JP3587876B2 - フィチン酸加水分解用酵素組成物及びフィチン酸の加水分解方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は酵素によるフィチンの加水分解に関する。より詳しくは、有機リン化合物であるフィチン酸を、無機リンとイノシトールとに加水分解するフィターゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
家畜飼養において、複数の必須ミネラルの存在が重要な役割を果たしているというのは確立した事実である。これらの飼料成分の取込・吸収性は、家畜の成育状況や、堆肥に含まれる排泄物に反映される。家畜の集中飼育生成の増加により、堆肥の生成はそれに含まれるリン酸分のために、環境問題を引きおこしている。さらに、堆肥に関する問題、特に堆肥のリン含有度を規制する法律によってそれに関わる出費が必要となり、環境へのリン排出量を減らすことが要請されている。リンは、様々な植物性原材料や、動物性副産物、或いは無機リンの形で、飼料に添加される。
【０００３】
フィチン酸 （ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ ｏｒ ｐｈｙｔａｔｅ） は、イノシトールの六リン酸エステル（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｈｅｘａｋｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であり、各種の種子や穀物に含まれている。また、フィチン酸は、リンとイノシトールの両方の主要な貯蔵形態であり、リン全含有量の ５０ ％ 以上にあたる［ロラス（Ｌｏｌａｓ）他、１９７６； ソーヴァー（Ｓａｕｖｅｕｒ）， １９８９］。油用種子は、５．２ ％ものフィチンを貯えることができる［レディ（Ｒｅｄｄｙ）他，１９８２］。
【０００４】
しかしながら、植物性原材料のフィチンに含まれているリンは、家畜、ブタ、人などの単胃の動物には、その単純な消化管のために消化が難しい。これらの動物では、腸内でフィチン酸の加水分解を触媒する腸内フィターゼの活性は、全くないか極く低いレベルであり、結腸に出されたフィチン性リンは、そのまま体外に排出される。このため、植物性原材料は、家畜飼養にとっては充分なリン供給源ではなく、付加的なリンを動物性副産物や無機リン酸の形で飼料に含有させる必要がある。
【０００５】
また、フィチンは、そのキレート特性により反滋養要因と考えられている。即ち、Ｃａ２＋， Ｆｅ３＋， Ｍｇ２＋ やＺｎ２＋ などの多価の陽イオンと結合して、非溶解性の錯体を形成しており、これらの必須飼料ミネラルの生体内取込性と吸収性を下げるためである。更にまた、タンパク質とフィチンによる複合体の形成［コスグルーヴ（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ），１９６６］は、酵素によるタンパク質の消化の妨げとなる。
この様な、フィチンの、リン及びミネラル代謝に及ぼす否定的効果により、また合わせて環境への高濃度のリン排出や、それに関する法律の制定により、フィチン性リンを生体内で利用可能にすることの必要性が高まっている。
【０００６】
フィチンやフィチン酸は、植物性原料に存在するか、或いは、微生物によって作られるフィターゼの触媒活性により加水分解される。酵素フィターゼ［ｍｙｏ−イノシトール六リン酸ホスホヒドロラーゼ（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）Ｅ．Ｃ．３．１．３．８．］は、適切な条件下でフィチン酸を無機リン酸とイノシトール一〜五リン酸 （ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｍｏｎｏ− ｔｏ ｐｅｎｔａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ） に加水分解する。
フィターゼは植物から微生物、特に真菌類、に広く分布している酵素であるが、単胃の動物では、腸内に、ほとんど微量にしか存在していない。
植物由来のフィターゼは ｐＨ 安定性に欠け、触媒活性を示す ｐＨ の範囲が狭い［スタルディ及びバックル（Ｓｕｔａｒｄｉ ＆ Ｂｕｃｋｌｅ），１９８６； ロラス及びマルカキス（Ｌｏｌａｓ ＆ Ｍａｒｋａｋｉｓ）， １９９１］。そのため単胃の動物の消化管の中で急速に不活化し、生体内効率は低い［イックハウトとデパエペ（Ｅｅｃｋｈｏｕｔ ａｎｄ Ｄｅ Ｐａｅｐｅ）、１９９１］。それ故、家畜用複合飼料の調製における、植物由来フィターゼの重要性は低い。
それに対し、微生物由来のフィターゼのいくつかは、広い ｐＨ 領域で安定性と活性を有しており、動物の腸内でフィチンがより効率的に加水分解される。そのため、動物の胃の酸性条件にも耐え得る微生物由来のフィターゼを加えることによって飼料に含まれるフィチン性リンの取込・吸収性を改良するため、微生物由来のフィターゼの生産方法が開発されてきた。しかしながら、微生物由来のフィターゼの熱安定性は低く、合成飼料を生産する工程で発せられる高温（７０〜８０ｏＣ）に耐えることができない。それ故、必要量の ３０ ％ 増の量を用いることが必要となる。
【０００７】
真菌類由来のフィターゼを加えると、フィチン性リン又はミネラルの吸収性が向上し、それによりリン転換率が高まって、飼料及び排泄物のリン含有量を減らすことのできることは、既に生体内の実験で発表されている。
【０００８】
微生物由来のフィターゼの活性については多くの論文がある。細菌由来のフィターゼ［グリーヴス（Ｇｒｅａｖｅｓ）他、１９６７； アーヴィング及びコスグルーヴ（Ｉｒｖｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｓｇｒｏｖｅ）， １９７１； ポワール及びジャガネーザン（Ｐｏｗａｒ ａｎｄ Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ）， １９８２］及びイースト由来のフィターゼ［ナイーニ及びマルカキス（Ｎａｙｉｎｉ ａｎｄ Ｍａｒｋａｋｉｓ）， １９８４］に続いて、主にカビ類特にアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株にフィターゼの存在することが知られている［シエ及びウェア（Ｓｈｉｅｈ ａｎｄ Ｗａｒｅ）， １９６８； 山本他、 １９７２；ユーセフ（Ｙｏｕｓｓｅｆ）他、１９８７］。これらの株のほとんどと、その他の微生物は、酸性ホスファターゼも産生する。いくつかの酸性ホスファターゼは、フィターゼと呼ばれることもあったが、それらは、フィチンに対してむしろ非特異的であって、フィチンに対する加水分解活性は、他の有機リン酸に対する加水分解活性に比べて低い。
【０００９】
発酵条件によって、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）ＮＲＲＬ ３１３５ の野生株は、細胞外ホスファターゼとフィターゼの混合物を産生する。フィターゼと酸性ホスファターゼの合成は、既知の先行技術に従って、リンの濃度により調節することができる［シエ（Ｓｈｉｅｈ）他、１９６９； ウラー及びクミンズ（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｓ），１９８７］。最近公開された特許出願公報には、遺伝子工学で作製したアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）Ｎ１ＲＲＬ ３１３５ 株 と アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）株を使い、フィターゼを大量に生産する方法が開示されている（ＥＰ 特許願第０，４２０，３５８号 Ａ１）。この公報には、酸性ホスファターゼのクローニングに関しても述べられている。
【００１０】
培養されたアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ から産生されたフィターゼを含む培養液を精製すると［ウラー及びギブソン（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ），１９８７］フィターゼは明らかに２つの最適 ｐＨ 値を示す。最も活性が高いのは、ｐＨ ５．０ − ５．５ の範囲で、２番目に高い活性（ｐＨ ５．０ における活性の ６０ ％）は、ｐＨ ２．２ において観察される。
【００１１】
ウラーとクミンズ（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｓ，１９８７）は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来の、最適 ｐＨ 値が２．５ の酸性ホスファターゼ［オルトホスフォリック モノエステル ホスホヒドロラーゼ（ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｅ．Ｃ． ３．１．３．２．）］を精製した。この酸性ホスファターゼは、ｐＨ ４．５ では ｐＨ ２．５ の時の ６５ ％ の活性を示し、ｐＨ ６．０ では実質的に不活性である。ウラーとクミンズ（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｓ， １９８８）はこの他にも、最適 ｐＨ 値が６．０ の酸性ホスファターゼを精製している。
【００１２】
これら２種の酸性ホスファターゼのどちらも、種々の有機リン酸モノエステルに対し広い基質選択性を示が、フィチン酸を基質として結合することはできない［ウラー及びクミンズ（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｓ），１９８８］。それに対し、アーヴィングとコスグローヴ（Ｉｒｖｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，１９７４）は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）の酸性ホスファターゼが ｐＨ ２．２ でフィチン酸に対し副次的活性（１６ ％）を持つと報告している。
【００１３】
ザイラ（Ｚｙｌａ， １９９３）は最近の文献の中で、酸性ホスファターゼが、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）から精製したフィターゼの存在下、種々の ｐＨ 値において、飼料原材料に対して活性を示すと述べている。
【００１４】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ が産生するフィターゼと酸性ホスファターゼは、基質選択性や最適 ｐＨ 値において互いに異なっているが、最適温度でも異なっている。フィターゼは ５８ｏＣ で最高の活性を示すが、６８ｏＣ で全活性を失う。一方、最適 ｐＨ ２．５ の酸性ホスファターゼは、６３ｏＣ で最高の活性を示し、７０ｏＣ でもなお ８８ ％ の活性を維持する。
最適 ｐＨ ６．０ の酸性ホスファターゼも ６３ｏＣ で最高活性を示すが、７０ｏＣ ではその ９２ ％ の活性を失う。以上のことから、最適 ｐＨ が ２．５ である酸性ホスファターゼが、フィターゼや最適 ｐＨ ６．０ の酸性ホスファターゼよりも高い温度範囲で活性を示すことがわかる。
【００１５】
アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）の老廃菌糸体から得られる未精製の細胞内酸性ホスファターゼは、最適 ｐＨ が １．８ から ２．６ の範囲であり、６０ｏＣで最高活性を示す。又、ｐＨ ４．５ においても最高活性の ８５ ％ の活性を示す［ザイラ（Ｚｙｌａ）他、１９８９］。
【００１６】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼは、フィチン量や糞中のリン排出量を減少させる必要性及び家畜の成育や飼料転換などの家畜の品質改善の目的に従って、家畜のブタとブロイラーの飼料に加えられている。フィターゼの活性／飼料 ｋｇ は、ブタとブロイラー用の飼料で ５００ から １０００ ユニット（ｐＨ ５）が適当であると報告されている［シモンズ（Ｓｉｍｏｎｓ）他、１９９０］。ここで ５００ ユニット／飼料 ｋｇ とは、リン ０．８ｇ／ブタ用飼料 ｋｇ または、リン １．０ｇ／ニワトリ用飼料 ｋｇ に相当する［ボルグリーヴ（Ｂｏｒｇｇｒｅｖｅ），１９９１；ヴァール（Ｖａｈｌ），１９９１］。ブタ飼料には、フィターゼは ６００ ユニット／飼料 ｋｇ まで加えられるが、それ以上の量を加えると逆に効果が下がるので、推められない［ナチュフォス マニュアル（Ｎａｔｕｐｈｏｓ ｍａｎｕａｌ）、ジスト−ブロケイズ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）］。
【００１７】
植物性原材料としての小麦ふすまと大豆に含まれるフィチンを、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の未精製の細胞内酸性ホスファターゼによるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での加水分解は、小麦ふすま及び大豆へ １２，０００ ユニット（Ｕ）／飼料 ｋｇ と ３０，０００ Ｕ ／飼料 ｋｇ をそれぞれ添加して ４０℃、ｐＨ ４．５ の条件でインキュベーション処理すると、２ 時間後に完了する。一方、ブロイラー用飼料を使うと、同条件下で ４ 時間後に加水分解が完了する。この結果は、酸性ホスファターゼがフィチンの分解に関しては効率の悪いことを示している［ザイラ（Ｚｙｌａ）他、１９８９］。
【００１８】
ザイラとコレレスキ（Ｚｙｌａ ａｎｄ ｋｏｒｅｌｅｓｋｉ， １９９３）は、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼに酸性ホスファターゼを付加してイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でセイヨウアブラナ種子や大豆を分解する場合、その分解活性はインキュベーションの ｐＨ 条件に影響されることを示した。このインキュベーション実験は、酸性ホスファターゼ／フィターゼ比が比較的高い条件で行われている（フィチン酸加水分解活性量の比で表すと ３．５／１ から ６２／１）。
【００１９】
ザイラ（Ｚｙｌａ， １９９３）は、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼのフィチンに対する脱リン酸作用は、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼの作用とは異なっており、結果として、２つの酵素の間に相加的作用がある（よって、分解に要する時間が短縮される）ことを示した。フィチン酸から完全にリン酸を脱離するのにかかる時間は、用いるフィターゼの精製度が高いほど（つまり、酸性ホスファターゼ／フィターゼ比が低いほど）長くなる。しかしながら、精製度が最も高いフィターゼであっても、酸性ホスファターゼ／フィターゼ比は依然として高い（３．５／１）。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、フィターゼ製剤を用いるフィチン又はフィチン酸の加水分解を高い効率で行なうための酵素組成物を開発すべく鋭意研究を行なった。その結果、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）とイン ヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、植物性原材料に含まれるフィチン加水分解に際し、真菌類由来の酸性ホスファターゼとフィターゼとよりなる酵素組成物において、酸性ホスファターゼ及びフィターゼが、酵素組成物の ｐＨ 値 ２．５ 及び ｐＨ 値 ５ におけるフィチン酸加水分解活性の比と定義される ｐＨ ２．５／５．０ 活性比が ０．８／１．０〜３／１ という低い範囲にある場合に、意外にもフィチン酸加水分解に対して相乗作用があるということを知見した。本発明は、この知見に基いてなされたものである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明によれば、フィチン酸加水分解活性を有する酸素組成物にして、２．５〜５．０ の ｐＨ 領域にてフィチン酸加水分解活性を持つフィターゼ及び ２．５ の ｐＨ 値でフィチン酸加水分解活性を持つ酸性ホスファターゼを含み、上記フィターゼ及び酸性ホスファターゼは、酵素組成物の ｐＨ 値 ２．５ 及び ｐＨ 値 ５ におけるフィチン酸加水分解活性の比と定義される ｐＨ ２．５／５．０ 活性比がフィチン酸加水分解に対して相乗作用を有するところの ０．８／１．０〜３／１ の範囲になるような量比で含有されてなることを特徴とする酵素組成物が提供される。
【００２２】
本発明の酵素組成物において、フィターゼ及び酸性ホスファターゼは、酵素組成物の上記のように定義した ｐＨ ２．５／５．０ 活性比が、好ましくは １／１〜２．５／１、さらに好ましくは １．５／１〜２／１ の範囲になるような量比で含有される。
【００２３】
本発明の酵素組成物のフィターゼは好ましくは真菌類由来のフィターゼ、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 属由来のフィターゼ、更に好ましくは、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス テレウス（Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ） 由来のフィターゼよりなる群から選ばれる真菌類フィターゼである。
【００２４】
本発明の酵素組成物の酸性ホスファターゼは、好ましくは真菌類由来の酸性ホスファターゼ、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 属由来の酸性ホスファターゼ、更に好ましくはアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス テレウス（Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ）由来の酸性ホスファターゼよりなる群から選ばれる真菌類酸性ホスファターゼである。更に、酸性ホスファターゼは熱安定性を有し、特にフィターゼよりも高い熱安定性を有することが望まれる。
【００２５】
本発明の酵素組成物は、特に、熱処理によって更に好ましい組成比を示すようになる。つまり、熱処理後、酵素組成物中の酸性ホスファターゼ／フィターゼ比が ｐＨ ２．５／５．０ 活性比で ０．８／１．０ 〜 ３／１ の範囲内で上昇するために、２つの酵素間の相乗効果も高まるということである。
【００２６】
更に本発明によれば、上述の酵素組成物を含有する食品、飼料又はかいば製品及びそれらのための成分材料を提供される。それらの中には、上述の酵素組成物を含有する、熱処理された食品、飼料又はかいば製品、或いはそれらのための成分材料が包含される。
【００２７】
また更に本発明によれば、上で定義される酵素組成物により、酵素組成物に含まれるフィターゼと酸性ホスファターゼがフィチン酸の加水分解活性を持つ ｐＨ 条件下で、フィチン酸を含有する原材料を処理する工程を含む、フィチン酸の加水分解方法が提供される。
この処理は好ましくは ｐＨ 約 ２ から ６ の間で、より好ましくは ｐＨ 約 ２．５ で行なうことが望ましい。
また、この工程で処理されるフィチン酸を含む飼料用原材料は、好ましくは植物性原材料であり、より好ましくは、大豆や小麦材料である。
【００２８】
更に本発明によれば、真菌類由来のフィターゼをコードする遺伝子と真菌類由来の酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を含有し、両遺伝子は転写及び翻訳をコントロールする配列に効果的に連結され、両遺伝子によりコードされている酵素が発現するように構成された遺伝子的に改変された植物、もしくはそれに由来する部分又は産生物が提供される。
【００２９】
また本発明によれば、家畜を、上述の酵素組成物を含む飼料又はかいばで飼養することを含む、家畜飼養における飼料又はかいばの消化を向上させ、且つ家畜の堆肥に含まれるリン排出量を減らす方法が提供される。
【００３０】
本発明は、適切な比率での酸性ホスファターゼとフィターゼとの混合物を用いると、その両酵素の相乗作用により、植物性フィチンの酵素分解が改善されることを開示する。
【００３１】
自然界では、多くの植物の種子や穀類の中で、フィチンはリンとイノシトール両方の主要な貯蔵形態の役割を果たしている。発芽・成長の際に、リンはこれらの種子や穀類の中に存在するフィターゼの働きにより、フィチンから離脱される。
【００３２】
これらの植物性原材料は食品や飼料産業で使われるので、フィチンは人間や家畜にとって潜在的なリン源である。ところが、単胃動物にとっては、このフィチンの生体内での取込性は限られている。何故ならば、植物由来のフィターゼは、胃酸により胃腸内で不活化し、よって生体内での効果が低下するからである。そのため、フィチン性リンの生体内利用能を高め、それにより必須食品ミネラルの生体内での取込・吸収性を高めるために次の方法の開発が考えられる：
ａ．酵素による植物性原材料の前処理により、植物性原材料中の消化可能なリンを増やす方法；
ｂ．酵素によって飼料や食品を前処理する方法；及び
ｃ．生体内におけるフィターゼ作用。
しかし、植物由来のフィターゼは、植物性材料及び飼料、食品の前処理（中性の ｐＨ 値）では重要な役割を果たすが、生体内での作用（胃内での ｐＨ 値は２）では、その利用価値は低下する。
【００３３】
生体内でのフィチンの加水分解は、微生物由来、特に真菌類由来のフィターゼによってより効果的になされる。何故ならば、真菌類由来のフィターゼは、胃内の酸性 ｐＨ 条件下で高い活性を示し、また ｐＨ 安定性が高いためである。フィチンを加水分解する酵素は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ） 属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ） 属、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）属等の真菌類によって産生される。これらの真菌類は酸性ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２）とフィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８）の混合物を産生する。この両酵素は、どちらもフィチンを加水分解するが、フィチン酸やリン酸モノエステルに対して、異なった特異性を示す。しかし、これらの生物は低レベルにしか酵素を産生しない。これらの酵素の産生量が、上述の方法を経済的なものにするために最も重要であるため、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）ＮＲＲＬ ３１３５ 株が高産生の株として選ばれた。産生量は低下するが、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス テレウス（Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ）も代用できる。
【００３４】
真菌類由来の酸性ホスファターゼもフィターゼも、それぞれ精製されて溶解しているフィチンを加水分解することはできる。しかし、酸性ホスファターゼは、植物性材料や、飼料、食品に含まれるフィチンに対しては、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でもイン ヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でもほとんど活性を示さない。そのため、酸性ホスファターゼは最近までフィチン加水分解酵素とは考えられていなかった。ところが、単独ではフィチン加水分解活性が低い酸性ホスファターゼであるが、酸性ホスファターゼをフィターゼに対しある一定の活性単位量比で加えると、両酵素間の相乗作用により、フィターゼのフィチン加水分解活性が向上する。この相乗作用は、フィターゼと酸性ホスファターゼを適切な比で混合し、かつ両酵素の濃度が低いときにあらわれる。
【００３５】
飼料及び食品生産工程では、フィチン加水分解酵素の ｐＨ 安定性の他に熱安定性が重要な要因となる。現在一般に行なわれている複合飼料の生産では、ぺレット状の飼料を生産することが多いので、ぺレット化する前の飼料に添加される酵素は、その後のフィチンの加水分解を確実なものにするために、飼料製粉機の中での高温（７５−８０ｏＣ）に耐えられなければならない。アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼは、その温度では部分的に変性するので、３０ ％ 増の量を加えておく必要がある。一方、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼは、フィターゼよりも高温で安定しており、変性も少ない。それ故、酸性ホスファターゼとフィターゼの混合物は、ぺレット状飼料の生産工程において、フィターゼのみよりも、より安定した活性を示す。
【００３６】
フィターゼそのものよりも酸性ホスファターゼとフィターゼの混合物を使う方が植物性フィチンの加水分解が改善されるのは、この酵素組成物の熱安定性が高いからだけではない。その主な理由は、両酵素の熱による変性度が異なるので、ｐＨ 値が ２．５ 及び ｐＨ 値 ５．０ におけるフィチン分解活性の比 （ｐＨ ２．５／５．０ 活性比） が高くなり、両酵素間の相乗的な相互作用が改善されるためである。
【００３７】
真菌類のアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）もしくはアスペルギルスニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２）と、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８）は、どちらもフィチン酸ドデカナトリウム（ｄｏｄｅｃａｓｏｄｉｕｍ ｐｈｙｔａｔｅ）を溶液中で加水分解できるが、両酵素の主要活性は互いに異なっている。フィターゼは主に、フィチン酸に働き（１）、副次的にモノリン酸エステルに働く（２）。酸性ホスファターゼは主にモノリン酸エステルに働き、副次的にフィチン酸に働く（実施例１参照）。フィチン酸に対する活性（１）の、β−グリセロールリン酸ジナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ−β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に対する活性（２）に対する比［（１）／（２）］は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼの場合、６．６ であり、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼの場合 ０．１３ である。この数値は、フィターゼのフィチン酸に対する高い特異性を示している。アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼの場合（１）／（２）は ０．１７ である。これ以下、「酸性ホスファターゼの活性」とはフィチン酸に対する加水分解活性を意味する。酸性ホスファターゼの最適 ｐＨ は ２．３ であり、一方フィターゼの最適 ｐＨ は ５．０ であり、２番目の最適値は ２．５ である。両酵素の混合物は、これから、ｐＨ 値 ２．５ における混合物のフィチン酸加水分解活性（ａ）と ｐＨ 値 ５ における混合物の活性（ｐ）の比（ａ／ｐ）によって識別する。純粋のフィターゼのみの時の ａ／ｐ 比はおよそ ０．６／１ であり、また純粋の酸性ホスファターゼのみの時の ａ／ｐ 比は １／０ である。
【００３８】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 株、及びアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）株由来のフィターゼと酸性ホスファターゼの混合溶液は、既知の方法によって得ることができる。
フィターゼ溶液中の活性要素を同定するために、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において標準的ブタ用飼料を用いて低湿度（７０ ％）、ｐＨ ２．５、４０ｏＣで３時間のテストを行なった（添付図参照）。
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 株由来の異なる ａ／ｐ 比を持つフィターゼ製剤を数種用意し、フィターゼに対する ｐＨ ２．５ における活性単位量（Ｕａ）又は ｐＨ ５ における活性単位量（Ｕｐ）に基づいて決められる量を、それぞれ、ブタ用飼料に添加した。
ｐＨ ２．５ でフィチン酸は実際に分解され（図１参照）、酸性ホスファターゼは液体に溶解しているフィチン酸ナトリウムは加水分解することができたが、フィターゼ製剤の ｐＨ ２．５ における活性と、フィチン酸の加水分解活性との間には直接の相関はみられなかった。一方、フィターゼ製剤の ｐＨ ５ における活性と、フィチン酸に対する加水分解活性との間は相関があり、特にフィターゼ製剤を、ａ／ｐ 比が １．５／１ 未満であるフィターゼ製剤と ａ／ｐ 比が １．５／１ 〜 ３／１ の間にあるフィターゼ製剤とに分類すると、上記の相関が明らかであった（図２参照）。
【００３９】
以上から、飼料中のフィチン酸に対する酸性ホスファターゼの活性は支配的ではないということが結論づけられる。しかしながら、多種の異なったフィターゼ製剤の間では、ｐＨ ５．０ における活性量が同じになるようにしてそれらを添加しても、フィチンに対する加水分解活性に差がみられた。この差は、フィターゼ溶液中の酸性ホスファターゼの異なる活性に対応するものであることがわかった（実施例２参照）。ａ／ｐ 比が ０．６／１ から ３／１ に高くなる、すなわち酸性ホスファターゼの割合が高くなると、ブタ用飼料のフィチンの加水分解に好ましい影響を与え、該フィターゼ混合物のフィチン加水分解効率（ｐＨ 値 ５．０における活性単位量で示した添加量、例えば ５００ 単位、のフィターゼ製剤によって脱離したフィチン性リン量“ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ”）が向上した（図３参照）。
【００４０】
ａ／ｐ 比が ０．６／１ より高い値をとるフィターゼ製剤中での、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）の重要性は、ａ／ｐ 比がそれぞれ ０．６／１ と １／１ である２種のフィターゼ製剤に、酸性ホスファターゼを ａ／ｐ 比で ２／１ まで加えて用いる場合と、酸性ホスファターゼを加えない場合との両者について、ブタ用飼料のフィチンをイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で加水分解することにより証明された（実施例３参照）。さらに、フィターゼと酸性ホスファターゼ間の相乗作用が見られた。同じ Ｕｐ 活性をもつフィターゼ（０．６／１）に酸性ホスファターゼ（１／０）を加えて ａ／ｐ 比を ２／１ にして、ブタ用飼料に添加すると、フィターゼ効率は ０．５５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ から １．２５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ に増加し、０．４９ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ の相乗作用がみられた。ブタ用飼料に対する、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼと、酸性ホスファターゼとの間の相乗作用は ａ／ｐ 比が １．５／１ から ２／１ の時に最高であり、ａ／ｐ 比が ３／１ へと高くなると相乗作用が減少することが示された。３／１ を超えると、相乗作用の上昇は見られなくなった（図３参照）。
【００４１】
飼料は、その組成に各々違いがあり、フィターゼの作用及びフィターゼと酸性ホスファターゼ間の相乗作用に影響を及ぼすことが考えられる。子ブタ用、家禽用のそれぞれ異なる飼料、例えば小ブタ用、雌ブタ用、雄ブタ用、ブロイラー用、産卵鶏用の飼料を、ａ／ｐ 比 １．６／１，０．６／１ のフィターゼ製剤、及びフィターゼ（０．６／１）と酸性ホスファターゼ（１／０）を ａ／ｐ 比 ２／１ になる様にした混合物を用いて、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でインキュベートした。
ホスファターゼと酸性ホスファターゼのフィチン分解効率は飼料の種類によってすべて大きく違う（０．６／１ のフィターゼは０．２５ から １．５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ、酸性ホスファターゼは ０．０２５ から ０．１５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）。これらの事実は、異なった植物性材料の中では、フィチンの存在が異なっており、それが酵素による加水分解にも影響を与えることを示している。
【００４２】
標準的ブタ用飼料において見られたアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼによるフィターゼとの相乗作用は、他の種類の飼料でも見られるが、異なる飼料間で大きな差がある（０．２５ → ０．９４ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）。
フィチンを含む植物性材料の違いが、フィターゼと酸性ホスファターゼの間の相乗作用に与える上記の影響については、エンドウマメ、小麦ふすま、大豆、米ぬか等の、頻繁に家畜用複合飼料に使われる異なる植物性材料を、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ） でフィチン加水分解して検証を行った（実施例５参照）。その際、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（０．６／１）にアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）を、ａ／ｐ 比が ２／１ になるように混合して用いた。
【００４３】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼ（ａ／ｐ 比 ０．６／１ と２／１）は、酸性ホスファターゼ（ａ／ｐ 比 １／０）と同様、その加水分解効率に非常にばらつきがあった。酸性ホスファターゼは、標準的ブタ用飼料に対しては低い効果しか示さないが（０．１５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）、ある種の植物性フィチン、例えば米ぬかに含まれるフィチンはこの酸性ホスファターゼにより容易に加水分解される（０．８ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）。ところが他の植物性フィチン、例えば小麦ふすまや粉状の大豆のフィチンはほとんど分解されない（０．２ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）。
【００４４】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼと酸性ホスファターゼの、飼料に使った際に見られる相乗作用は、酸性ホスファターゼが単独では加水分解効率が低い（０．２ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）植物性材料においてのみに見られる。例えば粉状大豆における相乗作用は ０．５７ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ であり、小麦ふすまでの相乗作用は ０．４７ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ である。
フィチンが酸性ホスファターゼ自身によってすでに加水分解される場合には、フィターゼと酸性ホスファターゼ間の相乗作用は低い。米ぬかにおいて見られる相乗作用は、 ０．１３ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ である。エンドウマメのフィチンはどちらの酵素によってもほとんど加水分解はできず、よって両酵素の相乗作用も見られなかった。
【００４５】
結局、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）の酸性ホスファターゼ（１／０）とフィターゼ（０．６／１）の飼料中での相互作用は、通常の相加的効果と、それに加えて、飼料を構成しているそれぞれの異なる植物性材料によって程度の異なる相乗効果の結果であると説明できる。
【００４６】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ の他にも、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）株によってフィターゼ及び酸性ホスファターゼが産生される。アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）と同様、アスペルギルスニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）も、細胞外フィターゼと酸性ホスファターゼの混合物を産生する。アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファタ−ゼ（ａ／ｐ 比 １／０）は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のものと ｐＨ 活性について同じ特性をもち、最適 ｐＨ は ２．３ である。後述の実施例により、異種の真菌に由来する、フィターゼと酸性ホスファターゼ間にも相乗作用がおこることが証明されている。
【００４７】
標準的ブタ用飼料を使ったアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼ製剤によるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィチン加水分解は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来のフィターゼ製剤によるフィターゼ加水分解と同様であった（実施例６参照）。アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼの加水分解効率は、フィターゼ製剤の ａ／ｐ 比が ０．９／１
から １．６／１ に高まるにつれて ０．７５ から １．１５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐに上昇した。
アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来の酸性ホスファターゼを、ａ／ｐ 比が １．１５／１ であるアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来フィターゼ製剤と混合して得られる、それぞれ ａ／ｐ 比が １．９／１ と １．６／１ である組成物は、これらの酵素間で相乗作用があることを示した（実施例７参照）。
【００４８】
これら２種類の酸性ホスファターゼの加水分解効率は類似している。ａ／ｐ 比が １．１５／１ のアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼ製剤に、酸性ホスファターゼを加えると、飼料中の残存フィチン性リン量が０となり、基質であるフィチン酸が無くなるために、酵素活性や酵素間相乗作用について正確な計測はできなかった。
【００４９】
酵素間相乗作用は、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼとアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来のフィターゼの間にも見られた。アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の ａ／ｐ比 ０．６／１ フィターゼに、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の ａ／ｐ 比 １／０ の酸性ホスファターゼを加えて ａ／ｐ 比を １．９／１ にすると、加水分解効率は２倍になり（０．８５ から １．８ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）、０．６２ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ の相乗効果を示す（実施例８参照）。
【００５０】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来の ａ／ｐ 比 １／０ の酸性ホスファターゼは、液状で且つ飼料のペレット化中に高い熱安定性を示して有利であり、そのためフィターゼ（０．６／１）と酸性ホスファターゼ（１／０）の相乗作用は、ペレット化飼料においてより大きくなる。
液状フィターゼ（０．６／１）は、８０ｏＣ、ｐＨ ５（０．５ Ｍ アセテートバッファー）で１分間インキュベートすると、ｐＨ ２．５ と ｐＨ ５ 両方での活性において、６０ ％ の変性が起きている。一方、酸性ホスファターゼ（１／０）は同条件下でのインキュベート後も、１０ ％ しか失活していない。
【００５１】
飼料粉砕条件下での熱安定性について模擬実施を行なった。ガラスびんに標準的ブタ用飼料を満たし、次いで液状のフィターゼ（０．６／１）または酸性ホスファターゼ（１／０）製剤を加える。この混合物の湿度は １２．２ ％ であった。ガラスびんは密閉し、それぞれウオーターバスにて異なった温度条件（６０−９０ｏＣ）のもとで、加熱した（実施例９参照）。
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）の酸性ホスファターゼ（１／０）の活性（ｐｈ ２．５ における）は、７０ｏＣ で １０ 分間加熱した後も１００ ％の活性を示した。一方、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼ（０．６／１）は、同条件で ４０ ％ の失活を示した（ｐＨ ２．５ における）。８０ｏＣの条件下では、酸性ホスファターゼの活性は ６５ ％ に、フィターゼの活性は ３５ ％ に減少した。
【００５２】
すでに液体中及び飼料の中では示された、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）の酸性ホスファターゼ（１／０）の高い熱安定性は、更にパイロット及び工業用粉砕機においても確認された。
ブタ用飼料にアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼ（０．６／１）または酸性ホスファターゼ（１／０）溶液を加えたものを（３０００ Ｕａ／飼料 ｋｇ）パイロットの規模でペレット化した（実施例１０参照）。ペレットの温度は、粉飼調整機の中に水蒸気を送り込んで調節した。
その結果、フィターゼ（０．６／１）は ６８．６〜７２．１ｏＣ ペレット化温度範囲で平均 ５５ ％ の失活したのに対し、酸性ホスファターゼ（１／０）は ７１．６〜７３．１ｏＣ の温度範囲で ２５ ％ 失活したにすぎない（ｐＨ ２．５ における活性で）。
【００５３】
工業的ペレット化実験を、乾燥フィターゼ製剤を用いて行なった。ａ／ｐ 比 ０．６／１ フィターゼまたは １．２５／１ のフィターゼ混合物を加えた標準ブタ用飼料（９００ Ｕｐ／飼料 ｋｇ）を、工業用飼料粉砕・ペレット成形機に通した（実施例１１参照）。粉飼中の、１．２５／１ フィターゼ混合物の酵素活性は、ペレット成形する前は ０．６／１ フィターゼの活性の １６０ ％ であった（０．９５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ／０．６ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）。ペレット成形した後は、約 ７５ ｏＣ のペレット温度でフィターゼ混合物（１．２５／１）の酵素活性は、フィターゼ（０．６／１）活性の １９０ ％ であった（０．７５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ／０．４ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）。この活性の差は、フィターゼ混合製剤（１．２５／１）に存在する酸性ホスファターゼ（１／０）の高い熱安定性と、２つの酵素の相乗作用効果との組合せによって生まれたと考えられる。例えば、フィターゼ混合製剤（１．２５／１のフィターゼ酵素（０．６／１）の失活（３３ ％）は、ペレット飼料中における酵素組成物の ａ／ｐ 比が １．９／１ （＝１．２５／０．６６）に高まることによって補償されている。
【００５４】
イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィチン加水分解でみられた、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来のフィターゼ（０．６／１）と酸性ホスファターゼ（１／０）の相乗作用及び、酸性ホスファターゼの高い熱安定性は、ペレット化飼料内フィチンの生体内加水分解においても好ましく働くと思われる。
【００５５】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）をアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（０．６／１）に加えることの効果を確かめるため、イン ヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の消化試験をブタを使って行なった（実施例１２及び１３参照）。生体内のフィターゼや酸性ホスファターゼの作用は、酵素作用によるフィチン加水分解に由来するところの、糞便検定から得られる消化性リン（ｄＰ）によって測定する。このような生体内消化性リン ｄＰ は、摂取リン全量−排出リン全量の計算式によって算出される。生体内におけるフィターゼや酸性ホスファターゼの作用による ｄＰ 量の増加は、このようにして求められるイン ヴィヴォ消化性リン ｄＰ と飼料調製中の工程で定まる飼料が生体内投与前に有している ｄＰ との差によって算出できる。
【００５６】
ブタを使った試験Ｉ（実施例１２参照）では、フィターゼ（０．６／１）を ７５０ Ｕｐ／飼料 ｋｇ 加えることにより、ｄＰ 値は ０．７８ ｇ／飼料 ｋｇ増加した。フィターゼに酸性ホスファターゼ（１／０）を １０５０ Ｕａ／飼料 ｋｇ 加え、ａ／ｐ 比を ２／１ にまで上げると、ｄＰ 値は ０．８９ ｇ／飼料 ｋｇ 増加し、相乗作用は０．０５５ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ であった。酸性ホスファターゼが単独で飼料に加えられた場合（１０５０ Ｕａ／飼料 ｋｇ）、飼料中 ｄＰ 値には全く影響がなかった。また ｄＰ 値は試験の後も変化はなかった。 この試験中のフィターゼによる加水分解効率は、高濃度で使われたために低かった（０．５２ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ）。フィターゼに酸性ホスファターゼを加えることにより、全体の加水分解効率は ０．５２ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ から ０．５９ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ へと １３ ％ 増加した。
【００５７】
フィターゼ及びフィターゼ／酸性ホスファターゼの混合物の両方の、ｄＰ 値により示される生体内での相乗作用は、リン排出量が酸性ホスファターゼの添加により減少するという事実にも反映されている。フィターゼ（７５０ Ｕｐ／飼料 ｋｇ）の添加により、リン排出量は統制飼料に比べて ３７ ％ 減少する一方、フィターゼ／酸性ホスファターゼ混合物の添加により、リン排出量は ４１ ％ 減少する。リン排出量のこのような減少（１１ ％）は、リン排出に関する法律による経費の縮小に役立つ。
【００５８】
ブタを使った試験ＩＩ（実施例１３参照）では、０．６／１ フィターゼが適量と認められるレベルである ４００ Ｕｐ／飼料 ｋｇ、ブタ飼料に加えられた。フィターゼの添加により ｄＰ 値は ０．５８ ｇ／飼料 ｋｇ 増加し、フィターゼに １／０ 酸性ホスファターゼを ａ／ｐ 比 ２／１ まで加えると（５８０ Ｕａ／飼料 ｋｇ）、ｄＰ 値は ０．７２ ｇ／飼料 ｋｇ増加した。
フィターゼの濃度を下げると、その活性は ０．７２５ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ にまで増加した。
酸性ホスファターゼを添加すると、混合物による全体の加水分解効率は ２４ ％ 増加し、０．９ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ を示し、相乗作用は０．１２５ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐであった。
生体内におけるアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼと酸性ホスファターゼの相乗作用は、フィターゼ及び酸性ホスファターゼの濃度が低いほどより顕著であることが、試験Ｉ，ＩＩの両方から結論できる（実施例１４参照）。フィターゼ＋酸性ホスファターゼの混合物の添加量が、７５０ Ｕｐ＋１０５０ Ｕａ／ｋｇ から４００ Ｕｐ ＋５８０ Ｕａ／ｋｇに減少すると、加水分解効率は０．５９ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐから０．９ ｇ ｄｐ／５００ Ｕｐ に高まった。
【００５９】
次に、添付の図１〜３について更に説明する。
図１〜３を作成するための実験は次のようにして行った。
フィチン性リンを ０．３３ ％ の割合で含有する標準的ブタ用飼料を用いて、ａ／ｐ 比が １／０ から １６／１ の範囲で異なる種々のアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ製剤により、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で植物性フィチンを加水分解した。ブタ用飼料の平均的構成成分は、エンドウマメ、タピオカ、グルテン状トウモロコシ飼料、グルテン状小麦飼料及び成分濃縮大豆である。
フィターゼ製剤は活性単位量を変えて添加された。
１．０ − ２．５ Ｕａ （ｐＨ ２．５ 活性）／飼料 ｇ （図１）
２．０ − ２．８ Ｕｐ （ｐＨ ５ 活性）／飼料 ｇ （図２）
飼料に含まれるフィチン性リン全量は、エリス及びモリス（Ｅｌｌｉｓ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ， １９８３， １９８６）の方法に従って測定した。２ ｇ の飼料に適当に希釈されたフィターゼ製剤を加えた。０．２Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン−塩化水素バッファーを加え、混合物の湿度を ７０ ％ に調整した。混合物を ４０ｏＣ で３時間インキュベートした。その後、飼料は ４０ ｍｌ の ２．４ ％ 塩酸で３時間抽出にかけ、抽出液中の残存フィチン性リンはイオン交換クロマトグラフィー処理及びフィチン破壊処理後に測定した。
フィチン酸に対する ｐＨ ５ におけるフィターゼの １ 活性単位はここでは１ Ｕｐ で示し、フィチン酸に対する ｐＨ ２．５ における酸性ホスファターゼの１活性単位は１ Ｕａ で示す。
【００６０】
図１は、フィターゼの作用後のフィチン性リン残存率を、添加したフィターゼ製剤の ｐＨ ２．５ における活性単位量で表わした添加量との関係により表したものである。飼料に ｐＨ ２．５ における活性が同一のフィターゼを添加した（例えば、 ０．５ 〜 １ Ｕａ／ｇ）が、残存フィチン性リン（９５ 〜 １０ ％）と添加された酵素活性単位量との間に相関は見られなかった。つまり、ｐＨ ２．５ における活性とブタ用飼料におけるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィチン加水分解とは、相関がないという事を示している。
【００６１】
図２は、フィターゼの作用後のフィチン性リン残存率を、添加したフィターゼ製剤の ｐＨ ５ における活性単位量で表わした添加量との関係により表したものである。飼料に ｐＨ ５ における活性が同一のフィターゼを添加すると（例えば、０．４ 〜 ０．５ Ｕｐ／ｇ）、残存フィチン性リンは添加された酵素活性単位量と相関を示した。更にフィターゼ製剤を ａ／ｐ 比が １．５／１ から ３／１ であるものと １．５／１ 未満のものに分けると、ｐＨ ５ にて同じ活性単位量を有する数種の酵素の添加によるフィチン性リン残存率の差が小さくなった。ａ／ｐ 比が １．５／１ 未満のフィターゼ製剤は １．５／１ から ３／１ であるものに比べ、フィチン加水分解の効率が低い。
【００６２】
図３は、１ ｋｇ の飼料に ５００ Ｕｐ のフィターゼを加え ４０ｏＣ で３時間インキュベートした際に遊離されるフィチン性リン量で表わされる、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィチン加水分解効率を示す。ａ／ｐ 比の異なるフィターゼ製剤の示すフィチン加水分解効率（実験値）を、そのフィターゼ製剤を構成するフィターゼ（０．６／１）と酸性ホスファターゼ（１／０）の２つの酵素間の相加効果を実施例３に準じて算出した加水分解効率（計算値）と比較した。両酵素間の相乗効果は、実験値と相加効果（計算値）との差として算出した。相乗効果は ａ／ｐ 比 ２／１ 周辺で最大となった。ａ／ｐ 比が ２／１ より高くなっても相乗効果がさらに増大することはなかった。
【００６３】
【実施例】
実施例１
フィターゼと酸性ホスファターゼの ｐＨ 値 ２．５ での活性は、リン遊離量の測定により分析された。０．５ ｍｌ の適切に希釈した酵素溶液を、０．２ Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン バッファー（Ｓｏｒｅｎｓｅｎｂｕｆｆｅｒ）と １２．５ ｍＭ のフィチン酸ドデカナトリウムもしくは ２５ ｍＭ のβ−グリセロールリン酸ジナトリウム溶液の１対１混合液 ２ ｍｌ に添加した。この反応液を ４０ｏＣ で １０ 分間インキュベートした。反応は １０ ％ トリクロロ酢酸溶液を ２．５ ｍｌ 加えて停止させた。遊離したリンは公式のＥＥＣ法（ｏｆｆｉｃｉａｌ ＥＥＣ ｍｅｔｈｏｄ）に従って、５ ｍｌ のヴァナデイト／モリブデイト（Ｖａｎａｄａｔｅ／ｍｏｌｙｂｄａｔｅ）試薬を加えて分光光度法により測定した。
フィチン酸ドデカナトリウムに対する ｐＨ ５ でのフィターゼ活性は、ｐＨ ２．５ のセーレンセン バッファーの代わりに １Ｍ ｐＨ ５ の酢酸バッファーを使って上記方法と同様に測定した。
フィターゼ活性または酢酸ホスファターゼ活性の１ユニットは、それぞれ ｐＨ ５ または ｐＨ ２．５ おいて、４０ｏＣで１分間に１μｍｏｌｅのリンを遊離する酵素の量と定義する。
ｐＨ ２．５ における（１）フィチン酸に対する酵素活性と（２）β−グリセロールリン酸ジナトリウムに対する酵素活性の比、（１）／（２）は、両酵素の基質特異性を示している。フィターゼ及び酸性ホスファターゼの（１）、（２）及び（１）／（２）の測定値を表１に示す。ａ／ｐ 比が ０．６／１ のフィターゼはフィチン酸に対して最も高い活性を示し、酸性ホスファターゼはβ−グリセロールリン酸ジナトリウムに対して最高活性を示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
実施例２
フィチン性リンを ０．３３ ％ の割合で含有する標準的ブタ用飼料を用いて、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の種々のフィターゼ製剤によりインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でフィチンを加水分解した。ブタ用飼料の平均的構成成分は、エンドウマメ、タピオカ、グルテン状トウモロコシ飼料、グルテン状小麦飼料及び抽出大豆（ｓｏｙａ ｂｅａｎｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）である。飼料に含まれるフィチン性リン全量は、エリス及びモリス（Ｅｌｌｉｓ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ， １９８３， １９８６）の方法に従って測定した。２ ｇ の飼料に １．４ Ｕｐ の液状フィターゼ製剤を加えた。０．２Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン−塩化水素バッファー（Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ）を加え、混合物の湿度は ７０ ％ に調整した。混合物を ４０ｏＣ で３時間インキュベートした。その後、飼料は ４０ ｍｌ の ２．４ ％ 塩化水素で３時間抽出にかけ、抽出液中の未分解フィチン性リンを、イオン交換クロマトグラフィー処理及びフィチン破壊処理後に測定した。フィチン加水分解効率はフィターゼによる処理前と処理後の飼料に含まれるフィチン含有量の差によって算出した。イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィターゼの効率は、５００ Ｕｐ／飼料 ｋｇ のフィターゼによる ４０ｏＣ で３時間の反応によって遊離されるフィチン性リン量（ｇ ｐｐ）から算出した。
フィターゼ製剤の ａ／ｐ 比とフィチン加水分解効率を表２に示す。
フィターゼ製剤の ａ／ｐ が低い（０．６／１ 〜 ２／１）ところで ａ／ｐ 比を上げると、フィターゼ製剤の効率は直線的に上昇した。例えば純粋なフィターゼ（０．６／１）が ０．５５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ の効率を示したのに対し、ａ／ｐ 比が ２／１ のフィターゼ製剤は １．７５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ もの効率を示した。従って、同じ ５００ Ｕｐ のフィターゼ活性をもつフィターゼ製剤を １ ｋｇ のブタ用飼料に加えても、ａ／ｐ 比の違いによってリン遊離量は ０．５５ ｇ から １．７５ ｇ の幅をもって変化する。ａ／ｐ 比が高いところでは効率の上昇（相乗効果）は頭打ちとなる。
【００６６】
【表２】
【００６７】
実施例３
標準的ブタ用飼料（実施例２参照）を使い、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ製剤によるフィチン加水分解を行った。その際、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）を添加して実験を行ない、酸性ホスファターゼ／フィターゼ混合物における酸性ホスファターゼの重要性を証明した。１．４ Ｕｐ の活性単位量を有するフィターゼ（０．６／１）にそれぞれ ２ Ｕａ 又は ３．４ Ｕａ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼを添加して、ａ／ｐ 比を ２／１ 又は ３／１ にした。１．４ Ｕｐ の活性単位量を有する ａ／ｐ 比 １／１ のフィターゼ製剤にそれぞれ １．４ Ｕａ 又は ２．８ Ｕａ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼを添加して、ａ／ｐ 比を ２／１ 又は ３／１ にした。
１．４ Ｕｐ の液状フィターゼ製剤（ａ／ｐ 比はそれぞれ ０．６／１、１／１、２／１ 及び ３／１）を ２ ｇの飼料に添加した。０．２ Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン−塩化水素バッファーを加え、混合物の湿度を ７０ ％ もしくは ８０ ％ に調節した。混合物を ４０ｏＣ で３時間インキュベートした。
酸性ホスファターゼ自身の効率は、２ Ｕａ の活性単位量を ２ ｇ のブタ用飼料に添加し、上記と同様の方法でインキュベートして求めた。
フィチン加水分解効率は実施例２と同様にして算出した。
フィターゼ、酸性ホスファターゼ及びそれらの混合物のフィチン加水分解効率、計算による相加効果及び相乗効果は表３に示す。
フィターゼと酸性ホスファターゼを飼料に添加する前に ａ／ｐ 比 ２／１ 又は ３／１となるよう混合すると、両酵素間の相加効果と相乗効果の両方により、酵素混合物の効率は高まる。
例えば、５００ Ｕｐ のフィターゼ（０．６／１）をブタ用飼料に加えると ０．９５ ｇ のフィチン性リンが遊離する。一方、５００ Ｕａ の酸性ホスファターゼ（１／０）を加えると、０．２５ ｇのフィチン性リンが遊離する。５００ Ｕｐ のフィターゼ（０．６／１）は ３００ Ｕａ の ｐＨ ２．５ 時活性をもつので、ａ／ｐ 比が ２／１ となる酸性ホスファターゼ／フィターゼ混合物を用意するためには、７００ Ｕａ の酸性ホスファターゼ（１／０）が必要である。もし両酵素が単純な相加効果しか有さないのであれば、効率は下記のように計算される。
（５００ Ｕｐ フィターゼ × ０．９５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）＋（７００ Ｕａ 酸性ホスファターゼ× ０．２５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）＝１．３ ｇ ｐｐ （／５００ Ｕｐ フィターゼ）。
しかし、この実験観察された効率は １．３ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ ではなく ２．１ ｇ ｐｐ／５００
Ｕｐ である。従って ０．８ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ の相乗効果があったことになる。
【００６８】
【表３】
【００６９】
実施例４
種々の標準的飼料（ブタ、子ブタ、雌ブタ、ブロイラー及び産卵鶏用）を使い、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の種々のフィターゼ製剤によるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での加水分解を行ない、一般的に飼料におけるフィターゼと酸性ホスファターゼとの間の相乗作用について検討した。
各種飼料の主要成分は以下の通りであった。
子ブタ：大麦、小麦、抽出大豆、小麦ふすま、乳漿（ｗｈｅｙ）パウダー及び魚の粉餌
雌ブタ：タピオカ、エンドウマメ、抽出ヒマワリ種子（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）、米ぬか及びココナッツの搾油かす
雄ブタ１：タピオカ、エンドウマメ、抽出大豆及びグルテン状小麦飼料
雄ブタ２：タピオカ、エンドウマメ、抽出大豆、グルテン状小麦飼料及びグルテン状トウモロコシ飼料
ブロイラー：モロコシ、抽出大豆、エンドウマメ及び肉餌
産卵鶏：トウモロコシ、大豆、抽出ヒマワリ種子及び石灰石
０．７ Ｕｐ／ｇ の活性単位量を有するフィターゼ（０．６／１）又は、１ Ｕａ／ｇ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼ（１／０）を各飼料に添加した。０．７ Ｕｐ の活性単位量を有するフィターゼ（０．６／１）に １ Ｕａ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼ（１／０）を添加して、ａ／ｐ 比を ２／１ にした。インキュベーション条件は、実施例３（湿度 ８０ ％）と同様にした。相乗効果は、実施例３と同様にして算出した。
フィターゼ及び酸性ホスファターゼのフィチン酸加水分解効率は、ともに、飼料により大きく異なった。両酵素の相乗効果はすべての飼料について見られたが、飼料によって異なっていた。
０．７ Ｕｐ／ｇ の活性単位量を有するフィターゼ製剤（ａ／ｐ 比 １．６／１）を種々の飼料に添加した。このフィターゼ製剤のフィチン酸加水分解効率は、酸性ホスファターゼ／フィターゼ混合物中の酸性ホスファターゼ（１／０）の効果を実証した。
【００７０】
【表４】
【００７１】
実施例５
酵素によるフィチンの加水分解効率は飼料により大きく異なった（実施例４）ので、フィチンの加水分解効率は飼料を構成する植物性材料に影響を受けることが予想できた。
種々の異なる植物性フィチンの加水分解効率及び種々の植物性材料に単独、あるいは混合されて添加されたアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）フィターゼ（０．６／１）及び酸性ホスファターゼ（１／０）のフィチン酸加水分解効率をイン
ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で試験した。
０．３５ 〜 ０．７ Ｕｐ／ｇ 飼料材料の活性単位量を有するフィターゼ（０．６／１）又は、 １ Ｕａ／ｇ 飼料材料の活性単位量を有する酸性ホスファターゼ（１／０）を各飼料材料に添加した。フィターゼ（０．６／１）にそれぞれ ０．５ Ｕａ／ｇ 又は １ Ｕａ／ｇ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼを添加して、ａ／ｐ 比を ２／１ にした。インキュベーション条件は、実施例２（湿度 ８０ ％）と同様に行なった。フィチンの加水分解は実施例２と同様に分析され、フィターゼの加水分解効率は実施例２と同様にして算出した。相乗効果は、実施例３と同様にして算出した。
エンドウマメに対するフィターゼの効率はきわめて低く（０．１５ ｇ ＰＰ／５００ Ｕｐ）、酸性ホスファターゼによる相乗効果はなかった。
最大の相乗効果は、フィチンがフィターゼにより容易に加水分解されるが、酸性ホスファターゼによってほとんど加水分解されない植物性材料、例えば大豆及び小麦ふすまにおいて見られた。
酸性ホスファターゼ自身が植物性フィチンをより効率よく加水分解する場合での相乗効果は低かった。
【００７２】
【表５】
【００７３】
実施例６
標準的ブタ用飼料（実施例２）を用いて、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来の異なる ａ／ｐ 比を有する種々のフィターゼ製剤によりイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのフィチン加水分解を行なった。フィターゼは ０．７ 又は １ Ｕｐ／ｇ 飼料の活性単位量相当量を添加した。インキューベーション条件は、実施例２（湿度 ７０ ％）と同様にした。
フィチン加水分解は、実施例２と同様に行ない、フィターゼ効率は実施例２と同様に算出した。
アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の種々のフィターゼ製剤の ａ／ｐ 比が０．８／１〜３／１の様に低い範囲で高まるとともに、これらの製剤のフィチン酸加水分解効率は増加した。すなわち、フィターゼのフィチン酸加水分解効率は、フィターゼの ａ／ｐ 比によって、０．７５ と １．１５ ｇ ＰＰ／５００ Ｕｐ の間で変化する。
【００７４】
【表６】
【００７５】
実施例７
標準的ブタ用飼料（実施例２参照）を使いイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、ａ／ｐ比が １．１５／１ のアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼ製剤にアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼもしくはアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）ＮＲＲＬ ３１３５ 由来の酸性ホスファターゼを添加し、それぞれ ａ／ｐ 比を １．９／１ 及び １．６／１ に増し、加水分解を行なった。
ブタ用飼料にアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼ（１．１５／１）を ０．７ Ｕｐ／飼料 ｇ で加え、０．５ Ｕａ／ｇ のアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼもしくは ０．３ Ｕａ／ｇ アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）ＮＲＲＬ 由来の酸性ホスファターゼを上記フィターゼに添加し、それぞれ ａ／ｐ 比を １．９／１ 及び １．６／１ にした。
上記混合物を湿度を ８０ ％ にした以外は実施例２と同様の条件でインキュベートした。フィターゼの加水分解結果を解析しフィチン加水分解効率を実施例２と同様にして算出した。
ａ／ｐ 比が １．１５／１ のアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼとアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス フィキューム 由来の酸性ホスファターゼ（１／０）の間の相加効果及び相乗効果を実施例３と同様にして算出した。
【００７６】
【表７】
【００７７】
実施例８
標準的ブタ用飼料を使い、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼに、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼを添加してフィチン加水分解を行った。フィターゼ（０．６／１）を０．７ Ｕｐ／飼料 ｇ 加え、０．８５ − ０．９ Ｕｐ／飼料 ｇ の酸性酸性ホスファターゼ（１／０）を添加してそれぞれの ａ／ｐ 比が １．８／１ 及び １．９／１ フィターゼ製剤を得た。
酸性ホスファターゼを １ Ｕａ ／飼料 ｇ 加えた。
上記フィターゼ製剤を、湿度 ８０ ％ にした以外は実施例２と同様の条件下でインキュベートした。
フィチン加水分解結果を解析したフィターゼの加水分解を実施例２と同様にして算出した。アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（０．６／１）とアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）の両酵素間の相乗効果を実施例３と同様にして算出した。
【００７８】
【表８】
【００７９】
実施例９
標準的ブタ用飼料（実施例２参照）を使い、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（０．６／１）及び酸性 ホスファターゼの熱安定性について実験を行った。この際、上記フィターゼ及び酸性ホスファターゼを、それぞれガラスびんに密閉し、ウォーターバスに浸漬し、飼料粉砕時の条件と同じ条件を得るようにした。
１７５０ Ｕａ のフィターゼもしくは酸性ホスファターゼを含む ２０ ｇ のブタ用飼料を ４８０ ｇ のブタ用飼料と混合し、３５００ Ｕａ／ｋｇ の飼料を得た。１０．５ Ｕａ のフィターゼもしくは酸性ホスファターゼを含む酵素入り飼料 ７ ｇ を複数のガラスびんに満たした。飼料の湿度は １２．２ ％ であった。ガラスびんを密閉し、それぞれ種々の温度条件（７０〜９０ｏＣ）下でウォーターバスに浸漬し、１０ 分間温めた。ｐＨ ２．５における残留酸性ホスファターゼ及びフィターゼの活性を、酵素抽出後、以下の様に測定した。即ち、熱処理された飼料 ３ ｇ を ５０ ｍｌ の ０．１ Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン バッファー（Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎｂｕｆｆｅｒ）で ３０ 分間抽出し、飼料抽出後におけるフィチン酸ドデカナトリウムに対する ｐＨ ２．５ でのフィターゼ又は酸性ホスファターゼの活性を実施例１と同様にして測定した。未処理の飼料における活性を １００ ％ と設定し、それぞれの温度で処理された飼料における酵素の残存活性をパーセンテージ（％）で算出した。
フィターゼ及び酸性ホスファターゼの残存活性を表９に示す。
【００８０】
【表９】
【００８１】
実施例１０
ブタ用飼料を、アスペルギルス フィキューム フィターゼ（０．６／１）又は酸性ホスファターゼ（１／０）の溶液を添加した後、パイロットの規模でペレット化した。各酵素は、活性が １６５０００ Ｕａ／ 混合物 ５５０ ｇ となるように混ぜ、ペレット化する前のブタ用飼料 ５５ ｋｇ に添加した。
このブタ用飼料は主としてエンドウマメ、抽出セイヨウアブラナ種子（ｒａｐｅ ｓｅｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）、グルテン状トウモロコシ飼料及びタピオカを含んでいた。飼料粉砕・ペレット成形機のダイスから取り出すペレットの温度を、水蒸気を送りこむことにより ６９ 〜 ７４ｏＣ の間に調整した。
飼料（粉飼）とペレット化飼料中のフィターゼ及び酸性ホスファターゼのｐＨ ２．５ における各活性を、以下の酵素抽出操作の後測定した：飼料 ５ ｇ を ５０ ｍｌ の ０．１ Ｍ セーレンセンバッファー（ｐＨ ２．５）で ３０ 分間抽出し、実施例１と同様にしてフィチン酸ドデカナトリウムに対するフィターゼ又は酸性ホスファターゼの ｐＨ ２．５ での活性を測定した。粉末飼料における各酵素活性（３ Ｕａ／ｇ）を １００ ％ とした。
フィターゼ又は酸性ホスファターゼを含む飼料の各湿度は、それぞれ １１．６ と １１．９ （粉飼調整機における）から、１０．６ と １０．８ （冷却したペレットにおける）と低下した。
【００８２】
【表１０】
【００８３】
実施例１１
アスペルギルス フィキューム フィターゼ（０．６／１）及びアスペルギルス フィキューム フィターゼ（１．２５／１）の各調製物をブタ飼料に ９００ Ｕｐ／飼料 ｋｇ となるように加えた後、工業規模で飼料をペレット化した。このブタ用飼料は主としてエンドウマメ、グルテン状トウモロコシ飼料、抽出大豆及びタピオカを含んでいた。飼料中フィチン性リン（ＰＰ）濃度は、実施例２の方法で測定したところ ０．３７ ％ だった。飼料粉砕・ペレット成形機のダイスから取り出すペレットの温度は、実施例１０と比較し得る温度であった（７４．５ｏＣ）。フィターゼの残存活性を、以下のペレット化飼料のイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）フィチン加水分解により測定した：フィターゼを含む ２ ｇ の飼料を実施例２と同様にしてインキュベートした（湿度 ８０ ％）。実施例２と同様にしてフィチンの加水分解度を分析し、フィターゼ効率を計算した。ペレット化する前の粉飼のフィターゼ効率を １００ ％とした。ペレット化飼料におけるフィターゼ（１．２５／１）効率（０．７５ ｇ ＰＰ）はフィターゼ（０．６／１）効率（０．４ ｇ ＰＰ）の １９０ ％ であったが、粉飼におけるフィターゼ（１．２５／１）効率（０．９５ ｇ ＰＰ）はフィターゼ（０．６／１）効率（０．６ ｇ ｐｐ）の １６０％ にとどまった。
【００８４】
【表１１】
【００８５】
実施例１２
リン消化試験 ＩＩ（ブタ １２ 頭、ブタ ３ 頭／飼料）：
ブタの対照用飼料には、消化性リンが ２ ｇ／ｋｇ、リン全量が ５．８ ｇ／ｋｇ となるように調製した（飼料Ｉ）。飼料Ｉは主としてエンドウマメ、タピオカ、グルテン状トウモロコシ飼料、グルテン状小麦飼料及び抽出大豆を含んでいた。
フィターゼ含有飼料は、消化性リンが １．１７ ｇ／ｋｇ、リン全量が ４．４ ｇ／ｋｇ となるようにし、主成分が飼料Ｉと同じになるように調製した。これらは飼料にそれぞれ異なるアスペルギルス フィキューム フィターゼ 調製物を加えたもの、即ち７５０ Ｕｐ／ｋｇ のフィターゼ（０．６／１）を加えたもの（飼料 ＩＩ）、１０５０ Ｕａ／ｋｇ の酸性ホスファターゼ（１／０）を加えたもの（飼料ＩＶ）、及び ７５０ Ｕｐ／ｋｇ のフィターゼ（０．６／１）と １０５０ Ｕａ／ｋｇ の酸性ホスファターゼ（１／０）の混合物を加えて ａ／ｐ 比＝２／１ としたもの（飼料ＩＩＩ）である。濃縮した各酵素溶液をそれぞれ粉飼に加えて与えた。１２ 頭のブタをそれぞれ別の檻に入れ、飼料Ｉ〜ＩＶをそれぞれ ３ 頭ずつに １７ 日間与えた（最初の ７ 日間を予備期間とし、残りの １０ 日間を試験期間とした）。１日当りの１頭の飼料摂取量は １８００ ｇ で、試験期間の全摂取量は １８ ｋｇ であった。試験期間の １０ 日間にわたってそれぞれのブタにつき糞を集め、集めた糞につきリンの全排出量をＥＥＣ法で測定した。見かけのリン消化係数（ＤＣ−Ｐ（％））をリン全摂取量とリン全排出量との差から計算した。
例えば、飼料Ｉについて：
リン全摂取量： １０４．４ ｇ ＝ １００ ％
リン全排出量： ７０．９ ｇ ＝ ６７．９ ％
ＤＣ−Ｐ （％） ＝ １００ − ６７．９（％） ＝ ３２．１（％）
消化性リン（ｇ ｄＰ／ｋｇ） ＝ 飼料中のリン濃度 × ＤＣ−Ｐ ＝ ５．８ （ｇ Ｐ／ｋｇ） × ０．３２１ ＝ １．８６ （ｇ Ｐ／ｋｇ）
【００８６】
【表１２】
【００８７】
実施例１３
リン消化試験 ＩＩ（ブタ ２４ 頭、ブタ ８ 頭／飼料）：
ブタの対照用飼料は、消化性リンが ２ ｇ／ｋｇ、リン全量が ６．１ ｇ／ｋｇ となるように調製した（飼料Ｉ）。飼料Ｉは主としてエンドウ、タピオカ、小麦グルテン飼料及び抽出大豆を含み、リンの一部はモノカルシウムホスフェートによって供給した。フィターゼ含有飼料は、消化性リンが １．４ ｇ／ｋｇ、リン全量が ５．２ ｇ／ｋｇとなるように調製した。フィターゼ含有飼料の成分は、モノカルシウムホスフェートを用いないこと以外は飼料Ｉと同様にした。
フィターゼ含有飼料については、フィターゼ（０．６／１）を推奨レベルである ４００ Ｕｐ／ｋｇ 加える（飼料 ＩＩ）か、又は ５８０ Ｕａ／ｋｇ の酸性ホスファターゼ（１／０）と ４００ Ｕｐ／ｋｇ のフィターゼ（０．６／１）の混合物を加えて ａ／ｐ 比＝２／１ とした（飼料ＩＩＩ）。フィターゼ溶液及びフィターゼ／酸性ホスファターゼ溶液を飼料（粉飼）に加えて与えた。２４ 頭のブタをそれぞれ別の檻に入れ、飼料Ｉ〜ＩＩＩをそれぞれ ８ 頭ずつに １７ 日間与えた（最初の ７ 日間を予備期間とし、残りの １０ 日間を試験期間とした）。１日当りの１頭の飼料摂取量は １８００ ｇ で、試験期間の全摂取量は １８ ｋｇ であった。試験期間の １０ 日間にわたってそれぞれのブタにつき糞を集め、集めた糞につきリンの全排出量をＥＥＣ法で測定した。消化性リン（ＤＣ−Ｐ ％ 及び ｇ ｄｐ／ｋｇ）を実施例 １２ と同様に計算した。
【００８８】
【表１３】
【００８９】
実施例１４
アスペルギルス フィキューム由来のフィターゼと酸性ホスファターゼのブタの飼料（粉飼）への添加量の違いと生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のフィターゼ効率（実施例 １２ 及び １３参照）：
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のフィターゼ効率（ｇ ｄｐ／５００ Ｕｐ）は、飼料に添加した ５００単位（Ｕｐ） のフィターゼ（０．６／１ 又は ２／１）によって消化中に遊離されるリンの量として定義した。
酵素によって遊離したリンの量は、飼料に配合した消化性リンの量と実施例１２におけるような動物実験から算出した消化性リンの量の差として定義した。
例えば：
飼料に配合した消化性リンの量： １．１７ ｇ／ｋｇ
動物実験から計算した消化性リンの量： ２．０６ ｇ／ｋｇ
飼料のフィターゼ含量： ７５０ Ｕｐ フィターゼ／ｋｇ ＋ １０５０ Ｕａ 酸性ホスファターゼ／ｋｇ
フィターゼ効率（ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ） ＝ （２．０６ − １．１７） × ５００／７５０ ＝ ０．５９
酸性ホスファターゼの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）効率は０であるから、相乗的効率は酸性ホスファターゼ（２／１）／フィターゼ混合物の効率とフィターゼ（０．６／１）の効率の差として求める。
【００９０】
【表１４】
【００９１】
【発明の効果】
本発明の酵素組成物は、動物の生体内及び家畜用飼料の生産工程において、飼料又は飼料原材料中に含まれるフィチン酸に対して高い加水分解効率を有するため、家畜の生体内でのフィチン性リンの取込・吸収性を高める。従って、環境的に問題の多い家畜からのリン排出量及び飼料中のリン含有量を減らすために非常に有用である。
【００９２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ製剤によるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのフィチン加水分解効果（ｐＨ ２．５ における活性単位量で表わした添加量に対するフィチン酸性リン残存率で示す）を示す図である。
【図２】図２は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ製剤によるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのフィチン加水分解効果（ｐＨ ５．０ における活性単位量で表わした添加量に対するフィチン酸性リン残存率で示す）を示す図である。
【図３】図３は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の異なる ｐＨ ２．５／ｐＨ ５．０ 活性比を有する種々のフィターゼ製剤におけるフィターゼ（０．６／１）及び酸性ホスファターゼ（１／０）のイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での相乗効果を示す図である。
【産業上の利用分野】
本発明は酵素によるフィチンの加水分解に関する。より詳しくは、有機リン化合物であるフィチン酸を、無機リンとイノシトールとに加水分解するフィターゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
家畜飼養において、複数の必須ミネラルの存在が重要な役割を果たしているというのは確立した事実である。これらの飼料成分の取込・吸収性は、家畜の成育状況や、堆肥に含まれる排泄物に反映される。家畜の集中飼育生成の増加により、堆肥の生成はそれに含まれるリン酸分のために、環境問題を引きおこしている。さらに、堆肥に関する問題、特に堆肥のリン含有度を規制する法律によってそれに関わる出費が必要となり、環境へのリン排出量を減らすことが要請されている。リンは、様々な植物性原材料や、動物性副産物、或いは無機リンの形で、飼料に添加される。
【０００３】
フィチン酸 （ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ ｏｒ ｐｈｙｔａｔｅ） は、イノシトールの六リン酸エステル（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｈｅｘａｋｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であり、各種の種子や穀物に含まれている。また、フィチン酸は、リンとイノシトールの両方の主要な貯蔵形態であり、リン全含有量の ５０ ％ 以上にあたる［ロラス（Ｌｏｌａｓ）他、１９７６； ソーヴァー（Ｓａｕｖｅｕｒ）， １９８９］。油用種子は、５．２ ％ものフィチンを貯えることができる［レディ（Ｒｅｄｄｙ）他，１９８２］。
【０００４】
しかしながら、植物性原材料のフィチンに含まれているリンは、家畜、ブタ、人などの単胃の動物には、その単純な消化管のために消化が難しい。これらの動物では、腸内でフィチン酸の加水分解を触媒する腸内フィターゼの活性は、全くないか極く低いレベルであり、結腸に出されたフィチン性リンは、そのまま体外に排出される。このため、植物性原材料は、家畜飼養にとっては充分なリン供給源ではなく、付加的なリンを動物性副産物や無機リン酸の形で飼料に含有させる必要がある。
【０００５】
また、フィチンは、そのキレート特性により反滋養要因と考えられている。即ち、Ｃａ２＋， Ｆｅ３＋， Ｍｇ２＋ やＺｎ２＋ などの多価の陽イオンと結合して、非溶解性の錯体を形成しており、これらの必須飼料ミネラルの生体内取込性と吸収性を下げるためである。更にまた、タンパク質とフィチンによる複合体の形成［コスグルーヴ（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ），１９６６］は、酵素によるタンパク質の消化の妨げとなる。
この様な、フィチンの、リン及びミネラル代謝に及ぼす否定的効果により、また合わせて環境への高濃度のリン排出や、それに関する法律の制定により、フィチン性リンを生体内で利用可能にすることの必要性が高まっている。
【０００６】
フィチンやフィチン酸は、植物性原料に存在するか、或いは、微生物によって作られるフィターゼの触媒活性により加水分解される。酵素フィターゼ［ｍｙｏ−イノシトール六リン酸ホスホヒドロラーゼ（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）Ｅ．Ｃ．３．１．３．８．］は、適切な条件下でフィチン酸を無機リン酸とイノシトール一〜五リン酸 （ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｍｏｎｏ− ｔｏ ｐｅｎｔａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ） に加水分解する。
フィターゼは植物から微生物、特に真菌類、に広く分布している酵素であるが、単胃の動物では、腸内に、ほとんど微量にしか存在していない。
植物由来のフィターゼは ｐＨ 安定性に欠け、触媒活性を示す ｐＨ の範囲が狭い［スタルディ及びバックル（Ｓｕｔａｒｄｉ ＆ Ｂｕｃｋｌｅ），１９８６； ロラス及びマルカキス（Ｌｏｌａｓ ＆ Ｍａｒｋａｋｉｓ）， １９９１］。そのため単胃の動物の消化管の中で急速に不活化し、生体内効率は低い［イックハウトとデパエペ（Ｅｅｃｋｈｏｕｔ ａｎｄ Ｄｅ Ｐａｅｐｅ）、１９９１］。それ故、家畜用複合飼料の調製における、植物由来フィターゼの重要性は低い。
それに対し、微生物由来のフィターゼのいくつかは、広い ｐＨ 領域で安定性と活性を有しており、動物の腸内でフィチンがより効率的に加水分解される。そのため、動物の胃の酸性条件にも耐え得る微生物由来のフィターゼを加えることによって飼料に含まれるフィチン性リンの取込・吸収性を改良するため、微生物由来のフィターゼの生産方法が開発されてきた。しかしながら、微生物由来のフィターゼの熱安定性は低く、合成飼料を生産する工程で発せられる高温（７０〜８０ｏＣ）に耐えることができない。それ故、必要量の ３０ ％ 増の量を用いることが必要となる。
【０００７】
真菌類由来のフィターゼを加えると、フィチン性リン又はミネラルの吸収性が向上し、それによりリン転換率が高まって、飼料及び排泄物のリン含有量を減らすことのできることは、既に生体内の実験で発表されている。
【０００８】
微生物由来のフィターゼの活性については多くの論文がある。細菌由来のフィターゼ［グリーヴス（Ｇｒｅａｖｅｓ）他、１９６７； アーヴィング及びコスグルーヴ（Ｉｒｖｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｓｇｒｏｖｅ）， １９７１； ポワール及びジャガネーザン（Ｐｏｗａｒ ａｎｄ Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ）， １９８２］及びイースト由来のフィターゼ［ナイーニ及びマルカキス（Ｎａｙｉｎｉ ａｎｄ Ｍａｒｋａｋｉｓ）， １９８４］に続いて、主にカビ類特にアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株にフィターゼの存在することが知られている［シエ及びウェア（Ｓｈｉｅｈ ａｎｄ Ｗａｒｅ）， １９６８； 山本他、 １９７２；ユーセフ（Ｙｏｕｓｓｅｆ）他、１９８７］。これらの株のほとんどと、その他の微生物は、酸性ホスファターゼも産生する。いくつかの酸性ホスファターゼは、フィターゼと呼ばれることもあったが、それらは、フィチンに対してむしろ非特異的であって、フィチンに対する加水分解活性は、他の有機リン酸に対する加水分解活性に比べて低い。
【０００９】
発酵条件によって、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）ＮＲＲＬ ３１３５ の野生株は、細胞外ホスファターゼとフィターゼの混合物を産生する。フィターゼと酸性ホスファターゼの合成は、既知の先行技術に従って、リンの濃度により調節することができる［シエ（Ｓｈｉｅｈ）他、１９６９； ウラー及びクミンズ（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｓ），１９８７］。最近公開された特許出願公報には、遺伝子工学で作製したアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）Ｎ１ＲＲＬ ３１３５ 株 と アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）株を使い、フィターゼを大量に生産する方法が開示されている（ＥＰ 特許願第０，４２０，３５８号 Ａ１）。この公報には、酸性ホスファターゼのクローニングに関しても述べられている。
【００１０】
培養されたアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ から産生されたフィターゼを含む培養液を精製すると［ウラー及びギブソン（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ），１９８７］フィターゼは明らかに２つの最適 ｐＨ 値を示す。最も活性が高いのは、ｐＨ ５．０ − ５．５ の範囲で、２番目に高い活性（ｐＨ ５．０ における活性の ６０ ％）は、ｐＨ ２．２ において観察される。
【００１１】
ウラーとクミンズ（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｓ，１９８７）は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来の、最適 ｐＨ 値が２．５ の酸性ホスファターゼ［オルトホスフォリック モノエステル ホスホヒドロラーゼ（ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｅ．Ｃ． ３．１．３．２．）］を精製した。この酸性ホスファターゼは、ｐＨ ４．５ では ｐＨ ２．５ の時の ６５ ％ の活性を示し、ｐＨ ６．０ では実質的に不活性である。ウラーとクミンズ（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｓ， １９８８）はこの他にも、最適 ｐＨ 値が６．０ の酸性ホスファターゼを精製している。
【００１２】
これら２種の酸性ホスファターゼのどちらも、種々の有機リン酸モノエステルに対し広い基質選択性を示が、フィチン酸を基質として結合することはできない［ウラー及びクミンズ（Ｕｌｌａｈ ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｓ），１９８８］。それに対し、アーヴィングとコスグローヴ（Ｉｒｖｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，１９７４）は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）の酸性ホスファターゼが ｐＨ ２．２ でフィチン酸に対し副次的活性（１６ ％）を持つと報告している。
【００１３】
ザイラ（Ｚｙｌａ， １９９３）は最近の文献の中で、酸性ホスファターゼが、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）から精製したフィターゼの存在下、種々の ｐＨ 値において、飼料原材料に対して活性を示すと述べている。
【００１４】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ が産生するフィターゼと酸性ホスファターゼは、基質選択性や最適 ｐＨ 値において互いに異なっているが、最適温度でも異なっている。フィターゼは ５８ｏＣ で最高の活性を示すが、６８ｏＣ で全活性を失う。一方、最適 ｐＨ ２．５ の酸性ホスファターゼは、６３ｏＣ で最高の活性を示し、７０ｏＣ でもなお ８８ ％ の活性を維持する。
最適 ｐＨ ６．０ の酸性ホスファターゼも ６３ｏＣ で最高活性を示すが、７０ｏＣ ではその ９２ ％ の活性を失う。以上のことから、最適 ｐＨ が ２．５ である酸性ホスファターゼが、フィターゼや最適 ｐＨ ６．０ の酸性ホスファターゼよりも高い温度範囲で活性を示すことがわかる。
【００１５】
アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）の老廃菌糸体から得られる未精製の細胞内酸性ホスファターゼは、最適 ｐＨ が １．８ から ２．６ の範囲であり、６０ｏＣで最高活性を示す。又、ｐＨ ４．５ においても最高活性の ８５ ％ の活性を示す［ザイラ（Ｚｙｌａ）他、１９８９］。
【００１６】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼは、フィチン量や糞中のリン排出量を減少させる必要性及び家畜の成育や飼料転換などの家畜の品質改善の目的に従って、家畜のブタとブロイラーの飼料に加えられている。フィターゼの活性／飼料 ｋｇ は、ブタとブロイラー用の飼料で ５００ から １０００ ユニット（ｐＨ ５）が適当であると報告されている［シモンズ（Ｓｉｍｏｎｓ）他、１９９０］。ここで ５００ ユニット／飼料 ｋｇ とは、リン ０．８ｇ／ブタ用飼料 ｋｇ または、リン １．０ｇ／ニワトリ用飼料 ｋｇ に相当する［ボルグリーヴ（Ｂｏｒｇｇｒｅｖｅ），１９９１；ヴァール（Ｖａｈｌ），１９９１］。ブタ飼料には、フィターゼは ６００ ユニット／飼料 ｋｇ まで加えられるが、それ以上の量を加えると逆に効果が下がるので、推められない［ナチュフォス マニュアル（Ｎａｔｕｐｈｏｓ ｍａｎｕａｌ）、ジスト−ブロケイズ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）］。
【００１７】
植物性原材料としての小麦ふすまと大豆に含まれるフィチンを、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の未精製の細胞内酸性ホスファターゼによるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での加水分解は、小麦ふすま及び大豆へ １２，０００ ユニット（Ｕ）／飼料 ｋｇ と ３０，０００ Ｕ ／飼料 ｋｇ をそれぞれ添加して ４０℃、ｐＨ ４．５ の条件でインキュベーション処理すると、２ 時間後に完了する。一方、ブロイラー用飼料を使うと、同条件下で ４ 時間後に加水分解が完了する。この結果は、酸性ホスファターゼがフィチンの分解に関しては効率の悪いことを示している［ザイラ（Ｚｙｌａ）他、１９８９］。
【００１８】
ザイラとコレレスキ（Ｚｙｌａ ａｎｄ ｋｏｒｅｌｅｓｋｉ， １９９３）は、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼに酸性ホスファターゼを付加してイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でセイヨウアブラナ種子や大豆を分解する場合、その分解活性はインキュベーションの ｐＨ 条件に影響されることを示した。このインキュベーション実験は、酸性ホスファターゼ／フィターゼ比が比較的高い条件で行われている（フィチン酸加水分解活性量の比で表すと ３．５／１ から ６２／１）。
【００１９】
ザイラ（Ｚｙｌａ， １９９３）は、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼのフィチンに対する脱リン酸作用は、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼの作用とは異なっており、結果として、２つの酵素の間に相加的作用がある（よって、分解に要する時間が短縮される）ことを示した。フィチン酸から完全にリン酸を脱離するのにかかる時間は、用いるフィターゼの精製度が高いほど（つまり、酸性ホスファターゼ／フィターゼ比が低いほど）長くなる。しかしながら、精製度が最も高いフィターゼであっても、酸性ホスファターゼ／フィターゼ比は依然として高い（３．５／１）。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、フィターゼ製剤を用いるフィチン又はフィチン酸の加水分解を高い効率で行なうための酵素組成物を開発すべく鋭意研究を行なった。その結果、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）とイン ヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、植物性原材料に含まれるフィチン加水分解に際し、真菌類由来の酸性ホスファターゼとフィターゼとよりなる酵素組成物において、酸性ホスファターゼ及びフィターゼが、酵素組成物の ｐＨ 値 ２．５ 及び ｐＨ 値 ５ におけるフィチン酸加水分解活性の比と定義される ｐＨ ２．５／５．０ 活性比が ０．８／１．０〜３／１ という低い範囲にある場合に、意外にもフィチン酸加水分解に対して相乗作用があるということを知見した。本発明は、この知見に基いてなされたものである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明によれば、フィチン酸加水分解活性を有する酸素組成物にして、２．５〜５．０ の ｐＨ 領域にてフィチン酸加水分解活性を持つフィターゼ及び ２．５ の ｐＨ 値でフィチン酸加水分解活性を持つ酸性ホスファターゼを含み、上記フィターゼ及び酸性ホスファターゼは、酵素組成物の ｐＨ 値 ２．５ 及び ｐＨ 値 ５ におけるフィチン酸加水分解活性の比と定義される ｐＨ ２．５／５．０ 活性比がフィチン酸加水分解に対して相乗作用を有するところの ０．８／１．０〜３／１ の範囲になるような量比で含有されてなることを特徴とする酵素組成物が提供される。
【００２２】
本発明の酵素組成物において、フィターゼ及び酸性ホスファターゼは、酵素組成物の上記のように定義した ｐＨ ２．５／５．０ 活性比が、好ましくは １／１〜２．５／１、さらに好ましくは １．５／１〜２／１ の範囲になるような量比で含有される。
【００２３】
本発明の酵素組成物のフィターゼは好ましくは真菌類由来のフィターゼ、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 属由来のフィターゼ、更に好ましくは、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス テレウス（Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ） 由来のフィターゼよりなる群から選ばれる真菌類フィターゼである。
【００２４】
本発明の酵素組成物の酸性ホスファターゼは、好ましくは真菌類由来の酸性ホスファターゼ、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 属由来の酸性ホスファターゼ、更に好ましくはアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス テレウス（Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ）由来の酸性ホスファターゼよりなる群から選ばれる真菌類酸性ホスファターゼである。更に、酸性ホスファターゼは熱安定性を有し、特にフィターゼよりも高い熱安定性を有することが望まれる。
【００２５】
本発明の酵素組成物は、特に、熱処理によって更に好ましい組成比を示すようになる。つまり、熱処理後、酵素組成物中の酸性ホスファターゼ／フィターゼ比が ｐＨ ２．５／５．０ 活性比で ０．８／１．０ 〜 ３／１ の範囲内で上昇するために、２つの酵素間の相乗効果も高まるということである。
【００２６】
更に本発明によれば、上述の酵素組成物を含有する食品、飼料又はかいば製品及びそれらのための成分材料を提供される。それらの中には、上述の酵素組成物を含有する、熱処理された食品、飼料又はかいば製品、或いはそれらのための成分材料が包含される。
【００２７】
また更に本発明によれば、上で定義される酵素組成物により、酵素組成物に含まれるフィターゼと酸性ホスファターゼがフィチン酸の加水分解活性を持つ ｐＨ 条件下で、フィチン酸を含有する原材料を処理する工程を含む、フィチン酸の加水分解方法が提供される。
この処理は好ましくは ｐＨ 約 ２ から ６ の間で、より好ましくは ｐＨ 約 ２．５ で行なうことが望ましい。
また、この工程で処理されるフィチン酸を含む飼料用原材料は、好ましくは植物性原材料であり、より好ましくは、大豆や小麦材料である。
【００２８】
更に本発明によれば、真菌類由来のフィターゼをコードする遺伝子と真菌類由来の酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を含有し、両遺伝子は転写及び翻訳をコントロールする配列に効果的に連結され、両遺伝子によりコードされている酵素が発現するように構成された遺伝子的に改変された植物、もしくはそれに由来する部分又は産生物が提供される。
【００２９】
また本発明によれば、家畜を、上述の酵素組成物を含む飼料又はかいばで飼養することを含む、家畜飼養における飼料又はかいばの消化を向上させ、且つ家畜の堆肥に含まれるリン排出量を減らす方法が提供される。
【００３０】
本発明は、適切な比率での酸性ホスファターゼとフィターゼとの混合物を用いると、その両酵素の相乗作用により、植物性フィチンの酵素分解が改善されることを開示する。
【００３１】
自然界では、多くの植物の種子や穀類の中で、フィチンはリンとイノシトール両方の主要な貯蔵形態の役割を果たしている。発芽・成長の際に、リンはこれらの種子や穀類の中に存在するフィターゼの働きにより、フィチンから離脱される。
【００３２】
これらの植物性原材料は食品や飼料産業で使われるので、フィチンは人間や家畜にとって潜在的なリン源である。ところが、単胃動物にとっては、このフィチンの生体内での取込性は限られている。何故ならば、植物由来のフィターゼは、胃酸により胃腸内で不活化し、よって生体内での効果が低下するからである。そのため、フィチン性リンの生体内利用能を高め、それにより必須食品ミネラルの生体内での取込・吸収性を高めるために次の方法の開発が考えられる：
ａ．酵素による植物性原材料の前処理により、植物性原材料中の消化可能なリンを増やす方法；
ｂ．酵素によって飼料や食品を前処理する方法；及び
ｃ．生体内におけるフィターゼ作用。
しかし、植物由来のフィターゼは、植物性材料及び飼料、食品の前処理（中性の ｐＨ 値）では重要な役割を果たすが、生体内での作用（胃内での ｐＨ 値は２）では、その利用価値は低下する。
【００３３】
生体内でのフィチンの加水分解は、微生物由来、特に真菌類由来のフィターゼによってより効果的になされる。何故ならば、真菌類由来のフィターゼは、胃内の酸性 ｐＨ 条件下で高い活性を示し、また ｐＨ 安定性が高いためである。フィチンを加水分解する酵素は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ） 属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ） 属、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）属等の真菌類によって産生される。これらの真菌類は酸性ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２）とフィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８）の混合物を産生する。この両酵素は、どちらもフィチンを加水分解するが、フィチン酸やリン酸モノエステルに対して、異なった特異性を示す。しかし、これらの生物は低レベルにしか酵素を産生しない。これらの酵素の産生量が、上述の方法を経済的なものにするために最も重要であるため、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）ＮＲＲＬ ３１３５ 株が高産生の株として選ばれた。産生量は低下するが、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス テレウス（Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ）も代用できる。
【００３４】
真菌類由来の酸性ホスファターゼもフィターゼも、それぞれ精製されて溶解しているフィチンを加水分解することはできる。しかし、酸性ホスファターゼは、植物性材料や、飼料、食品に含まれるフィチンに対しては、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でもイン ヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でもほとんど活性を示さない。そのため、酸性ホスファターゼは最近までフィチン加水分解酵素とは考えられていなかった。ところが、単独ではフィチン加水分解活性が低い酸性ホスファターゼであるが、酸性ホスファターゼをフィターゼに対しある一定の活性単位量比で加えると、両酵素間の相乗作用により、フィターゼのフィチン加水分解活性が向上する。この相乗作用は、フィターゼと酸性ホスファターゼを適切な比で混合し、かつ両酵素の濃度が低いときにあらわれる。
【００３５】
飼料及び食品生産工程では、フィチン加水分解酵素の ｐＨ 安定性の他に熱安定性が重要な要因となる。現在一般に行なわれている複合飼料の生産では、ぺレット状の飼料を生産することが多いので、ぺレット化する前の飼料に添加される酵素は、その後のフィチンの加水分解を確実なものにするために、飼料製粉機の中での高温（７５−８０ｏＣ）に耐えられなければならない。アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼは、その温度では部分的に変性するので、３０ ％ 増の量を加えておく必要がある。一方、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼは、フィターゼよりも高温で安定しており、変性も少ない。それ故、酸性ホスファターゼとフィターゼの混合物は、ぺレット状飼料の生産工程において、フィターゼのみよりも、より安定した活性を示す。
【００３６】
フィターゼそのものよりも酸性ホスファターゼとフィターゼの混合物を使う方が植物性フィチンの加水分解が改善されるのは、この酵素組成物の熱安定性が高いからだけではない。その主な理由は、両酵素の熱による変性度が異なるので、ｐＨ 値が ２．５ 及び ｐＨ 値 ５．０ におけるフィチン分解活性の比 （ｐＨ ２．５／５．０ 活性比） が高くなり、両酵素間の相乗的な相互作用が改善されるためである。
【００３７】
真菌類のアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）もしくはアスペルギルスニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２）と、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８）は、どちらもフィチン酸ドデカナトリウム（ｄｏｄｅｃａｓｏｄｉｕｍ ｐｈｙｔａｔｅ）を溶液中で加水分解できるが、両酵素の主要活性は互いに異なっている。フィターゼは主に、フィチン酸に働き（１）、副次的にモノリン酸エステルに働く（２）。酸性ホスファターゼは主にモノリン酸エステルに働き、副次的にフィチン酸に働く（実施例１参照）。フィチン酸に対する活性（１）の、β−グリセロールリン酸ジナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ−β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に対する活性（２）に対する比［（１）／（２）］は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼの場合、６．６ であり、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼの場合 ０．１３ である。この数値は、フィターゼのフィチン酸に対する高い特異性を示している。アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼの場合（１）／（２）は ０．１７ である。これ以下、「酸性ホスファターゼの活性」とはフィチン酸に対する加水分解活性を意味する。酸性ホスファターゼの最適 ｐＨ は ２．３ であり、一方フィターゼの最適 ｐＨ は ５．０ であり、２番目の最適値は ２．５ である。両酵素の混合物は、これから、ｐＨ 値 ２．５ における混合物のフィチン酸加水分解活性（ａ）と ｐＨ 値 ５ における混合物の活性（ｐ）の比（ａ／ｐ）によって識別する。純粋のフィターゼのみの時の ａ／ｐ 比はおよそ ０．６／１ であり、また純粋の酸性ホスファターゼのみの時の ａ／ｐ 比は １／０ である。
【００３８】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 株、及びアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）株由来のフィターゼと酸性ホスファターゼの混合溶液は、既知の方法によって得ることができる。
フィターゼ溶液中の活性要素を同定するために、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において標準的ブタ用飼料を用いて低湿度（７０ ％）、ｐＨ ２．５、４０ｏＣで３時間のテストを行なった（添付図参照）。
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 株由来の異なる ａ／ｐ 比を持つフィターゼ製剤を数種用意し、フィターゼに対する ｐＨ ２．５ における活性単位量（Ｕａ）又は ｐＨ ５ における活性単位量（Ｕｐ）に基づいて決められる量を、それぞれ、ブタ用飼料に添加した。
ｐＨ ２．５ でフィチン酸は実際に分解され（図１参照）、酸性ホスファターゼは液体に溶解しているフィチン酸ナトリウムは加水分解することができたが、フィターゼ製剤の ｐＨ ２．５ における活性と、フィチン酸の加水分解活性との間には直接の相関はみられなかった。一方、フィターゼ製剤の ｐＨ ５ における活性と、フィチン酸に対する加水分解活性との間は相関があり、特にフィターゼ製剤を、ａ／ｐ 比が １．５／１ 未満であるフィターゼ製剤と ａ／ｐ 比が １．５／１ 〜 ３／１ の間にあるフィターゼ製剤とに分類すると、上記の相関が明らかであった（図２参照）。
【００３９】
以上から、飼料中のフィチン酸に対する酸性ホスファターゼの活性は支配的ではないということが結論づけられる。しかしながら、多種の異なったフィターゼ製剤の間では、ｐＨ ５．０ における活性量が同じになるようにしてそれらを添加しても、フィチンに対する加水分解活性に差がみられた。この差は、フィターゼ溶液中の酸性ホスファターゼの異なる活性に対応するものであることがわかった（実施例２参照）。ａ／ｐ 比が ０．６／１ から ３／１ に高くなる、すなわち酸性ホスファターゼの割合が高くなると、ブタ用飼料のフィチンの加水分解に好ましい影響を与え、該フィターゼ混合物のフィチン加水分解効率（ｐＨ 値 ５．０における活性単位量で示した添加量、例えば ５００ 単位、のフィターゼ製剤によって脱離したフィチン性リン量“ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ”）が向上した（図３参照）。
【００４０】
ａ／ｐ 比が ０．６／１ より高い値をとるフィターゼ製剤中での、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）の重要性は、ａ／ｐ 比がそれぞれ ０．６／１ と １／１ である２種のフィターゼ製剤に、酸性ホスファターゼを ａ／ｐ 比で ２／１ まで加えて用いる場合と、酸性ホスファターゼを加えない場合との両者について、ブタ用飼料のフィチンをイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で加水分解することにより証明された（実施例３参照）。さらに、フィターゼと酸性ホスファターゼ間の相乗作用が見られた。同じ Ｕｐ 活性をもつフィターゼ（０．６／１）に酸性ホスファターゼ（１／０）を加えて ａ／ｐ 比を ２／１ にして、ブタ用飼料に添加すると、フィターゼ効率は ０．５５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ から １．２５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ に増加し、０．４９ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ の相乗作用がみられた。ブタ用飼料に対する、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼと、酸性ホスファターゼとの間の相乗作用は ａ／ｐ 比が １．５／１ から ２／１ の時に最高であり、ａ／ｐ 比が ３／１ へと高くなると相乗作用が減少することが示された。３／１ を超えると、相乗作用の上昇は見られなくなった（図３参照）。
【００４１】
飼料は、その組成に各々違いがあり、フィターゼの作用及びフィターゼと酸性ホスファターゼ間の相乗作用に影響を及ぼすことが考えられる。子ブタ用、家禽用のそれぞれ異なる飼料、例えば小ブタ用、雌ブタ用、雄ブタ用、ブロイラー用、産卵鶏用の飼料を、ａ／ｐ 比 １．６／１，０．６／１ のフィターゼ製剤、及びフィターゼ（０．６／１）と酸性ホスファターゼ（１／０）を ａ／ｐ 比 ２／１ になる様にした混合物を用いて、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でインキュベートした。
ホスファターゼと酸性ホスファターゼのフィチン分解効率は飼料の種類によってすべて大きく違う（０．６／１ のフィターゼは０．２５ から １．５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ、酸性ホスファターゼは ０．０２５ から ０．１５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）。これらの事実は、異なった植物性材料の中では、フィチンの存在が異なっており、それが酵素による加水分解にも影響を与えることを示している。
【００４２】
標準的ブタ用飼料において見られたアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼによるフィターゼとの相乗作用は、他の種類の飼料でも見られるが、異なる飼料間で大きな差がある（０．２５ → ０．９４ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）。
フィチンを含む植物性材料の違いが、フィターゼと酸性ホスファターゼの間の相乗作用に与える上記の影響については、エンドウマメ、小麦ふすま、大豆、米ぬか等の、頻繁に家畜用複合飼料に使われる異なる植物性材料を、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ） でフィチン加水分解して検証を行った（実施例５参照）。その際、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（０．６／１）にアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）を、ａ／ｐ 比が ２／１ になるように混合して用いた。
【００４３】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼ（ａ／ｐ 比 ０．６／１ と２／１）は、酸性ホスファターゼ（ａ／ｐ 比 １／０）と同様、その加水分解効率に非常にばらつきがあった。酸性ホスファターゼは、標準的ブタ用飼料に対しては低い効果しか示さないが（０．１５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）、ある種の植物性フィチン、例えば米ぬかに含まれるフィチンはこの酸性ホスファターゼにより容易に加水分解される（０．８ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）。ところが他の植物性フィチン、例えば小麦ふすまや粉状の大豆のフィチンはほとんど分解されない（０．２ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）。
【００４４】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼと酸性ホスファターゼの、飼料に使った際に見られる相乗作用は、酸性ホスファターゼが単独では加水分解効率が低い（０．２ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）植物性材料においてのみに見られる。例えば粉状大豆における相乗作用は ０．５７ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ であり、小麦ふすまでの相乗作用は ０．４７ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ である。
フィチンが酸性ホスファターゼ自身によってすでに加水分解される場合には、フィターゼと酸性ホスファターゼ間の相乗作用は低い。米ぬかにおいて見られる相乗作用は、 ０．１３ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ である。エンドウマメのフィチンはどちらの酵素によってもほとんど加水分解はできず、よって両酵素の相乗作用も見られなかった。
【００４５】
結局、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）の酸性ホスファターゼ（１／０）とフィターゼ（０．６／１）の飼料中での相互作用は、通常の相加的効果と、それに加えて、飼料を構成しているそれぞれの異なる植物性材料によって程度の異なる相乗効果の結果であると説明できる。
【００４６】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ の他にも、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）株によってフィターゼ及び酸性ホスファターゼが産生される。アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）と同様、アスペルギルスニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）も、細胞外フィターゼと酸性ホスファターゼの混合物を産生する。アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファタ−ゼ（ａ／ｐ 比 １／０）は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のものと ｐＨ 活性について同じ特性をもち、最適 ｐＨ は ２．３ である。後述の実施例により、異種の真菌に由来する、フィターゼと酸性ホスファターゼ間にも相乗作用がおこることが証明されている。
【００４７】
標準的ブタ用飼料を使ったアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼ製剤によるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィチン加水分解は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来のフィターゼ製剤によるフィターゼ加水分解と同様であった（実施例６参照）。アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼの加水分解効率は、フィターゼ製剤の ａ／ｐ 比が ０．９／１
から １．６／１ に高まるにつれて ０．７５ から １．１５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐに上昇した。
アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来の酸性ホスファターゼを、ａ／ｐ 比が １．１５／１ であるアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来フィターゼ製剤と混合して得られる、それぞれ ａ／ｐ 比が １．９／１ と １．６／１ である組成物は、これらの酵素間で相乗作用があることを示した（実施例７参照）。
【００４８】
これら２種類の酸性ホスファターゼの加水分解効率は類似している。ａ／ｐ 比が １．１５／１ のアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼ製剤に、酸性ホスファターゼを加えると、飼料中の残存フィチン性リン量が０となり、基質であるフィチン酸が無くなるために、酵素活性や酵素間相乗作用について正確な計測はできなかった。
【００４９】
酵素間相乗作用は、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼとアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来のフィターゼの間にも見られた。アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の ａ／ｐ比 ０．６／１ フィターゼに、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の ａ／ｐ 比 １／０ の酸性ホスファターゼを加えて ａ／ｐ 比を １．９／１ にすると、加水分解効率は２倍になり（０．８５ から １．８ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）、０．６２ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ の相乗効果を示す（実施例８参照）。
【００５０】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来の ａ／ｐ 比 １／０ の酸性ホスファターゼは、液状で且つ飼料のペレット化中に高い熱安定性を示して有利であり、そのためフィターゼ（０．６／１）と酸性ホスファターゼ（１／０）の相乗作用は、ペレット化飼料においてより大きくなる。
液状フィターゼ（０．６／１）は、８０ｏＣ、ｐＨ ５（０．５ Ｍ アセテートバッファー）で１分間インキュベートすると、ｐＨ ２．５ と ｐＨ ５ 両方での活性において、６０ ％ の変性が起きている。一方、酸性ホスファターゼ（１／０）は同条件下でのインキュベート後も、１０ ％ しか失活していない。
【００５１】
飼料粉砕条件下での熱安定性について模擬実施を行なった。ガラスびんに標準的ブタ用飼料を満たし、次いで液状のフィターゼ（０．６／１）または酸性ホスファターゼ（１／０）製剤を加える。この混合物の湿度は １２．２ ％ であった。ガラスびんは密閉し、それぞれウオーターバスにて異なった温度条件（６０−９０ｏＣ）のもとで、加熱した（実施例９参照）。
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）の酸性ホスファターゼ（１／０）の活性（ｐｈ ２．５ における）は、７０ｏＣ で １０ 分間加熱した後も１００ ％の活性を示した。一方、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼ（０．６／１）は、同条件で ４０ ％ の失活を示した（ｐＨ ２．５ における）。８０ｏＣの条件下では、酸性ホスファターゼの活性は ６５ ％ に、フィターゼの活性は ３５ ％ に減少した。
【００５２】
すでに液体中及び飼料の中では示された、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）の酸性ホスファターゼ（１／０）の高い熱安定性は、更にパイロット及び工業用粉砕機においても確認された。
ブタ用飼料にアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼ（０．６／１）または酸性ホスファターゼ（１／０）溶液を加えたものを（３０００ Ｕａ／飼料 ｋｇ）パイロットの規模でペレット化した（実施例１０参照）。ペレットの温度は、粉飼調整機の中に水蒸気を送り込んで調節した。
その結果、フィターゼ（０．６／１）は ６８．６〜７２．１ｏＣ ペレット化温度範囲で平均 ５５ ％ の失活したのに対し、酸性ホスファターゼ（１／０）は ７１．６〜７３．１ｏＣ の温度範囲で ２５ ％ 失活したにすぎない（ｐＨ ２．５ における活性で）。
【００５３】
工業的ペレット化実験を、乾燥フィターゼ製剤を用いて行なった。ａ／ｐ 比 ０．６／１ フィターゼまたは １．２５／１ のフィターゼ混合物を加えた標準ブタ用飼料（９００ Ｕｐ／飼料 ｋｇ）を、工業用飼料粉砕・ペレット成形機に通した（実施例１１参照）。粉飼中の、１．２５／１ フィターゼ混合物の酵素活性は、ペレット成形する前は ０．６／１ フィターゼの活性の １６０ ％ であった（０．９５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ／０．６ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）。ペレット成形した後は、約 ７５ ｏＣ のペレット温度でフィターゼ混合物（１．２５／１）の酵素活性は、フィターゼ（０．６／１）活性の １９０ ％ であった（０．７５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ／０．４ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）。この活性の差は、フィターゼ混合製剤（１．２５／１）に存在する酸性ホスファターゼ（１／０）の高い熱安定性と、２つの酵素の相乗作用効果との組合せによって生まれたと考えられる。例えば、フィターゼ混合製剤（１．２５／１のフィターゼ酵素（０．６／１）の失活（３３ ％）は、ペレット飼料中における酵素組成物の ａ／ｐ 比が １．９／１ （＝１．２５／０．６６）に高まることによって補償されている。
【００５４】
イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィチン加水分解でみられた、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ） ＮＲＲＬ ３１３５ 由来のフィターゼ（０．６／１）と酸性ホスファターゼ（１／０）の相乗作用及び、酸性ホスファターゼの高い熱安定性は、ペレット化飼料内フィチンの生体内加水分解においても好ましく働くと思われる。
【００５５】
アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）をアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（０．６／１）に加えることの効果を確かめるため、イン ヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の消化試験をブタを使って行なった（実施例１２及び１３参照）。生体内のフィターゼや酸性ホスファターゼの作用は、酵素作用によるフィチン加水分解に由来するところの、糞便検定から得られる消化性リン（ｄＰ）によって測定する。このような生体内消化性リン ｄＰ は、摂取リン全量−排出リン全量の計算式によって算出される。生体内におけるフィターゼや酸性ホスファターゼの作用による ｄＰ 量の増加は、このようにして求められるイン ヴィヴォ消化性リン ｄＰ と飼料調製中の工程で定まる飼料が生体内投与前に有している ｄＰ との差によって算出できる。
【００５６】
ブタを使った試験Ｉ（実施例１２参照）では、フィターゼ（０．６／１）を ７５０ Ｕｐ／飼料 ｋｇ 加えることにより、ｄＰ 値は ０．７８ ｇ／飼料 ｋｇ増加した。フィターゼに酸性ホスファターゼ（１／０）を １０５０ Ｕａ／飼料 ｋｇ 加え、ａ／ｐ 比を ２／１ にまで上げると、ｄＰ 値は ０．８９ ｇ／飼料 ｋｇ 増加し、相乗作用は０．０５５ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ であった。酸性ホスファターゼが単独で飼料に加えられた場合（１０５０ Ｕａ／飼料 ｋｇ）、飼料中 ｄＰ 値には全く影響がなかった。また ｄＰ 値は試験の後も変化はなかった。 この試験中のフィターゼによる加水分解効率は、高濃度で使われたために低かった（０．５２ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ）。フィターゼに酸性ホスファターゼを加えることにより、全体の加水分解効率は ０．５２ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ から ０．５９ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ へと １３ ％ 増加した。
【００５７】
フィターゼ及びフィターゼ／酸性ホスファターゼの混合物の両方の、ｄＰ 値により示される生体内での相乗作用は、リン排出量が酸性ホスファターゼの添加により減少するという事実にも反映されている。フィターゼ（７５０ Ｕｐ／飼料 ｋｇ）の添加により、リン排出量は統制飼料に比べて ３７ ％ 減少する一方、フィターゼ／酸性ホスファターゼ混合物の添加により、リン排出量は ４１ ％ 減少する。リン排出量のこのような減少（１１ ％）は、リン排出に関する法律による経費の縮小に役立つ。
【００５８】
ブタを使った試験ＩＩ（実施例１３参照）では、０．６／１ フィターゼが適量と認められるレベルである ４００ Ｕｐ／飼料 ｋｇ、ブタ飼料に加えられた。フィターゼの添加により ｄＰ 値は ０．５８ ｇ／飼料 ｋｇ 増加し、フィターゼに １／０ 酸性ホスファターゼを ａ／ｐ 比 ２／１ まで加えると（５８０ Ｕａ／飼料 ｋｇ）、ｄＰ 値は ０．７２ ｇ／飼料 ｋｇ増加した。
フィターゼの濃度を下げると、その活性は ０．７２５ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ にまで増加した。
酸性ホスファターゼを添加すると、混合物による全体の加水分解効率は ２４ ％ 増加し、０．９ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ を示し、相乗作用は０．１２５ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐであった。
生体内におけるアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼと酸性ホスファターゼの相乗作用は、フィターゼ及び酸性ホスファターゼの濃度が低いほどより顕著であることが、試験Ｉ，ＩＩの両方から結論できる（実施例１４参照）。フィターゼ＋酸性ホスファターゼの混合物の添加量が、７５０ Ｕｐ＋１０５０ Ｕａ／ｋｇ から４００ Ｕｐ ＋５８０ Ｕａ／ｋｇに減少すると、加水分解効率は０．５９ ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐから０．９ ｇ ｄｐ／５００ Ｕｐ に高まった。
【００５９】
次に、添付の図１〜３について更に説明する。
図１〜３を作成するための実験は次のようにして行った。
フィチン性リンを ０．３３ ％ の割合で含有する標準的ブタ用飼料を用いて、ａ／ｐ 比が １／０ から １６／１ の範囲で異なる種々のアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ製剤により、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で植物性フィチンを加水分解した。ブタ用飼料の平均的構成成分は、エンドウマメ、タピオカ、グルテン状トウモロコシ飼料、グルテン状小麦飼料及び成分濃縮大豆である。
フィターゼ製剤は活性単位量を変えて添加された。
１．０ − ２．５ Ｕａ （ｐＨ ２．５ 活性）／飼料 ｇ （図１）
２．０ − ２．８ Ｕｐ （ｐＨ ５ 活性）／飼料 ｇ （図２）
飼料に含まれるフィチン性リン全量は、エリス及びモリス（Ｅｌｌｉｓ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ， １９８３， １９８６）の方法に従って測定した。２ ｇ の飼料に適当に希釈されたフィターゼ製剤を加えた。０．２Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン−塩化水素バッファーを加え、混合物の湿度を ７０ ％ に調整した。混合物を ４０ｏＣ で３時間インキュベートした。その後、飼料は ４０ ｍｌ の ２．４ ％ 塩酸で３時間抽出にかけ、抽出液中の残存フィチン性リンはイオン交換クロマトグラフィー処理及びフィチン破壊処理後に測定した。
フィチン酸に対する ｐＨ ５ におけるフィターゼの １ 活性単位はここでは１ Ｕｐ で示し、フィチン酸に対する ｐＨ ２．５ における酸性ホスファターゼの１活性単位は１ Ｕａ で示す。
【００６０】
図１は、フィターゼの作用後のフィチン性リン残存率を、添加したフィターゼ製剤の ｐＨ ２．５ における活性単位量で表わした添加量との関係により表したものである。飼料に ｐＨ ２．５ における活性が同一のフィターゼを添加した（例えば、 ０．５ 〜 １ Ｕａ／ｇ）が、残存フィチン性リン（９５ 〜 １０ ％）と添加された酵素活性単位量との間に相関は見られなかった。つまり、ｐＨ ２．５ における活性とブタ用飼料におけるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィチン加水分解とは、相関がないという事を示している。
【００６１】
図２は、フィターゼの作用後のフィチン性リン残存率を、添加したフィターゼ製剤の ｐＨ ５ における活性単位量で表わした添加量との関係により表したものである。飼料に ｐＨ ５ における活性が同一のフィターゼを添加すると（例えば、０．４ 〜 ０．５ Ｕｐ／ｇ）、残存フィチン性リンは添加された酵素活性単位量と相関を示した。更にフィターゼ製剤を ａ／ｐ 比が １．５／１ から ３／１ であるものと １．５／１ 未満のものに分けると、ｐＨ ５ にて同じ活性単位量を有する数種の酵素の添加によるフィチン性リン残存率の差が小さくなった。ａ／ｐ 比が １．５／１ 未満のフィターゼ製剤は １．５／１ から ３／１ であるものに比べ、フィチン加水分解の効率が低い。
【００６２】
図３は、１ ｋｇ の飼料に ５００ Ｕｐ のフィターゼを加え ４０ｏＣ で３時間インキュベートした際に遊離されるフィチン性リン量で表わされる、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィチン加水分解効率を示す。ａ／ｐ 比の異なるフィターゼ製剤の示すフィチン加水分解効率（実験値）を、そのフィターゼ製剤を構成するフィターゼ（０．６／１）と酸性ホスファターゼ（１／０）の２つの酵素間の相加効果を実施例３に準じて算出した加水分解効率（計算値）と比較した。両酵素間の相乗効果は、実験値と相加効果（計算値）との差として算出した。相乗効果は ａ／ｐ 比 ２／１ 周辺で最大となった。ａ／ｐ 比が ２／１ より高くなっても相乗効果がさらに増大することはなかった。
【００６３】
【実施例】
実施例１
フィターゼと酸性ホスファターゼの ｐＨ 値 ２．５ での活性は、リン遊離量の測定により分析された。０．５ ｍｌ の適切に希釈した酵素溶液を、０．２ Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン バッファー（Ｓｏｒｅｎｓｅｎｂｕｆｆｅｒ）と １２．５ ｍＭ のフィチン酸ドデカナトリウムもしくは ２５ ｍＭ のβ−グリセロールリン酸ジナトリウム溶液の１対１混合液 ２ ｍｌ に添加した。この反応液を ４０ｏＣ で １０ 分間インキュベートした。反応は １０ ％ トリクロロ酢酸溶液を ２．５ ｍｌ 加えて停止させた。遊離したリンは公式のＥＥＣ法（ｏｆｆｉｃｉａｌ ＥＥＣ ｍｅｔｈｏｄ）に従って、５ ｍｌ のヴァナデイト／モリブデイト（Ｖａｎａｄａｔｅ／ｍｏｌｙｂｄａｔｅ）試薬を加えて分光光度法により測定した。
フィチン酸ドデカナトリウムに対する ｐＨ ５ でのフィターゼ活性は、ｐＨ ２．５ のセーレンセン バッファーの代わりに １Ｍ ｐＨ ５ の酢酸バッファーを使って上記方法と同様に測定した。
フィターゼ活性または酢酸ホスファターゼ活性の１ユニットは、それぞれ ｐＨ ５ または ｐＨ ２．５ おいて、４０ｏＣで１分間に１μｍｏｌｅのリンを遊離する酵素の量と定義する。
ｐＨ ２．５ における（１）フィチン酸に対する酵素活性と（２）β−グリセロールリン酸ジナトリウムに対する酵素活性の比、（１）／（２）は、両酵素の基質特異性を示している。フィターゼ及び酸性ホスファターゼの（１）、（２）及び（１）／（２）の測定値を表１に示す。ａ／ｐ 比が ０．６／１ のフィターゼはフィチン酸に対して最も高い活性を示し、酸性ホスファターゼはβ−グリセロールリン酸ジナトリウムに対して最高活性を示す。
【００６４】
【表１】
実施例２
フィチン性リンを ０．３３ ％ の割合で含有する標準的ブタ用飼料を用いて、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の種々のフィターゼ製剤によりインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でフィチンを加水分解した。ブタ用飼料の平均的構成成分は、エンドウマメ、タピオカ、グルテン状トウモロコシ飼料、グルテン状小麦飼料及び抽出大豆（ｓｏｙａ ｂｅａｎｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）である。飼料に含まれるフィチン性リン全量は、エリス及びモリス（Ｅｌｌｉｓ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ， １９８３， １９８６）の方法に従って測定した。２ ｇ の飼料に １．４ Ｕｐ の液状フィターゼ製剤を加えた。０．２Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン−塩化水素バッファー（Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ）を加え、混合物の湿度は ７０ ％ に調整した。混合物を ４０ｏＣ で３時間インキュベートした。その後、飼料は ４０ ｍｌ の ２．４ ％ 塩化水素で３時間抽出にかけ、抽出液中の未分解フィチン性リンを、イオン交換クロマトグラフィー処理及びフィチン破壊処理後に測定した。フィチン加水分解効率はフィターゼによる処理前と処理後の飼料に含まれるフィチン含有量の差によって算出した。イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のフィターゼの効率は、５００ Ｕｐ／飼料 ｋｇ のフィターゼによる ４０ｏＣ で３時間の反応によって遊離されるフィチン性リン量（ｇ ｐｐ）から算出した。
フィターゼ製剤の ａ／ｐ 比とフィチン加水分解効率を表２に示す。
フィターゼ製剤の ａ／ｐ が低い（０．６／１ 〜 ２／１）ところで ａ／ｐ 比を上げると、フィターゼ製剤の効率は直線的に上昇した。例えば純粋なフィターゼ（０．６／１）が ０．５５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ の効率を示したのに対し、ａ／ｐ 比が ２／１ のフィターゼ製剤は １．７５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ もの効率を示した。従って、同じ ５００ Ｕｐ のフィターゼ活性をもつフィターゼ製剤を １ ｋｇ のブタ用飼料に加えても、ａ／ｐ 比の違いによってリン遊離量は ０．５５ ｇ から １．７５ ｇ の幅をもって変化する。ａ／ｐ 比が高いところでは効率の上昇（相乗効果）は頭打ちとなる。
【００６６】
【表２】
実施例３
標準的ブタ用飼料（実施例２参照）を使い、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ製剤によるフィチン加水分解を行った。その際、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）を添加して実験を行ない、酸性ホスファターゼ／フィターゼ混合物における酸性ホスファターゼの重要性を証明した。１．４ Ｕｐ の活性単位量を有するフィターゼ（０．６／１）にそれぞれ ２ Ｕａ 又は ３．４ Ｕａ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼを添加して、ａ／ｐ 比を ２／１ 又は ３／１ にした。１．４ Ｕｐ の活性単位量を有する ａ／ｐ 比 １／１ のフィターゼ製剤にそれぞれ １．４ Ｕａ 又は ２．８ Ｕａ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼを添加して、ａ／ｐ 比を ２／１ 又は ３／１ にした。
１．４ Ｕｐ の液状フィターゼ製剤（ａ／ｐ 比はそれぞれ ０．６／１、１／１、２／１ 及び ３／１）を ２ ｇの飼料に添加した。０．２ Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン−塩化水素バッファーを加え、混合物の湿度を ７０ ％ もしくは ８０ ％ に調節した。混合物を ４０ｏＣ で３時間インキュベートした。
酸性ホスファターゼ自身の効率は、２ Ｕａ の活性単位量を ２ ｇ のブタ用飼料に添加し、上記と同様の方法でインキュベートして求めた。
フィチン加水分解効率は実施例２と同様にして算出した。
フィターゼ、酸性ホスファターゼ及びそれらの混合物のフィチン加水分解効率、計算による相加効果及び相乗効果は表３に示す。
フィターゼと酸性ホスファターゼを飼料に添加する前に ａ／ｐ 比 ２／１ 又は ３／１となるよう混合すると、両酵素間の相加効果と相乗効果の両方により、酵素混合物の効率は高まる。
例えば、５００ Ｕｐ のフィターゼ（０．６／１）をブタ用飼料に加えると ０．９５ ｇ のフィチン性リンが遊離する。一方、５００ Ｕａ の酸性ホスファターゼ（１／０）を加えると、０．２５ ｇのフィチン性リンが遊離する。５００ Ｕｐ のフィターゼ（０．６／１）は ３００ Ｕａ の ｐＨ ２．５ 時活性をもつので、ａ／ｐ 比が ２／１ となる酸性ホスファターゼ／フィターゼ混合物を用意するためには、７００ Ｕａ の酸性ホスファターゼ（１／０）が必要である。もし両酵素が単純な相加効果しか有さないのであれば、効率は下記のように計算される。
（５００ Ｕｐ フィターゼ × ０．９５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ）＋（７００ Ｕａ 酸性ホスファターゼ× ０．２５ ｇ ｐｐ／５００ Ｕａ）＝１．３ ｇ ｐｐ （／５００ Ｕｐ フィターゼ）。
しかし、この実験観察された効率は １．３ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ ではなく ２．１ ｇ ｐｐ／５００
Ｕｐ である。従って ０．８ ｇ ｐｐ／５００ Ｕｐ の相乗効果があったことになる。
【００６８】
【表３】
実施例４
種々の標準的飼料（ブタ、子ブタ、雌ブタ、ブロイラー及び産卵鶏用）を使い、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の種々のフィターゼ製剤によるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での加水分解を行ない、一般的に飼料におけるフィターゼと酸性ホスファターゼとの間の相乗作用について検討した。
各種飼料の主要成分は以下の通りであった。
子ブタ：大麦、小麦、抽出大豆、小麦ふすま、乳漿（ｗｈｅｙ）パウダー及び魚の粉餌
雌ブタ：タピオカ、エンドウマメ、抽出ヒマワリ種子（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）、米ぬか及びココナッツの搾油かす
雄ブタ１：タピオカ、エンドウマメ、抽出大豆及びグルテン状小麦飼料
雄ブタ２：タピオカ、エンドウマメ、抽出大豆、グルテン状小麦飼料及びグルテン状トウモロコシ飼料
ブロイラー：モロコシ、抽出大豆、エンドウマメ及び肉餌
産卵鶏：トウモロコシ、大豆、抽出ヒマワリ種子及び石灰石
０．７ Ｕｐ／ｇ の活性単位量を有するフィターゼ（０．６／１）又は、１ Ｕａ／ｇ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼ（１／０）を各飼料に添加した。０．７ Ｕｐ の活性単位量を有するフィターゼ（０．６／１）に １ Ｕａ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼ（１／０）を添加して、ａ／ｐ 比を ２／１ にした。インキュベーション条件は、実施例３（湿度 ８０ ％）と同様にした。相乗効果は、実施例３と同様にして算出した。
フィターゼ及び酸性ホスファターゼのフィチン酸加水分解効率は、ともに、飼料により大きく異なった。両酵素の相乗効果はすべての飼料について見られたが、飼料によって異なっていた。
０．７ Ｕｐ／ｇ の活性単位量を有するフィターゼ製剤（ａ／ｐ 比 １．６／１）を種々の飼料に添加した。このフィターゼ製剤のフィチン酸加水分解効率は、酸性ホスファターゼ／フィターゼ混合物中の酸性ホスファターゼ（１／０）の効果を実証した。
【００７０】
【表４】
実施例５
酵素によるフィチンの加水分解効率は飼料により大きく異なった（実施例４）ので、フィチンの加水分解効率は飼料を構成する植物性材料に影響を受けることが予想できた。
種々の異なる植物性フィチンの加水分解効率及び種々の植物性材料に単独、あるいは混合されて添加されたアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）フィターゼ（０．６／１）及び酸性ホスファターゼ（１／０）のフィチン酸加水分解効率をイン
ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で試験した。
０．３５ 〜 ０．７ Ｕｐ／ｇ 飼料材料の活性単位量を有するフィターゼ（０．６／１）又は、 １ Ｕａ／ｇ 飼料材料の活性単位量を有する酸性ホスファターゼ（１／０）を各飼料材料に添加した。フィターゼ（０．６／１）にそれぞれ ０．５ Ｕａ／ｇ 又は １ Ｕａ／ｇ の活性単位量を有する酸性ホスファターゼを添加して、ａ／ｐ 比を ２／１ にした。インキュベーション条件は、実施例２（湿度 ８０ ％）と同様に行なった。フィチンの加水分解は実施例２と同様に分析され、フィターゼの加水分解効率は実施例２と同様にして算出した。相乗効果は、実施例３と同様にして算出した。
エンドウマメに対するフィターゼの効率はきわめて低く（０．１５ ｇ ＰＰ／５００ Ｕｐ）、酸性ホスファターゼによる相乗効果はなかった。
最大の相乗効果は、フィチンがフィターゼにより容易に加水分解されるが、酸性ホスファターゼによってほとんど加水分解されない植物性材料、例えば大豆及び小麦ふすまにおいて見られた。
酸性ホスファターゼ自身が植物性フィチンをより効率よく加水分解する場合での相乗効果は低かった。
【００７２】
【表５】
実施例６
標準的ブタ用飼料（実施例２）を用いて、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来の異なる ａ／ｐ 比を有する種々のフィターゼ製剤によりイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのフィチン加水分解を行なった。フィターゼは ０．７ 又は １ Ｕｐ／ｇ 飼料の活性単位量相当量を添加した。インキューベーション条件は、実施例２（湿度 ７０ ％）と同様にした。
フィチン加水分解は、実施例２と同様に行ない、フィターゼ効率は実施例２と同様に算出した。
アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の種々のフィターゼ製剤の ａ／ｐ 比が０．８／１〜３／１の様に低い範囲で高まるとともに、これらの製剤のフィチン酸加水分解効率は増加した。すなわち、フィターゼのフィチン酸加水分解効率は、フィターゼの ａ／ｐ 比によって、０．７５ と １．１５ ｇ ＰＰ／５００ Ｕｐ の間で変化する。
【００７４】
【表６】
実施例７
標準的ブタ用飼料（実施例２参照）を使いイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、ａ／ｐ比が １．１５／１ のアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼ製剤にアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼもしくはアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）ＮＲＲＬ ３１３５ 由来の酸性ホスファターゼを添加し、それぞれ ａ／ｐ 比を １．９／１ 及び １．６／１ に増し、加水分解を行なった。
ブタ用飼料にアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼ（１．１５／１）を ０．７ Ｕｐ／飼料 ｇ で加え、０．５ Ｕａ／ｇ のアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼもしくは ０．３ Ｕａ／ｇ アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）ＮＲＲＬ 由来の酸性ホスファターゼを上記フィターゼに添加し、それぞれ ａ／ｐ 比を １．９／１ 及び １．６／１ にした。
上記混合物を湿度を ８０ ％ にした以外は実施例２と同様の条件でインキュベートした。フィターゼの加水分解結果を解析しフィチン加水分解効率を実施例２と同様にして算出した。
ａ／ｐ 比が １．１５／１ のアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のフィターゼとアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス フィキューム 由来の酸性ホスファターゼ（１／０）の間の相加効果及び相乗効果を実施例３と同様にして算出した。
【００７６】
【表７】
実施例８
標準的ブタ用飼料を使い、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼに、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼを添加してフィチン加水分解を行った。フィターゼ（０．６／１）を０．７ Ｕｐ／飼料 ｇ 加え、０．８５ − ０．９ Ｕｐ／飼料 ｇ の酸性酸性ホスファターゼ（１／０）を添加してそれぞれの ａ／ｐ 比が １．８／１ 及び １．９／１ フィターゼ製剤を得た。
酸性ホスファターゼを １ Ｕａ ／飼料 ｇ 加えた。
上記フィターゼ製剤を、湿度 ８０ ％ にした以外は実施例２と同様の条件下でインキュベートした。
フィチン加水分解結果を解析したフィターゼの加水分解を実施例２と同様にして算出した。アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（０．６／１）とアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来の酸性ホスファターゼ（１／０）の両酵素間の相乗効果を実施例３と同様にして算出した。
【００７８】
【表８】
実施例９
標準的ブタ用飼料（実施例２参照）を使い、イン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でアスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ（０．６／１）及び酸性 ホスファターゼの熱安定性について実験を行った。この際、上記フィターゼ及び酸性ホスファターゼを、それぞれガラスびんに密閉し、ウォーターバスに浸漬し、飼料粉砕時の条件と同じ条件を得るようにした。
１７５０ Ｕａ のフィターゼもしくは酸性ホスファターゼを含む ２０ ｇ のブタ用飼料を ４８０ ｇ のブタ用飼料と混合し、３５００ Ｕａ／ｋｇ の飼料を得た。１０．５ Ｕａ のフィターゼもしくは酸性ホスファターゼを含む酵素入り飼料 ７ ｇ を複数のガラスびんに満たした。飼料の湿度は １２．２ ％ であった。ガラスびんを密閉し、それぞれ種々の温度条件（７０〜９０ｏＣ）下でウォーターバスに浸漬し、１０ 分間温めた。ｐＨ ２．５における残留酸性ホスファターゼ及びフィターゼの活性を、酵素抽出後、以下の様に測定した。即ち、熱処理された飼料 ３ ｇ を ５０ ｍｌ の ０．１ Ｍ の ｐＨ ２．５ セーレンセン バッファー（Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎｂｕｆｆｅｒ）で ３０ 分間抽出し、飼料抽出後におけるフィチン酸ドデカナトリウムに対する ｐＨ ２．５ でのフィターゼ又は酸性ホスファターゼの活性を実施例１と同様にして測定した。未処理の飼料における活性を １００ ％ と設定し、それぞれの温度で処理された飼料における酵素の残存活性をパーセンテージ（％）で算出した。
フィターゼ及び酸性ホスファターゼの残存活性を表９に示す。
【００８０】
【表９】
実施例１０
ブタ用飼料を、アスペルギルス フィキューム フィターゼ（０．６／１）又は酸性ホスファターゼ（１／０）の溶液を添加した後、パイロットの規模でペレット化した。各酵素は、活性が １６５０００ Ｕａ／ 混合物 ５５０ ｇ となるように混ぜ、ペレット化する前のブタ用飼料 ５５ ｋｇ に添加した。
このブタ用飼料は主としてエンドウマメ、抽出セイヨウアブラナ種子（ｒａｐｅ ｓｅｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）、グルテン状トウモロコシ飼料及びタピオカを含んでいた。飼料粉砕・ペレット成形機のダイスから取り出すペレットの温度を、水蒸気を送りこむことにより ６９ 〜 ７４ｏＣ の間に調整した。
飼料（粉飼）とペレット化飼料中のフィターゼ及び酸性ホスファターゼのｐＨ ２．５ における各活性を、以下の酵素抽出操作の後測定した：飼料 ５ ｇ を ５０ ｍｌ の ０．１ Ｍ セーレンセンバッファー（ｐＨ ２．５）で ３０ 分間抽出し、実施例１と同様にしてフィチン酸ドデカナトリウムに対するフィターゼ又は酸性ホスファターゼの ｐＨ ２．５ での活性を測定した。粉末飼料における各酵素活性（３ Ｕａ／ｇ）を １００ ％ とした。
フィターゼ又は酸性ホスファターゼを含む飼料の各湿度は、それぞれ １１．６ と １１．９ （粉飼調整機における）から、１０．６ と １０．８ （冷却したペレットにおける）と低下した。
【００８２】
【表１０】
実施例１１
アスペルギルス フィキューム フィターゼ（０．６／１）及びアスペルギルス フィキューム フィターゼ（１．２５／１）の各調製物をブタ飼料に ９００ Ｕｐ／飼料 ｋｇ となるように加えた後、工業規模で飼料をペレット化した。このブタ用飼料は主としてエンドウマメ、グルテン状トウモロコシ飼料、抽出大豆及びタピオカを含んでいた。飼料中フィチン性リン（ＰＰ）濃度は、実施例２の方法で測定したところ ０．３７ ％ だった。飼料粉砕・ペレット成形機のダイスから取り出すペレットの温度は、実施例１０と比較し得る温度であった（７４．５ｏＣ）。フィターゼの残存活性を、以下のペレット化飼料のイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）フィチン加水分解により測定した：フィターゼを含む ２ ｇ の飼料を実施例２と同様にしてインキュベートした（湿度 ８０ ％）。実施例２と同様にしてフィチンの加水分解度を分析し、フィターゼ効率を計算した。ペレット化する前の粉飼のフィターゼ効率を １００ ％とした。ペレット化飼料におけるフィターゼ（１．２５／１）効率（０．７５ ｇ ＰＰ）はフィターゼ（０．６／１）効率（０．４ ｇ ＰＰ）の １９０ ％ であったが、粉飼におけるフィターゼ（１．２５／１）効率（０．９５ ｇ ＰＰ）はフィターゼ（０．６／１）効率（０．６ ｇ ｐｐ）の １６０％ にとどまった。
【００８４】
【表１１】
実施例１２
リン消化試験 ＩＩ（ブタ １２ 頭、ブタ ３ 頭／飼料）：
ブタの対照用飼料には、消化性リンが ２ ｇ／ｋｇ、リン全量が ５．８ ｇ／ｋｇ となるように調製した（飼料Ｉ）。飼料Ｉは主としてエンドウマメ、タピオカ、グルテン状トウモロコシ飼料、グルテン状小麦飼料及び抽出大豆を含んでいた。
フィターゼ含有飼料は、消化性リンが １．１７ ｇ／ｋｇ、リン全量が ４．４ ｇ／ｋｇ となるようにし、主成分が飼料Ｉと同じになるように調製した。これらは飼料にそれぞれ異なるアスペルギルス フィキューム フィターゼ 調製物を加えたもの、即ち７５０ Ｕｐ／ｋｇ のフィターゼ（０．６／１）を加えたもの（飼料 ＩＩ）、１０５０ Ｕａ／ｋｇ の酸性ホスファターゼ（１／０）を加えたもの（飼料ＩＶ）、及び ７５０ Ｕｐ／ｋｇ のフィターゼ（０．６／１）と １０５０ Ｕａ／ｋｇ の酸性ホスファターゼ（１／０）の混合物を加えて ａ／ｐ 比＝２／１ としたもの（飼料ＩＩＩ）である。濃縮した各酵素溶液をそれぞれ粉飼に加えて与えた。１２ 頭のブタをそれぞれ別の檻に入れ、飼料Ｉ〜ＩＶをそれぞれ ３ 頭ずつに １７ 日間与えた（最初の ７ 日間を予備期間とし、残りの １０ 日間を試験期間とした）。１日当りの１頭の飼料摂取量は １８００ ｇ で、試験期間の全摂取量は １８ ｋｇ であった。試験期間の １０ 日間にわたってそれぞれのブタにつき糞を集め、集めた糞につきリンの全排出量をＥＥＣ法で測定した。見かけのリン消化係数（ＤＣ−Ｐ（％））をリン全摂取量とリン全排出量との差から計算した。
例えば、飼料Ｉについて：
リン全摂取量： １０４．４ ｇ ＝ １００ ％
リン全排出量： ７０．９ ｇ ＝ ６７．９ ％
ＤＣ−Ｐ （％） ＝ １００ − ６７．９（％） ＝ ３２．１（％）
消化性リン（ｇ ｄＰ／ｋｇ） ＝ 飼料中のリン濃度 × ＤＣ−Ｐ ＝ ５．８ （ｇ Ｐ／ｋｇ） × ０．３２１ ＝ １．８６ （ｇ Ｐ／ｋｇ）
【００８６】
【表１２】
実施例１３
リン消化試験 ＩＩ（ブタ ２４ 頭、ブタ ８ 頭／飼料）：
ブタの対照用飼料は、消化性リンが ２ ｇ／ｋｇ、リン全量が ６．１ ｇ／ｋｇ となるように調製した（飼料Ｉ）。飼料Ｉは主としてエンドウ、タピオカ、小麦グルテン飼料及び抽出大豆を含み、リンの一部はモノカルシウムホスフェートによって供給した。フィターゼ含有飼料は、消化性リンが １．４ ｇ／ｋｇ、リン全量が ５．２ ｇ／ｋｇとなるように調製した。フィターゼ含有飼料の成分は、モノカルシウムホスフェートを用いないこと以外は飼料Ｉと同様にした。
フィターゼ含有飼料については、フィターゼ（０．６／１）を推奨レベルである ４００ Ｕｐ／ｋｇ 加える（飼料 ＩＩ）か、又は ５８０ Ｕａ／ｋｇ の酸性ホスファターゼ（１／０）と ４００ Ｕｐ／ｋｇ のフィターゼ（０．６／１）の混合物を加えて ａ／ｐ 比＝２／１ とした（飼料ＩＩＩ）。フィターゼ溶液及びフィターゼ／酸性ホスファターゼ溶液を飼料（粉飼）に加えて与えた。２４ 頭のブタをそれぞれ別の檻に入れ、飼料Ｉ〜ＩＩＩをそれぞれ ８ 頭ずつに １７ 日間与えた（最初の ７ 日間を予備期間とし、残りの １０ 日間を試験期間とした）。１日当りの１頭の飼料摂取量は １８００ ｇ で、試験期間の全摂取量は １８ ｋｇ であった。試験期間の １０ 日間にわたってそれぞれのブタにつき糞を集め、集めた糞につきリンの全排出量をＥＥＣ法で測定した。消化性リン（ＤＣ−Ｐ ％ 及び ｇ ｄｐ／ｋｇ）を実施例 １２ と同様に計算した。
【００８８】
【表１３】
実施例１４
アスペルギルス フィキューム由来のフィターゼと酸性ホスファターゼのブタの飼料（粉飼）への添加量の違いと生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のフィターゼ効率（実施例 １２ 及び １３参照）：
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のフィターゼ効率（ｇ ｄｐ／５００ Ｕｐ）は、飼料に添加した ５００単位（Ｕｐ） のフィターゼ（０．６／１ 又は ２／１）によって消化中に遊離されるリンの量として定義した。
酵素によって遊離したリンの量は、飼料に配合した消化性リンの量と実施例１２におけるような動物実験から算出した消化性リンの量の差として定義した。
例えば：
飼料に配合した消化性リンの量： １．１７ ｇ／ｋｇ
動物実験から計算した消化性リンの量： ２．０６ ｇ／ｋｇ
飼料のフィターゼ含量： ７５０ Ｕｐ フィターゼ／ｋｇ ＋ １０５０ Ｕａ 酸性ホスファターゼ／ｋｇ
フィターゼ効率（ｇ ｄＰ／５００ Ｕｐ） ＝ （２．０６ − １．１７） × ５００／７５０ ＝ ０．５９
酸性ホスファターゼの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）効率は０であるから、相乗的効率は酸性ホスファターゼ（２／１）／フィターゼ混合物の効率とフィターゼ（０．６／１）の効率の差として求める。
【００９０】
【表１４】
【発明の効果】
本発明の酵素組成物は、動物の生体内及び家畜用飼料の生産工程において、飼料又は飼料原材料中に含まれるフィチン酸に対して高い加水分解効率を有するため、家畜の生体内でのフィチン性リンの取込・吸収性を高める。従って、環境的に問題の多い家畜からのリン排出量及び飼料中のリン含有量を減らすために非常に有用である。
【００９２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ製剤によるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのフィチン加水分解効果（ｐＨ ２．５ における活性単位量で表わした添加量に対するフィチン酸性リン残存率で示す）を示す図である。
【図２】図２は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来のフィターゼ製剤によるイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのフィチン加水分解効果（ｐＨ ５．０ における活性単位量で表わした添加量に対するフィチン酸性リン残存率で示す）を示す図である。
【図３】図３は、アスペルギルス フィキューム（Ａ． ｆｉｃｕｕｍ）由来の異なる ｐＨ ２．５／ｐＨ ５．０ 活性比を有する種々のフィターゼ製剤におけるフィターゼ（０．６／１）及び酸性ホスファターゼ（１／０）のイン ヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での相乗効果を示す図である。
Claims (20)
- フィチン酸加水分解活性を有する酵素組成物にして、2.5〜5.0 の pH 領域にてフィチン酸加水分解活性を持つフィターゼ及び 2.5 の pH 値でフィチン酸加水分解活性を持つ酸性ホスファターゼを含み、該フィターゼ及び該酸性ホスファターゼは、該酵素組成物の pH 値 2.5 及び pH 値 5 におけるフィチン酸加水分解活性の比と定義される pH 2.5/5.0 活性比がフィチン酸加水分解に対して相乗作用を有するところの 0.8/1.0〜3/1 の範囲になるような量比で含有されてなることを特徴とする酵素組成物。
- 該フィターゼ及び該酸性ホスファターゼが、該酵素組成物のpH 2.5/5.0 活性比が 1/1〜2.5/1 の範囲になるような量比で含有されている請求項１に記載の酵素組成物。
- 該フィターゼ及び該酸性ホスファターゼが、該酵素組成物のpH 2.5/5.0 活性比が 1.5/1〜2/1 の範囲になるような量比で含有されている請求項１に記載の酵素組成物。
- 該フィターゼが真菌類由来のフィターゼである、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素組成物。
- 該真菌類由来のフィターゼが、アスペルギルス（Aspergillus）属由来のフィターゼである請求項４に記載の酵素組成物。
- 該真菌類由来のフィターゼが、アスペルギルス フィキューム（Aspergillus ficuum）由来のフィターゼ、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）由来のフィターゼ及びアスペルギルス テレウス（Aspergillus terreus）由来のフィターゼよりなる群から選ばれる請求項４に記載の酵素組成物。
- 該酸性ホスファターゼが真菌類由来の酸性ホスファターゼである請求項１〜３のいずれかに記載の酵素組成物。
- 該真菌類由来の酸性ホスファターゼが、アスペルギルス（Aspergillus）属由来の酸性ホスファターゼである請求項７に記載の酵素組成物。
- 該真菌類由来の酸性ホスファターゼが、アスペルギルス フィキューム（Aspergillus ficuum）由来の酸性ホスファターゼ、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）由来の酸性ホスファターゼ及びアスペルギルステレウス（Aspergillus terreus）由来の酸性ホスファターゼよりなる群から選ばれる請求項７に記載の酵素組成物。
- 該酸性ホスファターゼが熱安定性を有する酸性ホスファターゼである請求項１〜９のいずれかに記載の酵素組成物。
- 該酸性ホスファターゼがフィターゼよりも高い熱安定性を有する酸性ホスファターゼである請求項１〜９のいずれかに記載の酵素組成物。
- 熱処理によって該 pH 2.5/5.0 活性比が変化する請求項１〜１１のいずれかに記載の酵素組成物。
- 請求項１〜１２のいずれかに記載の酵素組成物を含む、食品、飼料又はかいば製品、或いはそれらのための成分材料。
- 請求項１〜１２のいずれかに記載の酵素組成物を含む、熱処理された食品、飼料又はかいば製品、或いはそれらのための成分材料。
- 請求項１〜１２のいずれかに記載の酵素組成物により、該酵素組成物に含まれる該フィターゼと該酸性ホスファターゼがフィチン酸の加水分解活性を持つ pH 条件下で、フィチン酸を含有する原材料を処理する工程を含む、フィチン酸の加水分解方法。
- 該処理を pH 値約 2 から約 6 の範囲で行なう請求項１５に記載の方法。
- 該処理を pH 値約 2.5 で行なわれる請求項１５に記載の方法。
- フィチン酸を含有する原材料が植物性原材料である請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
- 該植物性原材料が大豆又は小麦材料である請求項１８に記載の方法。
- 請求項１〜１２のいずれかに記載の酵素組成物を含む飼料又はかいばで家畜を飼養することを含む、家畜飼養における飼料又はかいばの消化を向上させ、且つ家畜の堆肥に含まれるリン排出量を減らす方法。
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