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Die
vorliegende Anmeldung zielt auf den Nutzen der Anmeldung zum Vorläufigen Patent
Seriennr. 60/127.032 ab, die am 31. März 1999 eingereicht wurde.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Phytasen
sind myo-Inositol-Hexakisphosphat-phosphohydrolasen, die die stufenweise
Spaltung von anorganischem Orthophosphat aus Phytat (myo-Inositol-Hexakisphosphat)
katalysieren. Es gibt zwei Arten von Phytasen. Eine wird 3-Phytase
genannt (EC.3.1.3.8), die die Eliminierung von Phosphatgruppen in
den Positionen 1 und 3 des Myo-Inositol.Rings in Gang setzt. Die
andere wird 6-Phytase genannt (EC.3.1.3.26) und setzt zuerst das
Phosphat in Position 6 des Rings frei. Auch wenn Phytasen in tierischen
Geweben nicht identifiziert wurden, enthalten Pflanzen im Allgemeinen
6-Phytasen und eine große
Vielfalt an Mikroorganismen, einschließlich Bakterien, fadenartiger
Pilze und Hefen, produzieren 3-Phytasen (2–9). Aufgrund der Tatsache,
dass mehr als 70% des gesamten Phosphors pflanzlicher Herkunft in
Lebensmitteln und im Tierfutter in Form von Phytat vorliegt, das
für Tiere
mit einfachem Magen und Menschen nur selten verwertbar ist, werden
Phytasen oft verwendet, um die mineralische Ernährung dieser Arten zu verbessern
(10–16).
Der Zusatz an mikrobiellen Phytasen in der Nahrung von Schweinen
und Hühnervögeln potenziert
wirksam die Bioverfügbarkeit
des Phosphorphytats und reduziert die Notwendigkeit eines anorganischen
Phosphorzusatzes (11–15), wodurch
eine geringere Umweltverschmutzung aufgrund des Phosphors in Gebieten
entsteht, in denen intensive Viehproduktion betrieben wird (8–15). Eine
Ergänzung
mit Phytase in relativ hohem Maße
in der tierischen Nahrung ist allerdings notwendig (10–16), da
sich wahrscheinlich durch die Proteolyse von Pepsin und Trypsin im
Magen und Dünndarm
eine beträchtliche
Menge des Enzyms abbaut (13). Unterdessen wurden die Proteolyseprofile
der verschiedenen Phytasen nicht erforscht. Klar ist, dass ein besseres
Verständnis
ihrer Hydrolyseempfindlichkeit für
Trypsin und Pepsin dabei helfen könnte, den Nährwert der Phytasen zu verbessern.
Es erfolgte eine Überexpression
des Gens der Phytase Aspergillus niger phyA) in seinem Ursprungswirt
(17) und das rekombinante Enzym(r-PhyA, EC.3.1.3.8) wurde in der
Tiernahrung als eine handelsübliche
Phytase verwendet. Bei diesem Enzym handelt es sich um ein Glukoprotein
von ungefähr
80 kDa. Außerdem
wurde das Gen der Phosphatasesäure
Escherichia coli (appA) mit einem pH-Wert von 2,5 gekennzeichnet
(18, 19). Experimente an Tieren haben bewiesen, dass das rekombinante
Enzym (r-AppA, EC.3.1.3.2) in der Freisetzung von Phosphorphytat
in Tiernahrung so wirksam ist wie r-PhyA (14).
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Der
Aufwand bei der Zufuhr von nur begrenzt im Handel zur Verfügung stehender
Phytase aber und die instabile Aktivität des Enzyms bei der Wärme der
Futterkörnung
verhindern ihren praktischen Einsatz in der Tierindustrie. Für den Einsatz
in Tierfutter besteht infolgedessen eine Notwendigkeit an Enzymen,
die ein hohes Maß an
Phytase-Aktivität
und ein hohes Maß an
Stabilität
besitzen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung schlägt
eine Phosphatase vor, die eine verbesserte Phytase-Aktivität besitzt,
ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das die
Phosphatase kodiert, einen Vektor, der das Nukleinsäure-Molekül trägt, eine
Wirtszelle, die mit dem Vektor verändert ist und ein verbessertes
Tierfutter, das die Phosphatase umfasst, so wie sie in Patentanspruch
1 definiert ist.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 zeigt die Veränderung in der Phytase-Aktivität nach der
Verdauung mit Protease 1A zeigt die Veränderungen
in der Phytase-Aktivität
von r-PhyA und r-AppA,
die in unterschiedlichen Verhältnissen
von Trypsin/Protein (w/w) inkubiert wurden (r = 0,001; 0,005; 0,01
und 0,025). Symbole:r-PhyA (∎) und r-AppA. Die Ergebnisse
sind der Mittelwert ± SEM
aus fünf
unabhängigen
Experimenten. * gibt die statistische Wertigkeit (P < 0,01) gegenüber der
Kontrolle von unbehandelten r-PhyA oder r-AppA an.
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1B zeigt
die Veränderungen
in der Phytase-Aktivität
von r-PhyA und r-AppA, die in unterschiedlichen Verhältnissen
von Trypsin/Protein (w/w) inkubiert wurden (r = 0,001; 0,002; 0,005
und 0,01). Symbole:r-PhyA (☐) und r-AppA (o). Die Ergebnisse
sind der Mittelwert ± SEM
aus sieben unabhängigen
Experimenten. * gibt die statistische Wertigkeit (P < 0,01) gegenüber der
Kontrolle von unbehandelten r-PhyA oder r-AppA an.
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2 zeigt
die verbleibende Phytase-Aktivität
von r-PhyA und r-AppA nach der Trypsin- oder Pepsinhydrolyse in
der Zeit (0, 1, 51 30 und 120 min). Symbole: mit Trypsin verdaute
r-PhyA (∎) oder r-AppA (•); mit Trypsin verdaute r-PhyA
(☐) und r-AppA
(o). Das verwendete Verhältnis
von Trypsin/Phytase (w/w) betrug: r = 0,01 (w/w). Das verwendete
Verhältnis
von Pepsin/Phytase betrug r = 0,005. Die Ergebnisse sind der Mittelwert ± SEM aus
sechs unabhängigen
Experimenten. * gibt die statistische Wertigkeit (P < 0,01) gegenüber der Kontrolle
von unbehandelten r-PhyA oder r-AppA an.
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3 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese
in SDS-Polyacrylamid-Gel der verdauten Produkte mit r-AppA (12%,
Schautafel A) oder r-PhyA (20%, Schautafel B) nach unterschiedlichen
Trypsinmengen (p = 0,001; 0,005; 0,01 und 0,025 (w/w)). Die Proteine
verfärbten
sich bei der Verwendung von Coomassie-Blau. T: Trypsinkontrolle,
C: gereinigte r-AppA (Schautafel A) oder r-PhyA (Schautafel B) Der
Proteinindikator (M) ist ein Maßstab
von 10 kDa (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 und
200 kDa) (Gibco). Die Ergebnisse sind aus vier unabhängigen Experimenten
repräsentativ.
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4 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese
in SDS-Polyacrylamid-Gel (20%) der mit r-AppA (4A)
oder r-PhyA (4B) verdauten Produkte nach
unterschiedlichen Pepsinmengen (r = 0,001; 0,002; 0,005 und 0,01
(w/w)). Die Proteine verfärbten
sich bei der Verwendung von Coomassie-Blau. T: Trypsinkontrolle,
C: gereinigte r-AppA (4A) oder r-PhyA (4B).
Der Proteinindikator (M) ist ein Maßstab von 10 kDa (10, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 und 200 kDa) (Gibco). Die
Ergebnisse sind aus sechs unabhängigen
Experimenten repräsentativ.
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5 zeigt die Menge an anorganischem Phosphor
(Pi), der durch r-PhyA und r-AppA aus Sojamehl freigesetzt
wurde, die in unterschiedlichen Trypsinkonzentrationen (p = 0,001;
0,005; 0,01 und 0,025 w/w) (5A) oder
Pepsinkonzentrationen (p = 0,001, 0,002; 0,005 und 0,01) (5B)
inkubiert wurden. Symbole: r-AppA (∎), r-PhyA (☐).
Die Ergebnisse sind der Mittelwert ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten.
* gibt die statistische Wertigkeit (P < 0,01) gegenüber der Kontrolle von unbehandelten
r-AppA oder r-PhyA an.
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6 zeigt
die Nukleotid-Sequenz des Gens appA2 (SEQ. ID. Nr. 1) und seine
abgeleitete Aminosäure-Sequenz
(SEQ. ID. Nr. 9). Der nicht übertragene
Bereich ist mit Kleinbuchstaben angegeben. Bei den unterstrichenen
Sequenzen handelt es sich um die Primer, die für die Erweiterung von appA2
verwendet wurden (Pf1:1–22
und K2:1468–1490),
appA2 (E2:243–252
und K2:1468–1490).
Die potentiellen Glykosilationsorte befinden sich in Kasten. Die
Sequenz von appA2 wurde an die Datenbank Genebank unter der Zugriffsnummer 250016 übermittelt.
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7 ist
eine Zeitstudie der Aktivitäten
der Phytase (☐) und der Phosphatasesäure (∎) außerhalb
der Zelle, und der Expression des RNS-m CIPPA2 (
in
Pichia pastoris, die nach der Induktion mit appA2 verändert wurde.
Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM aus drei Experimenten
ausgedrückt.
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8 zeigt
eine Northern-Blot-Analyse der Expression RNS-m appA2 in Pichia
pastoris, die nach der Induktion mit appA2 verändert wurde (8A).
Die Hybridisierung wurde ausgeführt,
wobei als Probe appA2 verwendet wurde, das mit [α–32P]
gekennzeichnet ist. 20 μg
der gesamten RNS wurden pro Strang eingefüllt. Die Schautafel B stellt
die Füllung
einer gleichen Menge RNS dar, was durch die Hefe-RNS-r unter UV-Licht sichtbar gemacht
ist.
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9 zeigt
die pH-Abhängigkeit
der Enzym-Aktivität
bei 37° C
von den gereinigten r-appA2 (•),
r-appA (
)
und r-phyA (☐) mit Natriumphytat als Substrat. Puffer:
0,2 M HCl/Glycin, pH 1,5–4,5;
0,2 M Citrat, pH 5,5–7,5,
0,2 M Tris-HCl, pH 8,5. Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM
aus drei Experimenten ausgedrückt.
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10 zeigt
eine Analyse der Elektrophorese der remanenten Phosphatasesäure Aktivität von r-AppA2
in nicht denaturiertem Gel (15%) nach der Inkubation bei verschiedenen
Temperaturen über
20 Min. hinweg. Nach der Wärmebehandlung,
wurden die Proben 5 Min. in Eis gelegt, bevor sie in das Gel gefüllt wurden
(200 μg
Proteine/Strang).
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11 zeigt
die Phosphorphytathydrolyse in Sojamehl mit verschiedenen Mengen
(100, 300, 600 und 900 PU) an den gereinigten Enzymen r-appA2 (•), r-appA
(
)
und r-phyA (☐). * gibt bedeutende Unterschiede (P < 0,05) zwischen
r-appA und den anderen beiden Enzymen an. Die Ergebnisse sind als
Mittelwert ± SEM aus
drei Experimenten ausgedrückt.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung schlägt
eine Phosphatase vor, die eine verbesserte Phytase-Aktivität besitzt.
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Die
verbesserte Phosphatase kann in Tierfutter verwendet werden, damit
das Tier einen besseren Zugriff auf das Phosphat erlangt.
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Die
Erfindung schlägt
eine Phosphatase vor, die eine verbesserte Phytase-Aktivität besitzt,
die die in SEQ. ID Nr. 9 gezeigte Aminosäure-Sequenz besitzt, wie sie
in 6 gezeigt wird.
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Vorzugsweise
wird das Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität durch
eine Zelle auf dem Nährboden
ausgeschieden. Dadurch kann ein höheres Expressionsniveau und
eine leichtere Isolierung des Produktes erzielt werden. Das Protein
oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität verbindet sich mit einer
Signalsequenz, mit deren Hilfe das Protein aus der Zelle geleitet
werden kann. Vorzugsweise spaltet Signalsequenz das Protein auf.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
verbindet sich das heterologe Gen, das ein Protein oder Polypeptid
mit Phytase-Aktivität
kodiert, im Gleichtakt mit einem Verstärkerelement der Übertragung.
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Das
Gen appA von E. Coli hat eine bevorzugte Phosphatase kodiert. Das
Gen, das ursprünglich
als E. Coli-Gen des Phosphohydrolase-Phosphoanhydrid-Periplasma
(appA) definiert war, enthält
1298 Nukleotide (Zugriffsnummer bei der GeneBank: M58708). Zu Beginn
kodierte das Gen in E. coli ein Phosphatasesäureprotein mit einem pH-Optimum
von 2,5 (EcAP). Die Phosphatasesäure
ist ein Monomer mit einer Molekülmasse
von 44644 Da. Die reife EcAP enthält 410 Aminosäuren (18).
Ostanin et al. bewirkten eine Überexpression
von appA in E. coli BL21, wobei sie einen Vektor pT7 verwendeten
und seine Phosphatase-Aktivität
um ungefähr
das 400-fache (440 mU/mg Protein) steigerten. Es ist vorher nicht
bewiesen worden, dass das Produkt des Gens appA Phytase-Aktivität hätte.
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Die
Phosphatase kann in einem prokaryontischen oder eukaryontischen
Expressionssystem ausgedrückt
werden. Es können
verschiedene Wirt-Vektor-Systeme verwendet werden, um die Sequenz
oder Sequenzen, die die Proteine kodieren, auszudrücken. Die
bevorzugten Vektoren schließen
einen Virusvektor, ein Plasmid, ein Kosmid oder ein Oligonukleotid
ein. Das Vektorensystem muss vor allem mit der verwendeten Wirtszelle
kompatibel sein. Die Wirtszellen-Systeme schließen, wenn auch ohne Beschränkung, die
folgenden ein: Bakterien, die mit DNS-Bakteriophagen, DNS-Plasmid
oder DNS-Kosmid verändert
sind; Mikroorganismen wie Hefen, die Hefevektoren enthalten; Zellensysteme
von Säugetieren,
die mit einem Virus infiziert sind (zum Beispiel virus vaccinia,
Adenovirus, etc.); Zellensysteme von Insekten, die mit einem Virus
infiziert sind (zum Beispiel Baculovirus) und Pflanzenzellen, die
mit Bakterien infiziert sind. Die Expressionselemente dieser Vektoren
variieren in ihrer Potenz und ihren Spezifitäten. In Abhängigkeit des verwendeten Wirt-Vektor-System können beliebige
der verschiedenen adäquaten
Transkriptions- und Übersetzungselemente
verwendet werden.
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Die
für die
Phosphataseexpression bevorzugten Wirte umfassen Pilzzellen; fadenartige
Hefe- oder Pilzarten können
ebenfalls in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung als Wirtszellen verwendet werden.
Die bevorzugten Hefewirtszellen umfassen verschiedene Stämme von
Saccharomyces cerevisiae. Es können
auch andere Hefen wie Kluyveromyces, Torulaspora und Schizosaccharomyces
verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der für die Überexpression
des Proteins verwendete Hefestamm Saccharomyces cerevisiae. Die
fadenartigen Pilzwirtszellen umfassen Aspergillus und Neurospora.
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Der
Hefestamm kann ein methylotropher Hefestamm sein. Die methylotrophen
Hefen sind solche Hefesorten, die Methanol als Kohlenstoffquelle
für die
Produktion der Energiereserven nutzen können, die für die Aufrechterhaltung der
Zellenfunktion nötig
sind und ein Gen für
die Expression von Alkohol-Oxidase enthalten. Die typischen methylotrophen
Hefen umfassen Mitglieder der Sorten Pichia, Hansenula, Torulopsis,
Candida und Karwinskia. Diese Hefesorten können Methanol als einzige Kohlenstoffquelle
verwenden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der methylotrophe
Hefestamm Pichia pastoris.
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Das
Protein oder Polypeptid, das eine Phytase-Aktivität besitzt,
kann eine optimale Aktivität
in einem Temperaturbereich von 57 bis 65° C besitzen. Eine bevorzugtere
Ausführungsform
ist ein Protein oder Polypeptid, das eine Phytase-Aktivität besitzt,
in der deren optimale Aktivität
in einem Temperaturbereich von 58 bis 62° C liegt.
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Eine
weitere ebenfalls bevorzugte Ausführungsform ist ein Protein
oder Polypeptid, das eine Phytase-Aktivität besitzt, in der das Protein
mindestens 40% seiner Aktivität
behält,
nachdem das Protein 15 Minuten lang bei 80° C erwärmt wurde. Bevorzugter ist
es ein Protein oder Polypeptid, das eine Phytase-Aktivität besitzt,
in der das Protein mindestens 60% seiner Aktivität behält, nachdem das Protein 15
Minuten lang bei 60° C
erwärmt
wurde.
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Das
reine Protein kann mit mehreren Methoden erhalten werden. Das Protein
oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in
reiner Form (vorzugsweise mit einem Reinheitsgrad von mindestens ungefähr 80%,
bevorzugter von 90%) mit herkömmlichen
Verfahrensweisen hergestellt. Typischerweise wird das Protein oder
Polypeptid der vorliegenden Erfindung im Nährboden der rekombinanten Wirtszellen
ausgeschieden. Alternativ wird das Protein oder Polypeptid der vorliegenden
Erfindung im Nährboden
hergestellt, aber dort nicht ausgeschieden. In solchen Fällen wird,
um das Protein zu isolieren, die Trägerwirtszelle eines rekombinanten
Plasmids fortgepflanzt, durch Sonikation lysiert, erwärmt oder
chemisch behandelt und das homogenisierte Gemisch zentrifugiert,
um die Zellenreste zu entfernen. Anschließend wird das Überschüssige mit
Ammoniaksulfat sequentieller Präzipitation
unterworfen. Die Fraktion, die das Polypeptid oder Protein der vorliegenden
Erfindung enthält,
wird einer Filtration in Gel in einer Dextran- oder Polyacrylamid-Kolonne
geeigneter Größe unterworfen,
um die Proteine zu trennen. Wenn es nötig ist, kann die Proteinfraktion
nachträglich
mit HPLC gereinigt werden.
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Der
Hefestamm kann ein heterologes Gen besitzen, das ein Protein oder
Polypeptid mit einer Phytase-Aktivität kodiert. Das heterologe Gen
muss funktionell mit einem Promotoren vereinigt sein, der die Phytase in
Hefen ausdrücken
kann, und von einem Transkriptionsterminatoren gefolgt sein.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist auch ein Vektor für die Expression
der Phytase in einem Wirt. Der Vektor trägt ein Phosphatase-Gen, das
ein Protein oder Polypeptid mit einer Phytase-Aktivität kodiert.
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Zur
Klonung in der Hefe kann das Gen in jedem beliebigen Vektor geklont
werden, der sich autonom replizieren oder sich in dem Genom der
Hefe integrieren kann. Die Anzahl der Plasmidkopien, die sich autonom
replizieren, zum Beispiel YEp Plasmide, kann hoch, aber ihre mitotische
Stabilität
unzureichend sein (48). Sie können
die 2 mu-Plasmid-Sequenz, die für
die autonome Replikation verantwortlich ist, und eine E. coli-Sequenz,
die für
die Replikation in E. coli verantwortlich ist, enthalten. Die Vektoren
enthalten vorzugsweise einen genetischen Indikator für die Auswahl
Hefe-Transformanten
und ein antibiotisches Resistenzgen für die Auswahl in E. coli. Die
episomale Vektoren, die die ARS- und CEN-Sequenzen enthalten, erscheinen
als einzige Kopie pro Zelle und sind stabiler als die YEp-Vektoren.
Integrative Vektoren werden verwendet, wenn ein DNS-Fragment als
Kopie oder mehrere Kopien im Hefegenom integriert wird. In diesem
Fall ist die rekombinante DNS stabil und bedarf keiner Auswahl (49–51). Einige
Vektoren besitzen einen Replikationsursprung, der in der ausgewählten Wirtszelle
abläuft.
Die adäquaten
Replikationsursprünge
umfassen 2μ,
RSS1 und 25 μM.
Die Vektoren besitzen Orte für
Restriktionsendonukleasen für
die Einsetzung des Fusionsgens und Promotoren-Sequenzen sowie Auswahlindikatoren.
Die Vektoren können
modifiziert werden, um Restriktionsorte zu entfernen oder hinzuzufügen, oder
andere unerwünschte
Nukleotide zu entfernen.
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Das
Phytasegen kann unter die Kontrolle jedes beliebigen Promotors gestellt
werden (52). Es kann ein konstitutiver oder ein regulierter Hefe-Promotor
gewählt
werden. Die adäquaten
Promotoren-Sequenzen für Hefevektoren
umfassen unter anderem Promotoren für Metallothionin, 3-Phosphoglycerat-Kinase
(53) und weitere glykolytische Enzyme (54), so wie Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat
Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxilase, Phosphofructokinase,
6-Phosphat-Glukose-Isomerase,
3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triphosphat-Isomerase,
Phosphoglukose-Isomerase und Glukokinase. Weitere für die Expression
von Hefen eingesetzte adäquate
Vektoren und Promotoren werden ausführlicher in EP A-73.657 von
Hitzeman beschrieben, das diesem Dokument als Referenz beigefügt ist.
Eine weitere Alternative ist der Glukose abwehrende Promotor ADH2,
der diesem Dokument als Referenz beigefügt ist.
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Es
kann ein konstitutiver oder ein regulierter Hefe-Promotor gewählt werden.
Die leistungsfähigen
Promotoren von, z.B. dem Gen der Phosphoglycerat-Kinase (PGK), weiteren
Genen, die glykolytische Enzyme kodieren, und dem Gen des Alpha-Faktors, sind konstitutive
Promotoren. Wenn ein konstitutiver Promotor verwendet wird, wird
das Produkt während
des Zellenwachstums synthetisch hergestellt. Der ADH2-Promotor wird
mit Äthanol
und Glukose, die GAL-1-10- und GAL7-Promotoren mit Galaktose und Glukose,
der PHO5-Promotor mit Phosphat und der Metallothionin-Promotor mit
Kupfer reguliert. Die Thermoschock-Promotoren, zu denen der HSP150-Promotor
gehört,
sind über
die Temperatur reguliert. Es können
auch hybride Promotoren verwendet werden. Ein regulierter Promotor
wird verwendet, wenn eine anhaltende Expression des gewünschten
Produkts die Wirtszellen schädigt.
Anstelle von Hefepromotoren kann ein leistungsfähiger prokaryontischer Promotor,
wie der T7-Promotor, verwendet werden, in diesem Fall muss jedoch
der Hefestamm mit einem Gen, das die Polymerase jeweils kodiert,
transformiert werden. Um die Transkription abzuschließen, wird
der HSP150-Terminator oder ein beliebig anderer funktioneller Terminator
verwendet. Hier sind die Promotoren und Terminatoren als Kontrollelemente
bezeichnet. Die vorliegende Erfindung ist auf keinen spezifischen
Vektor, Promotor oder Terminator beschränkt.
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Der
Vektor kann auch einen auswählbaren
Indikator tragen. Die auswählbaren
Indikatoren sind häufig antibiotische
Resistenzgene oder Gene, die die Hefestämme, die klar gekennzeichnete
metabolische Defizienzen, wie Mutanten, die Tryptophan- oder Histidindefizienzen
haben, besitzen. Die bevorzugten auswählbaren Indikatoren umfassen
URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4 oder antibiotische Resistenzgene.
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Der
Vektor kann auch einen Replikationsursprung besitzen, der eine Replikation
in einer Bakterienzelle bewirken kann. Die Vektorenmanipulation
ist in Bakterienstämmen
wirksamer. Die bevorzugten Bakterien-Replikationsursprünge sind
ColE1, Ori oder oriT.
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Es
kann auch eine Führersequenz
der Hefe- oder Phytasegene oder anderer Quellen verwendet werden,
um die Ausscheidung des in dem Medium ausgedrückten Phytaseenzyms zu unterstützen. Die
vorliegende Erfindung ist auf keinen spezifischen Typ Führersequenz
oder Signalpeptid beschränkt.
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Die
adäquaten
Führersequenzen
umfassen die Führersequenz
des Alpha-Faktors von Hefen, die für die direkte Ausscheidung
der Phytase verwendet werden kann. Die Führersequenz des Alpha-Faktors
wird häufig
zwischen die Promotorensequenz und die Sequenz des strukturellen
Gens eingefügt
(58; US-Patent Nr. 4,546,082 und in Europa veröffentlichte Patentanmeldung
Nr. 324.274, die diesem Dokument als Referenzen beigefügt sind).
Eine weitere adäquate
Führersequenz
ist die S. Cerevisiae-MF Alpha I (Alpha-Faktor), die synthetisch
als Präproform
aus 165 Aminosäuren
hergestellt wird, die das Signal oder Präpeptid aus 19 Aminosäuren, gefolgt
von einem "Führer" oder Propeptid aus
64 Aminosäuren
umfassen, und die drei Glykosilationsorte mit N-Verbindung, gefolgt von (LysArg(Asp/Glu,Ala)2-3
Alpha-Factor)4 besitzt (58). Der Führungssignalteil der preproMF
Alpha 1 wurde ausgedehnt angewendet, um in S. Cerevisiae eine heterologe
Proteinsynthese und -ausscheidung zu erlangen. Der Einsatz von homologen
Signal-/Führerpeptiden
für Hefen
sind aus dem US-Patent Nr. 4,546,082, den europäischen Patentanmeldungen Nr.
116.201; 123.294; 123.544; 163.529 und 123.289 und der Patentanmeldung
DK Nr. 3614/83 bekannt, die diesem Dokument als Referenz beigefügt sind.
In der europäischen
Patentanmeldung zum Nr. 123.289, die diesem Dokument als Referenz
beigefügt ist,
wird die Nutzung des Vorläufers
des Faktors a von S. Cerevisiae beschrieben, während in WO 84/01153, das diesem
Dokument als Referenz beigefügt
ist, die Nutzung des Signalpeptids der Invertase Saccharomyces cerevisiae
angegeben ist und die Anmeldung zum Deutschen Patent DK 3614/83,
das diesem Dokument als Referenz beigefügt ist, die Nutzung des Signalpeptids
PHO5 Saccharomyces cerevisiae für
die Ausscheidung fremder Proteine angibt.
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Das
Führersignal
des Saccharomyces cerevisiae-Alpha-Faktors (MF Alpha 1 oder MF Alpha
2) kann auch im Prozess einer in Hefen ausgedrückten heterologen Proteinausscheidung
verwendet werden (US-Patent Nr. 4,546,082, europäische Patentanmeldung Nr. 16.201;
123.294 und 163.529, die diesem Dokument als Referenz beigefügt sind).
Bewiesen wurde dies durch die Fusion einer DNS-Sequenz, die die
S. cerevisiae-Signal-/Führersequenz
MF Alpha I am äußersten
Rand 5' des Gens
für die
Ausscheidung und Verarbeitung des gewünschten Proteins kodiert. Der
Einsatz des Amylase-Signalpeptids der Speicheldrüse einer Maus (oder einem Mutanten
von dieser) wurde beschrieben, um in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen
Nr. WO 89/02463 und WO 90/10075, die diesem Dokument als Referenzen
beigefügt
sind, die Ausscheidung von in Hefen ausgedrückten heterologen Proteinen
vorzuschlagen.
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Das
US-Patent Nr. 5,726,038 beschreibt den Einsatz des Signalpeptids
der aspartischen 3-Protease von Hefe, mit der eine verbesserte Ausscheidung
der in Hefe ausgedrückten
Proteine erreicht werden kann. Weitere adäquate Führersequenzen für die leichtere
Ausscheidung rekombinanter Polypeptide aus Hefewirten sind dem Fachmann
bekannt. Eine Führersequenz
kann in der Nähe
ihres Extrems 3' modifiziert
werden, um einen oder mehrere Restriktionsorten zu enthalten. Dies
wird die Fusion der Führersequenz
mit dem strukturellen Gen erleichtern.
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Die
Tranformationsprotokolle von Hefen sind dem Fachmann bekannt. Ein
solches Protokoll ist in Hinnen et al. (59) beschrieben. Das Protokoll
von Hinnen et al. wählt
Trp-Transformanten in einem trennscharfen Medium aus, in dem das
trennscharfe Medium zu 0,67% aus einer Stickstoffbase von Hefen,
zu 0,5% aus Kasaminosäuren,
zu 2% aus Glukose, zu 10 μg/ml
aus Adenin und zu 20 μg/ml
aus Uracil besteht.
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Das
Gen kann in einem stabilen Expressionsvektor, einem künstlichen
Chromosom oder durch Integration in das Chromosom der Hefewirtszelle
erhalten werden. Die Integration in das Chromosom kann durch das
Klonen des Phytase-Gens in einem Vektor erreicht werden, der mit
dem Hefechromosom rekombiniert. Die adäquaten Vektoren können Nukleotid-Sequenzen
umfassen, die mit Nukleotid-Sequenzen
des Hefechromosoms homolog sind. Alternativ kann sich das Phytase-Gen
zwischen Rekombinationsorten wie Transposons befinden, die das Gen
im Chromosom mobilisieren.
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Die
Phytase kann hergestellt werden, wobei ein isoliertes Phosphatase-Gen,
das ein Protein oder Polypeptid mit einer Phytase-Aktivität kodiert
und das Gen in der Wirtszelle ausdrückt, befähigt wird. Die Phosphatase
ist vorzugsweise eine mikrobielle Phosphatase. In einer bevorzugteren
Ausführungsform
ist die mikrobielle Phosphatase eine Escherichia coli-Phosphatase.
Ebenso bevorzugt sind die mikrobiellen Phosphatasen AppA und AppA2.
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Das
Phytat kann sich in Inositol und anorganischen Phosphor umwandeln.
Ein appA-Gen wird aus einem Organismus isoliert, wobei auf diesem
Gebiet wohl bekannte Verfahren angewandt werden. Anschließend wird
ein Protein oder Polypeptid mit einer Phytase-Aktivität aus dem
Gen in einer Wirtszelle ausgedrückt.
Das erhaltene Protein oder Polypeptid wird gemischt oder tritt mit
dem Phytat in Kontakt. Dieses Verfahren ist besonders zweckmäßig, um
das Phytat von Lebensmitteln oder Tierfutter zu behandeln.
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Das
bevorzugte appA-Gen wird aus Escherichia coli isoliert.
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Während das
in einem Hefesystem produzierte Phytase-Enzym Phytat-P aus Mais
und Soja ebenso wirksam wie die derzeit handelsübliche Phytase freisetzte,
schien es wärmebeständiger zu
sein. Dieses Überexpressionssystem
von Phytase in Hefen kann verwendet werden, um eine wärmebeständige Phytase
für ihren
Einsatz in der Lebensmittel- und Futterindustrie zu liefern.
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BEISPIELE
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Beispiel 1 – Materialien
und Methoden für
die Beispiele 2–6
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Expression
r-AppA. Das Gen appA (Zugriffsnummer auf die Genebank M58708) wurde
aus dem Stamm E. coli BL21 erhalten, der mit einem Expressionsvektor
pAPPA1 (20) verändert
ist. Nach den Anweisungen des Herstellers (Perkin Elmer) wurde ein
DNS-Fragment durch PCR um 1,35 kb erweitert, das den Kodierungsbereich
appA enthielt. Die Primer wichen von den Bereichen 5' und 3' der Nukleotid-Sequenz
ab (18) und umfassen: E2 [direkt: 242–252]: 5'GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA3' (SEQ. ID Nr. 2)
und K2 [umgekehrt: 1468–1490]:
5'GGGGTACCTTACAAACTGCACG3' (SEQ. ID Nr. 3).
Diese beiden Primer wurden in den Einrichtungen für Oligonukleotid-Synthese
der Universität
von Cornell (Ithaca, NY) synthetisch hergestellt. Das erweiterte
Produkt wurde aus einem 1%igen Agargel ausgeschnitten und mit dem
Test-Kit GENECLEAN herausgelöst Π (Bio101).
Das reine Fragment wurde zuerst in einem Vektor pGEM T-easy (Promega)
geklont und anschließend
in den Expressionsvektor von Hefen pPIcZαA (Invitrogen) am Ort EcoRI
eingesetzt. Als ursprünglicher
Wirt wurde der Stamm TOP10F' von
E. coli (Invitrogen) verwendet, um diese beiden Konstruktionen zu erweitern.
Der Vektor pPIcZαA,
der appA enthielt, wurde gemäß der Anweisungen
des Herstellers (Invitrogen) im Stamm X33 von P. pastoris durch
Elektroporation transformiert. Die transformierten Zellen wurden
auf Platten mit Agar YPD-Zystein-Medium gelegt und die positiven
Bänder
in geringen Medien mit Glyzerin (BMGY) 24 h lang inkubiert. Als
die Zellendichte von Hefe 2,5 × 108 Zellen/ml (DO600 =
5) erreichte, wurden die Zellen zentrifugiert und im Medium mit
0,5%igem Methanol (BMMY) wieder suspendiert, um die Expression des
Gens appA zu induzieren. Das gesamte DNS-Genom von Hefe wurde nach der Induktion
aus den transformierten Zellen X33 herausgezogen und als Form verwendet,
um die Präsenz
des Gens appA durch PCR zu überprüfen, wobei
die gleichen Primer, die oben beschrieben wurden, verwendet wurden.
Das erweiterte DNS-Fragment wurde in den DNS-Einrichtungen und Dienstleistungen
der Universität
von Cornell sequenziert, wobei der automatische Sequencer Taq Cycle
mit Terminatoren Dye Deoxy (Applied Biosystems, Forster City, CA)
verwendet wurde.
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Reinigung
von r-PhyA und r-AppA. r-PhyA wurde von BASF erhalten (Mt Olive,
NJ). Beide Enzyme, r-PhyA und r-AppA wurden anfangs wieder in 50
mM Tris-HCl, pH
7 suspendiert und 25% gesättigtes
Ammoniaksulfat hinzugefügt.
Nachdem das Gemisch zentrifugiert wurde (25.000 g, 20 Min.), wurde
das Überschüssige auf
später
zurückgestellt
und bis zu 75% gesättigtes
Ammoniaksulfat hinzugefügt.
Anschließend
wurde das Gemisch zentrifugiert (25.000 g, 20 Min.) und das Sediment
wieder in 10 ml von 25 mM Tris-HCl, pH 7 suspendiert. Die Suspension
wurde eine Nacht lang gegen den gleichen Puffer dialysiert und in
eine mit 25 mM Tris-HCl, pH 7 ausgeglichenen Kolonne DEAE-Sepharose
(Sigma) gefüllt.
Die Proteine wurden mit 0,2 M NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7 versetzt,
anschließend
wurde die Kolonne mit 200 n-LL 25 mM Tris-HCl, pH 7 gewaschen. Die
Phytase-Aktivität
und die in allen Fraktionen aufgefangene Proteinkonzentration wurden
getestet (21). Die vollständige
Reinigung wurde bei 4° C
durchgeführt
und die Fraktionen wurden bei –20° C konserviert,
bevor sie analysiert wurden.
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Proteolyse
und Elektrophorese von Proteinen. Gemäß den Vorschriften des Herstellers
(Sigma) wurden die gereinigten r-AppA und r-PhyA (2 mg/ml) mit verschiedenen
Mengen an Pepsin und Trypsin inkubiert. Das Pepsin (800 Einheiten/mg Protein)
und das Trypsin (1.500 Einheiten BAEE/mg Protein) wurden jeweils
in 10 mM HCl, pH 2 (0,1 mg/ml) und 80 mM Ammoniakhydrogenkarbonat,
pH 7,5 (0,1 mg/ml) aufgelöst.
Eine Einheit BAEE wurde definiert als eine Absorbensveränderung
von 0,001 bis 253 nm pro Minute bei pH 7,6 und 25° C mit BAEE
als Substrat. In einem Endvolumen von 100 μl wurden 10 μg mit Trypsin oder Pepsin gereinigte r-PhyA
(0,1 PU) oder r-AppA (0,08 PU) in Protease/Phytase-Verhältnissen
(p/p) inkubiert, die 1 bis 120 Min. bei 37° C zwischen 0,001 und 0,01 schwankten.
Für die
Elektrophorese von Proteinen und den Test der Phytase-Aktivität wurde
die Umsetzung in Eis gestoppt und der pH-Wert des Gemischs auf 8
eingestellt. Die verdauten Proteingemische wurden mittels Elektrophorese
in Dodecylsulfonat (SDS)-Acrylamid-Gele oder SDS-Polyacrylamid-Harnstoffen wie oben beschrieben
analysiert (22, 23).
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Phytase-
und Hydrolyse Aktivität
des Phosphorphytats aus Sojamehlen. Wie oben beschrieben wurde die
Phytase-Aktivität
sowohl von r-PhyA als auch von r-AppA vorher oder mit verschiedenen
Proteolysezeitwerten bestimmt (24). Das freigesetzte anorganische
Phosphor (Pi) wurde durch die Methode Chen
et al. getestet (25). Eine Phytaseeinheit (PU) wurde als die Aktivität definiert,
die 1 μmol
Pi bei 37° C
pro Minute aus Natriumphytat produziert. Um die Proteolysewirkungen
des Trypsins oder Pepsins in den verbleibenden Aktivitäten von
r-PhyA und r-AppA zu bestätigen,
wurde ein Nachlauf der Hydrolyse des Phosphorphytats aus dem Sojamehl
durch diese beiden Enzyme durchgeführt, die mit unterschiedlichen
Mengen an Trypsin oder Pepsin inkubiert wurden. In 5 ml Gesamtreaktion
wurden 0,5 mg mit 1 g Sojamehl und Pepsin gereinigte r-PhyA (5 PU)
oder r-AppA (4 PU) in 10 mM HCl, pH 2,5 oder 0,2 M Trypsin, pH 6,8
in Citrat 2 h lang bei 3 VC inkubiert. Der freigesetzte P; wurde
wie oben beschrieben bestimmt.
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Beispiel 2 – Vorbereitung
von r-AppA und r-PhyA.
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Mehr
als 30 X33-Bänder,
die mit dem Gen appA verändert
sind, drückten
eine extrazellulare Phytase-Aktivität aus, die Natriumphytat hydrolytisch
abspaltet. Die Kolonie 26 besaß die
höchste
Aktivität
(88 U/ml) und wurde für
spätere
Studien ausgewählt.
Nachdem die r-PhyA- und r-AppA-Proben aus der Kolonne DEAE-Sepharose herausgelöst waren,
wurden von beiden Enzymen 45 Fraktionen von jeweils 4 ml aufgefangen,
um die Phytase-Aktivität
zu testen. Die für
die Proteolyse verwendeten Fraktionen besaßen eine spezifische Phytase-Aktivität von jeweils
9,6 und 8,1 U/mg Protein für
r-PhyA und r-AppA.
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Beispiel 3 – Wirkungen
bei der Verdauung mit Trypsin in den Phytase-Aktivitäten beider Enzyme.
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Nach
zweistündiger
Verdauung mit Trypsin kam es in den verbleibenden Phytase-Aktivitäten zwischen r-PhyA
und r-AppA zu beträchtlichen
Unterschieden (1A). Obwohl beide Enzyme mehr
als 85% ihrer ursprünglichen
Aktivitäten
bei den Verhältnissen
Trypsin/Phytase 0,001 und 0,005 aufrechterhielten, verlor r-AppA
jeweils 64 und 74% seiner ursprünglichen
Aktivität
bei den Verhältnissen
0,01 und 0,025. r-PhyA verlor währenddessen
jeweils nur 14 und 23% seiner ursprünglichen Aktivität. Aufgrund
des sichtlichen Unterschiedes in der Empfindlichkeit dieser beiden
Enzyme bei der Verdauung mit Trypsin bei einem Verhältnis 0,01
wurde eine Zeitstudie mit diesem Verhältnis durchgeführt. Bis
zur zweistündigen
Verdauung mit Trypsin hielt r-PhyA 90% seiner ursprünglichen
Aktivität
weiter aufrecht (2). r-AppA verlor im Gegenzug 64, 77, 87 und 95%
seiner ursprünglichen
Aktivität
jeweils nach 1, 5, 30 und 120 Minuten andauernder Verdauung.
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Beispiel 4 – Wirkungen
bei der Verdauung mit Pepsin in den Phytase-Aktivitäten beider
Enzyme.
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Nach
zweistündiger
Verdauung mit Pepsin war die verbleibende Phytase-Aktivität von r-AppA
absolut unerwartet. Bei den Verhältnissen
0,001 und 0,002 blieb die Phytase-Aktivität unverändert oder stieg leicht. Bei
den Verhältnissen
0,005 und 0,01 erhöhte
sich die Phytase-Aktivität
um 30% im Vergleich zum Anfangswert. r-PhyA indessen verlor bei diesen hohen
Verhältnissen
58 und 77% seiner ursprünglichen
Aktivität (1B).
Aufgrund der beträchtlich
unterschiedlichen Reaktionen zwischen r-PhyA und r-AppA beim Verhältnis 0,005
wurde dieses Verhältnis
für eine
darauf folgende Zeitstudie verwendet. Dabei kam es zu einem stufenweisen
Anstieg der Phytase-Aktivität
während
der Zeit, in der r-AppA von 0 bis 30 Min. mit Pepsin inkubiert wurde.
Danach wurden keine zusätzlichen
Steigerungen beobachtet (2). r-PhyA verlor indessen 42,
73, 82 und 92% seiner ursprünglichen
Aktivität
nach jeweils 1, 5, 30 und 120 Minuten Inkubation.
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Beispiel 5 – Elektrophorese
in SDS-Polyacrylamid-Gel.
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Als
r-AppA mit Trypsin inkubiert wurde, baute sich das Enzymprotein
bei den Verhältnissen
von ungefähr
0,01 ab und war bei dem Verhältnis
von 0,025 unsichtbar. In den drei niedrigen Trypsinverhältnissen
gab es eine Anfangsbande bei ungefähr 28 kDa mit mehreren Banden
zwischen dieser Bande und dem intakten Protein. Diese Anfangsbande
reduzierte sich jedoch deutlich und die anderen Bande verschwanden
mit den höchsten
Trypsinverhältnissen
(3A). Es entstanden viele Zwischenbande, als r-PhyA
mit verschiedenen Mengen Trypsin inkubiert wurde und es gab mindestens
drei sichtbare Bande mit dem höchsten
Trypsinverhältnis
(3B). Eine einzige Bande bei ungefähr 8,4 kDa
wurde nachgewiesen, als r-AppA mit Pepsin im Verhältnis von über 0,002
inkubiert wurde (4A). Andererseits entstanden
bei der Proteolyse von r-PhyA mit verschiedenen Mengen Pepsin neben
einem Anfangsfragment von ungefähr
14 kDa schleppend viele diffuse Flecke (4B).
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Beispiel 6 – Wirkungen
der Proteolyse in der Hydrolyse von Phosphorphytat durch r-PhyA
und r-AppA.
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Als
r-AppA mit Sojamehl und verschiedenen Mengen Trypsin 2 h lang bei
37° C inkubiert
wurde, betrug der Rückgang
in der Freisetzung von Pi aus dem Sojamehl
3, 13, 34 und 52% bei den Verhältnissen
von jeweils 0,001, 0,005, 0,01 und 0,025 (5A). Der
Rückgang
bei r-PhyA betrug währenddessen
unter der gleichen Bedingung jeweils 3, 6, 13 und 28%. Bei der Zusetzung
von Pepsin zu r-AppA (Verhältnis
0.005) und dem Sojamehlgemisch ergab sich ein Anstieg von ungefähr 30% bei
der Freisetzung von Pi aus dem Sojamehl
im Vergleich zur Kontrolle (5B). Die
gleichen Behandlungen bewirkten im Gegenzug einen Rückgang von
mehr als 50% bei der Freisetzung von Pi durch
r-PhyA.
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Bis
zu diesem Zeitpunkt waren keine spezifischen Daten über die
Empfindlichkeiten mikrobieller Phytasen für Trypsin und Pepsin vorhanden.
In dieser Studie wurden zwei rekombinante teilweise gereinigte Phytasen
mit einer einzigen Protease Verdauungen unterworfen und die Wirkungen
bei der Proteolyse auf ihre verbleibenden Aktivitäten und
ihre Fähigkeit,
Phosphorphytat aus Sojamehl freizusetzen, gemessen. Diese Ergebnisse
bewiesen, dass r-PhyA resistenter gegen Trypsin und weniger resistent
gegen Pepsin ist als r-AppA. Die Proteolysemuster dieser beiden
Phytasen, die durch eine SDS-PAGE-Analyse gezeigt werden sind ebenfalls
deutlich unterschiedlich. Diese unterschiedlichen Empfänglichkeiten
für Proteasen
zwischen r-PhyA und r-AppA können
vermutlich mit den Charakteristiken ihrer primären Aminosäuren-Sequenzen und der Peptidfaltung
in Zusammenhang stehen, da zwischen diesen beiden Enzymen eine geringe
Homologie (–15%)
in den Aminosäuren-Sequenzen besteht
(17, 18). Dabei ist allerdings Vorsicht geboten, wenn man den Molekularmechanismus
der Phytasenproteolyse bedenkt, der über die ursprüngliche
Reichweite der vorliegenden Untersuchung hinausgeht. Kürzlich erzielte
Fortschritte in der Kristallisierung und (oder) der Voruntersuchung
durch Röntgenstrahlen
der Phytase phyA (26) und von einer Phytase von E. coli (27) könnten zum
Verständnis
der strukturellen Base in Bezug auf ihre Proteolysereaktionen beitragen.
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r-AppA
zeigte in der verbleibenden Phytase-Aktivität nach der Verdauung mit Pepsin
unerwartet einen Anstieg um 30%. Mit Pepsinpräsenz setzte dieses Enzym ebenfalls
30% mehr Pi aus Sojamehl frei. Aus der Analyse
durch SDS-PAGE ergibt sich, dass während unterschiedlicher Inkubationszeiträume r-AppA
durch das Pepsin in kleine Peptide deutlich abgebaut wird. Es können wahrscheinlich
Polypeptide entstehen, die gegen das Pepsin mit einer höheren Phytase-Aktivität als das
intakte Protein r-AppA potentiell resistent sind. Obwohl die Analyse
durch SDS-PAGE keine spezifische Information über solche Peptide bot, wurde
bewiesen, dass das Pepsin natürliche
oder synthetische Proteine in aktive Polypeptide umwandelt, so wie
beispielsweise die Umwandlung von Schweineendothelin in aktives
Endothelin mit 21 Überresten
(28). Das Pepsin kann ebenfalls die Struktur und Funktionen bestimmter
Proteine modulieren (29, 30). Wie oben erwähnt könnte die Verfügbarkeit
der jüngsten
Daten über
die Kristallisation der phyA (26) und der Phytasen von E. coli (27)
die an den Ort des Gens appA gelenkten Mutagenesen oder Deletionen
erleichtern. Es kann somit möglich
sein, den Molekularmechanismus für
den Anstieg der Phytase-Aktivität
von r-AppA in Zusammenhang mit der Pepsin-Hydrolyse zu entdecken.
Trotz der biochemischen Ungewissheit in Bezug auf die gegen Pepsin
resistenten Peptide von r-AppA
besitzt diese Entdeckung eine große Nutritionsimplikation. Aufgrund
der Tatsache, dass das Pepsin, eine gut beschriebene aspartische
Protease, die die hauptsächliche
Protease im Magen ist (31), könnte
ein Phytase-Polypeptid, das gegen Pepsin resistent ist, die Ergänzung der
Nahrung mit einem geringen Enzymniveau, das eine ausreichende Aktivität besitzt,
ermöglichen.
Die Kosten für
den Einsatz von Nahrungsphytasen in der Tierproduktion würden so
gesenkt werden.
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Es
ist schwierig, die Aktivitätenniveaus
der in der vorliegenden Studie verwendeten Proteasen mit denen der
physiologischen Bedingungen zu vergleichen, da die Pepsin- und Trypsinkonzentrationen
in vivo nicht gut beschrieben wurden. Bekannt geworden ist eine
durchschnittliche Trypsin-Aktivität von 20 bis 25 U/mg Protein
im Schweinedarm (32), die viel größer ist als die in diesem Dokument
verwendeten Dosen. Verwendet wurden jedoch mehrere Trypsin- und
Pepsinniveaus mit Unterschieden in einem Bereich des 10- bis 25-fachen zwischen
den geringsten und den höchsten
Niveaus. Außerdem
wurde die Freisetzung von Pi durch r-AppA oder
r-PhyA unter Vorhandensein von Pepsin oder Trypsin aus Sojamehl
gemessen, eine simulierte in vivo-Verdauungsbedingung. Obwohl sowohl
r-AppA als auch r-PhyA teilweise rein waren, weisen alle Daten konstant
auf verschiedene Umsetzungsmuster dieser beiden rekombinanten Enzyme
in Bezug auf Pepsin und Trypsin hin. Diese Beobachtung in vitro
kann daher unter den physiologischen Bedingungen zutreffend sein.
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Beispiel
7 – Materialien
und Methoden für
die Beispiele 8–12
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Isolierung
und Identifikation von Bakterienkolonien, die eine Phytase produzieren.
Wir erhielten die Dickdarminhalte von (3 Wochen alten) Hampshire-Yorkshire-Duroc-Schweinen,
die in Gefangenschaft auf dem Schweinegut der Universität von Cornell
aufgewachsen waren. Diese Schweine wurden mit einer zweckgemäßen Nahrung
aus Mais-Sojamehl gefüttert.
Unmittelbar nachdem die Schweine geschlachtet wurden, wurde der
Dickdarminhalt mit sterilen Methoden entnommen und unter anaeroben
Bedingungen in sterilen Plastiktüten
frisch gehalten. Eine 10 g schwere Probe wurde mit 190 ml eines
Glukosemediums mit anaerober Flüssigkeit
des Pansens in einem 250 ml- Erlenmeyerkolben mit Gummipfropfen
versetzt. Das Gemisch wurde 3 Min. lang in einer CO2-Umgebung
kräftig
geschüttelt.
Es erfolgten in Reihen angeordnete Verdünnungen entsprechend nacheinander.
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Die
verdünnten
Proben wurden 3 Tage lang bei 37° C
in einem modifizierten Medium aus Pansen-Glukose-Zellbiose-Agar-Fluidum,
die unlösliches
Kalziumphytat enthielt, kultiviert (43, 44). Die Bänder mit
einem hellen Bereich wurden als potentielle Produzenten von intra-
und extrazellularer Phytase-Aktivität getestet. Die Phytase-Aktivität wurde
gemessen, wobei Natriumphytat als Substrat verwendet wurde (24).
Eine Phytaseeinheit (PU) wurde als die Aktivität definiert, die ein μmol anorganischen
Phosphor bei 37° C
pro Minute aus Natriumphytat freisetzt. Gemäß den Vorschriften des Herstellers
(Sigma, St Louis, MO) wurde die Phosphatasesäure-Aktivität getestet, wobei p-Nitrophenylphosphat
(P-NPP) als Substrat verwendet wurde. Die Identifikation der ausgewählten Kolonie
wurde im Diagnostischen Labor des Cornell Veterinary College (Ithaca,
NY) durchgeführt.
Die morphologischen und physiologischen Charakteristika der isolierten
Kolonie wurden mittels herkömmlicher
Methoden bestimmt.
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DNS-Erweiterung
und -Seguenzierung. Aufgrund der Tatsache, dass die Kolonie die
größten Phosphatasesäure- und
Phytase-Aktivitäten
produzierte, wurde es als ein E. coli-Stamm identifiziert; um das
Gen zu isolieren, wurden aus der DNS-Sequenz des Gens der Phosphatasesäure mit
einem pH-Wert von 2,5 von E. coli abgeleitete Primer verwendet (appA,
Zugriffsnummer auf die GeneBank 145283) (18). Primer: Pfl [direkt:
1–22]:5'-TAAGGAGCAGAAACAATGTGGT-3' (SEQ. ID. Nr. 4),
E2 [direkt: 254–264]:5'-GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA-3' (SEQ. ID. Nr. 5)
und K2 [umgekehrt: 1468–1491]:5'-GGGGTACCTTACAAACTGCACG-3' (SEQ. ID. Nr. 6)
wurden in den Einrichtungen für
die Synthese von Oligonukleotiden der Universität von Cornell synthetisch hergestellt.
Die vollständige
Sequenz und der Kodierungsbereich wurden erweitert, wobei jeweils
die Primer [Pf1-K21] y [E2-K2] verwendet wurden. Das PCR-Reaktionsgemisch
(100 μl)
enthielt 500 ng DNS-Genom als Muster, 100 pmoles von jedem Primer,
5 U DNS-Polymerase AmpliTaq (Perkin Elmer, Norwalk, CT), 10 mM Tris-HCl,
pH 8,3, 50 mM KCL, 12,5 mM MgCl2 und 200 μM von jedem
dNTP (Promega, Madison, WI). Die Umsetzung wurde im GeneAmp PCR
System 2400 (Perkin Elmer) ausgeführt. Das Temperaturprogramm
umfasst 1 Zyklus bei 94° C
(3 Min.), 30 Zyklen mit [94° C
(0,8 Min.), 54° C
(1 Min.) und 72° C (2
Min.)] und 1 Zyklus bei 72° C
(10 Min.). Die erweiterten PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese
in einem 1 %igem Agargel unter dem Fusionspunkt getrennt (Gibco
BRL, Grand Island, NY). Ein Teil des Gels, das das Band in erwarteter
Größe enthielt,
wurde aufgespaltet und die DNS mit dem Test-Kit GENECLEAN II (Bio101,
Vista, CA) herausgelöst.
Die PCR-Produkte wurden in den Einrichtungen des DNS-Dienstes der
Universität
von Cornell sequenziert, wobei der automatische Sequencer Taq Cycle
mit Terminatoren Dye Deoxy (Applied Biosystems, Forster City, CA)
verwendet wurde. Die Sequenzierungsexperimente wurden fünfmal durchgeführt und
die aus anderen Phosphatasesäuren
und Phytasen abgeleitete Amino-Sequenz angeordnet, wobei das multiple
alignment Programm CLUSTAL BLAST verwendet wurde (45). Die beiden
identifizierten PCR-Fragmente [Pf1-K2] und [E2-K2] wurden im Text
fortlaufend jeweils als appA2 und appA2 beschrieben. Zu komparativen
Zwecken wurde das Gen appA aus E. coli BL21 (DE3) erweitert, wobei
die Primer [E2-K2] verwendet
wurden. Die PCR-Umsetzungen und die erhaltenen Fragmente wurden
so wie oben beschrieben verarbeitet.
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Subklonung
und Bau von Expressionsvektoren. Gemäß der Vorschriften des Herstellers
wurden die PCR-Produkte [E2-K2] und [Pf1-K2] in dem Vektor pGEM®T-easy (Promega) geklont
und in TOP10F transformiert, um die positiven Bänder auszuwählen. Die isolierten Fragmente
appA2 und appA wurden wie in den Vorschriften des Herstellers beschrieben
im pPICZαA
(Invitrogen, San Diego, CA) an die Orte EcoRI und KpnI eingesetzt.
Die Konstruktionen wurden in TOP10F-Zellen transformiert, die auf
Platten aus LB-Medium, das 25 μg
Zystein/ml enthielt, gelegt wurden. Anschließend wurden die positiven Bänder kultiviert,
um die DNS auf die Transformation vorzubereiten.
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Transformation
und Expression in Hefen. Gemäß den Vorschriften
des Herstellers wurde der Stamm X33 von Pichia pastoris (Invitrogen)
in YPD-Medium kultiviert und auf die Transformation vorbereitet.
2 μg Plasmid-DNS
wurden linearisiert, wobei BglII verwendet wurde und anschließend durch
Elektroporation in Pichia transformiert. Nach der dreistündigen Inkubation
bei 30° C
in 1 M Sorbitol ohne Ausschütteln
ordneten sich die Zellen auf einer Platte aus YPD-Zystein-Agar-Medium, um
die Integration des im Bereich 5'AOX1
der Wirts-Chromosomen-DNS transformierten Gens auszuwählen. Nach
2 Tagen wurden die Transformanten 24 h lang in geringen Medien mit
Glyzerin (GMGY-Medium) inkubiert. Nachdem der Boden eine Dichte
von ungefähr
2,5 × 108 Zellen/ml (DO600 =
5) erreichte, wurden die Zellen zentrifugiert (3500g, 5 Min.) und
dann wieder in Medium mit 0,5%igem Methanol (GIMMY) suspendiert,
um die Expression des Gens der Phytase zu induzieren.
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RNS-Quantifikation.
Nach der Induktion wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten die gesamte
RNS aus den Transformanten appA2 herausgezogen. Die RNS wurde in
1 %igem Agar-Formaldehyd-Gel getrennt, auf eine Hybond N+ Membran
(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) durch Kapillaritätsübertragung und
zweiminütiger
Durchkreuzung mit UV-Licht übertragen.
Anschließend
wurde die Membran 4 h lang bei 42° C
prähybridisiert.
Die Probe war das PCR-Fragment appA2 [E2-K2] und wurde mit [α–32P]-dCTP (DuPont, Boston, MA) markiert,
wobei DNS-Perlen
als ready-To-Go-TM Kennzeichnung (Amersham Pharmacia Biotech) verwendet
wurden. Die Membran wurde eine Nacht lang bei 42° C mit der Probe hybridisiert
und dreimal 20 Min. lang bei 25° C
und zweimal bei 50° C
in SSC 2 × (0,15
M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 1 %igem Dodecylsulfonat (SDS) und
schließlich
zweimal 20 Min. lang bei 50° C
in SSC 0,2 × 0,1%igem
SDS gewaschen. Das Autoradiogramm wurde durch die zehnstündige Belichtung
der Membran auf einem Bildschirmverstärker einer Platte aus Imagen
BAS-III FUJI (Fuji, Japan) gewonnen und quantifiziert, wobei ein
Analysator Bio-Imagen (Kohshin Graphic Systems, Fuji, Japan) verwendet
wurde. Die Ergebnisse normalisierten sich mit den relativen Niveaus
RNSr 185.
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Reinigung
der ausgedrückten
Enzyme. Alle Vorgänge
wurden bei 4° C
ausgeführt.
Die beiden ausgedrückten
Enzyme r-appA und r-appA2 und die in A. niger ausgedrückte Phytase
r-phyA (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von BASF, Mt.
Olive, NJ) wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 7 mit zu 25% gesättigtem
Ammoniaksulfat wieder suspendiert. Die Suspension wurde 20 Min.
lang zu 25.000 g zentrifugiert. Der Überschuss wurde mit zu 75%
gesättigtem
Ammoniaksulfat unter Aufschütteln
12 h lang gemischt und das Gemisch 20 Min. lang zu 25.000 g zentrifugiert.
Das Sediment wurde anschließend
in 10 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7 wieder suspendiert und eine Nacht
lang gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die dialysierte Probe
wurde in eine DEAE-Sepharose
Kolonne (Sigma) gefüllt,
die mit 25 mM Tris-HCl, pH 7 ausgeglichenen war. Nachdem die Kolonne
mit 200 ml des gleichen Puffers gewaschen war, wurde die gebundene
Phytase mit 1 M NaCl in 25 mM Tris-HCl, pH 7 herausgelöst. Die
drei Fraktionen, die die höchsten
Phytase- und Phospahatsesäure-Aktivitäten zeigten,
wurden gemeinsam aufgefangen und für die Folgestudien eine Nacht
lang gegen 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 dialysiert.
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Elektrophorese
Analyse. Die Proteinkonzentration wurde durch die Methode Lowry
gemessen (21). Die Elektrophorese in nicht denaturiertem Gel und
die SDS-PAGE (zu
15%) wurden wie Laemmli es beschrieben hat ausgeführt (22).
Die Proteine in der SDS-PAGE verfärbten sich mit strahlendem
Coomassie-Blau R-250. Die Phosphatasesäure- oder Phytase-Aktivität auf den
nicht denaturierten Gelbanden wurden wie oben beschrieben nachgewiesen
(17). Nach der Elektrophorese wurde das Gel 20 Min. lang bei 25° C in 0,2%igem α-19 Naphtylphosphat
(oder Natriumphytat), 0,1 %igem Fast Gernt GBC-Salzen, 1 mM CaCl2 und dem Puffer 0,5 M Tris-HCl, pH 7,0 inkubiert.
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Deglykosilation
der Enzyme. Gemäß der Vorschriften
des Herstellers (New England Biolabs, Bervely, MA) erfolgte die
Deglykosilation von r-appA2, wobei 4 h lang bei 7° C 0,3 UI
Endoglykosidase Hf(Endo Hf)
verwendet wurde. Die Deglykosiladeproteine wurden in einem 15%igen
SDS-PAGE wie oben beschrieben analysiert.
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Eigenschaften
des Enzyms und Hydrolyse von Phosphorphytat in Sojamehl. Die Phytase-Aktivität bei verschiedenen
pH-Werten wurde bei 33° C
bestimmt, wobei drei unterschiedliche Puffer verwendet wurden. Der
optimalen Temperatur für
jedes Enzym wurde der optimale pH-Wert zugeordnet. Die Werte Km und Vmax für r-appA2
und r-appA wurden
beim optimalen pH-Wert jedes Enzyms und bei 37° C bestimmt. Die Phosphorphytat-Hydrolyse
durch r-appA2 wurde mit der von r-appA und r-phyA verglichen. Es
wurden verschiedene Mengen der mit 1 g Sojamehl gereinigten Enzyme
in 5 ml Puffer (10 mM HCl oder 0,2 M Citrat) bei ihren jeweiligen
optimalen pH-Werten
(2,5 für
r-appA, 3,5 für
r-appA2 und 5,5 für
r-phyA) 2 h lang bei 37° C
inkubiert. Die Freisetzung von anorganischem Phosphor wurde wie
oben beschrieben bestimmt (25). Die Wärmebeständigkeit dieser drei Enzyme
wurde verglichen. Jedes Enzym (2 mg/ml) wurde 1:200 mit 0,2 M Natriumcitrat,
pH 5,5 versetzt und 20 Min. lang bei 25, 37, 55, 65, 80 und 100° C inkubiert.
Die Proben wurden 30 Min. lang in Eis gelegt und die remanente Phytase-Aktivität bei 37° C gemessen.
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Angewendeter
statistischer Test. Der Test U Mann-Withney wurde für alle statistischen
Ermittlungen angewendet (46).
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Beispiel 8 – Screening
und Identifikation von Bakterienkolonien.
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Insgesamt
93 Kolonien wurden isoliert. Mehr als 70 Kolonien besaßen eine
intrazellulare Phytase-Aktivität,
die geringer als 500 U/g Protein war und 6 Kolonien besaßen eine
Aktivität,
die größer als
1.000 U/g Protein war. Die Kolonie 88 bewies die höchste Phytase-Aktivität (2.927
U/g Protein) mit einer Phosphatasesäure-Aktivität (1.391 U/g Protein). Sie
wurde daher für
zusätzliche
Experimente ausgewählt.
Die Produktion von Phytase- und Phosphatasesäure-Aktivitäten der Kolonie war in Sweet
E größer als
im Medium der Kultur LB und unter anaeroben Bedingungen größer als
unter aeroben. Die Kolonie wurde nachträglich als eine gram-negative
E. coli identifiziert. Dies wurde insbesondere durch das Fermentationsprofil
des Substrats bestätigt.
-
Beispiel 9 – Klonung
und Sequenzierung des Gens appA2 von Schweine-E. Coli
-
Die
Fragmente 1482 pb (vollständig)
und 1241 (Kodierungsbereich) wurden aus dem DNS-Genom der Kolonie
88 erweitert (6). Außer dem Gen appA von E. coli
und dem Gen der Phytase Bacillus wurden keine bedeutenden Homologien
in den Datenbanken GenPro databank (Version 61), GeneBank oder EMBL
gefunden, wobei das Programm BLAST verwendet wurde. Die vollständige Nukleotid-Sequenz
besitzt jeweils 47 und 95% Homologie mit dem Gen der Phytase DS
11 von Bacillus sp. (Zugriffsnummer auf GenBank 3150039) und mit
appA von E. coli. Trotz dieser hohen Sequenzhomologie bestanden
zwischen appA und appA2 und ihren kodierenden Polypeptiden deutliche
Unterschiede. Erstens waren sieben Aminosäuren in den abgeleiteten Peptid-Sequenzen
verschieden: eine im Signalpeptid, L4F; sechs im Kodierungsbereich,
S102P, P195S, S197L, K202N, K298M und T299A. Zweitens war der nicht übertragene
Bereich 73 pb, der sich zwischen der Führersequenz und dem Kodierungsbereich
befindet, 6 pb kürzer
als der von appA. Die drei Orte wahrscheinlicher N-Glykosilation
befanden sich jedoch weiterhin an den gleichen Orten des Kodierungsbereiches.
Das DNS-Fragment wurde fünfmal
sequenziert, um diese Unterschiede zu überprüfen. Verglichen mit phyA, besaß appA2
nur eine 19%ige Homologie in der Aminosäure-Sequenz. Die Sequenz wurde
an die Datenbank GeneBank unter der Zugriffsnummer 250016 übermittelt.
-
Beispiel 10 – Expression
von appA2 in Pichia pastoris.
-
Die
Phytase- und Phosphatasesäure-Aktivitäten von
insgesamt 42 Transformanten wurden in verschiedenen Bereichen analysiert.
Drei Tage nach der Induktion mit Methanol produzierten 13 Transformanten eine
Phytase-Aktivität
von durchschnittlich 18 bis 114 U/ml und eine Phosphatasesäure-Aktivität von 7
bis 42 U/ml. 22 Transformanten von appA drückten währenddessen eine Phytase-Aktivität von 25
bis 130 U/ml und eine Phosphatasesäure-Aktivität von 59 bis 85 U/ml aus. Der Transformant
appA2, der die höchsten
Aktivitäten aufwies
wurde in den Zeitstudien (7) und in
weiteren Studien verwendet. Das RNS-m-Niveau von appA2 erreichte
bei 4 h den Höhepunkt
(7 und 8) und erhielt die Höhe bis zu
12 h aufrecht und sank dann beträchtlich
ab. Ein RNS-m-Signal von appA2 in den Kontrollzellen wurde nicht
nachgewiesen. Sowohl die extrazellularen Phytase- als auch Phosphatasesäure-Aktivitäten, die
durch den Transformant produziert wurden, stiegen abrupt zwischen
0 und 24 Stunden an. Danach blieb die Phosphatasesäure-Aktivität nahezu
unverändert,
während
die Phytase-Aktivität
im Laufe der Zeit viel geringer stieg als in der Anfangsphase.
-
Beispiel 11 – Charakterisierung
der gereinigten Enzyme
-
Die
spezifische Phytase-Aktivität
der gereinigten Enzyme r-appA2, r-appA und r-phyA betrug jeweils 28,9,
30,7 und 19,8 U/mg Protein. Das gereinigte r-appA2 wies eine höhere Affinität für Natriumphytat
auf als für
pNPP, wie die Werte Km und Vmax zeigen
(Tabelle 1). Als Natriumphytat als Substrat verwendet wurde, wichen
die pH-Kurven der
drei Enzyme beträchtlich
voneinander ab.
-
TABELLE
1 Kinetische
Parameter der gereinigten r-appA und r-appA2, die in Pichia pastoris
ausgedrückt
wurden.
-
Der
optimale pH-Wert befand sich zwischen 2,5 und 3,5 für r-appA2,
bei 2,5 für
r-appA und zwischen 2,5 und 5,5 für die Phytase r-phyA (9).
Die beiden Enzyme von E. coli wiesen jedoch den gleichen optimalen
pH-Wert (2,5) für
das Substrat pNPP auf. Außerdem
besaßen
sowohl r-appA als auch r-appA2 die gleiche optimale Temperatur (55° C), die
leicht unter der von r-phyA lag. Diese beiden Enzyme besaßen ebenfalls sehr ähnliche
Thermostabilitäten
der Phytase-Aktivität,
die zwischen 37 und 60° C
leicht höher
und zwischen 65 und 100° C
leicht geringer waren als die von r-phyA. Die Phosphatasesäure-Aktivität von remanentem r-appA2
zeigte sich nach unterschiedlichen Temperaturbehandlungen in dem
nicht denaturierten Gel als eine einzige Bande bei 71 kDa (10).
Die Aktivität
wurde zu einem großen
Teil eingebüßt oder
verschwand bei 65 oder 80° C
vollständig,
wurde jedoch bei 100° C
teilweise auf irgendeine Weise wiederhergestellt. Als die drei mit
Sojamehl gereinigten rekombinanten Enzyme inkubiert wurden, setzte
das Protein r-appA2 bedeutend mehr Phosphor aus Phytat frei als
die anderen beiden Enzyme (11).
-
Beispiel 12 – Wirkungen
der Deglycosylation auf die Eigenschaften der Enzyme.
-
Nachdem
die drei gereinigten Enzyme mit β-Mercaptoäthanol und
mit Endo Hf behandelt wurden, gingen mehr
als 90% ihrer Aktivitäten
sowohl bei Natriumphytat als auch bei pNPP verloren. Nur Endo Hf jedoch besaß keine bedeutende Wirkung
auf seine katalytischen Aktivitäten.
Aus der Deglycosylation von r-appA2 entstand eine einzige Bande
mit einem ersichtlichen Mr von 46,3 kDa aus drei Banden, die in
den Glykosyladformen mit ersichtlichen Mr von 50,5, 53 und 56 kDa
voneinander abwichen. Dies ergab einen Glykosylationsbereich von
zwischen 8,3 und 17,3 % für
r-appA2.
-
In
den oben stehenden Beispielen wurde ein E. coli-Stamm isoliert,
der aus dem Inhalt des Schweinekolons eine Phytase produzierte.
Indem Primer verwendet wurden, die auf dem Gen der Phosphatasesäure von
E. coli (appA) mit einem pH-Wert von 2,5, das von Dassa et al. beschrieben
wurde (18), basieren, wurde ein DNS-Fragment 1487 pb aus dem DNS-Genom des
Stammes erweitert. Dieses Fragment, das als appA2 bezeichnet wurde,
kodiert ein Protein mit 433 Aminosäuren mit 3 wahrscheinlichen
Orten für
eine N-Glykosylation. Das abgeleitete Peptid enthält sowohl
das N-terminal Motiv (RHGXRXP, Position: 38–44)(SEQ. ID Nr. 7) als auch
das C-terminal Motiv (HD, Position: 325–326), Eigenschaften der Histidin-Phosphatasensäuren (8). Außerdem entsteht
eine Führersequenz
von 30 Aminosäuren
und eine nicht übertragene
Region 73 pb. Unter den in den Datenbanken verfügbaren Sequenzen teilen nur
die Gene der Phosphatasesäure
mit einem pH-Wert von 2,5 appA von E. coli und der Phytase DS11
von Bacillus sp. mit appA2 eine gewisse Homologie (jeweils 95% und
47% in der Nukleotid-Sequenz). Trotz der großen Homologie zwischen appA
und appA2 kommt es zu deutlichen Unterschieden zwischen diesen beiden
Genen und ihren jeweiligen Proteinen. Erstens weichen sieben Aminosäuren zwischen
den beiden abgeleiteten Polypeptid-Sequenzen voneinander ab: eine im
Signalpeptid und sechs im Kodierungsbereich. Zweitens war die nicht übertragene
Sequenz 73 pb zwischen der Führersequenz
und dem Kodierungsbereich 6 pb kürzer
als die von appA. Alle diese Unterschiede wurden in fünf wiederholten
Analysen der Nukleotidsequenzierung bestätigt.
-
Wenn
sich diese beiden Gene im gleichen Wirt, Pichia pastoris, transformieren,
weisen die ausgedrückten
Proteine r-appA und r-appA2 noch beträchtlichere Unterschiede in
ihren biochemischen Charakteristiken auf. Obwohl beide den gleichen
optimalen ph-Wert von 2,5 für
pNPP aufweisen, besitzt r-appA2 einen breiteren optimalen pH-Wert,
der zwischen 2,5 und 3,5 liegt, als r-appA mit 2,5 für Natriumphytat
besitzt. Im Vergleich zu r-appA besitzt r-appA2 eine größere Affinität für beide
Substrate, wie es durch die Werte geringer als Km und
größer als
Vmax bewiesen ist, und setzt mehr Phosphor
aus Phytat in Sojamehl in vitro frei. Damit scheint die katalytische
Funktion von r-appA2 in Bezug auf die Phosphorhydrolyse aus Phytat
oder Phosphat besser zu sein als die von r-appA. Offensichtlich
kann die Veränderung
von sechs Aminosäuren
im Polypeptid nicht nur eine Polymorphie des Enzyms bewirken, sondern
eher für
die beobachteten kinetischen Unterschiede verantwortlich sein. Nur
vernünftig
erscheint daher die Aussage, dass appA2 ein von appA verschiedenes Gen
ist, obwohl es einer besser definierten strukturellen Analyse bedarf,
um die Beziehung zwischen den spezifischen Veränderungen dieser beiden Aminosäuren und
den funktionellen Veränderungen
dieser beiden Enzyme aufzuklären.
Notwendigerweise wird das Kristall beider Enzyme für zukünftige strukturelle
Studien produziert werden müssen
(27).
-
Es
wurde oben stehend darüber
informiert, dass mehrere Enzyme von E. coli pNPP oder Natriumphytat
hydrolytisch abspalten (18, 19, 39–41). Greiner et al. (39) charakterisierten
zwei Phytasen von E. coli (P1 und P2). Sie fanden heraus, dass die
gereinigte Phytase P2 von E. coli eine große Identität mit der Phosphatasesäure mit
einem pH-Wert von 2,5 von E. coli in der N-terminal Sequenz, chemische
und kinetische Eigenschaften teilt. Sie schlugen daher vor, dass
diese beiden Enzyme das gleiche Protein sein sollten und dass die Phosphatasesäure mit
pH 2,5 von E. coli als eine Phytase betrachtet werden sollte. Tatsächlich können sowohl die
Phosphatasesäure
r-appA als auch r-appA2 nicht nur Phytat in gereinigter chemischer
Form oder in natürlicher
Nahrung hydrolytisch abspalten, sondern auch eine höhere Affinität für Natriumphytat
als für
pNPP besitzen. Infolgedessen könnten
diese beiden Enzyme als Phytasen klassifiziert werden.
-
Verglichen
mit der gereinigten Phytase (39) besitzt r-appA2 nach der Deglykosilation
das gleiche Temperaturoptimum (55° C)
und eine ähnliche
Molekularmasse (46,3 kDa). Auf der Grundlage der Analysen in nicht
denaturierten SDS-PAGE-Gelen ist das Protein auch monomer. r-appA2
besitzt jedoch ein saureres pH-Optimum (2,5 bis 3,5 gegenüber 4,5
für P2)
und enthält
durch die N-Glykosilation in Pichia 8 bis 14% Zuckerreste. Die Deglykosilation
von r-appA mit Endo Hf reduziert den molekularen
Umfang, hat aber eine geringe Auswirkung auf seine Aktivität. Im Gegenzug
reduzieren sich die Phytase- und Phosphatasesäure-Aktivitäten merklich, wenn das Protein
mit P-Mercaptoäthanol
und Endo Hf inkubiert wird. Dies zeigt an,
dass die Disulfidverbindungen für
ihre Phytase-Aktivität
notwendig sind, wie es oben für
die Phytase von A. ficuum bewiesen wurde (47).
-
Auch
wenn bevorzugte Ausführungsformen
in diesem Dokument ausführlich
dargestellt und beschrieben wurden, wird es für einen Fachmann evident sein,
dass mehrere Modifikationen, Zusätze,
Substitutionen und ähnliches
erfolgen können,
ohne die Essenz der Erfindung zu verändern und so sind wir deshalb
der Meinung, dass diese innerhalb der Reichweite der Erfindung liegen,
so wie es in den nachfolgenden Patentansprüchen definiert ist.
-
Literatur
-
Die
folgenden in diesem Dokument zitierten Referenzen sind hiermit dieser
Anmeldung als Referenzen beigefügt.
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