CN1163596C - 共有植酸酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从许多真菌植酸酶的序列制备共有植酸酶的方法。还涉及以该方法制备的共有植酸酶及其变异体或突变体。本发明还涉及含有该共有植酸酶的食品，饲料或药用组合物。

Description

共有植酸酶
植酸酶(肌醇六磷酸磷酸水解酶；EC3.1.3.8)是将植酸(肌醇六磷酸)水解成肌醇和无机磷酸且已知是一种有价值的食品添加剂的酶。
植酸酶于1907年在水稻糠中首先被描述[Suzuki等，Bull.Coll.Agr.Tokio Imp.Univ. 7，495(1907)]且1911年发现来自曲霉属种类的植酸酶[Dox和Golden，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)， 10，183-186(1911)]。植酸酶也在小麦糠，植物种子，动物肠道和微生物中发现[Howsen和Davis，酶微生物学技术(Enzyme Microb.Technol.)， 5，377-382(1983)，Lambrechts等，生物技术通讯(Biotech.Lett.) 14，61-66(1992)，Shieh和Ware，应用微生物学(Appl.Microbiol.)， 16，1348-1351(1968)]。
来自黑曲霉(无花果)的植酸酶的克隆和表达已由Van Hartingsveldt等在“基因”(Gene)， 127，87-94(1993)和在欧州专利申请公开号(EP)420358中描述，来自黑曲霉变种awamori的植酸酶由Piddington等在“基因”，133，55-62(1993)中描述。
具有改进特性的植酸酶的克隆，表达和纯化已在EP684313中公开。然而，由于仍然需要进一步改进的植酸酶，特别是关于其热稳定性，因此本发明的目的是提供下面的方法，但它不仅仅可应用于植酸酶。
一种用于制备共有蛋白质的方法，其中该方法的特征在于下面的步骤：
a)以本领域已知的任何标准序列对比程序对比给定蛋白质家族的至少三个，优选四个氨基酸序列；
b)以本领域已知的任何标准程序比较按该序列对比在相同位置的氨基酸的进化相似性，而将该程序提供的限定氨基酸最小相似性的相似性程度设定为较不严格数，该最小相似性用于确定相应位置的氨基酸，设定参数使该程序能够仅从相应位置的2个相同氨基酸确定为共有蛋白质的一个氨基酸；然而，如果比较的氨基酸序列中是互相间比与其余序列显示出更高程度相似性的序列，那么这些序列以其共有序列表示，该共有序列按与用于共有蛋白的共有序列的本方法中相同的方式来确定，或对这些序列中的每一个指定以这种序列的数目除1的选择权重。
c)如果以该程序鉴定在限定位置没有共同氨基酸，则选择用于比较的所有序列的任意氨基酸，优选选择所有这类序列的最常见氨基酸，或根据实施例2提供的意见选择氨基酸。
d)一旦限定了共有序列，将该序列转译为DNA序列，优选使用在其中发生表达的生物的常用密码子表进行转译；
e)以本领域已知的方法合成DNA序列，用整合在合适的表达载体中的形式或以其自身转化合适的宿主细胞；
f)在合适的培养条件下生长转化的宿主细胞，以本领域已知的方法从宿主细胞或其培养基分离共有蛋白质。
在该方法的优选实施方案中，步骤b)也可限定如下：
b)以本领域已知的任何标准程序比较按该序列对比在相同位置的氨基酸的进化相似性，而将该程序提供的相似性程度设定为最低可能性值，选择用于比较的至少一半序列最相似的氨基酸用于共有蛋白质氨基酸序列的相应位置。
可见整个方法的优选实施方案在于在该方法中从许多高度同源的序列选择一个序列，只取代那些与在中等严格条件下计算的该蛋白质家族的共有序列明显不同的氨基酸残基，而在该方法不能在中等严格条件下确定氨基酸的序列对比的所有位置选择优选序列的氨基酸。
本发明的另一个目的是提供这样一种方法，其中用于在限定位置比较氨基酸的进化相似性的程序是程序“PRETTY”。本发明的更具体的一个目的是提供这样一种方法，其中给定的蛋白质家族是植酸酶家族，特别是其中植酸酶来源于真菌。
本发明的更进一步的目的是提供这样一种方法，其中宿主细胞是真核细胞，特别是真菌，优选曲霉或酵母，优选酿酒酵母或汉逊氏酵母来源。
本发明的另一个目的是提供一种可从，优选以，这类方法获得的共有蛋白质，特别是具有图2所示氨基酸序列的共有蛋白质或其变异体。在本发明说明书中“变异体”指具有图2所示氨基酸序列的共有蛋白质，其中在一个或多个位置的氨基酸被缺失、添加或取之以一个或多个其它氨基酸，只要所得序列蛋白质的诸如酶活性(类型及比活)、热稳定性、在某一pH范围内的活性(pH稳定性)等基本特性无明显改变。本说明书中“明显”是指本领域的技术人员能明白变异体的特性可能有所不同，但相对于具有图2氨基酸序列的共有蛋白质本身而言不是非显而易见的。
本发明说明书中的突变蛋白质指图2所示的共有蛋白质氨基酸序列中的氨基酸被取代，产生具有进一步改进特性(例如，活性)的共有蛋白质。该突变蛋白质可根据欧洲专利申请号97810175.6提供的教导进行定义和制备，例如，Q50L，Q50T，Q50G，Q50L-Y51N，或Q50T-Y51N。在本说明书中“Q50L”指在氨基酸序列的50位氨基酸Q被氨基酸L取代。
另外，含有上文限定的共有蛋白质的食品、饲料或药用组合物也是本发明的一个目的。
在本说明书中“给定蛋白质家族的至少三个优选三个氨基酸序列”指三个，四个，五个，六至12，20，50或更多个序列可用于序列对比，且比较以产生共有蛋白质的氨基酸序列。“给定蛋白质家族的序列”指折叠成三维结构的这类序列，其中α-螺旋，β-折叠和转角位于相同位置使这些结构具有本领域的技术人员所谓的可重叠性。而且这些序列决定显示出相同类型的生物学活性的蛋白质，例如，给定的酶类型，例如，植酸酶。正如本领域已知的，一个这类序列的三维结构足以允许模拟该家族其它序列的结构。其如何发挥效力的一个例子在本申请的参考实施例中提供。在本申请说明书中“进化相似性”指按结构相似性分类氨基酸的程序，它使得一个氨基酸可被对总体结构具有最小影响的另一氨基酸取代，例如以本领域已知的程序，如“PRETTY”，可做到这一点。在本发明说明书中短语“将该程序提供的相似性程度…设定为较不严格数”指在实施本发明所用的程序中测定相似性程度的参数的值的选择方式是允许该程序限定所有氨基酸序列最多位置的共有氨基酸，例如，如果是程序PRETTY，可选择THRESHOLD的值为2或3，PLURALITY的值为2。另外，在本发明说明书中“以该序列数除1的选择权重”指限定与其它用于共有序列测定的序列具有高度相似性的一组序列的序列仅给该测定提供等于该组所有序列数除1的系数。
如前所述，假使该程序不能选择最相似的氨基酸，则选择最常见的氨基酸，假使后者不可能，则本领域的技术人员将从所有用于比较的序列中选择这样一个氨基酸，其中在本领域中已知该氨基酸在蛋白质中具有增强稳定性的特性，例如由下列文献所述：
Janece k，S.(1993)，生化方法(Process Biochem)，28，435-445或Fersht，A.R.和Serrano，L.(1993)，结构生物学的现代观点(Curr.Opin.Struct.Biol.)，3，75-83.
Alber，T.(1989)，生化年鉴(Annu.Rev.Biochem.)，58，765-798或
Matthews，B.W.(1987)，生化(Biochemistry)26，6885-6888.
Matthews，B.W.(1991)，结构生物学的现代观点，1，17-21.
酶的稳定性是许多工业应用的关键因素。因此已进行了或多或少有所成功的许多尝试以理性(van den Burg等，1998)或非理性途径(Akanuma等，1998)增强稳定性，优选酶的热稳定性。影响蛋白质热稳定性的作用力与负责肽链正确折叠的作用力相同(疏水相互作用，范德华相互作用，氢键，盐桥，构象张力(Matthews，1993))。而且，如Matthews等(1987)所示，非折叠状态的自由能也对蛋白质的稳定性具有影响。蛋白质的稳定性增强是指有利的相互作用的数量和强度增加且不利的相互作用的数目和强度减少。可导入二硫键(Sauer等，1986)，用丙氨酸残基取代甘氨酸残基或增加脯氨酸含量以减小非折叠状态的自由能(Margarit等，1992；Matthews，1987a)。其它小组致力于用于蛋白质稳定性的其它氢键和盐桥的重要性的研究(Blaber等，1993)或尝试填充蛋白质内的空穴以增加遮盖的疏水表面积和范德华相互作用(Karpusas等，1989)。另外，也研究了例如经过增加螺旋保护帽对二级结构元件特别是α-螺旋的稳定作用(Munoz和Serrano，1995)。
然而，还没有快速而有价值的方案来鉴定可增加稳定性，优选蛋白质的热稳定性的氨基酸取代。通常，需要蛋白质的三维结构来发现在分子中可能会稳定蛋白质的折叠状态的氨基酸取代位置。围绕这一问题的其它研究方式是寻找嗜热或嗜高温生物中的同源蛋白质或以随机诱变方案检测增强稳定性的氨基酸取代。后一种可能性仅在103至104个突变中会成功且局限于可得到快速筛选程序的酶(Arase等，1993；Risse等，1992)。对于所有这些方案，成功率会变化且是不可预料的，如果成功，热稳定性的增强几乎总是相当小。
这里我们提供了另一种方式来增强蛋白质的热稳定性。Imanaka等(1986)首先使用同源蛋白质比较来增强蛋白质的稳定性。他们使用来自嗜热生物的蛋白酶与嗜温生物的同源蛋白酶的比较来增强嗜温蛋白酶的稳定性。Serrano等(1993)使用两种同源嗜温RNA酶的氨基酸序列的比较来构建更具热稳定性的RNA酶。他们逐一突变了两者之间不同的所有残基并以多重突变组合增加稳定性的突变。Pantoliano等(1989)和特别是Steipe等(1994)表明在同源蛋白质序列对比的每个位置最常见的氨基酸对蛋白质的稳定性贡献最大。Steipe等(1994)对免疫球蛋白的可变区证实了这一点，而Pantoliano等(1989)检查了枯草杆菌蛋白酶一级序列中选择用于提高稳定性的酶序列差异极大的位置。他们的研究产生了取代物M50F，它将枯草杆菌蛋白酶的Tm提高了1.8℃。
Steipe等(1994)在免疫球蛋白的可变区证实了仅通过使用在该结构域的某一位置测定最常见的氨基酸残基的统计方法可预期具有超过60％成功率的致稳定突变。它也表明该方法不仅对于抗体可变区的稳定，而且对于其它蛋白质的结构域可提供有用的结果。然而，它没有提及该方法可延伸到完整的蛋白质。而且没有提到用于在一个明确的位置计算氨基酸频率的程序或是否使用如本发明中的计分模板。
因此本发明的一个目的是提供一种用于制备共有蛋白质的方法，包括计算用于所谓的共有蛋白质的几乎所有位置的氨基酸残基并从这种序列合成能在原核或真核表达系统中表达的完全基因的方法。
本发明的DNA序列可从编码蛋白质的基因组或cDNA序列开始构建，例如从现有技术已知的[序列信息见上述参考文献，例如，EP684313或序列数据库，例如，Genbank(Intelligenetics，California，USA)，欧洲生物信息研究所(Hinston Hall，英国剑桥)，NBRF(Georgetown University，医学中心，美国华盛顿区)和Vecbase(University of Wisconsin，生物技术中心，Madison，Wisconsin，美国)]或以体外诱变方法[参见，例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约]获得并在附图中所公开的植酸酶。最初由Hurchinson和Edgell所述[病毒学杂志， 8，181(1971)]的用于该定点诱变的广泛使用的策略涉及将携带所需核苷酸取代的合成寡核苷酸与待导入该突变的单链DNA序列的靶区域退火[综述见Smith，遗传学年鉴(Annu.Rev.Genet.)， 19，423(1985)，改进方法见Stanssen等，核酸研究， 17，4441-4454(1989)中的参考文献2-6]。优选用于实施本发明的突变给定DNA序列的另一可能性是经过使用聚合酶链式反应(PCR)进行诱变。作为起始材料的DNA以本领域已知的和例如在Sambrook等(分子克隆)中所述的方法从各自的菌株中分离。对于菌株信息，参见例如，EP684313或下面所述的任何保藏机构。黑曲霉[ATCC9142]，嗜热毁丝霉[ATCC48102]，嗜热踝节菌[ATCC20186]和烟曲霉[ATCC34625]已根据布达佩斯条约的要求分别以下列保藏号：ATCC74337，ATCC74340，ATCC74338和ATCC74339重新保藏在美国典型培养物保藏中心。然而，应理解根据本发明编码共有蛋白质的DNA也能以在例如EP747483中所述或以本领域已知的方法实例所述的合成方式制备。
一旦获得了本发明的完整的DNA序列，可将它们以本领域已知的和例如  在Sambrook等(出处同上)中所述的方法整合进载体以在合适的宿主系统中过度表达编码的多肽。然而，本领域的技术人员知道DNA序列本身也可用于转化本发明的合适的宿主系统以获得所编码的多肽的过度表达。合适的宿主系统是例如，真菌  如曲霉，例如黑曲霉[ATCC9142]或无花果曲霉[NRRL3135]，或如木霉属，例如Trichoderma reesei或酵母，如糖酵母属，例如，啤酒糖酵母或毕赤氏酵母属，如巴斯德毕赤氏酵母，或多形汉逊氏酵母，例如，多形汉逊氏酵母(DSM5215)或植物，由例如，Pen等，生物/技术(Bio/Technology)11，811-814(1994)所述。本领域的技术人员知道这些微生物可从保藏机构获得，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)，真菌菌种保藏中心(CBS)或德国微生物和培养物保藏中心(DSM)或在“工业产权”(Industrial Property)杂志[(1991) 1，29-40页]中所列的任何其它保藏机构。可使用的细菌有，例如，大肠杆菌，杆菌，例如，枯草芽孢杆菌或链霉菌属，例如，变青链霉菌(例如，见Anne和Mallaert，在FEMSMicrobiol.Letters  114，121(1993))。可使用的大肠杆菌是大肠杆菌K12菌株，例如，M15[Villarejo等，在“细菌学杂志”， 120，466-474(1974)中所述的DZ291]，HB101[ATCC No.33694]或大肠杆菌SG13009[Gottesman等，细菌学杂志， 148，265-273(1981)]。
可用于在真菌中表达的载体在本领域是已知的，例如在EP420358中，或由Cullen等[生物/技术 5，369-376(1987)]或Ward在“分子工业真菌学、丝状真菌的系统和应用”(Molecular Industrial Mycology，Systems and Applications for Filamentuns Fungi)，Marcel Dekker，纽约(1991)，Upshall等[生物/技术5，1301-1304(1987)]，Gwynne等[生物/技术 5，71-79(1987)]，Punt等[生物技术杂志 17，19-34(1991)]以及对于酵母由Sreekrishna等[基础微生物学杂志 28，265-278(1988)，生物化学 28，4117-4125(1989)]，Hitzemann等[自然 293，717-722(1981)]或在EP183070，EP183071，EP248227，EP263311中所述。可用于在大肠杆菌中表达的合适的载体，例如，由Sambrook等[出处同上]或由Fiers等在“第8届国际生物技术会议”[Soc.Franc.de Microbiol.，Paris(Durand等编辑)pp680-697(1988)]或由Buiard等，在“酶学方法”，Wu和Grossmann，AcademicPress，Inc.Vol. 155，416-433(1987)和Stuber等，在“免疫学方法”，Lefkovits和Pernis编，Academic Press，Inc.Vol.IV，121-152(1990)所述。可用于在杆菌中表达的载体在本领域是已知的，例如在EP405370，美国科学院学报 81，439(1984)，Yansura和Henner，酶学方法， 185，199-228(1990)或EP207459中所述。可用于在多形汉逊氏酵母中表达的载体在本领域是已知的，例如在Gellissen等，生物技术 9，291-295(1991)中所述。
要么该载体已携带调节元件，例如，启动子，要么可将本发明的DNA序列改造成含有该元件。可使用的合适的启动子元件在本领域中是已知的且例如对于Trichoderma reesei是cbh1-启动子[Haarki等，生物技术 7，596-600(1989)]或pkil启动子[Schindler等，基因 130，271-275(1993)]，对于米曲霉是amy-启动子[Christensen等，第19届分子遗传学Lunteren讲演文摘F23(1987)，Christensen等，生物技术 6，1419-1422(1988)，Tada等，分子普通遗传学(Md.Gen.Genet.) 229，301(1991)]，对于黑曲霉是glaA-启动子[Cullen等，生物/技术 5，369-376(1987)，Gwynne等，生物/技术 5，713-719(1987)，Ward，分子工业真菌学，丝状真菌的系统和应用，MarcelDekker，纽约，83-106(1991)]，alcA-启动子[Gwynne等，生物/技术 5，718-719(1987)]，suc1-[Boddy等，现代遗传学(Curr.Genet.)， 24，60-66(1993)]，aphA-启动子[MacRae等，基因 71，339-348(1988)，MacRae等，基因 132，193-198(1993)]，tpiA启动子[McKnight等，细胞 46，143-147(1986)，Upshall等，生物/技术 5，1301-1304(1987)]，gpdA-[Punt等，基因 69，49-57(1988)，Punt等，生物技术杂志(J.Biotechnol.) 17，19-37(1991)]和pkiA-启动子[de Graaff等，现代遗传学， 22，21-27(1992)]。可用于在酵母中表达的合适的启动子元件在本领域是已知的且它们是，例如，pho5-启动子[Vogel等，分子细胞生物学，2050-2057(1989)；Rudolf和Hinnen，美国科学院学报， 84，1340-1344(1987)]或用于在啤酒糖酵母和巴斯德毕赤氏酵母中表达的gap-启动子，例如，aoxl-启动子[Koutz等，酵母(Yeast) 5，167-177(1989)；Sreekrishna等，基础微生物学杂志，28，265-278(1988)]，或FMD启动子[Hollenberg等，EPANo.0299108]或用于多形汉逊氏酵母的MOX-启动子[Ledeboer等，核酸研究 13，3063-3082(1985)]。
因此，含有本发明的DNA序列，优选用于在细菌或真菌或酵母宿主中表达所述DNA序列的载体和其转化的细菌或真菌或酵母宿主也是本发明的目的。
本发明还有一个目的是提供允许蛋白质，优选本发明的植酸酶类共有植酸酶在汉逊氏酵母中高度表达的系统，其特征在于根据用于表达的生物，例如在本例中的酵母(例如，见实施例3)的常用密码子表选择编码该蛋白质DNA序列的密码子，并任选按实施例3中的具体情况所述的方式选择信号序列的密码子。这意味着根据编码给定蛋白质家族的氨基酸序列的DNA序列中所用的密码子做出常用密码子表。然后从用于表达的宿主细胞的常用密码子表中选择设计信号序列的DNA序列的密码子，从而使用在两表中常用性相当的常用密码子。
一旦在合适的培养基的合适的宿主细胞中表达了该DNA序列，如果所编码的蛋白质被分泌进培养基，则可从该培养基中分离蛋白质，或者如果该蛋白质存在于细胞内，则用蛋白质纯化领域已知的方法或对植酸酶所述的方法，例如在EP420358中所述从宿主生物分离该蛋白质。因此，制备本发明多肽的方法其特征在于在合适的培养条件下培养上述转化的细菌或宿主细胞，从中回收该多肽，以该方法生产的多肽或以本发明的DNA序列编码的多肽也是本发明的目的。
一旦获得，可鉴定本发明的多肽在农业中有用的特征，可使用本领域已知的和由，例如Simons等[Br.J.Nutr. 64，525-540(1990)]，Schoner等[动物生理学和动物营养学杂志(J.Anim.Physiol.a.Anim.Nutr.)，66，248-255(1991)]，Vogt[Arch.Geflugelk. 56，93-98(1992)]，Jongbloed等[动物科学杂志(J.Anim.Sci.)， 70，1159-1168(1992)]，Perney等[Poultry Sci. 72，2106-2114(1993)]，Farrell等[动物生理学和动物营养学杂志， 69，278-283(1993)]，Broz等[Br.Poultry Sci. 35，273-280(1994)]和Dungelhoef等[动物饲料科学技术(Animal Feed Sci.Technol.)， 49，1-10(1994)]所述的任何试验。
一般来说，可使用本发明的多肽而不局限于特定的应用领域，例如，植酸酶可用于将诸如肌醇六磷酸的肌醇多磷酸转变成肌醇和无机磷酸盐。
而且，本发明的多肽可用于制备药用组合物或复合食品或饲料，其中，该组合物的成分与一种或多种本发明的多肽混合。因此，含有一种或多种本发明的多肽的复合食品或饲料或药用组合物也是本发明的主题。本领域的技术人员对其制备方法是熟悉的。该药用组合物或复合食品或饲料可进一步包括一般用于该目的且在现有技术中已知的添加剂或成分。
本发明的另一个目的是提供降低动物粪便中肌醇六磷酸水平的方法，其特征在于以在将饲料中肌醇六磷酸转变成肌醇和无机磷酸盐中有效量的这种饲料组合物饲养动物。
在更详细地描述本发明前，下面提供了对表和附图的简短解释。
表1：所用的真菌植酸酶的氨基酸序列的权重。该表显示了用于计算真菌植酸酶共有序列的权重。
表2：真菌植酸酶的同源性。以程序GAP(GCG程序包，9；Devereux等，1984)使用标准参数比较序列对比中所用的植酸酶的氨基酸序列。比较局限于部分序列，即也用于缺乏差异较大的信号肽的序列对比的序列(见图1的说明).斜线上和下的数值分别代表氨基酸相同性和相似性。
表3：真菌共有植酸酶与用于其计算的植酸酶的氨基酸序列同源性。使用程序GAP(GCG程序包，9.0)比较了所有植酸酶的氨基酸序列与真菌共有植酸酶序列。另外，比较局限于用于序列对比的部分序列。
表4：用于将单个突变导入真菌共有植酸酶的引物。为了导入各突变，需要两个含所需突变的引物(见实施例8)。改变的三联体密码子以黑体字母来突出。
表5：真菌共有植酸酶和来自烟曲霉，黑色曲霉，构巢曲霉和嗜热毁丝霉的植酸酶的最适温度和Tm值。最适温度来自图3。用实施例10所述和图7所示的差示扫描量热术测定Tm值。
图1：从几乎所有已知的真菌植酸酶氨基酸序列的序列对比计算共有植酸酶序列。字母代表以单字母代码表示的氨基酸残基。下面的序列用于序列对比：来自土曲霉9A-1的phyA(Mitchell等，1997；从氨基酸(aa)27)，来自土曲霉cbs116.46的phyA(van Loon等，1997；从aa27)，来自黑色曲霉变种awamori的phyA(Piddington等，1993；从aa27)，来自黑色曲霉T213的phyA(从aa27)，来自黑色曲霉菌株NRRL3135的phyA(van Hartingsveldt等，1993；从aa27)，来自烟曲霉ATCC13073的phyA(Pasamontes等，1997b；从aa25)，来自烟曲霉ATCC32722的phyA(van Loon等，1997；从aa27)，来自烟曲霉ATCC58128的phyA(van Loon等，1997；从aa27)，来自烟曲霉ATCC26906的phyA(van Loon等，1997；从aa27)，来自烟曲霉ATCC32239的phyA(van Loon等，1997；从aa30)，来自构巢曲霉的phyA(Pasamontes等，1997a；从aa25)，来自嗜热踝节菌的phyA(Pasamontes等，1997a；从aa24)，来自嗜热毁丝霉的phyA(Mitchell等，1997；从aa19)。使用程序PILEUP计算序列对比。人工推敲缺口位置。在给定位置的对比序列中大写的氨基酸残基属于形成共有残基的氨基酸联合。在计算的共有序列下面，以黑体显示了最终构建的真菌共有植酸酶(Fcp)的氨基酸序列。根据实施例2所述的原理人工补齐计算的共有序列中的缺口。
图2：真菌共有植酸酶基因(fcp)和用于基因构建的合成引物的DNA序列。使用程序BACKTRANSLATE(Devereux等，1984)和高度表达的酵母基因的常用密码子表(GCG程序包，9.0)将计算的氨基酸序列(图1)转变成DNA序列。来自土曲霉cbs的植酸酶的信号肽与N-末端融合。黑体碱基代表用于产生基因的寡核苷酸的序列。各自的寡核苷酸名称在序列上面或下面注明。下面划线的碱基代表基因的起始和终止密码子。斜体字碱基表示两个导入的Eco RI位点。
图3：真菌共有植酸酶和用于计算共有序列的其它植酸酶的最适温度。为了测定最适温度，在37℃至85℃之间的一系列温度下进行植酸酶标准试验。根据实施例5纯化所用的植酸酶。，真菌共有植酸酶；，烟曲霉13073植酸酶；□，黑色曲霉NRRL3135植酸酶；○，构巢曲霉植酸酶；■，土曲霉9A-1植酸酶；·土曲霉cbs植酸酶。
图4：真菌共有植酸酶和突变体Q50L，Q50T和Q50G的pH-依赖性活性图。在不同的pH值下使用在合适缓冲液中的标准试验(见实施例9)测定植酸酶活性。图a)显示了真菌共有植酸酶(·)与突变体Q50L()，Q50T()和Q50G(○)的活性百分数的比较。图b)显示了使用在多形汉逊氏酵母中表达的纯化酶的比活比较真菌共有植酸酶(○)与突变体Q50L(·)和Q50T()。
图5：与真菌共有植酸酶突变体Q50L和Q50T相比，突变体Q50L，Y50N和Q50T，Y51N的pH-依赖活性图。在不同的pH值下使用在合适缓冲液中的标准试验(见实施例9)测定植酸酶活性。图a)显示了突变Y51N(·)对突变体Q50L(○)的影响。图b)显示了相同突变(·)对突变体Q50T(○)的影响。
图6：真菌共有植酸酶和其突变体Q50L，Q50T和Q50G的底物特异性。线段表示与用肌醇六磷酸(100％)的活性相比，用各种已知天然和合成的磷酸化化合物的相对活性。
图7：真菌共有植酸酶和其突变体Q50T的差示扫描量热术(DSC)。蛋白质样品浓缩至大约50-60mg/ml并用10mM乙酸钠，pH5.0充分透析。使用10℃/分的恒定加热速率加热到90℃。共有植酸酶Q50T的DSC(上图)产生78.9℃的解链温度，它几乎相同于真菌共有植酸酶的解链温度(78.1℃，下图)。
实施例
参考实施例
烟曲霉和土曲霉cbs116.46植酸酶的同源性模型
比较烟曲霉和土曲霉cbs116.46植酸酶的氨基酸序列与三维结构已经用X射线晶体学测定的黑色曲霉NRRL3135植酸酶的序列(见图1)。
黑曲霉NRRL3135植酸酶、烟曲霉植酸酶和土曲霉cbs116.46植酸酶的多氨基酸序列的序列对比用程序“PILEUP”(Prog.Menu for theWisconsin Package，version 8，1994年9月，遗传学计算机集团公司(Genetics Computer Group)，575Science Drive，Madison Wisconcin，USA53711)计算。烟曲霉植酸酶和土曲霉cbs116.46植酸酶的三维模型使用黑色曲霉NRRL3135植酸酶的结构作模板并根据分别与烟曲霉和土曲霉cbs116.46植酸酶的氨基酸的序列对比交换黑色曲霉NRRL3135植酸酶的氨基酸来建立。使用程序Moloc(Gerber和Muller，1995)进行模型构建和能量最优化。C-α位置保持固定，除新的插入/缺失和远离活性位点的袢环区域外。
在外部袢环中可观察到模型结构与原始晶体结构仅有较小的区别。而且构建了主要在以假单胞菌属细菌植酸酶进行的植酸(肌醇六磷酸)降解途径中出现的以及由黑色曲霉NRRL3135植酸酶(Cosgrove，1980)测定的不同底物分子并构成各植酸酶结构的活性位点腔。各底物以建议用于组氨酸酸性磷酸酶的假定结合模式(Van Etten，1982)定向。易切割的磷酸基团定向于催化必需的His59以形成共价磷酸酶中间产物。裂解后由Asp339质子化的底物磷酸酯键的氧定向于质子供体。用程序Moloc.经能量最优化进行底物剩余结构部分以及周围活性位点的构象松弛。
根据结构模型鉴定在活性位点腔中的残基。超过一半(60％)的这些位置在三个植酸酶中相同，而只有少数位置不保守(见图1)。这些观察结果可延伸到四个其它的植酸酶序列(构巢曲霉，土曲霉9A1，嗜热踝节菌，嗜热毁丝霉)。
实施例1
真菌植酸酶氨基酸序列的序列对比
使用来自序列分析包Release9.0的程序PILEUP(Devereux等，1984)以标准参数(缺口产生罚12分，缺口延伸罚4分)计算序列对比。使用文本编辑程序精选缺口位置。无信号序列的下列序列(见图1)用于以以下述氨基酸(aa)起始进行序列对比：
来自土曲霉9A-1的phyA基因，aa27(Mitchell等，1997)
来自土曲霉cbs116.46的phyA基因，aa27(van Loon等，1997)
来自黑色曲霉变种awamori的phyA基因，aa27(Piddington等，1993)
来自黑色曲霉T213的phyA基因，aa27
来自黑色曲霉菌株NRRL3135的phyA基因，aa27(vanHartingsveldt等，1993)
来自烟曲霉ATCC13073的phyA基因，aa26(Pasamontes等，1997)
来自烟曲霉ATCC32722的phyA基因，aa26(van Loon等，1997)
来自烟曲霉ATCC58128的phyA基因，aa26(van Loon等，1997)
来自烟曲霉ATCC26906的phyA基因，aa26(van Loon等，1997)
来自烟曲霉ATCC32239的phyA基因，aa30(van Loon等，1997)
来自构巢曲霉的phyA基因，aa25(Roche Nr.R1288，Pasamontes等，1997a)
来自嗜热踝节菌ATCC20186的phyA基因，aa24(Pasamontes等，1997a)
来自嗜热毁丝霉的phyA基因，aa19(Mitchell等，1997)
表2显示了上述植酸酶序列的同源性。
实施例2
真菌共有植酸酶氨基酸序列的计算
使用实施例1所述的精选序列对比，以来自序列分析包Release9.0的程序PRETTY(Devereux等，1984)计算共有序列。PRETTY以其所排列的各栏打印序列且可表现出序列对比的共有序列。指定所有序列关于所比较的植酸酶氨基酸序列之间相似性的权重。设定权重，例如，来自一个序列亚组(相同的来源种但不同的菌株)的所有植酸酶的组合影响，例如，设定所选定的来自烟曲霉的所有植酸酶的氨基酸序列为1，这意味着各序列提供菌株序列数除1的值(见表1)。以这种方式可防止，例如，来自不同烟曲霉菌株的植酸酶中极相似的氨基酸序列控制计算的共有序列。
用下列参数开始程序PRETTY：限定小于该值则无共有序列的票数设定为2.0，确定小于该值的氨基酸残基不能用作残基的联合的计分基值的阈值设定为2。对多肽PRETTY使用PrettyPep.Cmp共有计分基础。
根据下列规则人工补充序列对比的10个位置(位置46，66，82，138，162，236，276，279，280，308；图1)；如果存在最常见的残基，则选择该残基(138，236，280)；如果存在化学上相似或相当的残基的常见基团，选择带有该基团的最常见的一个残基或如果不可能，则选择带有该基团的一个残基(46，66，82，162，276，308)。如果既无常见残基，又无常见基团，根据其对蛋白质稳定性的影响的常见假定选择一个现存残基(279)。八个其它位置(132，170，204，211，275，317，384，447；图1)不用以该程序选择的氨基酸残基补充但一般用与该程序选择的残基相同频率出现的氨基酸来补充。在大多数情况下，以这种校正法排除对三个黑曲霉序列的略微低估(总权重：0.99)。
表3显示了所计算的真菌共有植酸酶氨基酸序列与用于该计算的植酸酶序列的同源性。
实施例3
将真菌共有植酸酶氨基酸序列转变成DNA序列
使用土曲霉cbs116.46植酸酶的前26个氨基酸残基作为信号肽并因此融合到所有共有植酸酶的N末端。对于这一段序列，我们使用一种特定的方法计算相应的DNA序列。Purvis等(1987)认为在基因中掺入稀少密码子对蛋白质的折叠效力有影响。因此，至少稀少密码子在土曲霉cbs116.46信号序列(用于真菌共有植酸酶且对该蛋白质的分泌极重要，但转变成啤酒糖酵母的惯用密码子)中的分布转变成用于在啤酒糖酵母中表达的新信号序列。对于该蛋白质的其余部分，我们使用从GCG程序包获得的高度表达的啤酒糖酵母基因的常用密码子表将计算的氨基酸序列翻译成DNA序列。
所得的fcp基因序列在图2中显示。
实施例4
真菌共有植酸酶序列的构建和克隆
交替使用有意义和反义链的序列，将计算的真菌共有植酸酶的DNA序列分成85bp的寡核苷酸。每个寡核苷酸与其前面和其后面的反链寡核苷酸重叠20bp。从Microsynth，Balgach(瑞士)购买的和以PAGE纯化形式获得的所有引物的位置在图2中表示。
在三个PCR反应中，合成的寡核苷酸组成完整的基因。为进行PCR，使用来自Boehringer Mannheim(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)的高保真(High Fidelity Kit)试剂盒和来自AMS生物技术(欧洲)有限公司(Lugano，瑞士)的热循环仪The ProtokolTM。
寡核苷酸CP-1至CP-10(混合物1，图2)与每种寡核苷酸各为0.2pMol/μl的浓度混合。用CP-9至CP-22(每种寡核苷酸各0.2pMol/μl)制备第二种寡核苷酸混合物(混合物2)。另外，在PCR反应中使用四种短引物：
CP-a：          Eco RI
    5’-TAT AT G AAT TCA TGG GCG TGT TCG TC-3’
CP-b：
    5’-TGA AAA GTT CAT TGA AGG TTT C-3’
CP-c：
    5’-TCT TCG AAA GCA GTA CAA GTA C-3’
CP-e：         Eco RI
    5’-TAT AT G AAT TCT TAA GCG AAA C-3’
PCR反应a：
        10μl混合物1(每种寡核苷酸各2.0pmol)
        2μl核苷酸(每种核苷酸各10mM)
        2μl引物CP-a(10pmol/μl)
        2μl引物CP-c(10pmol/μl)
        10.0μlPCR缓冲液
        0.75μl聚合酶混合物
        73.25μlH2O
PCR反应b：
        10μl混合物2(每种寡核苷酸各2.0pmol)
        2μl核苷酸(每种核苷酸各10mM)
        2μl引物CP-b(10pmol/μl)
        2μl引物CP-e(10pmol/μl)
        10.0μlPCR缓冲液
        0.75μl聚合酶混合物(2.6U)
        73.25μlH2O
PCR反应a和b的反应条件：
        步骤1  2分钟-45℃
        步骤2  30秒-72℃
        步骤3  30秒-94℃
        步骤4  30秒-52℃
        步骤5  1分钟-72℃
    步骤3至5重复40次。
以琼脂糖凝胶电泳(0.9％琼脂糖)并随后凝胶提取(QIAEX II凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)纯化PCR产物(670和905bp)。纯化的DNA片断用于PCR反应c。
PCR反应c：
        6μl反应a的PCR产物(≈50ng)
        6μl反应b的PCR产物(≈50ng)
        2μl引物CP-a(10pmol/μl)
        2μl引物CP-e(10pmol/μl)
        10.0μlPCR缓冲液
        0.75μl聚合酶混合物(2.6U)
        73.25μlH2O
PCR反应c的反应条件：
        步骤1  2分钟-94℃
        步骤2  30秒-94℃
        步骤3  30秒-55℃
        步骤4  1分钟-72℃
步骤2至4重复31次。
如上所述纯化所得的PCR产物(1.4kb)，用Eco RI消化，并连接进Eco RI消化的且去磷酸化的pBsk(-)-载体(Stratagene，La Jolla，CA，USA)中。将1μl连接混合物用于转化大肠杆菌XL-1感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。按Sambrook等(1987)所述进行所有标准程序。经测序(质粒pBsk--fcp)证实所构建的真菌共有植酸酶基因(fcp)。
实施例5
真菌共有植酸酶基因fcp及其变异体在啤酒糖酵母中的表达及其从 培养物上清中的纯化
从质粒pBsk-fcp分离真菌共有植酸酶基因，连接进啤酒糖酵母表达载体pYES2(Invitrogen，San Diego，CA，USA)表达盒的Eco RI位点或按Janes等(1990)所述亚克隆进变短的GAPFL(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子与pho5终止子之间。经PCR检查基因的正确取向。根据Hinnen等(1978)完成啤酒糖酵母菌株，例如，INVSc1(Invitrogen，San Diego，CA，USA)的转化。挑选含有在GAPFL启动子控制下的植酸酶基因的单一菌落并在30℃下在5ml选择培养基(SD-尿嘧啶，Sherman等，1986)中剧烈摇动(250rpm)培养一天。然后将预培养物加入500mlYPD培养基(Sherman等，1986)中并在相同条件下生长。根据厂商建议进行gall启动子的诱导。培养4天后，离心(7000rpm，GS3转子，15分钟，5℃)细胞培养液以去掉细胞并在Amicon8400杯(PM30膜)和ultrafree-15离心过滤装置(Biomax-30K，Millipore，Bedford，MA，USA)中以超滤方式浓缩上清液。以10mM乙酸钠，pH5.0用作洗脱缓冲液将浓缩物(10ml)在40ml Sephadex G25 Superfine柱(PharmaciaBiotech，Freiburg，德国)上脱盐。脱盐的样品放入2M(NH4)2SO4中并直接上样到1ml Butyl Sepharose 4 Fast Flow疏水相互作用色谱柱(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)上，用在10mM乙酸钠，pH5.0中从2M至0M(NH4)2SO4的线型梯度洗脱。在临界点洗脱了植酸酶，浓缩并上样到120ml Sephacryl S-300凝胶渗透色谱柱(PharmaciaBiotech，Freiburg，德国)上。真菌共有植酸酶和真菌共有植酸酶7作为均一的对称峰洗脱且以SDS-PAGE显示为大约95％的纯度。
实施例6
真菌共有植酸酶基因fcp及其变异体在多形汉逊氏酵母中的表达
经过将编码共有植酸酶或变异体的pBsk-fcp的Eco RI片断插入多形汉逊氏酵母表达载体pFPMT121的多克隆位点来构建用于转化多形汉逊氏酵母的植酸酶表达载体，其中pFPMT121以ura3选择标记和FMD启动子为基础。fcp基因的5’端与FMD启动子融合，3’端与MOX终止子融合(Gellissen等，1996；EP0299108B)。所得的表达载体命名为pFPMTfcp和Bsk-fcp7。
在大肠杆菌中繁殖构建的质粒。使用本领域的标准方法纯化质粒DNA。使用Gelissen等(1996)所述的用于感受态细胞制备和酵母转化的方法将表达质粒转化进乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(ura3)缺陷型多形汉逊氏酵母菌株RP11。将各转化的混合物涂布到含2％葡萄糖和1.8％琼脂的YNB(0.14％w/v Difco YNB和0.5％硫酸铵)中并在37℃培养。4至5天后挑出单个的转化菌落并在上述液体培养基上37℃生长2天。随后，将该培养物的等分试样用于接种含2％葡萄糖的YNB培养基的新鲜瓶。在选择培养基中再传代7次后，将表达载体以多体形式整合进酵母基因组。随后，再经过在3ml非选择培养基(YPD，2％葡萄糖，10g酵母提取物和20g蛋白胨)中的2个培养步骤获得分裂稳定的转化子。为了获得遗传上均一的重组菌株，将来自最后稳定培养物的等分试样涂布到选择平板上。分离单个菌落用于在含2％甘油代替葡萄糖以抑制fmd启动子的YNB中分析植酸酶表达。按实施例5所述进行真菌共有植酸酶的纯化。
实施例7
真菌共有植酸酶基因fcD及其变异体在黑色曲霉中的表达
质粒pBsk-fcp或fcp基因变异体的相应质粒用作将Bsp HI位点导入该基因起始密码子上游和将Eco RV位点导入终止密码子下游的模板。使用ExpandTM高度保真PCR试剂盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)及下列引物：
引物Asp-1：Bsp HI
5’-TAT A TC ATG AGC GTG TTC GTC GTG CAT CTG TTC-3’
用于fcp和fcp7克隆的引物Asp-2：
3’-ACC CGA CTT ACA AAG CGA ATT  CTA TAG ATA TAT-5’
                                 Eco RV
按供应商所述进行反应。PCR扩增的fcp基因在起始密码子处有一个由引物Asp-1导入的新的Bsp HI位点，这导致第二个氨基酸残基甘氨酸被丝氨酸取代。随后，用Bsp HI和Eco RV消化DNA片断并连接进黑色曲霉葡萄糖淀粉酶启动子(glaA)下游的Nco I位点和构巢曲霉色氨酸C终止子(trpC)上游的Eco RV位点(Mullaney等，1985)。克隆步骤后，测序基因以检查PCR可能导入的错误。基本上相应于EP684313实施例9所述的pGLAC载体的所得表达质粒含有粗糙链孢霉乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyr4)作为选择标记。按EP684313所述进行黑色曲霉的转化和共有植酸酶基因的表达。按实施例5所述纯化真菌共有植酸酶。
实施例8
构建真菌共有植酸酶突变体
为了构建在黑色曲霉，啤酒糖酵母，多形汉逊氏酵母中表达的突变体，含真菌共有植酸酶基因的相应表达质粒用作定点诱变的模板。使用来自Stratagene(La Jolla，CA，USA)的“quick exchangeTM定点诱变试剂盒按照厂商的方案并使用相应的引物导入突变。制备的所有突变和相应的引物在表4中概括。以本领域已知的DNA序列分析鉴定含有所需突变的克隆。经过完整基因的测序证实突变的植酸酶。
实施例9
植酸酶活性和共有植酸酶及其变异体最适温度的测定
基本上按Mitchell等(1997)所述测定植酸酶活性。在含0.5％植酸(≈5mM)，200mM乙酸钠，pH5.0的试验混合物中测定活性。在37℃培养15分钟后，加入等体积的15％的三氯乙酸终止反应。经过混合100μl试验混合物与900μlH2O和1ml 0.6M H2SO4，2％抗坏血酸和0.5％钼酸铵定量释放的磷酸。磷酸钾的标准溶液用作参考。一单位的酶活定义为37℃下每分钟释放1μmol磷酸的酶量。使用根据Pace等(1995)计算的280nm处酶的消光系数：真菌共有植酸酶，1.101；真菌共有植酸酶7，1.068确定蛋白质浓度。
对于pH最适值曲线，纯化的酶在10mM乙酸钠，pH5.0中稀释。经过将稀释的蛋白质等分试样与在一系列不同缓冲液：0.4M甘氨酸/HCl，pH2.5；0.4M 乙酸/NaOH，pH3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5；0.4M咪唑/HCl，pH6.0，6.5；0.4M Tris/HCl pH7.0，7.5，8.0，8.5，9.0中的等体积的1％植酸(≈10mM)混合开始保温。对照实验显示混合步骤仅对pH有微弱的影响。如上所述在37℃下进行保温15分钟。
为了测定植酸酶的底物特异性，试验混合物中的植酸用5mM浓度的各种磷酸化合物代替。如上所述进行活性测定。
为了测定温度最适值，在给定温度下预保温酶(100μl)和底物溶液(100μl)。经过向酶中加入底物溶液开始反应。保温15分钟后，用三氯乙酸终止反应并测定释放的磷酸量。
原始真菌共有植酸酶的最适pH大约为pH6.0-6.5(70U/mg)。经过导入Q50T突变，最适pH变为pH6.0(130U/mg)，而在相同位置以亮氨酸取代导致大约在pH5.5产生最大活性(212U/mg)。Q50G导致活性的最适pH超过pH6.0(见图4)。在位置51用天冬酰胺交换酪氨酸导致pH5.0下的活性相对增加(见图5)。特别是用Q50L突变显著增加真菌共有植酸酶对植酸的特异性(见图6)。
真菌共有植酸酶的最适温度(70℃)比用于计算共有序列的野生型植酸酶的最适温度(45℃-55℃)高15℃-25℃(见表5和图3)。
实施例10
以差示扫描量热术(DSC)测定解链温度
为了测定真菌共有植酸酶的解折叠温度，按以前公开的Brugger等(1997)所述进行差别扫描量热术。50-60mg/ml均一的植酸酶溶液用于该试验。进行10℃/分钟的恒定加热率以达到90℃。
测定的解链温度清楚地表明与野生型植酸酶相比真菌共有植酸酶热稳定性显著增强(见表5和图7)。图7显示了真菌共有植酸酶及其突变体Q50T的解链情况。其共同的解链温度测定为78至79℃。
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表1
土曲霉9A-1的植酸酶                      0.50
土曲霉cbs116.46的植酸酶                 0.50
黑色曲霉变种awamori的植酸酶             0.3333
黑色曲霉T213的植酸酶                    0.3333
黑色曲霉菌株NRRL3135的植酸酶            0.3333
烟曲霉ATCC13073的植酸酶                 0.20
烟曲霉ATCC32722的植酸酶                 0.20
烟曲霉ATCC58128的植酸酶                0.20
烟曲霉ATCC26906的植酸酶                0.20
烟曲霉ATCC32239的植酸酶                0.20
构巢曲霉的植酸酶                       1.00
嗜热踝节菌ATCC20186的植酸酶            1.00
嗜热毁丝霉的植酸酶                     1.00
表2                           ％相同性
土曲霉9A-1 土曲霉cbs116.46 黑色曲霉菌株NRRL3135 烟曲霉ATCC13073 构巢曲霉 嗜热踝节菌 嗜热毁丝霉
土曲霉9A-1 89.1 62.0 60.6 59.3 58.3 48.6
土曲霉cbs 90.7 63.6 62.0 61.2 59.7 49.1
黑色曲霉菌株NRRL3135 67.3 68.9 66.8 64.2 62.5 49.4
烟曲霉ATCC13073 66.1 67.2 71.1 68.0 62.6 53.0
构巢曲霉 65.0 66.7 69.0 73.3 60.5 52.5
嗜热踝节菌 63.8 64.5 68.9 68.1 67.4 49.8
嗜热毁丝霉 53.7 54.6 57.6 61.0 59.9 57.8
                                        ％相似性
表3
    植酸酶                  相同性[％]        相似性[％]
    黑色曲霉T213            76.6                79.6
    黑色曲霉变种awamori     76.6                79.6
    黑色曲霉菌株NRRL3135    76.6                79.4
    构巢曲霉                77.4                81.5
    土曲霉9A-1              70.7                74.8
    土曲霉cbs116.46         72.1                75.9
    烟曲霉ATCC13073         80.0                83.9
    烟曲霉ATCC32239         78.2                82.3
嗜热踝节菌                        72.7        76.8
嗜热毁丝霉                        58.3        64.5
表4
表4
突变                            引物对
                               Ssp BIQ50L         5’-CAC TTG TGG GGT T TG TAC AGT CCA TAC TTC TC-3’
         5’-GAG AAG TAT GGA CTG TAC AAA CCC CAC AAG TG-3’
                           KpnIQ50T         5’-CAC TTG TGG  GGT ACC TAC TCT CCA TAC TTC TC-3’
         5’-GA GAA GTA TGG AGA GTA GGT ACC CCA CAA GTG-3’Q50G         5’-CAC TTG TGG GGT GGT TAC TCT CCA TAC TTC TC-3’
         5’-GA GAA GTA TGG AGA GTA ACC ACC CCA CAA GTG-3’
                           KpnIQ50T-Y51N    5’-CAC TTG TGG  GGT ACC AAC TCT CCA TAC TTC TC-3’
         5’-GA GAA GTA TGG AGA GTT GGT ACC CCA CAA GTG-3’
                           BsaIQ50L-Y51N    5’-CAC TTG TGG  GGT CTC AAC TCT CCA TAC TTC TC-3’
         5’-GA GAA GTA TGG AGA GTT GAG ACC CCA CAA GTG-3’
表5
  植酸酶共有植酸酶黑色曲霉菌株NRRL3135烟曲霉ATCC13073土曲霉9A-1土曲霉cbs构巢曲霉嗜热毁丝霉  最适温度70℃55℃55℃49℃45℃45℃55℃  Tma78.0℃63.3℃62.5℃57.5℃58.5℃55.7℃-

Claims (5)

1.一种共有蛋白质，它具有图2所示的氨基酸序列或图2所示的序列通过缺失、添加和/或取代一个或多个氨基酸衍生的并且与图2所示的序列具有相同的生物功能的变异体或突变体。
2.权利要求1的共有蛋白质，其特征在于所述突变体在图2的氨基酸序列中进行了下列取代Q50L、Q50T、Q50G、Q50T-Y51N或Q50L-Y51N。
3.一种食品组合物，含有权利要求1或2的共有蛋白质。
4.一种饲料组合物，含有权利要求1或2的共有蛋白质。
5.一种药用组合物，含有权利要求1或2的共有蛋白质。
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