ES2202305T3 - Hidrolisis de fitina y composicion de enzimas que tienen actividad hidrolizante de fitato. - Google Patents
Hidrolisis de fitina y composicion de enzimas que tienen actividad hidrolizante de fitato.Info
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Abstract
UNA COMPOSICION ENZIMATICA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DE HIDROLIZACION DE FITATO SINERGESICO COMPRENDE UNA FITASA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DE HIDROLIZACION DE FITATO A UN PH ENTRE 2.5 Y 5.0 Y UNA FOSFATASA ACIDA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DE HIDROLIZACION DE FITATO A UN PH DE 2.5, EL PERFIL DE ACTIVIDAD CORRESPONDE A UN RELACION INFERIOR DE PH DE 2.5/5.0 Y VA DESDE 0.8/1.0 HASTA 3/1. DICHA COMPOSICION ENZIMATICA MUESTRA UNA EFICAZ HIDROLIZACION DE FITATO SINERGESICO MAS ELEVADA PREFERIBLEMENTE A TRAVES DEL TRATAMIENTO TERMICO. LAS ENZIMAS DE HONGOS PREFERIDAS ESPECIALMENTE SON LAS DE ASPERGILLUS. EMPLEO DE DICHA COMPOSICION ENZIMATICA EN ALIMENTACION, PRODUCTOS ALIMENTICIOS Y PIENSOS PARA MEJORAR LA HIDROLISIS DEL FITATO.
Description
Hidrólisis de fitina y composición de enzimas que
tienen actividad hidrolizante de fitato.
Esta invención pertenece al campo de la
hidrólisis de fitina por enzimas, en particular fitasas, capaces de
hidrolizar el compuesto órgano-fosforado fitato a
fósforo inorgánico e inositol.
Es un hecho establecido que la presencia de
minerales esenciales juega un papel importante en la alimentación
animal con piensos. La disponibilidad y asimilación de estos
componentes del pienso se refleja en el comportamiento del animal y
la excreción en el estiércol. Debido al incremento de la producción
intensiva de ganado, la producción de estiércol da lugar a problemas
medioambientales, en parte debido a sus fosfatos. Además, la
legislación concerniente a la problemática del estiércol,
especialmente al contenido de fósforo del estiércol, supone gastos,
lo que hace necesaria la reducción de la excreción de fósforo al
ambiente.
El fósforo se añade al pienso con diferentes
materias primas vegetales, subproductos animales y fósforo
inorgánico.
El ácido fítico o fitato es el éster
hexa-fosforado de inositol (hexaquisfosfato de
mio-inositol), que se encuentra en muchas semillas y
cereales. Actúa como la principal forma de almacenamiento tanto de
fósforo como de inositol y supone más del 50% del contenido total de
fósforo (LOLAS y col. 1976; SAUVER, 1989). Las semillas oleaginosas
pueden contener hasta 5,2% de fitina (REDDY y col., 1982).
Sin embargo, el fósforo de la fitina de la
materia prima vegetal se digiere mal por los animales monogástricos
tales como aves, cerdos y por el hombre debido a que éstos tienen un
tracto intestinal simple: carecen o tienen muy poca actividad de
fitasa intestinal para catalizar la hidrólisis de estos fitatos en
su intestino y el fósforo de fitina liberado en el colon es
excretado al ambiente. La materia prima vegetal constituye, por
este medio, una fuente pobre en fósforo para alimentación animal, y
ha de incluirse fósforo adicional en la dieta por subproductos
animales o fosfatos inorgánicos.
Además, la fitina se considera como un factor
anti-nutricional debido a sus propiedades quelantes:
enlaza muchos cationes multivalentes tales como Ca^{2+},
Fe^{3+}, Mg^{2+} y Zn^{2+} por formar con ellos complejos
insolubles y de aquí que reduzca la biodisponibilidad y absorción de
estos minerales esenciales en la dieta. Además, la formación de
complejos de las proteínas con fitina (COS-GROVE,
1966) obstruye la digestión de proteina enzimática.
Los efectos negativos de la fitina sobre el
metabolismo del fósforo y minerales, unido a una alta excreción de
fósforo al ambiente y la existencia de una legislación concerniente
a la excreción de fósforo, hace necesario volver biodisponible el
fósforo de fitina.
La fitina puede hidrolizarse enzimáticamente por
fitasas que están presentes en la materia prima vegetal o ser
producida por microorganismos.
La fitasa de enzimas (hexafosfato de
mio-inositol fosfohidrolasa E.C. 3.1.3.8.) hidroliza, en
condiciones apropiadas, ácido fítico o fitato
a fosfato inorgánico, inositol y monofosfatos de
inositol a pentafosfatos.
La fitasa está ampliamente distribuida en plantas
y microorganismos, especialmente hongos, pero se encuentra
únicamente en cantidades insignificantes en el tracto intestinal de
animales monogástricos.
Las fitasas vegetales, debido a su baja
estabilidad al pH y al estrecho intervalo de
actividad-pH (SUTARDI & BUCKLE, 1986; LOLAS
& MARKAKIS, 1977) son rápidamente inactivadas en el tracto
digestivo de animales monogástricos, y su eficacia in vivo es
baja (EECKHOUT & DE PAEPE, 1991). Tienen por tanto una
importancia menor para la formulación de piensos compuestos para
animales.
Por el contrario, algunas fitasas microbianas
tienen una amplia estabilidad al pH y amplio intervalo de
actividad-pH, por lo que la fitina puede ser
hidrolizada más eficazmente en el tracto intestinal del animal. Por
esta razón, se han desarrollado procedimientos de potenciamiento
del fósforo de fitina en las dietas de animales por aplicación de
fitasa que pueda tolerar el medio ácido del estómago. Sin embargo,
la termo-estabilidad de fitasa es todavía demasiado
baja para resistir las altas temperaturas (70-80ºC)
alcanzadas durante el proceso de manufactura del pienso compuesto.
Por esta razón, puede ser necesario aplicar una sobredosis de
30%.
Ya se ha demostrado in vivo que la adición
de fitasa de hongos puede mejorar la asimilación de fósforo de
fitina y minerales, incrementándose el coeficiente de conversión de
fósforo y reduciéndose la cantidad de fósforo en piensos y
estiércol.
La actividad de fitasa microbiana está bien
documentada. Esta fitasa, próxima a la fitasa bacteriana (GREAVES y
col. 1967; IRVING & COS-GROVE, 1971; POWAR &
JAGANNATHAN, 1982) y fitasas de levadura (NAYINI & MARKAKIS,
1984), se encuentra principalmente en mohos, en particular en cepas
de Aspergillus (SHIEN & WARE, 1968; YAMAMOTO y col.,
1972; YOUSSEF y col., 1987). La mayoría de estas cepas, y otros
microorganismos, producen también ácido fosfatasas. Aunque algunas
fosfatasas se han designado como fitasas, son bastante inespecíficas
y su actividad hidrolítica para fitina es baja comparada con la que
tienen para otros fosfatos orgánicos.
Dependiendo de las condiciones de fermentación,
la cepa tipo silvestre Aspergillus ficuum NRRL 3135 produce
una mezcla de fosfatasas y fitasas extracelulares. La síntesis de
fitasa y ácido fosfatasa se puede regular por la concentración de
fósforo, según métodos conocidos en la especialidad (SHIEH y col.,
1969; ULLAH y CUMMINS, 1987). Solicitudes de patente recientemente
publicadas reivindican la utilización de cepas de Aspergillus
ficuum NRRL 3135 y Aspergillus niger tratados por
ingeniería genética para obtener un alto nivel de producción de
fitasa (E.P. 0 420 358 A1). En este documento se menciona también la
clonación de ácido fosfatasa.
La purificación de caldo de cultivo de fitasa de
A. ficuum NRRL 3135 bruto (ULLAH & GIBSON, 1987) da una
fitasa con dos puntos óptimos de pH distintos: la actividad más alta
se encuentra a pH 5,0-5,5 mientras que el segundo
pico de actividad (60% de actividad a pH 5,0) aparece a pH 2,2.
ULLAH & CUMMINS (1987) han purificado una
ácido fosfatasa de Aspergillus ficuum NRRL 3135 (monoéster
ortofosfórico fosfohidrolasa E.C. 3.1.3.2.) con un óptimo a pH 2,5.
La acido fosfatasa es 65% menos activa a pH 4,5 y es virtualmente
inactiva a pH 6,0. Otra ácido fosfatasa ha sido purificada por
ULLAH & CUMMINS (1988) con un óptimo de pH 6,0.
Ambas acido fosfatasas eran inestables e
incapaces de acomodar fitato como substrato aunque presentan una
amplia selectividad de substrato sobre varios fosfomonoésteres
orgánicos (ULLAH & CUMMINS, 1988). IRVING & COSGROVE (1974)
por el contrario han mencionado una actividad secundaria (16%) de
acido fosfatasa de A. ficuum con óptimo de pH 2,2 sobre
fitato.
Publicaciones recientes de ZYLA (1993) describen
la acción de ácido fosfatasa en presencia de fitasa de
Aspergillus niger sobre materia prima de piensos y piensos a
diferentes valores de pH.
La fitasa de A. ficuum NRRL 3135 y ácido
fosfatasas no solamente difieren entre si en especificidad de
substrato y óptimos de pH, sino también en óptimos de temperatura.
La fitasa desarrolla la actividad más alta a 58ºC y pierde toda
actividad a 68ºC. La acido fosfatasa con óptimo de pH de 2,5 tiene
un punto óptimo de temperatura de 63ºC y aún retiene el 88% de su
actividad catalítica a 70ºC.
El óptimo de temperatura de la ácido fosfatasa
con óptimo de pH 6,0 es también 63ºC, pero la enzima pierde el 92%
de su actividad a 70ºC. A partir de esto, se llega a la conclusión
de que la ácido fosfatasa con óptimo a pH 2,5 es activa en un
intervalo de temperatura más alto que la fitasa y la ácido
fosfatasa con óptimo de pH 6,0.
Una acido fosfatasa intracelular
no-purificada de un micelio inutilizado de
Aspergillus niger tiene un óptimo de pH de 1,8 a 2,6 y un
óptimo de temperatura de 60ºC. La actividad de ácido fosfatasa
residual a pH 4,5 era aún el 85% de su máximo (ZYLA y col.,
1989).
La actividad de fitasa de Aspergillus
ficuum se suplementa para piensos de cerdos y pollos según la
fitina y la reducción del fósforo fecal deseadas, combinado con una
buen comportamiento del animal, incluyendo el crecimiento y la
transformación del pienso. Se menciona una actividad de fitasa de
500 a 1000 Unidades (pH 5)/kg de pienso para dietas de cerdos y
pollos (SIMONS y col., 1990), en el que la actividad de 500
unidades/kg es igual a 0,8 g de fósforo/kg en pienso para cerdos y
1,0 g/kg en pienso para pollos (BORGGREVE, 1991; VAHL, 1991). La
adición recomendada de fitasa a piensos de cerdos está limitada a
600 unidades/kg debido a un efecto decreciente de unidades
adicionales (manual Natuphos, Gist-Brocades).
La hidrólisis in vitro de fitina en la
materia prima vegetal salvado de trigo y habas de soja con ácido
fosfatasa de Aspergillus niger intracelular no- purificada
queda completada al cabo de 2 horas a la respectiva dosificación de
12000 y 30000 unidades/kg, 40ºC y pH 4,5, mientras que la hidrólisis
de fitina en pienso para pollos queda completada al cabo de 4 horas
de reacción en las mismas condiciones. Esto refleja la ineficacia de
la ácido fosfatasa para degradación de fitina (ZYLA y col.,
1989).
ZYLA y KORELESKI (1993) indican que la acción
in vitro de ácido fosfatasa adicionada a fitasa de
Aspergillus niger sobre semillas de colza y habas de soja
está influida por el pH de la incubación. Las incubaciones se llevan
a cabo a una relación ácido fosfatasa/fitasa relativamente alta
(3,5/1 a 62/1 expresada en actividad hidrolizante de fitato).
ZYLA (1993) ha indicado que la acción de
desfosforilación de ácido fosfatasa de Aspergillus niger
sobre fitina es diferente de la acción de fitasa de Aspergillus
niger, dando lugar a una acción aditiva entre ambas enzimas (y
un tiempo de degradación más corto). La liberación total de fósforo
desde fitato se indicaba como más lenta con la preparación de fitasa
más purificada (es decir, relación más baja de ácido
fosfatasa/fitasa). No obstante, la preparación más purificada aún
contenía una relación alta de ácido fosfatasa/fitasa (3,5/1).
El documento WO 94/030072 que reivindica una
prioridad de fecha del 31 de julio de 1992 pero está publicada el 17
de febrero de 1994, es decir, después de la fecha de registro de la
solicitud de la patente objeto, describe células huésped
recombinantes que producen fitasa recombinante y ácido fosfatasa
recombinante pH2,5, derivando ambas enzimas de Aspergillus
niger var. awamori cepa ALK0243. Estas enzimas se producen en
una relación de actividad de enzima ácido fosfatasa pH 2,5 a
actividad de enzima fitasa de 3:1 a 16:1. Se ha demostrado que tales
muestras tienen una actividad de enzima cooperativa.
Esta invención se basa en el descubrimiento de
una interacción sinérgica de ácido fosfatasas y fitasas fúngicas,
mezcladas a una relación baja de ácido fosfatasa/fitasa, durante
hidrólisis in vitro e in vivo de fitina en materia
prima vegetal y en piensos.
Esta invención proporciona una composición de
enzimas que tiene una actividad hidrolizante de fitato que comprende
una fitasa que tiene una actividad hidrolizante de fitato a un pH
en el intervalo de 2,5 a 5,0 y una acido fosfatasa que tiene una
actividad hidrolizante de fitato a pH 2,5, en una relación (a:p) de
su actividad a pH 2,5(a) y pH 5(p) sobre fitato desde
0,8:1 a por debajo de 3:1 teniendo acción sinégica sobre fitato.
En una composición de enzimas según la invención,
la relación de ácido fosfatasa/fitasa corresponde preferiblemente a
un perfil pH 2,5/ 5,0 de 1/1 a 2,5/1, más preferiblemente de 1,5/1
a 2/1.
En una composición de enzimas según la invención,
la fitasa es preferiblemente una fitasa fúngica, más preferiblemente
una fitasa de Aspergillus. Lo más adecuado es seleccionar
la fitasa fúngica del grupo que consiste en fitasa de
Aspergillus ficuum, fitasa de Aspergillus niger y
fitasa de Aspergillus terreus.
En una composición de enzimas de la presente
invención, la ácido fosfatasa es preferiblemente una ácido fosfatasa
fúngica, más preferiblemente una ácido fosfatasa de
Aspergillus, Más adecuadamente, la ácido fosfatasa fúngica se
selecciona del grupo que consiste en ácido fosfatasa de
Aspergillus ficuum, ácido fosfatasa de Aspergillus
niger y ácido fosfatasa de Aspergillus terreus.
Preferiblemente la ácido fosfatasa es una fosfatasa térmicamente
estable, en particular una enzima que es más estable térmicamente
que la fitasa.
En particular, esta invención se refiere a una
composición de enzimas como se ha definido antes que presenta una
relación mejorada por tratamiento térmico, es decir, después de
tratamiento térmico muestra una eficacia sinérgica mejorada como
resultado de un aumento de la relación ácido fosfatasa/fitasa.
La invención proporciona además un producto
alimenticio, un pienso o forraje, o componente de los mismos, que
contiene una composición de enzimas como se ha definido antes, que
incluyen un alimento, pienso o forraje tratados térmicamente, o un
componente de los mismos, que contienen la composición de enzimas
aquí definida.
Además, esta invención proporciona un
procedimiento para hidrólisis de fitato, que comprende la etapa de
tratamiento de una materia prima que contiene fitato con una
composición de enzimas como la aquí definida, llevándose a cabo el
citado tratamiento en condiciones de hidrólisis a un pH de
aproximadamente 2 a aproximadamente 6 donde la fitasa y la ácido
fosfatasa de la citada composición de enzimas tiene actividad
hidrolizante.
Preferiblemente, el citado tratamiento se lleva a
cabo a un pH de aproximadamente 2,5.
En el citado proceso, la materia prima que
contiene fitato es preferiblemente una materia prima vegetal,
(plantas), más en particular tal como materia prima de habas de
soja o trigo.
La invención proporciona además una planta
genéticamente modificada, o una parte o producto derivado de la
misma, conteniendo la citada planta, parte de planta o producto de
ella, un gen que codifica una fitasa fúngica que tiene una
actividad hidrolizante de fitato a un pH en el intervalo de 2,5 a
5,0 y un gen que codifica una ácido fosfatasa fúngica que tiene una
actividad hidrolizante de fitato a un pH de 2,5, estando ligados
ambos genes eficazmente a secuencias de control transcripcionales y
traduccionales para permitir la expresión de las encimas codificadas
por los citados genes en una relación (a:p) de su actividad a pH 2,5
(a) y pH 5(p) sobre fitato de 0,8:1 a por debajo de 3:1 que
tienen una acción sinérgica sobre fitato.
La invención proporciona también un procedimiento
para mejorar la digestión del pienso o forraje en la producción de
ganado y reducción de la excreción de fósforo en el estiércol del
ganado, que comprende alimentar el ganado con un pienso o forraje
que contiene una composición de enzimas como aquí se ha
definido.
La presente invención describe la degradación
enzimática mejorada de fitina de plantas por una mezcla apropiada de
ácido fosfatasa/fitasa debido a la interacción sinérgica entre ambas
enzimas.
En la naturaleza, la fitina actúa como la forma
de almacenamiento principal tanto de fósforo como de inositol en
muchas semillas de plantas y cereales. Durante el brotado, el
fósforo es liberado de la fitina por la acción de la fitasa,
presente en esas semillas y cereales.
\newpage
Cuando se utiliza esta materia prima vegetal en
la industria de alimentos y piensos, la fitina es una fuente
potencial de fósforo para el hombre y para los animales. Sin
embargo, la biodisponibilidad de esta fitina es limitada para los
seres monogástricos: las fitasas vegetales quedan inactivadas en el
tracto gastrointestinal por los ácidos del estómago, por lo que su
eficacia in vivo es baja. Por lo tanto, se pueden
desarrollar procedimientos para la mejora de la biodisponibilidad de
fósforo de fitina y por tanto de la biodisponibilidad y absorción
de los minerales esenciales de la dieta.
- a.
- pretratamiento enzimático de materia prima vegetal para incrementar fósforo digerible;
- b.
- pretratamiento enzimático del pienso o del alimento;
- c.
- acción de fitasa in vivo
Aunque las fitasas vegetales pueden jugar un
importante papel en el pre- tratamiento de materia prima vegetal,
piensos y alimentos (pH neutro), su importancia disminuye en la
acción in vivo (pH 2 del estómago).
La hidrólisis de fitina in vivo se puede
alcanzar mejor con fitasas microbianas, más específicamente fitasas
fúngicas, que pueden desarrollar una alta actividad en el pH ácido
del estómago, y que tienen estabilidad a un pH alto. Las enzimas
hidrolizantes de fitina son producidas por hongos que pertenecen al
género Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Botrytis,.... Estos
hongos producen una mezcla de ácido fosfatasas (E.C. 3.1.3.2) y
fitasas (E.C.3.1.3..8), que hidrolizan la fitina, ambas, pero con
una especificidad diferente para fitato y monoésteres fitato. Sin
embargo, la mayoría de estos organismos tienen un bajo nivel de
producción de enzimas. Como el nivel de producción de estas enzimas
es de suma importancia para hacer económico el proceso, se ha
seleccionado el Aspergillus ficuum NRRL 3135 como cepa
altamente productiva. Son hongos alternativos Aspergillus
niger y Aspergillus terreus, con un menor nivel de
producción.
Aunque tanto las ácido fosfatasas como la fitasas
pueden hidrolizar la fitina purificada disuelta, las ácido
fosfatasas muestran poca actividad sobre la fitina en materia prima
vegetal, piensos y alimentos, tanto in vitro como in
vivo. Por esta razón han sido desechadas hasta recientemente
como enzimas hidrolizantes de fitina. Sin embargo, a pesar de la
baja actividad hidrolizante de fitina de las ácido fosfafasas
cuando se utilizan como única fuente de enzima, la acción de fitasa
sobre fitina se puede mejorar suplementándola con ácido fosfatasa,
debido a la acción sinérgica entre ambas enzimas, dosificadas a
relaciones fijas de actividad ácido fosfatasa/fitasa. La acción
sinérgica se presenta a composición apropiada y relación baja de
ambas enzimas.
Junto a la estabilidad al pH, la termoestabilidad
de las enzimas que hidrolizan fitina es un factor importante para
los procesos de producción de alimentos y piensos. Ya que los
actuales procedimientos de producción de piensos compuestos son
frecuentemente para piensos aglomerados, las enzimas que se añaden
al pienso antes de la formación de los aglomerados deberán resistir
las altas temperaturas alcanzadas en los molinos de piensos
(75-80ºC) para asegurar una hidrólisis de fitina
predecible. Una fitasa de A. ficuum se desnaturaliza
parcialmente a estas temperaturas, por lo que es necesario una
sobredosis de un 30%. Por el contrario, la ácido fosfatasa de A.
ficuum es más estable, por lo que es menor la
desnaturalización, y una mezcla de ácido fosfatasa/fitasa es más
estable al proceso de aglomerado del pienso que la propia
fitasa.
Según esto, por utilización de una mezcla de
ácido fosfatasa y fitasa en lugar de fitasa como única enzima,
mejora la hidrólisis de fitina vegetal, no solo como resultado de
la mayor termoestabilidad de esta mezcla de enzimas, sino
principalmente como resultado de una interacción sinérgica mejorada
entre ambas enzimas ya que la relación de actividad hidrolizante de
fitato a pH 2,5/5,0 aumentará por la diferente degradación térmica
de ambas enzimas.
La acido fosfatasa fúngica de A. ficuum ó
A. niger (E.C.3.1.3.2) y fitasa de A. ficuum
(E.C.3.1.3.8) son capaces, ambas, de hidrolizar fitato dodecasódico
en líquido, pero su principal actividad es diferente: la fitasa
tiene una actividad principal sobre fitato (1) y una actividad
secundaria sobre ésteres mono-fosfato (2); la ácido
fosfatasa tiene una actividad principal sobre ésteres monofosfato
y una actividad secundaria sobre fitato (ejemplo I). La relación
(1)/(2) de actividad de fitasa de Aspergillus ficuum sobre
fitato y \beta-glicerofosfato disódico asciende
a 6,6, mientras que la relación de ácido fosfatasa de A.
ficuum (1)/(2) asciende a 0,13, lo que indica la elevada
especificidad de fitasa para fitato. Para Aspergillus niger,
la relación (1)/(2) asciende a 0,17. Tal como se emplea en adelante,
la actividad de ácido fosfatasa se refiere siempre a hidrólisis de
fitato. La ácido fosfatasa tiene una actividad óptima a pH 2,3,
mientras que la fitasa tiene una actividad óptima a pH 5,0, con un
segundo pico de actividad a 2,5. Las mezclas de enzimas de fitasa y
fosfatasa se caracterizan además por la relación (a:p) de su
actividad a pH 2,5 (a) y pH 5 (p) sobre fitato. Se ha encontrado que
la relación de fitasa pura a/p es 0,6/1 y la relación a/p de ácido
fosfatasa pura es 1/0.
Las soluciones de fitasa y ácido fosfatasa de
A. ficuum NRRL 3135 y A. niger se han obtenido por
métodos conocidos en la especialidad.
Se realizó un ensayo de fitasa in vitro
sobre pienso para cerdos convencional, nivel bajo de humedad (70%),
pH 2,5 y temperatura 40ºC, 3 horas de incubación, para determinar el
componente activo en preparaciones de fitasa (figuras).
\newpage
Se añadieron dosis de preparaciones de fitasa de
A.ficuum NRRL 3135 con diferentes relación a/p al pienso de
cerdos, basado en actividad a pH 2,5 (Ua) o basado en actividad a
pH 5 (Up) sobre fitato.
No existía una correlación directa entre la
actividad de fitasa a pH 2,5 y la hidrólisis de fitina, aunque la
degradación tenía lugar a pH 2,5, y la ácido fosfatasa era capaz de
hidrolizar el fitato de sodio disuelto en el líquido (figura 1).
Por otra parte, la hidrólisis de fitina podía correlacionarse con la
actividad de fitasa a pH 5,0, especialmente cuando las
preparaciones de fitasa se separaron en preparaciones con relación
a/p < 1,5/1 y preparaciones con relación de a/p entre 1,5/1 y 3/1
(figura 2).
Según esto, se puede concluir que la actividad de
ácido fosfatasa sobre la fitina del pienso no era dominante. Sin
embargo, se detectó aún una variación entre las diferentes
preparaciones de fitasa, dosificada a la misma actividad de pH 5,0.
Se encontró que esta variación correspondía a diferente actividad de
ácido fosfatasa en las preparaciones de fitasa (ejemplo II): cuando
la relación a/p aumentaba de 0,6/1 a 3/1, y consiguientemente
aumentaba la cantidad de ácido fosfatasa, quedaba favorecida la
hidrólisis de fitina en el pienso para cerdos y la eficacia de la
mezcla de fitasa (cantidad de fósforo de fitina liberado por la
preparación de fitasa (actividad a pH 5,0) - (g PP/500 Up)
aumentaba (figura 3).
Se comprobó la importancia de ácido fosfatasa de
A. ficuum 1/0 en una preparación de fitasa con a/p > 0,6/1
por hidrólisis in vitro de fitina de pienso para cerdos por
preparaciones de fitasa 0,6/1 y 1/1, con y sin suplemento de ácido
fosfatasa 1/0 a una relación a/p igual a 2/1 (ejemplo III). Se
observó además un efecto sinérgico entre la fitasa y la ácido
fosfatasa. La dosificación de la misma actividad de fitasa 0,6/1
(Up) al pienso para cerdos, suplementada con ácido fosfatasa a una
relación a/p 2/1, incrementaba la eficacia de fitasa de 0,55 a 1,25
g PP/500 Up, con un efecto sinérgico de 0,49 g PP/500 Up. El efecto
sinérgico entre fitasa y ácido fosfatasa de A. ficuum sobre
el pienso para cerdos era máximo a una relación a/p de
1,5-2/1 y presentaba un efecto decreciente cuando
a/p se incrementaba a 3/1. Por encima de esta relación, no puede
detectarse ningún efecto sinérgico adicional (figura 3).
Los piensos difieren uno de otro en la
composición de material del pienso y pueden, como tales, influir en
la acción de fitasa, así como en interacción sinérgica entre
preparaciones de fitasa y de ácido fosfatasa. Se incubaron
diferentes piensos para cerdo y aves, tales como piensos para
lechones, cerdas, cerdos, pollos y gallinas, in vitro, con
preparaciones de fitasa a/p1,6/1, 0,6/1 y una mezcla de fitasa
0,6/1 y ácido fosfatasa 1/0 a a/p 2/1.
Todas las eficacias de fitasa y ácido fosfatasa
diferían mucho para los diferentes piensos (por ejemplo, fitasa
0,6/1:0,25 \rightarrow 1,5 g PP/500 Up; ácido fosfatasa: 0,025
\rightarrow 0,15 g PP/500 Ua), lo que indicaba que la cantidad de
fitina de las diferentes materias primas era diferente, e influía en
su hidrólisis enzimática.
El efecto sinérgico de acido fosfatasa de A.
ficuum, detectado en piensos convencionales para cerdos era
transferible a los otros piensos, pero con diferente intensidad
para los diferentes piensos (0,25 \rightarrow 0,94 g PP/500
Up).
La influencia del origen de la fitina sobre el
efecto sinérgico entre fitasa y ácido fosfatasa, como se ha supuesto
antes, se ensayó por degradación de fitina in vitro de las
diferentes materias primas vegetales que se encuentran
frecuentemente en piensos compuestos para animales: guisantes,
salvado de trigo, habas de soja y salvado de arroz (ejemplo V). Se
suplementó fitasa de A. ficuum 0,6/1 con ácido fosfatasa de
A. ficuum 1/0 a una relación a/p = 2/1.
Las eficacias de fitasa de A. ficuum
(0,6/1 y 2/1), así como de ácido fosfatasa (1/0), eran muy
variables. Aunque la ácido fosfatasa tenía muy poca eficacia sobre
el pienso convencional para cerdos (0,15 g PP/500 Ua), esta ácido
fosfatasa (0,8 g PP/500 Ua) podía hidrolizar fácilmente la fitina de
algunas plantas, tal como fitina de salvado de arroz. La fitina de
otras plantas, como salvado de trigo y fitina de harina de soja era
muy difícil de hidrolizar por la ácido fosfatasa de A.
ficuum (0,2 g PP/500 Ua).
El efecto sinérgico entre la fitasa y la ácido
fosfatasa de A. ficuum, observado en piensos, solo se
encontraba en aquellas materias primas vegetales en las que la
propia ácido fosfatasa tenía poca eficacia (0,2 g PP/500 Ua):
sinergia en harina de habas de soja: 0,57 g PP/500 Up; sinergia en
salvado de trigo: 0,47 g PP/500 Up.
El efecto sinérgico entre la fitasa y la ácido
fosfatasa de A. ficuum era bajo, cuando la fitina se
hidrolizaba ya por la propia ácido fosfatasa: sinergia de salvado
de arroz: 0,13 g PP/500 Up). La fitina de guisante era muy difícil
de hidrolizar por ambas enzimas, y no pudo detectarse una
interacción sinérgica.
Por consiguiente, la interacción entre ácido
fosfatasa 1/10 y fitasa 0,6/1 de A. ficuum en pienso puede
explicarse como resultado del efecto aditivo normal suplementado
por diferentes efectos sinérgicos sobre las diferentes materias
primas vegetales que componen el pienso.
La fitasa y la ácido fosfatasa de A.
ficuum NRRL 3135, se producen también por cepas de
Aspergillus niger. Como el A. ficuum, el A.
niger produce una mezcla de fitasa y ácido fosfatasa
extracelulares. La ácido fosfatasa de A. niger 1/0 tiene un
perfil idéntico de actividad con el pH que la ácido fosfatasa de
A. ficuum con un óptimo de pH 2,3. Los siguientes
experimentos probaron el efecto sinérgico entre fitasas y ácido
fosfatasas de diferentes orígenes fúngicos.
La hidrólisis de fitina in vitro en
piensos convencionales para cerdos por preparaciones líquidas de
fitasa de A. niger era idéntica a la hidrólisis con
preparaciones de fitasa de A. ficuum NRRL 3135 (ejemplo VI).
La eficacia de fitasa de A. niger se incrementaba de 0,75 a
1,15 g PP/500 Up cuando la relación a/p de la preparación de fitasa
aumentaba de 0,9/1 a 1,6/1.
La adición de ácido fosfatasa, ya fuera de A.
niger o de A. ficuum NRRL 3135, a una preparación de
fitasa de A. niger de a/p 1,15/1 para incrementar la
relación a/p a, respectivamente, 1,9/1 y 1,6/1, demostró la
interacción sinérgica de estas enzimas (Ejemplo (VII).
La eficacia de las dos ácido fosfatasas era
similar. Cuando se añadía ácido fosfatasa a la fitasa de A.
niger 1,15/1, el fósforo de fitina residual en el pienso era
cero, por lo que no pudo calcularse correctamente la eficacia de la
enzima ni la sinergia debido al agotamiento del substrato
fitato.
Se observó también una interacción sinérgica
entre ácido fosfatasa de A. niger y fitasa de A.
ficuum NRRL 3135: se doblaba la eficacia (0,85 \rightarrow
1,8 g PP/500 Up) cuando la fitasa de A. ficuum 0,6/1 era
suplementada con ácido fosfatasa de A. niger 1/0 a a/p 1,9/1,
con un efecto sinérgico de 0,62 g PP/500 Up (ejemplo VIII).
La ácido fosfatasa de A. ficuum NRRL 3135
1/0 tiene la ventaja de una termoestabilidad potenciada en
condiciones líquidas, y durante la formación de los aglomerados de
pienso, por lo que podía ser promovido el efecto sinérgico entre
fitasa 0,6/1 y ácido fosfatasa 1/0 en pienso de aglomerados.
La desnaturalización de una solución de fitasa
líquida 0,6/1 ascendía al 60%, tanto para actividad a pH 2,5 como a
pH 5, al cabo de un minuto a 80ºC y pH 5 (tampón acetato 0,5 M),
mientras que una solución de ácido fosfatasa de 1/0 solo perdía un
10% de su actividad bajo condiciones idénticas de incubación.
Se simuló la termoestabilidad en condiciones de
fabricación de piensos. Se llenaron viales con pienso convencional
para cerdos suplementado con una fitasa líquida 0,6/1 o preparación
de ácido fosfatasa 1/0. La humedad de la mezcla era 12,2%. Los
viales se cerraron y calentaron a diferentes temperaturas (60- 90ºC)
por inmersión en un baño maría (ejemplo IX).
La actividad de ácido fosfatasa de A.
ficuum 1/0 (pH 2,5) ascendía a 100% aún después de calentar 10'
a 70ºC, mientras que la fitasa de A. ficuum 0,6/1 tenía ya
una pérdida del 40% de su actividad (pH 2,5). A 80ºC, la actividad
de ácido fosfatasa decrecía a 65% y la actividad de fitasa a
35%.
La mayor termoestabilidad de ácido fosfatasa de
A. ficuum 1/0, ya detectada en líquido y pienso, se detectó
además a escala piloto y escala de molino industrial.
El pienso para cerdos, suplementado con líquido
de fitasa 0,6 o de ácido fosfatasa 1/0 de A. ficuum (3000
Ua/kg de pienso), se transformó en aglomerados a escala piloto
(ejemplo X). La temperatura de los aglomerados se controló por
adición de vapor al acondicionador de harina.
La fitasa 0,6/1 perdía una media del 55% de su
actividad a una temperatura de aglomerado en el intervalo de
68,6-72,1ºC, mientras que la ácido fosfatasa 1/0
solo perdía una media de 25% de su actividad a
71,6-73,1ºC (actividad a pH 2,5).
Se llevó a cabo un experimento de obtención
industrial de aglomerados con preparaciones de fitasa desecada. La
fitasa 0,6/1 y mezcla de fitasa 1,25/1 se mezclaron con un pienso
para cerdos convencional (900 Up/kg de pienso) y se hicieron pasar a
través de un molino industrial para piensos (ejemplo XI). La
eficacia de la mezcla de fitasa 1,25/1 en la harina, antes de la
formación de aglomerados era el160% de la eficacia de la fitasa
0,6/1: 0,95 \leftrightarrow 0,6 g PP/500 Up. Después de la
formación de los aglomerados, a aproximadamente 75ºC (temperatura de
aglomerado), la eficacia de la fitasa 1,25/1 ascendía a 190% de la
fitasa 0,6/1:0,75 \leftrightarrow 0,4 gPP/500 Up. Este aumento se
puede adscribir a una combinación de una mayor termoestabilidad de
la ácido fosfatasa 1/0 presente en la preparación de fitasa 1,25/1 y
al efecto sinérgico entre ambas enzimas: la pérdida de actividad
(33%) del componente fitasa 0,6/1 en la preparación de fitasa
1,25/1, era compensado por el incremento de la relación de a/p a
1,25/0,66 = 1,9/1 en el pienso aglomerado.
El efecto sinérgico entre fitasa 0,6/1 y ácido
fosfatasa 1/0 de A. ficuum NRRL 3135, observado durante la
hidrólisis de fitina in vitro y la mayor termoestabilidad de
la ácido fosfafasa, puede favorecer la hidrólisis de fitina in
vivo en el pienso aglomerado.
Se llevaron a cabo pruebas de digestión in
vivo con cerdos (ejemplos XII y XIII) para determinar el efecto
de ácido fosfatasa 1/10 de A. ficuum, suplementada con fitasa
0,6/1 de A. ficuum. La acción de fitasa o ácido fosfatasa
in vivo se midió a través del fósforo digerible fecal (dP)
debido a la hidrólisis enzimática de fitina. El dP fecal in
vivo se calculó como sigue: ingesta total de fósforo -
excreción total de fósforo. El aumento de dP se calcula por la
diferencia del dP in vivo y el dP calculado durante la
formulación del pienso.
En la prueba I con cerdos (ejemplo XII) el dP
incrementado en 0,78 g/kg de pienso por adición de fitasa 0,6/1 a
750 Up/kg de pienso; suplementación de la fitasa con ácido
fosfatasa 1/0 a 1050 Ua/kg de pienso para aumentar la relación a/p
a 2/1 incrementaba el dP a 0,89 g/kg de pienso, con una eficacia
sinérgica de 0,055 g dP/500 Up. La ácido fosfatasa añadida en
solitario al pienso (1050 Ua/kg de pienso) no tenía influencia
ninguna sobre el nivel de dP en el pienso: el dP permanecía sin
cambiar después del período de ensayo.
La eficacia de la fitasa en esta prueba fue baja
(0,52 g de dP/500 Up) debido a su alta dosificación.
Por adición de ácido fosfatasa a la fitasa, la
eficacia global aumentaba el 13% respecto a 0,52 a 0,59 g dP/500
Up.
El efecto sinérgico in vivo en dP para los
dos casos, fitasa y mezcla de fitasa/ácido fosfatasa se traducía
también en una menor excreción de fósforo: la adición de fitasa (750
Up/kg de pienso) reducía la excreción de fósforo en 37%, mientras
que la mezcla de fitasa/ácido fosfatasa reducía la excreción de
fósforo en 41% comparando con el pienso de control. Esta reducción
suplementaria de la excreción (11% relativo) puede reflejarse en un
menor coste respecto a la legislación sobre excreción de
fósforo.
En la prueba II con cerdos (ejemplo XIII) se
dosificó fitasa 0,6/1 al pienso para cerdos al nivel recomendado de
400 Up/kg. El dP se incrementaba en 0,58 g/kg de pienso por adición
de fitasa y en 0,62 g/kg por suplementar la fitasa con ácido
fosfatasa 1/0 (580 Ua/kg) a una relación a/p igual a 2/1.
Rebajando el nivel de fitasa, su eficacia se
incrementaba a 0,725 g dP/500 Up.
Por adición de ácido fosfatasa, la eficacia
global aumentaba en 24% (relativo) a 0,9 g dP/500 Up, con un efecto
sinérgico de 0,125g dP/500 Up.
Partiendo de las pruebas I y II se puede llegar a
la conclusión que el efecto sinérgico in vivo entre fitasa y
ácido fosfatasa de A. ficuum es más pronunciado a niveles de
fitasa y ácido fosfatasa más bajos (ejemplo XIV). Cuando la
dosificación de la mezcla de fitasa + ácido fosfatasa decrecía de
750 Up + 1050Ua/kg a 400 Up + 580 Ua/kg, la eficacia aumentaba de
0,59 a 0,9 g dP/500 Up.
Se hidrolizó fitina vegetal in vitro en
pienso convencional para cerdos con 33% de fósforo de fitina por
diferentes preparaciones de fitasa de Aspergillus ficuum con
una relación a/p, que variaba entre 1/0 y 16/1. Los componentes
principales del pienso para cerdos eran tapioca, guisantes, pienso
de gluten de maíz, pienso de gluten de trigo, habas de soja
extraídas.
Las preparaciones de fitasa se dosificaron a
diferentes niveles:
- 1,0-2,5 Ua (actividad a pH 2,5)/g de pienso (figura 1)
- 2,0-2,8 Up (actividad a pH 5)/g de pienso (figura 2).
Se midió el fósforo de fitina total del pienso
según ELLIS y MORRIS (1983 y 1986). Se añadió una preparación de
fitasa adecuadamente diluida a 2 g del pienso, se adaptó la humedad
de la mezcla a 70% por adición de tampón Sörensen 0,2 M pH 2,5, y la
mezcla se incubó a 40ºC durante 3 horas. Después de la incubación,
se extrajo el pienso con 40 ml de HCl al 2,4% (3 horas), y se midió
el fósforo de fitina residual en el extracto después por
cromatografía de intercambio de ión y destrucción de fitina.
Una unidad de fitasa sobre fitato a pH 5 se
abrevia aquí como Up, mientras que una unidad de ácido fosfatasa o
fitasa sobre fitato a pH 2,5 se abrevia como 1 Ua.
La Figura 1 da el porcentaje de fósforo de fitina
residual después de la acción de fitasa en función de la actividad a
pH 2,5 dosificada: con la dosificación de la misma actividad a pH
2,5 de fitasa al pienso (por ej. 0,5-1 Ua/g) el
fósforo de fitina residual (95-10%) reveló que no
había correlación con la dosis de enzima, lo que indicaba que no
había correlación entre actividad de fitasa a pH 2,5 y la
hidrólisis de fitina in vitro en pienso para cerdos.
La Figura 2 da el porcentaje de fósforo de
fitina residual, después de la acción de fitasa, en función de la
actividad a pH 5 dosificada: dosificando la misma actividad de
fitasa a pH 5 al pienso (por ejemplo 0,4-0,5 Up/g),
el fósforo de fitina residual revelaba una correlación con la dosis
de enzima. Además, si se separaban las preparaciones de fitasa con
a/p entre 1,5/1 y 3/1, y a/p < 1,5/1, la diferencia en fósforo
de fitina residual después de la acción de fitasa a la misma
dosificación a pH 5 se hacía más pequeña: las preparaciones de
fitasa con a/p <1,5 hidrolizaban el fósforo de fitina menos
eficazmente que las preparaciones de fitasa con a/p entre 1,5/1 y
3/1.
La Figura 3 da la hidrólisis de fitina in
vitro calculada como la cantidad de fósforo de fitina liberado
por dosificación de 500 Unidades de fitasa (Up) para 1 kg de pienso
a 40ºC durante 3 horas (g PP/500 Up). La eficacia de las diferentes
preparaciones de fitasa se comparó con la eficacia calculada como un
efecto aditivo entre las dos enzimas que componen las preparaciones
de fitasa, fitasa 0,6/1 y ácido fosfatasa 1/0 como en el ejemplo
III. El efecto sinérgico entre ambas enzimas se calculó como la
diferencia entre el resultado de ensayo y el efecto aditivo
calculado. Un incremento en el efecto sinérgico puede detectarse con
un máximo a aproximadamente a/p 2/1. Por encima de esta relación no
se puede observar efecto sinérgico adicional.
Se ensayó la actividad de fitasa y ácido
fosfatasa a pH 2,5 por medida de la liberación de fósforo. Se
añadieron 0,5 ml de una preparación de enzima dluida adecuadamente a
2 ml de una mezcla 1/1 de tampón de Sörensen 0,2 M pH 2,5 y fitato
dodecasódico 12,5 mM o solución de
\beta-glicerofosfato disódico 25 mM. Se incubó la
mezcla de reacción durante 10 minutos a 40ºC. La reacción se detuvo
por adición de 2,5 ml de una solución de ácido tricloroacético al
10%. El fósforo liberado se midió espectrofotométricamente por
adición de 5 ml de un reactivo vanadato/molibdato según el método
EEC oficial.
La actividad de fitasa a pH 5 sobre fitato
dodecasódico se midió de manera similar, reemplazando el tampón de
Sörensen de pH 2,5 por tampón acetato 1M de pH 5.
Una unidad de actividad de fitasa o ácido
fosfatasa se definía como la cantidad de enzima que libera 1
\mumol de fósforo/minuto a 40ºC y pH 5 o pH 2,5
respectivamente.
La relación (1)(2) entre la actividad de enzima a
pH 2,5 sobre fitato (1) y \beta-glicerofosfato
disódico (2) determina la especificidad de ambas enzimas: la fitasa
0,6/1 desarrolla la actividad más alta sobre fitato, mientras que
las ácido fosfatasas desarrollan la actividad más alta sobre
\beta-glicerofosfato disódico.
| Enzima | pH 2,5 | relación | |
| (1) | (2) | (1)/(2) | |
| Fitasa de A. ficuum 0,6/1 | 77 | 11,7 | 6,6 |
| Acido fosfatasa de A. ficuum 1/10 | 490 | 3685 | 0,13 |
| Acido fosfatasa de A. niger 1/0 | 8,7 | 52 | 0,17 |
Se hidrolizó in vitro fitina en un pienso
convencional con 0,33% de fósforo de fitina por diferentes
preparaciones de fitasa de A. ficuum. Los componentes del
medio de pienso para cerdos eran guisantes, tapioca, pienso de
gluten de maíz y habas de soja extraídas. El fósforo de fitina total
del pienso se midió según ELLIS y MORRIS
(1983-1986). Se añadieron 1,4 unidades (Up) de una
preparación de fitasa líquida a 2 g del pienso, la humedad de la
mezcla se adaptó a 70% por adición de agente tampón de Sörensen 0,2
M de pH 2,5, y la mezcla se incubó a 40ºC durante 3 horas. Después
de la incubación, se extrajo el pienso con 40 ml de HCl al 2,4% (3
horas), y se midió el fósforo de fitina en el extracto después de
cromatografía de intercambio de ión y destrucción de fitina. La
hidrólisis de fitina se calculó como la diferencia en contenido de
fitina del pienso antes y después del tratamiento con fitasa. La
eficacia de fitasa in vitro se calculó como la cantidad de
fósforo de fitina (g PP) liberado por 500 unidades de fitasa (Up)
por kg de pienso a 40ºC durante 3 horas.
A medida que aumentaba la relación a/p de las
preparaciones de fitina a relación a/p baja (0,6/1 \rightarrow
2/1), la eficacia de las preparaciones presentaba un incremento
lineal: la fitasa pura 0,6/1 presentaba una eficacia de 0,55 g
PP/500 Up, mientras que la eficacia de una preparación de fitasa con
relación a/p = 2/1 ascendía a 1,75 g PP/500 Up. Según esto, la
adición de 500 unidades (Up) de actividad de fitasa a 1 Kg de pienso
para pollos da por resultado la liberación de una cantidad de
fósforo de fitina que varía entre 0,55 y 1,75 g, dependiendo de la
relación a/p de la fitasa. A relación a/p más alta, el aumento de
eficacia (sinergia) se nivela.
| a/p | g PP/500 Up |
| 0,6 | 0,55 |
| 0,8 | 0,85 |
| 1,0 | 1,00 |
| 1,4 | 1,20 |
| 1,6 | 1,30 |
| 1,7 | 1,60 |
| 2,1 | 1,75 |
| 3,0 | 1,80 |
| 16,3 | 3,5 |
Se hidrolizó in vitro la fitina de un
pienso convencional para cerdos (ejemplo II) por preparaciones de
fitasa de A. ficuum, suplementada con ácido fosfatasa de
A. ficuum 1/0 para probar la importancia de ácido fosfatasa
en una mezcla de ácido fosfatasa/fitasa.
Se suplementó fitasa de 0,6/1 con ácido fosfatasa
de a/p = 2/1 y 3/1 por adición, respectivamente, de 2 y 3,4 Ua de
ácido fosfatasa para 1,4 Up de fitasa; se suplementó fitasa 1/1
(1,4 Up) con 1,4 y 2,8 Ua de ácido fosfatasa a una relación a/p
respectiva de 2/1 y 3/1.
Se añadieron 1,4 Up de una preparación de fitasa
líquida (a/p 0,6/1, 1/1, 2/1 y 3/1) a 2 g del pienso para cerdos, se
adaptó la humedad de la mezcla a 70% o a 80% por adición de agente
tampón Sörensen 0,2 M pH 2,5 y se incubó la mezcla a 40ºC durante 3
horas.
Se determinó la eficacia de la misma ácido
fosfatasa por dosificación de 2 Ua a 2 g del pienso para cerdos e
incubando la mezcla como se ha mencionado antes.
La hidrólisis de fitina se calculó como en el
ejemplo II
Mezclando las preparaciones de fitasa y ácido
fosfatasa a una relación a/p 2/1 y 3/1 antes de añadirlas al pienso,
aumentaba la eficacia de la mezcla de enzimas por ambas
interacciones, la aditiva y la sinérgica, entre ambas enzimas.
Por ejemplo: la adición de 500 Up de fitasa 0,6/1
al pienso para cerdos libera 0,95 g de fósforo de fitina, mientras
que la adición de 500 Ua de ácido fosfatasa 1/0 libera 0,25 g de
fósforo de fitina. Dado que 500 Up de fitasa 0,6/1 tienen una
actividad de 300 Ua a pH 2,5, se necesitan 700 Ua de ácido fosfatasa
1/0 para obtener una mezcla de ácido fosfatasa/fitasa con una
relación a/p = 2,1. Si ambas enzimas tienen un simple efecto
aditivo, la eficacia puede calcularse como sigue:
(500 Up fitasa * 0,95 g PP/500 Up) + (700 Ua
ácido fosfatasa* 0,25 g PP/500 Ua) = 1,3 g PP(/500 Up
fitasa)
La eficacia observada en el ensayo no es 1,3 sino
2,1 g PP/500 Up, lo que implica un efecto sinérgico de 0,8 g PP/500
Up.
| a/p | ensayo | g PP/500 U adit. | sinergia |
| 1/0 (*) | 0,15 | - | - |
| 1/0**(*) | 0,25 | - | - |
| 0,6/1 | 0,55 | - | - |
| 0,6/1 \rightarrow 2/1 | 1,25 | 0,75 | 0,50 |
| 0,6/1** | 0,95 | - | - |
| 0,6/1 \rightarrow 2/1** | 2,10 | 1,30 | 0,80 |
| 1/1 | 1,15 | - | - |
| 1/1 \rightarrow 2/1 | 1,50 | 1,30 | 0,20 |
| 1/1 \rightarrow 3/1 | 1,75 | 1.45 | 0,30 |
| U: Up | |||
| (*): g PP/500 Ua | |||
| **: incubación a 80% de humedad | |||
| adit: eficacia de adición calculada | |||
| sin.: Eficacia (ensayo) - eficacia - (adit.), es decir la eficacia sinérgica de superavit. |
Se hidrolizó fitina in vitro en diferentes
piensos convencionales (para cerdos, lechones, cerdas, pollos y
gallinas) por diferentes preparaciones de fitasa de A.
ficuum para estudiar la interacción sinérgica entre fitasa y
ácido fosfatas sobre piensos en general.
Los principales componentes de los piensos
eran:
\newpage
para lechones: cebada, trigo, habas de soja
extraídas, salvado de trigo, suero en polvo
y harina de pescado
para cerdas: tapioca, guisantes, semillas de
girasol extraídas, salvado de arroz y extracto de coco
para cerdos 1: tapioca, guisantes, habas de soja
extraídas y pienso de gluten de trigo
para cerdos 2: tapioca, guisantes, habas de soja
extraídas, pienso de gluten de trigo y pienso de gluten de maíz
para pollos: sorgo, habas de soja extraídas,
guisantes y harina de carne
para gallinas: maíz, habas de soja, semillas de
girasol extraídas y cal.
Se dosificó fitasa 0,6/1 a 0,7 Up/g y ácido
fosfatasa 1/0 a 1 Ua/g. La fitasa 0,6/1 se suplementó con ácido
fosfatasa 1/0 a a/p 2/1 añadiendo 1 Ua de ácido fosfatasa a 0,7 Up
de fitasa. Las condiciones de incubación fueron similares a las del
ejemplo III (80% de humedad). El efecto sinérgico se calculó como en
el ejemplo III.
La eficacia de ambas, fitasa y ácido fosfatasa,
difería mucho para los diferentes piensos. El efecto sinérgico entre
ambas enzimas se encontró en todos los piensos, pero difería para
los diferentes piensos.
Se dosificó fitasa a/p 1,6/1 a 0,7 Up/g, para
diferentes piensos. La eficacia de esta fitasa confirmó el efecto de
la ácido fosfatasa 1/0 en una mezcla de ácido fosfatasa/fitasa.
| g PP/500 U | |||||||
| a/p | |||||||
| Pienso | % PP | 1,6/1 | 0,6/1 | 1/0 (*) | 0,6/1 | adit. | sinergia |
| \rightarrow 2/1 | |||||||
| lechón | 0,15 | - | 0,55 | 0,025 | >1,0 | 0,58 | >0,42 |
| cerda | 0,39 | 1,75 | 1,5 | 0,15 | 2,6 | 1,71 | 0,89 |
| cerdo 1 | 0,23 | 1,4 | 0,75 | 0,125 | >1,5 | 0,93 | 0,57 |
| cerdo 2 | 0,32 | - | 0,90 | 0,15 | 2,05 | 1,11 | 0,94 |
| pollo | 0,15 | - | 0,55 | 0,075 | >1,2 | 0,65 | >0,55 |
| gallina | 0,23 | - | 0,25 | 0,075 | 0,6 | 0,35 | 0,25 |
| U: Up | |||||||
| (*): g PP/500 Ua | |||||||
| >: contenido de fósforo de fitina tras incubación = 0, por lo que solo puede calcularse sinergia de fitasa en el | |||||||
| mínimo | |||||||
| adit.: eficacia aditiva |
Dado que la hidrólisis enzimática de fitina
vegetal difiere mucho entre los diferentes piensos (ejemplo IV),
cabría esperar que la hidróliisis de fitina dependiera solo de la
materia prima vegetal que compone el pienso.
Se ensayó in vitro la hidrólisis de fitina
vegetal de diferente origen y la eficacia de fitasa de A.
ficuum 0,6/1 y ácido fosfatasa 1/0, añadidas solas o en
combinación a las diferentes materias primas vegetales.
Se dosificó fitasa 0,6/1 a
0,35-07 Up/g y ácido fosfatasa 1/0 a 1Ua/g de
material de pienso. Se suplementó la fitasa 0,6/1 con ácido
fosfatasa 1/0 a a/p 2/1 añadiendo, respectivamente 0,5 y 1 Ua de
ácido fosfatasa/g. Las condiciones de incubación fueron similares a
las del ejemplo II (80% de humedad). Se analizó la hidrólisis de
fitina y se calculó la eficacia de fitasa como en el ejemplo II; el
efecto sinérgico se calculó como en el ejemplo III.
La eficacia de fitasa sobre guisantes era muy
baja (0,15 g PP/500 Up), sin interacción sinérgica de la ácido
fosfatasa.
La sinergia más grande se encontró en aquellos
materiales vegetales de partida en los que la fitina se hidroliza
fácilmente por la fitasa y se hidroliza difícilmente por la ácido
fosfatasa, por ejemplo, habas de soja y salvado de trigo.
Se encontró una sinergia baja cuando la ácido
fosfatasa misma ya hidrolizaba la fitina vegetal más eficazmente,
por ejemplo, salvado de arroz.
| g PP / 500 U | ||||||
| a/p | ||||||
| Material | % PP | 0,6/1 | 1/0 (*) | 0,6/1 \rightarrow 2/1 | adit. | sinergia |
| alimenticio | ||||||
| guisantes | 0,21 | 0,15 | 0,1 | 0,30 | 0,29 | 0,01 |
| habas de soja | 0,35 | 1,1 | 0,2 | 1,95 | 1,38 | 0,57 |
| salvado de trigo | 0,73 | 1,6 | 0,2 | 2,35 | 1,88 | 0,47 |
| salvado de arroz | 1,33 | 1,8 | 0,8 | 3,05 | 2,92 | 0,13 |
| U: Up | ||||||
| (*): g PP/500 | ||||||
| adit: eficacia aditiva |
Hidrólisis de fitina in vitro en pienso
convencional para cerdos (ejemplo II) por preparaciones de fitasa de
Aspergillus niger con diferente relación a/p. La fitasa se
dosificó a 0,7 ó a 1 Up/g de pienso. Las condiciones de incubación
eran similares a las del ejemplo II (70% de humedad).
Se analizó la hidrólisis de fitina y se calculó
la eficacia de fitasa como en el ejemplo II.
Cuando la relación a/p de las preparaciones de
fitasa de A. niger aumentaba (a relación baja), la eficacia
de las preparaciones aumentaba: la eficacia de fitasa varía entre
0,75 y 1,15 g PP/500 Up, dependiendo de la relación de a/p de la
fitasa.
| a/p | g PP / 500 Up |
| 1,1/1 | 0,75 |
| 1,5/1 | 1,00 |
| 1,6/1 | 1,15 |
Hidrólisis de fitina in vitro en pienso
convencional para cerdos (ejemplo II) con una preparación de fitasa
de Aspergillus niger a/p 1,15/1, suplementada con ácido
fosfatasa de Aspergillus niger (An) o Aspergillus
ficuum NRRL 3135 (Af), para aumentar la relación a/p a,
respectivamente, 1,9/1 y 1,6/1.
Se dosificó una fitasa de A. niger 1,15/1
a 0,7 Up/g de pienso; se añadieron 0,5 Ua de ácido fosfatasa de
A. niger ó 0,3 Ua de ácido fosfatasa de A. ficuum por
gramo a la fitasa de A. niger para incrementar la relación
a/p respectivamente a 1,9/1 (An) y 1,6/1 (Af). Las ácido fosfatasas
fueron dosificadas al pienso solamente a 0,5 Ua de A. niger ó 0,3
Ua de A. ficuum./g
Las condiciones de incubación eran similares a
las del ejemplo II (80% de humedad). Se analizó la hidrólisis de
fitina y se calculó la eficacia de fitasa como en el ejemplo
II.
Se calculó el efecto sinérgico entre fitasa de A.
niger a/p 1,15/1 y ácido fosfatasas 1/0, de A. niger o de
A. ficuum, como en el ejemplo III.
| g PP / 500 U | |||
| a/p | adit. | sinergia | |
| A. niger 1/0 (*) | 0,25 | - | - |
| A. ficuum 1/0 (*) | 0,30 | - | - |
| A. niger 1,15/1 | 1,25 | - | - |
| 1,15/1 \rightarrow 1,91/1 (An) | >1,65 | 1,44 | >0,21 |
| 1,51/1 \rightarrow 1,6/1 (Af) | >1,65 | 1,48 | >0,17 |
| U: Up | |||
| (*): g PP/500 unidades de ácido fosfatasa pH 2,5 | |||
| >: contenido en fósforo de fitina después de incubación igual a cero, por lo que solamente puede calcularse una | |||
| sinergía de fitasa del mínimo. | |||
| adit.: eficacia aditiva. |
Hidrólisis de fitina in vitro por fitasa
de A. ficuum (Af), suplementada con ácido fosfatasa de A.
niger (An), en pienso convencional para cerdos. Se dosificó
fitasa 0,6/1 a 0,7 Up/g; la fitasa se suplementó con
0,85-0,9 Ua/g de ácido fosfatasa 1/0 para obtener
preparaciones de fitasa con relaciones a/p respectivamente de 1,8/1
y 1,9/1.
Se dosificó ácido fosfatasa 1/0 a 1Ua/g.
Las condiciones de incubación eran similares a
las del ejemplo II (80% de humedad).
Se analizó la hidrólisis de fitina y se calculó
la eficacia de fitasa como en el ejemplo II. Se calculó el efecto
sinérgico entre fitasa de A. ficuum 0,6/1 y ácido fosfatasa
de A. niger 1/0 como en el ejemplo III.
| g PP/500 U | |||
| a/p | adit. | sinergia | |
| 0,6/ (Af) | 0,85 | - | - |
| 1/0 (An) (*) | 0,25 | - | - |
| 0,6/1 \rightarrow 1,8/1 | 1,5 | 1,15 | 0,35 |
| 0,6/1 \rightarrow 1,9/1 | 1,8 | 1,18 | 0,62 |
| U: Up | |||
| (*) g PP/500 Ua | |||
| adit.: eficacia aditiva |
Se ensayó la termoestabilidad in vitro de
fitasa de A. ficuum 0,6/1 y ácido fosfatasa 1/0 en pienso
convencional para cerdos (ejemplo II) en viales cerrados,
sumergidos en baño maría, simulando las condiciones de molino de
pienso.
Se mezclaron 20 g de pienso para cerdos, que
contenía 1750 Ua de fitasa o ácido fosfatasa con 480 g de pienso
para cerdos, lo que daba por resultado un pienso con 3500 Ua/kg. Se
llenaron viales con 7 g del pienso suplementado con enzima,
conteniendo 10,5 Ua de fitasa o ácido fosfatasa. La humedad del
pienso era 12,2%. Los viales se cerraron y se sumergieron en baño
maría a diferentes temperaturas (70-90ºC), durante
10 minutos. Se midió la actividad residual de ácido fosfatasa y
fitasa a pH 2,5 después de extracción con enzima: se extrajeron 3 g
del pienso tratado con calor con 50 ml de agente tampón de Sörensen
0,1 M pH 2,5 durante 30 minutos, y se determinó la actividad de
fitasa o ácido fosfatasa en el extracto de pienso a pH 2,5 sobre
fitato dodecasódico según el ejemplo I. La actividad, medida en el
pienso no-tratado se fijó en 100%, y se calcularon
todas las actividades como porcentajes de la actividad
remanente.
| T(ºC) | actividad remanente (%) | |
| fitasa 0,6/1 | ácido fosfatasa 1/0 | |
| 70 | 61 | 100 |
| 80 | 33 | 67 |
| 90 | 4 | 34 |
Se hicieron aglomerados de pienso para cerdos a
escala piloto después de la adición de fitasa 0,6/1 o ácido
fosfatasa 1/0 de A. ficuum, líquidas. Ambas enzimas se
dosificaron a 165000 Ua/550 g de premezcla, que se añadió entonces
a 55 kg de pienso para cerdos antes de la obtención de los
aglomerados.
Los principales componentes del pienso para
cerdos eran: guisantes, extracto de semilla de colza, pienso de
gluten de maíz y tapioca.
La temperatura de los aglomerados que salían de
la boquilla del molino se controló entre 69 y 74ºC por adición de
vapor.
La actividad de fitasa y ácido fosfatasa a pH 2,5
de la harina y los aglomerados se midieron después de extracción del
pienso. Se hizo la extracción de 5 g del pienso con 50 ml de agente
tampón de Sörensen 0,1 M de pH 2,5 durante 30 minutos, y se midió
la actividad de fitasa o de ácido fosfatasa a pH 2,5 sobre fitato
dodecasódico según el ejemplo I. La actividad del pienso de harina
(3 Ua/g) se fijó en un 100%.
El porcentaje de humedad del pienso con fitasa y
ácido fosfatasa decreció, respectivamente, de 11,6 y 11,9 en el
acondicionador de harina a 10,6 y 10,8 en los aglomerados
enfriados.
| fitasa | ácido fosfatasa | ||
| T(ºC) | actividad remanente (%) | T(ºC) | actividad remanente (%) |
| 68,6 | 50 | 71,6 | 76 |
| 72,1 | 41 | 73,0 | 77 |
| 74,2 | 35 | 73,1 | 67 |
Se añadieron como suplemento preparaciones de
fitasa 0,6/1 y fitasa 1,25/1 de A. ficuum a piensos de
cerdos a 900 Up/kg de pienso, seguido de la obtención de
aglomerados del pienso a escala industrial. Los principales
componentes del pienso eran: guisantes, pienso de gluten de maíz,
habas de soja extraídas y tapioca. La concentración del fósforo de
fitina era 0,37%, medida según el ejemplo II. La temperatura de los
aglomerados que salían del molde del molino era comparable (74,5ºC).
Se midió la remanencia de fitasa por hidrólisis de fitina in
vitro en el pienso de aglomerados: se incubaron 2 g del pienso
de fitasa como en el ejemplo II (80% de humedad). Se analizó la
hidrólisis de fitina y se acalculó la eficacia de fitasa como en el
ejemplo II. La eficacia de fitasa en el pienso de harina, antes de
la formación de los aglomerados, se fijó en 100%. La eficacia de
fitasa 1,25/1 en el pienso de aglomerados es de 190% (0,75) de la
eficacia de la fitasa 0,6/1 (0,4), mientras que su eficacia en
pienso de harina es solamente de 160% (0,95) de la eficacia de la
fitasa 0,6/1 (0,6).
| fitasa 0,6/1 | fitasa 1,25/1 | |||
| g PP/ 500 Up | % | g PP/500 Up | % | |
| harina | 0,6 | 100 | 0,95 | 100 |
| aglomerado | ||||
| 74,4ºC | 0,4 | 66 | - | - |
| 74,6ºC | - | - | 0,75 | 79 |
Se formuló un pienso de control para cerdos sobre
2 g/kg de fósforo digerible (dP) (Pienso I), y un contenido total de
fósforo de 5,8 g/kg. El pienso I contenía principalmente guisantes,
tapioca, pienso de gluten de maíz, pienso de gluten de trigo y habas
de soja extraídas.
Los piensos para cerdo que contenían fitasa se
formularon a un total de contenido de fósforo de 4,4 g/kg y 1,17
g/kg de fósforo digerible, que contenía los mismos componentes
principales que el pienso I. Se añadieron como suplemento diferentes
preparaciones de fitasa de A. ficuum: 750 Up de fitasa
(0,6/1)/kg (Pienso II), 1050 Ua de ácido fosfatasa (1/0)/kg (Pienso
IV), y una mezcla de 750 Up de fitasa + 1050 Ua de ácido
fosfatasa/kg (Pienso III) para obtener una relación a/p igual a 2/1.
Se añadieron soluciones de enzima concentradas al pienso de harina.
Se mantuvieron 12 cerdos en pocilgas individuales y se alimentaron
con el pienso durante 17 días (7 días antes y 7 días durante el
ensayo) (3 cerdos/pienso) con una ingesta diaria de pienso de 1800
g, y una ingesta total de 18 kg durante el período de ensayo. Se
recogieron las heces por cerdo durante estos 10 días, y se determinó
la excreción total de fósforo sobre las heces recogidas según el
método EEC. Se calculó el coeficiente de digestión de fósforo
aparente (DC-P (%) por la diferencia entre ingesta
total de fósforo y excreción total de fósforo.
p. e Pienso I.:
ingesta total de fósforo ( P-tot
ing.): 104,4 g = 100%
excreción total de fósforo
(P-tot exc.): 70,9 g = 67,9%
DC-P (%) = 100 - 67,9 (%) =
32,1
Se calculó entonces el fósforo digerible (g
dP/kg) como concentración total de fósforo en el pienso *
DC-P
p. e. Pienso I: g dP/kg = 5,8 g P/kg*0,321 =
1,8
| P-tot. Ing. | P-tot. Exc. | DC-P | dP | |
| (g) | (g) | (%) | g/kg | |
| Pienso I: 5,8 g P/kg - 2 g dP/kg | ||||
| 104,4 | 70,9 (100%) | 32,1 | 1,86 | |
| Pienso II: 4,4 g P/kg - 1,17 g dP/kg + 750 Up fitasa (pH5)/kg | ||||
| 79,2 | 44,2 (-37%) | 44,3 | 1,95 |
TABLA 12
(continuación)
| P-tot. Ing. | P-tot. Exc. | DC-P | dP | |
| (g) | (g) | (%) | g/kg | |
| Pienso III: Pienso II + 1050 Ua de ácido fosfatasa (pH 2,5)/kg | ||||
| 79,2 | 41,7 (-41%) | 47,3 | 2,06 | |
| Pienso IV: 4,4 g P/kg - 1,17 g fP/kg + 1050 Ua/kg | ||||
| 79,2 | 58,1 (-18%) | 26,7 | 1,17 | |
| DC-P: coeficiente de digestón de fósforo | ||||
| dP: fósforo digerible | ||||
| P-tot ing.: total de fósforo ingerido | ||||
| P-tot exc.: total de fósforo excretado |
El pienso para cerdos de control se formuló con 2
g/kg de fósforo digerible y 6,1 g/kg de fósforo total (Pienso I). El
pienso I contenía principalmente guisantes, tapioca, pienso de
gluten de trigo y habas de soja extraídas, el fósforo fue
suministrado en parte por fosfato monocálcico. Los piensos que
contenían fitasa se formularon con 5,2 g/kg de fósforo total y
1,4g/kg de fósforo digerible, conteniendo los mismos componentes
principales que el pienso I, omitiendo únicamente el fosfato
monocálcico.
Se suplementaron con fitasa 0,6/1, a un nivel
recomendado de 400 Up/kg (Pienso II) o una mezcla de 580 Ua de ácido
fosfatasa 1/0 + 400 Up de fitasa 0,6/1/kg para obtener una relación
de a/p igual a 2/1 (Pienso III). Las soluciones de fitasa se
añadieron al pienso de harina. Se mantuvieron 24 cerdos en pocilgas
individuales y se les alimentó con el pienso durante 17 días (7 días
previos y 10 días del ensayo) (8 cerdos/pienso) con una ingesta
diaria de 1800 g, y una ingesta total de 18 kg durante el período
de ensayo. Las heces se recogieron para cada cerdo durante 10 días,
y se midió la excreción total de fósforo sobre las heces recogidas
según el método EEC. El fósforo digerible (DC- P% y g dP/kg) se
calcularon como en el ejemplo XII.
| P-tot ing. | P-tot exc. | DC-P | dP | |
| (g) | (g) | (%) | g/kg | |
| Pienso I: 6,1 g P/kg - 2 g dP/kg | ||||
| 109,8 | 73,4 | 32,9 | 2,01 | |
| Pienso II: 5,2 g P/kg -1,4 g dP/kg - 400 Up fitasa/kg | ||||
| 93,6 | 58(-21%) | 38,1 | 1,98 | |
| Pienso III: Pienso II + 580 Ua ácido fosfatasa/kg | ||||
| 93,6 | 55,4(-24,5%) | 40,8 | 2,12 | |
| DC-P: coeficiente de digestión de fósforo | ||||
| dP: fósforo digerible | ||||
| P-tot ing.: total de fósforo ingerido | ||||
| P-tot exc.: total de fósforo excretado |
\newpage
Eficacia de fitasa in vivo (g dP/500 Up)
de fitasa y ácido fosfatasa de A. ficuum, líquidas,
dosificadas a diferentes niveles al pienso de cerdos (harina)
(ejemplos XII y XIII).
La eficacia de fitasa in vivo se definía
como la cantidad de fósforo liberada durante la digestión por 500
unidades (Up) de fitasa (0,6/1 ó 2/1) añadidas al pienso (g dP/500
Up).
La cantidad de fósforo, liberada por las enzimas
se calculó como diferencia entre el fósforo digerible formulado en
el pienso y el fósforo digerible calculado por el ensayo con
animales del ejemplo XII.
p. e:
fósforo digerible formulado en el pienso: 1,17
g/kg
fósforo digerible según el ensayo con animales:
2,06 g/kg
contenido de fitasa del pienso: 750 Up fitasa +
1050 Ua
ácido fosfatasa/kg
eficacia de fitasa (g dP/500 Up): (2,06 –
1,17)^{*}
500/750 = 0,59
Cuando la eficacia in vivo de la ácido
fosfatasa es 0, la eficacia sinérgica se calcula como la diferencia
entre la eficacia de la mezcla ácido fosfatasa 2/1/fitasa y la
fitasa 0,6/1.
| dosis de fitasa/ácido | formulación | ensayo con | efecto de las | g dP/kg | sinergia |
| fosfatasa (unidades/kg) | del pienso | animales, | enzimas | 500 | de Up |
| g dP/kg | |||||
| 750 Up | 1,17 | 1,95 | 0,78 | 0,52 | - |
| 1050 Ua (*) | 1,17 | 1,17 | 0,00 | 0,00 | - |
| 750 Up + 1050 Ua | 1,17 | 2,06 | 0,89 | 0,59 | - |
| 400 Up | 1,40 | 1,98 | 0,58 | 0,725 | 0,07 |
| 400 Up + 580 Ua | 1,40 | 2,12 | 0,72 | 0,9 | - |
| 0,175 | |||||
| U: unidades de fitasa a pH 5,0 | |||||
| Ua: unidades de ácido fosfatasa a pH 2,5 | |||||
| (*): g dP/500 Ua |
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fitato mediante ácido fosfatasa de Aspergillus niger. J.
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Claims (28)
1. Una composición de enzimas que tiene actividad
hidrolizante de fitato que comprende una fitasa que tiene actividad
hidrolizante de fitato a pH en el intervalo de 2,5 a 5,0 y una
ácido fosfatasa que tiene actividad hidrolizante de fitato a un pH
de 2,5, en una relación (a:p) de su actividad a pH 2,5 (a) y pH 5,0
(p) sobre fitato de 0,8:1 a por debajo de 3:1 que tiene acción
sinérgica sobre fitato.
2. Una composición de enzimas según la
reivindicación 1 donde la relación (a:p) de su actividad a pH 2,5
(a) y pH 5 (p) sobre fitato es de 1:1 a 2,5:1.
3. Una composición de enzimas según la
reivindicación 1 donde la relación (a:p) de su actividad a pH 2,5
(a) y pH 5 (p) sobre fitato es de 1,5:1 a 2:1.
4. Una composición de enzimas según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 donde la fitasa es una fitasa
fúngica.
5. Una composición de enzimas según la
reivindicación 4 donde la fitasa fúngica es una fitasa de
Aspergillus.
6. Una composición de enzimas según la
reivindicación 4 donde la fitasa fúngica se selecciona del grupo que
consiste en fitasa de Aspergillus ficuum, fitasa de
Aspergillus niger y fitasa de Aspergillus terreus.
7. Una composición de enzimas según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 donde la ácido fosfatasa es una fosfatasa
de ácido fúngico.
8. Una composición de enzimas según la
reivindicación 7 donde la ácido fosfatasa fúngica es una ácido
fosfatasa de Aspergillus.
9. Una composición de enzimas según la
reivindicación 7 donde la ácido fosfatasa fúngica se selecciona del
grupo que consiste en ácido fosfatasa de Aspergillus ficuum,
ácido fosfatasa de Aspergillus niger y ácido fosfatasa de
Aspergillus terreus.
10. Una composición de enzima según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 donde la ácido fosfatasa es una ácido
fosfatasa térmicamente estable que retiene su actividad a 70ºC.
11. Una composición de enzimas según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9 donde la ácido fosfatasa es
térmicamente más estable que la fitasa.
12. Una composición de enzimas según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 11 que presenta una relación (a:p)
mejorada de 1,5:1 a 2:1 por tratamiento térmico.
13. Un producto alimenticio, pienso o forraje, o
un componente del mismo, que contiene una composición de enzimas
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un producto alimenticio, pienso o forraje
tratado térmicamente, o un componente del mismo, que contiene una
composición de enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
12.
15. Un procedimiento para hidrolizar fitato, que
comprende la etapa de tratamiento de la materia prima que contiene
fitato con una composición de enzimas según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, llevándose a cabo el citado tratamiento en
condiciones de hidrólisis a un pH de aproximadamente 2,5 a
aproximadamente 5,0 donde la fitasa y la ácido fosfatasa de la
citada composición de enzimas tiene actividad hidrolizante.
16. Un procedimiento según la reivindicación 15
donde el citado tratamiento se lleva a cabo a un pH de
aproximadamente 2,5.
17. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 16 donde la materia prima que contiene fitato
es una materia prima vegetal (plantas).
18. Un procedimiento según la reivindicación 17
donde la citada materia prima vegetal es una materia prima de habas
de soja o de trigo.
19. Una planta modificada genéticamente,
conteniendo la citada planta un gen que codifica una fitasa fúngica
que tiene una actividad hidrolizante de fitato a un pH en el
intervalo de 2,5 a 5,0 y un gen que codifica una ácido fosfatasa
fúngica que tiene una actividad hidrolizante de fitato a un pH de
2,5, estando ligados eficazmente ambos genes a secuencias de
control transcripcionales y traduccionales para permitir la
expresión de las enzimas codificadas por los citados genes en una
relación (a:p) de su actividad a pH 2,5 (a) y pH 5 (p) sobre fitato
desde 0,8:1 a por debajo de 3:1 que tiene una acción sinérgica
sobre fitato.
\newpage
20. Una parte o producto derivado de una planta
modificada genéticamente según la reivindicación 19, conteniendo la
citada parte o producto una fitasa que tiene una actividad
hidrolizante de fitato a un pH en el intervalo de 2,5 a 5,0 y una
ácido fosfatasa que tiene una actividad hidrolizante de fitato a un
pH de 2,5 en una relación (a:p) de su actividad a pH 2,5 (a) y pH 5
(p) sobre fitato de 0,8:1 a por debajo de 3:1 teniendo una acción
sinérgica sobre fitato.
21. Un procedimiento para mejorar la digestión de
piensos o forrajes en la producción de ganado y reducir la excreción
de fósforo en el estiércol del ganado, que comprende alimentar el
ganado con pienso o forraje que contiene una composición de enzimas
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
22. Un producto alimenticio, pienso o forraje, o
un componente del mismo, que contiene una composición de enzimas que
tiene actividad hidrolizante de fitato que comprende una fitasa que
tiene actividad hidrolizante de fitato a un pH en el intervalo de
2,5 a 5,0 y una ácido fosfatasa que tiene una actividad
hidrolizante de fitato a un pH de 2,5, en una relación (a:p) de su
actividad a pH 2,5 (a) y pH 5 (p) sobre fitato de 0,8:1 a por
debajo de 3:1 que tiene acción sinérgica sobre fitato.
23. Un producto alimenticio, pienso o forraje
térmicamente tratado, o un componente del mismo, que contiene una
composición de enzimas que tiene actividad hidrolizante de fitato
que comprende una fitasa con actividad hidrolizante de fitato a un
pH en el intervalo de 2,5 a 5,0 y una ácido fosfatasa con actividad
hidrolizante de fitato a un pH de 2,5, en una relación (a:p) de su
actividad a pH 2,5 (a) y pH 5 (p) sobre fitato de 0,8:1 a por debajo
de 3:1 que tiene una acción sinérgica sobre fitato.
24. Un procedimiento para hidrolizar fitato, que
comprende la etapa de tratar una materia prima que contiene fitato
con una composición de enzimas que tiene una actividad hidrolizante
de fitato que comprende una fitasa que tiene una actividad
hidrolizante de fitato a un pH en el intervalo de 2,5 a 5,0 y una
ácido fosfatasa que tiene una actividad hidrolizante de fitato a un
pH de 2,5, en una relación (a:p) de su actividad a pH 2,5 (a) y pH
5 (p) sobre fitato de 0,8:1 a por debajo de 3:1 que tiene una
acción sinérgica sobre fitato, levándose a cabo el citado
tratamiento en condiciones de hidrólisis a un pH de aproximadamente
2,5 a aproximadamente 5,0 donde la fitasa y la ácido fosfatasa de
la citada composición de enzimas tienen actividad hidrolizante.
25. Un procedimiento según la reivindicación 24
donde el citado tratamiento se lleva a cabo a un pH de
aproximadamente 2,5.
26. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 25 donde la materia prima que contiene fitato
es una materia prima vegetal. (plantas)
27. Un procedimiento según la reivindicación 26
donde la citada materia prima vegetal es un material de habas de
soja o trigo.
28. Un procedimiento para mejorar la digestión
del pienso o forraje en la producción de ganado y reducir la
excreción de fósforo en estiércol de ganado, que comprende alimentar
el ganado con un pienso o forraje que contiene una composición de
enzimas que tiene actividad hidrolizante de fitato que comprende una
fitasa que tiene actividad hidrolizante de fitato a un pH en el
intervalo de 2,5 a 5,0 y una ácido fosfatasa que tiene una
actividad hidrolizante de fitato a un pH en el intervalo de 2,5 a
5,0 y una ácido fosfatasa que tiene una actividad hidrolizante de
fitato a un pH de 2,5, en una relación (a:p) de su actividad a pH
2,5 (a) y pH 5 (p) sobre fitato de 0,8:1 a por debajo de 3:1 que
tiene una acción sinérgica sobre fitato.
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