JP2002508942A - 飼料調製物及び植物発現における熱安定性フィターゼ - Google Patents
飼料調製物及び植物発現における熱安定性フィターゼInfo
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Abstract
Description
らの使用、及びそれらの植物内での発現に関する。
られる。
スジェニックアルファルファを生産するための標準的な様式、及び動物飼料補給
物としてそれ自体用いることができるフィターゼ含有濃縮物の調製を記載する。 EP 0 556 883 B1は、押出し技術に基づいて飼料ペレットを調
製するための方法を記載する。温度感受性剤、例えばフィターゼの添加は飼料ペ
レットの押出し後に行われ、その感受性剤は減圧下でペレットにまぜられる。
間の熱感受性物質の活性の損失は公知の問題である。上述のEP特許は、押出し
過程の後に減圧下でこれらの物質を加えることによりこの問題を解決することを
提唱する。しかしながら、この解決法は液体形態の感受性物質、及び更なる高価
な工程装置の設置を要求する。
ーゼ発現性トランスジェニック植物を供する。 発明の概要 本発明は、動物飼料を調製する方法であって、該方法は飼料成分の凝集を含み
、ここで熱安定性フィターゼは該凝集の前又は間に添加されることを特徴とする
方法を供する。
又はその一部も供する。 トランスジェニック植物又はその部分、例えば種子又は葉は、本発明の飼料調
製過程に用いることができ、それにより、好ましい実施形態において、同時に、
栄養(飼料成分)及び飼料添加物フィターゼを供することができる。
化することを意図し、又はそれに適した天然の又は人工の食料、食事等を意味す
る。ヒトのための食物は、飼料の定義に含まれる。 “動物”は、全ての動物、多胃動物(反芻動物);又は単胃動物、例えばヒト
、トリ、ブタ及び魚を含む。好ましい動物は単胃動物、特にブタ及びブロイラー
である。
意図した又は実際の成分部分を含む。非ヒト動物のための飼料成分は、通常、及
び好ましくは以下の非排他的リストから選択される。 植物由来製品 例えば種子、穀物、葉、根、塊茎、花、さや、包皮−これらは、フレーク、ケ
ーキ、グリット、フラワー等の形態をとることができる; 動物由来製品 例えば魚ミール、ミルク粉末、骨抽出物、肉抽出物、血液抽出物等; 添加物 例えば、ミネラル、ビタミン、芳香化合物、及び飼料増強酵素 フィチン酸又はミオイノシトール1,2,3,4,5,6−ヘキサキス二水素
リン酸1又は短いミオイノシトールヘキサキスホスフェートについて)は、イノ
シトールの主な源であり植物種子及び穀物中のホスフェートの主な貯蔵形態であ
る。マメ科植物の種子において、それはホスフェート成分の約90%を占める。
種子、穀物及びマメは重要な飼料成分である。
て、同義に又はランダムに用いられ、抗栄養因子である。これは、一部は、栄養
に必須のイオン、例えばカルシウム、微量ミネラル、例えばマンガン及び(静電
相互作用による)タンパク質へのその結合のためである。そしてフィチン酸及び
その塩フィテートはしばしば代謝されないので、そのリンが栄養的に利用できな
いからである。
引きおこす。 非代謝性フィチン酸のリンは動物の胃腸管を通過し、肥料と共に排出され、環
境に不要なリンの汚染を引きおこし、例えば水環境の栄養汚染及び藻類の過剰な
増殖を引きおこす。
”は、フィターゼ活性を示すポリペプチド又は酵素、即ち(1)ミオイノシトー
ル及び/又は(2)そのモノ−、ジ−、トリ−、テトラ−及び/又はペンタ−ホ
スフェート及び(3)無機ホスフェートへのフィテート(ミオイノシトールヘキ
サキスホスフェート)の加水分解を触媒するものである。
で、フィターゼ生産細菌及びフィターゼ生産真菌が知られている。 子嚢菌類(Ascomycota)の真菌門に属するフィターゼ生産性糸状菌のいくつか
の記載がある。特に、アスペルギルス(Aspergillus)属のフィターゼ生産性子 嚢菌類、例えばアスペルギルス・テルレウス(Aspergillus terreus)について の文献がある(Yamadaら、1986, Agric. Biol. Chem. 322 : 1275〜1282)。また
、アスペルギルス・ニゲル変種アワモリ(awamori)からのフィターゼ遺伝子のク
ローニング及び発現も記載されている(Piddingtonら、1993, Gene 133 : 55〜6
2)。EP 0420358は、アスペルギルス・フィクウム(ニゲル)のフィタ
ーゼのクローニング及び発現を記載する。EP 0684313は、子嚢菌類ア
スペルギルス・ニゲル、マイセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora the
rmophila)、アスペルギルス・テルレウスのフィターゼのクローニング及び発現 を記載する。なお更に、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans
)、タラロマイセス・サーモフィルス(Talaromyces thermophilus)、アルペルギ
ルス・フミガトウス(Aspergillus fumigatus)及びアスペルギルス・テルレウス
の別の株のフィターゼのいくつかの部分的な配列が供される。
ローニング及び発現はWO97/135017に記載される。 WO98/28409は、いくつかの担子菌類フィターゼ、例えばペニオホラ
・リッチ(Peniophora lycii)、アグロサイベ・ペジアデス(Agrocybe pediades
)、パキシルス・インボルトウス(Paxillus involutus)及びトラメテス・プベセ
ンス(Trametes pubescens)からのもののクローニング及び発現を記載する。
ているキャラクタライドされた酵素の各々の型を記載するthe Nomenclature Com
mittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology
(IUBMB)の推奨に主に基づく酵素の命名に関する情報の保管所)に従って、2つ の異なる型のフィターゼが現在知られている:いわゆる3−フィターゼ(ミオイ
ノシトールヘキサホスフェート3−ホスホヒドロラーゼ、EC 3.1.3.8
)及びいわゆる6−フィターゼ(ミオイノシトールヘキサホスフェート6−ホス
ホヒドロラーゼ、EC 3.1.3.26)である。3−フィターゼは最初にフ
ィチン酸の3−位でエステル結合を加水分解し、6−フィターゼは最初にフィチ
ン酸の6−位でエステル結合を加水分解する。これらのフィターゼの型の両方と
もフィターゼの先の定義に含まれる。
らのいずれをも用いることができる。好ましいフィターゼアッセイは実施例に含
まれる。 “アグロメレーション(凝集)”の概念は、種々の成分を熱の作用下で混合す
る過程として定義される。得られる産物は、好ましくは、“アグロメレート”又
は満足いく物理的安定性の産物を形成しながら成分が互いに接着しているコング
ロメレートである。このようなアグロメレートからのダストの形成は、その物理
的安定性の赤指標であり、形成されるダストが少いと、より優れている。アグロ
メレートからのダスト形成のための適切なアッセイはASAE標準S269−1
である。満足いくアグロメレートは20%未満、好ましくは15%未満、より好
ましくは10%未満、更により好ましくは6%未満のダストを有する。
測定して少くとも65℃であることを意味する。より好ましい温度は、少くとも
70,75,80,85,90,95,100,105,110,115,12
0,125、又は少くとも130℃である。 好ましいアグロメレーション過程は、加圧下で行われる。圧力は、典型的には
、その成分のコンパクト化のためであり、任意に断面又はスループット領域の減
少と組み合わせられる。好ましくは温度及び圧力のような過程のパラメータを正
確に調節することにより、得られるせん断力及びせん断速度は、スターチ−及び
タンパク質−含有飼料成分が流体になるような倍率のものである。
ションユニット内で測定した最大圧である。 水蒸気又はスチームの添加がしばしばアグロメレーションに含まれるが、絶対
に要求されるものではない。 アグロメレーションは、これらに限らないが、エクストルーション(押出し)
、エクスパンション(又はプレッシャーコンディショニング)及びペレッティン
グ(又はペレットプレシング)を含む。
5-7, PK-6705 Esbjerg 0又はNiels Finsensvej 4, DK-7160 Vejle (“Haendbog
i Pilleteringsteknik 1996”)から要求により利用できるハンドブックのpp. 1
49-153に記載される。しかしながら、本発明のアグロメレーション過程において
、上述のハンドブックに言及される以下のステップは全体として任意である。
ンドブックのpp. 61〜66に記載される。また、エクスパンションのために、上述
のステップ(i)〜(vi)、特にステップ(i)及び(vi)は全体として任意の
ステップである。 これは、以下のステップについても行われる: (ii′)(例えばp65に示すブレードグラニュレーターを用いて)産物を細
分し; (vii)(例えばp62に示すペレットプレスを用いて)産物をペレット化す る。
記載される。 本発明の好ましいアグロメレーション過程において、上述の更なるステップ(
i)〜(vii)のうちの1又は複数が含まれる。
も45℃、好ましくは少くとも50,55,60,65,70,75,80℃の
温度に予備加熱され;そして次に第2のステップ(b)において、少くとも65
℃、好ましくは70,75,80,85,90,95,100,105,110
,115,120,125、又は少くとも130℃の温度に加熱される。
プ(b)の前又は間に行われる。 ステップ(a)において好ましくは水が添加される。より好ましくは、成分の
混合の間(ステップ(a)及び/又は(b))に加熱したスチームが添加される
。
ブックp.44を参照のこと)。 “熱安定性”フィターゼは、好ましくはDSCについて一定の加熱速度、より
好ましくは10℃/分の値を用いて、少くとも65℃の、示差走査熱量測定(D
SC)により精製フィターゼタンパク質で測定したTm(融解温度)を有するフ
ィターゼである。好ましい実施形態において、Tmは少くとも66,67,68
,69,70,71,72,73,74又は75℃である。好ましくは、Tmは
150℃又はそれ未満、より好ましくは145,140,135,130,12
5,120,115又は110℃又はそれ未満である。従って、Tmの好ましい
間隔は、65〜150℃、66〜150℃等〜75〜150℃;65〜145℃
、66〜145℃等〜75〜145℃;65〜140℃等〜75〜140℃;等
〜65〜110℃、66〜110℃等〜75〜110℃である。
;70〜100℃;75〜95℃;又は80〜90℃。 以下の実施例3において、DSCによるTmの測定が記載され、いくつかのフ
ィターゼのTmが示される。 最適な温度も示される。なぜなら、かわりとして、熱安定性フィターゼは少く
とも60℃の至適温度を有するフィターゼとして定義することができるからであ
る。好ましくは、至適温度は、pH5.5で基質フィテート上で、又はpH5.0で
基質フィチン酸で決定される。好ましいユニットは、実施例3のFYT,FTU
又はユニットである。実施例3のフィターゼアッセイが最も好ましい。
5,66,67,68,69又は70℃である。好ましくは、至適温度は140
℃又はそれ未満、より好ましくは135,130,125,120,115,1
10,105又は100℃又はそれ未満である。従って、至適温度の好ましい間
隔は、60〜140℃、61〜140℃等〜70〜140℃;60〜135℃;
61〜135℃等〜70〜135℃;60〜130℃等〜70〜130℃;等〜
60〜100℃、61〜100℃等〜70〜100℃である。
ermo−Q50T−K91Aの完全なアミノ酸配列と、少くとも48%、好ま
しくは少くとも50,52,55,60,62,65,67,70,73,75
,77,80,82,85,88,90,92,95,98又は99%の類似性
又は相同性、好ましくは同一性の程度を示す。
アラインメントプログラムを用いても決定することができる。好ましいアライン
メントプログラムは、GCGバージョン8プログラムパッケージに供されるGA
P(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Ge
netics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)
である(Needleman, S.B.及びWunsch, C.D., (1976), Journal of Molecular Bi
ology, 48, 443〜453も参照のこと)。ポリペプチド配列比較のために次の設定 :3.000のGAPウエイト及び0.100のGAPレングスウエイトでGA
Pを用いる。
ile Up (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994
, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53
711)を用いて多重配列アラインメントを行うことができる。 プログラムGAPを用いて、いくつかの選択されたフィターゼは、共通フィタ
ーゼ−10−thermo(3)−Q50T−K91Aアミノ酸配列に対して以
下の割合の類似性(括弧内は同一性)を示す。
ず、例えばSDS−PAGEにより測定して、少くとも約20%純度、好ましく
は少くとも約40%純度、より好ましくは約60%純度、更により好ましくは約
80%純度、最も好ましくは約90%純度、更に最も好ましくは約95%純度で
ある。
5)のコンセンサスフィターゼ、即ち以下のものである。 (i)そこに記載される方法により得ることができるいずれかの熱安定性フィ
ターゼ; (ii)そのFig.2に示されるアミノ酸配列を含むフィターゼ又はその変異
体もしくはムテイン、好ましくは置換Q50L;Q50T;Q50G;Q50T
−Y51N又はQ50L−Y51Nを含むムテイン。
コンセンサスフィターゼ−1(又は単なるコンセンサスフィターゼ);コンセン
サスフィターゼ−1−thermo(3);コンセンサスフィターゼ−1−Q5
0T;担子菌コンセンサス(又は単なる担子菌);コンセンサスフィターゼ−1
0(又はFcp10);コンセンサスフィターゼ11(又はコンセンサス配列1
1);コンセンサスフィターゼ−1−thermo(8)−Q50T−K91A
;コンセンサスフィターゼ−1−thermo(8)−Q50T;コンセンサス
フィターゼ−1−thermo(8);コンセンサスフィターゼ−10−the
rmo(3)−Q50T−K91A;コンセンサスフィターゼ−10−ther
mo(3)−Q50T(時折、“(3)”はこの表現から削除される);アスペ
ルギルス・フミガトウスATCC 13073フィターゼα−変異体;アスペル
ギルス・フミガトウスATCC 13073フィターゼα−変異体+変異E59
A,S126N,R329H,S364T,G404A;アスペルギルスフミガ
トウスATCC 13073フィターゼα−変異体+変異E59A,K68A,
S126N,R329H,S364T,G404A;コンセンサスフィターゼ−
7;コンセンサスフィターゼ−12。
特に次の置換:Q50L,T,G;Q50L−Y51N;Q50T−Y51Nの
うちの1又は複数を含むもの。 用語“植物”は、全体の植物自体ばかりでなく、植物の部分又は器官、例えば
葉、種子又は穀粒、茎(幹)、根、塊茎、花、カルス、果実等;組織、細胞、プ
ロトプラスト等;並びにそれらのいずれかの組合せ又はサブコンビネーションを
含むことを意図する。植物組織培養物及び植物細胞系並びに植物プロトプラスト
は特に本明細書に含まれる。
物、並びにその遺伝子改変を保持しているその子孫及び繁殖材料である。好まし
くは、トランスジェニック植物は組換え遺伝子技術により祖先の植物に導入され
た少くとも1の特定の遺伝子を含む。 本発明は、熱安定性フィターゼをコードするDNA構成物を含むトランスジェ
ニック植物に関する。
コードするDNA構成物を含むことを特徴とする植物群である。この植物群のメ
ンバーは、極めて十分に個性を有するが、熱安定性フィターゼDNA構成物の共
通の特徴的な特徴により他の品種から明確に区別できる。 従って、本教示は、1超の植物品種に適用できる。天然の植物品種は本発明の
植物の中に含まれない。
その変異体;トランスジェニック植物種、トランスジェニック植物属、トランス
ジェニック植物科、及び/又はトランスジェニック植物月に関する。より好まし
くは、植物品種自体はディスクレームされる。 本発明において、いずれの熱安定性フィターゼも、例えばいずれかの野生型フ
ィターゼ、遺伝子操作されたフィターゼ、コンセンサスフィターゼ、フィターゼ
ムテイン、及び/又はフィターゼ変異体を用いることができる。遺伝子操作され
たフィターゼは、これらに限らないが、部位特異的変異誘発遺伝子シャッフリン
グ、ランダム変異誘発等により調製されたフィターゼを含む。
及び微生物源を含むいずれのソースのものであってもよく、慣用的な方法により
これらのソースから単離することができる。好ましくは、ヌクレオチド配列は微
生物、例えば真菌、例えばイーストもしくは糸状菌又は細菌から得られる。熱安
定性フィターゼをコードするDNA配列は、当該技術分野で公知の種々の方法を
用いてそれを生産する細胞から単離することができる(例えばWO98/284
09及びEP0897985を参照のこと)。
ターゼをコードするヌクレオチド配列は、いずれの方法でも、例えば実施例3及
びEP0897985に記載される方法で調製することができる。 本発明の植物において熱安定性フィターゼの発現を行うために、フィターゼを
コードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列の発現を指示することが
できる調節要素又は配列を含む発現構成物に挿入され、必要又は要求に応じて、
遺伝子産物の分泌を指示し、又は植物の種子への遺伝子産物のターゲッティング
を指示する。
問題の植物内で転写を媒介することができる好適なプロモーターに作用可能に連
結される。プロモーターは、誘導性プロモーターでも構成的プロモーターでもよ
い。典型的には、誘導性プロモーターは組織特異的又は成長段階特異的様式で転
写を媒介し、構成的プロモーターは全ての細胞組織において持続的転写を供する
。本発明のために役立つ好適な構成的プロモーターの例は、カリフラワーモザイ
クウイルス35Sプロモーターである。アグロバクテリウムの腫瘍誘導性プラス
ミド(Ti)からの転写開始配列、例えばオクトパインシンターゼ、ノパリンシ
ンターゼ、又はマンノパインシンターゼイニシエーターは好ましい構成的プロモ
ーターの更なる例である。
種子においてα−アミラーゼを発現するプロモーター(Stefanovら、Acta Biolo
gica Hungarica Vol. 42, No.4 pp. 323〜330 (1991))、グルテリン、プロラミ ン、グロブリン又はアルブミンのようなコメ種子貯蔵タンパク質をコードする遺
伝子のプロモーター(Wuら、Plant and Cell Physiology Vol. 39, No.8 pp. 88
5〜889 (1998))、レグミンB4からのソラマメ(Vicia faba)プロモーター及びC
onrad Uら、Journal of Plant Physiology Vol. 152, No.6 pp. 708〜711 (1998
)に記載されるソラマメからの未知の種子タンパク質遺伝子、ブラシカ・ナプス (Brassica napus)からの貯蔵タンパク質napAプロモーター、又は例えばW O91/14772に記載されるような当該技術分野で知られているいずれかの
他の種子特異的プロモーターがある。
素を用いることが要求される。例えば、プロモーターエンハンサーは、プロモー
ターとアミラーゼ遺伝子との間に置かれたイントロンであり得る。イントロンは
、単子葉植物又は双子葉植物由来のものであってよい。例えば、イントロンは、
コメWaxy(Wx)遺伝子からの最初のイントロン(Liら、Plant Science Vo
l. 108, No.2, pp. 181〜190 (1995))、トウモロコシUbi1(Ubiquitin)遺 伝子からの最初のイントロン(Vainら、Plant Cell Reports Vol. 15, No.7, pp
. 489〜494 (1996))又はAct1(アクチン)遺伝子からの最初のイントロンで
あり得る。双子葉植物イントロンの一例として、chsAイントロン(Vainら、
前掲)が言及される。また、種子特異的エンハンサーは、種子内での熱安定性フ
ィターゼの発現を増加させるために用いることができる。種子特異的エンハンサ
ーの例は、Vandergeest and Hall, Plant Molecular Biology Vol. 32, No.4, p
p 579〜588 (1996)により開示されるマメ(Phaseolus vulgaris)の主要種子貯蔵
タンパク質をコードするβ−ファセオリン遺伝子由来のものである。
のような熱安定性フィターゼのシグナル転写ターミネーションに対するターミネ
ーター配列を含む。 上手く形質転換された植物の選択のために、発現構成物は、好ましくは1又は
複数の選択マーカー、例えば抗生物質耐性選択マーカー又は除草剤に対する耐性
を供する選択マーカーも含む。1つの広く用いられる選択マーカーは、カナマイ
シン耐性を供するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(NPTII)
である。他の適切なマーカーの例は、測定可能な酵素活性、例えばジヒドロ葉酸
レダクターゼルシフェラーゼ、及びb−グルコロニダーゼ(GUS)を供するマ
ーカーを含む。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼは、除草剤ba
sta又はbialaphosと組み合わせて選択マーカーとして用いることが
できる。
調製することができる。用いる形質転換法は、形質転換すべき植物種に依存する
であろう。それは当該技術分野で知られている形質転換法のいずれか、例えば、
アグロバクテリウム媒介形質転換(Zambryskiら、EMBO Journal 2, pp 2143〜21
50, 1993)、パーティクルボンバードメント、エレクトロポレーション(Fromm ら1986, Nature 319, pp 791〜793)、及びウイルス媒介形質転換から選択するこ
とができる。単子葉植物の形質転換のため、胚形成細胞系又は培養した胚のパー
ティクルボンバードメント(即ちbiolistic形質転換)が好ましい。以
下に、種々の植物を形質転換するための種々の方法を開示する引用文献を列記す
る:コメ(Cristouら、1991, Bio/Technology 9, pp. 957-962)、トウモロコシ (Gordon-Kammら、1990, Plant Cell 2, pp. 603-618)、オート(Somersら、199
2, Bio/Technology 10, pp 1589-1594)、コムギ(Vasilら、1991, Bio/Technolo
gy 10, pp. 667-674, Weeksら、1993, Plant Physiology 102, pp. 1077-1084) 及びオオムギ(Wan及びLemaux 1994, Plant Physiology 102, pp. 37-48, revie
w Vasil 1994, Plant Mol. Biol. 25, pp 925-937)。
: 熱安定性フィターゼを有するベクターシステムを作製する。ベクターシステム
は、1つのベクターから構成されるが、2つのベクターから構成されてもよい。
2つのベクターの場合、ベクターシステムはバイナリーベクターシステムと呼ば
れる(Gynbeung Anら (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manu
al A3, 1〜19)。
テリウムの両方のための複製の起点並びに細菌の選択マーカーからなる。アグロ
バクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)からのTiプラス
ミドから又はアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)か らのRiプラスミドからの右及び好ましくは左ボーダーも植物の形質転換のため
に必要である。それらボーダー間に、熱安定性フィターゼ遺伝子及び好適な調節
配列、例えばプロモーター及びターミネーター配列を含む発現構成物がおかれる
。更に、選択遺伝子、例えばトランスポゾンTn5からのネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼタイプII(NPTII)遺伝子及びリポーター遺伝子、例えばG
US(β−グルクロニダーゼ)遺伝子がそれらボーダーの間にクローン化される
。ビルレンス遺伝子を含むヘルパープラスミドを有するジスアームトアグロバク
テリウム株が上述のベクターで形質転換される。次にその形質転換されたアグロ
バクテリウム株が植物形質転換のために用いられる。
物を調製する方法であって、(i)1つの熱安定性フィターゼをコードする1つ
のヌクレオチド配列を単離し;(ii)(i)のヌクレオチド配列を、1つの選択
された宿主植物中で該ヌクレオチド配列の発現を媒介することができる1つの発
現構成物中に挿入し、そして(iii)前記選択された宿主植物を前記発現構成物 で形質転換するステップを含む方法にも関する。
た上述の方法も本発明に含まれる。 この方法は本質的に非生物学的方法である。 いずれの植物が選択された宿主植物であってもよい。より詳しくは、植物は、
双子葉植物でも単子葉植物でもよい。主に関心があるのは潜在的な食物又は飼料
成分であるような植物である。これらの植物はフィチン酸を含み得る。単子葉植
物の例はグラス、例えばメドーグラス(meadow grass)(ブルーグラス、Poa )、飼草、例えばフェスキュ(festuca)、ライグラス(lolium)、テンペレート グラス(temperate grass)、例えばヌカボ(Agrostis)、及び穀物、例えばコム ギ、オート、ライムギ、オオムギ、コメ、モロコシ属植物及びトウモロコシ(コ
ーン)である。
ダイズ、並びにアブラナ科植物、例えばカリフラワー、脂肪種子ナタネ及び密接
に関連したモデル生物アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)であ る。 特に関心あるのは、単子葉植物、特に作物又はシリアル植物、例えばコムギ(
Triticum、例えばaestivum)、オオムギ(Hardeum、例えばvulgare)、オート、ラ
イムギ、コメ(イネ)、モロコシ属植物及びコーン(Zea、例えばmays)である。
料成分である。 実施例 実施例1 FYTアッセイ−フィターゼ酵素調製物の分析について フィターゼ活性は、以下のアッセイを用いて測定することができる:10μL
の希釈酵素サンプル(0.1M酢酸ナトリウム、0.01% Tween 20
、pH5.5に希釈)を、250μLの0.1M酢酸ナトリウム、0.01% T
ween 20、pH5.5中の5mMフィチン酸ナトリウム(Sigma)に加え
(フィチン酸ナトリウムを溶かした後にpHを調節;基礎を予備加熱)、37℃で
30分、インキュベートした。250μLの10% TCAを加えることにより
反応を停止し、100mLモリブデート試薬(8mL H2SO4中2.59g(NH 4 )6Mo7O24・4H2Oを250mLに希釈)中の7.3g FeSO4を500 μL加えることにより遊離ホスフェートを測定する。750nmでの吸光度を96
ウエルプレートマイクロタイタープレート内の200μLサンプルで測定する。
基質及び酵素ブランクを含める。ホスフェート標準曲線も含める(0〜2mMホス
フェート)。1FYTは所定の条件下で分当りに1μmolのホスフェートを遊離 する酵素の量に等しい。このアッセイは、他の飼料成分との混合物でない場合の
)フィターゼ酵素調製物のために好ましい。
出発濃度5mM)で、分当り1μmolのホスフェートと等価のホスフェートを放出 する酵素の量として定義される。
ゼ活性測定のために好ましい。 試薬/基質 飼料のための抽出緩衝液等 この緩衝液は、PO4−標準の調製及びプレミックスサンプルの更なる希釈の ためにも用いる。
l)。例えばMerck Art 46267及びリッター当り0.1gのTw een 20、例えばMerck Art 22184をはかりとる。 酢酸ナトリウムを脱塩水に溶かす。
6267。 リッター当り0.1gのTween 20、例えばMerck Art 22
184。 リッター当り30gのEDTA、例えばMerck Art 8418。
Art A−9647。 成分を脱塩水に溶かし、pHを酢酸で5.50±0.05に調節する。
トリウムに溶かす。
k Art 6267を計量し、脱塩水に溶かし、pHを酢酸で5.50±0.0
5に調節する。
釈した)酢酸の添加は溶解速度を増加させる。 pHを酢酸で5.50±0.05に調節する。 全量まで0.22M酢酸緩衝液を加える。
4H2O、例えばMerck Art 1182を脱塩水に溶かす。10mLの2 5%NH3を加える。 脱塩水を1リッターまで加える。 0.24%バナジン酸アンモニウム Bie & Berntsenから購入 モリブデン酸1バナジン酸停止溶液 1部のバナデート溶液(0.24%、バナジン酸アンモニウム)+1部のモリ
ブデート溶液を混合する。2部の21.7%硝酸溶液を加える。
液を選択し、Tweenを含む1000mLの0.22M酢酸緩衝液に溶かす。e
nclosurelを参照のこと。最も近い溶液容量までくり返す。
ダーで粉砕し、次に風袋ビーカーに入れる。サンプル重量を記録する。非ペレッ
ト化サンプルを粉砕することは必要でない。サンプルが大きすぎて扱えないなら
、それは約100gの部分に割る。 磁石をビーカーに入れ、Tweenを含む0.22M酢酸緩衝液を加える。
サンプルをとる。サンプルを溶液の表面下2〜5cmでとり、遠心ガラスに入れて
ふたでおおう。 サンプルを10分、4000rpmで遠心する。
。最も近い溶液容量までくり返す。 サンプルを計量したなら(50〜100g)、全てのサンプルを風袋ビーカー
に入れる。サンプル重量を記録する。サンプルが大きすぎて扱えないなら、それ
を約100gの部分に割る。
5mLサンプルをとる。溶液の表面下2〜5cmでサンプルをとり、遠心ガラスに入
れ、それをふたでおおう。
テストチューブに入れ、各々のチューブに磁石を入れる。 全てのサンプルを準備したなら、それらを撹拌しながら水浴に入れる。
60分) サンプルを1分、又はそれ超撹拌する。
入れ、磁石を各々のチューブに入れる。
液(試薬ブラインド)もとる。 A415を全てのサンプルで測定する。 計算 FTU/g=μmol PO4 3-/(min×g(サンプル)) Cgのサンプルを計算する(粉砕後)。
μmol/mmol}/t t=インキュベーション時間(分) Vol=サンプル容量(リッター)=0.0001リッター 1000=mmolからμmolへの変換因子 FTU/gprove={(x−b)×Vol×1000×Fp}/{a×t×C} C=計ったサンプルのグラム Fp=採取したサンプルと全サンプル(抽出後)との間の関係。例:1000m
Lから0.100mLを採取→Fp=1000/0.100=10000。
{a×60×C} 実施例3 種々のフィターゼの至適温度及び融点Tmの測定 種々のフィターゼの熱安定性、即ち融解温度Tm及び/又は至適温度を測定し
た。
及びvan Hartingsveldtら(Gene, 127, 87〜94, 1993)に記載されるように調製 した。 アスペルギルス・フミガトウスATCC 13073、アスペルギルス・テル
レウス9A−1、アスペルギルス・テルレウス・CBS 116.46、アスペ
ルギルス・ニジュランス、マイセニオフトラ・サーモフィラ、及びタラロマイヤ
ス・サーモフィルスのフィターゼをEP−0897985及びその中の引用文献
に記載される通り調製した。
0TはEP0897985に示され、それに記載されるように調製した。 コンセンサスフィターゼ−10は、EP−0897985の教示に従って得て
、調製した。(各々Examples1−2及び3−7)が、その図1のアライ
ンメントに加えて、サーモマイセス・ラヌギノサ(Thermomyces lanuginosa)の フィターゼ配列(Berkaら、Appl. Environ Microbiol. 64, 4423〜4427, 1998) 及び担子菌コンセンサス配列(以下に記載の通り誘導)を調製した−A.ニゲル
T213の配列を省略し、残りのA.ニゲルフィターゼ配列について0.58vo
te weightを割り当てる。コンセンサスフィターゼ−10の配列の誘導化を図7 に示す。
シグナルペプチドを除く)成熟フィターゼの最初のアミノ酸残基で開始して、W
O98/28409の5の担子菌フィターゼから得ることもできる。0.5のボ
ート・ウエイト(vote weight)を2つのPaxillusフィターゼに割り当て
、全ての他の遺伝子を1.0のボート・ウエイトで用いた。図6を参照のこと。
ーゼ−10−thermo−Q50T−K91A(図10)及びコンセンサスフ
ィターゼ−10−thermo−Q50Tを、3つの復帰突然変異K94A,V
158I及びA396S(“thermo(3)”又は“thermo”)並び
に適用できるなら変異Q50T又はQ50T−K91Aも導入することにより、
EP−0897985のExample 5〜8と同様に、コンセンサスフィタ
ーゼ−10から調製した。
ィターゼ−1−thermo(8)−Q50T−K91A(図9)及びコンセン
サスフィターゼ−1−thermo(8)−Q50Tを、8つの変異E58A,
D197N,E267D,R291I,R329H,S364T,A379K及
びG404A(“thermo(8)”)並びに適用可能なら、変異Q50T又
はQ50T−K91Aも導入することにより、EP−0897985のExam
ple 8と同様に、コンセンサスフィターゼ−1から調製した。
V158I及びA396Sの導入によりコンセンサスフィターゼ−1から調製し
た。 アスペルギルス・フミガトウスのいわゆるα−変異体(Q51(27)T,E
55Y,V100I,F114Y,A243L,S265P,N294D)及び
表1に示すその更なるムテインを全般的に上述されるように調製した。位置番号
は、その図11をいう。但し、括弧内の番号はEP0897010に用いられる
番号をいう。
985の教示に従って調製することができる。その植物内での発現のために、そ
の記載を引用する。 フィターゼの非ホールディング温度又は融解温度Tmを決定するために、示差
走査熱量測定を、Bruggerら (1997) : "Thermal denaturation of phytases and
pH 2.5 acid phosphatase studied by differential scanning calorimetry,"
in The Biochemistry of phytate and phytase (eds. Rasmussen, S.K; Raboy,
V.; Dalboge, H. and Loewus, F.; Kluwer Academic Publishers)により以前に 公開されるように適用した。
10mM酢酸ナトリウムpH5.0に対して大量に透析した。10℃/分の一定の加
熱速度を90〜95℃まで適用した。 上述のフィターゼに基づくTm測定の結果を以下の表1に示し;所定のフィタ
ーゼについては図1〜4にも示す。
フィターゼ活性を、基本的にMitchellら(Microbiology 143, 245〜252, 1997) に記載されるように決定した:その活性は、200mM酢酸ナトリウムpH5.0中
0.5%フィチン酸(約5mM)を含むアッセイ混合物中で測定した。37℃で1
5分のインキュベーションの後、等量の15%トリクロロ酢酸を加えることによ
り停止させた。その遊離したホスフェートを、そのアッセイ混合物100μLを
900μLのH2O及び1mLの0.6M H2SO4、2%アスコルビン酸及び0 .5%モリブデン酸アンモニウムと混合することにより定量した。リン酸カリウ
ムの標準溶液を引用として用いた。酵素活性の1ユニットを37℃で1分当りに
1μmolのホスフェートを遊離する酵素の量として定義した。タンパク質濃度を 、Paceら(Prot. Sci. 4, 2411〜2423, 1995)に従って計算した280mmでの酵 素吸光係数を用いて決定した:コンセンサスフィターゼ、1.101;コンセン
サスフィターゼ7、1.068;コンセンサスフィターゼ10、1.039。
定の温度で5分、プレインキュベートした。酵素に基質溶液を加えることにより
反応を開始した。15分のインキュベーションの後、その反応をトリクロロ酢酸
で停止させ、遊離したホスフェートの量を測定した、フィターゼ活性対温度をプ
ロットし、至適温度を活性がその最大値に達する温度として決定する。
定(DSC)チャートである。
ィターゼ−10−thermo−Q50T−K91AのDSCである。
サスフィターゼ−1−thermo〔8〕−Q50T−K91AのDSCである
。
体からのフィターゼのDSCである。
の担子菌フィターゼを、各々の担子菌配列について0.2のアサインド・ボート
・ウエイト(assigned vote weight)を用いて独立した配列として用いた;なお 更にA.ニゲル(A. niger)のアミノ酸配列を用いた)。
NA及びアミノ酸配列である。
DNA及びアミノ酸配列である。
である。
K,D164S,P201S,G203A,G205S,H212P,G224
A,D226T,E255T,D256E,V258T,P265S,Q292
H,G300K,Y305H,A314T,S364G,M365I,A397
S,S398A,G404A、及びA405Sを含むコンセンサスフィターゼの
DNA及びアミノ酸配列である。
Claims (14)
- 【請求項1】 動物の飼料を調製する方法であって、該方法が、飼料成分の
アグロメレーションを含み、ここで該アグロメレーションの前又は間に熱安定性
フィターゼが添加されることを特徴とする方法。 - 【請求項2】 前記飼料成分が少くとも65℃の温度に加熱されることを特
徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記熱安定性フィターゼが、DSCのために10℃/分の一
定の加熱速度を用いて、少くとも65℃のDSCにより測定したTmを有するフ
ィターゼであることを特徴とする請求項1〜2のいずれかに記載の方法。 - 【請求項4】 フィードエキスパンダーで行うことを特徴とする請求項1〜
3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 エクストルーダーで行うことを特徴とする請求項1〜3のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項6】 ペレットプレスで行うことを特徴とする請求項1〜3のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項7】 前記熱安定性フィターゼがトランスジェニック植物中に存在
することを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 請求項1〜7のいずれかに記載の方法であって、前記アグロ
メレーションが、 (a)飼料成分を少くとも45℃の温度に予備加熱するステップと、 (b)ステップ(a)の産物を少くとも65℃の温度に加熱するステップと、
を含み、前記熱安定性フィターゼをステップ(a)及び/又は(b)の前に又は
その間に添加することを特徴とする方法。 - 【請求項9】 熱安定性フィターゼをコードするDNA構成物を含むトラン
スジェニック植物。 - 【請求項10】 前記熱安定性フィターゼをコードするDNA構成物が、前
記植物の少くとも一部分内のフィターゼコーディング配列の発現を媒介すること
ができる調節配列に作用可能に連結されていることを特徴とする請求項9に記載
のトランスジェニック植物。 - 【請求項11】 植物の少くとも一部分内のフィターゼコーディング配列の
発現を媒介することができる調節配列に作用可能に連結された熱安定性フィター
ゼをコードするDNA構成物を含む発現構成物。 - 【請求項12】 請求項11に記載の発現構成物を含むベクター。
- 【請求項13】 熱安定性フィターゼを発現することができるトランスジェ
ニック植物を調製する方法であって、 (i)熱安定性フィターゼをコードするヌクレオチド配列を単離するステップ
と、 (ii)前記(i)のヌクレオチド配列を、選択された宿主植物内の前記ヌクレ
オチド配列の発現を媒介することができる発現構成物内に挿入するステップと、 (iii)前記選択された宿主植物を前記発現構成物で形質転換するステップと 、 を含む方法。 - 【請求項14】 前記植物から前記フィターゼを抽出するステップを更に含
む請求項13に記載の方法。
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