JP2002508942A - 飼料調製物及び植物発現における熱安定性フィターゼ - Google Patents

飼料調製物及び植物発現における熱安定性フィターゼ

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Abstract

(57)【要約】 動物飼料の調製における熱安定性フィターゼの使用、及び該フィターゼの植物における発現。動物飼料の調製のために、アグロメレーションステップの前又は間に熱安定性フィターゼを加える。好ましい方法は、ペレッティング、エクストルーション及びエキスパンションである。熱安定性フィターゼを発現するトランスジェニック植物は、動物飼料調製に直接、用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本願は、熱安定性フィターゼ、即ち動物飼料の生産のための方法におけるそれ
らの使用、及びそれらの植物内での発現に関する。
【０００２】 背景技術 ＷＯ９１／１４７８２は、アスペルギルス・フィクウム（Aspergillus ficuum )ＮＲＲＬ３１３５由来のフィターゼを発現するトランスジェニックタバコ及び ナタネ植物を記載する。そのトランスジェニックタバコ種子はブロイラーに与え
られる。
【０００３】 ＵＳ５，８２４，７７９は、同じＡ．フィクウムフィターゼを発現するトラン
スジェニックアルファルファを生産するための標準的な様式、及び動物飼料補給
物としてそれ自体用いることができるフィターゼ含有濃縮物の調製を記載する。 ＥＰ ０ ５５６ ８８３ Ｂ１は、押出し技術に基づいて飼料ペレットを調
製するための方法を記載する。温度感受性剤、例えばフィターゼの添加は飼料ペ
レットの押出し後に行われ、その感受性剤は減圧下でペレットにまぜられる。
【０００４】 ＥＰ ０ ５５６ ８８３ Ｂ１において認められるように、飼料調製過程の
間の熱感受性物質の活性の損失は公知の問題である。上述のＥＰ特許は、押出し
過程の後に減圧下でこれらの物質を加えることによりこの問題を解決することを
提唱する。しかしながら、この解決法は液体形態の感受性物質、及び更なる高価
な工程装置の設置を要求する。
【０００５】 本発明は、動物飼料を調製するための改良された方法、及び改良されたフィタ
ーゼ発現性トランスジェニック植物を供する。 発明の概要 本発明は、動物飼料を調製する方法であって、該方法は飼料成分の凝集を含み
、ここで熱安定性フィターゼは該凝集の前又は間に添加されることを特徴とする
方法を供する。
【０００６】 熱安定性フィターゼをコードするＤＮＡ構成物を含むトランスジェニック植物
又はその一部も供する。 トランスジェニック植物又はその部分、例えば種子又は葉は、本発明の飼料調
製過程に用いることができ、それにより、好ましい実施形態において、同時に、
栄養（飼料成分）及び飼料添加物フィターゼを供することができる。
【０００７】 発明の詳細な記載 本文脈において、“飼料”又は“動物飼料”とは、動物が食べ、取り入れ、消
化することを意図し、又はそれに適した天然の又は人工の食料、食事等を意味す
る。ヒトのための食物は、飼料の定義に含まれる。 “動物”は、全ての動物、多胃動物（反芻動物）；又は単胃動物、例えばヒト
、トリ、ブタ及び魚を含む。好ましい動物は単胃動物、特にブタ及びブロイラー
である。
【０００８】 “飼料成分”の概念は、飼料となるべき又はそれが生産される原材料；飼料の
意図した又は実際の成分部分を含む。非ヒト動物のための飼料成分は、通常、及
び好ましくは以下の非排他的リストから選択される。 植物由来製品 例えば種子、穀物、葉、根、塊茎、花、さや、包皮−これらは、フレーク、ケ
ーキ、グリット、フラワー等の形態をとることができる； 動物由来製品 例えば魚ミール、ミルク粉末、骨抽出物、肉抽出物、血液抽出物等； 添加物 例えば、ミネラル、ビタミン、芳香化合物、及び飼料増強酵素 フィチン酸又はミオイノシトール１，２，３，４，５，６−ヘキサキス二水素
リン酸１又は短いミオイノシトールヘキサキスホスフェートについて）は、イノ
シトールの主な源であり植物種子及び穀物中のホスフェートの主な貯蔵形態であ
る。マメ科植物の種子において、それはホスフェート成分の約９０％を占める。
種子、穀物及びマメは重要な飼料成分である。
【０００９】 フィチン酸又はその塩であるフィテートは、特に示さなければ、本文脈におい
て、同義に又はランダムに用いられ、抗栄養因子である。これは、一部は、栄養
に必須のイオン、例えばカルシウム、微量ミネラル、例えばマンガン及び（静電
相互作用による）タンパク質へのその結合のためである。そしてフィチン酸及び
その塩フィテートはしばしば代謝されないので、そのリンが栄養的に利用できな
いからである。
【００１０】 これは、食物及び飼料調製物に、例えば無機ホスフェートを補給する必要性を
引きおこす。 非代謝性フィチン酸のリンは動物の胃腸管を通過し、肥料と共に排出され、環
境に不要なリンの汚染を引きおこし、例えば水環境の栄養汚染及び藻類の過剰な
増殖を引きおこす。
【００１１】 フィチン酸はフィターゼにより分解され得る。本文脈において、“フィターゼ
”は、フィターゼ活性を示すポリペプチド又は酵素、即ち（１）ミオイノシトー
ル及び／又は（２）そのモノ−、ジ−、トリ−、テトラ−及び／又はペンタ−ホ
スフェート及び（３）無機ホスフェートへのフィテート（ミオイノシトールヘキ
サキスホスフェート）の加水分解を触媒するものである。
【００１２】 植物による及び微生物によるフィターゼの生産が報告されている。微生物の中
で、フィターゼ生産細菌及びフィターゼ生産真菌が知られている。 子嚢菌類（Ascomycota）の真菌門に属するフィターゼ生産性糸状菌のいくつか
の記載がある。特に、アスペルギルス（Aspergillus）属のフィターゼ生産性子 嚢菌類、例えばアスペルギルス・テルレウス（Aspergillus terreus）について の文献がある（Yamadaら、1986, Agric. Biol. Chem. 322 : 1275〜1282)。また
、アスペルギルス・ニゲル変種アワモリ（awamori)からのフィターゼ遺伝子のク
ローニング及び発現も記載されている（Piddingtonら、1993, Gene 133 : 55〜6
2)。ＥＰ ０４２０３５８は、アスペルギルス・フィクウム（ニゲル）のフィタ
ーゼのクローニング及び発現を記載する。ＥＰ ０６８４３１３は、子嚢菌類ア
スペルギルス・ニゲル、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora the
rmophila)、アスペルギルス・テルレウスのフィターゼのクローニング及び発現 を記載する。なお更に、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans
)、タラロマイセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus)、アルペルギ
ルス・フミガトウス（Aspergillus fumigatus)及びアスペルギルス・テルレウス
の別の株のフィターゼのいくつかの部分的な配列が供される。
【００１３】 サーモマイセス・ラヌキノスス（Thermomyces lanuginosus)のフィターゼのク
ローニング及び発現はＷＯ９７／１３５０１７に記載される。 ＷＯ９８／２８４０９は、いくつかの担子菌類フィターゼ、例えばペニオホラ
・リッチ（Peniophora lycii)、アグロサイベ・ペジアデス（Agrocybe pediades
)、パキシルス・インボルトウス（Paxillus involutus)及びトラメテス・プベセ
ンス（Trametes pubescens)からのもののクローニング及び発現を記載する。
【００１４】 酵素命名データベースＥｘＰＡＳｙ（ＥＣ（Enzyme Commission)番号が供され
ているキャラクタライドされた酵素の各々の型を記載するthe Nomenclature Com
mittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology
(IUBMB)の推奨に主に基づく酵素の命名に関する情報の保管所）に従って、２つ の異なる型のフィターゼが現在知られている：いわゆる３−フィターゼ（ミオイ
ノシトールヘキサホスフェート３−ホスホヒドロラーゼ、ＥＣ ３．１．３．８
）及びいわゆる６−フィターゼ（ミオイノシトールヘキサホスフェート６−ホス
ホヒドロラーゼ、ＥＣ ３．１．３．２６）である。３−フィターゼは最初にフ
ィチン酸の３−位でエステル結合を加水分解し、６−フィターゼは最初にフィチ
ン酸の６−位でエステル結合を加水分解する。これらのフィターゼの型の両方と
もフィターゼの先の定義に含まれる。
【００１５】 フィターゼ活性の多くのアッセイが知られており、本発明の目的のためにこれ
らのいずれをも用いることができる。好ましいフィターゼアッセイは実施例に含
まれる。 “アグロメレーション（凝集）”の概念は、種々の成分を熱の作用下で混合す
る過程として定義される。得られる産物は、好ましくは、“アグロメレート”又
は満足いく物理的安定性の産物を形成しながら成分が互いに接着しているコング
ロメレートである。このようなアグロメレートからのダストの形成は、その物理
的安定性の赤指標であり、形成されるダストが少いと、より優れている。アグロ
メレートからのダスト形成のための適切なアッセイはＡＳＡＥ標準Ｓ２６９−１
である。満足いくアグロメレートは２０％未満、好ましくは１５％未満、より好
ましくは１０％未満、更により好ましくは６％未満のダストを有する。
【００１６】 “熱の作用（影響）下”とは、アグロメレーションユニットの出口で産物上で
測定して少くとも６５℃であることを意味する。より好ましい温度は、少くとも
７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００，１０５，１１０，１１５，１２
０，１２５、又は少くとも１３０℃である。 好ましいアグロメレーション過程は、加圧下で行われる。圧力は、典型的には
、その成分のコンパクト化のためであり、任意に断面又はスループット領域の減
少と組み合わせられる。好ましくは温度及び圧力のような過程のパラメータを正
確に調節することにより、得られるせん断力及びせん断速度は、スターチ−及び
タンパク質−含有飼料成分が流体になるような倍率のものである。
【００１７】 “加圧”とは、標準大気圧と比べて増加していることを意味し、アグロメレー
ションユニット内で測定した最大圧である。 水蒸気又はスチームの添加がしばしばアグロメレーションに含まれるが、絶対
に要求されるものではない。 アグロメレーションは、これらに限らないが、エクストルーション（押出し）
、エクスパンション（又はプレッシャーコンディショニング）及びペレッティン
グ（又はペレットプレシング）を含む。
【００１８】 エクストルーションは、例えば“Danish Company Sprout-Matador, Gletevej
5-7, PK-6705 Esbjerg 0又はNiels Finsensvej 4, DK-7160 Vejle (“Haendbog
i Pilleteringsteknik 1996”）から要求により利用できるハンドブックのpp. 1
49-153に記載される。しかしながら、本発明のアグロメレーション過程において
、上述のハンドブックに言及される以下のステップは全体として任意である。
【００１９】 （ｉ）飼料成分をカスケードミキサー内でプレ処理し； （ii）ノズルセクションを出た産物を断片に切断し； （iii）要求される大きさの断片にし； （iv）それを順化又はコンディショニングし； （ｖ）それをコーティングし； （vi）それを乾燥させ； （vii）それを冷却する。
【００２０】 エクスパンション（プレッシャーコンディショニング）の過程は、例えば同ハ
ンドブックのpp. 61〜66に記載される。また、エクスパンションのために、上述
のステップ（ｉ）〜（vi）、特にステップ（ｉ）及び（vi）は全体として任意の
ステップである。 これは、以下のステップについても行われる： （ii′）（例えばｐ６５に示すブレードグラニュレーターを用いて）産物を細
分し； （vii）（例えばｐ６２に示すペレットプレスを用いて）産物をペレット化す る。
【００２１】 ペレッティングの過程は、例えば同ハンドブックのpp. 71〜107に記載される 。ここでも、上述のステップ（ｉ）〜（vii）は全体として任意のステップであ る。これらのステップは、例えば上述のハンドブックのpp. 29〜70により詳細に
記載される。 本発明の好ましいアグロメレーション過程において、上述の更なるステップ（
ｉ）〜（vii）のうちの１又は複数が含まれる。
【００２２】 特に好ましい更なるステップはステップ（ｉ）である。 最も好ましい実施形態において、飼料成分はステップ（ａ）において、少くと
も４５℃、好ましくは少くとも５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０℃の
温度に予備加熱され；そして次に第２のステップ（ｂ）において、少くとも６５
℃、好ましくは７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００，１０５，１１０
，１１５，１２０，１２５、又は少くとも１３０℃の温度に加熱される。
【００２３】 熱安定性のフィターゼの添加は、ステップ（ａ）の前又は間及び／又はステッ
プ（ｂ）の前又は間に行われる。 ステップ（ａ）において好ましくは水が添加される。より好ましくは、成分の
混合の間（ステップ（ａ）及び／又は（ｂ））に加熱したスチームが添加される
。
【００２４】 ステップ（ａ）は好ましくはカスケードミキサー内で行われる（上述のハンド
ブックｐ．４４を参照のこと）。 “熱安定性”フィターゼは、好ましくはＤＳＣについて一定の加熱速度、より
好ましくは１０℃／分の値を用いて、少くとも６５℃の、示差走査熱量測定（Ｄ
ＳＣ）により精製フィターゼタンパク質で測定したＴｍ（融解温度）を有するフ
ィターゼである。好ましい実施形態において、Ｔｍは少くとも６６，６７，６８
，６９，７０，７１，７２，７３，７４又は７５℃である。好ましくは、Ｔｍは
１５０℃又はそれ未満、より好ましくは１４５，１４０，１３５，１３０，１２
５，１２０，１１５又は１１０℃又はそれ未満である。従って、Ｔｍの好ましい
間隔は、６５〜１５０℃、６６〜１５０℃等〜７５〜１５０℃；６５〜１４５℃
、６６〜１４５℃等〜７５〜１４５℃；６５〜１４０℃等〜７５〜１４０℃；等
〜６５〜１１０℃、６６〜１１０℃等〜７５〜１１０℃である。
【００２５】 Ｔｍの特に好ましい範囲は次の通りである：６５〜１１０℃；７０〜１１０℃
；７０〜１００℃；７５〜９５℃；又は８０〜９０℃。 以下の実施例３において、ＤＳＣによるＴｍの測定が記載され、いくつかのフ
ィターゼのＴｍが示される。 最適な温度も示される。なぜなら、かわりとして、熱安定性フィターゼは少く
とも６０℃の至適温度を有するフィターゼとして定義することができるからであ
る。好ましくは、至適温度は、pH５．５で基質フィテート上で、又はpH５．０で
基質フィチン酸で決定される。好ましいユニットは、実施例３のＦＹＴ，ＦＴＵ
又はユニットである。実施例３のフィターゼアッセイが最も好ましい。
【００２６】 好ましい実施形態において、至適温度は少くとも６１，６２，６３，６４，６
５，６６，６７，６８，６９又は７０℃である。好ましくは、至適温度は１４０
℃又はそれ未満、より好ましくは１３５，１３０，１２５，１２０，１１５，１
１０，１０５又は１００℃又はそれ未満である。従って、至適温度の好ましい間
隔は、６０〜１４０℃、６１〜１４０℃等〜７０〜１４０℃；６０〜１３５℃；
６１〜１３５℃等〜７０〜１３５℃；６０〜１３０℃等〜７０〜１３０℃；等〜
６０〜１００℃、６１〜１００℃等〜７０〜１００℃である。
【００２７】 本発明の好ましいフィターゼは、以下の（iii）に言及されるフィターゼのい ずれかの完全なアミノ酸配列、好ましくはコンセンサスフィターゼ−１０−ｔｈ
ｅｒｍｏ−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１Ａの完全なアミノ酸配列と、少くとも４８％、好ま
しくは少くとも５０，５２，５５，６０，６２，６５，６７，７０，７３，７５
，７７，８０，８２，８５，８８，９０，９２，９５，９８又は９９％の類似性
又は相同性、好ましくは同一性の程度を示す。
【００２８】 類似性又は相同性、あるいは同一性の程度は当該技術分野で知られたいずれの
アラインメントプログラムを用いても決定することができる。好ましいアライン
メントプログラムは、ＧＣＧバージョン８プログラムパッケージに供されるＧＡ
Ｐ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Ge
netics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)
である（Needleman, S.B.及びWunsch, C.D., (1976), Journal of Molecular Bi
ology, 48, 443〜453も参照のこと）。ポリペプチド配列比較のために次の設定 ：３．０００のＧＡＰウエイト及び０．１００のＧＡＰレングスウエイトでＧＡ
Ｐを用いる。
【００２９】 ３．０００のGap Weight及び０．１００のGap Length Weightで、プログラムP
ile Up (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994
, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53
711)を用いて多重配列アラインメントを行うことができる。 プログラムＧＡＰを用いて、いくつかの選択されたフィターゼは、共通フィタ
ーゼ−１０−ｔｈｅｒｍｏ（３）−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１Ａアミノ酸配列に対して以
下の割合の類似性（括弧内は同一性）を示す。
【００３０】 Ａ．フミガトウス ATCC-13073 α−変異体 86.7％ (81.8％） 担子菌コンセンサス 64.1％ (49.0％） コンセンサスフィターゼ−１ 98.7％ (97.9％） コンセンサスフィターゼ−１０ 96.6％ (94.4％） コンセンサスフィターゼ−１−thermo(8)-Q50T-K91A 97.4％ (95.5％） コンセンサスフィターゼ−１１ 96.5％ (94.2％） コンセンサスフィターゼ−１２ 92.5％ (89.9％） コンセンサスフィターゼ−７ 95.5％ (93.4％） “精製された”フィターゼは、他の非フィターゼポリペプチドを本質的に含ま
ず、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、少くとも約２０％純度、好ましく
は少くとも約４０％純度、より好ましくは約６０％純度、更により好ましくは約
８０％純度、最も好ましくは約９０％純度、更に最も好ましくは約９５％純度で
ある。
【００３１】 好ましい熱安定性フィターゼはＥＰ９８１１３１７６．６（ＥＰ０８９７９８
５）のコンセンサスフィターゼ、即ち以下のものである。 （ｉ）そこに記載される方法により得ることができるいずれかの熱安定性フィ
ターゼ； （ii）そのＦｉｇ．２に示されるアミノ酸配列を含むフィターゼ又はその変異
体もしくはムテイン、好ましくは置換Ｑ５０Ｌ；Ｑ５０Ｔ；Ｑ５０Ｇ；Ｑ５０Ｔ
−Ｙ５１Ｎ又はＱ５０Ｌ−Ｙ５１Ｎを含むムテイン。
【００３２】 他の好ましい熱安定性フィターゼは以下のものである。 （iii）以下のアミノ酸配列の少くとも１つを含む熱安定性フィターゼ（これ らのいくつかは本明細書の図５〜１２に示す）、好ましくは以下のフィターゼ：
コンセンサスフィターゼ−１（又は単なるコンセンサスフィターゼ）；コンセン
サスフィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ（３）；コンセンサスフィターゼ−１−Ｑ５
０Ｔ；担子菌コンセンサス（又は単なる担子菌）；コンセンサスフィターゼ−１
０（又はＦｃｐ１０）；コンセンサスフィターゼ１１（又はコンセンサス配列１
１）；コンセンサスフィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ（８）−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１Ａ
；コンセンサスフィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ（８）−Ｑ５０Ｔ；コンセンサス
フィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ（８）；コンセンサスフィターゼ−１０−ｔｈｅ
ｒｍｏ（３）−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１Ａ；コンセンサスフィターゼ−１０−ｔｈｅｒ
ｍｏ（３）−Ｑ５０Ｔ（時折、“（３）”はこの表現から削除される）；アスペ
ルギルス・フミガトウスＡＴＣＣ １３０７３フィターゼα−変異体；アスペル
ギルス・フミガトウスＡＴＣＣ １３０７３フィターゼα−変異体＋変異Ｅ５９
Ａ，Ｓ１２６Ｎ，Ｒ３２９Ｈ，Ｓ３６４Ｔ，Ｇ４０４Ａ；アスペルギルスフミガ
トウスＡＴＣＣ １３０７３フィターゼα−変異体＋変異Ｅ５９Ａ，Ｋ６８Ａ，
Ｓ１２６Ｎ，Ｒ３２９Ｈ，Ｓ３６４Ｔ，Ｇ４０４Ａ；コンセンサスフィターゼ−
７；コンセンサスフィターゼ−１２。
【００３３】 （iv）並びに（iv）及び（ｖ）のフィターゼの熱安定性変異体及びムテイン、
特に次の置換：Ｑ５０Ｌ，Ｔ，Ｇ；Ｑ５０Ｌ−Ｙ５１Ｎ；Ｑ５０Ｔ−Ｙ５１Ｎの
うちの１又は複数を含むもの。 用語“植物”は、全体の植物自体ばかりでなく、植物の部分又は器官、例えば
葉、種子又は穀粒、茎（幹）、根、塊茎、花、カルス、果実等；組織、細胞、プ
ロトプラスト等；並びにそれらのいずれかの組合せ又はサブコンビネーションを
含むことを意図する。植物組織培養物及び植物細胞系並びに植物プロトプラスト
は特に本明細書に含まれる。
【００３４】 用語“トランスジェニック植物”は、遺伝子改変されている先に定義される植
物、並びにその遺伝子改変を保持しているその子孫及び繁殖材料である。好まし
くは、トランスジェニック植物は組換え遺伝子技術により祖先の植物に導入され
た少くとも１の特定の遺伝子を含む。 本発明は、熱安定性フィターゼをコードするＤＮＡ構成物を含むトランスジェ
ニック植物に関する。
【００３５】 好ましい実施形態において、トランスジェニック植物は熱安定性フィターゼを
コードするＤＮＡ構成物を含むことを特徴とする植物群である。この植物群のメ
ンバーは、極めて十分に個性を有するが、熱安定性フィターゼＤＮＡ構成物の共
通の特徴的な特徴により他の品種から明確に区別できる。 従って、本教示は、１超の植物品種に適用できる。天然の植物品種は本発明の
植物の中に含まれない。
【００３６】 別の好ましい実施形態において、本発明は、トランスジェニック植物品種又は
その変異体；トランスジェニック植物種、トランスジェニック植物属、トランス
ジェニック植物科、及び／又はトランスジェニック植物月に関する。より好まし
くは、植物品種自体はディスクレームされる。 本発明において、いずれの熱安定性フィターゼも、例えばいずれかの野生型フ
ィターゼ、遺伝子操作されたフィターゼ、コンセンサスフィターゼ、フィターゼ
ムテイン、及び／又はフィターゼ変異体を用いることができる。遺伝子操作され
たフィターゼは、これらに限らないが、部位特異的変異誘発遺伝子シャッフリン
グ、ランダム変異誘発等により調製されたフィターゼを含む。
【００３７】 野生型熱安定性フィターゼをコードするヌクレオチド配列は、哺乳動物、植物
及び微生物源を含むいずれのソースのものであってもよく、慣用的な方法により
これらのソースから単離することができる。好ましくは、ヌクレオチド配列は微
生物、例えば真菌、例えばイーストもしくは糸状菌又は細菌から得られる。熱安
定性フィターゼをコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野で公知の種々の方法を
用いてそれを生産する細胞から単離することができる（例えばＷＯ９８／２８４
０９及びＥＰ０８９７９８５を参照のこと）。
【００３８】 ムテイン及び変異体を含む、熱安定性の遺伝子操作され又はコンセンサスフィ
ターゼをコードするヌクレオチド配列は、いずれの方法でも、例えば実施例３及
びＥＰ０８９７９８５に記載される方法で調製することができる。 本発明の植物において熱安定性フィターゼの発現を行うために、フィターゼを
コードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列の発現を指示することが
できる調節要素又は配列を含む発現構成物に挿入され、必要又は要求に応じて、
遺伝子産物の分泌を指示し、又は植物の種子への遺伝子産物のターゲッティング
を指示する。
【００３９】 転写がおこるために、熱安定性フィターゼをコードするヌクレオチド配列は、
問題の植物内で転写を媒介することができる好適なプロモーターに作用可能に連
結される。プロモーターは、誘導性プロモーターでも構成的プロモーターでもよ
い。典型的には、誘導性プロモーターは組織特異的又は成長段階特異的様式で転
写を媒介し、構成的プロモーターは全ての細胞組織において持続的転写を供する
。本発明のために役立つ好適な構成的プロモーターの例は、カリフラワーモザイ
クウイルス３５Ｓプロモーターである。アグロバクテリウムの腫瘍誘導性プラス
ミド（Ｔｉ）からの転写開始配列、例えばオクトパインシンターゼ、ノパリンシ
ンターゼ、又はマンノパインシンターゼイニシエーターは好ましい構成的プロモ
ーターの更なる例である。
【００４０】 好適な誘導性プロモーターの例には、種子特異的プロモーター、例えばコムギ
種子においてα−アミラーゼを発現するプロモーター（Stefanovら、Acta Biolo
gica Hungarica Vol. 42, No.4 pp. 323〜330 (1991))、グルテリン、プロラミ ン、グロブリン又はアルブミンのようなコメ種子貯蔵タンパク質をコードする遺
伝子のプロモーター（Wuら、Plant and Cell Physiology Vol. 39, No.8 pp. 88
5〜889 (1998))、レグミンＢ４からのソラマメ（Vicia faba)プロモーター及びC
onrad Uら、Journal of Plant Physiology Vol. 152, No.6 pp. 708〜711 (1998
)に記載されるソラマメからの未知の種子タンパク質遺伝子、ブラシカ・ナプス （Brassica napus)からの貯蔵タンパク質ｎａｐＡプロモーター、又は例えばＷ Ｏ９１／１４７７２に記載されるような当該技術分野で知られているいずれかの
他の種子特異的プロモーターがある。
【００４１】 熱安定性フィターゼの発現を増加させるために、プロモーターエンハンサー要
素を用いることが要求される。例えば、プロモーターエンハンサーは、プロモー
ターとアミラーゼ遺伝子との間に置かれたイントロンであり得る。イントロンは
、単子葉植物又は双子葉植物由来のものであってよい。例えば、イントロンは、
コメＷａｘｙ（Ｗｘ）遺伝子からの最初のイントロン（Liら、Plant Science Vo
l. 108, No.2, pp. 181〜190 (1995))、トウモロコシＵｂｉ１（Ubiquitin）遺 伝子からの最初のイントロン（Vainら、Plant Cell Reports Vol. 15, No.7, pp
. 489〜494 (1996))又はＡｃｔ１（アクチン）遺伝子からの最初のイントロンで
あり得る。双子葉植物イントロンの一例として、ｃｈｓＡイントロン（Vainら、
前掲）が言及される。また、種子特異的エンハンサーは、種子内での熱安定性フ
ィターゼの発現を増加させるために用いることができる。種子特異的エンハンサ
ーの例は、Vandergeest and Hall, Plant Molecular Biology Vol. 32, No.4, p
p 579〜588 (1996)により開示されるマメ（Phaseolus vulgaris)の主要種子貯蔵
タンパク質をコードするβ−ファセオリン遺伝子由来のものである。
【００４２】 また、発現構成物は、好ましくはｒｂｃＳ２′及びｎｏｓ３′ターミネーター
のような熱安定性フィターゼのシグナル転写ターミネーションに対するターミネ
ーター配列を含む。 上手く形質転換された植物の選択のために、発現構成物は、好ましくは１又は
複数の選択マーカー、例えば抗生物質耐性選択マーカー又は除草剤に対する耐性
を供する選択マーカーも含む。１つの広く用いられる選択マーカーは、カナマイ
シン耐性を供するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）
である。他の適切なマーカーの例は、測定可能な酵素活性、例えばジヒドロ葉酸
レダクターゼルシフェラーゼ、及びｂ−グルコロニダーゼ（ＧＵＳ）を供するマ
ーカーを含む。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼは、除草剤ｂａ
ｓｔａ又はｂｉａｌａｐｈｏｓと組み合わせて選択マーカーとして用いることが
できる。
【００４３】 本発明のトランスジェニック植物は、当該技術分野で知られている方法により
調製することができる。用いる形質転換法は、形質転換すべき植物種に依存する
であろう。それは当該技術分野で知られている形質転換法のいずれか、例えば、
アグロバクテリウム媒介形質転換（Zambryskiら、EMBO Journal 2, pp 2143〜21
50, 1993）、パーティクルボンバードメント、エレクトロポレーション（Fromm ら1986, Nature 319, pp 791〜793)、及びウイルス媒介形質転換から選択するこ
とができる。単子葉植物の形質転換のため、胚形成細胞系又は培養した胚のパー
ティクルボンバードメント（即ちｂｉｏｌｉｓｔｉｃ形質転換）が好ましい。以
下に、種々の植物を形質転換するための種々の方法を開示する引用文献を列記す
る：コメ（Cristouら、1991, Bio/Technology 9, pp. 957-962)、トウモロコシ （Gordon-Kammら、1990, Plant Cell 2, pp. 603-618)、オート（Somersら、199
2, Bio/Technology 10, pp 1589-1594)、コムギ（Vasilら、1991, Bio/Technolo
gy 10, pp. 667-674, Weeksら、1993, Plant Physiology 102, pp. 1077-1084) 及びオオムギ（Wan及びLemaux 1994, Plant Physiology 102, pp. 37-48, revie
w Vasil 1994, Plant Mol. Biol. 25, pp 925-937)。
【００４４】 より詳しくは、アグロバクテリウム媒介形質転換は便利には次の通り行われる
： 熱安定性フィターゼを有するベクターシステムを作製する。ベクターシステム
は、１つのベクターから構成されるが、２つのベクターから構成されてもよい。
２つのベクターの場合、ベクターシステムはバイナリーベクターシステムと呼ば
れる（Gynbeung Anら (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manu
al A3, 1〜19）。
【００４５】 アグロバクテリウムベースの植物形質転換ベクターは、大腸菌及びアグロバク
テリウムの両方のための複製の起点並びに細菌の選択マーカーからなる。アグロ
バクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)からのＴｉプラス
ミドから又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes)か らのＲｉプラスミドからの右及び好ましくは左ボーダーも植物の形質転換のため
に必要である。それらボーダー間に、熱安定性フィターゼ遺伝子及び好適な調節
配列、例えばプロモーター及びターミネーター配列を含む発現構成物がおかれる
。更に、選択遺伝子、例えばトランスポゾンＴｎ５からのネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼタイプII（ＮＰＴII）遺伝子及びリポーター遺伝子、例えばＧ
ＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子がそれらボーダーの間にクローン化される
。ビルレンス遺伝子を含むヘルパープラスミドを有するジスアームトアグロバク
テリウム株が上述のベクターで形質転換される。次にその形質転換されたアグロ
バクテリウム株が植物形質転換のために用いられる。
【００４６】 本発明は、熱安定性フィターゼを発現することができるトランスジェニック植
物を調製する方法であって、（ｉ）１つの熱安定性フィターゼをコードする１つ
のヌクレオチド配列を単離し；（ii）（ｉ）のヌクレオチド配列を、１つの選択
された宿主植物中で該ヌクレオチド配列の発現を媒介することができる１つの発
現構成物中に挿入し、そして（iii）前記選択された宿主植物を前記発現構成物 で形質転換するステップを含む方法にも関する。
【００４７】 熱安定性フィターゼに関して用いる“１つの”を“少くとも１の”でおきかえ
た上述の方法も本発明に含まれる。 この方法は本質的に非生物学的方法である。 いずれの植物が選択された宿主植物であってもよい。より詳しくは、植物は、
双子葉植物でも単子葉植物でもよい。主に関心があるのは潜在的な食物又は飼料
成分であるような植物である。これらの植物はフィチン酸を含み得る。単子葉植
物の例はグラス、例えばメドーグラス（meadow grass)（ブルーグラス、Ｐｏａ ）、飼草、例えばフェスキュ（festuca)、ライグラス（lolium)、テンペレート グラス（temperate grass)、例えばヌカボ（Agrostis)、及び穀物、例えばコム ギ、オート、ライムギ、オオムギ、コメ、モロコシ属植物及びトウモロコシ（コ
ーン）である。
【００４８】 双子葉植物の例は、マメ科植物、例えばルピナス、エンドウ、インゲン豆及び
ダイズ、並びにアブラナ科植物、例えばカリフラワー、脂肪種子ナタネ及び密接
に関連したモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana)であ る。 特に関心あるのは、単子葉植物、特に作物又はシリアル植物、例えばコムギ（
Triticum、例えばaestivum)、オオムギ（Hardeum、例えばvulgare)、オート、ラ
イムギ、コメ（イネ）、モロコシ属植物及びコーン（Zea、例えばmays)である。
【００４９】 更に特に関心あるのは双子葉植物、例えば上述のものである。 好ましい実施形態において、祖先植物又は宿主植物はそれ自身が要求される飼
料成分である。 実施例 実施例１ ＦＹＴアッセイ−フィターゼ酵素調製物の分析について フィターゼ活性は、以下のアッセイを用いて測定することができる：１０μＬ
の希釈酵素サンプル（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０
、pH５．５に希釈）を、２５０μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．０１％ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０、pH５．５中の５mMフィチン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）に加え
（フィチン酸ナトリウムを溶かした後にpHを調節；基礎を予備加熱）、３７℃で
３０分、インキュベートした。２５０μＬの１０％ ＴＣＡを加えることにより
反応を停止し、１００mLモリブデート試薬（８mL Ｈ2ＳＯ4中２．５９ｇ（ＮＨ 4 ）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏを２５０mLに希釈）中の７．３ｇ ＦｅＳＯ4を５００ μＬ加えることにより遊離ホスフェートを測定する。７５０nmでの吸光度を９６
ウエルプレートマイクロタイタープレート内の２００μＬサンプルで測定する。
基質及び酵素ブランクを含める。ホスフェート標準曲線も含める（０〜２mMホス
フェート）。１ＦＹＴは所定の条件下で分当りに１μmolのホスフェートを遊離 する酵素の量に等しい。このアッセイは、他の飼料成分との混合物でない場合の
）フィターゼ酵素調製物のために好ましい。
【００５０】 実施例２ ＦＴＵアッセイ−飼料成分との混合物におけるフィターゼの分析について １ＦＴＵは、標準状態（３７℃、pH５．５；反応時間６０分及びフィチン酸の
出発濃度５mM）で、分当り１μmolのホスフェートと等価のホスフェートを放出 する酵素の量として定義される。
【００５１】 １ＦＴＵ＝１ＦＹＴ ＦＴＵアッセイは、動物飼料プレミックス及び同様の複合組成物でのフィター
ゼ活性測定のために好ましい。 試薬／基質 飼料のための抽出緩衝液等 この緩衝液は、ＰＯ4−標準の調製及びプレミックスサンプルの更なる希釈の ためにも用いる。
【００５２】 Ｔｗｅｅｎ ２０ pH５．５を含む０．２２Ｍ酢酸緩衝液 １リッター当り３０ｇの酢酸ナトリウム三水和物（ＭＷ＝１３６．０８ｇ／mo
l）。例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ４６２６７及びリッター当り０．１ｇのＴｗ ｅｅｎ ２０、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ２２１８４をはかりとる。 酢酸ナトリウムを脱塩水に溶かす。
【００５３】 Ｔｗｅｅｎ ２０を加え、pHを酢酸で５．５０±０．０５に調節する。 全量まで脱塩水を加える。 プレミックスのための抽出緩衝液 Ｔｗｅｅｎ ２０，ＥＤＴＡ，ＰＯ4 3-ｏｇＢＳＡを含む０．２２Ｍ酢酸緩衝 液。
【００５４】 リッター当り３０ｇの酢酸ナトリウム三水和物、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ
６２６７。 リッター当り０．１ｇのＴｗｅｅｎ ２０、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ２２
１８４。 リッター当り３０ｇのＥＤＴＡ、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ８４１８。
【００５５】 リッター当り２０ｇのＮａ2ＨＰＯ4、２Ｈ2Ｏ、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ ６５８０。 リッター当り０．５ｇのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、例えばＳｉｇｍａ
Ａｒｔ Ａ−９６４７。 成分を脱塩水に溶かし、pHを酢酸で５．５０±０．０５に調節する。
【００５６】 全量まで脱塩水を加える。 ＢＳＡは安定でなく、それゆえ同日に緩衝液を加えて用いなければならない。 ５０mM ＰＯ4 3-ストック溶液 ０．６８１ｇのＫＨ2ＰＯ4（ＭＷ＝１３６．０９ｇ／mol）、例えばＭｅｒｃ ｋ Ａｒｔ ４８７３を計量し、Ｔｗｅｅｎを含む１００mLの０．２２Ｍ酢酸ナ
トリウムに溶かす。
【００５７】 保存安定性：冷蔵庫内で１週間 Ｔｗｅｅｎを含まない０．２２Ｍ酢酸緩衝液 この緩衝液は、フィチン酸基質の生産のために用いる。 １５０ｇの酢酸ナトリウム三水和物（ＭＷ＝１３６．０８）、例えばＭｅｒｃ
ｋ Ａｒｔ ６２６７を計量し、脱塩水に溶かし、pHを酢酸で５．５０±０．０
５に調節する。
【００５８】 脱塩水を５０００mLまで加える。 保存安定性：室温で１週間 フィチン酸基質、５mMフィチン酸 フィチン酸の容量を、用いるバッチの水含有量を許容して計算する。 水含有量が例えば８．４％なら、次の通り得られる。
【００５９】
【数１】
【００６０】 フィチン酸（Ｎａ塩）（ＭＷ＝９２３．８ｇ／mol）、例えばＳｉｇｍａ Ｐ −８８１０を計量し、０．２２Ｍ酢酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎなし）に溶かす。（希
釈した）酢酸の添加は溶解速度を増加させる。 pHを酢酸で５．５０±０．０５に調節する。 全量まで０．２２Ｍ酢酸緩衝液を加える。
【００６１】 ２１．７％硝酸溶液 停止溶液のため。 １部の濃（６５％）硝酸を２部の脱塩水と混合する。 モリブデート試薬 停止溶液のため。
【００６２】 １００ｇのヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物（ＮＨ4）６Ｍｏ7Ｏ24、
４Ｈ2Ｏ、例えばＭｅｒｃｋ Ａｒｔ １１８２を脱塩水に溶かす。１０mLの２ ５％ＮＨ3を加える。 脱塩水を１リッターまで加える。 ０．２４％バナジン酸アンモニウム Bie & Berntsenから購入 モリブデン酸１バナジン酸停止溶液 １部のバナデート溶液（０．２４％、バナジン酸アンモニウム）＋１部のモリ
ブデート溶液を混合する。２部の２１．７％硝酸溶液を加える。
【００６３】 その溶液を使用前２時間以内に調製し、そのボトルをすず箔で包む。 サンプル 凍結したサンプルを一晩、冷蔵庫内で解凍する。 飼料サンプルのサンプルサイズ：少くとも７０ｇ、好ましくは１００ｇ。 飼料サンプル サンプル重量、例えば１００ｇの１０倍に相当する緩衝液の添加を許容する溶
液を選択し、Ｔｗｅｅｎを含む１０００mLの０．２２Ｍ酢酸緩衝液に溶かす。ｅ
ｎｃｌｏｓｕｒｅｌを参照のこと。最も近い溶液容量までくり返す。
【００６４】 サンプルサイズが約１００ｇであるなら、全てのサンプルをコーヒーグライン
ダーで粉砕し、次に風袋ビーカーに入れる。サンプル重量を記録する。非ペレッ
ト化サンプルを粉砕することは必要でない。サンプルが大きすぎて扱えないなら
、それは約１００ｇの部分に割る。 磁石をビーカーに入れ、Ｔｗｅｅｎを含む０．２２Ｍ酢酸緩衝液を加える。
【００６５】 サンプルを９０分、抽出する。 抽出の後、サンプルを３０分、放置して飼料を沈殿させる。ピペットで５mLの
サンプルをとる。サンプルを溶液の表面下２〜５cmでとり、遠心ガラスに入れて
ふたでおおう。 サンプルを１０分、４０００rpmで遠心する。
【００６６】 プレミックスサンプル サンプル重量の１０倍に相当する緩衝液の添加を許容する溶液容量を選択する
。最も近い溶液容量までくり返す。 サンプルを計量したなら（５０〜１００ｇ）、全てのサンプルを風袋ビーカー
に入れる。サンプル重量を記録する。サンプルが大きすぎて扱えないなら、それ
を約１００ｇの部分に割る。
【００６７】 磁石をビーカーに入れ、Ｔｗｅｅｎ、ＥＤＴＡｏｇＰＯ4 3-を含む０．２２Ｍ 酢酸緩衝液を加える。 サンプルを６０分、抽出する。 抽出後、サンプルを３０分、放置してプレミックスを沈殿させる。ピペットで
５mLサンプルをとる。溶液の表面下２〜５cmでサンプルをとり、遠心ガラスに入
れ、それをふたでおおう。
【００６８】 サンプルを１０分、４０００rpmで遠心する。 分析 飼料サンプルの抽出物を直接、分析する。 プレミックスの抽出物を約１．５ＦＴＵ／ｇ（Ａ415（主要サンプル）＜１． ０）に希釈する。
【００６９】 Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．２２Ｍ酢酸緩衝液を希釈のために用いる。 主要サンプル 抽出し、遠心したサンプルからの上清の２×１００mLをしるしのついたガラス
テストチューブに入れ、各々のチューブに磁石を入れる。 全てのサンプルを準備したなら、それらを撹拌しながら水浴に入れる。
【００７０】 ３．０mLの基質を加える。 基質の添加後正確に６０分、インキュベートする。 サンプルを水浴からとり、２．０mLの停止溶液を加える（基質の添加後正確に
６０分） サンプルを１分、又はそれ超撹拌する。
【００７１】 飼料サンプルを４０００rpmで１０分、遠心する（プレミックスサンプルを遠 心することは必要でない）。 ブラインドサンプル 抽出し、遠心したサンプルからの上清１００mLを印のついたテストチューブに
入れ、磁石を各々のチューブに入れる。
【００７２】 そのサンプルに２．０mLの停止溶液を加える。 ３．０mLの基質をサンプルに加える。 サンプルを室温で６０分、インキュベートする。 飼料サンプルを４０００rpmで１０分、遠心する（プレミックスサンプルを遠 心することは必要でない）。
【００７３】 標準 ８の標準の各々から２×１００mLをとり、４×１００mLの０．２２Ｍ酢酸緩衝
液（試薬ブラインド）もとる。 Ａ415を全てのサンプルで測定する。 計算 ＦＴＵ／ｇ＝μmol ＰＯ4 3-／（min×ｇ（サンプル）） Ｃｇのサンプルを計算する（粉砕後）。
【００７４】 抽出し、遠心したサンプルから１００μＬをとる。 ＰＯ4 3-標準曲線には線形である。 ＰＯ4 3-標準についての回帰曲線からサンプルの実際の濃度を見い出す（mMの 濃度）： 〔ＰＯ4 3-〕＝（ｘ−ｂ）／ａ ｘ＝Ａ415 、ａ＝傾き、ｂ＝ｙ軸の切片 μmol ＰＯ4 3-／min＝｛〔ＰＯ4 3-〕（mM）×Ｖｏｌ（リッター）×１０００
μmol／mmol｝／ｔ ｔ＝インキュベーション時間（分） Ｖｏｌ＝サンプル容量（リッター）＝０．０００１リッター １０００＝mmolからμmolへの変換因子 ＦＴＵ／ｇprove＝｛（ｘ−ｂ）×Ｖｏｌ×１０００×Ｆp｝／｛ａ×ｔ×Ｃ｝ Ｃ＝計ったサンプルのグラム Ｆp＝採取したサンプルと全サンプル（抽出後）との間の関係。例：１０００m
Lから０．１００mLを採取→Ｆp＝１０００／０．１００＝１００００。
【００７５】 以下の値の挿入での縮めた表現： ｔ＝６０ Ｖｏｌ＝０．０００１Ｌ Ｆp＝１００００ ＦＴＵ／ｇsample＝｛（ｘ−ｂ）×０．０００１×１０００×１００００｝／
｛ａ×６０×Ｃ｝ 実施例３ 種々のフィターゼの至適温度及び融点Ｔｍの測定 種々のフィターゼの熱安定性、即ち融解温度Ｔｍ及び／又は至適温度を測定し
た。
【００７６】 アスペルギルス・ニゲルＮＲＲＬ３１３５のフィターゼをＥＰ０４２０３５８
及びvan Hartingsveldtら（Gene, 127, 87〜94, 1993)に記載されるように調製 した。 アスペルギルス・フミガトウスＡＴＣＣ １３０７３、アスペルギルス・テル
レウス９Ａ−１、アスペルギルス・テルレウス・ＣＢＳ １１６．４６、アスペ
ルギルス・ニジュランス、マイセニオフトラ・サーモフィラ、及びタラロマイヤ
ス・サーモフィルスのフィターゼをＥＰ−０８９７９８５及びその中の引用文献
に記載される通り調製した。
【００７７】 コンセンサスフィターゼ−１（図５）及びコンセンサスフィターゼ−１−Ｑ５
０ＴはＥＰ０８９７９８５に示され、それに記載されるように調製した。 コンセンサスフィターゼ−１０は、ＥＰ−０８９７９８５の教示に従って得て
、調製した。（各々Ｅｘａｍｐｌｅｓ１−２及び３−７）が、その図１のアライ
ンメントに加えて、サーモマイセス・ラヌギノサ（Thermomyces lanuginosa)の フィターゼ配列（Berkaら、Appl. Environ Microbiol. 64, 4423〜4427, 1998) 及び担子菌コンセンサス配列（以下に記載の通り誘導）を調製した−Ａ．ニゲル
Ｔ２１３の配列を省略し、残りのＡ．ニゲルフィターゼ配列について０．５８vo
te weightを割り当てる。コンセンサスフィターゼ−１０の配列の誘導化を図７ に示す。
【００７８】 担子菌コンセンサス配列は、ＥＰ−０８９７９８５の原理に従っても、即ち（
シグナルペプチドを除く）成熟フィターゼの最初のアミノ酸残基で開始して、Ｗ
Ｏ９８／２８４０９の５の担子菌フィターゼから得ることもできる。０．５のボ
ート・ウエイト（vote weight)を２つのＰａｘｉｌｌｕｓフィターゼに割り当て
、全ての他の遺伝子を１．０のボート・ウエイトで用いた。図６を参照のこと。
【００７９】 ムテインコンセンサスフィターゼ−１０−ｔｈｅｒｍｏ、コンセンサスフィタ
ーゼ−１０−ｔｈｅｒｍｏ−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１Ａ（図１０）及びコンセンサスフ
ィターゼ−１０−ｔｈｅｒｍｏ−Ｑ５０Ｔを、３つの復帰突然変異Ｋ９４Ａ，Ｖ
１５８Ｉ及びＡ３９６Ｓ（“ｔｈｅｒｍｏ（３）”又は“ｔｈｅｒｍｏ”）並び
に適用できるなら変異Ｑ５０Ｔ又はＱ５０Ｔ−Ｋ９１Ａも導入することにより、
ＥＰ−０８９７９８５のＥｘａｍｐｌｅ ５〜８と同様に、コンセンサスフィタ
ーゼ−１０から調製した。
【００８０】 ムテインコンセンサスフィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ（８）、コンセンサスフ
ィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ（８）−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１Ａ（図９）及びコンセン
サスフィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ（８）−Ｑ５０Ｔを、８つの変異Ｅ５８Ａ，
Ｄ１９７Ｎ，Ｅ２６７Ｄ，Ｒ２９１Ｉ，Ｒ３２９Ｈ，Ｓ３６４Ｔ，Ａ３７９Ｋ及
びＧ４０４Ａ（“ｔｈｅｒｍｏ（８）”）並びに適用可能なら、変異Ｑ５０Ｔ又
はＱ５０Ｔ−Ｋ９１Ａも導入することにより、ＥＰ−０８９７９８５のＥｘａｍ
ｐｌｅ ８と同様に、コンセンサスフィターゼ−１から調製した。
【００８１】 コンセンサスフィターゼ−１−Ｔｈｅｒｍｏ（３）を、３つの変異Ｋ９４Ａ，
Ｖ１５８Ｉ及びＡ３９６Ｓの導入によりコンセンサスフィターゼ−１から調製し
た。 アスペルギルス・フミガトウスのいわゆるα−変異体（Ｑ５１（２７）Ｔ，Ｅ
５５Ｙ，Ｖ１００Ｉ，Ｆ１１４Ｙ，Ａ２４３Ｌ，Ｓ２６５Ｐ，Ｎ２９４Ｄ）及び
表１に示すその更なるムテインを全般的に上述されるように調製した。位置番号
は、その図１１をいう。但し、括弧内の番号はＥＰ０８９７０１０に用いられる
番号をいう。
【００８２】 上述の熱安定性フィターゼをコードするＤＮＡ構成物は、例えばＥＰ０８９７
９８５の教示に従って調製することができる。その植物内での発現のために、そ
の記載を引用する。 フィターゼの非ホールディング温度又は融解温度Ｔｍを決定するために、示差
走査熱量測定を、Bruggerら (1997) : "Thermal denaturation of phytases and
pH 2.5 acid phosphatase studied by differential scanning calorimetry,"
in The Biochemistry of phytate and phytase (eds. Rasmussen, S.K; Raboy,
V.; Dalboge, H. and Loewus, F.; Kluwer Academic Publishers)により以前に 公開されるように適用した。
【００８３】 ５０〜６０mg／mLのタンパク質の均一又は精製したフィターゼ溶液を調製し、
１０mM酢酸ナトリウムpH５．０に対して大量に透析した。１０℃／分の一定の加
熱速度を９０〜９５℃まで適用した。 上述のフィターゼに基づくＴｍ測定の結果を以下の表１に示し；所定のフィタ
ーゼについては図１〜４にも示す。
【００８４】 以下の表１において、種々のフィターゼの至適温度も示す。この測定のため、
フィターゼ活性を、基本的にMitchellら（Microbiology 143, 245〜252, 1997) に記載されるように決定した：その活性は、２００mM酢酸ナトリウムpH５．０中
０．５％フィチン酸（約５mM）を含むアッセイ混合物中で測定した。３７℃で１
５分のインキュベーションの後、等量の１５％トリクロロ酢酸を加えることによ
り停止させた。その遊離したホスフェートを、そのアッセイ混合物１００μＬを
９００μＬのＨ2Ｏ及び１mLの０．６Ｍ Ｈ2ＳＯ4、２％アスコルビン酸及び０ ．５％モリブデン酸アンモニウムと混合することにより定量した。リン酸カリウ
ムの標準溶液を引用として用いた。酵素活性の１ユニットを３７℃で１分当りに
１μmolのホスフェートを遊離する酵素の量として定義した。タンパク質濃度を 、Paceら（Prot. Sci. 4, 2411〜2423, 1995)に従って計算した２８０mmでの酵 素吸光係数を用いて決定した：コンセンサスフィターゼ、１．１０１；コンセン
サスフィターゼ７、１．０６８；コンセンサスフィターゼ１０、１．０３９。
【００８５】 至適温度の測定のため、酵素（１００μＬ）及び基質溶液（１００μＬ）を所
定の温度で５分、プレインキュベートした。酵素に基質溶液を加えることにより
反応を開始した。１５分のインキュベーションの後、その反応をトリクロロ酢酸
で停止させ、遊離したホスフェートの量を測定した、フィターゼ活性対温度をプ
ロットし、至適温度を活性がその最大値に達する温度として決定する。
【００８６】 表１ 種々のフィターゼについての至適温度及びＴｍ フィターゼ 至適温度 Ｔｍ（℃） （℃） アスペルギルス・ニゲル 55 63.3（Aspergillus niger) NRRL 3135 アスペルギルス・フミガトウス 55 62.5（Aspergillus fumigatus) ATCC 13073 アスペルギルス・テルレウス 49 57.5（Aspergillus terreus) 9A-1 アスペルギルス・テルレウス 45 58.5 CBS 116.46 アスペルギルス・ニジュランス 45 55.7（Aspergillus nidulans) マイセリオフトラ・サーモフィラ 55 −（Myceliophthora thermophila) タラロマイセス・サーモフィルス 45 −（Talaromyces thermophilus) コンセンサスフィターゼ-10- 82 89.3thermo-Q50T-K91A コンセンサスフィターゼ-10- 82 88.6thermo-Q50T コンセンサスフィターゼ-10 80 85.4 コンセンサスフィターゼ-1- − 85.7thermo(8)-Q50T-K91A コンセンサスフィターゼ-1- 78 84.7thermo(8)-Q50T コンセンサスフィターゼ-1- 81 −thermo(8) コンセンサスフィターゼ-1- 78 84.7thermo(8)-Q50T-K91A コンセンサスフィターゼ-1- 75 −thermo(3) コンセンサスフィターゼ-1- − 78.9Q50T コンセンサスフィターゼ-1 71 78.1 アスペルギルス・フミガトウス 63 − α−変異体＋変異E59A, S126N, R329H,S364T, G404A 上述のアスペルギルス・フミガトウス 63 −＋変異K68A アスペルギルス・フミガトウス 60 67.0 α−変異体（Q51(27)T, F55Y, V100I, F114Y, A243L, S265P, N294D)
【図面の簡単な説明】
【図１】 コンセンサスフィターゼ１及びコンセンサスフィターゼ１０の示差走査熱量測
定（ＤＳＣ）チャートである。
【図２】 コンセンサスフィターゼ−１０−ｔｈｅｒｍｏ−Ｑ５０Ｔ及びコンセンサスフ
ィターゼ−１０−ｔｈｅｒｍｏ−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１ＡのＤＳＣである。
【図３】 コンセンサスフィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ−〔８〕−Ｑ５０Ｔ及びコンセン
サスフィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ〔８〕−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１ＡのＤＳＣである
。
【図４】 Ａ．フィミガトウス（A. fumigatous)ＡＴＣＣ １３０７３及びそのα−変異
体からのフィターゼのＤＳＣである。
【図５】 コンセンサスフィターゼ−１アミノ酸配列のデザインを示す。
【図６】 ５の担子菌フィターゼのアラインメント及び担コンセンサス菌子配列である。
【図７】 コンセンサスフィターゼ−１０アミノ酸配列のデザインである。
【図８】 コンセンサスフィターゼ−１１のデザインについのアラインメトである（全て
の担子菌フィターゼを、各々の担子菌配列について０．２のアサインド・ボート
・ウエイト（assigned vote weight)を用いて独立した配列として用いた；なお 更にＡ．ニゲル（A. niger)のアミノ酸配列を用いた）。
【図９】 コンセンサスフィターゼ−１−ｔｈｅｒｍｏ（８）−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１ＡのＤ
ＮＡ及びアミノ酸配列である。
【図１０】 コンセンサスフィターゼ−１０−ｔｈｅｒｍｏ（３）−Ｑ５０Ｔ−Ｋ９１Ａの
ＤＮＡ及びアミノ酸配列である。
【図１１】 Ａ．フミガトウスＡＴＣＣ １３０７３α−変異体のＤＮＡ及びアミノ酸配列
である。
【図１２】 コンセンサスフィターゼ−１と比べた次の変異：Ｓ８９Ｄ，Ｓ９２Ｇ，Ａ９４
Ｋ，Ｄ１６４Ｓ，Ｐ２０１Ｓ，Ｇ２０３Ａ，Ｇ２０５Ｓ，Ｈ２１２Ｐ，Ｇ２２４
Ａ，Ｄ２２６Ｔ，Ｅ２５５Ｔ，Ｄ２５６Ｅ，Ｖ２５８Ｔ，Ｐ２６５Ｓ，Ｑ２９２
Ｈ，Ｇ３００Ｋ，Ｙ３０５Ｈ，Ａ３１４Ｔ，Ｓ３６４Ｇ，Ｍ３６５Ｉ，Ａ３９７
Ｓ，Ｓ３９８Ａ，Ｇ４０４Ａ、及びＡ４０５Ｓを含むコンセンサスフィターゼの
ＤＮＡ及びアミノ酸配列である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年５月１５日（２０００．５．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ＰＡ １９９８ ０１１７６ (32)優先日 平成10年９月18日(1998．9．18) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ＰＡ １９９９ ０００９１ (32)優先日 平成11年１月22日(1999．1．22) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ＰＡ １９９９ ０００９３ (32)優先日 平成11年１月22日(1999．1．22) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 2B030 AD08 CA14 CA15 CA17 CA19 2B150 AA01 AA02 AA03 AA05 AA08 AE29 BA04 BE03 DF11 4B024 AA08 BA07 CA04 DA01 GA11 4B050 CC03 DD03 LL05

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 動物の飼料を調製する方法であって、該方法が、飼料成分の
    アグロメレーションを含み、ここで該アグロメレーションの前又は間に熱安定性
    フィターゼが添加されることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記飼料成分が少くとも６５℃の温度に加熱されることを特
    徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記熱安定性フィターゼが、ＤＳＣのために１０℃／分の一
    定の加熱速度を用いて、少くとも６５℃のＤＳＣにより測定したＴｍを有するフ
    ィターゼであることを特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
  4. 【請求項４】 フィードエキスパンダーで行うことを特徴とする請求項１〜
    ３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 エクストルーダーで行うことを特徴とする請求項１〜３のい
    ずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 ペレットプレスで行うことを特徴とする請求項１〜３のいず
    れかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記熱安定性フィターゼがトランスジェニック植物中に存在
    することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、前記アグロ
    メレーションが、 （ａ）飼料成分を少くとも４５℃の温度に予備加熱するステップと、 （ｂ）ステップ（ａ）の産物を少くとも６５℃の温度に加熱するステップと、
    を含み、前記熱安定性フィターゼをステップ（ａ）及び／又は（ｂ）の前に又は
    その間に添加することを特徴とする方法。
  9. 【請求項９】 熱安定性フィターゼをコードするＤＮＡ構成物を含むトラン
    スジェニック植物。
  10. 【請求項１０】 前記熱安定性フィターゼをコードするＤＮＡ構成物が、前
    記植物の少くとも一部分内のフィターゼコーディング配列の発現を媒介すること
    ができる調節配列に作用可能に連結されていることを特徴とする請求項９に記載
    のトランスジェニック植物。
  11. 【請求項１１】 植物の少くとも一部分内のフィターゼコーディング配列の
    発現を媒介することができる調節配列に作用可能に連結された熱安定性フィター
    ゼをコードするＤＮＡ構成物を含む発現構成物。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の発現構成物を含むベクター。
  13. 【請求項１３】 熱安定性フィターゼを発現することができるトランスジェ
    ニック植物を調製する方法であって、 （ｉ）熱安定性フィターゼをコードするヌクレオチド配列を単離するステップ
    と、 （ii）前記（ｉ）のヌクレオチド配列を、選択された宿主植物内の前記ヌクレ
    オチド配列の発現を媒介することができる発現構成物内に挿入するステップと、 （iii）前記選択された宿主植物を前記発現構成物で形質転換するステップと 、 を含む方法。
  14. 【請求項１４】 前記植物から前記フィターゼを抽出するステップを更に含
    む請求項１３に記載の方法。
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