する。
【００９６】
各顆粒について１００％の活性レベルと規定する０週サンプル（閉じたバイヤル）をサンプル調製の完了直後に凍結する。３０℃で保存するサンプルは再度蓋を開ける。開放バイヤルを、サンプル中の約１０％の水分に相当する４３％のｒＨに水で調整した１リットルのグリセロールを含むプラスチック箱に入れる（糖スケールで測定すると６２％の屈折計乾燥物質）。プラスチック箱の蓋を強力テープでシールする。これは、水分活性が１３週間の試験期間全体にわたり０．４３であることを意味する。
【００９７】
貯蔵期間の満了後、サンプルをグリセロール箱から取り出し、スクリュー蓋で閉じ、そして凍結する。
【００９８】
サンプルを冷蔵庫（５℃）の中で一夜かけて解凍してから分析する。
−１８℃で貯蔵した０週サンプル及び３０℃で貯蔵した対応のサンプルを同日に分析し、日間差及び人間差を排除する。
結果を以下の表１に示す：ＣＳＬ＝コーン・スチープ・リカー及びＷＳ＝コムギデンプン。
２％のＣＳＬ、３％のＣＳＬ及び２％ＣＳＬ＋５％のＷＳを含むフィターゼ顆粒は似かよった性能を示す。
【００９９】
【表１】
実施例５
飼料中のフィターゼ顆粒の貯蔵安定性
以下の表２に表示のフィターゼ顆粒を実施例３に従って調製する。「コントロール」は実施例３の通常の標準方法に従って調製したが、ＷＳもＣＳＬも二糖類も添加していないフィターゼ顆粒を示す。
【０１０１】
飼料中の顆粒のサンプルはＢｉｏｔｅｋｎｏｌｏｇｉｓｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，Ｋｏｌｄｉｎｇ，Ｄｅｎｍａｒｋにて調製する。
【０１０２】
飼料の組成は以下の通りである：
７４．０％のコムギ
２０．７％のローストダイズケーキ
５．０％のダイズ油
０．３％のＰｒｅｍｉｘ Ｅｎｇａ １−０２／Ｎｏｒｄｋｏｒｎ
【０１０３】
飼料をフィターゼ顆粒の添加前に≦１０％の水分含有量へと乾かす。
顆粒バッチを飼料に供給し、そしてこの混合物を６５℃でペレット化する。
この飼料ペレットをサンプル分割し、そして１００mlのサンプルバイヤルに充填する。
各顆粒について１００％の活性レベルと規定する０週サンプルをスクリュー蓋で閉じ、そして−１８℃で保存する。
【０１０４】
３０℃で保存するサンプルは閉じない。開放バイヤルを、サンプル中の約１０％の水分に相当する４３％のｒＨに水で調整した１リットルのグリセロールを含むプラスチック箱に入れる（糖スケールで測定すると６２％の屈折計乾燥物質）。プラスチック箱の蓋を強力テープでシールする。このことは、水分活性が１３週間の試験期間全体にわたり０．４３であることを意味する。
【０１０５】
貯蔵期間の満了後、サンプルをグリセロール箱から取り出し、スクリュー蓋で閉じ、そして凍結する。サンプルを冷蔵庫（５℃）の中で一夜かけて解凍し、分析する。
均一性試験のためのサンプルを分析するまで＋５℃で冷蔵保存する。
【０１０６】
マッシュ飼料、６５℃に加熱した飼料及び添加酵素抜きの飼料ペレットは全て予想通り約０．５FTU／ｇ を含んだ。
【０１０７】
酵素添加した及び６５℃に加熱したマッシュ飼料のサンプル５つを均一性について分析する。相対標準偏差は２％〜１１％である。従って、均一性は許容できる。
【０１０８】
飼料ペレットのサンプル５つを均一性について試験する。相対標準偏差は２〜１０％である。従って、均一性は許容できる。
【０１０９】
貯蔵安定性を１３週間後に測定する。−１８℃で貯蔵した０週サンプル及び３０℃で貯蔵した対応のサンプルを日間差及び人間差を排除するために同日に分析する。
【０１１０】
フィターゼ残留活性測定値の結果を以下の表２に示す（残留活性の計算前に内因活性を総活性から差し引く）；ＣＳＬ＝コーン・スチープ・リカー、そしてＷＳ＝コムギデンプン。
【０１１１】
２％のＣＳＬ、３％のＣＳＬ及び２％のＣＳＬ＋５％のＷＳを含むフィターゼ顆粒は似かよった性能を示す。
【０１１２】
【表２】
実施例６
フィターゼ顆粒自体：顆粒収率及び貯蔵安定性
実施例２の液体濃縮物を実施例３の方法に従って実験用固体フィターゼ組成物を調製するために用いた。
第一顆粒実験では、二糖ラクトースを２％の量で３％の乳酸起源コーン・スチープ・リカー（ＣＳＬ）と一緒に加えた。
第二顆粒実験では、３％のコムギデンプン（ＷＳ）を、第一実験の２成分に加え、適用した。
第三顆粒実験では、２％の量の二糖トレハロース及び３％のＷＳを、３％の乳酸起源ＣＳＬと一緒に添加した。
【０１１４】
得られる顆粒自体の顆粒収率及び貯蔵安定性に対する効果を検討する。
【０１１５】
顆粒収率は、顆粒単位の中に入り込んだ液体濃縮物のフィターゼ単位に対する、顆粒単位から遊出して製品中に残留するフィターゼ単位として計算する。
【０１１６】
得られるフィターゼ顆粒組成物自体の貯蔵安定性は下記のやや厳しい条件を利用して検討する：４週、４０℃及び６０％の相対湿度。
【０１１７】
その結果を以下の表３に示す。
【０１１８】
【表３】
実施例７
その他のフィターゼの顆粒組成物の貯蔵安定性
液体フィターゼ濃縮物及び固体組成物（即ち、顆粒）をＥＰ０８９７０１０に記載のいわゆる共通（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）フィターゼを用い、実施例２及び３の教示に従って調製した。
【０１２０】
顆粒実験は本質的に実施例６に記載の通りにして実施した。しかしながら、貯蔵安定性のため、サンプルを３０℃でも貯蔵する。結果を以下の表４に示す。
【０１２１】
【表４】
実施例８
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用するＣＳＬの特性決定
様々な供給者（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ，４ Ｒｕｅ Ｐａｔｏｕ，Ｆ−５９０２２ Ｌｉｌｌｅ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ；Ｓｔａｒａｌ ｓ．ａ．，Ｚ．Ｉ．ＥＴ Ｐｏｒｔｕａｉｒｅ，Ｂ．Ｐ．３２，Ｆ−６７３９０ Ｍａｒｃｋｏｌｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ；及びＣｅｒｅｓｔａｒ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ Ａ／Ｓ，Ｓｋｏｖｌｙｔｏｆｔｅｎ ３３，ＤＫ−２８４０ Ｈｏｌｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）由来のＣＳＬの様々なバッチからのサンプル１５個を下記の通りに試験する。
【０１２３】
Ｃａｒｒｅｚ−沈殿
５．０ｇのＣＳＬを１００mlのフラスコに秤量する。４０mlのＭＱ水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑフィルターで濾過した脱鉱水）を加え、そして７０℃で１５分、２００rpm で振盪しながらインキュベーションする。１２mlのＣａｒｒｅｚ−Ｉ−溶液（カリウム−ヘキサフルオロ鉄（II）−三水和物）を加え、そして振盪する。１２mlのＣａｒｒｅｚ−II−溶液（硫酸亜鉛−ｔ水和物）を加え、そして振盪する。２０mlの０．５ＮのＮａＯＨを加え、振盪する。冷却し、ＭＱ水を１００ml加え、振盪する。この調製品１０mlをバイヤルに移し、そして４０００rpm で１０分遠心分離する。その上清液をＨＰＬＣ分析のために０．５μｍのフィルターで濾過する。サンプルブラインド（ＭＱ水及びＣａｒｒｅｚ溶液）を含む、各サンプルを２回分析する。
【０１２４】
クロマトグラフィーパラメーター
カラム： Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−１８−ＤＢ，
Ｎｏ．０８８８７７ＡＥ
ディテクター：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤＭ６Ａ−ダイオードアレー
２２０nm〜３５０nm
データー分析：データー分析のため、２６０nmでのインテグレーションから
得られるピークを使用
ポンプ： ＨＰ １０８０ グラジェントポンプ
溶出液： Ａ）ＭＱ−水
Ｂ）３０％ ＭｅＯＨ
Ｃ）６０％ ＭｅＯＨ
Ｄ）９０％ ＭｅＯＨ
勾配： ０ min Ａ
１５ min Ａ
３５ min Ｂ
５０ min Ｃ
６０ min Ｃ
６５ min Ｄ
７０ min Ｄ
７５ min Ｃ
８０ min Ｂ
８５ min Ａ
９０ min Ａ
【０１２５】
ＨＰＬＣにより分析したＣＳＬの１５のサンプルについての分散統計の結果を以下の表５に示す：
【０１２６】
【表５】
【表６】
表５の％ＳＤ行において、特徴的なピークを添数字（１，２，３…９，１０）で表示する。以下、これらのピークをピーク−１、ピーク−２、ピーク−３、…、ピーク−９、ピーク−１０とそれぞれ呼ぶ。１０個のピークのグループ全体をピーク１−１０と呼ぶ。サブグループを似たように表示する。例えば、５つのピーク番号１〜５についてはピーク−１−５、ピーク−１、ピーク−３及びピーク−５についてはピーク−１，３，５、等と呼ぶ。かくして、サンプル中のこれらのピークの１又は複数の存在はＣＳＬの存在を示唆する。好適な態様において、これらのピークのうちの１，２，３，４，５，６，７，８，９又は１０個全ての存在がＣＳＬの存在を示唆する。より好適な態様において、５，７，８又は１０ピークの存在がＣＳＬの存在を示唆する。５ピークの存在が最も好ましい。
【０１２９】
未知含有量のＣＳＬのサンプルの場合、適当な希釈率は単純な試行錯誤技術を利用して思い出せる。
【０１３０】
上記の定性方法は標準バッチとなる、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓにより命名されたバッチと比較することにより定量化できうる。Ｒｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓからの特に好適な標準ＣＳＬバッチはＳＯＬＵＬＹＳ（登録商標）Ｌ ４８ Ｌ ＣＡＳ Ｎｏ．６６０７１−９４−１，ＥＩＮＥＣＳ：２６６−１１３−４である。
Claims (15)
- 固体フィターゼ組成物であって、
（ａ）フィターゼ活性を有する酵素及び
（ｂ）コーン・スチープ・リカー（ＣＳＬ）
を含んで成り、ここで当該組成物のフィターゼ活性は２０単位／ｇ以上である、固体フィターゼ組成物。 - ａ）前記組成物のフィターゼ活性がｉ）２０〜５００００単位／ｇ、ｉｉ）１００〜２５０００単位／ｇ、ｉｉｉ）５００〜１００００単位／ｇ、又はｉｖ）１０００〜５０００単位／ｇの範囲にあり、及び／又はｂ）前記フィターゼ活性がｉ）ＦＹＴの単位において決定されるもしくはｉｉ）ＦＴＵアッセイを利用して測定される、請求項１記載の組成物。
- 前記ＣＳＬがＨＰＬＣにより分析したときのクロマトグラフィーにおいて下記表の「％ＳＤ」の列に示す数値の右肩に添数字で番号の表示されたピーク１〜１０のうちの１又は複数の存在を示す、請求項１又は２記載の組成物：
- 前記ＣＳＬがＨＰＬＣにより分析したときのクロマトグラフィーにおいて、請求項３に記載の表のピーク１〜１０のうちのｉ）２本、ｉｉ）３本、ｉｉｉ）４本、ｉｖ）５本、ｖ）６本、ｖｉ）７本、ｖｉｉ）８本、ｖｉｉｉ）９本、又はｉｘ）１０本の存在を示す、請求項３記載の組成物。
- 前記ＣＳＬを０．０１〜１０％の量で含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
- 前記ＣＳＬをｉ）０．０１〜１０％又はｉｉ）１〜５％の量で含んで成る、請求項５記載の組成物。
- 小麦粉デンプンを更に含んで成る、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
- 下記の１又は複数をさらに含んで成る、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物：
ｉ）デンプン起源；
ｉｉ）二糖；
ｉｉｉ）担体材料；
ｉｖ）充填材；
ｖ）１もしくは複数種のビタミン；及び／又は
ｖｉ）１もしくは複数種のミネラル。 - 固体フィターゼ組成物を調製するための方法であって、コーン・スチープ・リカー（ＣＳＬ）をフィターゼ活性を有する酵素と一緒に乾燥させることを含んで成り、ここで当該固体フィターゼ組成物のフィターゼ活性は２０単位／ｇ以上である、方法。
- ａ）前記組成物のフィターゼ活性がｉ）２０〜５００００単位／ｇ、ｉｉ）１００〜２５０００単位／ｇ、ｉｉｉ）５００〜１００００単位／ｇ、又はｉｖ）１０００〜５０００単位／ｇの範囲にあり、及び／又はｂ）前記フィターゼ活性がｉ）ＦＹＴの単位において決定されるもしくはｉｉ）ＦＴＵアッセイを利用して測定される、請求項９記載の方法。
- 前記固体フィターゼ組成物がフィターゼ顆粒組成物であり、そして前記方法が：
（ｉ）前記フィターゼ活性を有する酵素を担体上にスプレーし；
（ii）前記ＣＳＬを前記担体上にスプレーし；
（iii）混合し；そして
（iv）乾燥させる；
ことを含んで成る請求項９又は１０に記載の方法。 - 前記乾燥がスプレードライである、請求項９又は１０記載の方法。
- １もしくは複数種のデンプン起源及び／又は１もしくは複数種の二糖類の添加を更に含んで成る、請求項９〜１２のいずれか１項記載の方法。
- ２０単位／ｇ以上のフィターゼ活性を有し、且つ請求項９〜１３いずれか１項記載の方法により得られうる固体組成物。
- ａ）請求項９〜１３いずれか１項記載の方法により得られうるものであり及び／又はｂ）前記組成物のフィターゼ活性がｉ）２０〜５００００単位／ｇ、ｉｉ）１００〜２５０００単位／ｇ、ｉｉｉ）５００〜１００００単位／ｇ、もしくはｉｖ）１０００〜５０００単位／ｇの範囲にあり、及び／又はｃ）前記フィターゼ活性がｉ）ＦＹＴの単位において決定されるもしくはｉｉ）ＦＴＵアッセイを利用して測定される、請求項１４記載の組成物。
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