JPH11146791A - コンセンサスフィターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 改良された特性、特に熱安定性に関して改良
された特性を有するフィターゼのクローニング、発現お
よび精製に関する方法を提供する。 【解決手段】 （ａ）標準的アラインメントプログラム
により定義されたタンパク質群の少なくとも３、好まし
くは４のアミノ酸配列をアラインさせ；（ｂ）同位置に
あるアミノ酸をそれらの進化的類似度について比較する
などし；（ｃ）定義された位置に共通のアミノ酸が同定
されない場合、そのようなすべての配列の任意のアミノ
酸、好ましくは最高頻度のアミノ酸を選択し；コンセン
サス配列を定義してあるのであれば、これをＤＮＡ配列
へと逆翻訳し；（ｅ）該ＤＮＡ配列を合成し、宿主細胞
を形質転換し;（ｆ）形質転換された宿主細胞を増殖さ
せ、コンセンサスタンパク質を単離することを含む方
法、これによって得られたコンセンサスタンパク質、な
らびにこれを含む食品、飼料または医薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術】フィターゼ（ｍｙｏ−イノシトール六リ
ン酸ホスホヒドロラーゼ；ＥＣ３．１．３．８）は、フ
ィチン酸（ｍｙｏ−イノシトール六リン酸エステル）を
ｍｙｏ−イノシトールと無機リン酸とに加水分解する酵
素であり、有用な飼料添加物であることが知られてい
る。

【０００２】フィターゼは、１９０７年に米のふすま中
で最初に記載され〔Suzuki et al.,Bull. Coll. Agr. T
okio Imp. Univ. 7, 495 (1907)〕、アスペルギルス属
の一種からのフィターゼは、１９１１年に記載された
〔Dox and Golden, J. Biol. Chem. 10, 183-186 (191
1)〕。フィターゼは、小麦のふすま、植物の種子、動物
の腸、および微生物にも認められている〔Howsen and D
avis, Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382 (1983)；L
ambrechts et al., Biotech. Lett. 14, 61-66 (199
2)；Shieh and Ware, Appl. Microbiol., 16, 1348-135
1 (1968)〕。

【０００３】Aspergillus niger（ficuum）由来のフィ
ターゼのクローニングおよび発現は、Gene, 127, 87-94
(1993)にVan Hartingsveldtらによって、また欧州特許
公開第４２０ ３５８号明細書にも記載され、Aspergil
lus niger var. awamori由来のフィターゼのクローニン
グおよび発現は、Gene, 133, 55-62 (1993)にPiddingto
nらによって記載されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】改良された特性を有す
るフィターゼのクローニング、発現および精製は、欧州
特許公開第６８４ ３１３号明細書に記載されている。
しかし、特にその熱安定性に関して、更に改良されたフ
ィターゼに対する需要が依然として存在することから、
下記の方法を提供することが本発明の目的であるが、こ
の方法は、フィターゼに限らず適用できる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、コンセンサス
タンパク質を製造する方法であって、そのような方法
は、下記の段階： （ａ）公知の任意の標準的アラインメント（alignmen
t）プログラムにより、定義されたタンパク質群の少な
くとも３、好ましくは４のアミノ酸配列をアライン（al
ign）させる段階と； （ｂ）そのようなアラインメントにより同位置にあるア
ミノ酸を、公知の任意の標準的プログラムによりそれら
の進化的類似度について比較する一方、対応する位置の
アミノ酸の決定に用いられるアミノ酸の最小の類似度を
定義するようなプログラムによって提供される類似度の
程度を、より緊縮でない数に設定し、対応する位置で２
のみの同一なアミノ酸から、コンセンサスタンパク質の
ためのアミノ酸を該プログラムが決定できるような方法
でパラメータを設定するが、比較されるアミノ酸配列の
うちに、残余の配列に対するよりもはるかに高い程度の
類似度を相互に示す配列があるならば、これらの配列
を、コンセンサスタンパク質のコンセンサス配列につい
ての本方法と同じ方法で定義されたように決定されたそ
れらのコンセンサス配列によって表すか、またはそのよ
うな配列の数で１を除した票の重み（vote weight）
を、これらの配列のそれぞれに割り当てる段階と； （ｃ）定義された位置に共通のアミノ酸が該プログラム
によって決定されない場合、比較に用いたすべての配列
の任意のアミノ酸、好ましくはそのようなすべての配列
で最高頻度のアミノ酸を選択するか、または実施例２に
示した考慮に基づいてアミノ酸を選択する段階と； （ｄ）コンセンサス配列を定義してあるのであれば、そ
のような配列を、好ましくは発現を行う生物のコドン頻
度表を用いることによって、ＤＮＡ配列へと逆翻訳する
段階と； （ｅ）公知の方法により該ＤＮＡ配列を合成し、適切な
発現ベクターに組み込んでか、またはそれ自体により、
適切な宿主細胞を形質転換させるために用いる段階と； （ｆ）形質転換された宿主細胞を適切な培養条件下で増
殖させ、コンセンサスタンパク質を公知の方法によって
該宿主細胞またはその培地から単離する段階とを含む方
法に関する。

【０００６】本方法の好適な実施態様では、段階（ｂ）
は、下記のとおりに定義することもできる。： （ｂ）そのようなアラインメントにより同位置にあるア
ミノ酸を、公知の任意の標準的プログラムによりそれら
の進化的類似度について比較する一方、そのようなプロ
グラムによって提供される類似度の程度を、出来る限り
最低の値に設定し、比較に用いた配列の少なくとも半数
について最も類似するアミノ酸を、コンセンサスタンパ
ク質のアミノ酸配列中の対応する位置について選択する
段階。

【０００７】この方法全体の好適な実施態様は、高度に
相同である多数の配列からある配列を選択し、このタン
パク質群のコンセンサス配列とは明らかに異なるアミノ
酸残基のみを、中程度の緊縮条件下で算出して置き換え
るが、中程度の緊縮条件下で本方法がアミノ酸を決定で
きないアラインメントのすべての位置で、好適な配列の
アミノ酸を対象とする方法において認められる。

【０００８】定義された位置のアミノ酸をそれらの進化
的類似度について比較するのに用いるプログラムが、
「ＰＲＥＴＴＹ」というプログラムであるような方法を
提供することは、本発明の更なる目的である。定義され
たタンパク質群が、フィターゼ群である、特に該フィタ
ーゼが、真菌起源のものであるような方法を提供するこ
とは、より詳細に、本発明の目的である。

【０００９】宿主細胞が真核生物、特に真菌、好ましく
はAspergillus属または酵母、好ましくはSaccharomyces
属またはHansenula属起源のものであるような方法を提
供することが、更に本発明の目的である。

【００１０】そのような方法によって得ることができ
る、または得られたコンセンサスタンパク質、詳細には
図５〜図７に示したアミノ酸配列を有するコンセンサス
タンパク質、またはその変異型もしくは突然変異タンパ
ク質を提供することも、本発明の目的である。「変異
型」とは、本発明の文脈では、図５〜図７に示したアミ
ノ酸配列を有するコンセンサスタンパク質であって、一
ヶ所またはそれ以上の位置においてアミノ酸が欠失、付
加、または一つもしくはそれ以上の他のアミノ酸で置換
されている（ただし、得られる配列は、酵素活性（種類
および特異的活性）、熱安定性、一定のpH範囲内での活
性（pH安定性）のようなその基本的特性が有意に変えら
れていないタンパク質をもたらす）コンセンサスタンパ
ク質を意味する。「有意に」とは、本文脈では、当業者
が、変異型の特性は、図５〜図７のアミノ酸配列自体を
有するコンセンサスタンパク質のそれとはなおも異なる
が、非自明ではないとすると思われることを意味する。

【００１１】突然変異タンパク質とは、本発明の文脈で
は、図５〜図７に示したコンセンサスタンパク質のアミ
ノ酸配列中のアミノ酸が置換され、それにより、更に改
良された特性、例えば活性を有するコンセンサスタンパ
ク質が得られることを意味する。そのような突然変異タ
ンパク質は、欧州特許公開第９７８１０１７５．６号明
細書に示された教示、例えばＱ５０Ｌ、Ｑ５０Ｔ、Ｑ５
０Ｇ、Ｑ５０Ｌ−Ｙ５１Ｎ、Ｑ５０Ｔ−Ｙ５１Ｎまたは
Ｑ５０Ｌ−Ｑ５１Ｎに基づいて定義かつ調製することが
できる。「Ｑ５０Ｌ」とは、本文脈では、アミノ酸配列
の第５０位で、アミノ酸Ｑがアミノ酸Ｌに置き換えられ
ていることを意味する。

【００１２】加えて、上記に定義されたコンセンサスタ
ンパク質を含む食品、飼料または医薬組成物も、本発明
の目的である。

【００１３】本文脈で、「そのように定義されたタンパ
ク質群の少なくとも３、好ましくは４のアミノ酸配列」
とは、コンセンサスタンパク質のアミノ酸配列を生成す
るためのアラインメントおよび比較に、３、４、５、６
ないし１２、２０、５０またはそれ以上の配列を用いる
ことができることを意味する。「定義されたタンパク質
群の配列」とは、αヘリックス、β−シートおよび−タ
ーンが同位置にあるために、このような構造が、当業者
が称するように、スーパーインポーザブルであるよう
な、三次元構造にそのような配列が折りたたまれること
を意味する。その上、これらの配列により、同じ型の生
物学的活性、例えば定義された酵素クラス、例えばフィ
ターゼの活性を示すようタンパク質が特徴付けられる。
当業界では公知のとおり、そのような配列の一つの三次
元構造は、そのような群の他の配列の構造のモデリング
を可能とする。これをどのように実施できるかの一例
は、本願の参考実施例に示す。本発明の文脈での「進化
的類似度」とは、アミノ酸をそれらの構造的類似度につ
いて分類することによって、一つのアミノ酸をもう一つ
のアミノ酸に、全体的構造に対する影響は最少のまま置
換することを可能とするスキームを意味し、それは例え
ば、当業界に公知の「ＰＲＥＴＴＹ」のようなプログラ
ムによってなされるとおりである。語句「そのようなプ
ログラムによって提供される類似度の程度を．．．より
緊縮ではない数に設定する」とは、本発明の文脈では、
本発明の実施に用いるプログラムでの類似度の程度を決
定するパラメータの値を、このプログラムが、アミノ酸
配列全体の位置の最大値に対する共通のアミノ酸を定義
するのを可能とするような方法で選択することを意味
し、例えばプログラムＰＲＥＴＴＹの場合、ＴＨＲＥＳ
ＨＯＬＤに対しては２または３の値を、ＰＬＵＲＡＬＩ
ＴＹに対しては２という値を選択することができる。更
に、「そのような配列の数で１を除した票の重み」と
は、本発明の文脈では、コンセンサス配列の決定に用い
られる他の配列より高度の類似度を有する配列の群を定
義する配列のみが、この群のすべての配列の数で１を除
したものに等しい係数でそのような決定に寄与すること
を意味する。

【００１４】前述のとおり、該プログラムが最も類似す
るアミノ酸を選択するのを可能としないのであれば、最
も頻度の高いアミノ酸を選択し、これが不可能であるな
らば、当業者は、例えば以下に論じられているように、
タンパク質の熱安定性を改良する特性が当業界に知られ
ている、比較に用いたすべての配列からアミノ酸を選択
するであろう。

【００１５】Janecek, S. (1993), Process Biochem. 2
8, 435-44またはFersht, A.R. & Serrano, L. (1993),
Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 75-83. Alber, T. (19
89), Annu. Rev. Biochem. 58, 765-798またはMatthew
s, B.W. (1987), Biochemistry26, 6885-6888. Matthe
ws, B.W. (1991), Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 17-2
1.

【００１６】酵素の安定性は、多くの工業的応用には決
定的な因子である。したがって、酵素の安定性、好まし
くは熱安定性を、合理的であるか（van den Burg et a
l., 1998）または非合理的（Akanuma et al., 1998）な
手段によって、改良するために多くの試みがなされてお
り、多少の成果を示したものもある。タンパク質の熱安
定性に影響する力は、ペプチド鎖の適正な折りたたみに
寄与するそれと同じである〔疎水性相互作用、ファンデ
ルワールス相互作用、水素結合、塩橋、配座歪み（Matt
hews, 1993）〕。その上、Matthewsら（１９８７）が示
したとおり、折りたたまれていない状態の自由エネルギ
ーも、タンパク質の安定性に影響する。タンパク質の安
定性を高めることは、好都合な相互作用の数および強度
を増加させ、不都合な相互作用の数および強度を減少さ
せることを意味する。ジスルフィド結合を導入して（Sa
uer et al., 1986）グリシンをアラニン残基で置換する
か、またはプロリン含量を増加させて、折りたたまれて
いない状態の自由エネルギーを減少させる（Margarit e
t al., 1992；Matthews, 1987a）ことが可能になってい
る。その他のグループは、タンパク質の安定性のための
追加の水素結合または塩橋の重要性に着目したか（Blab
er et al., 1993）、またはタンパク質内部のキャビテ
ィを満たして、埋められた疎水性表面積およびファンデ
ルワールス相互作用を増大させることを試みた（Karpus
as et al., 1989）。更に、二次構造の要素、特にαヘ
リックスの、例えばらせんのキャッピングの改善による
安定化も研究された（Munoz & Serrano, 1995）。

【００１７】しかしながら、タンパク質の安定性、好ま
しくは熱安定性を増大させると考えられるアミノ酸置換
を特定するための、迅速かつ有望な戦略は皆無である。
共通して、タンパク質の三次元構造については、アミノ
酸置換がタンパク質の折りたたまれた状態を安定化する
可能性のある、分子内の位置を見出す必要がある。この
問題を回避する替わりの方法は、好熱性もしくは高度好
熱性生物中に相同タンパク質を求めるか、またはランダ
ム突然変異誘発法による、安定性を増大させるアミノ酸
置換を探すかのいずれかである。この後者の可能性は、
１０³〜１０⁴回の突然変異においてのみ成功するにすぎ
ず、迅速なスクリーニングが可能である酵素に限定され
る（Arase et al., 1993；Risse et al., 1992）。これ
らすべての取組み法に対して、成功は可変的かつ予測不
能であり、成功するとしても、熱安定性の増大は、ほと
んど常に、きわめてわずかなものであった。

【００１８】ここで、本発明者らは、タンパク質の熱安
定性を改良する替わりの方法を提示する。Imanakaら
（１９８６）は、相同タンパク質の比較により、タンパ
ク質の安定性を増大させた最初の研究者の一員であっ
た。彼等は、好熱性生物からのプロテアーゼと中温生物
の相同なそれとの比較により、中温生物のプロテアーゼ
の安定性を増大させた。Serranoら（１９９３）は、２
種類の相同な中温生物のＲＮアーゼのアミノ酸配列の比
較により、より熱安定なＲＮアーゼを構築した。彼等
は、この二者間で異なるすべての残基を個別に突然変異
させ、複数の突然変異体で安定性を増大させる突然変異
を組み合わせた。Pantolianoら（１９８９）、および特
にSteipeら（１９９４）は、相同タンパク質のアライン
メントのすべての位置で最高頻度のアミノ酸が、タンパ
ク質の安定性に最も寄与すると示唆した。Steipeら（１
９９４）は、免疫グロブリンの可変ドメインについてこ
れを証明したが、Pantolianoら（１９８９）は、より高
い安定性を求めて改良するために選択した酵素の配列が
単一分岐性であるズブチリシンの一次配列中の位置を探
した。彼等の取組みの結果、ズブチリシンのＴ_mを１．
８℃上昇させる置換Ｍ５０Ｆが得られた。

【００１９】Steipeら（１９９４）は、免疫グロブリン
の可変ドメインで、このドメインの一定の位置の最高頻
度のアミノ酸残基を決定する統計的方法を用いるだけ
で、安定化突然変異を６０％以上の成功率で予測できる
ことを証明した。この方法は、抗体の可変ドメインの安
定化ばかりでなく、他のタンパク質のドメインについて
も有用な結果をもたらすであろうことも示唆された。し
かし、この方法が、タンパク質全体に拡大できる可能性
があることは、決して言及されなかった。その上、別個
の位置のアミノ酸残基の頻度を計算するのに用いたプロ
グラムに関して、あるいは本事例のように採点マトリッ
クスを用いたか否かに関しては、何も述べられていな
い。

【００２０】したがって、いわゆるコンセンサスタンパ
ク質のほとんど全位置についてアミノ酸残基を計算し、
原核または真核生物の発現系で発現させ得る完全な遺伝
子をこの配列から合成する方法を含む、コンセンサスタ
ンパク質を製造する方法を提供することが、本発明の目
的である。

【００２１】本発明のＤＮＡ配列は、当業界に公知のタ
ンパク質、例えばフィターゼをコードするゲノムまたは
ｃＤＮＡ配列から出発して構築することができる〔配列
情報については、上記の参考文献、例えば欧州特許公開
第６８４ ３１３号明細書、またはGenbank（Intellige
netics, California, 米国）、European Bioinformatic
s Institute（Hinston Hall, Cambridge, 英国）、ＮＢ
ＲＦ（Georgetown University, Medical Centre, Washi
ngton DC, 米国）およびVecbase（Universityof Wisons
in, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, 米
国）のような配列データベースを参照。またはin vitro
突然変異誘発の方法による数字に開示されている（例え
ば、Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Sprin
g HarborLaboratory Press, New Yorkを参照）。Hurchi
nson およびEdgell〔J. Virol.8, 181 (1971)〕が最初
に概略を述べたように、そのような「位置指定突然変異
誘発」のために広く用いられる戦略は、突然変異を導入
すべき一本鎖ＤＮＡ配列の標的領域への、所望のヌクレ
オチド置換体を有する合成オリゴヌクレオチドのアニー
リングを包含する〔総説についてはSmith, Annu. Rev.
Genet. 19, 423 (1985)を、改良された方法についてはS
tanssen et al., Nucl. Acid Res., 17, 4441-4454 (19
89)の参考文献２〜６を参照〕。所与のＤＮＡ配列を突
然変異させる、本発明の実施にも好適であるもう一つの
可能性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるこ
とによる突然変異誘発である。出発材料としてのＤＮＡ
は、当業界に公知である、例えばSambrookら（Molecula
r Cloning）に記載された方法によって、それぞれの株
から単離することができる。株の情報については、例え
ば欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書、または下記
に示した寄託機関を参照。Aspergillus niger〔ＡＴＣ
Ｃ９１４２〕、Myceliophthora thermophila〔ＡＴＣＣ
４８１０２〕、Talaromyces thermophilus〔ＡＴＣＣ２
０１８６〕およびAspergillus fumigatus〔ＡＴＣＣ３
４６２５〕は、ブダペスト条約の規定により、下記の寄
託番号でアメリカンタイプカルチャーセルコレクション
に再寄託されている：それぞれ、ＡＴＣＣ７４３３７、
ＡＴＣＣ７４３４０、ＡＴＣＣ７４３３８およびＡＴＣ
Ｃ７４３３９。しかし、本発明によるコンセンサスタン
パク質をコードするＤＮＡは、例えば欧州特許公開第７
４７ ４８３号明細書に記載されているような合成法に
より、または当業界で公知の方法によっても調製するこ
とができることは理解される。

【００２２】本発明の完全なＤＮＡ配列が得られたなら
ば、当業界に公知である、例えばSambrookら〔前掲〕に
記載された方法によって、それらをベクターに組み込ん
で、コードされたポリペプチドを適切な宿主系で過剰発
現させることができる。しかし、当業者には、該ＤＮＡ
配列自体を本発明の適切な宿主系を形質転換するのに用
いて、コードされたポリペプチドを過剰発現させること
ができることも公知である。適切な宿主系は、例えば、
Aspergillus属、例えばAspergillus niger〔ＡＴＣＣ９
１４２〕もしくはAspergillus ficuum〔ＮＲＲＬ３１３
５〕、またはTrichoderma属、例えばTrichoderma reese
iのような真菌、あるいはSaccharomyces属、例えばSacc
haromyces cerevisiae、またはPichia属、例えばPichia
pastoris、またはHansenula属、例えばHansenula poly
morpha〔ＤＳＭ５２１５〕のような酵母、あるいは例え
ばPenら、Bio/Technology 11, 811-814 (1994)が記載し
たような植物である。当業者には、そのような微生物
は、寄託機関、例えばアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ＡＴＣＣ）、Centraalbureau voor Schimmel
cultures（ＣＢＳ）もしくはDeutche Sammlung feur Mi
kroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭ）、ま
たは雑誌「Industrial Property」〔（1991）１、２９
〜４０ページ〕に列挙された他の寄託機関から入手でき
ることが公知である。用い得る細菌は、例えば、E. col
i、例えばBacillus subtilisのようなBacillus属、また
はStreptomyces属、例えばStreptomyces lividansであ
る〔例えばFEMS Microbiol. Letters, 114, 121 (1993)
のAnneおよびMallaertを参照〕。用い得ると思われるE.
coliは、E. coli Ｋ１２株、例えばＭ１５〔J. Bacter
iol.120, 466-474 (1974)にVillarejoらがＤＺ２９１と
して記載〕、ＨＢ１０１〔ＡＴＣＣ No.３３６９４〕ま
たはE. coli ＳＧ１３００９〔Gottesman et al.,J. Ba
cteriol. 148, 265-273 (1981)〕である。

【００２３】真菌での発現に用い得るベクターは、当業
界には公知であり、例えば欧州特許公開第４２０ ３５
８号明細書に、あるいはCullenら〔Bio/Technology 5,
369-376 (1987)〕、Ward〔Molecular Industrial Mycol
ogy, Systems and Applications for Filamentous Fung
i, Marcel Dekker, New York (1991)〕、Upshallら〔Bi
o/Technology 5, 1301-1304 (1987)〕、Gwynneら〔Bio/
Technology 5, 71-79(1987)〕、またはPuntら〔J. Biot
echnol. 17, 19-34 (1991)〕によって、酵母については
Sreekrishnaら〔J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (19
88)；Biochemistry 28, 4117-4125 (1989)〕、またはHi
tzemannら〔Nature 293, 717-722 (1981)〕によって、
あるいは欧州特許公開第１８３ ０７０、１８３ ０７
１、２４８ ２２７および２６３ ３１１号明細書に記
載されている。E. coliでの発現に用い得る適切なベク
ターは、例えば、Sambrookら〔前掲〕、またはFiersら
〔Procd. 8^{t h} Int. Biotechnology Symposium, Soc. Fr
anc. de Microbiol., Paris, (Durand et al., eds.),
pp.680-697〕、もしくはBujardら〔Methods in Enzymol
ogy, eds. Wu and Grossmann, Academic Press, Inc. V
ol. 155, 416-433(1987)〕、およびSteuberら〔Immunol
ogical Methods, eds. Lefkovits and Pernis, Academi
c Press, Inc., Vol. IV, 121-152 (1990)〕によって言
及されている。Bacillusでの発現に用い得るベクター
は、当業界に公知であり、例えば、欧州特許公開第４０
５ ３７０号明細書に、YansuraおよびHennerによってP
rocd. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984)に、Meth.
Enzymol. 185, 199-228 (1990)、または欧州特許公開
特許第２０７ ４５９号明細書に記載されている。H.po
lymorphaでの発現に用い得るベクターは、当業界に公知
であり、例えばGellissen et al., Biotechnology 9, 2
91-295 (1991)に記載されている。

【００２４】そのようなベクターは、調節要素、例えば
プロモーターを既に保有しているか、または本発明のＤ
ＮＡ配列は、そのような要素を含むように操作すること
ができるかのいずれかである。用い得る適切なプロモー
ター要素は、当業界に公知であり、例えば、Trichoderm
a reeseiに対してはｃｂｈ１〔Haarki et al., Biotech
nology 7, 596-600 (1989)〕またはｐｋｉ１〔Schindle
r et al., Gene 130,271-275 (1993)〕プロモーターで
あり、Aspergillus oryzaeに対してはａｍｙプロモータ
ー〔Christensen et al., Abstr. 19^{t h} Lunteren Lectu
res on Molecular Genetics F23 (1987)；Christensen
et al., Biotechnology 6, 1419-1422 (1988)；Tada et
al., Mol. Gen. Genet. 229, 301 (1991)〕であり、As
pergillus nigerに対してはｇｌａＡ〔Cullen et al.,
Bio/Technology 5, 369-376 (1987)；Gwynne et al., B
io/Technology 5, 713-719 (1987)；Ward, Molecular I
ndustrial Mycology, Systems and Applications for F
ilamentous Fungi, MarcelDekker, New York, 83-106
(1991)〕、ａｌｃＡ〔Gwynne et al., Bio/Technology
5, 718-719 (1987)〕、ｓｕｃ１〔Boddy et al., Curr.
Genet. 24, 60-66(1993)〕、ａｐｈＡ〔MacRae et a
l., Gene 71, 339-348 (1988)；MacRae et al., Gene 1
32, 193-198 (1993)〕、ｔｐｉＡ〔McKnight et al., C
ell 46, 143-147 (1986)；Upshall et al., Bio/Techno
logy 5, 1301-1304 (1987)〕、ｇｐｄＡ〔Punt et al.,
Gene 69, 49-57 (1988)；Punt et al., J. Biotechno
l. 17,19-37 (1991)〕およびｐｋｉＡ〔de Graaf et a
l., Curr. Genet. 22, 21-27 (1992)〕プロモーターで
ある。酵母での発現に用い得る適切なプロモーター要素
は、当業界に公知であり、例えばｐｈｏ５プロモーター
〔Vogel et al., Mol. Cell. Biol. 2050-2057 (198
9)；Rudolf and Hinnen, Proc. Natl. Acal. Sci., 84,
1340-1344 (1987)〕であるか、またはSaccharomycesで
の発現にはｇａｐプロモーターであり、Pichia pastori
sに対しては、例えばａｏｘ１プロモーター〔Koutz et
al. Yeast 5, 167-177 (1989)；Sreekrishna et al.,
J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)〕、またはH.
polymorphaについてはＦＭＤプロモーター〔Hollenber
g et al., 欧州特許公開第０ ２９９ １０８号明細
書〕もしくはＭＯＸプロモーター〔Ledeboer et al., N
ucleic Acids Res. 13, 3063-3082(1985)〕である。

【００２５】したがって、本発明のＤＮＡ配列を含む、
好ましくは細菌または真菌または酵母宿主での該ＤＮＡ
配列の発現のためのベクター、およびこれにより形質転
換された細菌または真菌または酵母宿主も、本発明の目
的である。

【００２６】Hansenula属でのタンパク質、好ましくは
本発明のコンセンサスフィターゼのようなフィターゼの
高度な発現を可能とする系であって、そのようなタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列のコドンが、発現に用いら
れる生物、例えば本事例でのような酵母のコドン頻度表
に基づいて選択され（例えば実施例３を参照）、場合に
より、シグナル配列のためのコドンが、実施例３での特
定の事例について記載されたような方式で選択されてい
る系を提供することも本発明の目的である。これは、コ
ドン頻度表が、定義されたタンパク質群のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列に用いられるコドンに基づいて
作成されることを意味する。そうして、シグナル配列の
ＤＮＡ配列の設定のためのコドンが、発現に用いられる
宿主細胞のコドン頻度表から選択され、それによって、
両頻度表の同等の頻度のコドンが常に用いられる。

【００２７】そのようなＤＮＡ配列を、適切な培地中の
適切な宿主細胞で発現させたら、コードされるタンパク
質を、該タンパク質が培地中に分泌される場合は培地か
ら、またはそのようなタンパク質が細胞内に存在する場
合は、タンパク質精製の分野でに公知であるか、もしく
はフィターゼの場合は例えば欧州特許公開第４２０３５
８号明細書に記載された方法によって、宿主生物から単
離することができる。したがって、本発明のポリペプチ
ドを製造する方法であって、上記のように形質転換され
た細菌または宿主細胞を適切な培養条件下で培養し、そ
れからポリペプチドを回収することを特徴とする方法、
そしてそのような方法によって製造されたポリペプチ
ド、または本発明のＤＮＡ配列がコードするポリペプチ
ドも、本発明の目的である。

【００２８】本発明のポリペプチドは、一度得られれ
ば、それらを農業において有用としているその特性につ
いて特徴付けることができるが、それには、当業界に公
知であり、例えばSimonsら〔Br. J. Nutr., 64, 525-54
0 (1990)〕、Scheonerら〔J. Anim. Physiol. a. Anim.
Nutr. 66, 248-255 (1991)〕、Vogt〔Arch. Gefluegel
k. 56, 93-98 (1992)〕、Jongbloedら〔J. Anim. Sci.
70, 1159-1168 (1992)〕、Perneyら〔Poultry Sci. 72,
2106-2114 (1993)〕、Farrellら〔J. Anim. Physiol.
a. Anim. Nutr. 69, 278-283 (1993)〕、Brozら〔Br. P
oultry Sci. 35,273-280 (1994)〕およびDuengelhoefら
〔Animal Feed Sci. Technol. 49, 1-10(1994)〕が記載
したアッセイも用いることができる。

【００２９】一般に、本発明のポリペプチドは、特定の
応用分野に限定されることなく、例えばフィターゼの場
合は、フィチン酸のようなイノシトールポリリン酸エス
テルのイノシトールと無機リン酸への変換に用いること
ができる。

【００３０】その上、本発明のポリペプチドは、医薬組
成物または複合食品もしくは飼料の製造方法であって、
このような組成物の成分を本発明の１種類またはそれ以
上のポリペプチドと混合する方法に用いることができ
る。したがって、本発明の１種類またはそれ以上のポリ
ペプチドを含む複合食品もしくは飼料または医薬組成物
も、本発明の目的である。当業者は、それらの製造法に
精通している。そのような医薬組成物または複合食品も
しくは飼料は、そのような目的に一般的に用いられ、当
業界の技術水準に公知である添加物または成分を更に含
むことができる。

【００３１】更に、動物の厩肥中のフィチン酸の濃度を
低下させる方法であって、飼料に含まれるフィチン酸を
イノシトールと無機リン酸とに変換するのに充分な量の
このような飼料組成物を動物に摂取させることを特徴と
する方法を提供することも、本発明の目的である。

【００３２】本発明をより詳しく説明する前に、表、お
よび添付の図の説明を以下に記載する。

【００３３】表１：用いた真菌フィターゼのアミノ酸配
列の票の重み。真菌フィターゼのコンセンサス配列を算
出するのに用いた票の重みを示す。

【００３４】表２：真菌フィターゼの相同性。アライン
メントに用いたフィターゼのアミノ酸配列を、標準的パ
ラメータを用いたプログラムＧＡＰ（ＧＣＧプログラム
パッケージ、９；Deveruxら、1984）によって比較し
た。比較は、非常に多様なシグナルペプチドを欠くアラ
インメント（図１〜図４の凡例を参照）にも用いた配列
の一部に限定した。対角線の上下の数は、それぞれアミ
ノ酸の同一度および類似度を表す。

【００３５】表３：算出に用いたフィターゼに対する真
菌コンセンサスフィターゼのアミノ酸配列の相同性。す
べてのフィターゼのアミノ酸配列を、プログラムＧＡＰ
（ＧＣＧプログラムパッケージ、９．０）を用いて真菌
コンセンサスフィターゼの配列と比較した。やはり、比
較は、アラインメントに用いた配列の一部に限定した。

【００３６】表４：真菌コンセンサスフィターゼへの単
一突然変異の導入に用いたプライマー。各突然変異の導
入には、所望の突然変異を有する２種類のプライマーが
必要であった（実施例８を参照）。変化させたトリプレ
ットを太字で強調してある。

【００３７】表５：最適温度と、真菌コンセンサスフィ
ターゼ、ならびにA. fumigatus、A. niger、A. nidulan
sおよびM. thermophila由来のフィターゼのＴ_m値。最適
温度は、図８から採った。Ｔ_m値は、実施例１０に記載
し、図１２に示したように、示差走査熱量測定によって
決定した。

【００３８】図１〜図４：公知のほとんどすべての真菌
フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコン
センサスフィターゼ配列の算出。文字は、一文字コード
でのアミノ酸残基を表す。下記の配列をアラインメント
に用いた：Aspergilus terreus ９Ａ−１からのｐｈｙ
Ａ（Mitchell et al., 1997；アミノ酸（ａａ）２７か
ら）、Aspergillus terreus ｃｂｓ１１６．４６からの
ｐｈｙＡ（van Loon etal., 1997；ａａ２７から）、As
pergillus niger var. awamoriからのｐｈｙＡ（Piddin
gton et al., 1993；ａａ２７から）、Aspergillus nig
er Ｔ２１３からのｐｈｙＡ；ａａ２７から、Aspergill
us niger ＮＲＲＬ３１３５株からのｐｈｙＡ（van Har
tingsveldt et al., 1993；ａａ２７から）、Aspergill
us fumigatus ＡＴＣＣ１３０７３からのｐｈｙＡ（Pas
amontes et al., 1997b；ａａ２５から）、Aspergillus
fumigatus ＡＴＣＣ３２７２２からのｐｈｙＡ（van L
oon et al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus fumi
gatus ＡＴＣＣ５８１２８からのｐｈｙＡ（van Loon e
t al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus
ＡＴＣＣ２６９０６からのｐｈｙＡ（van Loon et a
l., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus Ａ
ＴＣＣ３２２３９からのｐｈｙＡ（van Loonet al., 19
97；ａａ３０から）、Aspergillus nidulansからのｐｈ
ｙＡ（Pasamontes et al., 1997a；ａａ２５から）、Ta
laromyces thermophilusからのｐｈｙＡ（Pasamontes e
t al., 1997a；ａａ２４から）、およびMyceliophthora
thermophilaからのｐｈｙＡ（Mitchell et al., 199
7；ａａ１９から）。アラインメントは、プログラムＰ
ＩＬＥＵＰを用いて算出した。ギャップの位置は、手動
で精緻化した。所与の位置におけるアラインメント中
の、大文字のアミノ酸残基は、コンセンサス残基を確立
するアミノ酸の連携（coalition）に属する。太字で、
算出したコンセンサス配列の下に、最終的に構築された
真菌コンセンサスフィターゼのアミノ酸配列（Ｆｃｐ）
を示す。算出したコンセンサス配列中のギャップは、実
施例２に述べた原則に従って、手動で充填した。

【００３９】図５〜図７：真菌コンセンサスフィターゼ
遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプライ
マーのＤＮＡ配列。算出したアミノ酸配列（図１〜図
４）を、プログラムＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（Deve
reux et al., 1984）、および高度に発現される酵母遺
伝子のコドン頻度表（ＧＣＧプログラムパッケージ、
９．０）を用いてＤＮＡ配列へと変換した。A. terreus
ｃｂｓからのフィターゼのシグナルペプチドをＮ末端
に融合させた。太字の塩基は、遺伝子を生成するのに用
いたオリゴヌクレオチドの配列を表す。それぞれのオリ
ゴヌクレオチドの名称を配列の上下に記す。下線を付し
た塩基は、遺伝子の開始および停止コドンを表す。斜体
で書いた塩基は、導入される二つのＥｃｏＲＩ部位を示
す。

【００４０】図８：コンセンサス配列を算出するのに用
いた真菌コンセンサスフィターゼおよびその他のフィタ
ーゼの最適温度。最適温度の決定には、３７〜８５℃の
一連の温度でフィターゼ標準アッセイを実施した。用い
たフィターゼは、実施例５に従って精製した。▽；真菌
コンセンサスフィターゼ、▼；A. fumigatus １３０７
３フィターゼ、□A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィター
ゼ、；A. nidulansフィターゼ、■；A. terreus ９Ａ−
１フィターゼ、●；A. terreus ｃｂｓフィターゼ。

【００４１】図９：真菌コンセンサスフィターゼならび
に突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０ＧのpH依
存活性特性。フィターゼ活性は、異なるpH値の適切な緩
衝液での標準的アッセイ（実施例９を参照）を用いて決
定した。プロットａ）は、突然変異体Ｑ５０Ｌ（▽）、
Ｑ５０Ｔ（▼）およびＱ５０Ｇ（）に対する真菌コンセ
ンサスフィターゼ（●）の比較を活性の％で示す。プロ
ットｂ）は、突然変異体Ｑ５０Ｌ（●）およびＱ５０Ｔ
（▽）に対する真菌コンセンサスフィターゼ（）の比較
を、H. polymorphaで発現させた精製酵素の比活性を用
いて示す。

【００４２】図１０：真菌コンセンサスフィターゼの突
然変異体Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｌと比較した、突然変異
体Ｑ５０ＬおよびＹ５１ＮならびにＱ５０ＴおよびＹ５
１ＮのpH依存活性特性。フィターゼ活性は、異なるpH値
の適切な緩衝液での標準的アッセイ（実施例９を参照）
を用いて決定した。グラフａ）は、突然変異体Ｑ５０Ｌ
（）に対する突然変異Ｙ５１Ｎ（●）の影響を示す。グ
ラフｂ）は、突然変異体Ｑ５０Ｔ（）に対する同じ突然
変異（●）の影響を示す。

【００４３】図１１：真菌コンセンサスフィターゼなら
びにその突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｇ
の基質特異性。棒は、様々な公知の天然および合成リン
酸化化合物とともにフィチン酸（１００％）を用いた活
性と比較した相対活性を表す。

【００４４】図１２：真菌コンセンサスフィターゼおよ
びその突然変異体Ｑ５０Ｔの示差走査熱量測定（ＤＳ
Ｃ）。タンパク質の試料を、約５０〜６０mg/mlに濃縮
し、１０mM酢酸ナトリウム（pH５．０）に対して徹底的
に透析した。１０℃/分の一定した加熱速度を９０℃ま
で適用した。コンセンサスフィターゼＱ５０ＴのＤＳＣ
（上のグラフ）は、７８．９℃の融解温度を生じたが、
これは、真菌コンセンサスフィターゼの融点（７８．１
℃、下のグラフ）とほぼ同一である。

【００４５】

【実施例】参考例 A. fumigatusおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フ
ィターゼの相同性のモデリング A. fumigatusおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フ
ィターゼのアミノ酸配列を、Ｘ線結晶学によって三次元
構造を決定しておいたA. niger ＮＲＲＬ３１３５フィ
ターゼの配列と比較した（図１〜図４を参照）。

【００４６】A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼ、
A. fumigatusフィターゼおよびA. terreus ｃｂｓ１１
６．４６フィターゼの多重アミノ酸配列アラインメント
を、プログラム「ＰＩＬＥＵＰ」（ウィスコンシンパッ
ケージバージョン８、１９９４年９月のためのプログラ
ムメニュー、Genetics Computer Group, 575 Science D
rive, Madison, Wisconsin, 米国 53711）で計算した。
A. fumigatusフィターゼおよびA. terreus ｃｂｓ１１
６．４６フィターゼの三次元モデルは、A. nigerＮＲＲ
Ｌ３１３５フィターゼの構造を鋳型として用い、それぞ
れA. fumigatusおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６
フィターゼのアミノ酸の配列アラインメントに従って、
A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼのアミノ酸を交
換することによって構築した。モデルの構築およびエネ
ルギー最適化は、プログラムＭｏｌｏｃ（Gerber and M
ueller, 1995）を用いることによって実施した。新たな
挿入／欠失以外そして、活性部位から離れたループ領域
では、Ｃ−α位を固定したままにした。

【００４７】外部ループでは、初めの結晶構造に対する
モデル化した構造の僅かな差のみを認めることができ
た。更に、Pseudomonas sp.の細菌のフィターゼ、およ
び決定された限りでA. niger ＮＲＲＬ３１３５フィタ
ーゼ（Cosgrove, 1980）によってフィチン酸（ｍｙｏ−
イノシトール六リン酸）の分解経路で主として生じる、
異なる基質分子を、各フィターゼの構造の活性部位のキ
ャビティ内に、構築し、形成した。これらの基質をそれ
ぞれ、ヒスチジン酸ホスファターゼについて提唱された
仮説的な結合モード（Van Etten, 1982）に配向させ
た。切断され易いリン酸基を、触媒作用に必須の第５９
位ヒスチジンへと配向させて、共有結合リン酸化酵素の
中間体を形成させた。切断後に第３３９位アスパラギン
酸によってプロトン化される基質リン酸エステル結合の
酸素を、プロトン供与体へと配向させた。基質の残りの
構造部分はもとより、周囲の活性部位残基の配座弛緩
も、プログラムＭｏｌｏｃによるエネルギー最適化によ
って実施した。

【００４８】構造モデルに基づき、活性部位のキャビテ
ィ内を指し示す残基を特定した。これらの位置の半数以
上（６０％）が、これら３種類のフィターゼ間で同一で
あったが、ほとんどの位置は保存されていた（図１〜図
４）。この所見は、追加の４種類のフィターゼの配列に
拡張できると思われる（A. nidulans、A. terreus９Ａ
１株、Talaromyces thermophilus、Myceliophthora the
rmophila）。

【００４９】実施例１ 真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメント 標準的パラメータ（ギャップ形成ペナルティー１２、ギ
ャップ拡大ペナルティー４）を有する配列分析パッケー
ジリリース９．０（Devereux et al., 1984）からのプ
ログラムＰＩＬＥＵＰを用いて、アラインメントを計算
した。ギャップの位置は、テキストエディターを用いて
精緻化した。シグナル配列なしの下記の配列（図１〜図
４を参照）を用いて、下記のアミノ酸（ａａ）から出発
してアラインメントを実施した：

【００５０】Aspergillus terreus ９Ａ−１、ａａ２７
からのｐｈｙＡ遺伝子（Mitchell etal., 1997）、Aspe
rgillus terreus ｃｂｓ１１６．４６、ａａ２７からの
ｐｈｙＡ遺伝子（van Loon et al., 1997）、Aspergill
us niger var. awamori、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝
子（Piddingtonet al., 1993）、Aspergillus niger Ｔ
２１３、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子、Aspergillus
niger ＮＲＲＬ３１３５、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝
子（van Hartingsveldt et al., 1993）、Aspergillus
fumigatus ＡＴＣＣ１３０７３、ａａ２６からのｐｈｙ
Ａ遺伝子（Pasamontes et al., 1997）、Aspergillus f
umigatus ＡＴＣＣ３２７２２、ａａ２６からのｐｈｙ
Ａ遺伝子（van Loon et al., 1997）、Aspergillus fum
igatus ＡＴＣＣ５８１２８、ａａ２６からのｐｈｙＡ
遺伝子（van Loon et al., 1997）、Aspergillus fumig
atus ＡＴＣＣ２６９０６、ａａ２６からのｐｈｙＡ遺
伝子(van Loon et al., 1997)、Aspergillus fumigatus
ＡＴＣＣ３２２３９、ａａ３０からのｐｈｙＡ遺伝子
（van Loon et al., 1997）、Aspergillus nidulans、
ａａ２５からのｐｈｙＡ遺伝子（Roche Nr.R1288、Pasa
montes at al., 1997a）、Talaromyces thermophilus
ＡＴＣＣ２０１８６、ａａ２４からのｐｈｙＡ遺伝子
（Pasamontes et al., 1997a）、Myceliophthora therm
ophila、ａａ１９からのｐｈｙＡ遺伝子（Mitchell et
al., 1997）。

【００５１】表２は、上記のフィターゼ配列の相同性を
示す。

【００５２】実施例２ 真菌コンセンサスフィターゼのアミノ酸配列の計算 実施例１の精緻化したアラインメントをインプットとし
て用い、配列分析パッケージリリース９．０（Devereux
et al., 1984）からのプログラムＰＲＥＴＴＹによっ
て、コンセンサス配列を計算した。ＰＲＥＴＴＹは、配
列を、それらのカラムをアラインさせて印刷し、アライ
ンメントのためのコンセンサス配列を示すことができ
る。アラインさせたフィターゼのアミノ酸配列間の類似
度を考慮する票の重みを、すべての配列に割り当てた。
一つの配列サブグループ（同種であるが異なる株）から
のすべてのフィターゼ、例えばA. fumigatusからのすべ
てのフィターゼのアミノ酸配列の、選出に対する結びつ
いた影響力が１に設定されるように票の重みを設定した
が、これは、各配列が、株の配列数で１を除した値で寄
与することを意味する（表１を参照）。この手段によっ
て、非常に類似したアミノ酸配列、例えばA. fumigatus
の異なる株からのフィターゼのアミノ酸配列が、計算さ
れるコンセンサス配列に大きな影響を及ぼすのを防ぐこ
とができた。

【００５３】プログラムＰＲＥＴＴＹは、下記のパラメ
ータで開始させた：それ未満ではコンセンサスがない票
数を定義する相対多数（plurality）を２．０に設定し
た。閾値は、それ未満ではあるアミノ酸残基が残基の連
携（coalition）のための有効票とならない可能性があ
る評点マトリックスの値を決定し、２に設定した。ＰＲ
ＥＴＴＹは、ペプチドについてのPretty Pep. Cmpとい
うコンセンサス評点マトリックスを用いた。

【００５４】アラインメントの１０ヶ所の位置（第４
６、６６、８２、１３８、１６２、２３６、２７６、２
７９、２８０、３０８位；図１〜図４）に対しては、プ
ログラムがコンセンサス残基を決定できず、下記の規則
に従って手動で満たした：最高頻度の残基が存在するな
らば、この残基を選択し（第１３８、２３６、２８０
位）；化学的に類似するか、または等価である優勢な残
基群が出現したならば、最高頻度のか、もしくはそれが
得られないならばこの群の一つの残基を選択した（第４
６、６６、８２、１６２、２７６、３０８位）。優勢な
残基も優勢な群も存在しないならば、タンパク質の安定
性に対する影響に関する一般的な仮定に従って、出現す
る残基の一つを選択した（第２７９位）。その他の８ヶ
所（第１３２、１７０、２０４、２１１、２７５、３１
７、３８４、４４７；図１〜図４）は、プログラムが選
択したアミノ酸残基ではなく、通常は、プログラムが選
択した残基と同じ頻度で出現するアミノ酸で満たされ
た。殆どの場合、この補正によって、３種類のA. niger
配列の僅かな過小評価（票の重みの合計：０．９９）は
除去された。

【００５５】表３は、計算に用いたフィターゼ配列に対
する計算された真菌のコンセンサスフィターゼアミノ酸
配列の相同性を示す。

【００５６】実施例３ 真菌のコンセンサスフィターゼアミノ酸配列のＤＮＡ配
列への変換 A. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼの初めの２
６アミノ酸残基をシグナルペプチドとして用い、したが
って、すべてのコンセンサスフィターゼのＮ末端と融合
させた。この伸長のために、本発明者らは、対応するＤ
ＮＡ配列を算出する特別の方法を用いた。Purvisら（１
９８７）は、遺伝子への稀有コドンの組込みは、タンパ
ク質の折りたたみの効率に影響を有すると提唱した。し
たがって、少なくとも、真菌コンセンサスフィターゼに
用いた、タンパク質の分泌に非常に重要であるが、S. c
erevisiaeのコドン使用へと転換されるA. terreus ｃｂ
ｓ１１６．４６のシグナル配列中の稀有コドンの分布
を、S. cerevisiaeでの発現のために生成される新たな
シグナル配列中に移転した。タンパク質の残りの部分に
ついては、本発明者らは、ＧＣＧプログラムパッケージ
から得られた高度に発現されるS. cerevisiae遺伝子の
コドン頻度表を用いて、算出されたアミノ酸配列をＤＮ
Ａ配列へと翻訳した。

【００５７】得られたｆｃｐ遺伝子の配列を図５〜図７
に示す。

【００５８】実施例４ 真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子の構築およびクロー
ニング 真菌コンセンサスフィターゼの算出されたＤＮＡ配列
を、センスおよびアンチセンス鎖の配列を交互に用い
て、８５bpのオリゴヌクレオチドへと分割した。オリゴ
ヌクレオチドはすべて、対向する鎖のその前および後の
オリゴヌクレオチドと２０bpずつ重複する。Microsynt
h, Balgach （スイス国）から購入し、ＰＡＧＥで精製
した形態で得られた全プライマーの位置を図５〜図７に
示す。

【００５９】３回のＰＣＲ反応で、合成されたオリゴヌ
クレオチドを遺伝子全体へと構成した。ＰＣＲには、Bo
ehringer Mannheim（Boehringer Mannheim, Mannheim,
ドイツ国）からのHigh Fidelity Kit、およびAMS Biote
chnology (Europe) Ltd. （Lugano, スイス国）からの
サーモサイクラー（thermocycler）The Protokol（登録
商標）を用いた。

【００６０】オリゴヌクレオチドＣＰ−１〜ＣＰ−１０
（ミックス１、図５〜図７）を、各オリゴヌクレオチド
あたり０．２pmol/μlの濃度に混合した。ＣＰ−９〜Ｃ
Ｐ−２２を用いて、第二のオリゴヌクレオチド混合物
（ミックス２）を調製した（各オリゴヌクレオチドあた
り０．２pmol/μl）。加えて、４種類の短いプライマー
をＰＣＲ反応に用いた：

【００６１】

【表１】

【００６２】ＰＣＲ反応ａ： ミックス１を１０μl（各オリゴヌクレオチド２．０pmo
l） ヌクレオチド２μl（各ヌクレオチド１０mM） プライマーＣＰ−ａ２μl（１０pmol/μl） プライマーＣＰ−ｃ２μl（１０pmol/μl） ＰＣＲ緩衝液１０．０μｌ ポリメラーゼ混合物０．７５μｌ Ｈ₂Ｏ７３．２５μl

【００６３】ＰＣＲ反応ｂ： ミックス２を１０μl（各オリゴヌクレオチド２．０pmo
l） ヌクレオチド２μl（各ヌクレオチド１０mM） プライマーＣＰ−ｂ２μl（１０pmol/μl） プライマーＣＰ−ｅ２μl（１０pmol/μl） ＰＣＲ緩衝液１０．０μl ポリメラーゼ混合物０．７５μl（２．６Ｕ） Ｈ₂Ｏ７３．２５μl

【００６４】ＰＣＲ反応ａおよびｂのための反応条件： 段階１：４５℃で２分 段階２：７２℃で３０秒 段階３：９４℃で３０秒 段階４：５２℃で３０秒 段階５：７２℃で１分 段階３〜５は、４０回反復した。

【００６５】ＰＣＲ生成物（６７０および９０５bp）
を、アガロースゲル電気泳動（０．９％アガロース）と
その後のゲル抽出（ＱＩＡＥＸ IIゲル抽出キット、Qi
agen,Hilden, ドイツ国）とによって精製した。精製し
たＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ反応ｃに用いた。

【００６６】ＰＣＲ反応ｃ： 反応ａのＰＣＲ生成物６μl（≒５０ng） 反応ｂのＰＣＲ生成物６μl（≒５０ng） プライマーＣＰ−ａ２μl（１０pmol/μl） プライマーＣＰ−ｅ２μl（１０pmol/μl） ＰＣＲ緩衝液１０．０μl ポリメラーゼ混合物０．７５μl（２．６Ｕ） Ｈ₂Ｏ７３．２５μl

【００６７】ＰＣＲ反応ｃのための反応条件： 段階１：９４℃で２分 段階２：９４℃で３０秒 段階３：５５℃で３０秒 段階４：７２℃で１分 段階２〜４は、３１回反復した。

【００６８】得られたＰＣＲ生成物（１．４kb）を、上
記のとおり精製し；EcoRIで消化し；EcoRIで消化し、脱
リン酸化したpBsk(-)ベクター（Stratagene, La Jolla,
CA, 米国）に連結した。連結混合物１μlを用いて、E.
coliXL-１コンピテント細胞（Stratagene, La Jolla,
CA, 米国）を形質転換した。標準的操作はすべて、Samb
rookら（１９８７）が記載したとおりに実施した。構築
された真菌コンセンサスフィターゼの遺伝子（ｆｃｐ）
は、配列決定（プラスミドpBsk-fcp）によって確認し
た。

【００６９】実施例５ Saccharomyces cerevisiaeでの真菌コンセンサスフィタ
ーゼ遺伝子（ｆｃｐ）およびその変異体の発現、ならび
に培養上清からのそれらの精製 Saccharomyces cerevisiaeの発現ベクターであるpYES2
（Invitrogen, San Diego, CA, 米国）の発現カセット
のEcoRI部位に連結したか、またはJanesら（１９９０）
が記載したような短縮ＧＡＰＦＬ（グリセルアルデヒド
−３−リン酸脱水素酵素）プロモーターとｐｈｏ５ター
ミネーターとの間でサブクローニングしたプラスミドpB
sk^-fcpから、真菌のコンセンサスフィターゼ遺伝子を単
離した。遺伝子が正しく配向されていることを、ＰＣＲ
によって確認した。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株、
例えばＩＮＶＳｃＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， 米国）の形質転換を、Hinnen
ら（１９７８）に従って実施した。ＧＡＰＦＬプロモ
ーターの制御下でフィターゼ遺伝子を宿す単一コロニー
を採集し、選別培地（ＳＤウラシル、Sherman et al.,
1986）５ml中、３０℃で、激しく撹拌しながら（２５０
rpm）１日培養した。次いで、この予備培養物を、ＹＰ
Ｄ培地（Sherman et al., 1986）５００mlに加え、同じ
条件下で増殖させた。gal１プロモーターの導入は、メ
ーカーの指示に従って実施した。インキュベーションの
４日後に、細胞ブロスを遠心分離（７，０００rpm、Ｇ
Ｓ３ローター、１５分、５℃）して細胞を除去し、上清
を、Amicon8400という細胞（ＰＭ３０膜）およびウルト
ラフリー１５遠心濾過装置（Biomax-30K, Millipore, B
edford, MA, 米国）を用いた限外濾過により濃縮した。
濃縮液（１０ml）を、溶離緩衝液として働く１０mM酢酸
ナトリウム、pH５．０を用いた４０mlのSephadex G25 S
uperfineカラム（Pharmacia Biotech,Freiburg, ドイツ
国）で脱塩した。脱塩した試料を、２M（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
に溶かし、１mlのブチルセファロース４高速流動疎水性
相互作用クロマトグラフィーカラム（Pharmacia Biotec
h, Freiburg, ドイツ国）に直接装荷し、１０mM酢酸ナ
トリウム、pH５．０への（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の２Mから０M
までの線形勾配で溶出させた。フィターゼを通過液に溶
出させ、濃縮し、１２０mlのSephacrylＳ−３００ゲル
浸透クロマトグラフィーカラム（Pharmacia Biotech, F
reiburg, ドイツ国）に装荷した。真菌コンセンサスフ
ィターゼおよび真菌コンセンサスフィターゼ７は、均質
な対称ピークとして溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
約９５％の純度であると示された。

【００７０】実施例６ Hansenula polymorphaでの真菌コンセンサスフィターゼ
遺伝子ｆｃｐおよびその変異体の発現 H. polymorphaの形質転換に用いるフィターゼ発現ベク
ターを、コンセンサスフィターゼまたは変異体をコード
するpBsk^-fcpのEcoRIフラグメントをH. polymorpha発現
ベクターpFPMT121の多重クローニング部位に挿入するこ
とによって構築したが、これは、ｕｒａ３選別マーカー
およびFMDプロモーターに基づく。ｆｃｐ遺伝子の５′
末端をFMDプロモーターに、３′末端をMOXターミネータ
ーに融合させた（Gellissen et at., 1996；欧州特許公
開第０２９９ １０８Ｂ号明細書）。得られた発現ベク
ターを、pFPMTfcpおよびpBsk^-fcp7と称した。

【００７１】構築したプラスミドをE. coli内で増殖さ
せた。当業界の標準的水準の操作を用いて、プラスミド
ＤＮＡを精製した。Gelissenら（１９９６）に記載され
たとおりのコンピテント細胞の製造、および酵母の形質
転換のための操作を用いて、発現プラスミドをオロチジ
ン−５′−リン酸脱炭酸酵素（ｕｒａ３）を欠くH. pol
ymorpha 株ＲＰ１１へと形質転換した。形質転換混合物
を、グルコース２％および寒天１．８％を含むＹＮＢ
（０．１４w/v％のDifco ＹＮＢおよび硫酸アンモニウ
ム０．５％）に塗布し、３７℃でインキュベートした。
４〜５日後に、それぞれの形質転換コロニーを採集し、
上記の液体培地で３７℃で２日間増殖させた。次いで、
この培養体のアリコートを用いて、グルコース２％を含
有するＹＮＢ培地を有する新鮮なバイアルに接種した。
選択培地で更に７回継代した後、発現ベクターは、酵母
ゲノムに多量体の形態で組み込まれた。次いで、非選択
液体培地（ＹＰＤ、グルコース２％、酵母抽出物１０ｇ
およびペプトン２０ｇ）３ml中で更に２回培養すること
によって、有糸分裂的に安定した形質転換体が得られ
た。遺伝的に均質な組換え株を得るために、最後の安定
化培養からのアリコートを選択プレートに塗布した。グ
ルコースに代えてグリセリン２％を含有するＹＮＢでの
フィターゼ発現の分析のために、一つのコロニーを単離
して、ｆｍｄプロモーターを抑制解除した。真菌コンセ
ンサスフィターゼの精製は、実施例５に記載のとおり実
施した。

【００７２】実施例７ Aspergillus nigerでの真菌コンセンサス遺伝子ｆｃｐ
およびその変異体の発現ｆｃｐ遺伝子のプラスミドpBsk
^-fcp、またはｆｃｐ遺伝子の変異体の対応するプラスミ
ドを鋳型として用いて、この遺伝子の開始コドンの上流
にBspHI部位、および停止コドンの下流にEcoRV部位を導
入した。Expand（登録商標）という高忠実度（High Fid
elity）ＰＣＲキット（Boehringer Mannheim, Mannhei
m, ドイツ国）を、下記のプライマーとともに用いた：

【００７３】プライマーＡｓｐ−１：

【００７４】

【表２】

【００７５】ｆｃｐおよびｆｃｐ７のクローニングのた
めのプライマーＡｓｐ−２：

【００７６】

【表３】

【００７７】提供者が記載したとおりに、反応を実施し
た。ＰＣＲで増幅したｆｃｐ遺伝子は、プライマーAsp-
1によって導入された新たなBspHIという部位を開始コド
ンに有しており、このため、第二のアミノ酸残基である
グリシンがセリンで置換されていた。次いで、ＤＮＡフ
ラグメントをBspHIおよびEcoRVで消化し、Aspergillus
nigerのグルコアミラーゼプロモーター（ｇｌａＡ）の
下流のNcoI部位、およびAspergillus nidulansトリプト
ファンＣターミネーター（ｔｒｐＣ）の上流のEcoRV部
位に連結させた（Mullaney et al., 1985）。このクロ
ーニング段階の後、遺伝子を配列決定して、ＰＣＲによ
って導入された可能性がある欠陥を検出した。得られた
発現プラスミドは、欧州特許公開第６８４ ３１３号明
細書の実施例９に記載されたように、pGLACベクターに
基本的に相当し、Neurospora crassaのオロチジン−
５′−リン酸脱炭酸酵素遺伝子（ｐｙｒ４）を選別マー
カーとして含有していた。Aspergillus nigerの形質転
換、およびコンセンサスフィターゼ遺伝子の発現を、欧
州特許公開第６８４ ３１３号明細書に記載されたとお
りに実施した。真菌コンセンサスフィターゼを、実施例
５に記載したとおりに精製した。

【００７８】実施例８ 真菌コンセンサスフィターゼの突然変異タンパク質の構
築 A. niger、S. cerevisiaeまたはH. polymorphaにおける
発現のための突然変異タンパク質を構築するために、真
菌コンセンサスフィターゼ遺伝子を含む対応する発現プ
ラスミドを、位置指定突然変異誘発のための鋳型として
用いた。突然変異は、Stratagene（La Jolla, CA, 米
国）からの「quick exchange（登録商標）位置指定突然
変異誘発キット」を用い、メーカーのプロトコルに従
い、そして対応するプライマーを用いて導入した。実現
したすべての突然変異、および対応するプライマーを表
４に示した。望みの突然変異を有するクローンは、当業
界に公知のＤＮＡ配列分析によって確認した。突然変異
したフィターゼは、完全な遺伝子の配列決定によって確
認した。

【００７９】実施例９ コンセンサスフィターゼおよびその変異体のフィターゼ
活性と最適温度の決定 フィターゼ活性は、基本的にはMitchellら（１９９７）
が記載したとおりに決定した。活性は、フィチン酸０．
５％（≒５mM）、酢酸ナトリウム２００mM、pH５．０を
含有するアッセイ混合物中で測定した。３７℃で１５分
のインキュベーション後、等量の１５％トリクロロ酢酸
の添加によって反応を停止させた。放出されたリン酸塩
は、アッセイ混合物１００μlをＨ₂Ｏ ９００μl、なら
びに０．６M Ｈ₂ＳＯ₄ １ml、アスコルビン酸２％およ
びモリブデン酸アンモニウム０．５％と混合することに
よって定量した。リン酸カリウムの標準溶液を参照とし
て用いた。酵素活性１単位は、３７℃で毎分１μmolの
リン酸塩を放出する酵素の量として定義した。タンパク
質濃度は、Paceら（１９９５）に従って算出した２８０
nmでの酵素の吸光係数を用いて決定した：真菌コンセン
サスフィターゼ；１．１０１；真菌コンセンサスフィタ
ーゼ７；１．０６８。

【００８０】pH最適曲線の場合は、精製した酵素を１０
mM酢酸ナトリウム、pH５．０で希釈した。インキュベー
ションは、希釈したタンパク質のアリコートを、一連の
異なる緩衝液（０．４Mグリシン／ＨＣｌ、pH２．５；
０．４M酢酸／ＮａＯＨ、pH３．０、３．５、４．０、
４．５、５．０、５．５；０．４Mイミダゾール／ＨＣ
ｌ、pH６．０、６．５；０．４Mトリス／ＨＣｌ、pH
７．０、７．５、８．０、８．５、９．０）中の等量の
１％フィチン酸（≒１０mM）と混合することによって開
始した。対照実験によって、混合段階によって、pHは僅
かに影響されるにすぎないことが示された。インキュベ
ーションは、上記のとおり、３７℃で１５分間実施し
た。

【００８１】フィターゼの基質特異性を決定するため、
アッセイ混合物中のフィチン酸を、５mM濃度のそれぞれ
のリン酸化合物と置き換えた。活性試験は、上記のとお
り実施した。

【００８２】最適温度を決定するため、酵素（１００μ
l）および基質溶液（１００μl）を、所与の温度で５分
間プレインキュベーションした。基質溶液の酵素への添
加によって、反応を開始させた。１５分のインキュベー
ションの後、トリクロロ酢酸で反応を停止させ、放出さ
れたリン酸塩の量を測定した。

【００８３】本来の真菌コンセンサスフィターゼの最適
pHは、pH６．０〜６．５前後であった（７０U/mg）。Ｑ
５０Ｔ突然変異の導入によって、最適pHは、pH６．０へ
と移動した（１３０U/mg）が、同じ位置でのロイシンと
の置換により、pH５．５前後で最大活性が得られた（２
１２U/mg）。Ｑ５０Ｇの交換では、pH６．０以上で活性
の最適pHが得られた（図９を参照）。第５１位のチロシ
ンをアスパラギンと交換したところ、pH５．０以下で活
性の増大が得られた（図１０を参照）。特にＱ５０Ｌの
突然変異によって、真菌コンセンサスフィターゼのフィ
チン酸に対する特異性が、劇的に増大した（図１１を参
照）。

【００８４】真菌コンセンサスフィターゼの最適温度
（７０℃）は、コンセンサス配列を算出するのに用いた
野生型フィターゼの最適温度（４５〜５５℃）より１５
〜２５°高かった（表５および図８を参照）。

【００８５】実施例１０ 示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による融点の決定 真菌コンセンサスフィターゼの展開温度を決定するため
に、Bruggerら（１９９７）が以前に発表したように示
差走査熱量測定を行った。５０〜６０mg/mlの均質なフ
ィターゼの溶液を試験に用いた。１０℃/分の一定した
加熱速度を９０℃まで適用した。

【００８６】測定した融点により、真菌コンセンサスフ
ィターゼの野生型フィターゼと比較して、熱安定性が非
常に改良されたことが明瞭に示された（表５および図１
２を参照）。図１２は、真菌コンセンサスフィターゼ、
およびその突然変異体Ｑ５０Ｌの融解プロフィールを示
す。その共通する融点は、７８〜７９℃であると測定さ
れた。

【００８７】参考文献 van den Burg, B., Vriend, G., Veltman, O.R., Venem
a & G., Eijsink, V.G.H. (1998), Engineering an enz
yme to resist boiling （耐煮沸酵素の操作）,Proc. N
atl. Acad. Sci. (USA) 95, 2056-2060. Akanuma, S., Yamagishi, A., Tanaka, N. & Oshima,
T. (1998), Serial increase in the thermal stabilit
y of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Bacillus
subtilis by experimental evolution （B. subtilis
の３−イソプロピルマレート脱水素酵素の熱安定性の実
験的進化による連続的増大）, Prot. Sci. 7, 698-705. Matthews, B.W. (1993), Structural and genetic anal
ysis of protein stability （タンパク質の安定性の構
造的および遺伝学的解析）, Annu. Rev. Biochem. 62,
139-160. Serrano, L., Day, A.G. & Fersht, A.R. (1993), Step
-wise mutation of barnase to binase. A procedure f
or engineering increased stability of proteins and
an experimental analysis of the evolution of prot
ein stability （バルナーゼからビナーゼへの段階的突
然変異。タンパク質の安定性の上昇の操作と、タンパク
質の安定性の進化の実験的解析とのための一手順）, J.
Mol. Biol. 233, 305-312. Matthews, B.W. (1987a), Genetic and structural ana
lysis of the protein stability problem （タンパク
質の安定性の問題の遺伝学的および構造的解析）,Bioch
emistry 26, 6885-6888. Sauer, R., Hehir, K., Stearman, R., Weiss, M., Jei
tler-Nilsson, A., Suchanek, E. & Pabo, C. (1986),
An engineered intersubunit disulfide enhances the
stability and DNA binding of the N-terminal domain
of λ-repressor（操作されたサブユニット間ジスルフ
ィドは、λリプレッサーのＮ末端ドメインの安定性およ
びＤＮＡ結合を強化する）, Biochemistry 25, 5992-59
99. Margarit, I., Campagnoli, S., Frigerio, F., Grand
i, G., Fillipis, V.D. &Fontana, A. (1992), Cumulat
ive stabilizing effects of glycine to alanine subs
titutions in Bacillus subtilis neutral protease（B
acillus subtilis中性プロテアーゼにおけるグリシンか
らアラニンへの置換の累積的安定化作用）, Prot. Eng.
5, 543-550. Matthews, B.W., Nicholson, H. & Becktel, W. (198
7), Enhanced protein thermostability from site-dir
ected mutations that decrease the entropy of unfol
ding（折りたたまれていない状態のエントロピーを減少
させる位置指定突然変異からの増大したタンパク質熱安
定性）, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84,6663-6667. Blaber, M., Lindstrom, J.D., Gassner, N., Xu, J.,
Heinz, D.W. & Matthews, B.W. (1993), Energetic cos
t and structural consequences of burying a hydroxy
l group within the core of a protein determined fr
om Ala->Ser andVal->Thr substitutions in T4 Lysozy
me（Ｔ４リゾチームにおけるAla→SerおよびVal→Thr置
換から決定された、タンパク質コア内のヒドロキシル基
の埋設のエネルギーコストおよび構造的結果）, Bioche
mistry 32, 11363-11373. Karpusas, M., Baase, W.A., Matsumura, M. & Matthew
s, B.W. (1989), Hydrophobic packing in T4 Lysozyme
probed by cavity-filling mutants（キャビティ充填
性突然変異体によって検証されたＴ４リゾチームにおけ
る疎水性パッキング）, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
86, 8237-8241. Munoz, V. & Serrano, L. (1995), Helix design, pred
iction and stability（らせんのデザイン、予測および
安定性）, Curr. Opin. Biotechnol. 6, 382-386. Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube,
Y. & Okada, H. (1993), Stabilization of xylanase
by random mutagenesis（ランダム突然変異によるキシ
ラナーゼの安定化）, FEBS Lett. 316, 123-127. Risse, B., Stempfer, G., Rudolph, R., Schumacher,
G. & Jaenicke, R. (1992), Characterization of the
stability effect of point mutations of pyruvate ox
idase from Lactobacillus plantarum: protection of
the native stateby modulating coenzyme binding and
subunit interaction（Lactobacillus plantarumから
のピルビン酸オキシダーゼの点突然変異の安定化作用の
特徴：補酵素結合およびサブユニット相互作用の調節に
よる未変性状態の保護）, Prot. Sci. 1, 1710-1718. Imanaka, T., Shibazaki, M. & Takagi, M. (1986), A
new way of enhancing the thermostability of protea
ses（プロテアーゼの熱安定性を増大させる新たな方
法）, Nature 324, 695-697. Pantoliano, M.W., Landner, R.C., Brian, P.N., Roll
ence, M.L., Wood, J.F.& Poulos, T.L. (1987), Prote
in engineering of subtilisin BPN': enhancedstabili
zation through the introduction of two cysteines t
o form a disulfide bond（ズブチリシンＢＰＮ’のタ
ンパク質操作：ジスルフィド結合を形成するための２シ
ステインの導入による安定性の増大）, Biochemistry 2
6, 2077-2082. Steipe, B., Schiller, B., Plueckthun, A. & Steinba
ch, S. (1994), Sequence statistics reliably predic
t stabilizing mutations in a protein domain（配列
統計学は、タンパク質のドメインでの安定化突然変異を
確実に予測する）, J. Mol. Biol. 240, 188-192. Mitchell, D.B., Vogel, K., Weimann, B.J., Pasamont
es, L. & van Loon, A.P.G.M. (1997), The phytase su
bfamily of histidine acid phosphatases: isolation
of genes for two novel phytases from the fungi Asp
ergillus terreusand Myceliophthora thermophila（ヒ
スチジン酸性ホスファターゼのフィターゼサブファミリ
ー：真菌であるAspergillus terreusおよびMyceliophth
ora thermophilaからの２種類の新規フィターゼの遺伝
子の単離）, Microbiology 143, 235-252. van Loon, A.P.G.M., Simoes-Nunes, C., Wyss, M., To
mschy, A., Hug, D., Vogel, K. & Pasamontes, L. (19
97), A heat resistant phytase of Aspergillusfumiga
tus with superior performance in animal experiment
s. Phytase optimization and natural variability
（動物実験で優れた性能を有するAspergillus fumigatu
sの耐熱性フィターゼ。フィターゼの最適化および自然
変異性）, InProceedings book of the workshop on pl
ant phytate and phytases, Kluwer Academic Press. Pasamontes, L., Haiker, M., Wyss, M., Tessier, M.
& van Loon, A.P.G.M. (1997), Cloning, purification
and characterization of a heat stable phytase fro
m the fungus Aspergillus fumigatus（真菌であるAspe
rgillus fumigatusからの熱安定性フィターゼのクロー
ニング、精製および特徴）, Appl. Environ. Microbio
l. 63, 1696-1700. Pasamontes, L., Haiker, M., Henriquez-Huecas, M.,
Mitchell, D.B. & van Loon, A.P.G.M. (1997a), Cloni
ng of the phytases from Emericella nidulansand the
thermophilic fungus Talaromyces thermophilus（Eme
ricella nidulansおよび好熱性真菌Talaromyces thermo
philusからのフィターゼのクローニング）, Biochim. B
iophys. Acta 1353, 217-223. Piddington, C.S., Houston, C.S., Paloheimo, M., Ca
ntrell, M., Miettinen-Oinonen, A., Nevalainen, H.
& Ramsbosek, J. (1993), The cloning and sequencing
of the genes encoding phytase (phy) and pH 2.5-op
timum acid phosphatase (aph) from Aspergillus nige
r var. awamori（Aspergillus niger var.awamoriから
のフィターゼ（ｐｈｙ）、およびpH２．５が最適の酸性
ホスファターゼ（ａｐｈ）をコードする遺伝子のクロー
ニングと配列決定）, Gene 133, 55-62. van Hartingsveldt, W., van Zeiji, C.M.F., Hartevel
d, G.M., Gouka, R.J.,Suykerbuyk, M.E.G., Luiten,
R.G.M., van Paridon, P.A., Selten, G.C.M., Veenstr
a, A.E., van Gorcom, R.F.M. & van den Hondel, C.A.
M.J.J. (1993), Cloning, characterization and overe
xpression of the phytase-encoding gene(phyA) of As
pergillus niger（Aspergillus nigerのフィターゼコー
ド遺伝子（phyA）のクローニング、特徴および過剰発
現）, Gene 127, 87-94. Gerber, P. and Mueller, K. (1995), Moloc molecular
modeling software（Moloc分子モデル化ソフトウエ
ア）, J. Comput. Aided Mol. Des. 9, 251-268.Van Et
ten, R.L. (1982), Human prostatic acid phosphatas
e: a histidine phosphatase（ヒト前立腺の酸性ホスフ
ァターゼ：ヒスチジンホスファターゼ）, Ann. NY Aca
d. Sci. 390, 27-50. Cosgrove, D.J. (1980), Inositol phosphates - their
chemistry, biochemistry and physiology: studies i
n organic chemistry, chapter 4（イノシトールリン酸
−それらの化学、生化学および生理学：有機化学の研
究、第４章）, Elsevier Scientific Publishing Compa
ny, Amsterdam, Oxford, New York. Devereux, J., Haeberli, P. & Smithies, O. (1984),
A comprehensive set ofsequence analysis programs f
or the VAX（ＶＡＸのための配列解析プログラムの包括
的セット）, Nucleic Acids Res. 12, 387-395. Purvis, I.J., Bettany, A.J.E., Santiago, T.C., Cog
gins, J.R., Duncan, K., Eason, R. & Brown, A.J.P.
(1987), The effieciency of folding of some protein
s is increased by controlled rates of translation
in vivo（ある種のタンパク質の折りたたみの効率は、i
n vivoにおける翻訳速度の制御によって上昇する）, J.
Mol. Biol. 193, 413-417. Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{n d} Ed（分
子クローニング：研究室向けマニュアル、第２版）., C
old Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY. Janes, M., Meyhack, B., Zimmermann, W. & Hinnem,
A. (1990), The influence of GAP promoter variants
on hirudine production, average plasmid copynumber
and cell growth in Saccharomyces cerevisiae（Sacc
haromyces cerevisiaeにおけるヒルジン生産、平均プラ
スミドコピー数および細胞増殖に対するＧＡＰプロモー
ター変異体の影響）, Curr. Genet. 18, 97-103. Hinnen, A., Hicks, J.B. & Fink, G.R. (1978), Trans
formation of yeast（酵母における形質転換）, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 75,1929-1933. Sheman, J.P., Finck, G.R. & Hicks, J.B. (1986), La
boratory course manualfor methods in yeast genetic
s（酵母の遺伝学の方法のための研究室向けコースマニ
ュアル）, Cold Spring Harbor University. Gellissen, G., Piontek, M., Dahlems, U., Jenzelews
ki, V., Gavagan, J.E.,DiCosimo, R., Anton, D.I. &
Janowicz, Z.A. (1996), Recombinant Hansenula polym
orpha as a biocatalyst : coexpression of the spina
ch glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae ca
talase T (CTT1) gene（生物触媒としての組換えHansen
ulla polymorpha：ホウレンソウグリコール酸オキシダ
ーゼ（ＧＯ）およびS. cerevisiaeのカタラーゼＴ（Ｃ
ＴＴ１遺伝子の同時発現）, Appl.Microbiol. Biotechn
ol. 46, 46-54. Mullaney, E.J., Hamer, J.E., Roberti, K.A., Yelto
n, M.M. & Timberlake, W.E. (1985), Primary structu
re of the trpC gene from Aspergillus nidulans（Asp
ergillus nidulansからのｔｒｐＣ遺伝子の一次構造）,
Mol. Gen. Genet.199, 37-46. Pace, N.C., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. & Gr
ay, T. (1985), How tomeasure and predict the molar
absorption coefficient of a protein（タンパク質の
モル吸収係数を測定かつ予測する方法。 Prot. Sci. 4,
2411-2423. Brugger, R., Mascarello, F., Augem, S., van Loon,
A.P.G.M. & Wyss, M. (1997), Thermal denaturation o
f fungal phytases and pH 2.5 acid phosphatase stud
ied by differential scanning calorimetry（示差走査
熱量測定によって調べた真菌フィターゼとpH２．５の酸
性ホスファターゼの熱変性）, In Proceedings book on
the workshop on plant phytate and phytase, Kluwer
AcademicPress.

【００８８】

【表４】

【００８９】

【表５】

【００９０】

【表６】

【００９１】

【表７】

【００９２】

【表８】

【図面の簡単な説明】

【図１】公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミ
ノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィター
ゼ配列の算出を示す。

【図２】図１の続きであり、公知のほとんどすべての真
菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコ
ンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。

【図３】図２の続きであり、公知のほとんどすべての真
菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコ
ンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。

【図４】図３の続きであり、公知のほとんどすべての真
菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコ
ンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。

【図５】真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）
と遺伝子構築のために合成したプライマーのＤＮＡ配列
を示す。

【図６】図５の続きであり、真菌コンセンサスフィター
ゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプラ
イマーのＤＮＡ配列を示す。

【図７】図６の続きであり、真菌コンセンサスフィター
ゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプラ
イマーのＤＮＡ配列を示す。

【図８】コンセンサス配列を算出するのに用いた真菌コ
ンセンサスフィターゼおよびその他のフィターゼの最適
温度を示す。

【図９】真菌コンセンサスフィターゼならびに突然変異
体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０ＧのｐＨ依存活性特
性を示す。

【図１０】真菌コンセンサスフィターゼの突然変異体Ｑ
５０ＴおよびＱ５０Ｌと比較した、突然変異体Ｑ５０Ｌ
およびＹ５１Ｎ、ならびにＱ５０ＴおよびＹ５１Ｎのｐ
Ｈ依存活性特性を示す。

【図１１】真菌コンセンサスフィターゼならびにその突
然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｇの基質特異
性を示す。

【図１２】真菌コンセンサスフィターゼおよびその突然
変異体Ｑ５０Ｔの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 Ａ６１Ｋ 37/54 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コンセンサスタンパク質を製造する方法
   であって、 （ａ）公知の任意の標準的アラインメントプログラムに
   より、定義されたタンパク質群の少なくとも３、好まし
   くは４のアミノ酸配列をアラインさせる段階と； （ｂ）そのようなアラインメントにより同位置にあるア
   ミノ酸を、公知の任意の標準的プログラムによりそれら
   の進化的類似度について比較する一方、対応する位置の
   アミノ酸の決定に用いられるアミノ酸の最小の類似度を
   定義するようなプログラムによって提供される類似度の
   程度を、より緊縮でない数に設定し、対応する位置で２
   のみの同一なアミノ酸から、コンセンサスタンパク質の
   ためのアミノ酸を該プログラムが決定できるような方法
   でパラメータを設定するが、比較されるアミノ酸配列の
   うちに、残余の配列に対するよりもはるかに高い程度の
   類似度を相互に示す配列があるならば、これらの配列
   を、コンセンサスタンパク質のコンセンサス配列につい
   ての本方法と同じ方法で定義されたように決定されたそ
   れらのコンセンサス配列によって表すか、またはそのよ
   うな配列の数で１を除した票の重みを、これらの配列の
   それぞれに割り当てる段階と； （ｃ）定義された位置に共通のアミノ酸が該プログラム
   によって同定されない場合、そのようなすべての配列の
   任意のアミノ酸、好ましくは最高頻度のアミノ酸を選択
   する段階と； （ｄ）コンセンサス配列を定義してあるのであれば、そ
   のような配列を、好ましくは発現を行う生物のコドン頻
   度表を用いることによって、ＤＮＡ配列へと逆翻訳する
   段階と； （ｅ）公知の方法により該ＤＮＡ配列を合成し、適切な
   発現ベクターに組み込んでか、またはそれ自体により、
   適切な宿主細胞を形質転換させるために用いる段階と； （ｆ）形質転換された宿主細胞を適切な培養条件下で増
   殖させ、コンセンサスタンパク質を公知の方法によって
   該宿主細胞またはその培地から単離する段階とを含む方
   法。
2. 【請求項２】 定義された位置のアミノ酸をそれらの進
   化的類似度について比較するのに用いるプログラムが、
   「ＰＲＥＴＴＹ」というプログラムである、請求項１記
   載の方法。
3. 【請求項３】 定義されたタンパク質群が、フィターゼ
   群である、請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】 フィターゼが、真菌起源のものである、
   請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 宿主細胞が、真核生物起源のものであ
   る、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 【請求項６】 真核生物が、真菌、好ましくはAspergil
   lus属または酵母、好ましくはSaccharomyces属またはHa
   nsenula属を意味する、請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方
   法によって得ることができる、または得られたコンセン
   サスタンパク質。
8. 【請求項８】 図５〜図７に示したアミノ酸配列を有す
   るコンセンサスタンパク質、またはその変異型もしくは
   突然変異タンパク質。
9. 【請求項９】 図５〜図７のアミノ酸配列中、Ｑ５０
   Ｌ、Ｑ５０Ｔ、Ｑ５０Ｇ、Ｑ５０Ｔ−Ｙ５１ＮまたはＱ
   ５０Ｌ−Ｑ５１Ｎの置換が行われていることを特徴とす
   る、請求項８記載のコンセンサスタンパク質の突然変異
   タンパク質。
10. 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれか１項記載のコ
    ンセンサスタンパク質を含む、食品、飼料または医薬組
    成物。