KR20010042063A

KR20010042063A - 사료 제제 및 식물 발현에 있어서의 열안정성 피타제

Info

Publication number: KR20010042063A
Application number: KR1020007010410A
Authority: KR
Inventors: 페테르센스벤드
Original assignee: 피아 스타르; 노보자임스 에이/에스
Priority date: 1998-03-23
Filing date: 1999-03-22
Publication date: 2001-05-25
Also published as: BR9909006A; AU753475B2; CN1293542A; AU3326799A; CA2325440A1; JP2002508942A; EP1065941A1; AU753475C; WO1999048380A1

Abstract

동물 사료의 제조에 있어서의 열안정성 피타제의 사용과, 그러한 피타제의 식물에서의 발현. 동물 사료의 제조를 위하여, 열안정성 피타제는 응집 단계전이나 동안에 첨가된다. 바람직한 과정은 펠리팅, 압출 및 팽창이다. 열안정성 피타제를 발현하는 트랜스제닉 식물은 동물 사료 제제에서 직접적으로 사용될 수 있을 것이다.

Description

사료 제제 및 식물 발현에 있어서의 열안정성 피타제{THERMOSTABLE PHYTASES IN FEED PREPARATION AND PLANT EXPRESSION}

WO 91/14782는 Aspergillus ficuum NRRL 3135로부터 유도된 피타제를 발현하는 트랜스제닉 담배와 평지씨 식물을 설명한다.

US 5,824,779는, 동일한 A. ficuum 피타제를 발현하는 트랜스제닉 앨팰퍼(alfalfa)를 생산하는 방법, 및 그 자체로 동물사료 보충제로서 사용될 수 있는 피타제-함유 농축물의 제조를 표준적인 양식으로 설명한다.

EP 0 556 883 B1은 압출기술에 기초하여 사료 펠렛을 제조하기 위한 방법을 설명한다. 피타제가 한 예인 온도 민감성 약제의 첨가가 사료 펠렛의 압출후에 발생하고, 온도 민감성 약제는 감압하에서 펠렛상으로 로딩된다.

EP 0 556 883 B1에서 인정된 대로, 사료 제조 과정동안의 열-민감성 물질의 활성의 손실은 잘-알려진 문제이다. 상기의 EP-특허는, 압출 과정 다음에 감압하에서 이 물질들을 첨가함으로써 이 문제를 해결할 것을 제안한다. 그러나, 이 해결책은 부가적인 고가의 공정장치의 설비는 물론 액체 형태의 민감성 물질을 필요로 한다.

본 발명은, 개선된 피타제-발현 트랜스제닉 식물은 물론, 동물사료의 개선된 제조방법을 제공한다.

발명의 개요

본 발명은, 동물사료의 제조방법을 제공하는데, 이 과정은 사료의 성분의 응집을 포함하고, 이때 응집전 또는 응집동안 열안정성 피타제를 첨가한다.

열안정성 피타제를 코드화하는 DNA-구조물을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 그것의 일부가 또한 제공된다.

트랜스제닉 식물 또는 그것의 일부, 예를 들어 종자나 잎을, 본 발명의 사료 제조 과정에 사용함으로써 -바람직한 구체예에서- 영양소(사료 성분)와 사료 첨가제(additive) 피타제를 동시에 제공할 수 있을 것이다.

본 발명은 열안정성 피타제(phytase), 즉 동물 사료의 제조방법에서의 그것의 사용, 및 식물에서의 그것의 발현에 관한 것이다.

하기 본 발명의 상세한 설명에서, 도면이 참조되는데,

도 1은 공통 피타제-1 및 공통 피타제-10의 시차주사열계량법(DSC) 도표이고;

도 2는 공통 피타제-10-열(thermo)-Q50T 및 공통 피타제-10-열-Q50T-K91A의 DSC이고;

도 3은 공통 피타제-1-열[8]-Q50T 및 공통 피타제-1-열[8]-Q50T-K91A의 DSC이고;

도 4는 A. fumigatus ATCC 13073으로부터의 피타제 및 그것의 α-돌연변이체의 DSC이고;

도 5는 공통-피타제-1 아미노산 서열의 고안을 보여주고;

도 6은 5개의 Basidiomycete 피타제의 정렬과 담자균류 공통서열이고;

도 7은 공통-피타제-10 아미노산 서열의 고안이고;

도 8은 공통-피타제-11의 고안을 위한 정렬이고(모든 Basidiomycete 피타제는 각각의 Basidiomycete 서열을 위한 0.2의 할당된 투표중량(vote weight)을 이용하여 독립적인 서열로서 사용되었고; A. niger T213의 아미노산 서열이 더욱더 사용되었다);

도 9는 공통-피타제-1-열(8)-Q50T-K91A의 DNA 및 아미노산 서열이고;

도 10은 공통-피타제-10-열(3)-Q50T-K91A의 DNA 및 아미노산 서열이고;

도 11은 A. fumigatus ATCC 13073 α-돌연변이체의 DNA 및 아미노산 서열이고;

도 12는 공통-피타제-1에 비교될 때 다음의 돌연변이를 포함하는 공통-피타제-7의 DNA 및 아미노산 서열이다: S89D, S92G, A94K, D164S, P201S, G203A, G205S, H212P, G224A, D226T, E225T, D256E, V258T, P265S, Q292H, G300K, Y305H, A314T, S364G, M365I, A397S, S398A, G404A, 및 A405S.

본 전후관계에서, "사료" 또는 "동물사료"는, 동물에 의하여 먹고 섭취되고 소화되도록 의도되거나 동물에 의하여 먹고 섭취되고 소화되기에 적당한 어떠한 자연적이거나 인공적인 식이, 식사 또는 유사한 것이라도 의미한다.

"동물"은 모든 동물을 포함하고, 다위(polygastric) 동물(반추동물); 또는 인간, 조류, 돼지 및 어류과 같은 단위(monogastric) 동물일 수 있다. 바람직한 동물은 단-위 동물, 특히 돼지와 병아리이다.

"사료 성분"의 개념은, 그것으로부터 사료가 생산될 수 있거나 생산되는 원료; 또는 사료의 의도되거나, 실제의 구성성분 일부를 포함한다. 인간아닌 동물을 위한 사료 성분은 보통, 그리고 바람직하게는 다음의 비-배타적인 목록중으로부터 선택된다:

식물 유도된 생산물

예를 들어, 종자, 낟알, 잎, 뿌리, 괴경, 꽃, 꼬투리, 깍지- 및 그것들은 박편, 케이크, 그리트, 고운 가루등의 형태를 취할 수 있을 것이다;

동물 유도된 생산물

예를 들어, 어류 식사, 분유, 뼈추출물, 수육추출물, 혈액추출물 등;

첨가제

예를 들어, 미네랄, 비타민, 향 화합물, 및 사료 증강효소(feed enhancng enzymes).

피트산 또는 미오-이노시톨 1,2,3,4,5,6-헥사키스 디히드로젠 포스페이트(또는 짧게는 미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)는 이노시톨의 1차적인 공급원이고 식물 종자와 낟알에서의 포스페이트의 1차적인 저장 형태이다. 두류의 종자에서, 그것은 포스페이트 함유량의 약 70%를 차지한다. 종자, 곡류 낟알 및 두류는 중요한 사료 성분이다.

피트산, 또는 그것의 염 피테이트-이들 용어는 본문에서 달리 표시하지 않으면 같은 뜻으로 구분없이 사용한다-는 항-영양 인자(anti-nutritional factor)이다. 이것은 부분적으로는, 칼슘과 같은 영양학적으로 필수적인 이온, 망간과 같은 미량 무기물, 및 또한 단백질과의 그것의 결합(정전기적 상호작용에 의함)에 기인한다. 그리고, 부분적으로는, 피트산과 그것의 염, 피테이트가 종종 대사되지 않기 때문에 그것의 인이 영양학적으로 이용가능하지 않다는 사실에 기인한다.

이것은 식사와 사료 제제를, 예를 들어 무기 포스페이트로 보충할 필요를 이끌어 낸다.

대사가능하지 않은 피트산의 인은 그러한 동물의 위장관을 통과하고 거름과 함께 배설되어, 그 결과로 환경의 원하지 않는 포스페이트 오염이 생기고, 그 결과 예를 들어, 물환경의 부영양화와 조류의 광범위한 성장이 생기게 된다.

피트산은 피타제에 의하여 분해될 수 있다. 본 전후관계에서, "피타제"는, 피타제 활성을 보이는, 즉 피테이트(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)를 (1)미오-이노시톨 및/또는 (2)그것의 모노-, 디-, 트리-, 테트라- 및/또는 펜타-포스페이트 및 (3)무기 포스페이트로 가수분해하는 것을 촉매하는 폴리펩티드 또는 효소이다.

미생물은 물론 식물에 의한 피타제의 생산이 보고되어 왔다. 미생물들중에서, 피타제 생산 균류는 물론 피타제 생산 박테리아가 알려져 있다.

균류의 문 Ascomycota에 속하는 피타제 생산 자낭균류(Ascomycetes)의 몇가지 설명이 있다. 특히, Aspergillus terreus와 같은 Aspergillus 속의 피타제 생산 자낭균류에 대한 몇가지 참고문헌이 있다(Yamada 등, 1986, Agric. Biol. Chem. 322:1275-1282). 또한, Aspergillus niger var. awamori로부터의 피타제 유전자의 클로닝과 발현이 설명되었다(Piddington 등, 1993, Gene 133:55-62). EP 0420358은 Aspergillus Ficuum(niger)의 피타제의 클로닝과 발현을 설명한다. EP 0684313은 자낭균류 Aspergillus niger, Myceliophthora thermophila, Aspergillus terreus의 피타제의 클로닝과 발현을 설명한다. 더욱이, Aspergillus nidulans, Talaromyces thermophilus, Aspergillus fumigatus 및 Aspergillus terreus의 또하나의 균주의 피타제의 어느정도의 부분적인 서열이 주어진다.

Thermomyces lanuginosus의 피타제의 클로닝과 발현이 WO 97/35017에서 설명된다.

WO 98/28409는, 예를 들어 Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Paxillus involutus 및 Trametes pubescens로부터의 몇가지 담자균류 피타제의 클로닝과 발현을 설명한다.

효소 명명 데이터베이스 ExPASy(EC(Enzyme Commission) 번호를 제공받은 각각의 유형의 특징지워진 효소를 설명하는 the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(IUBMB)의 Nomenclature Committee의 추천에 일차적으로 기초한 효소의 명명에 상대적인 정보의 저장소)에 따라서, 두개의 다른 유형의 피타제가 현재 알려져 있다: 이른바 3-피타제(미오-이노시톨 헥사포스페이트 3-포스포히드롤라제, EC 3.1.3.8) 및 이른바 6-피타제(미오-이노시톨 헥사포스페이트 3-포스포히드롤라제, EC 3.1.3.26). 3-피타제는 먼저 피트산의 3-위치에 있는 에스테르 결합을 가수분해하는 한편, 6-피타제가 먼저 피트산의 6-위치에 있는 에스테르 결합을 가수분해한다. 이 두 유형의 피타제 모두는 피타제의 상기의 정의안에 포함된다.

피타제 활성의 많은 분석이 알려져 있고, 이들중의 어느 것이라도 본 발명의 목적을 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 피타제 분석이 실시예에 포함된다.

"응집"의 개념은, 다양한 구성성분이 열의 영향하에서 혼합되는 과정으로서 정의된다. 결과적인 생산물은 바람직하게는, 만족스러운 물리적인 안정성의 생산물을 형성하면서 구성성분들이 서로서로 부착하는 "덩어리" 또는 집괴이다. 그러한 덩어리로부터 분진의 형성은 물리적인 안정성의 표시이다 - 더 적은 분진이 형성될수록 더 좋다. 덩어리로부터의 분진 형성을 위한 적당한 분석은 ASAE 표준적인 S 269-1이다. 만족스러운 덩어리는 20% 미만, 바람직하게는 15% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 보다 더 바람직하게는 6% 미만의 분진을 가진다.

"열의 영양하에서"는, 응집 유니트의 출구에서 생산물상에서 측정되었을 때 온도가 적어도 65℃라는 것을 의미한다. 보다 바람직한 온도은 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125 또는 심지어 적어도 130℃에서이다.

바람직한 응집 과정은 증가된 압력에서 작동된다. 압력은 전형적으로 성분의 밀집에 기인하는데, 임의로 단면적 또는 배출(throughput)면적의 감소와 조합된다. 바람직하게는, 온도와 압력과 같은 과정 매개변수를 알맞게 조정함으로써, 결과적인 전단력과 전단속도는 전분- 및 단백질-함유 사료 성분이 액체가 되는 그러한 크기이다.

"증가된 압력"는 정상적인 대기압에 비교하여 증가되는 것을 의미하고 응집 유니트내에서 측정될 때 최대 압력이다.

수증기 또는 스팀의 첨가는 종종 응집안에 포함되지만, 절대적인 요구사항으로서는 아니다.

응집은 압출, 팽창(또는 압력 조절(conditioning))과 펠리팅(또는 펠렛 압착)이라 불리는 잘-알려진 과정들을 포함하지만, 그것들에 한정되지는 않는다.

압출은, Danish Company Sprout-Matador, Glentevej 5-7, DK-6705 Esbjerg또는 Niels Finsensvej 4, DK-7100 Vejle("Handbog i Pilleteringsteknik 1996")으로부터 요청시 구입가능한 편람의 pp. 149-153에서 설명된다. 그러나, 본 발명의 응집 과정에서, 상기의 편람에서 언급된 다음의 과정 단계들은 완전히 임의적이다:

(i) 캐스케이드(cascade) 혼합기에서 사료 성분을 전-처리하고;

(ii) 노즐단면을 나오는 생산물을 원하는 크기의

(iii)조각으로 절단하고;

(iv) 그것을 순응시키고 조절하고;

(v) 그것을 코팅하고;

(vi) 그것을 건조시키고;

(vii)그것을 냉각시킨다.

팽창(압력 조절)의 과정은 pp. 61-66에서 동일한 편람에서 설명된다. 팽창을 위하여서도, 상기의 과정 단계들 (i)-(vi), 특히 단계 (i)과 (vi)는 완전히 임의적인 단계이다.

이것은 다음의 과정 단계를 위하여서도 그러하다:

(ii') 생산물을 잘게 빻고(예를 들어, p. 65에서 보여지는 바와 같이 블레이드 입자제조기(blade granulator)를 사용하여);

(vii) 생산물을 펠리팅한다(예를 들어 p. 62에서 보여지는 바와 같이 펠렛 압착기를 이용하여);

펠리팅의 과정은 동일한 편람에서 pp. 71-107에서 설명된다. 또한 본원에서, 상기의 단계들 (i)-(vii)는 완전히 임의적인 단계이다. 이 단계들은 상기의 편람의 pp 29-70에서 보다 상세하게 설명된다.

본 발명의 바람직한 응집 과정에서, 상기에 언급된 추가적인 과정 단계들 (i)-(vii)의 하나이상이 포함된다.

특히 바람직한 추가적인 단계는 단계 (i)이다.

가장 바람직한 구체예에서, 사료-성분은 첫번째 단계 (a)에서 적어도 45℃, 바람직하게는 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80℃의 온도로 전-가열된 후; 두번째 단계 (b)에서 적어도 65℃, 바람직하게는 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 또는 심지어 적어도 130℃로 가열된다.

열안정성 피타제의 첨가는 단계 (a)전이나 동안에 및/또는 단계 (b)전이나 동안에 발생한다.

물은 바람직하게는 단계 (a)에서 첨가된다. 보다 바람직하게는, 가열된 스팀은 성분의 혼합동안 첨가된다(단계 (a) 및/또는 (b)).

과정 단계 (a)는 바람직하게는 캐스케이드 혼합기안에서 수행된다(상기에 인용된 편람 p. 44을 참조).

"열안정성" 피타제는, 바람직하게는 DSC를 위하여 일정한 가열속도, 보다 바람직하게는 10℃/분의 가열속도를 이용하여, 시차주사열계량법(DSC)에 의하여, 정제된 피타제 단백질상에서 측정할 때 적어도 65℃의 Tm(멜팅 온도)을 가지는 피타제이다. 바람직한 구체예에서, Tm은 적어도 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 또는 75℃이다. 바람직하게는 Tm은 150℃이거나 그보다 낮고, 보다 바람직하게는 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115 또는 110℃이거나 그보다 낮다. 따라서, Tm의 바람직한 간격은 65-150℃, 66-150℃, - (등) - 75-150℃; 65-145℃, 66-145℃, - (등) - 75-145℃; 65-140℃, - (등) - 75-140℃; - (등) - 65-110℃, 66-110℃, - (등) - 75-110℃이다.

Tm을 위한 특히 바람직한 범위는 다음과 같다:65와 110℃사이; 70과 110℃사이; 70과 100℃사이; 75와 95℃사이; 80와 90℃사이.

하기의 실시예 3에서 DSC에 의한 Tm의 측정이 설명되고, 많은 피타제의 Tm이 보여진다.

최적 온도가 또한 가리켜지는데, 다른 방도에서, 열안정성 피타제는 적어도 60℃의 온도-최적을 가지는 피타제로서 정의될 수 있기 때문이다. 바람직하게는, 최적 온도는 pH 5.5에서의 기질 피테이트상에서, 또는 pH 5.0에서의 피트산상에서 측정된다. 바람직한 단위는 FYT, FTU 또는 실시예 3의 단위이다. 실시예 3의 피타제 분석이 가장 바람직하다.

바람직한 구체예에서, 최적 온도는 적어도 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70℃이다. 바람직하게는 최적 온도는 140℃이거나 그보다 낮고, 보다 바람직하게는 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105 또는 100℃이거나 그보다 낮다. 따라서, 최적 온도의 바람직한 간격은: 60-140℃, 61-140℃, - (등) - 70-140℃; 60-135℃, 61-135℃, - (등) - 70-135℃; 60-130℃, - (등) - 70-130℃; - (등) - 60-100℃, 61-100℃, - (등) - 70-100℃이다.

본 발명의 바람직한 피타제는, (iii)하에서 하기에 언급된 피타제중 어느 것의 완전한 아미노산 서열에 대하여-바람직하게는 공통-피타제-10-열-Q50T-K91A의 완전한 아미노산 서열에 대하여 적어도 48%, 바람직하게는 적어도 50, 52, 55, 60, 62, 65, 67, 70, 73, 75, 77, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 95, 98 또는 99%의 유사성이나 상동성, 바람직하게는 동일성의 정도를 보여준다.

유사성이나 상동성, 양자택일적으로 동일성의 정도는 당업계에서 알려진 어떤 정렬 프로그램을 이용하여서든지 측정될 수 있다. 바람직한 정렬 프로그램은 GCG 버전 8 프로그램 팩키지에서 제공되는 GAP이다(Program Manual for the Wisconsin Package, 버전 8, 1994년 8월, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (또한, Needleman, S.B.과 Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453을 참조). 폴리펩티드 서열 비교를 위하여 다음의 설정을 이용한 GAP을 사용한다: 3.000의 GAP 중량 및 0.100의 GAP 길이중량.

다수의 서열은 프로그램 PileUp(Program Manual for the Wisconsin Package, 버전 8, 1994년 8월, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)을, 3.000의 GapWeight와 0.100의 GapLengthWeight와 함께 사용하여 정렬될 수 있다.

프로그램 GAP을 이용하여, 어느정도의 선택된 피타제는 공통-피타제-10-열(3)-Q50T-K91A 아미노산 서열에 대하여 다음의 백분율 유사성(괄호안에 동일성)을 보여준다:

A. fumigatus ATCC-13073 α-돌연변이체 86.7% (81.8%)

Basidiomycet 공통 64.1% (49.0%)

공통-피타제-1 98.7% (97.9%)

공통-피타제-10 96.6% (94.4%)

공통-피타제-1-열(8)-Q50T-K91A 97.4% (95.5%)

공통-피타제-11 96.5% (94.2%)

공통-피타제-12 92.5% (89.9%)

공통-피타제-7 95.5% (93.4%)

"정제된" 피타제는, SDS-PAGE에 의하여 측정될 때, 본질적으로 다른 피타제 폴리펩티드가 없고, 예를 들어 적어도 약 20% 순수하고, 바람직하게는 적어도 약 40% 순수하고, 보다 바람직하게는 약 60% 순수하고, 보다 더 바람직하게는 약 80% 순수하고, 가장 바람직하게는 약 90% 순수하고, 보다 더 가장 바람직하게는 약 95% 순수하다.

바람직한 열안정성 피타제는 EP 98113176.6(EP 0897985)의 이른바 공통 피타제인데, 즉,

(i) 본원에서 설명된 과정에 의하여 얻어질 수 있는 모든 열안정성 피타제와;

(ii) 도 2에서 보여지는 아미노산 서열을 포함하는 피타제 그것의 어떤 변이체 또는 뮤테인(mutein)이라도 해당되고, 바람직한 뮤테인들은 치환 Q50L; Q50T; Q50G; Q50T-Y51N 또는 Q50L-Y51N을 포함하는 뮤테인들이다.

다른 바람직한 열안정성 피타제는

(iii) 다음의 아미노산 서열(그 중 얼마간은 본원의 도 5-12에서 보여짐)중 적어도 하나를 포함하는 열안정성 피타제, 바람직하게는 다음의 피타제이다: 공통-피타제-1 (또는 간단히, 공통 피타제); 공통-피타제-1-열(3); 공통-피타제-1-Q50T; 담자균류-공통(또는 간단히 바시디오(Basidio)); 공통-피타제-10 (또는 Fcp 10); 공통-피타제-11(또는 공통 서열 11); 공통-피타제-1-열(8)-Q50T-K91A; 공통-피타제-1-열(8)-Q50T; 공통-피타제-1-열(8); 공통-피타제-10-열(3)-Q50T-K91A; 공통-피타제-10-열(3)-Q50T(때때로, "(3)"은 이 표현으로부터 삭제된다); Aspergillus fumigatus ATCC 13073 피타제 α-돌연변이체; Aspergillus fumigatus ATCC 13073 피타제 α-돌연변이체 더하기 돌연변이 E59A, S126N, R329H, S364T, G404A; Aspergillus fumigatus ATCC 13073 피타제 α-돌연변이체 더하기 돌연변이 E59A, K68A, S126N, R329H, S364T, G404A; 공통-피타제-7; 공통-피타제-12.

(iv) (iv)와 (v)의 피타제의 열안정성 변이체 및 뮤테인, 특히 다음의 치환중 하나이상을 포함하는 것들:Q50L,T,G; Q50L-Y51N; Q50T-Y51N.

"식물"이라는 용어는 전체의 식물 그 자체 뿐만 아니라, 잎, 종자 또는 낟알, 줄기, 뿌리, 괴경, 꽃, 캘러스, 열매 등과 같은 식물 부분 또는 기관; 조직, 세포, 원형질체 등과; 그것들의 모든 조합과 하위-조합도 역시 포함하도록 의도된다. 식물 원형질체는 물론, 식물 조직 배양물과 식물 셀라인은 특정적으로 본원에 포함된다.

"트랜스제닉 식물"이라는 용어는 상기에 정의된 대로의 식물이고, 이 식물은 유전학적으로 변형되어 지고, 그것의 자손과 그것의 전파물질(propagating material)도 물론 유전학적인 변형을 보유한다. 바람직하게는, 트랜스제닉 식물은, 재조합체 유전자 기술에 의하여 선조 식물안으로 도입된 적어도 하나의 특정한 유전자를 포함한다. 이 용어는 단일의 식물 변종에 한정되지 않는다.

본 발명은 열안정성 피타제를 코드화하는 DNA-구조물을 포함하는 트랜스제닉 식물에 관한 것이다.

바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 식물은, 열안정성 피타제를 코드화하는 DNA-구조물을 포함한다는 점에서 특징지워지는 식물 분류(grouping)이다. 이 식물 분류의 일원들은 당연히 개성을 가지지만, 열안정성 피타제 DNA-구조물의 그것들의 공통된 특징에 의하여 다른 변종들로부터 확연히 구별될 수 있다.

따라서, 본 가르침은 하나이상의 식물 변종에 적용가능하다. 어떤 자연 발생적인 식물 변종들도 본 발명의 식물중에 포함되지 않는다.

또하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 트랜스제닉 식물 변종 또는 그것의 변이체; 트랜스제닉 식물 종, 트랜스제닉 식물 속, 트랜스제닉 식물 과, 및/또는 트랜스제닉 식물 목에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 식물 변종들이 그자체로 기권된다.

어떤 열안정성 피타제라 하더라도 본 발명에서 사용될 수 있을 것인데, 예를 들어, 모든 야생형 피타제, 유전학적으로 설계된 피타제, 공통 피타제, 피타제 뮤테인, 및/또는 피타제 변이체이다. 유전학적으로 설계된 피타제는 특정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis), 유전자 셔플링, 무작위적인 돌연변이유발, 등에 의하여 제조된 피타제를 포함하지만, 그것에 한정되지는 않는다.

야생형 열안정성 피타제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은, 포유동물, 식물 및 미생물 기원을 포함하여 어떤 기원이라도 일수 있을 것이고, 종래의 방법에 의하여 이 공급원들로부터 분리될 수 있을 것이다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 균류, 예를 들어 효모나 사상균류 또는 박테리아와 같은 미생물로부터 유도된다. 열안정성 피타제를 코드화하는 DNA 서열은, 당업계에서 잘 알려진 다양한 방법을 이용하여 그것을 생산하는 세포로부터 분리될 수 있을 것이다(예를 들어, WO 98/28409와 EP 0897985를 참조).

뮤테인이나 그것의 변이체를 포함하여, 열안정성의 유전학적으로 설계된 피타제 또는 공통 피타제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 본원의 실시예 3과 EP 0897985에서 설명된 대로의 어떤 방법으로든지 제조될 수 있을 것이다.

본 발명의 식물안에서 열안정성 피타제의 발현을 달성하기 위하여, 피타제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열이, 뉴클레오티드 서열의 발현을 지휘해서, 필요하거나 원한다면 유전자 산물의 분비를 지휘하거나 식물의 종자로 유전자 산물을 표적화하도록 할 수 있는 조절 요소 또는 서열을 포함하는 발현 구조물안으로 삽입된다.

전사가 발생하기 위하여, 열안정성 피타제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열이, 문제의 식물안에서 전사를 매개할 수 있는 적당한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 유도가능한 프로모터 또는 구성적인 프로모터일 수 있을 것이다 전형적으로, 유도가능한 프로모터는 조직-특이적이거나 성장-단계 특이적인 방법으로 전사를 매개하는 한편, 구성적인 프로모터는 모든 세포 조직안에서 지속되는 전사를 제공한다. 본 발명을 위하여 유용한 적당한 구성적인 프로모터의 예는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35 S 프로모터이다. 옥토핀 생성효소, 노팔린 생성효소 또는 만노핀 생성효소와 같은 Agrobacterium의 종양-유도 플라스미드(Ti)로부터의 전사 개시 서열은 바람직한 구성적인 프로모터의 추가적인 예이다.

적당한 유도가능한 프로모터의 예에는, 밀 종자안에서 알파-아밀라제를 발현시키는 프로모터와 같은 종자-특이적인 프로모터(Stefanov 등, Acta Biologica Hungarica Vol. 42, No. 4 pp. 323-330 (1991)을 참조, 글루텔린, 프롤라민, 글로불린 또는 알부민과 같은 벼 종자 저장 단백질을 코드화하는 유전자의 프로모터(Wu 등, Plant and Cell Physiology Vol. 39, No. 8 pp. 885-889 (1998)), Conrad U. 등, Journal of Plant Physiolosy Vol. 152, No. 6 pp. 708-711 (1998)에 의하여 설명된 레구민 B4 및 Vicia faba로부터의 미지의 종자 단백질 유전자로부터의 Vicia faba 프로모터, Brassica napus로부터의 저장 단백질 napA 프로모터, 또는, 예를 들어 WO 91/14772에서 설명된 대로 당업계에서 알려진 어떤 다른 종자 특이적인 프로모터라도 포함된다.

열안정성 피타제의 발현을 증가시키기 위하여, 프로모터 인핸서 요소가 사용되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 프로모터 인핸서는 프로모터와 아밀라제 유전자 사이에 배치된 인트론일 수 있을 것이다. 인트론은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물로부터 유도된 인트론일 수 있을 것이다. 예를 들어, 인트론은, 벼 Waxy(Wx) 유전자로부터의 첫번째의 인트론(Li 등, Plant Science Vol. 108, No. 2, pp. 181-190 (1995)), 옥수수 Ubi1(Ubiquitin) 유전자로부터의 첫번째의 유전자(Vain 등, Plant Cell Reports Vol. 15, No. 7 pp. 489-494 (1996)) 또는 Act1(액틴) 유전자로부터의 첫번째의 인트론일 수 있을 것이다. 쌍자엽식물 인트론의 예로서, chsA 인트론(앞에 인용된 Vain 등)이 언급된다. 또한, 종자 특이적인 인핸서는 종자안에서 열안정성 피타제의 발현을 증가시키기 위하여 사용될 수 있을 것이다. 종자 특이적인 인핸서의 예는, Vandergeest와 Hall, Plant Molecular Biology Vol. 32, No. 4, pp. 579-588 (1996)에 의하여 개시된 콩(Phaseolus vulgaris)의 주요한 종자 저장 단백질을 코드화하는 베타-파세올린(beta-phaseolin) 유전자로부터 유도된 인핸서이다.

또한, 발현 구조물은 바람직하게는, rbcS2'와 nos3' 종결인자와 같은 열안정성 피타제 유전자의 전사 종결을 신호하기 위한 종결인자 서열을 포함한다.

성공적으로 형질전환된 식물의 선택을 용이하게 하기 위하여, 발현 구조물은 또한 바람직하게는, 하나이상의 선택가능한 표지, 예를 들어 항생제 저항성 선택 표지 또는 제초제에 대한 저항성을 제공하는 선택 표지를 포함해야 한다. 하나의 널리 사용되는 선택 표지는 카나마이신 저항성을 제공하는 네오마이신 포스포트란스퍼라제 유전자(NPTII)이다. 다른 적당한 표지의 예에는, 측정가능한 효소 활성, 예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제, 루시퍼라제, 및 b-글루코로니다제(GUS)를 제공하는 표지가 포함된다. 포스포이노트리신 아세틸 트란스퍼라제는, 제초제 바스타 또는 비알라포스와 조합하여 선택 표지로서 사용될 수 있을 것이다.

본 발명의 트랜스제닉 식물은 당업계에서 알려진 방법에 의하여 제조될 수 있을 것이다. 사용된 형질전환 방법은 형질전환될 식물 종에 달려있을 것이고, Agrobacterium 매개된 형질전환(Zambryski 등, EMBO Journal 2, pp 2143-2150, 1993), 입자 포격, 일렉트로포레이션(Fromm 등 1986, Nature 319, pp 791-793), 및 바이러스 매개된 형질전환과 같은 당업계에서 알려진 어떤 형질전환 방법으로부터라도 선택될 수 있다. 단자엽식물의 형질전환을 위하여, 배발생의 셀라인 또는 배양된 배아의 입자 포격(즉, 바이오리스틱(biolistic) 형질전환)이 바람직하다. 하기에, 참고문헌이 목록화되는데, 이것은 다양한 식물:벼(Cristou 등 1991, Bio/Technology 9, pp. 957-962), 옥수수(Gordon-Kamm 등 1990, Plant Cell 2, pp. 603-618), 귀리(Somers 등 1992, Bio/Technology 10, pp 1589-1594), 밀(Vasil 등 1991, Bio/Technology 10, pp. 667-674, Weeks 등 1993, Plant Physiology 102, pp. 1077-1084) 및 보리(Wan과 Lemaux 1994, Plant Physiology 102, pp. 37-48, Vasil 1994, Plant Mol. Biol. 25, pp 925-937를 검토)를 형질전환하는 다양한 방법을 개시한다.

보다 명확하게 말하면, Agrobacterium 매개된 형질전환은 다음과 같이 편리하게 성취된다:

열안정성 피타제를 운반하는 벡터 체계가 구성된다. 그 벡터 체계는 하나의 벡터로 이루어질 수 있지만, 두개의 벡터로 이루어질 수 있다. 두개의 벡터의 경우에, 벡터 체계는 이원의 벡터 체계라고 불린다(Gynheung An 등 (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19).

Agrobacterium 기초한 식물 형질전환 벡터는, E. coli와 Agrobacterium 둘다를 위한 복제 원점(들) 및 박테리아의 선택 표지로 구성된다. Agrobacterium tumefaciens로부터의 Ti 플라스미드 또는 Agrobacterium rhizogenes로부터의 Ri 플라스미드로부터의 오른쪽 경계, 바람직하게는 왼쪽 경계도 또한 식물의 형질전환을 위하여 필수적이다. 경계사이에, 열안정성 피타제 유전자와, 프로모터와 종결인자 서열과 같은 적절한 조절 서열을 포함하는 발현 구조물이 배치된다. 부가적으로, 선택 유전자, 예를 들어, 트란스포존 Tn5으로부터의 네오마이신 포스포트란스퍼라제 유형 II(NPYII) 유전자 및 GUS(베타-글루쿠로니다제) 유전자와 같은 리포터 유전자가 경계사이에 클로닝된다. 독성(virulence) 유전자를 포함하는 보조(helper) 플라스미드를 가진 무장해제된 Agrobacterium 균주는 상기의 벡터로 형질전환된다. 그리고나서, 형질전환된 Agrobacterium 균주는 식물 형질전환을 위하여 사용된다.

본 발명은 또한 열안정성 피타제를 발현할 수 있는 트랜스제닉 식물을 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 (i)열안정성 피타제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 분리하는 단계; (ii)선택된 숙주 식물안에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 매개할 수 있는 발현 구조물안에 (i)의 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 단계; 및 (iii)선택된 숙주 식물을 그 발현 구조물을 이용하여 형질전환하는 단계를 포함한다.

"적어도 하나"가 "하나의(a),"를 대치하는 상기의 방법은, 열안정성 피타제에 관련하여 사용될 때, 또한 이 발명내에 든다.

이 방법은 본질적으로 비-생물학적인 방법이다.

어떤 식물이라도 선택된 숙주 식물일 수 있을 것이다. 보다 명확하게 말하면, 식물은 쌍자엽성이거나 단자엽성, 간단히 말해서 쌍자엽식물, 단자엽식물일 수 있다. 잠재적인 양식 또는 사료 구성성분인 그러한 식물들이 1차적인 관심사이다. 이 식물들은 피트산을 포함할 수 있을 것이다. 단자엽식물의 예는, 메도우그래스(블루그래스, Poa)와 같은 풀, 페스투카(festuca)와 같은 벼과사료작물, 롤리움(lolium), Agrostis와 같은 한치형목초, 및 곡류, 예를 들어, 밀, 귀리, 호밀, 보리, 벼, 수수 및 옥수수(콘(corn))이다.

쌍자엽식물의 예는, 루핀(lupins), 완두, 콩 및 대두와 같은 두류, 및 꽃양배추, 평지(oil seed rape) 및 밀접하게 관련된 모델 유기체 Arabidopsis thaliana와 같은 겨자과(Brassicaceae 과)이다.

단자엽성 식물, 특히 밀(Tricum, 예를 들어, aestivum), 보리(Hardeum, 예를 들어, vulgare), 귀리, 호밀, 벼, 사탕수수 및 콘(Zea, 예를 들어, mays)이 흥미있다.

상기에 언급된 것들과 같은 쌍자엽성 식물이 더 특별히 흥미롭다.

바람직한 구체예에서, 선조 식물 또는 숙주 식물은 그 자체로서 원하는 사료 성분이다.

실시예 1

FYT-분석 - 피타제 효소 제제를 분석하기 위한

피타제 활성은 다음의 분석을 이용하여 측정될 수 있다: 10㎕의 희석된 효소 샘플(0.1M 아세트산 나트륨, 0.01% Tween20, pH 5.5중에 희석됨)을, 0.1M 아세트산 나트륨, 0.01% Tween20, pH 5.5중의 5mM 소듐 피테이트(Sigma) 250㎕안으로 첨가하고(소듐 피테이트를 용해시킨 후에 pH를 조정하고; 기질을 전가열한다), 37℃에서 30분동안 인큐베이션한다. 250㎕의 10% TCA를 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 100ml의 몰리브데이트 시약(250ml로 희석된 8ml의 H₂SO₄중의 2.5g의 (NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O)중의 7.3g의 FeSO4 500㎕를 첨가함으로써 유리 포스페이트를 측정한다. 750nm에서의 흡광도를 96웰 미세적정 플레이트안의 200㎕ 샘플상에서 측정한다. 기질과 효소 바탕값(blank)을 포함한다. 포스페이트 표준곡선을 또한 포함한다(0-2mM 포스페이트). 1FYT는, 주어진 조건에서 1μmol 포스페이트/분을 방출하는 효소의 양과 같다. 이 분석은 피타제 효소 제제를 위하여 바람직하다(다른 사료 성분과의 첨가물안에 있지 않은 때).

실시예 2

FTU 분석 - 사료 성분과의 첨가물안에 있는 피타제를 분석하기 위한

1FTU는, 표준적인 조건(37℃, pH 5.5; 반응시간 60분, 및 피트산의 개시 농도 5mM)에서, 분당 1μmol 포스페이트에 등가인 포스페이트를 방출하는 효소의 양으로 정의된다.

1FTU = 1FYT

FTU 분석은 동물 사료 전혼합물 및 유사한 복합체 조성물상의 피타제 활성 측정을 위하여 바람직하다.

시약/기질

사료 등을 위한 추출 완충액

이 완충액은 또한 PO₄-표준의 제조를 위하여 사용되고, 전혼합물 샘플의 희석을 위하여 더 사용된다.

Tween 20 pH 5.5를 함유한 0.22M 아세트산염 완충액

리터당 30g의 아세트산 나트륨 삼수화물(MW = 136.08 g/mol) 예를 들어 Merck Art 46267 및 리터당 0.1g의 Tween 20 예를 들어 Merck Art 22184를 저울로 달아 배분한다.

아세트산 나트륨을 광물질이 제거된 물안에 용해시킨다.

Tween20을 첨가하고, 아세트산을 이용하여 pH를 5.50 ± 0.05로 조정한다.

광물질이 제거된 물을 총 부피까지 첨가한다.

전혼합물을 위한 추출 완충액

Tween 20, EDTA, P0₄ ^-3og BSA를 함유한 0.22M 아세트산염 완충액.

리터당 30g의 아세트산 나트륨 삼수화물, 예를 들어 Merck Art 6267.

리터당 0.1g의 Tween 20, 예를 들어 Merck Art 22184.

리터당 30g의 EDTA f. eks. Merck Art 8418.

리터당 20g의 Na₂HPO₄, 2H₂O, 예를 들어 Merck Art 6580.

리터당 0.5g의 BSA(Bovine Serum Albumine, 예를 들어 Sigma Art A-9647).

광물질이 제거된 물에 성분을 용해시키고, 아세트산을 이용하여 pH를 5.50 ± 0.05로 조정한다.

광물질이 제거된 물을 총 부피까지 첨가한다.

BSA는 안정하지 않으므로 완충액이 사용되는 동일한 날에 첨가되어야 한다.

50mM PO₄ ^-3원액

0.681g의 KH2PO4 (MW = 136.09 g/mol) 예를 들어 Merck Art 4873을 저울로 달아 분배하고, Tween을 함유한 0.22M 아세트산 나트륨, pH 5.5안에 용해시킨다.

저장 안정성: 냉장고에서 1주일.

Tween이 없는 0.22M 아세트산염 완충액 pH 5.5

이 완충액은 피트산 기질의 생산을 위하여 사용된다.

150g의 아세트산 나트륨 삼수화물(MW = 136.08) 예를 들어 Merck Art 6267을 저울로 달아 분배하고 광물질이 제거된 물안에 용해시키고, 아세트산을 이용하여 pH를 5.50 ± 0.05로 조정한다.

광물질이 제거된 물을 5000ml까지 첨가한다.

저장 안정성: 실온에서 1주일.

피트산 기질; 5mM의 피트산

피트산의 부피는, 사용된 뱃치의 수분함량을 참작하여 계산된다.

수분함량이 예를 들어 8.4%이면, 다음이 얻어진다:

피트산(Na-염)(MW = 923.8g/mol) 예를 들어 Sigma P-8810을 저울로 달아 분배하고 0.22M 아세트산염 완충액(Tween이 없는)안에 용해시킨다. (희석된) 아세트산의 첨가는 용해 속도를 증가시킨다.

아세트산을 이용하여 pH을 5.50 ± 0.05로 조정한다.

0.22M 아세트산염 완충액을 총 부피까지 첨가한다.

21.7% 질산 용액

정지 용액을 위하여.

1 부분의 농축된(65%) 질산을 2 부분의 광물질이 제거된 물안으로 혼합한다.

몰리브데이트 시약

정지 용액을 위하여.

100g의 암모늄 헵타몰리브데이트 테트라하이드레이트 (NH₄)6Mo₇O₂₄,4H₂O, 예를 들어 Merck Art 1182를 광물질이 제거된 물안에 용해시킨다. 10ml의 25% NH₃을 첨가한다.

광물질이 제거된 물을 1리터까지 첨가한다.

0.24% 암모늄 바나데이트

fra Bie ＆ Berntsen으로부터 구입됨.

몰리브데이트/바나데이트 정지 용액

1 부분의 바나데이트 용액(0.24% 암모늄 바나데이트) + 1 부분의 몰리브데이트 용액을 혼합한다. 2 부분의 21.7% 질산 용액을 첨가한다.

이 용액을 사용하기전 길어야 2시간 전에 제조하고, 병을 은종이안에 덮어싼다.

샘플

냉동된 샘플을 냉장고안에서 밤새 해동시킨다.

사료 샘플을 위한 샘플 크기: 적어도 70g, 바람직하게는 100g.

사료 샘플

샘플 중량의 10배에 상응하는 완충액의 첨가를 허가하는 용액부피을 선택하는데, 예를 들어 Tween을 함유한 1000ml의 0.22M 아세트산염 완충액안에 100g을 용해시키고, 동봉물 1을 참조하라. 용액부피에 가깝게 맞춘다.

샘플 크기가 약 100g이면, 모든 샘플을 커피 분쇄기안에서 분쇄한 다음에 중량을 단 비커안에 배치한다. 샘플의 중량을 주의한다. 펠리팅되지 않은 샘플을 가는 것은 필수적이지 않다. 샘플이 다루기에 너무 크면, 약 100g의 부분들로 샘플을 쪼갠다.

자석을 비커안에 배치하고 Tween을 함유한 0.22M 아세트산염 완충액을 첨가한다.

샘플을 90분동안 추출한다.

추출후에, 사료가 침전하도록 하기 위하여 30분동안 샘플을 그대로 둔다. 5ml의 샘플을 피펫으로 빼낸다. 샘플을 용액의 표면밑 2-5cm에서 취하고 원심분리 유리기구안에 배치시키고 뚜껑을 덮는다.

샘플을 4000rpm에서 10분동안 원심분리시킨다.

전혼합물 샘플

샘플 중량의 10배에 상응하는 완충액의 첨가를 허가하는 용액 부피를 선택한다. 용액 부피에 가깝게 맞춘다.

샘플을 저울에 달았으면(50-100g), 모든 샘플을 중량을 단 비커안에 배치한다. 샘플 중량을 주의한다. 만약 샘플이 다루기에 너무 크면, 샘플을 약 100g의 부분들로 쪼갠다.

자석을 비커안에 배치하고 Tween, EDTA og PO₄ ^-3을 함유한 0.22M 아세트산염 완충액을 첨가한다.

샘플을 60분동안 추출한다.

추출후에, 전 혼합물이 침전하도록 하기 위하여 30분동안 샘플을 그대로 둔다. 5ml의 샘플을 피펫으로 빼낸다. 샘플을 용액의 표면밑 2-5cm에서 취하고 원심분리 유리기구안에 배치시키고 뚜껑을 덮는다.

샘플을 4000rpm에서 10분동안 원심분리시킨다.

분석

사료 샘플의 추출물을 직접적으로 분석한다.

전혼합물의 추출물을 약 1.5 FTU/g로 희석한다(A₄₁₅(주 샘플)＜1.0)

Tween 20을 함유한 0.22M 아세트산염 완충액을 희석을 위하여 사용한다.

주 샘플

추출되고 원심분리된 샘플로부터의 상청액 2 x 100ml을 표시된 유리 시험관안에 배치하고 자석을 각각의 시험관에 배치한다.

모든 샘플이 준비될 때, 그것들을 교반하면서 수조상에 배치한다. 온도: 37℃.

3.0ml의 기질을 첨가한다.

기질의 첨가후, 정확히 60분동안의 인큐베이션.

샘플을 수조에서 꺼내고 2.0ml의 정지 용액을 첨가한다(기질의 첨가후 정확히 60분후).

샘플을 1분이나 그 이상동안 교반한다.

사료 샘플을 4000rpm에서 10분동안 원심분리한다(전혼합물 샘플을 원심분리하는 것은 필수적이지 않다).

블라인드(blind) 샘플

추출되고 원심분리된 샘플로부터의 상청액 100ml을 표시된 유리 시험관안에 배치하고 자석을 각각의 시험관에 배치한다.

2.0ml의 정지 용액을 샘플에 첨가한다.

3.0ml의 기질을 샘플에 첨가한다.

샘플을 실온에서 60분동안 인큐베이션한다.

사료 샘플을 4000rpm에서 10분동안 원심분리한다(전혼합물을 원심분리하는 것을 필수적이지 않다).

표준

여덟개의 표준 각각으로부터 2 x 100ml을 취하고, 4 x 100ml의 0.22M 아세트산염 완충액(시약 블라인드)을 취한다.

A₄₁₅을 모든 샘플상에서 측정한다.

계산

C g의 샘플을 저울로 달아 분배한다(분쇄한 후에).

추출되고 원심분리된 샘플로부터 100㎕를 취한다.

PO₄ ^-3표준곡선은 선형이다.

PO₄ ^-3표준을 위한 회귀곡선으로부터, 샘플의 실제적인 농도를 찾는다(mM 단위의 농도).

t = 분 단위의 인큐베이션 시간

Vol = 리터 단위의 샘플 부피 = 0.0001 리터

1000 = mmol에서 μmol로의 환산인자

C = 저울로 달아 분배된 그램 샘플

F_p= 취해진 샘플과 총 샘플사이의 관계(추출후). 예: 1000ml로부터 취해진 0.100ml → F_p= 1000/0.100 = 10000.

다음의 값들을 삽입하여 환산된 식

t = 60

Vol = 0.0001 ℓ

F_p= 10000

FTU /g_sample= { (x - b) x 0.0001 x 1000 x 10000} / { a x 60 x C }

실시예 3

다양한 피타제의 최적 온도와 멜팅 온도 Tm의 측정

다양한 피타제의 열안정성, 즉 멜팅 온도, Tm, 및/또는 최적 온도를 측정하였다.

Aspergillus niger NRRL 3135의 피타제를, EP 0420358과 van Hartingsveldt 등(Gene, 127, 87-94, 1993)에서 설명된 대로 제조하였다.

Aspergillus fumigatus ATCC 13073, Aspergillus terreus 9A-1, Aspergillus terreus CBS 116.46, Aspergillus nidulans, Myceliophthora thermophila, 및 Talaromyces thermophilus의 피타제를, EP-0897985와 그 안의 참고문헌에서 설명된 대로 제조하였다.

공통-피타제-1(도 5)과 공통-피타제-1-Q50T가 보여지고 EP 0897985에서 설명된 대로 제조되었다.

공통-피타제-10을, EP-0897985의 가르침에 따라 유도하였고 제조하였지만(실시예 1-2와 3-7 각각), 그것의 도 1에서의 정렬에, Thermomyces lanuginosa의 피타제 서열(Berka 등, Appl. Environ. Microbiol. 64, 4423-4427, 1998)과 담자균류 공통서열(하기에 설명된 유도)을 부가하고, A.niger T213의 서열을 생략하고, 남아있는 A.niger 피타제 서열들을 위하여 0.5의 투표중량을 할당한다. 공통-피타제-10의 서열의 유도는 도 7에서 보여진다.

담자균류 공통서열이 또한, EP-0897985의 원칙에 따라서, 즉 WO 98/28409의 다섯개의 담자균류 피타제로부터 유도되었고, 성숙한 피타제의 첫번째의 아미노산 잔기로 시작하였다(신호 펩티드를 배제하고). 0.5의 투표중량은 두개의 Paxillus 피타제에 할당되었고, 모든 다른 유전자들은 1.0의 투표중량을 이용하여 사용되었다-도 6을 참조.

뮤테인 공통-피타제-10-열, 공통-피타제-10-열-Q50T-K91A(도 10) 및 공통-피타제-10-열-Q50T를, EP-0897985의 실시예 5-8과 유사하게, 3개의 백(back)-돌연변이 K94A, V158I 및 A396S("열(3)" 또는 "열") 및, 적용가능한 경우에 돌연변이 Q50T 또는 Q50T-K91A도 도입함으로써, 공통-피타제-10으로부터 제조하였다.

뮤테인 공통-피타제-1-열(8), 공통-피타제-1-열(8)-Q50T-K91A(도 9) 및 공통-피타제-1-열(8)-Q50T를, EP-0897985의 실시예 8과 유사하게, 8개의 돌연변이 E58A, D197N, E267D, R291I, R329H, S364T, A397K 및 G404A("열(8)") 및, 적용가능한 경우에 돌연변이 Q50T 또는 Q50T-K91A도 도입함으로써, 공통-피타제-1으로부터 제조하였다.

공통-피타제-1-열(3)을, 3개의 돌연변이 K94A, V158I 및 A396S의 도입에 의하여 공통-피타제-1로부터 제조하였다.

Aspergillus fumigatus 이른바 α-돌연변이체(돌연변이 Q51(27)T, F55Y, V100I, F114Y, A243L, S265P, N294D)와, 표 1에서 보여진 그것의 그이상의 뮤테인들이, 상기에서 일반적으로 설명된 대로 제조되었다. 위치 번호매김(numbering)은, EP 0897010에서 사용된 번호매김에 적용되는 괄호안의 번호를 제외하고, 본원의 도 11에 적용된다.

상기의 열안정성 피타제를 코드화하는 DNA 구조물은, 예를 들어 EP 0897985의 가르침에 따라 제조될 수 있다. 식물에서의 그것의 발현을 위하여, 본 설명이 참조된다.

피타제의 언폴딩(unfolding)온도 또는 멜팅온도, Tm을 측정하기 위하여, Brugger 등 (1997)에 의하여 앞서 출판된 대로 시차주사열계량법을 적용하였다: The Biochemistry of phytate and phytase(eds. Rasmussen, S.K; Raboy, V.; Dalbøge, H. 및 Loewus, F.; Kluwer Academic Publishers)안의 "Thermal denaturation of phytases and pH 2.5 acid phosphatase studied by differential scanning calorimetry,".

50-60 mg/ml의 단백질의 균질이거나 정제된 피타제 용액을 제조하였고, 10mM 아세트산 나트륨, pH 5.0에 대항하여 광범위하게 투석시켰다. 10℃/분의 일정한 가열속도를 90-95℃까지 적용하였다.

상기 피타제상의 Tm 측정의 결과가 하기의 표 1에서 보여지고; 선택된 피타제에 대하여 도 1-4에서도 보여진다.

하기의 표 1에서, 다양한 피타제의 최적 온도가 또한 보여진다. 이 측정을 위하여, 피타제 활성을, 기본적으로는 Mitchell 등(Microbiology 143, 245-252, 1997)에 의하여 설명된 대로 측정하였고; 활성을, 200mM 아세트산 나트륨, pH 5.0중의 0.5% 피트산(~5mM)을 포함하는 분석 혼합물안에서 측정하였다. 37℃에서의 15분간의 인큐베이션 후에, 같은 부피의 15% 트리클로로아세트산의 첨가에 의하여 반응을 정지시켰다. 100㎕의 분석 혼합물을 900㎕의 H₂O와 1ml의 0.6M H₂SO₄, 2% 아스코르브산 및 0.5% 암모늄 몰리브데이트와 혼합함으로써, 유리된 포스페이트를 정량하였다. 인산칼륨의 표준곡선은 기준으로서 사용하였다. 1유니트의 효소 활성은, 37℃에서 분당 1μmol 포스페이트를 방출하는 효소의 양으로서 정의되었다. 단백질 농도는, Pace 등(Prot.Sci. 4, 2411-2423, 1995): Consensus phytase, 1.101; consensus phytase 7, 1.068; consensus phytase 10, 1.039에 따라서 계산된 280nm에서의 효소 소광계수를 이용하여 측정되었다.

최적의 온도를 측정하기 위하여, 효소(100㎕)와 기질 용액(100㎕)을, 주어진 온도에서 5분동안 전-인큐베이션하였다. 기질용액을 효소에 첨가함으로써 반응을 시작시켰다. 15분의 인큐베이션 후에, 트리클로로아세트산을 이용하여 반응을 정지시키고 방출된 포스페이트의 양을 측정하였다. 피타제-활성-대-온도가 플롯팅되고, 최적의 온도는, 활성이 최대치에 이르는 그 온도로서 측정된다.

다양한 피타제를 위한 최적의 온도 및 Tm

피타제	최적 온도(℃)	Tm (℃)
Aspergillus nigerNRRL 3135	55	63.3
Aspergillus fumigatus ATCC 13073	55	62.5
Aspergillus terreus9A-1	49	57.5
Aspergillus terreusCBS 116.46	45	58.5
Aspergillus nidulans	45	55.7
Myceliophthorathermophila	55	-
Talaromyces thermophilus	45	-
공통-피타제-10-열-Q50T-K91A	82	89.3
공통-피타제-10-열-Q50T	82	88.6
공통-피타제-10	80	85.4
공통-피타제-1-열(8)-Q50T-K91A	-	85.7
공통-피타제-1-열(8)-Q50T	78	84.7
공통-피타제-1-열(8)	81	-
공통-피타제-1-열(8)-Q50T-K91A	78	84.7
공통-피타제-1-열(3)	75	-
공통-피타제-1-Q50T	-	78.9
공통-피타제-1	71	78.1
Aspergillusfumigatus α-돌연변이체,더하기 돌연변이 E59A,S126N, R329H, S364T,G404A	63	-
Aspergillusfumigatus-상기에서 처럼, 더하기 돌연변이 K68A	63	-
Aspergillusfumigatus α-돌연변이체(Q51(27)T, F55Y,V100I, F114Y, A243L,S265P, N294D)	60	67.0

Claims

동물 사료를 제조하는 방법으로, 사료 성분의 응집을 포함하고, 이때 열안정성 피타제가 응집전 또는 동안에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 사료 성분이 적어도 65℃의 온도로 가열되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, DSC를 위하여 10℃/분의 일정한 가열속도를 이용하여, 열안정성 피타제가 DSC에 의하여 측정될 때 적어도 65℃의 Tm을 갖는 피타제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 사료 팽창기안에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 압출기안에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 펠렛 압착기안에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서, 열안정성 피타제가 트랜스제닉 식물안에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 응집이 다음의

(a) 적어도 45℃의 온도까지 사료 성분을 전-가열하는 단계와;

(b) (a)단계의 생산물을 적어도 65℃의 온도까지 가열하는 단계를 포함하고,

이때 열안정성 피타제가 단계 (a) 및/또는 (b)전 또는 동안에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
열안정성 피타제를 코드화하는 DNA-구조물을 함유하는 트랜스제닉 식물.
제 9 항에 있어서, 열안정성 피타제를 코드화하는 DNA-구조물이, 식물의 적어도 한 부분에서 상기 피타제 코드화 서열의 발현을 매개할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물.
식물의 적어도 한 부분에서 피타제 코드화 서열의 발현을 매개할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 열안정성 피타제를 코드화하는 DNA 구조물을 포함하는 발현 구조물.
제 11 항 기재의 발현 구조물을 포함하는 벡터.
열안정성 피타제를 발현할 수 있는 트랜스제닉 식물을 제조하는 방법으로,

(i) 열안정성 피타제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 분리하는 단계;

(ii) (i)의 뉴클레오티드 서열을, 선택된 숙주 식물안에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 매개할 수 있는 발현 구조물안에 삽입하는 단계 및;

(iii) 발현 구조물을 이용하여 선택된 숙주 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 식물로부터 피타제를 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.