MXPA04001802A - Plantas y partes de plantas autoprocesadoras. - Google Patents

Plantas y partes de plantas autoprocesadoras.

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MXPA04001802A
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Abstract

La invencion proporciona polinucleotidos, preferiblemente polinucleotidos sinteticos que codifican enzimas procesadoras que son optimizadas para expresion en plantas. Los polinucleotidos codifican enzimas procesadoras mesofilicas, termofilicas o hipertermofilicas, que son activadas bajo condiciones de activacion adecuadas para actuar sobre el sustrato deseado. Tambien se proporcionan plantas y partes de plantas transgenicas "auto-procesadoras", por ejemplo, granos que expresan una o mas de estas enzimas y tienen una composicion alterada que facilita el procesamiento de la planta y grano. Tambien se proporcionan metodos para hacer y usar estas plantas, por ejemplo para producir productos alimenticios que tienen sabor mejorado y para producir sustratos fermentables para la produccion de etanol y bebidas fermentadas.

Description

PLANTAS Y PARTES DE PLANTAS ADTOPROCESADORAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Número de Serie 60/315,281, presentada el 27 de agosto del 2001, la cual es incorporada en la presente por referencia. CAMPO DE LA INVENCION La presente invención generalmente se relaciona al campo de biología molecular de plantas y más específicamente, a la creación de plantas que expresan una enzima procesadora que proporciona una característica deseada a la planta o productos de la misma. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las enzimas son usadas para procesar una variedad de productos de la agricultura tales como madera, frutos y vegetales, almidones, jugos y similares. Típicamente, las enzimas procesadoras son producidas y recuperadas en una escala industrial desde varias fuentes, tal como la fermentación microbiana (a-amilasa de Bacillus) , o aislamiento de plantas (ß-galactosidasa de café o papaina de partes de plantas) . Las preparaciones de enzimas son usadas en diferentes aplicaciones de procesamiento al mezclar la enzima y el sustrato bajo las condiciones apropiadas de humedad, temperatura, tiempo y mezclado mecánico tal que la reacción enzimática es alcanzada de una manera comercialmente viable. Los métodos implican etapas separadas de producción de enzima, fabricación de una preparación de enzima, mezclado de la enzima y el sustrato, y sujeción de la mezcla a las condiciones apropiadas para facilitar la reacción enzimatica. Un método que reduce o elimina el tiempo, energía, mezclado, gastos de capital y/o costos de producción de enzima, o que da por resultado productos mejorados o novedosos, seria útil y beneficioso. Un ejemplo de donde tales mejoras son necesarias está en el área de la molienda de maiz. Actualmente el maiz es molido para obtener almidón de maiz y otros co-productos de la molienda del "maiz tal como el "alimento de gluten de maiz, harina de gluten de maiz y aceite de maiz. El almidón obtenido del proceso frecuentemente es además procesado en otros productos tales como almidones y azúcares derivados, o fermentado para hacer una variedad de productos incluyendo alcoholes o ácido láctico. El procesamiento del almidón de maiz frecuentemente implica el uso de enzimas, en particular, enzimas que hidrolizan y convierten el almidón en azúcares fermentables o fructosa (a- y gluco-amilasa, a-glucosidasa, glucosa isomerasa y similares) . El proceso usado comercialmente hoy en dia es intensivo de capital ya que la construcción de molinos muy grandes es requerida para procesar el maiz en escalas requeridas para la efectividad en costo razonable. Además, el proceso requiere la fabricación separada de enzimas hidrolizantes o modificantes de almidón y luego la maquinaria para mezclar la enzdLma y el sustrato para producir los productos de almidón hidrolizados . El proceso de recuperación de almidón- del grano de maiz es bien conocido e implica un proceso de molienda húmeda. La molienda húmeda del maiz incluye las etapas de empapar la semilla de maiz, moler la semilla de maiz y separar los componentes de la semilla. Las semillas son empapadas en un tanque de empapamiento con un flujo a contracorriente de agua a aproximadamente 120°F y las semillas permanecen en el tanque de empapamiento durante 24 a 48 horas . Esta agua de empapamiento típicamente contiene dióxido de azufre a una concentración de aproximadamente 0.2% en peso. El dióxido de azufre es empleado en el proceso para ayudar a reducir el crecimiento microbiano y también para reducir los enlaces de disulfuro en las proteínas de endosperma para facilitar la separación del almidón-proteína más eficiente. Normalmente, aproximadamente 0.59 galones de agua de empapamiento es usada por 35.23 litros de maíz. El agua de empapamiento es considerada de desecho y frecuentemente contiene niveles indeseables de dióxido de azufre residual. Las semillas empapadas luego se les quita el agua y se someten a conjuntos de molinos de tipo de fricción. El primer conjunto de molino de tipos de fricción rompe Las semillas liberando el germen del resto de la semilla. Un molino de tipo de fricción comercial adecuado para el negocio de molienda húmeda es vendido bajo el nombre comercial Bauer. La centrifugación es usada para separar el germen del resto de la semilla. Un separador de centrifugación comercial típico es el separador centrífugo Merco. Los molinos de fricción y los separadores centrífugos son artículos costosos grandes que usan energía para funcionar. En la siguiente etapa del proceso, los componentes de la semilla restantes incluyendo el almidón, hollejo, fibra y gluten son sometidos a otro conjunto de molinos de fricción y pasados a través de un conjunto de cribas dé lavado para separar los componentes de fibra del almidón y el gluten (proteína de endosperma) . El almidón y el gluten pasan a través de las cribas mientras que la fibra no pasa. La centrifugación o una tercera molienda seguido por la centrifugación es usada para separar el almidón de la proteína de endosperma. La centrifugáción produce una suspensión espesa de almidón a la cual se le elimina el agua, luego se lava con agua fresca y se seca a aproximadamente 12% de humedad- El almidón sustancialmente puro es típicamente además procesado mediante el uso de enzimas . La separación del almidón de los otros componentes del grano es realizada debido a que la remoción del tegumento, el embrión y las proteínas de endosperma permite eficientemente poner en contacto el almidón con las enzimas procesadoras, y los productos de hidrólisis resultantes están relativamente libres de contaminantes de os otros componentes de la semilla. La separación también asegura que los otros componentes del grano sean efectivamente recuperados y puedan ser subsecuentemente vendidos como co-productos para incrementar los beneficios del molino. Después de que el almidón es recuperado del proceso de molienda húmeda, éste típicamente se somete a las etapas de procesamiento de gelatinización, licuefacción y dextrinización para la producción de maltodextrina y las etapas . subsecuentes de sacarificación, isomerizacióri · y refinamiento para la producción de glucosa, maltosa y fructosa. La gelatinización es empleada en la hidrólisis del almidón debido a que las enzimas actualmente disponibles no pueden fácilmente .hidrolizar el almidón cristalino. Para hacer el almidón disponible a las enzimas hídrolíticas, el almidón típicamente se hace en una suspensión espesa con agua (20-40% de sólido seco) y se calienta a la temperatura de gelificación apropiada. Para el almidón de maíz esta temperatura está entre 105-110°C. El almidón gelatinizado es típicamente muy viscoso y frecuentemente es diluido en la siguiente etapa llamada licuefacción. La licuefacción rompe algunos de los enlaces entre las moléculas de glucosa del almidón y es realizada enzimáticamente o a través del uso de ácido. Las enzimas de endo a-amilasa estables al calor son usadas en esta etapa., y en etapas subsecuentes de dextrinización. El grado de hidrólisis es controlado en la etapa de dextrinización para producir productos de hidrólisis del porcentaje deseado de dextrosa. La hidrólisis adicional de los productos de dextrina de la etapa de licuefacción es llevada a cabo por un número de diferentes exo-amilasas y enzimas de desrramificación, dependiendo de los productos que son deseados. Y finalmente, si se desea fructosa, entonces l énzima glucosa .isomerasa inmovilizada es típicamente empleada para convertir glucosa en fructosa. Los procesos de molienda seca para fabricar azúcares fermentables (y luego etanol, por ejemplo) del almidón de maiz facilita el contacto eficiente de las enzimas exógenas con el almidón. Estos procesos son menos intensivos en capital que la molienda húmeda pero las ventajas en costos significantes aún son deseables, ya que frecuentemente los co-productos derivados de estos procesos no son tan valiosos como aquellos derivados de la molienda húmeda. Por ejemplo, en la molienda seca del rr.aiz, la semilla es molida a un polvo para facilitar el concacco eficiente del almidón por las enzimas degradantes. Después de la hidrólisis de la enzima de la harina de maiz, los sólidos residuales tienen algo de valor alimenticio ya que ellos contienen proteínas y algunos otros componentes- Eckhoff recientemente describió el potencial para mejoras y puntos relevantes relacionados con la molienda seca en un artículo intitulado "Fermentation and costs of fuel etanol from corn with quick-germ procesa" (Appl. Biochem. Biotechnol, 34:41 (2001)). El método de "germen rápido" permite la separación del germen rico en aceite del almidón usando un tiempo de empapamiento reducido. Un ejemplo donde la regulación y/o nivel de las enzimas procesadoras endógenas en una planta puede dar por resultado un producto deseable es el maíz dulce. Las variedades típicas de maíz dulce son distinguidas de las variedades del maíz del campo por el hecho de que el maíz dulce no es capaz de los niveles normales de la bíosíntesis de almidón. Las mutaciones genéticas en los genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de almidón son típicamente empleadas en las variedades de maíz dulce para limitar la biosíntesis de almidón. Tales mutaciones están en los genes que codifican sintasas de almidón y ADP-glucosa pirofosforilasas (tales como las mutaciones azucaradas y superdulces) . La fructosa, glucosa y sacarosa que son los azúcares simples necesarios para producir la dulzura agradable que desean los consumidores del maíz fresco comestible, se acumulan en el endosperma en desarrolle de tales mutantes . Sin embargo, si el nivel de acumulación de almidón es demasiado alto, tal como .cuando el maíz se deja madurar por demasiado tiempo (cosecha tardía) o el almidón es almacenado durante un periodo excesivo antes de que sea consumido, el producto pierde dulzura y toma un sabor y sensación en la boca almidonado. La ventana de cosecha para el maíz dulce es por lo tanto muy reducida, y es limitada la vida en anaquel. Otra desventaja significante para el agricultor, quien planta variedades de maíz dulce, es que la utilidad de estas variedades está limitado exclusivamente al alimento comestible. Si un agricultor deseara proseguir la cosecha de su maíz dulce para el uso como alimento comestible durante el desarrollo de la semilla, el cultivo sería esencialmente una pérdida. El rendimiento y la calidad del grano del maíz dulce es pobre por dos razones fundamentales. La primera razón es que las mutaciones en la ruta de biosíntesis de almidón debilitan la maquinaria biosintética del almidón y los granos no se llenan completamente, causando que sea comprometidos el rendimiento y la calidad. En segundo ' lugar, debido a los altos niveles de azúcares presentes en el grano y la incapacidad para secuestrar estos azúcares como almidón, la resistencia descendente total de la semilla es reducida, lo cual exacerba la reducción del almacenamiento de nutrientes en el grano. Los endospermas de las semillas de variedad de maíz dulce son encogidos y colapsados, no se someten a la desecación apropiada y son susceptibles a enfermedades, la pobre · calidad del grano de maíz dulce tiene además implicaciones agronómicas; como pobre viabilidad de la semilla, pobre germinación, susceptibilidad de enfermedad de la plántula y pobre vigor de la plántula temprana que resulta de la combinación de los factores ocasionados por la acumulación de .almidón inadecuada. Asi, los pobres puntos de calidad del maíz dulce impactan al consumidor, agricultor/cultivador, distribuidor y productor de semillas. Asi, para la molienda seca, existe una necesidad por un método que mejore la eficiencia del proceso y/'o incremente el valor de los co-productos . Para la molienda húmeda, existe una necesidad por un método de procesamiento de almidón que no requiere al equipo necesario para el empapamiento prolongado, trituración, molienda y/o la separación de los componentes de la semilla. Por ejemplo, existe una necesidad para modificar o eliminar . la etapa de empapamiento en la molienda húmeda ya que esto reduciría la cantidad de agua de desecho que requiere evacuación, ahorrando de esta manera energía y tiempo, e incrementando la capacidad del molino {las semillas pasarían menos tiempo en los tanques de empapamiento) . También hay una necesidad para eliminar o mejorar el proceso de separar el endosperma que contiene almidón del embrión.
Breve Descripción de la Invención. La presente invención se dirige a plantas y partes de plantas autoprocesadoras y métodos para usar las mismas, La planta y partes de plantas autoprocesadoras de la presente invención son capaces de expresar y activar enzima (s) (mesofilica, - termofilica, y/o hipertermofilica) . En la activación de la enzima (s) (mesofilica, termofilica o hipertermofilica) la planta o parte de planta es capaz de autoprocesar el sustrato en el cual actúa para obtener el resultado deseado. La presente invención se dirige a un polinucleótido aislado, a) que comprende la SEQ ID NO:2, 4, 6, 9, 19, 21/25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 o 59 o el complemento de la misma, o un polinucleótido que híbrida- al complemento de cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 o 59 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de oí-amilasa, pululanasa, a-glucosidasa, glucosa isomerasa o glucosa amilasa o b) que codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 o 51 o un fragmento enzimáticaiiente activo de la misma. De preferencia, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido y un segundo péptido, en donde el primer polipéptido tiene actividad de a-amilasa, pululanasa, -glucosidasa, glucosa isomerasa o glucoamilasa . Mucho más de preferencia, el segundo péptido comprende un péptido de secuencia de señal/ que puede dirigir el primer polipéptido a una vacuola, reticülo endoplásmico, cloroplasto, granulo de almidón, semilla o pared celular de una planta. Por ejemplo, la secuencia de señal puede ser una secuencia de señal N-terminal de waxy, una secuencia de señal N-terminal de y-zeina, un dominio de enlace de almidón o un dominio de enlace de almidón C-terminal. Además están comprendidos polinucleótidos que hibridan al complemento de cualquiera . de la SEQ ID NO: 2, 9 o 52 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de -amilasa; al complemento de la SEQ ID NO: o 25 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de pululanasa; · al complemento de la SEQ ID NO : 6 y codifica un polipéptido que tiene actividad . de a-glucosidasa; al complemento de cualquiera de* la SEQ ID NO: 19, 21, 37, 39, 41 o 43 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de glucosa isomerasa; al complemento de cualquiera de la SEQ ID NO: 46, 48, 50 o 59 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa .
Además, un cásete de expresión que comprende un polinucleótido a) que tiene la SEQ ID N0:2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 o 59 o el complemento de la misma, o un polinucleótido que híbrida al complemento de cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 o 59 o bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de cx-amilasa, pululanasa, oc-glucosidasa, glucosa isomerasa o glucoamilasa o b) que codifica un polipéptido que comprende la^ SEQ ID NO: 10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 o 51," o un fragmento enzimáticamente activo de la misma. De preferencia, el cásete de expresión además comprende un promotor operablemente enlazado al polinucleótido, tal como un promotor inducible, promotor específico de tejido o de preferencia un promotor específico de endosperma. De preferencia, el promotor específico de endosperma es un promotor de ?-zeina de maíz o un promotor ADP-gpp. En una modalidad preferida, el promotor comprende la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO:12. Además, en otra modalidad preferida el nucleótido está orientado en la orientación de sentido con relación al promotor. El cásete de expresión de la presente invención puede codificar una secuencia de señal que está operablemente enlazada al polipéptido codificado . por el pqlinucleótido . La secuencia de señal de preferencia dirige el polipéptido operablemente enlazado a una vacuola, retículo endoplásmico, cloroplasto, granulo de almidón, semilla o pared celular de una planta. De preferencia las secuencias de señal incluyen una secuencia de señal N-terminal de waxy, una secuencia de señal N-terminal de ?-zeina o un dominio de enlace de almidón. La presente invención además se dirige a un vector o célula que comprende los casetes de expresión de la presente invención. La célula puede ser seleccionada del grupo que consiste de un Agrobacterium, una célula monocotiledónea, una célula dicotiledónea, una célula Liliopsida, una célula Panicoideae, una célula de maíz y una célula de cereal- De preferencia, la célula es una célula de maiz . Además, la presente invención comprende una planta establemente transformada con los vectores de la presente invención. Se proporciona una planta establemente transformada con un vector que comprende una a-amilasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO:l, 10, 13, 14, 15, 16, 33 o 35 o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 2 o 9. De preferencia, la -amilasa es hipertermofilica . En otra modalidad, se proporciona una planea establemente transformada con un vector que comprende una pululanasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 24 o 34, o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: o 25. Además se proporciona una planta establemente transformada con un vector que comprende un a-glucosidasa . que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 26 o 27, o codificada por un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO- 6. De preferencia, la a-glucosidas . es hipertermofilica . Además se describe en la presente una planta establemente transformada con un vector que comprende una glucosa isomerasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO.18, 20, 28, 29, 30, 38, 40, 42 o 44 o codificada por un polinucleótido que comprendé cualquiera de la SEQ ID NO: 19, 21, 37, 39, 41 o 43. De preferencia, la glucosa isomerasa es hipertermofilica . En otra modalidad, se describe una planta establemente transformada con un vector que comprende una glucosa amilasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 5, 47 o 49 o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO_:46, 48, 50 o 59. De preferencia, la glucosa amilasa es hipertermofilica . Además se proporcionan productos de plantas, tales como semillas, frutos o granos de las plantas establemente transformadas de la presente invención. En otra modalidad, la invención se dirige a una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que codifica por lo menos una enzima procesadora operablemente enlazada a una secuencia de promotor, la secuencia de este polinucleótido que es optimizada para la expresión en la planta. La planta puede ser una monocotiledónea, tal como maíz o una dicotiledónea. De preferencia, la planta es una planta de cereal o una planta comercialmente cultivada. La enzima de procesamiento es seleccionada del grupo que consiste de una ct-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, glucanasa, ß-amilasa, ocglucosidada, isoamilasa, pululanasa, neo-pululanasa, iso-pululanasa, amilopululanasa, celulasa, exo-1, 4-ß-celobiohidrolasa, exo-1 , 3-p-D-glucanasa, ß-glucosidása, endoglucanasa, L-arabinasa, -arabinosidasa, galactanasa, galactosidasa, mananasa, manosidasa, xilanasa, xilosidasa, proteasa, glucanasa, xilanasa, esterasa, fitasa y lipasa. De preferencia, la enzima procesadora es una enzima procesadora de almidón seleccionada del grupo que consiste de a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, ß-amilasa, a-glucosidasa, isoamilasa, pululanasa, neo-pululanasa, iso-pululanasa y amilopululanasa. Más de preferencia, la enzima ' es seleccionada de a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, glucosa isomerasa, -glucosidasa y pululanasa. La enzima procesadora además de preferencia es hipertermofilica . De acuerdo con este aspecto de la invención, la enzima puede ser una enzima degradante no de almidón seleccionada del grupo que consiste de proteasa, glucanasa, xilanasa, estearasa, fitasa y lipasa. Tales enzimas además pueden ser hipertermofilicas „ En una modalidad preferida, la enzima se acumula en la vacuola, retículo endoplásmico, cloroplasto, granulo de almidón semilla o pared celular de una planta. Además en otra modalidad, el genoma de l planta puede ser además aumentado con un segundo polinucleótido recom inante que comprende una enzima no hipertermofílica . En otro aspecto de la invención, se proporciona una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que codifica por lo menos una enzima de procesamiento seleccionada del grupo que consiste de cx-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, -glucosidasa y pululanasa, operablemente enlazada a una secuencia ide promotor, la secuencia de este polinucleótido que es optimizada para la expresión en la planta. De preferencia/ la enzima de procesamiento es hipertermofílica y ma.iz. Otra modalidad se dirige a una planta de maíz transformada, el genoma de la . cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que codifica por lo menos una enzima de procesamiento seleccionada del grupo que consiste de a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, oc-glucosidasa y pululanasa, operablemente enlazada a ur.a secuencia de promotor, ia secuencia de este polinucleótido que es optimizada para la expresión en la planta de maíz. De preferencia, la enzima de procesamiento es hipertermo- filica. Se proporciona una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que tiene la SEQ ID N0:2, 9 o 52, operablemente enlazada a un promotor en una secuencia de señal. Adicionalmente, se describe una planta transformada, el genoma de la cual es aumentada con un polinucleótido recombinante que tiene la SEQ ID NO: 4 o 25, operablemente enlazada a un promotor y a una secuencia de señal.' En otra modalidad, una planta transformada el genoma de la cual es aumentado con un •polinucleótido recombinante que tiene la SEQ ID NO: 6, operablemente enlazado a un promotor y a una secuencia de señal. Además, se describe una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que tiene la SEQ ID NO: 19, 21, 37, 39, 41 o 43. Una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un polinucléotido recombinante que tiene la SEQ ID NO:46, 48, 50 o 59. Los productos de las plantas transformadas además son contemplados en la presente. El producto, por ejemplo, incluye semilla, fruto o grano. El producto alternativamente puede ser la enzima procesadora, almidón o azúcar. Además se describe una planta obtenida de las plantas establemente transformadas de la presente invención.
En este aspecto, la planta puede ser una planta híbrida o una planta endogámica . Una composición de almidón además es una modalidad adicional de la invención que comprende por lo menos una enzima procesadora la cual es una proteasa, glucanasa o esterasa. De preferencia, la enzima es hipertermofilica . El grano es otra modalidad de la invención que comprende por lo menos una enzima procesadora, la cual es una oí-amilasa, pululanasa, cc-glucosidasa, g^coamilasa o glucosa isomerasa. De preferencia, la enzima es hipertermofilica . En otra modalidad, se proporciona un método para preparar gránulos de almidón, que comprende : tratar el grano que comprende por lo menos una enzima procesadora no de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, producir una mezcla que comprende gránulos de almidón y productos de degradación no de almidón, en donde el grano es obtenido de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima y separar los gránulos de almidón de la mezcla. En la misma, la enzima es de preferencia una proteasa, glucanasa, xilanasa, fitasa o esterasa. Además, la enzima es de preferencia hipertermofilica. El grano puede ser grano fraccionado y/o puede ser tratado bajo condicipnes de bajo o alto contenido de humedad. Alternativamente, el grano puede ser tratado con dióxido de azufre. La presente invención además de preferencia puede comprender la separación de productos no de almidón de la mezcla. Además se describen los productos de almidón y los productos no de almidón obtenidos por este método. Todavía en otra modalidad, se proporciona un método para producir maíz hiperdulce que comprende tratar el maíz transformado o una parte del mismo, el genoma del cual es aumentado con .y expresa en el endosperma un cásete de expresión que codifica por lo menos una enzima degradante de almidón o isomerizante de almidón; bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para convertir poiisacáridos en el maíz en azúcar, produciendo maíz hiperdulce. El cásete de expresión de preferencia además comprende un promotor operablemente enlazado al polinucleótido que codifica la enzima. El promotor puede ser un promotor constitutivo, promotor específico de semilla o promotor específico de endosperma, por ejemplo. De preferencia, la enzima es hipertermofílica. Más de preferencia, la enzima ¦ es a-amilasa. El cásete de expresión usado en la presente puede comprender un polinucleótido qué codifica una secuencia de señal operablemente enlazada por lo menos una enzima. La secuencia de señal puede dirigir la enzima hipertermofílica al apoplasto o al retículo endoplásmico, por ejemplo. De preferencia, la enzima comprende cualquiera de la SEQ ID N0.-13, 14, 15, 16, 33 o 35.
En una modalidad mucho más preferida, se describe un método para producir maiz hiperdulce que comprende tratar el maiz transformado o una parte del mismo,- el genoma del cual es aumentado con, y expresa en el endosperma un cásete de expresión que codifica un a-amilasa, bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para convertir los polisacáridos en el maiz en azúcar, produciendo maiz hiperdulce. De preferencia, la enzima es hipertermofilica y la -amilasa hipertermofilica comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO:13, 14, 15, 16, 33 o 35, o un fragmento enzimáticamente activo de la misma que tiene a.ctividad de a-amilasa. ' · " En la presente se describe un método para preparar una solución de producto de almidón hiarolizado que comprende una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una enzima procesadora bajo condiciones que activan a por lo menos una enzima 'para procesar de esta manera ' los gránulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende producto de almidón hidrolizado, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica por lo menos una enzima de procesamiento de almidón; y recolectar la solución acuosa que comprende el producto de almidón hidrolizado; el producto de almidón hidrolizado puede comprender una dextrina, maltooligosacárido, glucosa y/o mezclas de los mismos. De preferencia, la enzima es a-amílasa, a-giucosidasa, glucoamilasa, pululanasa, amilopululanasa, glucosa isomerasa o cualquier combinación de las mismas. Además, de preferencia, la enzima es hipertermofilica . En otro aspecto, el genoma de la parte de planta puede ser además aumentado con un cásete de expresión que codifica una enzima procesadora de almidón o hipertermofilica . La enzima procesadora de almidón no hipertermof lica puede ser seleccionada del grupo que consiste de amilasa, glucoamilasa, a-glucosidada, pululanasa, glucosa isomerasa o una combinación de las mismas. Todavía, en otro aspecto,- la enzima procesadora es de' preferencia expresada en el endosperma . De preferencia, la parte de planta es "grano, y es de maíz, trigo, cebada, centeno, avena, caña de azúcar o arroz. De preferencia, la por lo menos una enzima procesadora está operablemente enlazada a un promotor en una secuencia de señal que dirige la enzima al gránulo de almidón o al retículo endoplásmico, o a la pared celular. El método además puede comprender aislar el producto de almidón hidrolizado y/o fermentar el producto de almidón hidrolizado. En otro aspecto de la invención, se describe un método para preparar un producto de almidón hidrolizado que comprende tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para de esta manera procesar los gránulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende un producto de a3.midón hidrolizado, en · donde la parte de la planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica por lo menos un a-amilasa; y recolectar la solución acuosa que comprende el producto de almidón hidrolizado. De preferencia, la a-amilasa es hipertermofilica y más de preferencia, la a-amilasa hipertermofilica comprende la secuencia . de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO:l, 10, 13, 14, 15, 16, 33 o 35 o un "fragmento activo de la misma que tiene actividad de a-amilasa. De preferencia, el cásete de expresión comprende un polinucleótido seleccionado de cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 9, 46 o 52 o un complemento del mismo, o un polinucleótido que híbrida cualquiera de la SEQ ID NO:2, 9, 46 o 52 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad- de a-amilasa. Además, la invención además proporciona el genoma de la planta transformada que además comprende un polinucleótido que codifica una enzima procesadora de almidón no termofilica. Alternativamente, la parce de planta puede ser tratada con una enzima procesadora de almidón no hipertermofilica. La presente invención además se dirige a una parte de planta transformada que comprende por lo menos una enzima procesadora de . almidón presente en la célula de la planta, donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un .cásete de expresión que codifica la' por lo menos una enzima procesadora de almidón. De preferencia, la enzima es una enzima procesadora seleccionada del grupo que consiste de ct-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, ß-amilasa, oc-glucosidasa, isoamilasa, pululanasa, neo-pululanasa, iso-pululanasa y amilopululanasa . Además, la enzima es de preferencia hipertermofilica . La planta puede ser cualquier planta, pero es de preferencia maíz. Otra modalidad de la invención es una parte' de planta transformada que comprende por lo menos una enzima procesadora no de almidón presente en la pared celular o las células de la planta, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica por lo menos una enzima procesadora no de almidón o por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón. De preferencia, la enzima es hipertermofílica . Además, .la enzima procesadora no -de almidón es de preferencia seleccionada del grupo que consiste de proteasa, glucanasa, xilanasa, esterasa, fitasa y lipasa. La parte de la planta puede ser cualquier parte de planta, pero de preferencia es una mazorca, semilla, fruto, grano, forraje, paja o bagazo.
La presente invención también se dirige a partes de plantas transformadas. Por ejemplo, se describen partes de plantas transformadas que comprenden un a-amilasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID N0:1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 o 35 o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 9, 46 o 52, una parte de planta transformada que comprende una o¡-glucosidasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 5, 26 o 27, o codificada por un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 6, una parte de planta transformada que comprende una glucosa isomerasa que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera ' de la SEQ ID NO: 28, 29, 30, 38, 40, 42 o 44, o codificada por un polinucleótido .que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 19, 21, 37, 39, 41 o 43, una de planta transformada que comprende una glucoamilasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 49, o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 46, 48, 50 o 59 y una parte de planta transformada .que comprende una pululanasa codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 4 o 25. Otra modalidad es un método para convertir almidón en la parte de planta transformada que comprende activar la enzima procesadora de almidón contenida en la misma. Ademas se describe el almidón, dextrina, maltooligosacárido o azúcar producido de acuerdo con este método . La presente invención además describe un método para usar una parte de planta transformada que comprende por lo menos una enzima procesadora no de almidón y la pared celular o la célula de la planta, que comprende tratar una parte de planta transformada que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima para digerir de esta manera el polisacárido no de almidón para formar una solución acuosa que comprende oligosacárido y/o azúcares, en donde la parte de planta es obtenida de ' una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón y recolectar la solución acuosa que comprende los oligosacáridos y/o azúcares. De preferencia, la enzima procesadora de polisacárido no de almidón es hipertermofílica. Un método para usar semillas transformadas que comprende por lo menos una enzima procesadora que comprende tratar las semillas transformadas que comprenden por lo menos una proteasa o lipasa bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima que produce una mezcla acuosa que comprende aminoácidos y ácidos grasos, en donde las semillas obtenidas de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentddo con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima; es recolectar la mezcla acuosa. Los aminoácidos, ácidos grasos o ambos son de preferencia aislados. De preferencia, la por lo menos una proteasa o lipasa es hipertermofilica . Un .método para preparar etanol que comprende tratar una parte de planta que comprende de por lo menos una enzima procesadora de polisacárido bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima para de esta manera digerir el olisacárido para formar oligosacárido o azúcar fermentabie, en donde, la parte de planta es obtenido de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de polisacárido; e incubar el azúcar fermentabie bajo condiciones que promueve la formación del azúcar fermentabie u oligosacárido en etanol. De preferencia,- la parte de planta es un grano, fruto, semilla, tallos, madera, vegetal o maíz. De preferencia, la parte de planta es obtenida de una planta seleccionada del grupo que consiste de avenas, cebada, trigo, baya, vids, centeno, maíz, arroz, papa, betabel, caña de azúcar, piña, céspedes y árboles. En otra modalidad preferí ia la enzima procesadora de polisacárido es cf-am -dsa, glucoamilasa, oí-glucosidasa, glucosa isomerasa, pui ianasa o una combinación de las mismas .
Se proporciona un método para preparar etanol que comprende tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima seleccionada del grupo que consiste de a- amilasa, glucoamilasa, a-glucosidasa, glucosa isomerasa o pululanasa o una combinación de las mismas, con calor durante una cantidad de tiempo y bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima para de esa manera digerir el polisacárido para formar azúcar fermentable, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentada con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima; e incubar el azúcar •feriaentable bajo condiciones que promueven la conversión del azúcar fermentable en etanol. De preferencia, la por lo menos una enzima es hipertermofilica o mesofilica. En otra modalidad, se proporciona un método para preparar etanol que comprende tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima procesadora no de almidón bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima, para digerir de esta manera el polisacárido no de almidón a oligosacárido y azúcar fermentable, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima; e incubar el azúcar fermentable bajo condiciones que promueven la conversión del azúcar fermentable en e anol. De preferencia, la enzir.a procésadora no de almidón es una glutanasa, xilanasa o celulasa. Además se proporciona un método para preparar etanol que comprende tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima seleccionada del grupo que consiste de a-amilasa, giucomilasa, a-glucosidasa, glucosa isomerasa o pululasa, o una combinación de las mismas, bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima para digerir de esta manera el polisacárido para formar azúcar fermentable, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la pbr lo menos una enzima; e incubar el azúcar fermentable bajo condiciones que promueven la conversión del azúcar fermentable en etanol. De preferencia, la enzima es hipertermofilica . Además, se describe un método para producir un producto alimenticio harinoso endulzado sin adicionar edulcorante adicional que comprende tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima procésadora de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para de esta manera procesar los gránulos de almidón en la parte de planta a azucares para formar un producto endulzado, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzir.a; y procesar el producto endulzado en un producto alimenticio harinoso. El producto alimenticio harinoso puede ser formado del producto endulzado y agua. Además, el producto alimenticio harinoso puede contener malta, 'saborizantes, vitaminas, minerales, agentes colorantes o cualquier combinación de los mismos. De preferencia, la por lo menos una enzima es hipertermofilica . La enzima puede ser seleccionada de -amilasa, a-glucosidasa, glucoamilasa, pululanasa, glucosa isomerasa o cualquier combinación de las mismas. La planta además puede ser seleccionada del grupo que consiste de soya, centeno, avenas, cebada, trigo, maiz, arroz y caña de azúcar. De preferencia, el producto alimenticio harinoso es un alimento de cereal, un alimento de desayuno, un alimento listo para comer o un alimento horneado . El procesamiento puede incluir el horneado, ebullición, calentamiento, vaporización, descarga eléctrica o cualquier combinación de los mismos. La presente invención además se dirige a un método para endulzar un producto que contiene almidón sin adicionar edulcorante, que comprende tratar el almidón que comprende por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima, para digerir de esta manera e almidón para formar un azúcar para formar almidón endulzado, en donde el almidón es obtenido de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima, y adicionar el almidón endulzado a un producto para producir un producto que contiene almidón endulzado. De preferencia, la planta transformada es seleccionada del grupo que consiste de maíz, soya, centeno, avena, cebada, trigo, arroz y caña de azúcar. De preferencia, la por lo menos una enzima en hipertermofilica . Más de preferencia, la por lo menos una enzima es oc-amilasa, -glucosidada, glucoamilasa, pululanasa, glucosa isomerasa o cualquier combinación de las mismas . Un producto alimenticio harinoso y almidón endulzado que contiene el producto se proporciona en' -la presente . La invención también se dirige a un método para endulzar un fruto o vegetal que contiene polisacárido que comprende tratar un fruto vegetal que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para procesar de esta manera el polisacárido en el fruto vegetal para formar azúcar, produciendo un fruto o vegetal endulzado, en donde el fruto o vegetal es obtenido de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica por lo menos una enzima procesadora de polisacárido. El fruto vegetal es seleccionado del grupo que consiste de papa, tomate, plátano, calabaza, guisantes y frijoles. De preferencia la por lo menos una enzima es hipertermofilica . La presente invención además se" dirige a un método para preparar una solución acuosa que comprende azúcar, que comprende tratar los^ gránulos de almidón oprimidos de la parte de planta bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para producir de esta manera una solución acuosa que comprende azúcar. Otra modalidad se dirige a un método para preparar productos derivados de almidón a partir de grano, que no implica la molienda húmeda o seca del grano antes de la recuperación de los productos derivados del almidón, que comprende tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y. por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para de esta manera procesar los granulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende dextrinas o azúcares, en donde la parte de planta es obtenida de una. planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de almidón; recolectar la solución acuosa que comprende el producto derivado de almidón. De preferencia, la por lo menos una er. irr.a procesadora de almidón es hipertermofilica.
Además se proporciona un método para aislar un o¡-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, cu-glucosidasa y pululanasa que comprende cultivar la planta transformada y aislar la a-amílasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, a-glucosidasa y pululanasa a partir de la misma. De preferencia, la enzima es hipertermof lica . Un método para preparar maldodextrina que comprende mezclar grano transgénico con - agua, calentar la mezcla, separar el sólido del jarabe de dextrina generado y recolectar la maltodextrina . De preferencia, el grano transgénico comprende por lo menos una enzima procesadora de almidón. De preferencia, la enzima procesadora de almidón es a-amilasa, glucoamilasa, a-glucosidada y glucosa isomerasa. Además, se proporciona maltodextrina producida por el método asi como la composición producida por este método. Se proporciona un ¦ método para preparar dextrinas, azúcares de grano que no implican rotura mecánica del grano antes de la recuperación del almidón derivado, que comprende tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para procesar de esta manera los gránulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende dextrinas o azúcares, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora; y recolectar la solución acuosa que comprende azúcares y/o dextrinas. La presente invención además se "dirige a un método para producir azúcar fermentable que comprende tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para procesar de esta manera los gránulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende dextrinas o azúcares, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con ún cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima de procesamiento; y recolectar la solución acuosa que comprende el azúcar fermentable . Además, en la presente se proporciona una planta de maíz establemente transformada con un vector que comprende un cz-amilasa hiper-termofilica . Por ejemplo, de preferencia, esta comprendida una planta de maíz establemente transformada con un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica a-amilasa que es mayor que.60% idéntica a la SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 51. Breve Descripción de las Figtxras Las Figuras 1A y IB ilustran la actividad de la -amilasa expresada en semillas de maíz y en el endosperma de semillas TI segregantes de plantas pNOV6201 y de seis lineas pNOV6200. La Figura 2 ilustra la actividad de oc-amilasa en semillas Ti segregantes de lineas pNOV6201. La Figura 3 representa la cantidad de etanol producida en la fermentación de amasijos de maíz transgénico que contienen -amilasa 797GL3 termoestable que se sometieron a tiempos de licuefacción de hasta 60 minutos a 85°C y 95°C. Esta figura ilustra que el etanol producido en 72 horas de fermentación estuvo casi sin cambio de 15 minutos a 60 minutos de licuefacción. Además, muestra que el amasijo producido por la licuefacción a 95°C produjo más etanol en cada punto del tiempo que el amasijo producido por la licuefacción a 85°C. La Figura 4 representa la cantidad de almidón residual (%) que permanece después de la fermentación-de amasijos de maíz transgénico que contienen -amilasa termoestable que se sometieron a un tiempo de licuefacción de hasta 60 minutos á 85°C y 95°C. Esta figura ilustra que el etanol producido en 72 horas de fermentación estuvo casi sin cambio de 15 minutos a 60 minutos de licuefacción. Además, muestra que el amasijo producido por licuefacción a 953C produjo más etanol en cada punto en el tiempo que el amasijo producido por la licuefacción a 85°O.
La Figura 5 representa los rendimientos de etanol para los amasijos de un maíz transgénico, maís de control y varias mezclas de los mismos preparados a 85°C y 95°C. Esta figura ilustra que el maíz transgénico que comprende -amilasa da por resultado una mejora significante en la elaboración del almidón disponible para la fermentación puesto que hubo una reducción del almidón dejado después de la fermentación. La Figura 6 representa la cantidad de almidón residual medida en la destilación seca después de la fermentación para amasijos de un grano transgénico, maíz de control, y varias mezclas de los mismos preparados a 85°"C y 95 C. La Figura 7 representa los rendimientos de etanol en una función del tiempo de fermentación de una muestra que comprende 3% de maíz transgénico durante un período de 20-80 horas a varios rangos de pH de 5.2-6.4. La figura ilustra que la fermentación conducida a pH menor procede más rápido que a un pH de 6.0 o más alto. La Figura 8 representa los rendimientos de etanol durante la fermentación de un amasijo que comprende varios porcentajes en peso de maíz transgénico de 0-12% en peso a varios rangos de pH de 5.2-6.4. Esta figura ilustra que el rendimiento de etanol fue independiente de la cantidad de giano transgénico incluido en la muestra.
La Figura 9 muestra el análisis de las semillas T2 de diferentes eventos transformadas con pNOV7005. La alta expresión de la actividad de pululanasa, comparada con el control no transgénico, puede ser detectada en un número de eventos . Las Figuras 10A y 10B muestran los resultados de los análisis de HPLC de los productos hidroliticos generados por la pululanasa expresada del almidón en- la harina de maíz transgénico. La incubación de la harina del maíz que expresa pululanasa en la solución reguladora de reacción a 75°C durante .30 minutos da por resultado la producción de los óligosacáridos · de mediana cadena (grado de polimerización (DP) -10-30) y cadenas de amilosa cortas (DP-100-200) del almidón de maíz. Las Figuras 10A y 10B también muestran i el efecto de los iones de calcio adicionados en la actividad de la pululanasa. Las Figuras 11A y 11B representan los datos generados del análisis de HPLC del producto de hidrólisis de almidón de las dos mezclas de reacción. La primera reacción indicada como ^Amilasa' tiene una mezcla [1:1 (p/p) ] de muestras de harina de ma z de maíz transgénico que expresa a-amilasa y maíz no transgénico A188; y la segunda mezcla de reacción 'Amilasa+Puiuir.r.-isa ' contiene una mezcla [1:1 (p/p' 3 de muestras de harina de aí: de maíz transgénico que expresa o¡-amilasa y maíz transgém c que expresa pululanasa.
La Figura 12 representa la cantidad de producto de azúcar en µg en 25 µ? de mezcla de reacción para dos mezclas de reacción. La primera reacción indicada como \Amilasa' contiene una mezcla [l:l(p/p)] de muestras de harina de maiz de maiz transgénico que expresa a-amilasa y maiz no transgénico A188; y la segunda mezcla de reacción VAmilasa+Pululanasa' contiene una mezcla l:l(p/p)] de muestras de harina de maiz de maiz transgénico que expresa o¡-amilasa y maiz transgénico que expresa pululanasa. Las Figuras 13A y 13B muestran el producto de hidrólisis de almidón de dos conjuntos de mezcla de reacción al final de 30 minutos de incubación a 85°C y 95°C. Para cada conjunto existen dos mezclas de reacción, la primera reacción indicada como ''Amilasa X Pululanasa' contiene harina de maiz transgénico (generado por polinización cruzada) que expresa tanto la a-amilasa y la pululanasa y la segunda reacción indicada como mezcla de 'Amilasa' de muestras de harina de maiz de maiz transgénico qué expresa a-amilasa y maiz no transgénico A188 en relación para obtener la misma cantidad de actividad de a-aiaiiasa como es observado en la cruza (Amilasa X Pululanasa) . La Figura 14 representa la degradación del almidón a glucosa usando semilla de maiz no transgénico (control; , semilla de maiz transgénico que comprende la a-amilasa 79T 12 y una combinación de semilla de maíz transgénico 797GL3 con Mal .A a-glucosidasa . La Figura 15 representa la conversión del almidón bruto a temperatura' ambiente a 30°C. En esta figura, las mezclas de reacción 1 y 2 son una combinación de agua y almidón a temperatura ambiente y 30°C, respectivamente. Las mezclas de reacción 3 y 4 son una combinación de a-amilasa de cebada y almidón a temperatura ambiente y a 30°C, respectivamente. Las mezclas de reacción 5 y 6 son combinaciones de glucoamilasa de Termoanaerobacterium, y almidón a temperatura ambiente y 30°C, respectivamente. Las mezclas de reacción 7 y 8 son combinaciones de a-amilasa de cebada (sigma) y glucoamilasa de Termoanaerobacterium y almidón a temperatura ambiente y 30°C,' respectivamente. Las mezclas de reacción 9 y 10 son combinaciones del control de oí-amilasa de cebada (sigma) y almidón a temperatura ambiente y 30°C, respectivamente. El grado de polimerización (DP) de productos de la glucoamilasa de Termoanaerobacterium es indicado . La Figura 16 representa la producción de fructosa de la harina de maíz transgénico. de amilasa usando una combinación de -amilasa, a-glucosidasa y glucosa isomerasa como es descrito en el Ejemplo 19. La harina de maíz de amilasa se mezcló con soluciones de enzima más agua o solución reguladora. Tedas las reacciones contuvieron ó0 rr.g de harina de amilasa y un total de 600 µ? de líquido y se incubaron durante 2 horas a 90°C. La Figura .17 representa las áreas pico de los productos de reacción con harina .de amilasa al 100% de una semilla autoprocesadora como una función del tiempo de incubación de 0-1200 minutos a 90 °C. La Figura 18 representa las áreas pico de los productos de reacción con harina de amilasa transgénica al 10% de una semilla autoprocesadora y la harina de maíz de control al 90% como una función del tiempo de incubación de 0-1200 minutos a 90°C. La Figura 19 proporciona los resultados de los análisis de HPLC de la harina de amilasa transgénica incubadas 70°, 80°, 90° o 100°C por hasta 90 minutos para estimar el efecto de la temperatura en la hidrólisis del almidón . La Figura 20 representa el área pico de ELSD para muestras que contienen 60 mg de harina de amilasa transgénica mezclada con soluciones de enzima más agua o solución reguladora bajo varias condiciones de reacción. Un conjunto de reacciones se reguló con MOPS 50 mM, pH 7.0 a temperatura ambiente, más MgS04 10 mM y CoCl: 1 mM; en un segundo conjunto de reacciones la solución reguladora que contiene metal se reemplazó por agua. Todas las reacciones se incubaron durante 2 horas a 90 °C.
Descripción Detallada de la Invención De acuerdo con la presente invención, una planta o parte de planta "autoprocesadora" tiene incorporada en la misma un polinucleótido aislado que codifica una enzima procesadora capaz de procesar, por ejemplo, modificar, almidones, polisacáridos, líquidos, proteínas y similares en plantas, en donde la enzima procesadora puede ser mesofílica, termofílica, o ipertermofílica, y puede ser activada mediante molienda, la adición de agua, calentamiento o de otra manera la provisión de condiciones favorables para la función de la enzima. El polinucleótido aislado que codifica la enzima procesadora es integrado en una planta o part ¦ de planta para la expresión en la misma. En la expresión y la activación de la enzima procesadora, la planta o parte de planta de la presente invención procesa el sustrato en el cual actúa la enzima procesadora. Por lo tanto, la planta o partes de plantas de la presente invención son capaces de autoprocesar el sustrato de la enzima en la activación de la enzima procesadora contenida en el mismo en la ausencia de o con fuentes externas reducidas normalmente requeridas para procesar estos sustratos. Como tales, las plantas transformadas, células de plantas transformadas y partes de plantas transformadas tienen capacidades de procesamiento "acumuladas" para procesar sus sustratos deseados por medio de las enzimas incorporadas en los mismos de acuerdo con esta invención. De preferencia, los polinucleótidos que codifican la enzima procesadora son "genéticamente estables", es decir, el polinucleótido es establemente mantenido en la planta o partes de planta transformadas de la presente invención y establemente heredado por la progenie a través de generaciones sucesivas . De acuerdo con la presente invención, los métodos que emplean tales plantas y partes de plantas pueden eliminar la necesidad de moler o de otra manera romper físicamente la integridad de las partes de la planta antes de la recuperación de los productos derivados de almidón. Por ejemplo, ' la invención proporciona métodos me orados para procesar maíz y otro grano para recuperar los productos derivados de almidón. La invención también proporciona , un método que permite la recuperación de gránulos de almidón que contienen niveles de enzimas degradantes de almidón, en o sobre los granulos, que son adecuados para la hidrólisis de enlaces específicos dentro del almidón sin el requerimiento de adicionar enzimas hidrolizantes de almidón exógenamente producidas. La invención también proporciona productos mejorados de la planta 2 partes de plantas autoprocesadoras obtenidas por los métodos :ie la invención. Además, la parte de planta transforma :ia "autoprocesadora", por ejemplo, grano y la planta transformada evitan los problemas mayores con la tecnología existente, es decir, las enzimas procesadoras son típicamente producidas por la fermentación de microbios, que requieren el aislamiento de las enzimas sobrenadantes de cultivo, que cuestan dinero; la enzima aislada necesita ser formulada para la aplicación particular y los procesos y la maquinaria para la visión, mezclado y la reacción de la enzima con su sustrato deben ser desarrollados. La planta transformada de la invención o una parte de la misma también es una fuente de la enzima de procesamiento misma así como sustratos y productos de esa enzima, tales como azúcares, aminoácidos, ácidos grasos y almidón y polisacáridos no de almidón. La planta de la invención también puede ser empleada para preparar plantas de progenie tales como plantas híbridas y endogámicas . Enzimas Procesadoras y Polinucleótidos que las Codifican Un polinucleótido que codifica una enzima procesadora (mesofílica, termofílica o hipertermofílica) es introducido en una planta o parte de planta. La enzima procesadora es seleccionada en base al sustrato deseado en el cual actúa como es encontrado en las plantas o plantas transgénícas y/o el producto final deseado. Por ejemplo, la enzima procesadora puede ser una enzima procesadora de almidón, tal como una enzima degradante de almidón o isomerizante de almidón, c una enzima procesadora no de almidón. Las enzimas procesadoras adecuadas incluyen, pero : z están limitadas a, enzimas degradantes o isomerizantes de almidón que incluyen, por ejemplo, a-amilasa, endo o exo-1, o 1,6- -D, glucoamilasa, glucosa isomerasa, ß-amilasas, -glucosidasas y otras exo-amilasas; enzimas de desramificación de almidón, tales como isoamelasa, pululanasa, no pululanasa, isopululanasa, amilopululanasa y similares, glicosil transferasas tal como ciclodextrin glicosil transferasa y similares, celulasas tales como exo-1, 4-p-celobiohidrolasa, exo-1, 3-p-D-glucanasa, hemicelulasa, ß-glucosidasa y similares; endoglucanasas tales como endo-1, 3-p-glucanasa y endo-1, -p-glucanasa y similares; L-arabinasas, tales como endo-1, 5-oí-L-arabinasa, a-arabinosidasas y similares; galactanasas tales como endo-1, 4-p-D-galactanasa, endo-1, 3-ß-D-galactanasa, 3-galactosidasa, a-galactosidasa y similares; manonasas tales como endo-1, 4- -D-mananasa, ß-manosidasa, a-manosidasa y similares; xilanasas tales como endo-1, 4-ß-xilanasa, ß-D-xilosidasa , 1 , 3^-D-xilanasa y similares; y pectinasas; y enzimas procesadoras no de almidón, incluyendo proteasa, glucanasa, xilanasa, tioredoxin/tioredoxin reductasa, esterasa, fitasa y lipasa. -En una modalidad, la enzima procesadora es una enzima degradante de almidón seleccionada del grupo de a-amilása, pulanasa, -glucosidasa, glucoamilasa, amilopululanasa, glucosa isomerasa, o combinaciones de las mismas. De acuerdo con esta modalidad, la enzima degradante de almidón es capaz de permitir el autoprocesamiento de la planta ¦ o parte de la planta para degradar el almidón en la activación de la enzima contenida en la planta o parte de planta, como será descrito adicionalmente en la presente. La enzima (s) degradante de almidón es seleccionada basada en los productos finales deseados. Por ejemplo, una glucosa-isomerasa puede ser seleccionada para convertir la glucosa (hexosa) en fructosa. Alternativamente, la enzima puede ser seleccionada basada en el producto final derivado de almidón deseado con varias longitudes de cadena basadas en, por ejemplo como una función del grado de proces miento o con varios patrones de ramificación deseados. Por ejemplo, uña a-amilasa, glucoamilasa o amilopululanasa puede ser usada bajo tiempos de incubación cortos para producir productos de dextrina y bajo tiempos de incubación más largos para producir productos de cadena más corta o azúcares. Una pululanasa puede ser' usada para hidrolizar específicamente los puntos de ramificación en el almidón produciendo un almidón de alto contenido de amilosa, o una neopululanasa puede ser usada para producir un almidón con es iramientos de ot-1, 4 enlaces con aß-1, 6 enlaces interdispersados . Las glucosidasas podrían ser usadas para producir dextrinas limitadas, o una combinación de diferentes enzimas para hacer otros derivados de almidón.
En otra modalidad, la enzima de procesamiento es una enzima procesadora no de almidón seleccionada de proteasa, glucanasa, xilanasa y esterasa. Estas enzimas degradantes no de almidón permiten a la planta o parte de planta autoprocesadora de la presente invención incorporar en un área dirigida de la planta y, en la activación, romper la planta mientras que se deja el gránulo de almidón en la misma, intacto. Por ejemplo, en una modalidad preferida, las enzimas degradantes no de almidón dirigen la matriz de endosperma de la célula de la planta y, en la activación rompen la matriz de endosperma mientras que dejan el gránulo de almidón en la misma, intacto y más fácilmente recuperable del material resultante. Las combinaciones de enzimas procesadoras además son contempladas por la presente invención. Por ejemplo, las enzimas procesadoras de almidón y procesadoras no de almidón pueden ser usadas en combinación. Las combinaciones de enzimas procesadoras pueden ser obtenidas al emplear el uso de múltiples construcciones de genes · que codifican cada una de las enzimas. Alternativamente, las plantas transgénicas individuales establemente transformadas con las enzimas pueden ser usadas por métodos conocidos para obtener una planta que contiene ambas enzimas . Otro método incluye el uso de enzima (s) exógena con la planta transgénica .
Las enzimas procesadoras pueden ser aisladas o derivadas de . cualquier fuente y los polinucleótidos correspondientes a la mismas pueden ser averiguadas por un experto en la técnica. Por ejemplo, la enzima procesadora, de preferencia a-amilasa es derivada del Pyrococcus (por ejemplo, Pyrococcus furiosus) , Thermus, Thermococcus (por ejemplo, Thermococcus hidrothermalis) , Sulfolobus (por ejemplo, Sulfolobus solfataricus) , Thermotoga (por ejemplo, Thermotoga marítima y Thermotoga neapolitana) , Thermoanaerobacterxum (por ejemplo, Thermoanaerobacter tengcongensís) , Aspergillus (por ejemplo, Aspergillus shirousami y -Aspergillus niger) , Rhizopus (por ejemplo, Rhizopus oryzae) , Thermoproteales, Desulfurococcus (por ejemplo, Desul urococcus amílolycticus) , Methanobacterium thermoautotrophícum, Methanococcus jannaschii , Methanopyrus kandleri, Thermosynechococcus elongatus, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium, Aeropyrum pernix y plantas tales como, maíz, cebada y arroz. Las enzimas procesadoras de la presente invención son capaces de ser activadas después de ser introducidas y producidas en el genoma de una planta . Las condiciones para activar la enzima s;r. determinadas para cada enzima individual y pueden inc:.-.:-.r condiciones variantes tales coro temperatura, pH, hidrslación, presencia de metales, compuestos de activacicr. , compuestos de inactivación, etz.
Por ejemplo, las enzimas dependientes de la temperatura pueden incluir enzimas mesofílicas, termofilícas e hipertermofilicas . Las enzimas mesofílicas típicamente tienen actividad máxima a temperaturas entre 20°-65°C y son inactivadas a temperaturas mayores que 70 °C. Las enzimas mesofilicas tienen actividad significante a 30 a 37 °C, la actividad a 30°C es de preferencia 10% de la actividad máxima, más de preferencia por lo menos 20% de la actividad máxima . Las enzimas termofílicas tienen una. actividad máxima a temperaturas de entre 50 y 80°C y son inactivadas a temperaturas mayores que 80°c. Una enzima termofílica de preferencia tendrá menos de 20% de la actividad máxima a 30°C, más de preferencia menos de 10% de la actividad máxima. Una enzima "hipertermofílica" tiene actividad a unas temperaturas más altas . Las enzimas hipertermofílicas tienen una actividad máxima a temperaturas mayores que 80 °C y detienen la actividad a temperaturas por lo menos 80 °C, más de preferencia retienen la actividad a temperaturas de por lo menos 90°C y muchos más de preferencia retienen la actividad a temperaturas de por lo menos 95°C. Las enzimas hipertermofílicas tambi n tienen actividad reducida a bajas temperaturas. Una er.3i.~a hipertermofílica puede tener actividad a 3 °C que es -encr que 10% en la actividad máxima, y,de preferencia menor que 5 de la actividad máxima.
El polinucleótido que codifica la enzima procesadora es de preferencia modificado para incluir codones que son optimizados para la expresión de un organismo seleccionado tal como una planta (ver, por ejemplo, Wada y colaboradores, Nucí. Acids . Res., 18:2367 (1990), Murray y colaboradores, Nucí. Acids. Res., 17:477 (1989), patentes, norteamericanas Nos. 5,096,825, 5,625,136, 5,670,356 y 5,874,304). Las secuencias optimizadas de codones son secuencias sintéticas, es decir, no surgen en la naturaleza, y de preferencia codifican al polipéptido idéntico (o un fragmento enzimáticamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialménte la misma actividad, el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido de origen optimizado no de codón que codifica una enzima procesadora. Se, prefiere que el polipéptido sea bioquímicamente distinto mejorado, por ejemplo mediante la mutagénesis recursiva de DNA que codifica una enzima procesadora particular, del polipéptido de fuente de origen tal que su desempeño en la aplicación del proceso sea mejorada. Los polinucieótidos preferidos son optimizados para la expresión en una planta · huésped de objetivo y codifican una enzima procesadora. Los métodos para preparar estas enzimas incluyen - la mutagénesis, por ejemplo, ia mutagénesis recursiva y la selección. Los métodos para mutagénesis y las alteraciones de la secuencia de nucleótidos. son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel, Proc. ' Nati. Acad. Sci . USA, 82:488 (1985); Kunkel y colaboradores, Methods in Enzymol, 154:367 (1987), patente norteamericana No. 4, 873, 192; Walker y Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en la misma y Arnold y colaboradores Chem. Eng. Sci., 51:5091 (1996) . Los métodos para optimizar la expresió de un segmento de ácido nucleico en una- planta objetivo u organismo son bien conocidos en la técnica. Brevemente se obtiene una tabla de utilización de codones que indican los codones óptimos utilizados para el organismo objetivo y los codones óptimos son seleccionados para reemplazar aquellos en el polinucleótido objetivo y la secuencia optimizada luego es químicamente sintetizada. Los codones preferidos para el maíz son descritos en la patente norteamericana No. 5,625,136. Además se contemplan los ácidos nucleicos complementarios de los polinucleótidos de .la presente invención. Un ejemplo de condiciones de baja severidad para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en un manchado de Southern o de Northern es formamida al 50%, por ejemplo, hibridación de formamida al 50¾, NaCl 1 M, SDS al i¾ a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 al 35%, NaCl 1M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37 °C y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC=NaCl 3.0 M/citrato trisódico 3.0 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderada ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl-1.0 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado al 0.5 X a IX SSC a 55 a 60°C. Además, adicionalmente se contemplan polinucleótido que codifican un fragmento "enzimáticamente activos" de las enzimas procesadoras . Como se utiliza en la presente, "enzimáticamente activo" significa un fragmento de polipéptido de enzima procesadora que tiene sustancialménte la misma actividad biológica, la enzima procesadora para modificar el sustrato en el cual la enzima de procesadora normalmente actúa bajo condiciones apropiadas. En una modalidad preferida, el polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido optimizado de maíz que codifica a-amilasa, tal como es proporcionada en la SEQ* ID NOs: 2, 9, 46 y 52. En otra modalidad preferida, el polinucleótido es un polinucleótido optimizado de maíz que codifica pululanasa, tal como es proporcionado en la SEQ ID NOs: 4 y 25. Todavía en otra modalidad preferida el polinucleótido es un polinucleótido optimizado de maíz que codifica a-glucosidasa como es proporcionada en la SEQ ID NC : 6. Otro polinucleótido preferido es el polinucleótido optimizado de maíz que codifica glucosa isomerasa que tiene la SEQ ID NO:19, 21, 37, 39, 41 o 43. En otra modalidad, el polinucleótido · optimizado de maíz que codifica glucoamilasa como es expuesto en la SEQ ID NO: 46, 48 o 50 es preferido. Además, un polinucleótido optimizado de maíz para el polipéptido de fusión de glucanasa/mananasa es proporcionada en la SEQ ID NO: 57. La invención además proporciona complementos para tales polinucleótidos, que hibridan bajo condiciones de hibridación moderada- o de preferencia bajo condiciones de hibridación de baja severidad y que codifica un polipéptido que tiene actividad de oc-amilasa, pululanasa, á-glucosidasa, ¦ glucosa isomerasa, glucoamilasa, glucanasa o manasa, como puede ser el caso. El polinucleótido puede ser usado intercambiablemente con "ácido nucleico" o "ácido polinucleico" y se' refiere a deoxiribonucleótidos-., o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en la forma ya sea de una sola o doble hebra, compuesto de monómeros (nucleótidos) que contienen un azúcar, fosfato y una base, que es ya sea una purina o pirimidina . A menos que se limite específicamente, el terrr.ino comprende ácidos nucleicos que contienen análogos cor.:::.io5 de nucleótidos naturales, que tienen propiedades de enlace similares como el ácido nuclei.o de referencia y son metat ! izados de una manera similar a los nucleótidos que surgen .ie manera natural. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también implícitamente comprende variantes conserv tivamente modificados de las mismas (por ejemplo, substituciones · de codón degenerado) y secuencias complementarias asi como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente las sustituciones de codones degenerados pueden ser alcanzadas al generar secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) está substituida con residuos de base mezclada y/o deoxinosina. "Variantes" o secuencias sustancialmente similares además están comprendidas en la presente- Para secuencias de nucleótidos, las variantes incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifica la secuencia de aminoácidos idéntica de la proteína nativa. Las variantes alélicas que surgen de manera natural tales como estas pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, por ejemplo, con la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , técnicas de hibridación y técnicas de reensamble de ligación. Las secuencias de nucleóndos variantes también incluyen secuencias de núcleoticos sintéticamente derivados, tales como aquellas generadas, por ejemplo, al utilizar la mutagénesis dirigida al sitio, que codifica la proteina nativa así como aquellas que codifican un polipéptido que tiene sustituciones de aminoácidos. Generalmente, las variantes de secuencias de nucleótidos de la invención tendrán por lo menos 40%, 50%, 60%, de preferencia 70%, más de preferencia 80%, aún más de preferencia 90%, mucho más de preferencia 99% y un solo porcentaje unitario de identidad a la secuencia de nucleótidos nativa basada en estas clases. Por ejemplo, 71%, 72%, 73% y similares, hasta por lo menos 90%- de la clase. Las variantes también pueden incluir un gen de longitud completa correspondiente a un fragmento de gen identificado . Secuencias Reguladoras : Promotores/Secuencias de Señal/Marcadores Seleccionables Las secuencias de polinucleótido que codifican la enzima procesadora de la presente invención pueden ser operablemente enlazadas a secuencias de polinucleótido que codifican señales de localización o secuencia de señal (en el N- o C-terminal de un polipéptido) , por ejemplo, para dirigir la enzima hipertermofilica a un compartimiento particular dentro de una planta. Ejemplos de tales objetivos incluyen, pero no están limitados a, la vacuola, retículo endoplásmico, cloroplasto, amiloplasto, gránulo de almidón o pared celular o a un tejido particular, por ejemplo, semilla. La expresión de un polinucleótido que -edifica una enzima procesadora que tiene una secuencia de señal en una planta, en particular, en conjunción con el uso de un promotor específico de tejido inducible, puede producir altos niveles de enzima procesadora localizada en la planta. Se conocen numerosas secuencias de señal para influenciar en la expresión o la dirección de un polinucleótido a un compartimiento particular o fuera de un compartimiento particular. Las secuencias de señal adecuadas y. los promotores de dirección son conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, aquellos proporcionados en la presente. Por ejemplo, donde se desea la expresión en tejidos u órganos específicos se pueden usar promotores específicos del tejido. En contraste, donde se desea la expresión de gen en respuesta a un estímulo, los promotores inducibles son los elementos reguladores de elección. Donde se desea la expresión continua por todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Las secuencias reguladoras adicionales corriente arriba y/o corriente abajo de la secuencia de promotor de núcleo pueden ser incluidas en construcciones de expresión de vectores de transformación para dar origen a niveles variantes de expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica. Un número de promotores de plantas se han descrito con varias características de expresión. Ejemplos de algunos promotores constitutivos que se han descrito incluyen la actina 1 de arroz (Wang y colaboradores, Mol. Cell. Biol., 12:3399 (1992); patente norteamericana No. 5,641,876), CaMV 35S (Odell y colaboradores, Nature, 313:810 (1985)) CaMV 19S (Lawton y colaboradores, 1987), nos (Elbert y colaboradores 1987), Adh (Walker y colaboradores, 1987), sacarosa sintasa (Yang & ussell, 1990) y los promotores ubicuitin. Los vectores para el uso en la dirección especifica de tejido de los genes de plantas transgénicas típicamente incluirán promotores específicos del tejido y también pueden incluir otros elementos de control específicos del tejido tales como secuencias mej oradoras. Los promotores que dirigen la expresión específica o mejorada en ciertos tejidos de plantas serán conocidos por los expertos en la técnica e vista de la presente descripción. Estos incluye, por ejemplo el promotor rbcS, específico para el tejido verde/ los promotores oes, nos y mas que tienen más alta actividad en la raíces o el tejido de hoja enrollado; un promotor 353 truncado .(-90 a +8) que dirige la expresión mejorada en las ralees, un gen a-tubulina que dirige la expresión, en raíces y promotores derivados de genes de proteína de almacenamiento de zeína que dirigen la expresión en el endosperma. La expresión específica del tejido puede ser funcionalmente realizada al introducir un gen constitutivamente expresado (todos ios tejidos) en combinación con un gen antisentido que es expresado solamente en aquellos tejidos donde el producto de gen no es deseado.
Por ejemplo, un gen que codifica para una lipasa puede ser introducido de tal manera que es expresado en todos los tejidos usando - el promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor. La expresión de un transcripto antisentido del gen de lipasa en una semilla de maíz, usando por ejemplo un promotor de zeína, prevendría la acumulación de la proteína de lipasa en la semilla. Por consiguiente la proteína codificada por el gen introducido se presentaría en todos los tejidos excepto la semilla. Además, varios genes y/o promotores regulados específicos del tejido se han reportado en plantas. Algunos genes específicos del tejido reportados incluyen los genes que codifican las proteínas de almacenamiento de semilla (tales como napina, cruciferina, - beta-conglicinina y faseolina) proteínas de zeína o del cuerpo aceitoso (tal como oleosina) , o genes implicados en la biosíntesis de ácido graso (incluyendo proteína portadora de acilo, estearoil AC?' desaturasa y desaturasas de ácido graso (fad 2-1)), y otros genes expresados durante el desarrollo del embrión (tal como Bce4, ver, por ejemplo, EP 255378 y Kridl y colaboradores, Seed Science Research, 1:209 (1991)). Ejemplos de promotores específicos del tejido, que se han descrito incluyen la lectína (Vodkin, Prog. Clin. Biol. Res., 138; 87 (1983); lindstrom y colaboradores, Der . Genet., 11:160 (1990)), deshidrogenasa 1 de alcohol de maíz (Vogel y colaboradores , 1989; Dennis y colaboradores, Nucleic Acids Res., 12:3983 (1984)), complejo de recolección de luz del maíz (Simpson, 1986; Bansal y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:3654 (1992)), proteína de choque térmico del maíz (Odell y colaboradores, 1985; Rochester y colaboradores, 1386), carboxilasa de RuBP subunitaria pequeña de guisante (Poulsen y colaboradores, 1986; Cashmore y colaboradores, 1983), manopina sintasa de plásmido Ti (Langridge y colaboradores, 1989) nopalina sintasa de plásmido Ti (Langridge y colaboradores, 1989), calcona isomerasa de petunia (vanTunen y colaboradores, EMBO J., 7; 1257 (1988)), proteína 1 rica en glicina de frijol (Keller y colaboradores, Genes Dev. , 3:1639 (1989) ), 35S de CaMV truncado (Odell y colaboradores, Nature, 313:810 (1985)), patatina de . papa ( enzler y colaboradores, Plant Mol. Biol., 13:347 (1989)), célula de raíz (Yamamoto y colaboradores, Nucleic Acids Res, 18:7449 (1990)), zeína de maíz (Reina y colaboradores, Nucleic Acids Res., 18:6425 (1990) ; Kriz y colaboradores," Mol. Gen. Genet., 207:90 (1987); Wandelt y colaboradores, Nucleic Acids Res., 17:2354 (1989); Langridge y colaboradores, Cell, 34:1015 (1983); Reina y colaboradores, .V cleic Acids Res., 18:7449 (1990)), globulina-1 (Belanger y colaboradores, Genetics, 129:863 (1991) ), a-tubulina, ca . Sullxvan y colaboradores, Mol. Ge:.. Genet., 215:431 (1989)), PSPCase (Hudspeth & Gruía, 1989), promotores asociados con el complejo de gen R (Chandler y colaboradores, Plant Cell, 1:1175 (1989)) y promotores de calcona .sintasa (Franken y colaboradores, EMBO J. , 10:2605 (1991) ) . Particularmente útil para la expresión especifica de la semilla es el promotor de vicilina de guisante (Czako y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 235:33 (1992). (Ver también la patente norteamericana No. 5,625,136, incorporada en la presente por referencia) . Otros promotores útiles para la expresión en hojas maduras son aquellos que son cambiados al inicio de la senectud, tal como el promotor SAG de Arabidopsis (Gan y colaboradores, Science, 270:1986 (1995). Una clase de promotores específicos del fruto •expresados en o durante la antesis a través del desarrollo del fruto, por lo menos hasta el inicio de la maduración, es discutida en la patente norteamericana No. 4,943,674, la descripción de la cual es incorporada en la presente por referencia. Los clones de cDMA que son preferencialmente expresados en la fibra de algodón han sido aislados (John y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5769 (1992). Los clones de cDNA del tomate que muestran expresión diferencial durante el desarrollo del fruto han sido aislados y caracterizados (Mansson y colaboradores, Gen. Genet., 200:356 (1985), Slater y colaboradores, Plant Mol. Biol . , 5:137 (1985)) . El promo rr para el gen poligalacturonasa está activo en la maduración del fruto. El gen poligalacturonasa es descrito en la patéate norteamericana No. 4,535,060, patente norteamericana No. 4,769,061, patente norteamericana No. 4,801,590 y patente norteamericana No, 5,107,065, las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Otros ejemplos de promotores específicos del tejido incluyen aquellos que dirigen la expresión en las células de la hoja después del daño a la hoja (por ejemplo, de insectos masticadores ) , en tubérculos (por ejemplo, el promotor del gen patatina,- y en células de fibra (un ejemplo de una proteína de célula de fibra desarrolladamente regulada es E6 (John y colaboradores, Proc . Nati. Acad Sci. USA, 89-5769 (1992) . El gen E6 es más activo" en la fibra, aunque bajos niveles de transcriptos son encontrados en la hoja, óvulo y flor . La especificidad del tejido de algunos promotores "específicos del tejido" no puede ser absoluta y puede ser probada por un experto en la técnica usando la secuencia de la toxina de difteria. También se puede alcanzar la expresión específica del tejido con la expresión "indiscreta" mediante una combinación de promotores específicos del tejido diferentes (Beals y colaboradores, Plant Cell, 9:1527 (1997)). Otros promotores específicos del tejido pueden ser aislados por un experto en la técnica íver la patente norteamericana y,o 5, 589, 379) .
En una modalidad, la dirección del producto de un gen de hidrólisis de polisacárido, tal como a-amilasa, puede ser dirigida a un organelo particular tal como el apoplasto antes que al citoplasma. Esto se ha ejemplificado mediante el uso de la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maíz (SEQ ID NO:17) que confiere la dirección de las proteínas específica al apoplasto. La dirección de la proteína o enzima a un compartimiento específico permitirá que la enzima sea localizada de una manera que no entrará en contacto con el sustrato. De esta manera la acción enzimática de la enzima no ocurrirá hasta que la enzima se pone en contacto con su sustrato. La enzima puede ser puesta en contácto con sú sustrato mediante el proceso de molienda (rotura física de la integridad celular), o al calentar las células o tejido de planta para romper la integridad física de las células de planta u órganos que contienen enzima. Por ejemplo, una enzima hidrolizante de almidón mesofilica puede ser dirigida al apoplasto o al retículo endoplásmico y así no entrar en contacto con los gránulos de almidón en el amiloplasto . "La molienda del grano romperá la integridad del grano y la enzima hidrolizante de almidón luego se pondrá en contacto con los gránulos de almidón. De esta manera los efectos negativos potenciales de la co-localización de una enzima y sus sustratos puede ser evitada.
En otra modalidad, un promotor especifico de tejido incluye los promotores específicos de endosperma tal como el promotor de ?-zeína de maíz (ejemplificado por la SEQ ID NO: 12) o el promotor ADP-gpp de maíz (ejemplificado por la SEQ ID NO: 11, que incluye una secuencia no traducida 5' y un intrón) . Así, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende un promotor que comprende la SEQ ID NO: 11 o 12, un polinucleótido que híbrida al complemento de la misma bajo condiciones de hibridación de baja severidad, o un fragmento de la misma que tiene actividad de promotor, por ejemplo, por lo menos 10%, y de preferencia por lo menos 50%, la actividad de un promotor que tiene la SEQ ID NO: 11 o 12.· En otra modalidad de la invención, el polinucleótido codifica una enzima procesadora hipertermofílica que está operablemente enlazada a un péptido de tránsito de cloroplasto (amiloplasto) (CTP) y un dominio de enlace de almidón, por ejemplo, del gen wasy. Un polinucleótido ejemplar en esta modalidad codifica la SEQ ID NO: 10 (a-amilasa enlazada al dominio de enlace de almidón del wasy) . Otros polinucleótidos ejemplares codifican una enzima procesadora hipertermofílica enlazada a una secuencia de señal que dirige una enzima al retículo endoplásmico y la secreción al apoplasto (ejemplicado por un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 13, 27 o 30, que comprende la secuencia N- terminal de la ?-zeína de maíz operablemente enlazada a a-amilasa,. a-glucosidasa, glucosa-isomerasa, respectivamente) una enzima procesadora hipertermofilica enlazada a una secuencia de señal que retiene la enzima en el retículo endoplásmico (ejemplicado por un polinucleótido que codifica la SEQ ID N0:14, 26, 28, 29, 33, 34, 35 o 36, que comprende la secuencia N-terminal de la ?-zeina de maíz' operablemente enlazada a la enzima hipertermofilica, que está operablemente enlazada a SEKDEL, en donde la enzima es a-amilasa, MalA a-glucosidasa, glucosa isomerasa de T. marítima, glucosa isomerasa de T. neapolitana) , una enzima procesadora ipertermofilica enlazado a una secuencia N-terminal que dirige la enzima al amiloplasto (e emplificado por un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 15, que comprende la secuencia de dirección de amiloplasto N-terminal de wasy operablemente enlazado a a-amilasa), un polipéptido de fusión hipertermofílico que dirige la enzima a los gránulos- de almidón (ejemplicada por un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 16, que comprende la secuencia de dirección de amiloplasto N-terminal de wasy operablemente enlazado a un polipéptido de fusión de a~amilasa/ti/asy que comprende el dominio de enlace de almidón wasy) , una enzima de procesamiento hiperterr.c £ ilica enlazada a una señal de retención ER (e emplificada por un polinucleótido que codifica la SEQ ID :::3? y 39). Además, una enzima procesadora hipertermofil ca pueden ser enlazada a un sitio de enlace de almidón bruto que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:53), en donde el polinucleótido que codifica la enzima de procesamiento está enlazado a la secuencia de ácido nucleico optimizada de maíz (SEQ ID NO: 54) que codifica este sitio de enlace. Varios promotores inducibles se han reportado. Muchos son descritos en una revisión por Gatz, en Current Opinión in Biotechnology, 7:168. (1996) y Gatz, C, Annu. Rey. Plant Physi-ol. Plant. Mol. Biol., .48:89 (1997). Ejemplos incluyen el sistema represor de tetraciclina, sistema represor de Lac, sistemas inducibles de cobre, sistemas inducibles de salicilato (tal como el sistema PRla) , sistema inducible de glucocorticoide (Aoyama T. Y colaboradores, N-H Plant Journal, 11:605 (1997)) y sistemas inducibles de ecdisona. Otros promotores inducibles incluyen los promotores inducibles de ABA y de turgor, el promotor del gen de proteina de enlace de auxina (Schwob y colaboradores, Plant J., 4:423 (1993)), el promotor de gen de glicosil-transferasa flavonoide de glucosa UDP (Ralston y colaboradores, Genetics , 119:185 (1988)), el promotor inhibidor de proteinasa MPI (Cordero y colaboradores, Plant J., 6:141 (1994)) y el promotor de gen de gil ;eraldehido-3-fosfato deshidrogenase (Kohler y colaboradores, Plant Mol. Biol., 29:1293 (1995); Quigley y colaboradores, J. Mol. Evol., 29:412 (1989); Martínez y colaboradores, J. Mol. Biol. 208:551 (1989) 4.
También incluidos están los sistemas inducibles de benceno sulfonamida (patente norteamericana No. 5,364,780) y los sistemas inducibles de alcohol (WO 97/06269 y WO 97/06268) y los promotores de glutationa S-transferasa. Otros estudios se han enfocado en genes induciblemente regulados en respuestas al estrés ambiental o estímulos tales como la salinidad incrementada, sequía, patógenos y destrozos. (Graham y colaboradores, J. Bi-ol. Chem., 260:6555 (1985); Graham y colaboradores, J. Biol. Chem. 260:6561 (1985), Smith y colaboradores, Planta, 168:94 (1986)). La acumulación de la proteína del inhibidor de metalocarboxípeptidasa se ha reportado en' las 'hojas de plantas de papa afectadas (Graham y colaboradores, Biochem. Biophys . Res. Comm., 101:1164 (1981)). Otros genes de planta se han reportado que son inducidos por el jasmonato de metilo, inductores, choque térmico, estrés anaeróbico o moderadores a herbicidas . La expresión regulada de una proteína de replicación viral de transacción quimérica puede, ser además regulada por otras estrategias genéticas tales como, por ejemplo, la activación del gen mediado por Cre (Odell y colaboradores, Mol. Gen. Genet . , 113:369 (1990)). Así, un fragmento de DNA que contiene la secuencia reguladora 3' enlazada por los sitios lox entre el promotor y la secuencia de codificación de proteina de replicación que bloquea la expresión de un gen de replicación quimérico del promotor puede ser removida mediante la excisión mediada por Cre y da por resultado la expresión del gen de replicación de transacción. En este caso el gen Cre quimérico, el gen de replicación de transacción quimérico, o ambos pueden estar bajo el control de los promotores específicos del tejido y del desarrollo o inducibles . Una estrategia genética alterna es el uso del gen supresor de tRNA. Por ejemplo, la expresión regular de un gen supresor de tRNA puede condicionalmente controlar la expresión de una secuencia de codificación de proteina de replicación de transacción que contiene un codón de terminación apropiado (Ulmasov y' colaboradores Plant Mol." Biol., 35:417 (1997)). Nuevamente, ya sea el tRNA de gen supresor de tRNA quimérico, el gen de replicación de transacción quimérico, o ambos pueden estar bajo el control de los promotores específicos del tejido o específicos del desarrollo o inducibles . De preferencia, en el caso de un organismo multicelular, el promotor también puede ser específico para un tejido particular, órgano o etapa de desarrollo. Ejemplos de tales promotores, incluyen, pero no están limitados a, el ADP-gpp de Zea mays y el promotor de ?-zeina de Zea mays y el promotor de globulina de Zea mays. La expresión de un gen en una planta transgénica puede ser deseada solamente en un cierto período de tiempo durante el desarrollo de la planta. La sincronización de desarrollo está frecuentemente relacionada con la expresión de gen especifico del tejido. Por ejemplo, la expresión de las proteínas de almacenamiento de zeína es iniciada en el endosperma a aproximadamente 15 días después de la polinización. Adicionalmente, los vectores pueden ser construidos y empleados en la dirección intracelular de un producto de gen específico dentro de las células de una planta transgénica o en la dirección de una proteína al medio ambiente extracelular . Esto generalmente será alcanzado al unir una secuencia de DNA que codifica una secuencia' -de péptido de señal o de tránsito o la secuencia de codificación de un gen particular. El péptido de tránsito o de señal resultante transportará la proteína a un destino intracelular o extracelular particular, respectivamente, y luego . los removerá postraduccionalmente. Los péptidos de tránsito o de señal actúan al facilitar el transporte de las proteínas a través de las membranas intracelulares, por ejemplo vacuola, vesícula, plástida y membranas mitocóndricas, mientras que los péptidos .de señal dirigen las proteínas a través de la membrana extracelular. Una secuencia de señal tal como la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maíz para la dirección al retículo endoplásmico y la secreción en la apoplasto puede ser operablemente enlazada a un polinucleotido que codifica una enzima de procesamiento hipertermofllica de acuerdo con la presente invención (Torrent y colaboradores, 1997) . Por ejemplo, las SEQ ID N0s:13, 27 y 30 proporcionan un polinucleotido que codifica una enzima hipertermofilica operablemente enlazada a la secuencia N-terminal de la proteina de ?-zeina de maíz. Otra secuencia de señal es la secuencia de aminoácidos SEKDEL para la retención de polipéptidos en el retículo endoplásmico (Munro y Pelham, 1987) . Por ejemplo, un polinucleotido que codifica la SEQ ID NOS: 14, 26, 28, 29, 33, 34, 35 o 36, que comprende la secuencia N-terminal de la ?-zeína de maíz operablemente enlazada a una enzima de procesamiento que es operablemente enlazada a SEKDEL. Un polipéptido también puede ser dirigido al amiloplasto mediante la fusión del péptido de dirección de amiloplasto wasy (Klosgen y colaboradores, 1986) o a · un gránulo de almidón. Por ejemplo," el polinucleotido que codifica una enzima procesadora hipertermofilica puede ser operablemente enlazado a un péptido de tránsito de cioroplasto (amiloplasto) (CTP) y un dominio de enlace de almidón, por ejemplo, del gen wasy. La SEQ ID NO: 10 ejemplifica la a-amilas enlazada al dominio de enlace de almidón del wasy. La SE^ l' O:15 ejemplifica la secuencia ce dirección de amiloplasto d la sécuencia N-terminal del wasy operablemente enlazado a a-amxíasa. Además, el polinucleótxdo que codifica la enzima procesadora puede ser fusionado a los gránulos de almidón objetivo usando el dominio de enlace de almidón wasy. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 16 ejemplifica un polipéptido dé fusión que comprende la secuencia de dirección de amiloplasto N-terminal del wasy operablemente enlazado a un polipéptido de fusión de -amilasa/wasy que comprende el dominio de enlace del almidón wasy. Los polinucleótidos de la presente invención, además de las señales de procesamiento, además pueden incluir otras secuencias reguladoras, como es conocido en la técnica. Las "secuencias reguladoras" y "secuencias reguladoras adecuadas" cada uno se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas corriente arriba (secuencias de no codificación 5' ) dentro, o corriente abajo (secuencias de no codificación 3' ) de una secuencia de codificación, y que influencian la transcripción, procesamiento de RNA o estabilidad, o la traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras incluyen mej oradores, promotores, secuencias guias de traducción, intrones y secuencias de señal de poliadenilación. Ellos incluyen secuencias naturales y sintéticas asi corr.o secuencias, que pueden ser una combinación de secuencias sintéticas y naturales. Los marcadores seleccionables también pueden ser usados en la presente invención para permitir la selección de plantas transformadas y jido de planta, como es bien conocido en la técnica. Se puede desear emplear un gen marcador selecciónatele o clasificable como el, o además del, gen expresable de interés. Los "genes marcadores" son genes que imparten un fenotipo distinto a las células que expresan el gen marcador y asi permiten que tales células transformadas sean distinguidas de las células que no tienen el marcador. Tales genes pueden codificar ya sea un marcador seleccionable o clasificable, dependiendo de si el marcador confiere una cualidad que se puede seleccionar por medios químicos, es decir, a través del uso de ün agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibióticos, o similares), o si es simplemente una cualidad que sé puede identificar a través de la observación o prueba, es decir, mediante la clasificación (por ejemplo, la cualidad del sitio R) . Por supuesto, muchos ejemplos de genes marcadores adecuados son conocidos en la técnica y pueden ser empleados en la práctica de la invención. Incluidos dentro de los términos de genes marcadores seleccionables o clasificables también están los genes que codifican un "marcador secretable" cuya secreción puede ser detectada como un medio para identificar' o seleccionar ' células transformadas. Ejemplos incluyen marcadores que incluyen un antígeno secretable que puede ser identificado por la interacción del anticuerpo, o a una enzima secretable que puede ser detectadas por su actividad catalítica. Las proteínas secretables caen en un número de clases,' incluyéndose proteínas difusibles, pequeñas, detectables, por ejemplo por ELISA; enzimas activas pequeñas detectables en las soluciones extracelulares (por ejemplo, -amilasa, ß—lactamasa, fosfimotricina acetiltransferasa) / y proteínas que son insertadas o atrapadas en la pared celular (por ejemplo, proteínas que incluyen una secuencia guia tal como aquella encontrada en la unidad de expresión de extensina o' PR-S de tabaco) . Con respecto a los . marcadores secretables seleccionables, el uso de un gen que codifica una proteina que llega a ser secuestrada en la pared celular, y 'está proteina que incluye un epitope único se considera que es particularmente ventajoso. Tal marcador de antigeno secretado idealmente emplearla una secuencia de epitope que proporcionarla bajo antecedente en el tejido de planta, una secuencia guia de promotor que impartirla eficiente expresión y dirección a través de la membrana de plasma, y produciría proteína que es enlazada en la pared celular y todavía accesible a los anticuerpos . Una proteína de pared normalmente secretada o modificada para incluir un epitope único cumpliría con todos los requerimientos de tal clase . Un ejemplo de una proteína adecuada para la modificación de esta manera es la extensina, o glucoproteina rica en hidroxiprolina (HPRG) . Por ejemplo, la molécula HPRG de maíz (Steifel y colaboradores, The Plant Cell, 2:785 (1990) ) es bien caracterizada en términos de biología molecular, la expresión y estructura de la proteína- Sin embargo, cualquiera de una variedad de extensinas y/o proteínas de pared rica en glicina ' (Keller y colaboradores, EMBO Journal, 8:1309 (1989)) podrían ser modificadas mediante la adición de un sitio antigénico para crear un marcador clasificable . •a. Marcadores Seleccionables Los marcadores seleccionables posibles para el uso en relación con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un gen neo o nptll (Potrykus y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 199:183 (1985)) que codifica para la resistencia a la kanamicina y puede ser seleccionado para usar kanamicina G418 y similares; un gen bar que confiere resistencia al herbicida fosfinotricin; un gen que codifica una proteina de sintasa de EPSP alterada (Hinchee y colaboradores, Biotech., 6:915 (1988))) confiriendo de esa manera resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia a bromoxinilo (Stalker y colaboradores., Science, 242:419 (1988)); un gen de acetolactato sintasa mutante (ALS) que confiere resistencia a la imidazolínona, sulfonilurea y otras sustancias químicas inhibidoras de ALS (solicitud de patente europea No. 154,204, 1985); un gen DHFR resistente a metotrexato (Thillet y colaboradores, J. Biol. Chem., 263 : 12500 (1988); un gen dalapon de alogenasa que confiere resistencia al herbicida dalapon; un gen fosfomanosa isomerasa ( PMI ) ; un gen antranilato sintasa mutada que confiere resistencia a 5-metil-triptofano; el gen hph que confiere resistencia al antibiótico higromicina; o el gen manosa-6-fostato isomerasa (también referido en la presente como el gen fosfomanosa isomerasa), que proporciona la habilidad para metabolizar mañosa (patentes norteamericanas Nos. 5,767,378 y 5,994,629). Un experto en la técnica es capaz de . seleccionar un gen marcador seleccionable adecuado para uso en la presente invención. Donde se emplea un gen sintasa EPSP mutante se puede realizar beneficio adicional a través de la incorporación de un péptido de tránsito .de cloroplasto adecuado, CTP (solicitud de patente europea No. 0, 218, 571, 1987) . Una modalidad ilustrativa de un gen marcador seleccionable capaz de ser usado en sistemas para seleccionar transformantes son los genes que codifican la enzima fosfinotricina acetiltransferasa, tal como el gen bar de Streptomyces hygroscopic::s o el gen pat de Streptomyces viridochromogenes. La e n: :. a fos finotricin acetil transferasa ( PAT ) inactiva el ingrediente activo en el herbicida bialafos, fosfinotricin i P ?T ) . PP inhibe la glutamina sintetasa (Murakami y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 205:42 (1986); T ell y colaboradores, Plant Physiol., 91:1270 (1989)) ocasionando la acumulación rápida de amoniaco y la muerte celular. El éxito en usar este sistema selectivo en conjunción con monocotiledóneas fue particularmente sorprendente debido a que las principales dificultades se han reportado en la transformación de cereales (Potrykis, Trends Biotech., 7:269 (1989)) . Donde se desea emplear un gen de resistencia a bialafos en la práctica de la invención, un gen particularmente útil para este propósito es el gen bar o pat obtenible de la especie de Streptomyces (por ejemplo, ATCC No." 21,705) . La clonación del gen bar ha sido descrita (Murakami y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 205:42 (1986); Thompson y colaboradores., EMBO Journal, 6:2519 (1987)) ya que tiene el uso del gen bar en el contexto de plantas diferentes de monocotiledóneas (De Block y colaboradores, EMBO Journal, 6:2513 (1987); De Block y colaboradores, Plant Physiol., 91:694 (1989)) . b. Marcadores Clasificables Los marcadores clasificables que pueden ser empleados incluyen, pero no están limitados a, un gen ß-glucoronidasa o un gen idA (GUS) que codifica una enzima para la cual se conocen vamos sustratos cromogénicos; un gen de sitio R, que codifica un producto que regula la producción de_ los pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos de plantas (Dellaporta y colaboradores, en Chromosome Structure and Function, pp. 263-282 (1988)); un gen ß-lactamasa (Sutcliffe, PNAS USA, 75:3737 (1978)), que codifica una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica) ; un gen xylE (Zukiwsky y colaboradores, PNA5 USA, 80:1101 (1983)) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen -amilasa (Ikuta y colaboradores, Biotech. , 8:241 (1990)); un gen tirosinasa (Katz y colaboradores, J. Gen. Microbiol., 129:2703 (1983)) que codifica una enzima capaz de . oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa para formar el compuesto fácilmente detectable en melanina; un gen ß-galactosidasa, que codifica una enzima para la cual existen sustratos cromogénicos; un gen luciferasa (lux) (Ow y colaboradores, Science, 234:856 (1986)), que permite la detección por bioluminiscencia; o un gen aequorina (Prasher y colaboradores, Biochem Biophys. Res. Comía., 126:1259 (1985)), que puede ser empleado en la detección de bioluminiscencia sensible al calcio, o gen de proteina fluorescente verde (Niedz y colaboradores, Plant Cell Reports, 14:403 (1995)) . Los genes del complejo de gen R de maíz se contemplan que son par icularmente útiles como marcadores clasificables . El complejo de gen R en el maíz codifica una proteína que actúa para regular la producción de pigmentos ié antocianina en la mayoria de semillas y el tejido de plantas. Un gen del complejo de gen R es adecuado para la transformación del maíz, debido a que la expresión de este gen en células transformadas no daña las células. Asi, un gen R introducido en tales células ocasionará la expresión de un pigmento rojo y si es establemente incorporado, puede ser visualmente registrado como un sector rojo. Si una linea de maiz lleva alelos dominantes para los genes que codifican los intermediarios enzimáticos en la ruta biosintética de antocianina (C2, Al, A2, Bzl y Bz2), pero lleva un alelo recesivo en el sitio R, la transformación de cualquier célula de esa linea con R dará por resultado la formación dé pigmento rojo. Lineas ejemplares incluyen Wisconsin 22 que contiene el alelo rg-stadler y TR112, un derivado 55 es r-g, b, Pl . Alternativamente cualquier genotipo de maiz puede ser utilizado si los alelos Cl y R con introducidos con untamente. Un marcador clasificable adicional contemplado para uso en la presente invención es la luciferasa de luciérnaga, codificada por el gen lux, la presencia del gen lux en las células transformadas puede ser detectado usando, por ejemplo, la película de rayos X, control de centelleo, espectrofotometría fluorescente, cámaras de video de baja luz, cámaras de conteo de fotones o luminometría de multicavidades . También se contempla que este sistema puede ser desarrollado para la clasificación poblacional por bioluminiscencia, tal como en placas de cultivo de tejido o aun para la clasificación de plantas completas. Los polínucleótidos usados para transformar la planta pueden incluir, pero no están limitados a, DNA de genes de planta y genes no de plantas tales como aquellos de bacterias, levaduras, animales o virus. El DNA introducido puede incluir genes modificados, porciones de genes o genes quiméricos, incluyendo genes del mismo o diferente genotipo del maiz. El término "gen quimérico" o "DNA quimérico" se define como un gen o secuencia o segmento de DNA que comprende por lo menos dos secuencias o segmentos de DNA de especies que no combinan DNA bajo condiciones naturales", ¦ o secuencias o segmentos de DNA que están posicionados o enlazados de manera que normalmente no surgen en el genoma nativo de la planta no transformada. Además se proporcionan casetes de expresión que comprende el polinucleótido que codifica una enzima procesadora hipertermofilica, y de preferencia un polinucleótido optimizado de codón. Se prefiere que el polinucleótido en el cásete de expresión (el primer polinucleótido) esté operablemente enlazado a las secuencias reguladoras, tal como un promotor, un mejorador, un intrón, una secuencia de terminación o cualquier combinación de las mismas, y, opcionalmente a un segundo polinucleótido que codifica una secuencia de señal (N- o C-terminal) que dirxge la enzima codificada por el primer polinucleótido a una localización celular o subcelular particular. Asi, un promotor y una o más secuencias de señal en proporcionar altos niveles de' expresión de la enzima en localizaciones particulares en una ' planta, tejido de planta o célula de planta. Los promotores pueden ser promotores constitutivos, promotores inducibles (condicionales) o promotores específicos del tejido, por ejemplo, promotores específicos del endosperma tal como el promotor de ?-zeína de maíz (ejemplificado por la SEQ ID NO: 12) o el promotor ADP-gpp de maíz (ejemplificado por la SEQ ID NO: 11, que incluye una secuencia' no traducida 5' y un intrón) . La invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende un promotor que comprende la SEQ ID NO: 11 o 12, ,un polinucleótido que híbrida al complemento de la misma bajo condiciones de hibridación de baja severidad, un fragmento del mismo que tiene actividad de promotor, por ejemplo, al menos 10%, de preferencia al menos 50%, la actividad de un promotor que tiene la SEQ ID NO: 11 o 12. También se proporcionan vectores que comprenden el cásete de expresión o polinucleótido de la invención y células transformadas que comprenden el polinucleótido, cásete de expresión o vector de la invención. Un vector la invención puede comprender ur.a secuencia de polinucleót do que codifica más de una enzima procesadora hipertermofil :a . de la invención, secuencia que puede estar en orientación de sentido o antisentido, y una célula transformada puede comprender uno o más vectores de la invención. Los vectores preferidos son aquellos útiles para introducir ácidos nucleicos en células de plantas. Transformación El cásete de expresión, o una construcción de vector que contiene el cásete de expresión puede ser insertado en una célula. El cásete de expresión o construcción de vector puede ser llevado episomalmente o integrado en el genoma de la célula. La célula transformada luego puede ser cultivada en una planta transgénica. Por consiguiente, la invención proporciona los productos de la planta transgénica. Tales productos pueden incluir, pero no están limitados a, las semillas, fruto, progenie y productos de la progenie de la planta transgénica. Una variedad de técnicas están disponibles y conocidas para aquellos expertos en la técnica para la introducción de construcciones en un huésped celular. La transformación de bacterias y muchas células eucariótxcas puede ser realizada a través del uso de polietilenglicol, cloruro de calcio, infección viral, infección por fago, electroporación y otros ~e codos conocidos en la técnica. Las técnicas para la transformación de células o te ido de plantad incluyen' la transformación con DNA empleando A. turnefaciens o A. rhizoger..es como el agente de transformación, electroporación, inyección de DNA, bombardeo de microproyectiles, aceleración de partículas, etc. (Ver, por ejemplo, EP 295959 y EP 138341) . En una modalidad, los vectores de tipo binario de los plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium spp. Los vectores derivados de Ti son usados para transformar una amplia variedad de plantas superiores, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, tal como soya, algodón, colza, tabaco y arroz (Pacciotti y colaboradores Bio/Technology, 3:241 (1985) : Byrne y colaboradores, Plant Ceil Tissue and Organ Culture, 8:3 (1987); Sukgapinda y colaboradores, Plant Mol. Biol., 8:209 (1987); Lorz y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 199:178 (1985); Potrykus Mol. Gen. Genet., 199:183 (1985); Park y colaboradores., J. Plant Biol., 38:365 (1985): Hiei y colaboradores, Plant J. , 6:271 (1994)). El uso de T-DNA para transformar células de plantas ha recibido estudio extensivo y es ampliamente descrito (EP 120516; Joekema, In: The Binary Plant Vector System. Offset-drukkerij Kanters B.V.; Alblasserdam (1985), Chapter V; Knauf, y colaboradores, Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium In: Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction. Puhler, A. ed., Springer-Verlag, New York, 1983,' p. 245: y An. Y colaboradores., EMBO J . , 4;277 (1985)).
Otros métodos de transformación están disponibles para aquellos expertos en la técnica, tal como la captación directa de construcciones de DNA extrañas (ver EP 295959)., técnicas de electroporación (Fromm y colaboradores, Nature (London), 319:791 (1986), o el bombardeo balístico de alta velocidad con partículas de metal recubiertas con las construcciones de ácido nucleico (Kline y colaboradores/ Nature (Londos) .327; 70 (1987) y la patente norteamericana No. 4,945,050). Una vez transformadas, las células pueden ser regeneradas por aquellos expertos en la técnica. De relevancia particular son los métodos recientemente descritos para transformar genes extraños en cultivos cbmercialmenté importantes, tal como semilla de colza (De Block y colaboradores, Plant Physiol. 91:694-701 (1989)), girasol (Everett y colaboradores, Bio/Technology, 5:1201 (1987)), soya (McCabe y colaboradores, Bio/Technology, 6:923 (1988); Hinchee y colaboradores, Bio/Technology, 6:915 (1988); Chee y colaboradores, Plant Physiol., 91:1212 (1989);. Christou y colaboradores, Proc. Nati. Rcad. Sci USA, 86:7500 (1989) EP 301749), arroz (Hiei y colaboradores, Plant J., 6:271 (1994)) y maíz (Gordon amm y colaboradores, Plant Cell, 2:603 (1990); Fromm y colaboradores, Biotechnology, 8:833, (1990)) . Los vectores de expresión que contienen fragmentos genómicos o sintéticos pueden ser introducidos en protoplastos o en tejidos intactos o células aisladas. De preferencia los vectores de expresión son introducidos en el tejido intacto. Se proporcionan métodos generales para cultivar tejidos de plantas, por ejemplo, por Maki y colaboradores "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich y colaboradores (Eds.), pp. 67-88 CRC Press (1993); y por Phillips y colaboradores, "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation" in Corn & Corn Improvement, 3rd Edition 10, Sprague y colaboradores (Eds.) pp. 345-387, American society of Agronomy Inc. (1988). En una modalidad, los vectores de expresión pueden ser introducidos en el maiz u otros tejidos de plantas usando un método de transferencia de gen directo tal como el suministro mediado por microproyectiles, inyección de DNA, electroporación y similares . Los vectores de expresión son introducidos en los tejidos de plantas usando el suministro del medio de microproyectiles, con el dispositivo biolistico. Ver, por ejemplo, Tomes y colaboradores, "Direct DNA transfer into intact plant cells via microproj ectile bombardment" in Gamborg and Phillips (Eds.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Springer Verlag, Berlín (1995) . No obstante, la presente invención contempla la transformación de plantas con una enzima procesadora hipertermofílica de acuerdo con los métodos de transformación conocidos. También ver, Weissinger y colaboradores, _ Anual Rev. Genet., 22:421 (1988); Sanford y colaboradores, Particulate Science and Technology/ 5:27 (1987) (cebolla); Datta y colaboradores , Bio/Techr.ology, 8:736 (1990) (arroz) ; Klein y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 85:4305 (1988) (maiz) ; Kelin y colaboradores, Bio/Technology, 6:559 (1988) maiz); Kelin y colaboradores, Plant Physiol, 91:440 (1988) (maiz); Klein y colaboradores, Bio/Technology, 6:559 (1988) (maiz); y Gordon-Kamm y colaboradores, Plant Cell, 2:603 (1990) (maiz); Svab y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:8526 (1990) (cloroplasto de tabaco); Koziel y colaboradores, Biotechnology, 11:194 (1993) (maiz); Shimamoto y colaboradores, Nature, 338:274 (1989) (arroz); Christou y colaboradores, Biotechnology, 9:957 (1991) (arroz); European Patent Application EP 0 332 581 (hierbas de huerto y otiros Pooideae) ; Vasil y colaboradores, Biotechnology, 11:1553 (1993) (trigo); Weeks y colaboradores, Plant Physiol., 102:1077 (1993) (trigo) . Me.thods in Molecular Biology, 82. Arabidopsis Procois Ed. Martinez-Zapater and Salinas 1998 Humana Press (Arabidopsis) . La transformación de plantas puede ser llevada a cabo con una sola molécula de DNA o múltiples moléculas de DNA (es. decir, co-trans : rmacion) y ambas de estas técnicas son adecuadas para el · ?? on los casetes y construcciones ce expresión de la presente invención. Numerosos vectores de transformación están disponibles para la transformación de plantas, y los casetes de expresión de esta invención pueden ser usados en conjunción con cualquiera de tales vectores. La selección del vector dependerá ' de la técnica de transformación preferida y la especie objetivo para la transformación. Finalmente, los segmentos de DNA más deseables para la introducción en un genoma de monocotiledónea pueden ser genes o familias de genes homólogos que codifican una cualidad deseada (por ejemplo, "hidrólisis de proteina, lipidos- o polisacáridos) y que son introducidos bajo el control de promotores o mej oradores novedosos, etc., o quizás a uh promotor o elementos de control homólogos o específicos del tejido (por ejemplo, específicos de raíz, envoltura/vaina, verticilo, tallo, pedúnculo, semilla u hoja) . En realidad, se contempla que un uso particular de la presente invención será la dirección de un objetivo de una manera constitutiva o de una manera inducible. Ejemplos de Vectores de Transformación Adecuados Numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de plantas son conocidos para aquellos expertos ordinarios en las técnicas de transformación de plan as y los genes pertinentes a esta invención pueden ser usados en conjunción con cualquiera de tales vectores conocidos en la técnica-. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y la especie objetivo para la transformación . ' a. Vectores adecuados para la Transformación con Agrobacterium Muchos vectores están disponibles para la transformación usando Agrobacterium tumefaciens . Estos típicamente llevan por lo menos una secuencia de borde de T-DNA e incluyen vectores tal como pBIN19 (Bevan, Nucí. Acids. Res . (1984)). Enseguida, se describe la construcción de dos vectores típicos adecuados para la transformación con Agrobacteri um . PCIB200 y pCIB2001 Los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001 son usados para la construcción de vectores recombinantes para el uso con Agrobacterium y son construidos de la siguiente manera. PTJS75kan es creado mediante la digestión con NarI de pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol., 164:446 (1935)) permitiendo la excisión del gen de resistencia a tetraciclina, seguido por la inserción de un fragmento Accl de pUC4K que lleva un PTII (Messing & Vierra, Gene, 19:259 (1982): Bevan y colaboradores, Nature, 304:184 (1983): McBride y colaboradores, Plant Molecular Biology, 14:266 (1990) ) , Los enlazadores hol son ligados al framento Eco V de PC1B7 que contiene los bordes de T-DNA izquierdo y derecho, un gen quimérico r. s r.ptII seleccionable de planta y el polienlazador pUC (Rothstein y coalboradores, Gene, 53:153 (1987)), y el fragmento digerido de Xhol son clonados en pTJS75kan digerido con Salí para crear pCIB200 (ver también EP 0 332 104, ejemplo 19). PCIB200 contiene los siguientes sitios de restricción de polienlazador únicos: EcoRI, SstI, Kpnl, BglII, Xbal y Salí. PCIB2001 es un derivado de pCIB200 creado por la inserción en el polienlazador de sitios, de restricción adicionales. Los sitios de restricción únicos en el polienlazador de pCIB2001 son EcoRI, SstI, Kpnl, BglII, Xbal, Salí, MluI, Bell, Avrll, Apal, Hpal y Stul. PCIB2001, además de contener estos sitios de restricción únicos también tiene selección de kanamicina de' plantas y bacterianas", bordes de T-DNA izquierdo y derecho para la transformación mediada con Agrobacterium, la función trfA derivada de RK2 para la mobilización entre E. colí y otros huéspedes, y las funciones OriT y OriV también de RK2. El polienlazador pCIB2001 es adecuado para la clonación de cásete de expresión de plantas que contienen sus propias señales reguladoras. pCIBlO y Derivados de Selección de Higiromicina del mismo : El vector binario pCIBlO contiene un gen que codifica resistencia a kanamicina para la selección en plantas y secuencias de borde izquierdo y derecho de T-DNA e incorpora secuencias del plásraido pRK252 de amplio rango de huésped que le permite replicarse tanto en E. coli y Agrobacterium. Su construcción es descrita por Rothstein y colaboradores (Gene, 53:153 (1987)). Se construyen varios derivados de pCIB.10 que incorporan el gen para higromicin B fosfotransferasa descrito por Gritz y colaboradores (Gene, 25_:179 (1983)). Estos derivados permiten la selección de células de plantas transgénicas en higromicina solamente (pCIB743), o higromicina o kanamicina (pCIB715, pCIB717). b. Vectores adecuados para la Transformación sin Agrobacterium La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens evita el requerimiento para las secuencias de T-DNA en el vector de transformación seleccionado" · y consecuentemente los vectores que carecen de estas secuencias pueden ser utilizados además de los vectores tales como aquellos descritos que contienen secuencias de T-DNA. Las técnicas de transformación que no dependen del Agrobacterium incluyen la transformación por medio del bombardeo de partículas, captación de protoplasto (por ejemplo, PEG y electroporación) y microinyección. La elección del vector depende grandemente de la selección preferida para la especie que es transformada. Ejemplos no limitativos de la construcción de vectores típicos adecuados para la transformación sin Agrobacterium son además descritos . PCIB3064 PCIB3064 es un vector derivado de pü"C adecuado para las técnicas de transferencia de gen directas en combinación con la selección por el herbicida basta (o fosfonotricina) . El plásmido pCIB246 comprende el promotor 35S de CaMV en fusión de operación con el gen GUS de E. coli y el terminador de transcripción 35S de CaMV y es descrito en la solicitud publicada de PCT WO 93/07273. El promotor 35S de este vector contiene dos secuencias de ATG 5' del sitio de inicio. Estos sitios son mutados usando técnicas de PCR estándares de tal manera para remover los ATG y generar los sitios de restricción SspI y Pvull . Los nuevos sitios de restricción son de 96 y 37· bp lejos del sitio salí único y' 101 y 42 bp lejos del sitio de inicio actual. El derivado resultante de pCIB246 es designado pClB3025. El gen GUS luego es extirpado de pCIB3025 mediante la digestión son Salí y Sacl, las terminaciones se despuntan y se religan para generar- el plásmido pCIB3060. El plásmido pJIT82 puede ser obtenido del John Innes Centre, Norwich y el fragmento Smal de 400 bp que contiene el gen bar de Streptomyces viridochromogenes es extirpado e insertado en el sitio Hpal de pCIB3060 (Thompson y colaboradores, 2MBC J, 6:2519 (1987)). Este pCIB3064 generado, que comprende el gen bar bajo el control del promotor 35S de CaMV u-l terminador para la selección a herbicida, a un gen para la resistencia a ampiicilina (para la selección en E. coli. y un polienlazador con los sitios únicos Sphl, PstI, HindIII y BamHI . Este vector es adecuado para la clonación de cásete de expresión de plantas que contienen sus propias señales reguladoras. pS0G19 -y pSOG35 : El plásmido pSOG35 es un vector de transformación que utiliza el gen dihidrofolato reductasa (DHFR) de E. coli como un marcador selecciónatele que confiere resistencia a metotrexato. La PCR es usada para amplificar el promotor 35S (-800 bp), intrón 6 del gen Adhl de maíz (-55C bp) y 18 bp de la secuencia guia no traducida GUS de pSOGlO . Un fragmento de 250 bp que codifica el gen dehidrofolato reductasa tipo II de ?. coli también es amplificado por PCR y estos dos fragmentos de PCR son ensamblados con un fragmento SacI-PstI del pB1221 (Clontec ) que comprende la cadena principal del vector PUC1S y el terminador de nopalina sintasa. El ensamble de estos fragmentos genera pSOG19 que contiene el promotor 35S en fusión con la secuencia del intrón 6, la guia GUS, el gen de DHFR y el terminador de nopalina sintasa. El reemplazo de la guia GUS en pS0Gl9 con la secuencia guia del virus moteado clorótico de maíz (MCMV) genera el vector pSOG35. pSOG19 y pSOG35 llevan el gen pUC para la resistencia a ampicilina y tienen los sitios Hindi;:, Sphl, PstI y EcoRI disponibles para la clonación de sustancias extrañas. C. Vector Adecuado para la Transformación de Cl roplasto Para la expresión de una secuencia de nucleótidos de la presente invención en plástidas de planta, se usa el vector de transformación de plástida pPH143 ( O 97/32011, ejemplo 36) . La secuencia de nucleótidos es insertada en pPH143 para reemplazar de esta . manera la secuencia de codificación PROTOX. Este vector luego es usado para la transformación de plástida y la selección de transformantes para la resistencia a espectinomicina . Alternativamente, la secuencia de nucleótido es insertada en pPH143 de modo que reemplaza el gen aadH. En este caso, los transformantes son seleccionados para la resistencia a los inhibidores PROTOX . Huéspedes de Plantas Sometidos a Métodos de Transformación Cualquier tejido de planta capaz de la propagación clonal subsecuente, ya sea por organogénesis o embriogénesis , puede ser transformado con una construcción de la presente invención. El término organogénesis significa un proceso mediante el cual los retoños y raices son desarrollados secuencialmente de centros meristemáticos mientras que el término embriogénesis significa un proceso mediante el cual los retoños y raices se desarrollan conjuntamente en un aspecto combinado (no secuencialmente) , ya sea de células somáticas o gametos. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y meior adecuados para, las especies particulares que son transformadas. Los objetivos de tejido ejemplares incluyen tejidos' o plantas diferenciadas o no diferenciadas, incluyendo, pero no limitadas a, discos de hojas, raices, tallos, retoños, hojas, polen, semillas, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametófitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemas épicos, brotes axilares y meristemas de raíz) y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocótilo) tejido de tumor y varias formas de células y cultivos tales como células individuales, protoplasto, embriones y tejido de callo. El tejido de planta puede estar en plantas o en cultivo de órganos, tejidos ó células . Las plantas de la presente invención pueden tomar una variedad de formas. Las plantas pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; las plantas pueden ser transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el cásete de. expresión) ; las plantas pueden comprender injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, un material de raiz transformado e injertado a una púa no transformada en especies de cítricos). Las plantas transformadas pueden ser propagadas por una variedad de medios tal como la propagación clonal o las técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, las plantas transformadas de primera generación (o TI) pueden ser autocultivadas para dar plantas transformadas de segunda generación (o 2) homocígotas, y las plantas T2 además propagadas a través de las técnicas de reproducción clásicas. Un marcador seleccionable dominante (tal como nptll) puede ser asociado con el cásete de expresión para ayudar en la reproducción. La presente invención puede ser usada para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo monocotiledóneas o dicotiledóneas, incluyéndose, pero no limitados a, maíz (Zea mays) , Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semilla, alfa'l-fa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeno (Sécale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorg um vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perlado (Eleusine coracana) ) , mijo proso (Panicum miliaceum) , mijo de cola de zorra (Setaria itálica) , mijo extendido (Eleusine coracana)), girasol (Heliant us annuus), cártamo (Carthamus tinctorius) , trigo (Triticum aestivum) , soya (Glycine" max), tabaco (Nicotiana tabacum) , papa (Solanum tuberosum) , manís (Arachis hipogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote (Ipomoea batatus) , mandioca (Manihot esculenta) , café (Cofea spp.), coco (Cosos nucífera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp, ) , cacao (Theobroma cacao) , te (Camelia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaca), papaya (Carica papaya) , anacardo (Anacardium occidentale) , macadamia (Macadamia integrifolia) , almendra (Prunus amygdalus), betabel (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, vegetales, plantas ornamentales, plantas de madera tales como coniferas y árboles cáducos, calabazas, zapallo, cáñamo, calabazin, manzano, peral, membrillo, melón, ciruela, cerezo, durazno, nectarina, albaricoque, fresa, vid, frambuesa, zarzamora, soya, sorgo, caña de azúcar, semilla de col, colsa, trébol, zanahoria y Arabldopsls th.alla.na.. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judias verdes (Phaseolus vulgaris), habas (Phaseolus limensia) , guisantes (lathyrus spp.), coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimiento, apio y miembros del género Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantalupo (C. cantalupensis) y melón amarillo (C. meló) .' Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hidrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis) , rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos atrompetados (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida) , clavel (Dianthus cary pr.ylius': , pastora roja (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo . Las coniferas que pueden ser empleadas en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tal como el pino del incienso (Pinus taeda) , pino dé tala (Pinus elliotii) , pino ponderoso (Pinus ponderosa), pino retorcido (Pinus contorta) y pino Monterrey (Pinus , radiata)> abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); cicuta del oeste (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea-glauca); secoya (Sequoia sempervirens ) ; abetos naturales tal como abeto blanco (Abies amabilis) y abeto de bálsamo (Abies balsamea) ; y cedros tal como el cedro rojo del Oeste (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis ) : las plantas leguminosas incluyen habichuelas y guisantes. Las habichuelas incluyen guar, algarroba, fenégreco, soya, habichuelas de jardín, caupi, mungo, haba, habichuela fava, lentejas, garbanzo, etc. Las legumbres incluyen, pero no están limitadas a, Arachis, por ejemplo, manis, Vicia, por ejemplo, arveja coronada, arveja vellosa, habichuela adzuki, mungo y garbanzo, Lupinus, por ejemplo, lupino, trifolio, Phaseolus, por ejemplo, habichuela común y haba, Pisum, por ejemplo, habichuela de campo, Melilotus, por ejemplo, trébol, Medicago, por ejemplo, alfalfa, Lotus, por ejemplo, trifolio, lens, por ejemplo, lenteja y amorfa. La hierba de forraje y césped preferida para uso en los métodos de la presente invención incluyen alraifa, hierba de huerto, cañuela espigada, ballico perenne, hierba curva encrespada y agrostis alba.
De preferencia, las plantas de la presente invención incluyen plantas de cultivo, por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soya, algodón, cártamo, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, cebada, arroz, tomate, papa, calabaza, melones, cultivos de legumbres, etc. Otras plantas preferidas incluyen Lilopsida y Panicoxdeae. Una vez que una secuencia de DNA deseada se ha transformado en una especie de planta particular, ésta se puede propagar en esa especie o mover en otra variedad de la misma especie, particularmente incluyendo variedades comerciales, usando técnicas de reproducción tradicionales. Enseguida se encuentran descripciones de técnicas representativas para conformar plantas tanto dicotiledóneas como monicotiledóneas así como una técnica de transformación de plástida representativa . a. Transformación de Dicotiledóneas Las técnicas de transformación para dicotiledóneas son bien conocidas en la técnica e incluyen técnicas basadas en Agrobacterium. y técnicas que no requieren Agrobacterium. Las técnicas sin Agrobacterium implican la captación de material genético exógeno directamente por los protoplastos o células. Esto puede ser realizado mediante la captación mediada por PEG o eleccroporación, suministro mediado por bombardeo de partículas, o mieroinyección. Ejemplos de estas técnicas son descritas por Paszkowski y colaboradores., £?-SC J. 3:2717 (1984), Potrykis y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 199:169 (1985), Reich y colaboradores, Biotechnology, 4 : 1001 (1986) y Klein y colaboradores, Nature, 2} 327: 70 (1987). En cada caso las células transformadas son regenerads a plantas completas usando técnicas estándares conocidas en el arte. La transformación mediada .por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de dicotiledóneas debido a su alta eficiencia de transformación y su amplia utilidad con muchas especies diferentes. La transformación con Agrobacterium típicamente implica la transferencia del vector binario que lleva el DNA extraño de interés (por ejemplo, pCIB200 o pCIB2001) a una cepa de Agrobacterium apropiada que puede depender del complemento de los genes vir llevados por la cepa de Agrobacterium huésped ya sea en un plásmido Ti co-residente o cromosomalmente (por ejemplo, la cepa CIB542 para pCIB200 y pCIB2001 (Uknes y colaboradores, Plant Cell, 5:159 (1993)). La transferencia del vector binario recombinante Agrobacterium es realizada por un procedimiento de acoplamiento de triple ascendencia usando E. coli que lleva el vector binario recombinante, una cepa de E. coli ayudante que lleva un plásmido tal como pRK2013 y que es capaz de movilizar el vector binario recombinante a la cepa Agrobacterium objetivo. Alternativamente, el vector binario recombinante puede ser transferido al Agrobacterium mediante la transformación de DNA (Hofgen & Willmitzer, Nucí . Acids Res . , 16:9877 (1988) ) . La transformación de la especie de planta objetivo mediante el Agrobacterium recombinante usualmente implica el co-cultivo del Agrobacterium con explantas de la planta y siguen los protocolos bien conocidos en la técnica. El tejido transformado es regenerado en el medio seleccionable que lleva el marcador de resistencia al antibiótico al herbicida presente entre los bordes de T-DNA de plásmido binario. Los vectores pueden ser introducidos a las células de plantas de manera conocidas . Las células preferidas para la transformación incluyen Agrojacterium, células monocotiledóneas y células dicotiledóneas, incluyéndose células Liliopsida y células Panicoideae. Las células monocotiledóneas preferidas son células de cereales, por ejemplo, maíz (cereal), cebada y trigo y las células dicotiledóneas que acumulan almidón, por ejemplo, papa. Otro procedimiento para transformar una célula de planta con un gen que implica la impulsión de partículas inertes o biológicamente activas en tejidos y células de plantas. Esta técnica es descrita en las patentes norteamericanas Nos. 4,945,050, 5,036,006 y 5,100,792. Generalmente, este procedimiento implica la impulsión de partículas inertes o biológicamente activas en las células bajo condiciones efectivas para penetrar la superficie externa de la célula y permitir la incorporación dentro del interior de la misma. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede ser introducido en la célula al recubrir las partículas con el vector que contiene el gen deseado. Alternativamente, la célula objetivo puede ser circundada por el vector de modo que el vector es llevado en la célula mediante la estela de la partícula. Las partículas biológicamente activas (por ejemplo, células de levadura seca, bacteria seca o un bacteriófago, cada uno que contiene DNA que se desea introducir) también pueden ser impulsadas en el tejido de la célula de planta. b. Transformación de Monocotiledóneas La transformación de la mayoría de especies de monocotiledóneas ahora también ha llegado a ser de rutina. Las técnicas preferidas incluyen la transferencia de gen directo en protoplastos usando técnicas de polietilenglicol (PEG) o electroporación, y un bombardeo de partículas en el tejido del callo. Las transformaciones también pueden ser realizadas con una sola especie de DNA o múltiples especies de DNA (es decir, co-crans formación) y ambas de estas técnicas son adecuadas para el uso con esta invención. La co-transformación puede ner la ventaja de evitar la construcción del vect:: completo y de generar plantas transgénicas con sitios r.2 enlazados para el gen de interés y el marcador seleccionable, permitiendo la remoción del marcador seleccionable en generaciones subsecuentes, si esto se considera deseable. Sin embargo, una desventaja del uso de la co-'transformación es que menos de 100% de frecuencia con las especies de- DNA separada son integradas en el genoma (Schocher y colaboradores, Biotechnology, 4:1093 (1986)). Las solicitudes de patente EP 292 435, EP 0 391 225 y WO 93/07278 describen técnicas para la preparación de callo y protoplastos de una linea endogámica de élite de maíz, la transformación de protoplastos usando PEG de electroporación, y la regeneración de plantas de maíz a partir de protoplastos transformados. Gordon Kamm y colaboradores (Plant Cell, 2:603 (1990)) y Fromm y colaboradores (Biotechnology, 8:833 (1990)) han publicado técnicas para la transformación de la linea de maíz derivada de A188 usando el bombardeo de partículas. Además, WO 93/07278 y Koziel y colaboradores (Biotechnology, _11:194 (1993)) describen técnicas para la transformación de líneas endogámicas de élite de maíz mediante el bombardeo de partículas. Esta técnica utiliza embriones de maíz inmaduro de 1.5-2.5 mm de longitud extirpados de una mazorca de maíz de 14-15 días después de la polinización y un dispositivo PDS-1000 He Biolistics para el bombardeo. La transformación del arroz también puede ser llevada a cabo mediante técnicas de transferencia de gen directas utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación mediada por protoplastos se ha descrito por los tipos de Japónica y los tipos Indica (Zhang y colaboradores, Plant Cell Rep, 7:379 (1988); Shimamoto y colaboradores, Nature, 338:274 (1989); Datta y colaboradores, Biotechnology, 8:376 (1990)) . Ambos tipos también son rutinariamente transformables utilizando el bombardeo de partículas (Christou y colaboradores., Biotechnology, 9:957 (1991) ) . Además, WO 93/21335 describe técnicas para la transformación del arroz por medio de la electroporación. La solicitud de patente EP 0 332 581 describe técnicas para la generación, transformación y regeneración de protoplastos de Pooideae. Estas técnicas permiten la transformación de Dactylis y trigo. Además, la transformación del trigo ha sido descrita por Vasil y colaboradores (Biotechnology, 10:667 (1992) ) usando bombardeo de partículas en células de callo regenerable a largo plazo de tipo C y también por Vasil y colaboradores (Biotechnology, 11:1553 (1993) y Weeks y colaboradores (Plant Physiol., 102:1077 (1993)) utilizando el bombardeo de partículas de embriones inmaduros y callo derivado de embrión inmaduro. Una técnica preferida para la transformación del trigo, sin embargo, implica la transformación del trigo mediante el bombardeo de partículas de embriones inmaduros e incluye una etapa ya sea de alto contenido de sacarosa o de alto contenido de maltosa antes del suministro de gen. Anees del bombardeo, cualquier número de embriones (0.75-1 mm en longitud) son colocados sobre el medio MS con sacarosa al 3% (Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum, , 15 :473 (1962) y 3 mg/1 de 2,4-D para la inducción de embriones somáticos, que se deja proceder en la oscuridad. En el dia de élección de bombardeo, los embriones son retirados del medio de inducción y colocados sobre el medio osmótico (es decir, medio de inducción con sacarosa o maltosa adicionada a la concentración deseada, típicamente 15%..Los embriones se dejan plasmolizar durante 2-3 horas y luego son bombardeados. 20 embriones por placa objetivo es típico, aunque no crítico. Un plásmido que lleva el gen apropiado (tal como pCIB3064 o pSG35) es precipitado sobre partículas de oro de tamaño mic ornétrico utilizando procedimientos estándares. Cada placa de embriones es disparada con el dispositivo de helio DuPont Biolistics® usando una presión de estallido de aproximadamente 1000 psi usando una criba de malla 80 estándar. Después del bombardeo, los embriones son • colocados nuevamente en la oscuridad para la recuperación durante aproximadamente 24 horas (aún en el medio osmótico). Después de 24 horas, los embriones son removidos del medio osmótico y colocados nuevamente sobre el medio de inducción donde permanecen durante aproximadamente un mes antes de la regeneración. Aproximadamente un mes después las explantas del embrión con el callo embriogénico en desarrollo son transferidas al medio de regeneración (MS + 1 mg/litro NAA, 5 mg/litro GA) , que además contiene el agente de selección apropiados (10 mg/1 basta en el caso de pCIB3064 y 2 mg/1 de metotrexato en el caso de pSOG35) . Después de aproximadamente un mes, los retoños desarrollados son transferidos a contenedores estériles más grandes conocidos como "GA7s" que contienen MS de mediana intensidad, sacarosa al 2% y la misma concentración del agente de selección. La transformación de monocotiledóneas, usando ¦ Agrobacterium también ha sido descrita. Ver, WO 94/00977 y la patente norteamericana No. 5,591,616, ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. c. Transformación de Plástidas Semillas de Nicotíana tabacum c.v. Xanthi nc' 'son germinadas siete por placa en un arreglo circular de 1" en el medio agar T y bombardeadas 12-14 dias después de la siembra con partículas de tungsteno de 1 ja (MIO, Biorad, Hercules, CA) recubiertas con DNA de los plásmidos pPH143 y pPH145 esencialmente como es descrito (Svab y Maliga, PNAS, 90:913 (1993) ) . Las plántulas bombardeadas son incubadas en el medio T durante dos dias después de lo cual las hojas son extirpadas y colocadas con el lado hacia arriba abaxial en luz brillante (350-500 µ?a?? de fotones/m2/s) sobre placas del medio RMOP (Svab, Haj dukiewicz y Maliga, PNAS, 87:8526 (1990)) que contiene 500 pg/ml de diclorhidrato de espectinomicina (Sigma, St. Louis, MO) . Los retoños resistentes que aparecen debajo de las hojas blanqueadas de tres a ocho semanas después del bombardeo son subclonados en el mismo medio selectivo, dejados formar el callo y los retoños secundarios aislados y subclonados. La segregación completa de las copias de genoma de plástida transformadas (homoplasmicidad) en subclones independientes es estimada por técnicas estándares del manchado de Southern (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1989)). El DNA celular total digerido, de BamHI/ScoRI es separado en geles de agarosa de Tris-borato al 1% (TBE) , transferido a membranas de nylon (Amersham) y sondeado por las secuencias de DNA cebadas áleatorias marcadas con """P correspondientes a un fragmento de DNA de BamHI/HindIII 0.7kb de pC8 que contiene una porción de la secuencia de dirección de plástida rps7/ 2. Los retoños homoplásmicos son arraigados asépticamente en el medio MS/IBA que contiene espectinomicina (McBride- y colaboradores, PNAS, 91:7301 (1994)) y transferidos al invernadero . Producción ? Caracterización de Plantas Establemente Transformadas Las células de plantas transformadas luego son colocadas en un medio ¿electivo apropiado para la selección de células transgénicas, rje luego son cultivadas al calle. Los retoños son cultivados del callo y las plantitas generadas del retoño ai ulcivar · en el medio para hechar raices. Las diversas construcciones normalmente serán unidas a un marcador para la selección en células de plantas. Convenientemente, el marcador puede ser de resistencia a un biocida (particularmente un antibiótico, tal como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, cloranfenicol, herbicida o similares) . El marcador particular utilizado permitirá la selección de células transformadas comparadas con las células que carecen del DNA que será introducido. Los componentes de las construcciones de DNA, incluyendo el . cásete de transcripción/expresión de esta invención, pueden ser preparados de las secuencias, que son nativas (endógenas) o extrañas (exógenas) al huésped. Por "extraño" se da a entender que la secuencia no es encontrada en el huésped de tipo silvestre en el cual es introducida la construcción. Las construcciones heterólogas contendrán por lo menos una región, que no es nativa al gen de la cual se deriva la región de transcripción-iniciación. Para confirmar la presencia de los transgenes en células y plantas transgénicas, un análisis de manchado de Southern puede ser realizado utilizando los métodos conocidos paa aquellos expertos en la técnica. La integración de un segmento de ácido poi ir.ucleico en el genoma puede ser detectado y cuantificado 'mediante el manchado de Southern, puesto que son fácilmente distinguidos de construcciones que contienen los segmentos a través del uso de enzimas de restricción apropiadas. Los productos de expresión de los transgenes pueden ser detectados en cualquiera de una variedad de maneras, dependiendo de la naturaleza del producto, e incluyen el manchado de Western y la prueba de enzima. Una manera particularmente útil para cuantificar la expresión de la proteina y para detectar la replicación en diferentes tejidos de plantas es usar un gen reportador, tal como GUS . Una vez que se han obtenido plantas transgénicas, ellas pueden ser cultivadas para producir tejidos o partes de plantas que tienen el fenotipo deseado. El tejido de planta o partes de planta pueden ser cosechados y/o recolectada la semilla. La semilla puede servir como una fuente para cultivar plantas adicionales con tejidos o partes que tienen las características deseadas. La invención asi proporciona una planta o parte de planta transformada, tal como una mazorca, semilla, fruto, grano, forraje, paja o bagazo, que comprende por lo menos un polinueleótido, cásete de vector de expresión de la invención, métodos para elaborar tal planta y métodos para usar tal planta o una parte de la misma. La planta o parte de planta transformada expresa una enzima procesadora, opcionalmente localizada en un compartimiento celular o subcelular particular de un cierto tejido o en el grano en desarrollo. Por ejemplo, la invención proporciona una parte de planta transformada que comprende por lo menos una en ma procesadora de almidón presente en las células de la planta, en donde, la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica por lo menos una enzima procesadora 'de almidón. La enzima procesadora no actúa en el sustrato objetivo a menos que sea activado por los métodos tal como el calentamiento, molienda, u otros métodos, que permite que la enzima se ponga en contacto con el sustrato bajo condiciones donde la enzima es activa . Métodos Preferidos de la Presente Invención Las plantas y partes de plantas autoprocesadoras de la presente invención pueden . ser usadas en varios métodos empleando las enzimas procesadores (mesofílicas, termofilicas o hipertermofílicas) expresadas y activadas en las mismas. De acuerdo con la presente invención, una parte de planta transgénica obtenida de una planta transgénica, el genoma de la cual es aumentado con por lo menos una enzima procesadora, es colocada bajo condiciones en las cuales . la enzima procesadora es expresada y activada. En la activación, la enzima procesadora es activada y funciona para actuar en el sustrato en el cual normalmente actúa para obtener el resultado deseado. Por ejemplo, las enzimas procesadoras de almidón actúan en el almidón para degradar, hidrolizar, isomerizar u de otra manera modificar para obtener el resultado deseado en la activación. Las enzimas procesadoras no de almidón pueden ser usadas para romper la membrana celular de la planta para facilitar la extracción de almidón lipidos, aminoácidos u otros productos de las plantas. Además, las enzimas no hipertermofiiicas e hipertermofilicas pueden ser usadas en combinación en la planta o partes de plantas autoprocesadoras de la presente invención. Por ejemplo, una enzima degradante no de almidón mesofilica puede ser activada para romper la membrana celular de la planta para la extracción de almidón es subsecuentemente como una enzima degradante de almidón hipertermofiiica luego puede ser activada en la planta autoprocesadora para degradar el almidón, " · Las enzimas expresadas en el grano pueden ser activadas al colocar la planta o parte de planta que las contiene en condiciones en las cuales es promovida su actividad. Por ejemplo, se pueden usar una o más de las siguientes técnicas: La parte de planta puede ser puesta en contacto con agua, que proporciona un sustrato para una enzima hidrolitica y de esta manera activará la enzima. La parte de planta puede ser puesta en contacto con agua que permitirá que la enzima migre del compartimiento en el cual se depositó durante el desarrollo de la parte de planta y de esta manera se asocie con su sustrato. El movimiento de la enzima es posible debido a que la compartimentalización es rota durante la maduración, secado del grano y rehidratación .
El grano intacto o quebrado puede ser puesto en contacto con agua' mientras que se permite que la enzima migre del compartimiento en el cual se depositó durante el desarrollo de la parte de la planta y de esta manera se asocie con su sustrato. Las enzimas también pueden ser activadas mediante la adición de' un compuesto de activación. Por ej mplo, una enzima dependiente de calcio puede ser activada mediante la adición de calcio. Otros compuestos de activación pueden ser determinados por aquellos expertos en la técnica. Las enzimas pueden ser activadas mediante la remoción de un inactivador. Por ejemplo, existen inhibidores de péptidos conocidos .de enzimas de amilasa, la amilasa podría ser coexpresada con un inhibidor de amilasa y luego activada mediante la adición de una proteasa. las enzimas pueden ser activadas mediante ila alteración de pH a uno en el cual la enzima es más activa. Las enzimas también pueden ser activadas al implementar la temperatura. Una enzima generalmente se incrementa en actividad hasta la temperatura máxima de esa enzima. Una enzima mesofílica se incrementará en actividad desde el nivel de la temperatura ambiental de actividad hasta la temperatura en la cual pierde actividad que es típicamente menor o igual a 70°C. De · manera sir.xlar las enzimas termofílicas e hipertermofílicas también ueden ser activadas en incrementar la temperatura. Las enzimas termofílicas pueden ser activadas al calentar a temperaturas hasta la temperatura máxima de actividad o de estabilidad. Para una enzima termofilica las temperaturas máximas de estabilidad y actividad generalmente serán entre 70 y 85°C. Las enzimas hipertermofilicas tendrán la activación relativa aún más grande que las enzimas mesofilicas o termofílicas debido al cambio potencial más grande en temperatura de 25°C hasta 85°C a 95°C o a un 100°C. La temperatura incrementada puede ser alcanzada por cualquier método, por ejemplo al calentar tal como mediante el horneado, ebullición, calentamiento, vaporización, descarga eléctrica o cualquier combinación de los mismos. Además, en plantas que expresan enzima (s) mesofilica o termofilica, la activación de la enzima puede ser realizada mediante molienda, para de esta manera permitir que la enzima se ponga en contacto con el sustrato. Las condiciones óptimas, por ejemplo, temperatura, hidratación, pH, etc., puede ser determinada por uno que tiene habilidad en la técnica y puede depender de la enzima individual que es empleada y la aplicación deseada de la enzima . La presente invención además proporciona el uso de enzimas exógenas que pueden ayudar en un proceso particular. Por ejemplo, el uso ae una planta o parte de planta autoprocesadora de la presente invención puede ser usado en combinación con la enzima exógenamente proporcionada para facilitar la reacción. Como un ejemplo, el maiz de a-amilasa transgénico puede ser usado en combinación con otras enzimas procesadoras de almidón, tales como pululanasa, c¡-glucosidasa, glucosa isomerasa, mananasa, hemicelulasa, etc., para hidrolizar el almidón o producir etanol. De hecho, se ha encontrado que las combinaciones del maíz de ot-amilasa transgénica con tales enzimas ha proporcionado inesperadamente grados superiores de conversión de almidón con relación al uso del almidón de cc-amilasa transgénico solo. Se proporcionan ejemplos de " métodos adecuados contemplados en la presente. a. Extracción de Almidón de Plantas La invención proporciona un método para facilitar la extracción de almidón de plantas. En particular, por lo menos un polinucleótido que codifica una enzima procesadora que rompe la matriz físicamente de restricción del endosperma (paredes celulares, polisacárido no de almidón y matriz de proteína) es introducido a una planta de modo que la enzima está de preferencia en estrecha proximidad física a los granos de almidón en la planta. De preferencia, en esta modalidad de la invención, las plantas transformadas expresan uno o más de proteasa, glucanasa, xilanasa, tioredoxin/tíoredoxin reductasa, esterasa y similares, pero no enzimas que tienen alguna actividad degradante de almidón, para mantener la integridad en los granos de almidón. La expresión de estas enzimas en una parte de planta tal como un grano de esta manera mejora las características del proceso del grano. La enzima de procesamiento puede ser mesofílica, termofílica o hipertermofílica . En un ejemplo, el grano de una planta transformable de la invención es secado con calor, inactivando probablemente las enzimas procesadoras no hipertermofílicas y mejorando la integridad de la semilla. El grano (o grano quebrado) es empapado a bajas temperaturas o altas temperaturas (donde el tiempo es esencial) con condiciones de alto o bajo contenido de humedad (ver, Primary Cereal Processing, Gordon and illm, eds., pp. 319-337 (1994), la descripción de la cual es incorporada en la presente por reférencia) con o sin dióxido de azufre. Al alcanzar las temperaturas elevadas, opcionalmente ciertas condiciones de humedad, la integridad de la matriz del endosperma es rota al activar las enzimas, por ejemplo, proteasas, xilanasas, fitasas o glucanasas que degradan las proteínas y los polisacáridos no de almidón presentes en el endosperma dej ando el gránulo de almidón en el mismo intacto y no es fácilmente recuperable del material resultante. Además, las proteínas y polisacáridos no de almidón en el efluente son al menos parcialmente degradadas y altamente concentradas, y así se pueden usar para alimento de animal mejorado, comida o como componentes del medio para la -fermentación de microorganismos. El efluente se considera un licor empapado de maíz con composición mejorada. Así, la invención proporciona un método para preparar gránulos de almidón. El método comprende tratar el grano, por ejemplo, grano quebrado, que comprende por lo menos una enzima procesadora no de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, produciendo una mezcla que comprende gránulos de almidón y productos de degradación o de almidón, por ejemplo, productos de la matriz de endosperma digerida. La enzima de procesamiento no de almidón puede ser mesofilica, termofilica o hipertermofilica. Después de la activación de la enzima, los gránulos de almidón son separados de la mezcla. El grano es obtenido de una planta transformada, el genoma de la. cual comprende (está aumentado con) un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora. Por ejemplo, la enzima procesadora puede ser una proteasa, glucanasa, xilanasa, fitasa, tioredoxin/tioredoxin reductasa o esterasa. De preferencia, la enzima procesadora es hipertermofilica . El grano puede ser tratado bajo condiciones de bajo o alto contenido de humedad en la presencia o ausencia de dióxido de azufre. Dependiendo de la actividad y el nivel de expresión de la enzima procesadora en el grano de la planta transgénica, el grano transgénico puede ser mezclado con grano de mercancía antes o durante del procesamiento. También se proporcionan productos obtenidos por el método tales como productos de almidón, no de almidón y agua de empapamiento mejorada que comprende por lo menos un componente adicional, b . Métodos Procesadores de Almidón Las -plantas o partes de plantas transformadas de la presente invención pueden comprender enzimas degradantes de almidón como es descrito en la presente, que degradan gránulos de almidón a dextrinas, otros almidones modificados o exosas (por ejemplo, a-amilasa, pululasa, a-glucosidasa, glucoamilasa, amilopululanasa) o convertir glucosa en fructosa (por ejemplo, glucosa isomerasa) . De preferencia, la enzima degradante de almidón es seleccionada de -amilasa, OÍ-glucosidasa, glucoamilasa, pululanasa, neopululanasa, amilopululanasa, glucosa isomerasa y combinaciones de las mismas es utilizada para transformar el grano. Además, de preferencia la enzima está operablemente enlazada a un promotor y a una secuencia de señal que dirige la enzima al gránulo de almidón, un amiloplasto, el apoplasto o el retículo endoplásmico . Mucho más de preferencia, la enzima es expresada en el endosperma, y particularmente, el endosperma de maíz, y localizada a uno o más compartimientos celulares, o dentro del gránulo de almidón mismo. La parte de planta preferida es el grano. Las partes de plantas preferidas sor. aquellas de maiz, trigo, cebada, centeno, avena, caña de azúcar o arroz.
De acuerdo con un método degradante de almidón de la presente invención, el gránulo transformado acumula la enzima degradante de almidón en gránulos de almidón, es empapado a temperaturas convencionales de 50°C-60°C y molido en húmedo como es conocido en la técnica. De preferencia, la enzima degradante de almidón es hipertermofilica. Debido a la dirección subcelular de la enzima al gránulo de almidón, en virtud de la asociación de la enzima con el gránulo de almidón, el poner en contacto la enzima y el gránulo de almidón durante el proceso de molienda húmeda a las temperaturas convencionales, la enzima coprocesadora es copurificada con los granulos de almidón para obtener la mezcla de gránulos de. almidón/enzima. Subsecuente la recuperación de . la mezcla de gránulos de almidón/enzima, la enzima luego es activada al proporcionar condiciones favorables para la actividad de la enzima. Por ejemplo, el procesamiento puede ser realizado en varias condiciones de humedad y/o temperatura para facilitar la hidrólisis parcial (para hacer almidones derivados o dextrinas) o la hidrólisis completa del almidón en exosas. Los jarabes que contienen altos equivalentes de dextrosa o fructosa son obtenidos de esta manera. Este método efectivamente reduce los costos de tiempo, energía y de la enzima y la eficiencia con la cual el almidón es convertido a la exosa correspondiente, y se incrementa la eficiencia de la producción de productos, similar al agua de empapamiento con alto contenido de azúcar y. jarabes de más alto equivalente de dextrosa. En otra modalidad, una planta, o un producto de la planta tal como un fruto o grano, una harina hecha del grano que expresa la enzima es tratada para activar la enzima y convertir polisacáridos expresados y contenidos dentro de la planta en azúcares . De preferencia, la enzima es fusionada a una secuencia de señal que dirige la enzima a un gránulo de almidón, un amiloplasto, el apoplasto o al retículo endoplásmido como es descrito en la presente. El azúcar producido luego puede ser aislado y recuperado de la planta o el producto de la planta. En otra modalidad, una enzima procesadora capaz de convertir polisacáridos en azúcares es colocada bajo el control de un promotor inducible de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. La enzima procesadora puede ser mesofilica, termofilica o hipe termofilica. La planta es cultivada a una etapa deseada y el promotor es inducido ocasionando la expresión de la enzima y la conversión de los polisacáridos, dentro de la planta o producto de la planta, a azúcares. De preferencia, la enzima está operablemente enlazada a una secuencia de señal que dirige la enzima a un gránulo de almidón, un amiloplasto, un apoplasto o al retículo endoplásmico. En otra modalidad, una planta transformada se produce de modo que expresa una enzima de procesamiento capaz de convertir almidón en azúcar. La enzima es fusionada a una secuencia de señal que dirige la enzima a un gránulo de almidón dentro de la planta. El almidón luego es aislado de la planta transformada que contiene la enzima expresada por la planta transformada. La enzima contenida en el almidón aislado luego puede ser activada para convertir el almidón en azúcar. La enzima puede ser mesofilica, termofilica o hipertermofilica . Ejemplos de enzimas hipertermofilicas capaces de convertir almidón en azúcar se proporcionan en la presente. Los métodos pueden ser usados con cualquier planta que produce un polisacárido y que puede expresar una enzima capaz de convertir un polisacárido en azúcares o' producto de almidón hidrolizado tal como dextrina, maltooligosacárido, glucosa y/o mezclas de los mismos. , La invención proporciona un método para producir dextrinas y almidones alterados de una planta, o un producto de una planta, que se ha transformado como una enzima procesadora que hidroliza ciertos enlaces covalentes de un polisacárido para formar un derivado de polisacárido. En una modalidad, una planta o un producto de la planta tal como un fruto o grano, o harina hecha del grano que expresa la enzima es colocado bajo condiciones suficientes para activar la enzima y convertir los polisacaridos contenidos dentro de' la planta en polisacáridos de peso molecular reducido. De preferencia, la enzima es fusionado a una secuencia de señal que dirige la enzima a un gránulo de almidón, un amiloplasto, el apoplasto o al retículo endoplásmico como es descrito en la presente. La dextrina o almidón derivado producido luego puede ser aislado o recuperado de la planta o el producto de la planta. En otra modalidad, una enzima procesadora capaz de convertir polisacáridos en dextrinas o almidones alterados es colocada bajo el control de un promotor inducible de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. La planta es cultivada a una etapa deseada y el promotor es inducido causando expresión de la enzima y conversión de los polisacáridos, dentro de la planta o producto de la planta, a dextrinas o almidones alterados. De preferencia la enzima es a-amilasa, pululanasa, iso o neo-pululanasa y está operablemente enlazada a una secuencia de señal que dirige la enzima a un gránulo de almidón, un amiloplasto, el apoplasto o al retículo endoplásmico. En una modalidad, la enzima es dirigida al apoplasto o al endoretículo . Todavía en otra modalidad, se produce una planta transformada que expresa una enzima capaz de convertir almidón en dextrinas o almidones alterados. La enzima es fusionada a una secuencia de señal que dirige la enzima a un gránulo de almidón dentro de la planta. El almidón luego es aislado de la planta transformada que contiene la enzima expresada por la planta transformada. La enzima contenida en el^ almidón aislado luego puede ser activada bajo condiciones suficientes para la activación para convertir el almidón en dextrinas o almidones alterados. Ejemplos de enzimas hipertermofilicas, por ejemplo, capaces de convertir almidón a productos de almidón hidrolizado se proporcionan en la presente. Los métodos pueden ser usados con cualquier planta que produce un polisacárido y que puede expresar una enzima capaz de convertir un polisacárido en azúcar.' En otra modalidad, el grano de plantas transformadas de la invención que acumula enzimas degradantes de almidón que degradan los enlaces en los gránulos de almidón a dextrinas, almidones modificados o exosa (por ejemplo, a-amilasa, pululanasa, a'-glucosidasa, glucoamilasa, amilopululanasa) es empapado bajo condiciones que favorecen la actividad de la enzima degradante de almidón durante varios periodos- de tiempo, La mezcla resultante puede contener altos niveles del producto derivado de almidón. El uso de tal grano: 1) elimina la necesidad para moler el grano, o de otra manera procesar el grano para primero obtener gránulo de almidón, 2) hace el almidón más accesible a las enzimas en virtud de colocar las enzimas directamente en él tejido de endosperma del grano y 3) elimina la necesidad por enzimas hidrolizantes de almidón microbialmente producidas. Asi, el proceso completo de molienda húmeda antes de la recuperación de hexosa es eliminado al simplemente calentar el grano, de preferencia grano de maiz, en la presencia de agua para permitir que las enzimas actúen sobre el almidón. Este proceso también puede ser empleado para la producción de etanol, jarabes de alto contenido de fructosa, medios de fermentación que contienen exosas (glucosa) o cualquier otro uso del almidón que no requiere el refinamiento de los componentes del grano. La invención además proporciona un método para preparar dextrina, maltooligosacáridos y/o azúcar que implica tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima para de esta manera digerir los gránulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende azúcares. La parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentada con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima de procesamiento. La solución acuosa que comprende dextrinas, maltooligosacáridos y/o azúcar luego es recolectada. En una modalidad, la enzima del procesamiento es a-amilasa, Oí-glucosidasa, pululariasa, glucoamilasa, amilopululanasa, glucosa isomerasa o cualquier combinación de las mismas. De preferencia, la enzima es hipertermofilica . En otra modalidad, el método además comprende aislar las dextrinas, maltooligosacáridos y/o azúcar. c . Variedades de Maíz Mejoradas La invención también proporciona la producción de variedades de maíz mejoradas y variedades de otros cultivos (que tienen niveles normales de acumulación de almidón, y acumulan suficientes niveles de enzima (s) amilolitica en su endosperma, u órgano que acumula almidón, tal que en la activación de la enzima contenido en la misma, tal como por ebullición o calentamiento de la planta o una parte de la misma en el caso de una enzima hipertermofílica, la enzima (s) es activada y facilita la conversión rápida del almidón en azúcares simples. Estos azúcares simples (principalmente glucosa) proporcionarán dulzura al maiz tratado. La planta de maiz resultante es una variedad mejorada para el uso doble como un híbrido que produce grano y como almidón dulce. Así, la invención proporciona un método para producir maíz hiperdúlce, que comprende tratar el maíz transformado en una parte del mismo, el genoma del cual es aumentado con y se expresan en el endosperma a un cásete de expresión que comprende un promotor operablemente enlazado a un primer polinucleótido que codifica por lo menos una enzima amilolitica, condiciones que activan la por lo menos una enzima para convertir polisacáridos en el maíz en azúcar, produciendo maíz hiperdúlce. El promotor puede ser un promotor constitutivo, un promotor específico de semilla, un promotor específico de endosperma que está enlazado a una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de procesamiento tal como a-amilasa, por ejemplo, una que comprende la SEQ ID NO: 13, 14 o 16. De preferencia, la enzima es hipertermofilica . En una modalidad, el cásete de expresión además comprende un segundo polinucleótido que codifica una secuencia de señal operablemente enlazada a la enzima codificada en el primer polinucleótido- Las secuencias de señal ejemplares en esta modalidad de la invención dirigen la enzima al apoplasto, el retículo endoplásmico, un gránulo de almidón o un amiloplasto. La planta de maíz es cultivada tal que las mazorcas con semilla son formadas y luego el promotor es inducido para ocasionar que la enzima se expresada, y convierta el polisacárido contenido dentro de la planta en azúcar . d. Plantas Autofermentadoras < En otra modalidad de la invención, las plantas, tales como maíz, arroz, trigo o caña de azúcar son diseñadas para acumular grandes cantidades de enzimas procesadoras en sus paredes celulares, por ejemplo xilanasas, celulasas, hemicélulasas, glucanasas, pectinasas y similares (enzimas degradantes de polisacárido no de almidón) . Después de la cosecha del componente del grano (o azúcar en el caso de la caña de azúcar), el forraje, paja o bagazo es usado como una fuente de la enzima, que se dirigió para la expresión y acumulación en las paredes celulares, como una fuente de biomasa. El forraje (u otro tejido sobrante) es usado como un material de alimentación en un proceso para recuperar azúcares fermentables . El proceso de obtener los azúcares fermentadles consiste de activar la enzima degradante de polisacárido no de almidón, por ejemplo, la activación puede comprender calentar el tejido de la planta en la presencia de agua durante periodos de tiempo adecuados para la hidrólisis del polisacárido no de almidón en los azúcares resultantes . Asi, este forraje autoprocesador produce las enzimas requeridas para la conversión ¦ de polisacáridos en monosacáridos, esencialmente sin costo incrementado ya que son un componente del material de alimentación. Además, las enzimas dependientes de la temperatura no tienen efectos perjudiciales en el crecimiento de la planta y el desarrollo, y la dirección de la pared celular, aun la dirección en las microfibrilas de polisacárido en virtud de los dominios de enlace de celulosa/xilosa fusionados a la proteina, mejora la accesibilidad del sustrato en la enzima. Asi, la invención también proporciona un método para usar una parte de planta transformada que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón en la pared celular de las células de la parte de planta. El método comprende tratar una parte de planta transformada que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para de esta manera digerir los gránulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende azúcares, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón; y recolectar la solución acuosa que comprende los azúcares. La invención también incluye una planta o parte de planta transformada que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón presente en la célula o pared celular de las células de la planta o parte de planta. La parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado como un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora no de almidón, por ejemplo una xilanasa, una celulasa, una glucanasa, una peptinasa o cualquier combinación de las mismas . e. Fase Acuosa de Alto Contenido de Proteina y Azúcar Todavía en otra modalidad, las proteasas y lipasas son diseñadas para acumularse en semillas, por ejemplo, semillas de soya. Después de la activación de la proteasa o lipasa, tal como, por ejemplo, mediante el calentamiento, estas enzimas en las semillas hidrolizan el lipido y las proteínas de almacenamiento presentes en la soya durante el procesamiento. " Los productos solubles que comprenden aminoácidos, que pueden ser usados como alimento, comida o medio de fermentación y ácidos grasos, asi pueden ser obtenidos . Los polisacáridos son típicamente encontrados en la fracción insoluble del grano procesado. Sin embargo, al combinar la expresión de la enzima degradante de polisacárido y la acumulación en las semillas, las proteínas y polisacáridos pueden ser hidrolizados y son encontrados en la fase acuosa, por ejemplo, las zeinas del maíz y la proteina de almacenamiento y los polisacáridos de no almidón de soya pueden ser solubilizados de esta manera. Los componentes de las fases acuosas hidrofóbicas pueden ser fácilmente separadas por extracción con solvente orgánico o dióxido de carbono supercritico . Asi, lo que se' proporciona es un método para producir un extracto acuoso de grano que contiene más altos niveles de proteina, aminoácidos, azúcares o sacáridos. f . Fermentación Autoprocesadora . La invención proporciona un método para producir etanol, una bebida fermentada u otro producto (s) derivado de la fermentación. El método implica obtener una planta, o el producto o parte de una planta o un derivado de planta tal como harina de grano, en donde se expresa una enzima procesadora que convierte el polisacárido en azúcar, la planta, o producto de la misma se trata tal que el azúcar es producida mediante la conversión del polisacárido como es descrito en lo anterior. Los azúcares y otros componentes de la planta luego son fermentados para formar etanol o una bebida fermentada, u otros productos derivados de la fermentación, de acuerdo con métodos conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 4,929,452. Brevemente, el azúcar producida por la conversión de polisacáridos es incubada con levadura bajo condiciones que promueven la conversión del azúcar en etanol. Una levadura adecuada incluye las cepas de levadura tolerantes al alto contenido de alcohol y tolerantes al alto' contenido de azúcar, tales como, por ejemplo, la levadura, S. cerevisiae ATCC No. 20867. Esta cepa se depositó con la Colección Americana de Cultivos Tipo Tockville, MD el 17 de Septiembre de 1987.y se le asignó ATCC No. 20867. El producto fermentado o bebida fermentada luego puede ser destilado para aislar etanol o una bebida destilada, o el producto de fermentación de otra manera recuperado. La planta usada en este método puede ser cualquier planta que contiene un polisacárido y es capaz de expresar una enzima de la invención. Muchas de tales plantas son descritas en la presente. De preferencia la planta es una que es cultivada comercialmente. Más de preferencia, la planta es una que es normalmente utilizada para producir etanol o bebidas fermentadas, productos fermentados, tales como, por ejemplo, trigo, cebada, maíz, centeno, papa, vids o arroz. Mucho más de preferéncia la planta es maíz .
El método comprende tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima, para de esa manera digerir el polisacárido en la parte de planta para formar azúcar fermentable, la enzima procesadora de polisacárido puede ser mesofilica, termofilica o hipertermofílica. De preferencia, la enzima es hipertermofilica . La parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de polisacárido. Las partes de plantas para est modalidad de la invención incluyen, pero no están limitados a, . grano, fruto, semilla, tallo, madera, vegetal o raíz. Las plantas preferidas incluyen, pero no están limitadas a, avena, cebada, trigo, baya, vid, centeno, maiz, arroz, papa, betabel, caña de azúcar, piña, hierbas · y árboles. La parte de planta puede ser combinada con grano de mercancía u otros sustratos comercialmente disponibles; la fuente del sustrato para el procesamiento puede ser una fuente diferente a la planta autoprocesadora . El azúcar fermentable luego es incubado bajo condiciones que promueven la conversión del azúcar fermentable en . etanol, por ejemplo, con levadura y/u otros microbios. En una modalidad preferida, la parte de planta es derivada de maíz transformado con a-amilasa, que se ha encontrado que reduce la cantidad de tiempo y costo de fermentación. Se ha encontrado que la cantidad de almidón residual es reducida cuando el maíz transgénico hecho de acuerdo con la presente invención que expresa una a-amilasa termoestable, por ejemplo, se utiliza en la fermentación. Esto indica que más almidones solubilizados durante la fermentación. La cantidad reducida de almidón residual da por resultado los granos de las destiladoras que tienen más alto contenido de proteina en peso y más alto valor. Además, la fermentación del maíz transgénico de la presente invención permite que sea realizado el proceso de licuefacción a un pH menor dando por resultado ahorros en el costo de las sustancias químicas usadas para ajustar el pH, a una temperatura más alta, por e emplo, mayor que 85°C, de preferencia mayor que 90°C, más de preferencia 95°C o mayor, que da por resultado tiempos de licuefacción más cortos y solubilización más completa del almidón, y reducción de los tiempos de licuefacción, todos que dan por resultado las reacciones de fermentación eficientes, con más altos rendimientos de etanol. Además, se ha encontrado que el contacto de las partes de plantas convencionales con aun una porción pequeña de la planta transgénica hecha de acuerdo con la presente invención puede reducir el tiempo y . los costos de fermentación asociados con el mismo. Como tal, la presente invención se relaciona a la reducción en el tiempo de fermentación para plantas, que comprende someter una parte de planta transgénica de una planta que comprende una enzima procesadora de polisacárido que convierte polisacáridos en azúcar con relación al uso de una parte de planta que no comprende la enzima procesadora de polisacárido. g. Enzimas Procesadoras de Almidón Bruto y Polinucleótidos que las Codifican Un polinucleótido que codifica una enzima (s) procesadora mesofilica es introducida en una planta o parte de planta. En una modalidad preferida, el polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido optimizado de maiz tal como es proporcionado en la SEQ ID NOs:48, 50 y 59, que codifica una glucoamilasa, tal como es proporcionada en las SEQ ID NOs : 47 y 49. En otra modalidad preferida, el polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido optimizado de maiz tal como es proporcionado en la SEQ ID NO.52, que codifica una alfa-amilasa, tal como es proporcionada en la SEQ ID' NO: 51. Además, los productos de fusión de las enzimas procesadoras además es contemplado. En una modalidad preferida, el polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido optimizado de maiz tal como es proporcionado en la SEQ ID NO: 46, que codifica una fusión de alfa-amilasa y glucoamilasa, tal como es proporcionado en la SEQ ID NO: 5. Las combinaciones de enzimas procesadoras además · son contempladas por la presente invención. Por ejemplo, una combinación de enzimas procesadoras de almidón y enzimas procesadoras no de almidón es contemplada en la presente. Tales combinaciones de enzimas procesadoras pueden ser obtenidas al emplear el uso de múltiples construcciones de genes que codifican cada una de las enzimas. Alternativamente, las plantas transgénicas individuales establemente transformadas con las enzimas pueden ser cruzadas por métodos conocidos para obtener una planta que contiene las enzimas. Otro método incluye el uso de enzima (s) exógena con la planta transgénica. La fuente de las enzimas procesadoras de almidón y procesadoras no de almidón puede ser aislada o derivada de cualquier fuente y los polinucleótidos correspondientes a las mismas pueden ser averiguados por uno que tiene habilidad en la técnica. De preferencia, la a-amilasa es derivada de Aspergillus (por ejemplo, . Aspergillus shirousami y Aspergillus niger), Rhizopus (por ejemplo, Rhizopus oryzae) y plantas tales como maiz, cebada y arroz. De preferencia la glucoamilasa es derivada de Aspergillus (por ejemplo, Aspergillus shirousami y Aspergillus niger), Rhizopus (por ejemplo, Rhizopus oryzae) y Termoanaerobacter (por ejemplo-, Thermoanerobacter thermosaccharolyticum) .
En otra modalidad de la invención, el polinucleótido codifica una enzima procesadora de almidón mesofilico que ' está operablemente enlazado a un polinucleótido optimizado de maíz tal como es proporcionado en la SEQ ID NO: 54, que codifica un dominio de enlace de almidón bruto, tal como es proporcionado en la SEQ ID NO: 53. En otra modalidad, un promotor específico de tejido incluye los promotores específicos de endosperma tal como el promotor de ?-zeína de maíz (ejemplificado por la SEQ ID NO: 12) o el promotor ADP-gpp de maíz (ejemplificado por la SEQ ID NO: 11, que incluye una secuencia no traducida 5' y un intrón) , Así, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende un promotor que comprende la SEQ ID NO: 11 o 12,, un polinucleótido que híbrida al complemento de la misma bajo condiciones de hibridación de baja severidad o un fragmento del mismo que tiene actividad de promotor, por ejemplo, al menos 10%, y de preferencia menos de 50%, la actividad de un promotor que tiene la SEQ ID NO: 11 o 12. En una modalidad, el producto de un gen de hidrólisis de almidón, tal como a-amilasa, glucoamilasa o fusión de a-amilasa/glucoamilasa puede ser dirigido a un organelo particular de localización tal como el retículo endoplásmico o apoplasto, antes que al citoplasma. Esto es ejemplicado por el uso de la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maíz (SEQ ID NO: 17) que · confiere dirección especifica al apoplasto de las proteínas, y el uso de la secuencia de señal N-terminal de ?-zeina (SEQ ID NO: 17) que está operablemente enlazado a la enzima de procesamiento que es operablemente enlazada a la secuencia SEKDEL para la retención en el retículo endoplásmico . La dirección de la proteína o enzima a un compartimiento específico permitirá a la enzima que sea localizada de una manera que no entrará en contacto con el sustrato. De esta manera, la acción enzimática de la enzima no ocurrirá hasta que la enzima se ponga en contacto con su sustrato. La enzima puede ser puesta en contacto co su sustrato por el proceso . de molienda (rotura física de la integridad celular) e hidratación. Por ejemplo, una enzima hidrolizante de almidón mesofilica puede ser dirigida al apoplasto o al retículo endoplásmico y por ?? tanto no entrará en contacto con los gránulos de almidón en el amiloplasto . La molienda del grano romperá la integridad del grano y la enzima hidrolizante de almidón luego se pondrá en contacto con los gránulos de almidón. De esta manera, pueden ser evitados los efectos negativos potenciales de la co-localización de una enzima y su sustrato. h. Productos Alimenticios sin Edulcorante Adicionado También se proporciona un método para producir un producto alimenticio harinoso endulzado sin adicionar edulcorante adicional. Ejemplos de productos harinosos incluyen, pero no están limitados a, alimento de desayuno, alimento listo para comer, alimento horneado, productos de pasta y cereales tal como cereal de desayuno. El método comprende tratar' una parte de planta que comprende por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones que activan la enzima procesadora de almidón, para de esta manera procesar los gránulos de almidón en la parte de planta a azúcares para formar un producto endulzado, por ejemplo, con relación al producto producido al procesar gránulos de almidón de una parte de planta que no comprende la enzima hipertermofilica. De preferencia, la enzima procesadora de almidón es hipertermofilica y es activada por calentamiento, tal como mediante horneado, ebullición, calentamiento, vaporación, descarga eléctrica o cualquier combinación de los mismos. La parte de planta es obtenida de una planta transformada, por ejemplo, de soya transformada, centeno, avena, cebada, trigo, maiz, arroz o caña de azúcar, el genoma del cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de almidón hipertermofilica, por ejemplo, -amilasa, -glucosidasa, glucoamilasa, pululanasa, glucosa isomerasa o cualquier combinación de las mismas. El producto endulzado luego es procesado en un producto alimenticio harinoso. La invención también proporciona un producto alimenticio harinoso, por ejemplo, un alimento de cereal, un alimento de desayuno, un alimento listo para comer, un alimento horneado, producido por el método. El producto alimenticio harinoso puede ser formado del producto endulzado y agua, y puede contener malta, saborizantes, vitaminas, minerales, agentes colorantes o cualquier combinación de los mismos . La enzima puede ser activada para convertir polisacáridos contenidos dentro del material de planta en azúcar antes de la inclusión del material de planta en el producto de cereal o durante el procesamiento de producto de cereal. Por consiguiente, los polisacáridos contenidos dentro del material de planta pueden ser convertidos en azúcar para activar el material, tal como " mediante el calentamiento en el paso de una enzima hipertermofilica, antes de la inclusión en el producto harinoso. El material de planta que contiene azúcar producida mediante la conversión de los polisacáridos luego es adicionado al producto para producir un producto endulzado. Alternativamente, los polisacáridos pueden ser convertidos en azúcares mediante la enzima durante el procesamiento del producto harinoso. Ejemplos de procesos usados para fabricar los productos de cereales son bien conocidos en la técnica e incluyen calentamiento, horneado, ebullición y similares, como es descrito en las patentes norteamericanas Nos.: 6,183,788; 6,158,530; 6,1459,965; 4,988,521 y 5,368,870.
Brevemente, la masa puede ser preparada al mezclar varios ingredientes secos junto con agua y al coser para gelatinizar los componentes almidonados y para desarrollar un sabor de cocción. El material cocido luego puede ser mecánicamente elaborado para formar una masa cocida tal como masa de cereal. Los ingredientes secos pueden incluir varios aditivos tales como azúcares, almidón, sal, vitaminas, minerales, colorantes, saborizantes, sales y similares. Además del agua, se pueden adicionar varios ingredientes líquidos tal como jarabe de maiz (cereal) o malta. El material harinoso puede incluir granos de . cereal, granos cortados, sémolas o harinas de trigo, arroz, maiz, avena," cebada, centeno, u otros granos de cereal y mezclas de los mismos a partir de una planta transformada de la invención. La masa luego puede ser procesada en una forma deseada a través de un proceso tal como instrucción o estampado y además cocida utilizando medios tal como un aparato de cocción de James, o un horno o un dispositivo .de descarga eléctrica . Además se proporciona un método para endulzar un producto que contiene almidón sin adición de edulcorante. El método comprende tratar el almidón que comprende por lo menos una enzima procesadora de almidón, en condiciones para activar la por lo menos una enzima para de esta manera digerir el almidón para formar un azúcar formando un almidón tratado (endulzado), por ejemplo, con relación a un producto producido al tratar almidón que no comprende la enzima hipertermofilica . El almidón de la invención es obtenido de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado por un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora. Las enzimas preferidas incluyen a-amilasa, a-glucosidasa, glucoamilasa, pululanasa, glucosa isomerasa o cualquier combinación de las mismas . De preferencia, la enzima es hipertermofilica y es activada con calor. Las plantas transformadas preferidas incluyen, maiz, soya, centeno, avena, cebada, trigo, arroz o caña de azúcar. El almidón tratado luego es adicionado a un producto para producir un producto que contiene almidón endulzado, por ejemplo, un producto alimenticio harinoso. También se proporciona un producto que contiene almidón endulzado producido por el método. La invención además proporciona un método para endulzar un fruto o vegetal que contiene polisacárido que comprende: tratar un fruto o vegetal que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para de esta manera procesar el polisacárido en el fruto o vegetal para formar azúcar, produciendo un fruto o vegetal endulzado, por ejemplo, con relación a un fruto o vegetal de una planta que no comprende la enzima procesadora de polisacárido. El fruto o vegetal de la invención se obtiene de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de polisacárido . Los frutos y vegetales preferidos incluyen papa, tomate, plátano, calabaza, guisante y habichuela. Las enzimas preferidas incluyen a-amilasa, o¡-glucosidasa, glucoamilasa, pululanasa, glucosa isomerasa o cualquier combinación de las mismas. De preferencia, la enzima es hipertermofilica . . i . Endulzamiento de una Planta o Producto .de Planta que contiene Polisacárido El método implica obtener una planta que expresa una enzima procesadora de polisacárido que convierte a iun polisacárido en una azúcar como es descrito en lo anterior. Por consiguiente, la enzima es expresada en la planta y en los productos de la planta, tal como en un fruto o vegetal. En una modalidad la enzima es colocada bajo el control de un promotor inducible tal que la expresión de la enzima puede ser inducida por un estimulo externo. Tales promotores inducibles y construcciones son bien conocidos en la técnica y son descritos en la presente. La expresión de la enzima dentro de la planta o producto de la misma ocasiona que el polisacárido contenido dentro de la planta o producto de la misma sea convertido en azúcar y endulce la planta o producto de la misma. En otra modalidad, la enzima procesadora de polisacárido es constitutivamente expresada. Asi, la planta o producto de la misma puede ser activada bajo condiciones suficientes para activar la enzima para convertir los polisacáridos en azúca a través de la acción de la enzima para endulzar la planta o producto de la misma. Como resultado, este autoprocesamiento del polisacárido en el fruto o vegetal para formar azúcar" produce un fruto o vegetal endulzado, por ejemplo, con relación a un fruto o vegetal de una planta que no comprende la enzima procesadora de polisacárido. El fruto o vegetal de la invención se obtiene de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica por lo menos una enzima procesadora de polisacárido, los frutos y vegetales preferidos incluyen papa, tomate, plátano, calabaza, guisantes y habichuelas. Las enzimas preferidas incluyen a-amilasa, ot-glucosidasa, glucoamilasa, pululanasa, glucosa isomerasa o cualquier combinación de las mismas. De preferencia, la enzima procesadora de polisacárido es hipertermofilica . j . Aislamiento de Almidón del Grano Transformado que contiene una Enzima que Rompe la Matriz de Endosperma La invención proporciona un método para aislar almidón de un grano transformado en donde se expresa una enzima que . rompe la matriz de endosperma. El método implica obtener una planta que expresa una enzima que rompe la matriz de endosperma mediante la modificación de, por ejemplo, paredes celulares, polisacáridos no de almidón y/o proteina. Ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no están limitadas a, proteasas, glucanasas, tioredoxina, riotedoxin reductasa y esterasa. Tales enzimas no incluyen cualquier enzima que muestra actividad degradante de almidón para mantener la integridad de los gránulos de almidón. De preferencia, la enzima es fusionada a una secuencia de señal que dirige la enzima al gránulo de almidón. En una modalidad, el grano es secado con calor para activar la enzima e inactivar las enzimas endógenas contenidas dentro del grano. El tratamiento con calor causa la activación de la enzima, que actúa para romper la matriz de endosperma que luego es fácilmente separada de los gránulos de almidón. En otra modalidad, el grano es empapado a baja o alta temperatura, con alto o bajo contenido de humedad, con o sin dióxido de azufre. El grano luego es tratado con- calor para romper la matriz de endosperma y permitir la fácil separación de los gránulos de almidón. En otra modalidad, las condiciones de temperatura y humedad apropiada son creadas para permitir que las proteasas entren a los gránulos de almidón .y degraden las proteínas contenidas dentro de los gránulos . Tal tratamiento producirá gránulos de almidón con alto rendimiento y poca contaminación de la proteína. k. Jarabe que tiene un alto equivalente de azúcar y uso del jarabe para producir etanol o una bebida fermentada El método implica obtener una planta que expresa una enzima procesadora de polisacárido que convierte un polisacárido en un azúcar como es descrito en lo anterior. La planta, o producto de la misma, es empapada en una corriente acuosa bajo condiciones donde la enzima expresada convierte el polisacárido contenido dentro de la planta como a un producto de la misma, en dextrina, maltooligosacárido y/o. azúcar. La corriente acuosa que contiene la dextrina, maltooligosacárido y/o azúcar producida a . través de la conversión del polisacárido luego es separada para producir un jarabe que tiene un alto equivalente de azúcar. El método puede o no puede incluir una etapa adicional de molienda húmeda de la planta o producto de la misma para obtener gránulos de almidón. Ejemplos de enzimas que pueden ser usadas dentro del método incluyen, pero no están limitadas a, ot-amilasa, glucoamilasa, pululanasa y a-glucpsidasa. De preferencia, la enzima es hipertermofilica . Los azúcares producidos de acuerdo con el método incluyen, pero no están limitados a, hexosa, glucosa y fructosa. Ejemplos de plantas que pueden ser usadas con el método incluyen, pero no están limitadas a, maiz, trigo o cebada. Ejemplos de productos de una planta que puede ser . usada, incluyen, pero no están limitadas a, fruto, grano y vegetales. En una modalidad, la enzima procesadora de polisacárido es colocada bajo el control de ion promotor inducible. Por consiguiente, antes o durante del proceso de empapamiento, el promotor es inducido para causar expresión de la enzima, que luego proporciona la conversión de polisacárido en azúcar. Ejemplos de promotores inducibles y construcciones que los contienen son bien conocidos en la técnica y son proporcionados en la presente. Asi, donde el procesamiento del polisacárido es ipertermofilico, el empapamiento es realizado a una alta temperatura para activar la enzima hipertermofilica e inactivar las enzimas endógenas encontradas dentro de la planta o producto de la misma. En otra modalidad, una enzima hipertermofilica capaz de convertir polisacárido en azúcar es constitutivamente expresada. Esta enzima puede o no puede ser dirigida a un compartimiento dentro de la planta a través del uso de una secuencia de señal. La planta, o producto de la misma, es empapada bajo altas condiciones de temperatura para ocasionar la conversión de los polisacáridos contenidos dentro de la planta en azúcar. También se proporciona un método para producir etanol o una bebida fermentada de jarabe que tiene un alto equivalente de azúcar. El método implica incubar el jarabe con levadura bajo condiciones que permiten la conversión del azúcar contenida dentro del jarabe en etanol o una bebida fermentada. Ejemplos de tales bebidas fermentadas incluyen, pero no están limitadas a, cerveza y vino. Las condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica y son descritas en la patente norteamericana No.: 4,929,452 y en la presente. De preferencia la levadura es una cepa de levadura tolerante al alto contenido de alcohol y tolerante al alto contenido de azúcar tal como ATCC NO. 20867 de S. cerevisiae. El producto fermentado o bebida fermentada puede ser destilado para aislar etanol o una bebida destilada. 1. Acumulación de enzima hipertermofilica en la pared celular de una planta . La invención proporciona un método para acumular una enzima hipertermofilica en la pared celular de una planta. El método implica expresar dentro de una planta una enzima hipertermofilica que es fusionada a una señal ide dirección de pared celular tal que la enzima dirigida se acumula en la pared celular. De preferencia, la enzima- es capaz de convertir polisacáridos_ en monosacáridos . Ejemplos de secuencias de dirección, incluyen, pero no están limitadas a, un dominio de enlace de celulosa o xilosa. Ejemplos de enzimas hípertermofílicas incluyen aquellas listadas en la SEQ ID NO:l, 3, 5, 10, 13, 14, 15 o 16. El material de planta que contiene paredes celulares se puede adicionar con una fuente de enzimas deseadas en un proceso para recuperar azúcares del material de alimentación o como una fuente de enzimas para la conversión de los polisacáridos que se originan de otras fuentes a monosacáridos . Adicionalmente, las paredes celulares pueden servir como una fuente de la cual se pueden purificar las enzimas. Los métodos para purificar enzimas son bien conocidos en" la técnica e incluyen, pero no están limitados a; filtración en gel, cromatografia de intercambio iónico, cromatoenfocamiento, enfocamiento isoeléctrico, cromatografia por afinidad, FPLC, HPLC, precipitación de sal, diálisis y" similares. Por consiguiente, la invención también proporciona enzimas purificadas aisladas de las paredes celulares de plantas . m. Método para preparar y aislar enzimas procesadoras . De acuerdo con la presente invención, las enzimas procesadoras recombinantemente producidas de la presente invención se pueden preparar al transformar el tejido de planta o célula de ' planta que comprende la enzima procesadora de la presente invención, capaz de ser activada en la planta, seleccionada para el tejido de planta transformado o célula, cultivar el tejido de planta transformado o célula en una planta transformada, y aislar la enzima procesadora de la planta transformada o parte de la misma. De preferencia, la enzima recombinantemente producida es una a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, a-glucosidasa y pululanasa. Mucho más de preferencia, la enzima en codificada por el polinucleótido seleccionado de cualquiera de las SEQ ID M0S:2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 o 59. La invención será descrita adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no se proponen para limitar el alcance de la invención de ninguna manera. EJEMPLOS Ejemplo 1 Construcción de genes optimizados de maíz para enzimas de procesamiento/isomerización de almidón hxpertermofilicas Las enzimas a-amilasa, pululanasa, -glucosidasa y glucosa isomerasa implicadas en la degradación del almidón o la isomerización de glucosa se seleccionaron por sus perfiles de actividad deseados.. Estas incluyen, por ejemplo, la actividad mínima a temperatura ambiente, actividad/estabilidad a alta temperatura y actividad a bajo pH. Los genes correspondientes luego se diseñaron al usar codones preferidos de maíz como es descrito en la patente norteamericana No. 5,625,136 y sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) . La -amilasa 797GL3, que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:l, se seleccionó para su actividad hipertermofílica. Esta secuencia de ácido nucleico de la enzima. se dedujo y se optimizó del maíz, como es representado en la SEQ ID NO: 2. De manera similar, se seleccionó la pululanasa 6gp3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3. La secuencia de ácido nucleico para la pululanasa 6gp3 se dedujo y se optimizó del maíz como es representado en la SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos para la a-glucosidasa malA de Sulfolobus solfataricus se obtuvo de la literatura, J. Bact. 177/482-485 (1995); J. Bact. 180:1287-1295 (1998). Basada en la secuencia de aminoácidos publicada de. la proteína (SEQ ID NO:5), se diseñó el gen sintético optimizado de maíz (SEQ ID NO: 6) que codifica la a-glucosidasa mal-A. Varias enzimas de glucosa isomerasa se seleccionaron. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) para la glucosa isomerasa derivada de Thermotoga marítima sé predijo basada en la secuencia de DNA publicada que tiene el Acceso No. NC-000853 y un gen sintético optimizado de maíz fue diseñado (SEQ ID NO: 19) . De manera similar la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:20) para la glucosa isomerasa derivada de Thermotoga neapolitana se predijo basado en las secuencias de DNA publicada de Appl. Envir. Microbiol. 61 ( 5 ): 1867-1875 (1995). Acceso No. L38994. Se diseño un gen sintético optimizado de maíz que codifica la glucosa isomerasa de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NO:21.) . Ejemplo 2 Expresión de la fusión de a-amilasa 797GL3 y la región encapsulante de almidón en E. coli Una construcción que codifica la a-amilasa 797GL3 hipertermofilica fusionada a la región encapsulante de almidón (SER) de la sintasa de almidón enlazada al grá.nulo de maíz (wasy) se introdujo y se expresó en E. coli. El cDNA de sintasa de almidón enlazado al gránulo de maíz (SEQ ID NO: 7) que codifica la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) (Klosgen RB y colaboradores, 1986) se clonó como una fuente de un dominio de enlace de almidón o región encapsulante de almidón (SER) . El cDNA de longitud completa se amplificó mediante RT-PCR del RNA preparado de la semilla de maíz utilizando los cebadores SV57 (5' AGCGAATTCATGGCGGCTCTGGCCACGT 3' ) (SEQ ID NO: 22) y SV58 (5' AGCTAAGCTTCAGGGCGCGGCCACGTTCT 3') (SEQ ID NO:23) designados de GenBank Acceso No. X03935. El cDNa completo se clonó en pBluescript como un fragmento EcoRI/HindIII y el plásmido se designó pNOV4022. La porción C-terminal (codificada por bp 919-1818) del cDNA de axy, incluyendo el dominio de enlace de almidón, se amplificó de pNOV 022 y se fusionó en la estructura en el extremo 3' del gen 797GL3 optimizado de maíz de longitud completa (SEQ ID NO: 2) . El producto de gen fusionado, 797GL3/Waxy, que tiene el ácido nucleico SEQ ID NO: 9 y que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:10 se clonó como un fragmento Ncol/Xbal en pET28b (NOVAGEN, Madison, WI) que se cortó con Ncol/Nhel. El gen 797GL3 solo también . se clonó en el vector pET28b como un fragmento Ncol/Xbal.
El pET28/797GL3 y los vectores pET23/797GL3/Waxy se transformaron en células de E. coli BL21/DE3 (NOVAGEN) y se cultivaron y se indujeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis mediante el manchado de PAGE/Coomassie reveló una proteina inducida en ambos extractos correspondiente a los tamaños predichos de la amilasa fusionada y no fusionada, respectivamente. Los extractos de células totales se analizaron para la actividad de amilasa hipertermofilica como sigue: 5 mg de almidón se suspendieron en 20 µ? de agua luego se diluyeron con 20 µ?' de etanol. El control positivo de amilasa estándar o' la muestra a. ser probada para la actividad dé amilasa se adicionó a la mezcla y se adicionó agua a un volumen de reacción final de 500 µ?. La reacción se llevó a cabo a 8Q°C durante 15-45 minutos. La reacción luego se enfrió por debajo de la temperatura ambiente, y se adicionaron 500 µ1· de o-dianisidina y mezcla de glucosa oxidasa/peroxidasa (SIGMA.) . La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos. 500 µ? de ácido sulfúrico de 12 N se adicionó para detener la reacción. La absorbancia a 540 nm se midió para cuantificar la cantidad de glucosa liberada por la muestra de amilasa. La prueba de tanto los extractos de amilasa fusionados y no fusionados dieron niveles similares de actividad de amilasa hipertermofílica, mientras que les extractos de control fueron negativos. Esto indicó que la amilasa 797GL3 fue aun activa (a altas temperaturas) cuando se fusionó a la porción C-terminal de la proteina waxy. Ejemplo 3 Aislamiento de los fragmentos de promotor para la expresión especifica de endosperma en el maiz El promotor y la región I de no codificación 5' (incluyendo el primer intrón) de la subunxdad grande de ADP-gpp de Zea mays (ADP-glucosa pirofosforilasa) se amplificó como un fragmento de 1515 pares base (SEQ ID NO: 11) del DNA genómico de maiz utilizando los cebadores designados de Geribank acceso M81603. El promotor de ADP-gpp se ha mostrado que"- es especifico de endosperma (Shaw and Hanna , 1991). El promotor del gen ?-zeina de Zea mays se amplificó como un fragmento de 673 bp (SEQ ID NO: 12) del plásmido pGZ27.3 (obtenido del Dr. Brian Larkins) . El promotor de ?-zeína se- ha mostrado que es especifico de endosperma (Torrent y colaboradores (1997) . Ejemplo 4 Construcción de los vectores de transformación para la a- amilasa hipertermofilica 797GL3 Se construyeron casetes de expresión para expresar la amilasa hipertermofílica 797G13 en el endosperma de maiz con varias señales de dirección como sigue: pNOV6200 (SEQ ID NO: 13) comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maiz (MRVLLV7ALALLALAASATS ) (SEQ ID NO: 17) fusionado a la amilasa 797GL3 sintética como es descrito en lo anterior en el Ejemplo 1 para la dirección al retículo endoplásmico y la secreción del apoplasto (Torrent y colaboradores 1997) . La fusión se clonó detrás del promotor ADP-gpp de maíz para la expresión específicamente en el endosperma. pNOV6201 (SEQ ID NO: 14.) comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína fusionada a la amilasa 797GL3 sintética con una adición C-terminal de la secuencia SE DEL para la dirección a, y la retención del retículo endoplásmico (ER) (Munro y Pelham, 1987) . La fusión se clonó detrás del promotor ADP-spp de maíz para la expresión específicamente en el endosperma. pNOV7013 comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína fusionada a la amilasa 797GL3 sintética con una adición C-terminal de la secuencia SEKDEL para la dirección y la retención en el retículo endoplásmico (ER) . PNOV7013 es el mismo como pNOV6201, excepto que el promotor de ?-zeína de maíz (SEQ ID NO: 12) se usó en lugar del promotor ADP-spp de maíz para expresar la fusión en el endosperma. pNOV4029 (SEQ ID NO: 15) comprende el péptido de dirección de amiloplasto waxy ( losgen y colaboradores, 1986) fusionado a la amilasa 797GL3 sintética para la dirección al amiloplasto. La fusión se clonó detrás del promotor ADP-gpp de maíz para la expresión específicamente en el endosperma. pNOV4031 (SEQ ID NO: 16) comprende el péptido de dirección de amiloplasto axy fusionado a la proteína de fusión 797GL3/waxy sintética para la dirección a los gránulos de almidón. La fusión se clonó detrás del promotor ADP-gpp de maíz para la expresión específicamente en el endosperma . Se hicieron construcciones adicionales con estas fusiones clonadas detrás del promotor de ?-zeína de maíz para obtener niveles más altos de la expresión de enzima. Todos los casetes de expresión de movieron en un vector binario para la transformación en maíz por medio de la infección por Agrobacterium. El vector binario contuvo el gen fosfomanosa isómerasa (PMI) que permite la selección de células transgénicas con mañosa. Las plantas de maíz transformadas fueron ya sea autopolinizadas o de cruce distinto y la semilla se colectó para el análisis. Se hicieron construcciones adicionales con las señales de dirección descritas en lo anterior fusionadas a ya sea pululanasas' 6gp3 o a-glucosidasa 340gl2 precisamente de la misma manera como es descrito para la -amilasa. Estas fusiones se clonaron detrás del promotor ADP-gpp de maíz y/o el promotor de ?-zeína y se transformaron en maíz, como es descrito anteriormente. Las plantas de maíz ransformadas fueron ya sea autopolinizadas o de cruce distinto y la semilla se colectó para el análisis.
Las combinaciones de las enzimas son producidas ya sea al cruzar plantas que expresan las enzimas individuales o al clonar varios casetes de expresión en el mismo vector binario para hacer posible la cotransformación. Ejemplo 5 Construcción de vectores.de transformación de plantas para la pululanasa termofilica 6GP3 Se construyó un cásete de expresión para expresar la pululanasa termofilica 6GP3 en el retículo endoplásmico del endosperma de maiz como sigue: PNOV7005 (SEQ ID NOs : 24 y 25) comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeina de maiz fusionada a la pululanasa 6GP3 sintética con una adición C-terminal de la secuencia SEKDEL para la dirección y retención en el ER. El péptido de aminoácidos SEKDEL se fusionó al extremo C-terminal de las enzimas usando PCR con cebadores diseñados para amplificar el gen sintético y simultáneamente adicionar los 6 aminoácidos en el extremo C-terminal de la proteina. La fusión se clonó detrás del promotor de y-zeína de maiz para la expresión específicamente en el endosperma. Ejemplo 6 Construcción de vectores de transformación de plantas para la g-glucosidasa hipertermofilica malA Se construyeron casetes de expresión para expresar la -glucosidasa hipertermofílica malA de Sulfoloüus solfataricus en endosperma de maíz con varias señales de dirección como sigue: pNOV4831 (SEQ ID NO: 26) comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maíz (MRVLLVALALIJALAASATS ) (SEQ ID NO: 17) fusionada a la -glucosidasa malA sintética con una adición C-terminal de la secuencia SEKDEL, para la retención en el tejido endoplásmico (ER) (Munro y Pelham, 1987) . La fusión se clonó detrás del promotor de ?-zeína de maíz para la expresión específicamente en el endosperma. pNOV4839 (SEQ ID NO: 27) comprende la secuencia de señal de . N-terminal de ?-zeína de maíz (MRVLLVÍU^LALAASATS) (SEQ ID NO: 17) fusionada al ct-glucosidasa malA sintética para la dirección al retículo endoplásmico y la secreción del apoplasto (Torrent y colaboradores 1997) . La fusión se clamó detrás del promotor de ?-zeína de maíz para la expresión específicamente en el endosperma . pNOV4837 comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maíz, (I^VLLVALALIALAASATS ) (SEQ ID NO: 17) fusionada a la ot-glucosidasa malA sintética · con una adición C-terrainal de la . secuencia SEKDEL para la dirección y retención en el ER. La fusión de clonó detrás del promotor ADPggp de maíz para la expresión específicamente en el endosperma. La secuencia de aminoácidos para este clon es idéntica a aquella de ph"OV4831 (SEQ ID NO: 26) . Ejemplo 7 Construcción de vectores de transformación de plantas para las glucosa isomerasas de Thermotoga marítima, y Thermotoga neapolítana hipertermofílicas Se construyeron casetes de expresión para expresar las- glucosa isomerasas hipertermofilicas de Thermotoga marítima y Thermotoga neapolítana en el endosperma de maiz con varias señales de dirección como sigue: pNOV4832 (SEQ ID NO : 28) comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeina de maiz (liRVLLYMiMLALAASATS) (SEQ ID NO: 17) fusionada a la glucosa isomerasa de Termotoga marítima sintética con una adición C-terminal de la secuencia SEKDEL para la dirección y retención en el ER. La fusión se clonó detrás del promotor de ?-zeina de maiz para la expresión específicamente en el endosperma. pNOV 833 (SEQ ID NO : 29) comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maiz ( RVLLVALALIÍALAASATS ) (SEQ ID NO: 17) fusionada a la glucosa isomerasa de Termotoga neapolítana sintética con una adición C-terminal de la secuencia SEKDEL para la dirección y retención del ER. La fusión se clonó detrás del promotor de ?-zeína de maiz para la expresión específicamente en el endosperma. pNOV4840 (SEQ I D NO : 30) comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maíz (MRVLLWJ_ALIiALAASATS ) (SEQ ID NO: 17} fusionada a la glucosa isomerasa de Termotoga neapolítana sintética para la dirección al retículo endoplásmico y la secreción del apoplasto (Torrent y colaboradores 1997) . La fusión se clonó detrás del promotor de ?-zeína. de maíz para la expresión específicamente en el endosperma. pNOV 838 comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maíz (MRVLLVALAL3LAILAASATS) (SEQ ID NO: 17) fusionada a la clucosa isomerasa de Termotoga neapolitana sintética con una adición C-terminal de la secuencia SEKDEL para la dirección y retención en el ER. La fusión se clonó detrás del promotor ADPgpp de maíz para la expresión específicamente en el endosperma. La secuencia de aminoácidos para este clon es idéntica a aquella de pNOV4833 (SEQ ID NO : 29 ) . E emplo 8 Construcción de vectores de transformación de plantas para la expresión de la glucanasa hipertermofilica EglA pNOV4800 (SEQ ID NO: 58) comprende la secuencia de señal AMY32b de a-amilasa de cebada (MGKNGNLCCFSLLLLLLAGLASGHQ) (SEQ ID NO: 31) fusionada con la secuencia de proteína madura EglA para la localización al apoplasto. La fusión se clonó detrás del promotor de ?-zeíha de maíz para la expresión específicamente en el endosperma. Ejemplo 9 • Construcción de vectores de transformación de plantas para la expresión de múltiples enzimas hipertermofilicas pNOV4841 comprende una construcción de doble gen de una fusión de a-amilasa 797GL3 y una fusión de pululanasa 6GP3. Tanto la fusión 797GL3 (SEQ ID N0:33) como la fusión 6GP3 (SEQ ID NO: 34) tuvieron la secuencia de señal de N-terminal de ?-zeina de maíz y la secuencia SEKDEL para la dirección a, y la retención en el ER. Cada fusión se clonó detrás de un promotor de ?-zeína de maiz separado para la expresión especifica en el endosperma. pNOV 842 comprende una construcción de doble gen de una fusión de a-amilasa 797GL3 y una fusión de a-glucosidasa malA. Tanto el polipéptido de fusión 797GL3 (SEQ ID NO: 35) y el' polipéptido de fusión de -glucosidasa malA (SEQ ID NO: 36) poseen la secuencia de señal de N-terminal de ?-zeina de maiz y la secuencia SEKDEL para la dirección a, y la retención en el ER. Cada fusión se clonó detrás de un promotor de ?-zeina de maiz separado para la expresión específicamente en el endosperma. pNOV4843 comprende una construcción de .doble gen de una fusión de a-amilasa 797GL3 y una fusión de a-glucosidasa malA. Tanto la fusión 797GL3 como la fusión de a-glucosidasa malA poseen la secuencia de señal de N-terminal de ?-zeína de maíz y la secuencia SEKDEL para la dirección a, y la retención en el ER. La fusión 797GL3 se clonó detrás del promotor de ?-zeína de maíz y la fusión malA detrás del promotor ADPgpp para la expresión específicamente en el endosperma. La secuencia de aminoácidos de la fusión 797GL3 y la fusión malA son idénticas a aquellas de pNOV4842 (SEQ ID NOs: 35 y 36, respectivamente). pNOV4844 comprende una construcción de triple gen de una fusión de a-amilasa 797GL3, una fusión de pululanasa 6GP3 y una fusión de a-glucosidasa malA. 797GL3, malA y 6GP3 todos poseen la secuencia de señal de N-terminal de y-zeina de maiz y la secuencia SEKDEL para la dirección a, y la retención en el ER. Las fusiones 797GL3 y malA se clonaron detrás de 2 promotores ?-zeína de maiz separados, y la fusión 6GP3 se clonó detrás del promotor ADPgpp de maiz para la expresión específicamente en el endosperma. Las secuencias · de aminoácidos para las fusiones 797GL3 y malA son idénticas a aquellas de pNOV4842 (SEQ ID NOs:35 y 36, respectivamente). La secuencia de aminoácidos para la fusión 6GP3 es idéntica a aquella de la fusión 6GP3 en pNOV4841 (SEQ ID NO: 34) . Todos los casetes de expresión se movieron en el vector binario pNOV2117 para la transformación en maíz por medio de la infección con Agrobacterium. pNOV2117 contiene el gen fosfomanosa isomerasa (PMI) que permite la selección de células transgénicas con ma osa. pNOV2117 es un vector binario con ambos de los orígenes de replicación pVSl y ColEl. Este vector contiene el genVirG constitutivo de pJAD1289 (Hansen, G. , y colaboradores, PNAS USA 91:7603-7607 (1994)) y un gen de resistencia de espectinomicina de Tn7.
Clonado en el polienlazador entre los bordes derecho izquierdo están el promotor de ubiquitin de maiz, la región de codificación PMI y el. teritiinador de sintasa de nopalina de pN0V117 (Negrotto, D., y colaboradores, Plant Cell Reports 19:798-803 (2000)). Las plantas de maiz transformadas serán ya sea autopolinizadas o cruzadas distintamente y la semilla recolectada para el análisis . Las combinaciones de las diferentes enzimas se pueden producir ya sea al cruzar las plantas que expresan las enzimas individuales o al transformar una planta con una de los casetes de mul igenes . Ejemplo 10 Construcción de vectores de expresión bacterianos y de Pichia Se construyeron casetes de expresión para expresar la -glucosidasa hipertermofilica y las glucosa xsomerasas en ya sea Pichia o bacterias como sigue: pNOV4829 (SEQ ID NOS: 37 y 38) comprende una fusión de glucosa isomerasa de Thermotoga marítima sintética con la señal de retención de ER en el vector de expresión bacteriano pET29A. El gen de fusión de glucosa isomerasa se clonó en los sitios Ncol de pET29a, que da por resultado la adición de un S-tag N-terminal para la purificación de proteina. pNOV4830 (SEQ ID NOS: 39 y 40) comprende una fusión de glucosa isomerasa de narmotoga neapolitana sintética con la señal de retención de ER en el vector de expresión bacteriano pET29A. El gen de fusión de glucosa isomerasa se clonó en los sitios Ncol y SacI de pET29a, que da por resultado la adición de un S-tag N-terminal para la purificación de proteina. pNOV4835 (SEQ ID NO: 1 y 42) comprende el gen de glucosa isomerasa de Thermotoga marítima sintética clonado en los sitios BamHI y EcoRI del vector de expresión bacteriano pET28C. Esto dio por resultado la fusión de un His-tag (para purificación de proteina) al extremo N-terminal de la glucosa isomerasa. pNOV4836. (SEQ ID NO: 43 y 44) comprende el gen de ' glucosa isomerasa de Thermotoga neapolitana sintética clonado en los sitios BamHi y EcoRI del vector de expresión bacteriano pET28C. Esto dio por resultado la fusión de un His-tag (para purificación de proteina) al extremo N-terminal de la glucosa isomerasa. Ejemplo 11 La transformación de embriones de maiz inmaduros se realizó esencialmente coiiio es descrito en Negrotto y colaboradores, Plant Cell Reports 19:798-803. Para este ejemplo, todos los constituyentes del medio son como se describen en Negrotto y colaboradores, supra. Sin embargo, varios constituyentes del medio descritos en la literatura pueden ser sustituidos . , A. Transformación de plásmidos y marcador seleccionable Los genes usados para la transformación se clonaron en un vector adecuado para la transformación del maiz. Los vectores usados en este ejemplo contuvieron el gen fosfomanosa isomerasa (PMI) para la selección de lineas transgénicas (Negrotto y colaboradores (2000) Plant Cell Reports 19:798-803. B. Preparación de Agrobacterium. tumefaciens La cepa de Agrobacterium LBA4404 (pSBI) que contiene el plásmido de transformación de plantas se cultivó en el medio sólido YEP (extracto de levadura (5 g/L), peptona (10 g/L), NaCl (5 g/L), 15 g/L de agar, pH 6.8) durante 2-4 dias a 28°C. Aproximadamente ' 0.8X109 Agrobacterium se suspendieron en el medio LS-inf suplementado con 100 uM de AS (Negrotto y colaboradores (2000) Plant Cell Rep 19:798-803). Las bacterias se preindu eron . en este medio durante 30-60 minutos . C . Inoculación Embriones inmaduros de A188 u otros genotipo adecuado se extirparon de mazorcas de 8-12 dias en el liquido Ls-inf+100 uM As. Los embriones se enjuagaron una vez con el medio de infección fresco. La solución de Agrobacterium luego se adicionó y los embriones se giraron con vórtice durante 30 segundos y se dejaron asentar con las bacterias durante 5 minutos. Los embriones luego se transfirieron con el lado del escutelo hacia arriba al medio LSAs y se cultivaron en la oscuridad durante dos a tres dias. Subsecuentemente, entre 20 y 25 embriones por placas petri se transfirieron al medio LSDc suplementado con cefotaxime (250 mg/L) y nitrato de plata (1.6 mg/1) y se cultivaron en la oscuridad a 28°C durante 10 dias . D. Selección de células transformadas ? regeneración de plantas transformadas Embriones inmaduros que producen callo embriogénico se transfirieron al medio LSD1M0.5S. Los cultivos se seleccionaron en este medio durante 6 semanas con una etapa de subcultivo a 3 semanas. Los callos sobrevivientes se transfirieron al medio Regí suplementado con ma osa. Después del cultivo en la luz (régimen de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad), los tejidos verdes luego se transfirieron al _ medio Reg2 · sin reguladores de crecimiento y se incubaron durante 1-2 semanas. Las plantitas se transfirieron a cajas Magenta Ga-7 (Magente Corp, Chicago III) que contienen el medio Reg3 y se cultivaron en la luz. Después de 2-3 semanas, las plantas se probaron para la presencia de los genes PMI y otros genes de interés por PCR. Las plantas positivas de la prueba de PCR se transfirieron al invernadero . Ejemplo 12 Análisis de la semilla TI de plantas de maiz que expresan la g-amilasa dirigida al apoplasto c al ER Se obtuvieron semillas TI de plantas de maiz autopolinizadas transformadas ya sea con pNOV6200 o pNOV6201 como es descrito en el Ejemplo 4. La acumulación de almidón en estas semillas se presentó que es normal, basado en la inspección visual en el manchado normal para el almidón con una solución de yodo antes de cualquier expresión a alta temperatura. Las semillas inmaduras se disectaron y los endospermas purificados se colocaron individualmente en tubos de microcentrifuga y se sumergieron en 200 µ? de solución reguladora de NaP04 50 mM. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 85°c durante 20 minutos, .luego se. enfriaron sobre hielo. .Veinte microlitros de una solución de yodo al 1% 'se adicionó a cada tubo y se mezcló. Aproximadamente 25% de las semillas segregantes se mancharon normalmente para el almidón. El 75% restante no se logró manchar, indicando que el almidón se ha degradado en azúcares de bajo peso molecular que no se manchan con yodo. Se encontró que las semillas Ti de pNOV6200 y pNOV6201 estuvieron autohidrolizando el almidón de maiz. No hubo reducción det.ectable en el almidón después de la incubación a 37 °C. La expresión de la amilasa se analizó adicionalmente mediante el aislamiento de la fracción de proteina hipertermofilica del endosperma seguido por el PAGE/manchado de Coomassie. Se observó una banda de proteina segregante del peso molecular (50 kD) . Estas muestras se someten a una prueba de a-amilasa utilizando amilasa teñida comercialmente disponible (AMYLAZYME, de Megazyme, Ireland) . Altos niveles de actividad de amilasa hipertermofilica se correlacionaron con la presencia de la proteina 50 kD. Además se encontró que el almidón en las semillas de una mayor parte del maíz transgénico, que expresa o¡-amilasa hipertermofilica, dirigida al amiloplasto, es suficientemente activa a temperatura ambiente para hidrolizar la mayor parte del almidón si la enzima se deja estar en contacto directo con un gránulo de almidón. De las ochenta lineas que tienen a-amilasa hipertermofilica dirigida . al amiloplasto, cuatro líneas se identificaron que acumulan almidón en las semillas. Tres de estas líneas se analizaron para la actividad de -amilasa termoestable usando una prueba de amilazima colorimétrica (Megazyme) . La prueba de enzima de amilasa indicó que estas tres líneas tuvieron bajos niveles de actividad de amilasa termoestable. Cuando el almidón purificado de estas tres líneas se trató con condiciones apropiadas de humedad y calor, el almidón se hidrolizó indicando la presencia de niveles adecuados de -amilasa para facilitar la autohidrólisis del almidón preparado de estas líneas. Se obtuvo la semilla TI de múltiples líneas independientes ¦ de los transformantes pNOV6200 y pNOV6201. Las semillas individuales de cada línea se . disectaron y los endospermas purificados se homogenizaron individualmente en 300 µ? de solución reguladora de NaP04 50 mM. Alícuotas de las suspensiones de ndosperma se analizaron para la actividad de -amilasa a 85°C. Aproximadamente 80% de las lineas segregan para la actividad hipertermofilica (Ver las Figuras 1A, IB y 2) . Las semillas de plantas de tipo silvestre o plantas transformadas con pNOV6201 se calentaron a 100°C durante.1, 2, 3 o 6 horas y luego se mancharon para el almidón con una solución de yodo. Poco o nada de almidón se detectó en las semillas maduras después de 3 o 6 horas, respectivamente. Asi', el almidón en la semilla del maiz transgénico que expresa amilasa hipertermofilica que es dirigida al retículo endoplásmico se hidrolizó cuando es incubado a alta temperatura . En otro experimento, el almidón parcialmente purificado de las semillas TI maduras de plantas pNOV6201 que se empaparon a 50°C durante 16 horas se hidrolizaron después del calentamiento a 85°C durante 5 minutos. Esto ilustró que la a-amilasa dirigida al retículo endoplásmico enlaza al almidón después de la molienda de la semilla y es capaz de hidrolizar el almidón en el calentamiento. El manchado con yodo . indicó que el almidón permanece intacto en las semillas maduras después del empapamiento de 16 horas a En otro experimento, las semillas maduras, segregantes de plantas transformadas con pNOV6201 se calentaron a 95CC durante 16 horas y luego se secaron. En las semillas que expresan la -amilasa hipertermofílica, la hidrólisis del almidón al azúcar dio por resultado una apariencia arrugada después del secado. Ejentplo 13 Análisis de la semilla TI de plantas de maíz que expresa la ot-amilasa dirigida al amiloplasto Se obtuvieron semillas TI de plantas de maíz autopolinizadas transformadas ya sea con pNOV4029 o pNOV4031 como es descrito en el Ejemplo 4. La acumulación de almidón en las semillas de estas lineas no fue claramente normal. Todas las lineas segregaron, con algo de variación en la severidad, para un fenotipo de muy bajo contenido o nada de almidón. El endosperma purificado de las semillas inmaduras se manchó, solo débilmente con yodo antes de la exposición . a altas temperaturas después de 20 minutos a 85 °C, no hubo manchado. Cuando las mazorcas se secaron, las semillas se marchitaron. Esta amilasa particular claramente tuvo suficiente actividad en las temperaturas del invernadero para hidrolizar el almidón si se deja estar en contacto directo con el gránulo. Ejemplo 14 Fermentación de grano de plantas de maíz que expresan g- amilasa Grano 100% transgénico a 85°C contra 950C, tiempo de licuefacción variado. Maíz transgénico (pNOV6201) que contiene una a-amilasa termoestáble se desempeña bien en la fermentación sin .la adición de -amilasa exógena, requiere mucho menos tiempo de licuefacció y da por resultado una solubilización más completa del almidón. Las fermentaciones a escala de laboratorio se realizaron mediante un protocolo con las siguientes etapas (detalladas enseguida) : 1) molienda, 2) análisis de humedad, 3) preparación de una suspensión espesa que contiene maíz molido,, agua, retroajuste y a-amilasa, 4) licuefacción y 5) sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) . En este ejemplo la temperatura y el tiempo de la etapa de lucuefacción se variaron como es descrito enseguida. Además, el maíz transgénico fue licuado con y sin a-amilasa exógena y el desempeño en la producción de etanol se comparó con el maíz de control tratado con a-amilasa comercialmente disponible. El maíz transgénico usado en este gen se hizo de acuerdo con los procedimientos expuestos en el Ejemplo 4 usando un vector que comprende el gen a-amilasa y él marcador seleccionable PMI, específicamente pNOV6201. El maíz transgénico se produjo al polinizar un híbrido comercial (N3030BT) con el polen de una linea transgénica que expresa un alto nivel de -amilasa termoestable . El maíz se secó a 11% de humedad y se almacenó a temperatura ambiente. El contenido de a a-amilasa de la harina de maiz transgénico de 95 unidades/g donde 1 unidad de enzima genera 1 micromol de extremo de reducción por minuto de la harina de maiz a 85°C en solución reguladora MES pH 6.0. El maiz de control que se usó fue un maiz de hendidura amarillo conocido que se desempeña bien en la producción de etanol. 1) Molienda: Maiz transgénico (1180 g) se molió en un molino de martillos Perten 3100 equipado con una criba de 2.0 mm para generar de esta manera harina de maiz transgénico. El maiz de control se molió en el mismo molino después de limpiar completamente para prevenir la contaminación por el maiz transgénico. 2) . Análisis de humedad: Muestras (20 g) de maiz transgénico y de control se pesaron en botes pesados de aluminio y se calentaron a 100°C durante 4 h. Las muestras se pesaron nuevamente y el contenido de humedad se calculó de la pérdida de peso. El contenido de humedad de la harina transgénica fue de 9.26%; mientras que la harina de control fue de 12.54%. 3) Preparación de suspensiones espesas: La composición de las suspensiones espesas se diseñó para pioducir un amasijo con 36% de sólidos al inicio del SSF. Las muestras de control se prepararon en botellas de plástico de 100 mi y contuvieron 21.50 g de harina de maíz de control, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroajuste (8% de sólidos en peso) y 0.30 mi de a-amilasa comercialmente disponible diluido a 1/50 con agua. La dosis de o¡-amilasa se seleccionó como representativa de la utilización industrial. Cuando se utilizó bajo las condiciones descritas anteriores para la prueba del a-amilasa transgénica, la dosis de a-amilasa de control fue de 2 U/g de harina de maiz. El pH se ajustó a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio, las muestras transgénicas se prepararon de la misma . manera pero contuvieron 20 g de la harina de maiz debido al menor contenido de humedad de la harina transgénica. Las suspensiones espesas de harina transgénica se prepararo « ya sea con oí-amilasa a la misma dosis, como las muestras de control o sin -amilasa exógena. 4) Licuefacción: Las botellas que contienen suspensiones espesas de harina de maiz transgénico se sumergieron en baños de agua a ya sea 85°C o 95°C durante tiempos de 5, 15, -30, 45 o 60 min. Las suspensiones espesas de control se incubaron a 60 min a 85°C. Durante la incubación a alta temperatura las suspensiones espesas se mezclaron vigorosamente con la mano cada 5 min. Después de la etapa de alta temperatura las suspensiones espesas se enfriaron sobre hielo. 5) Sacarificación y fermentación simultáneas: El amasijo producido por licuefacción se mezcló con glucoamilasa (0.65 mi de una dilución de 1/50 de una glucoamilasa L-400 comercialmente disponible), proteasa (0.60 mi de una dilución de 1000 veces de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%) . Un agujero se cortó en la tapa de la botella de 100 mi que contiene el amasijo para permitir la ventilación del C02. El amasijo luego se inoculó con levadura (1.44 mi) y se incubó en un baño de agua ajustado a 90°F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura se bajó a '86°F; 48 horas se ajustó a 82°F. . La levadura para la inoculación se propagó al preparar una mezcla que contiene levadura (0.12 g) con 70 gramos de maltodextrina,. 230 mi de agua, 100 mi de retroajuste, glucoamilasa (0.88 mi de una dilución 10 veces de una glucoamilasa comercialmente disponible) proteasa (1.76 mi de una dilución de 100 veces de una enzima comercialmente disponible) urea (1.07 gramos), penicilina (0.67 mg) y sulfato de zinc (0.13 g) . El cultivo de propagación se inició el día antes de que se necesitara y se incubó con mezclado a 90°F. En 24, 48 y 72 horas se tomaron muestras de cada recipiente de fermentación, se filtraron a través de filtros de 0.2 um y se analizaron mediante HPLC para etanol y azúcares. En 72 horas las muestras se analizaron para los sólidos disueltos totales y para el almidón residual. El análisis de HPLC se realizó en un sistema de gradiente binario equipado con un detector de Indice de refracción, calentador de columna y la columna Bio-Rad Aminex HPX-87H. El sistema se equilibró con H2SO4 0.005 M en agua a 1 ml/min. La temperatura de la columna fue de 50°C. El volumen de inyección de muestra fue de 5 µ?; la elución fue en el mismo solvente. La respuesta RI se calibró mediante la inyección de estándares conocidos. El etanol y glucosa ambos se midieron en cada inyección. El almidón residual se midió como sigue. Muestras y estándares se secaron a 50°C en un horno, luego se molieron a un polvo en un molino de muestra. El polvo (0.2 g) se pesó en un tubo de centrifuga graduada de 15 mi. El polvo se lavó 3 veces con etanol con 10 mi de etanol acuoso (80% v/v) por vórtice, seguido por la centrifugación y el desecho del sobrenadante. Se adicionó. DMSO (2.0 mi) a la pelotilla seguido por 3.0 mi de una alfa-amilasa termoestable (300 unidades) en solución reguladora de MOPS. Después del mezclado vigoroso, los tubos se incubaron en un baño de agua a 85°C durante 60 rain. Durante la incubación, los tubos se mezclaron cuatro veces.. Las muestras se enfriaron y 4.0 mi de solución reguladora de acetato de sodio (200 mM, pH 4.5) se adicionaron seguido por 0.1 mi de glucoamilasa (20 U) . Las muestras se incubaron a 50°C durante 2 horas, se mezclaron, luego se centrifugaron durante 5 min a 3,500 rpm. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0.2 um y se analizó para glucosa mediante el método de HPLC descrito en lo anterior. Un tamaño de inyección de 50 µ? se usó para las muestras con almidón de bajo contenido residual (<20% de sólidos) . Resultados . El maiz transgénico se desempeñó bien en la fermentación sin oc-amilasa adicionada. El rendimiento de etanol a 72 horas fue esencialmente el mismo con o sin o¡- amilasa exógena como es mostrado en la Tabla I. Estos datos también muestran que un rendimiento más alto de etanol- sé alcanza cuando la temperatura de licuefacción es más alta; la enzima presente expresada en el maiz transgénico tiene actividad a temperaturas más altas que otras enzimas usadas comercialmente tal como la a-amilasa de Bacill s liquefaciens. Tabla 1 95 60 No 2 18.25 ND Cuando el tiempo de licuefacción se cambió, se encontró que el tiempo de licuefacción requerido para la producción de etanol eficiente fue mucho menor que las horas requeridas para el proceso. La Figura 3 muestra que el rendimiento de etanol a 72 horas de fermentación estuvo casi sin cambio durante 15 min a 60 min de licuefacción. Además la licuefacción a 95°C dio más etanol en cada punto en el tiempo que en la licuefacción a 85 °C. Esta observación demuestra la mejora del proceso alcanzada por el uso- de una enzima hipertermofilica. El maíz de control dio un rendimiento de etanol final más alto que el maíz transgénico, pero el control fue seleccionado debido a que se desempeña muy bien en la fermentación. En contraste, el maíz transgénico tiene un fondo genético seleccionado para facilitar la transformación. La introducción de la cualidad ¦ de a-amilasa en el germen plasma del maíz de élite por técnicas de reproducción bien conocidas debe eliminar esta diferencia. El examen de los niveles de almidón residuales de la cerveza producida en 72 horas (Figura 4) muestra que la o¡-amilasa transgénica da por resultado una mejora significante en la elaboración del almidón disponible para la fermentación; mucho menos almidón se quedó después de la fermentación. Usando ambos niveles de etanoi y los niveles de almidón residuales, los tiempos- de licuefacción óptimos fueron de 15 min a 95°C y 30 min a 85°C. En los presentes experimentos estos tiempos fueron el tiempo total que los recipientes de fermentación estuvieron en el baño de agua y asi incluyen un periodo de tiempo durante el cual la temperatura de las muestras se incrementó "de la temperatura ambiente a 85°C a 95°C. Los tiempos de licuefacción más cortos pueden ser óptimos en procesos industriales a gran escala que rápidamente calientan el amasijo mediante el uso de equipo tales como equipos de cocción a chorro. Los • procesos de licuefacción industriales convencionales requieren tanques de contención para permitir que el amasijo se incube a alta temperatura durante una o más horas .· La presente invención elimina la necesidad por tales tanques de contención e incrementará la productividad del equipo de licuefacción. Una función importante de la a-amilasa en los procesos de fermentación es reducir la viscosidad del amasijo. En todos los puntos en el tiempo las muestras que contienen harina de maíz transgénico fueron marcadamenie menos viscosas que la muestra de control. Además, las muestras transgénicas no aparecen para proseguir a través de la fase gelatinosa observada con todas las muestras de control, la gelatinización normalmente ocurre cuando son cocidas las suspensiones espesas de maíz. Así, al tener la -amilasa distribuida por todos los fragmentos del endosperma da propiedades físicas ventajosas al amasijo durante la cocción al prevenir la formación de grandes geles que se difunden lentamente e incrementan los costos de energía de mezclado y bombeo del amasijo. La alta dosis de a-amilasa en el maíz transgénico también puede contribuir a las propiedades favorables del amasijo transgénico. A 85°C, la actividad de a-amilasa del maíz transgénico fue muchas veces más grande que la actividad que a la dosis de la -amilasa exógena usada en los controles. Esto último se escogió como representantivo de los gastos de uso comerciales. Ejemplo 15 Función efectiva del maíz transgénico cuando es mezclado con maíz de control Harina de maíz transgénico se mezcló con harina de maíz de control en varios niveles de harina de maíz transgénico de 5% a 100 . Estos se trataron como es descrito en el Ejemplo 14. Los amasijos que contienen -amilasa transgénicamente expresada fueron licuados a 85°C durante 30 min o a 95°C durante 15 ruin; los amasijos de control se prepararon .como es descrito en el Ejemplo 14 y se licuaron a 85°C durante 30 o 60 min (uno de cada uno) o a 95°C durante 15 o 60 min (uno de cada uno) . Los datos para el etanol a 48 y 72 horas y para el almidón residual se dan en la Tabla 2. Los niveles de etanol a 48 horas son grafxcados en la Figura 5; las determinaciones de almidón residual se muestran en la Figura 6. Estos datos muestran que la cx-amilasa termoestable transgénicamente expresada dan desempeño muy excelente en la producción de etanol aun cuando el grano transgénico es solamente una porción pequeña (tan bajo como 5%) del grano total en el amasijo. Los datos también muestran que el almidón residual es marcadamente menor que en el amasijo de control cuando el grano transgénico comprende por lo menos 40% del grano total. Tabla 2 0* 7.79 17.64 20.11 11.23 17.88 19.87 Muestras de control. Los valores son el promedio determinaciones. Ejemplo 16 Producción de etanol como una función del pH de licuefacción usando maiz transgénico a una proporción de 1.5 a 12% del maíz total Debido, a que el maiz transgénico se desempeñó bien a un nivel de 5-10% del maiz total en una fermentación, se realizó una serie adicional de fermentaciones en la cual el maiz transgénico comprendió de 1.5 a 12% del maiz total. El pH se varió de 6.4 a 5.2 y la enzima -amilasa expresada en el maiz transgénico se optimizó para la actividad a un pH menor que es convencionalmente usado en forma industrial. Los experimentos se realizaron como es descrito en el Ejemplo 15 con las siguientes excepciones: 1) . La harina transgénica se mezcló con harina de control como un por ciento del peso seco total a los .niveles que varían de 1.5% a 12.0%. 2) El maíz de control fue N3030BT que es más similar al maíz transgénico que el control usado en los ejemplos 14 y 15. 3) No se adicionó -amilasa exógena a las muestras que contienen harina transgénica. 4) Las muestras se ajustaron a un pH de 5.2, 5·.6, 6.0 o 6.4 antes de la licuefacción. Por lo menos 5 muestras que comprenden el rango de 0% de harina de maiz transgénico a 12% de harina de maiz transgénico se prepararon para cada pH. 5) La licuefacción para todas las muestras se realizó a 85°C durante 60 min. Los cambios en el contenido de etanol como una función del tiempo de fermentación se muestran en la Figura 7. Esta figura muestra los datos obtenidos de las muestras que contuvieron 3% de maiz transgénico. Al pH menor, la fermentación procede más rápidamente que al pH 6.0 y más alto/ el comportamiento similar se observó en muestras con otras dosis de grano transgénico. El pe.rfil de pH de la actividad de la enzima transgénica combinada con los altos niveles de expresión permitirá licuefacciones a pH menor que dan por resultado fermentaciones más rápidas y de esta manera rendimientos más altos que son posibles en el proceso de pH 6.0 convencional . Los rendimientos de etanol en 72 horas se muestran en la Figura 8. Como se puede observar, en la base del rendimiento de etanol, los resultados mostraron poca dependencia de la cantidad de grano transgénico incluido en la muestra. Asi, el grano contiene amilasa abundante para facilitar la producción fermentativa de etanol. También se demuestra que el pH menor de la licuefacción da por resultado un rendimiento más alto de etanol.
La viscosidad de las muestras después' de la licuefacción se inspeccionó y se observó que a un pH de 6.0, 6% de grano transgénieo es suficiente para adaptar la reducción en la viscosidad. A pH 5.2 y 5.6, la viscosidad es equivalente a aquella del control a 12% de grano transgénieo, pero no a porcentajes menores de grano transgénieo. Ejemplo 17 Producción de fructosa de la harina de maíz usando enzimas , termofílicas El maíz que expresa la -ainilasa hipertermofílica, 797GL3, se mostró que facilita la producción de fructosa cuando es mezclado con un a-glucosidasa (MalA) y una xilosa isomerasa (XylA) . Las semillas de las plantas transgénicas pNOV6201 que expresan 797GL3 se molieron a una harina en una celda Kleco creando de esa manera harina de amilasa. Las semillas de maíz no transgénicas se molieron de la misma manera para generar harina de control. La a-glucosidasa, MalA (de 5. solfataricus) , se expresó en E. coli. Las bacterias cosechadas se suspendieron en solución reguladora de fosfato de potasio 50 mM pH 7.0 que contiene fluoruro de 4- ( 2-aminoetil)bencensulfonilo 1 mM, luego se lisaron en una celda de presión Frenen. El lisado se •centrifugó a 23, 000 x g durante 15 min a 4°C. La solución sobrenadante se retiró, se calentó a 70°C durante 10 min, se enfrió en hielo durante 10 minutos y luego se centrifugó a 34, 000 xg durante 30 min a 4°C. La solución sobrenadante se retiró y la MalA se concentró dos veces en dispositivos centricon 10. El filtrado de la etapa centricon 10 se retuvo para el uso como un control negativo para MalA. La xilosa (glucosa) isomerasa se preparó al expresar el gen XylA de T. neapolitana en E. coli. Las bacterias se suspendieron en fosfato de sodio 100 m pH 7.0 y se Usaron mediante el pasaje a través de una celda de presión Frenen. Después de la precipitación de los restos celulares, el extracto se calentó a 80°C durante 10 min, luego se centrifugó. La solución sobrenadante contuvo la actividad enzimática XylA. Un extracto de control de vector vacio se preparó en paralelo con el extracto XylA. La harina de maiz (60 mg por muestra) se mezcló con solución reguladora y se extrajo de E. colí. Como es indicado en la Tabla 3, las muestras contuvieron harina de maiz de amilasa (amilasa) o harina de maiz de control (control), 50 µ? de ya sea extracto de MalA (+) o filtrado (-) y 20 µ? de ya sea extracto XylA (+) o control de vector vacio (-) . Todas las muestras también contuvieron 230 µ? de MOPS 50 mM, MgS04 10 mM y CoCl2 1 mM; el pH de la solución reguladora fue de 7.0 a temperatura ambiente . Las muestras se incubaron a 85°C durante 18 horas. Al final del tiempo de incubación, las muestras s.e diluyeron con 0.9 mi de agua a 85°C y se centrifugaron para retirar el material insoluble. La fracción sobrenadante luego se filtró a través de un dispositivo de ultrafiltración Centricon3 y se analizó mediante HPLC con detección de ELSD. El sistema de HPLC de gradiente se equipó con Astee Polymer Amino Column, tamaño de partícula de 5 mieras, 250 X 4.6 MI y un detector Alltech ELSD 2000. El sistema se pre-equilibró con una mezcla 15:85 de agua: cetonitrilo. El gasto de flujo fue de 1 ml/min. Las condiciones iniciales se mantuvieron durante 5 min después de la inyección seguido por un gradiente de 20 min a agua: acetonitrilo 50:50 seguido por 10 minutos del mismo solvente. El sistema se lavó durante 20 min con agua: acetonitrilo 80:20 y luego se reequilibró con el solvente de partida. La fructosa se eluyó en 5.8 min y glucosa en 8.7 min. Tabla 3 Muestra Harina de MalA XylA Fructosa Glucosa 1 maíz área pico área pico ' x 10"e x 10"' , 1 amilas + + 25.9 110.3 2 amilasa +· 7.0 i2.4 ; 3 amilasa + 0.1 147.5 , 4 amilasa - 0 25.9 5 control + + 0.8 0.5 6 control + 0.3 0.2 7 control + — 1.3 1.7 8 ' control - - 0.2 0.3 Los resultados de HPLC también indicaron la presencia de maltooligosacáridos más grandes en todas las muestras que contienen la a-amilasa.. Estos resultados demuestran que las tres enzimas termofilicas pueden funcionar conjuntamente para producir . fructosa de la harina de maíz a una alta temperatura. Ejemplo 18 Harina de Amilasa con Isomerasa En otro ejemplo, la harina de amilasa se mezcló con MalA purificada y cada una de dos xilosa isomerasas bacterianas: XylA de T. marítima y una enzima designada BD8037 obtenida de Diversa. La harina de amilasa se preparó como es descrito en el Ejemplo 18. MalA de S. solfataricus con una porción de purificación 6His se expresó en E. colí. El lisado de células se preparó como es descrito en el Ejemplo 18, luego se purificó a la homogeneidad aparente usando una resina de afinidad de níquel (Probond, Invitrogen) y siguiendo las instrucciones del fabricante para la purificación de la proteina nativa. XylA de T. marítima con la adición de una porción S y una señal de retención ER se expresó en E. coli y se preparó ' de la misma manera como la Xyl de T. neapolitana descrita en el Ejemplo 18. La xilosa isomerasa BD8037 se obtuvo como un polvo liofilizado y se resuspendió en 0.4x del volumen original de agua. La harina de maíz de amilasa se mezcló con las soluciones de enzima más agua o solución reguladora. Todas las reacciones contuvieron 60 mg de harina de amilasa y un total de 600 µ? de liquido. Un conjunto de reacciones se reguló con MOPS 50 mM, pH 7.0 a temperatura ambiente, más MgS04 10 mM y 1 mM CoC12; en un segundo conjunto de reacciones la solución · reguladora que contiene metal ' se reemplazó por agua. Las cantidades de enzima de isomerasa se variaron como es indicado en la Tabla 4. Todas las reacciones se incubaron durante 2 horas a 90°C. Las fracciones sobrenadantes de reacción se prepararon mediante centrifugación. Las pelotillas se lavaron con 600 µ? adicionales de ¾0 y se recentrifugaron. Las fracciones sobrenadantes de cada reacción se combinaron, se filtraron a través de un Centricon 10, se analizaron mediante HPLC con la detección de ELSD como es descrito en el Ejemplo 17. Las cantidades de glucosa y fructosa observadas son graficadas en la Figura 15. Tabla 4 Muestra Harina de Mal A Isomerasa axnilasa 1 60 mg + ninguna 2 60 mg + T. marítima, 100 µ? 3 60 mg + ?.' marítima, 10 µ? 4 60 mg + ?. marítima, 2 µ? 5 60 mg + BD8037, 100 µ? 7 60 mg + BD8037, 2 µ? C · 60 mg ninguna Ninguna · Con cada una de las isomerasas, la fructosa se produjo de la harina de maíz de una manera dependiente de 1 la dosis cuando la a-amilasa y la a-glucosidasa estuvieron presentes en la reacción. Estos resultados demuestran qué la amilasa expresada en el grano 797GL3 puede funcionar con MalA y una variedad de diferentes isomerasas te mofílicas, con o sin iones metálicos adicionados, para producir fructosa de la harina de maíz a una alta temperatura. En la presencia de iones metálicos divalentes adicionados, las isomerasas pueden alcanzar la fructosa predicha: equilibrio de glucosa a 90°C de aproximadamente 55 ¾ de fructosa. Esto sería una mejora sobre el proceso actual que usa isomerasas raesofílicas, que requiere una separación cromatográfica para incrementar la concentración de fructosa. Ejemplo 19 Expresión de una pululanasa en maiz Plantas transgénicas que fueron homocígotas para ya sea pNOV7013 o pNOV7005 se cruzaron para generar semilla de maiz transgénico que expresa tanto la ot-amilasa 797GL3 como la pululanasa 6GP3. Se obtuvieron semillas TI o T2 de plantas de maiz autopolinizadas transformadas con ya sea pNOV7005 o pNOV4093. pNOV4093 es una fusión del gen sintético optimizado de maiz para 6GP3 (SEQ ID: 3, ) con la .secuencia de dirección al amiloplasto (SEQ ID NO: 7, 8) para la localización de la proteina de fusión al amiloplasto. Esta proteina de fusión está bajo el control del promotor ADPgpp (SEQ ID NO: 11) para la expresión específicamente en el endosperma. La construcción pNOV7005 dirige la expresión de la pululanasa en el retículo endoplásmico en el endosperma. La localización de esta enzima en el ER permite la acumulación normal del almidón en las semillas. El manchado normal para el almidón, con una solución de yodo también fue observada, antes de cualquier exposición a alca temperatura. Como es descrito en el caso de la a-amilasa, la expresión de pululanasa dirigida al amiloplasto (pNOV4093) dio por resultado una acumulación de almidón anormal en las semillas. Cuando las mazorcas de maíz son secadas, las semillas son marchitadas. Aparentemente, esta pululanasa termofilica es suficientemente activa a bajas temperaturas e hidroliza el almidón si se deja estar en contacto directo con los gránulos de almidón en el endosperma de semilla. Preparación de enzima o extracción de la enzima de ,1a harina de maíz: La enzima pululanasa se extrajo de las semillas transgénicas al molerlas en el molino Kleco, seguido por la incubación de la harina en solución reguladora de NaOAc 50 mM pH 5.5 durante 1 hr RT, con agitación continua. La mezcla incubada luego se giró durante 15 min. a 14000 rpm.. El sobrenadante se uso como la fuente de enzima. Prueba de pululanasa: La reacción de prueba se llevó a cabo en placas de 96 cavidades. La enzima extraída de la harina de maíz (100 µ?) se diluyó 10 veces con 900 µ? de solución reguladora NaOAc 50 mM, pH 5.5, que contiene CaCl 40 mM. La mezcla se giró en vórtice, una tableta de Limit-Dextrizyme (pululan reticulado con azurina, de Megazyme) se adicionó a cada mezcla de reacción y se incubó a 75°C durante 30 min (o como es mencionado) . Al final de la incubación las mezclas de reacción se giraron a 3500 rpm durante 15 minutos. Los sobrenadantes se diluyeron 5 veces y se transfirieron en la placa de fondo plano de 96. cavidades para la medición de absorbencia a 590 nm. La hidrólisis del sustrato de pululan reticulado con azurina por la pululanasa produce fragmentos de tintes solubles en agua y la proporción de liberación de éstos (medida como el incremento en la absorbencia a 500 nm) está relacionado directamente con la actividad de la enzima. La Figura 9 muestra el análisis de las semillas T2 de diferentes eventos transformadas con pNOV7005. La alta expresión de la actividad de pululanasa, comparada con el control no transgénico, puede ser detectada en un número de eventos. A una cantidad medida (~100 µg) de harina de maiz seco de maiz transgénico (que expresa pululanasa, o amilasa o ambas de las enzimas) y/o maiz de control (no transgénico), se adicionaron 1000 µ? de solución reguladora de NaOAc 50 mM pH 5.5 que contiene CaC12 40 mM. Las mezclas de reacción se giraron con vórtice y se incubaron en un agitador durante 1 hr. La reacción enzimática se inició al transferir las mezclas de incubación a alta temperatura (75°C, la temperatura de reacción óptima para pululanasa o como es mencionado en las figuras) durante un periodo de- tiempo como es indicado en las figuras. Las reacciones se detuvieron al enfriarlas sobre hielo. Las mezclas de reacción luego se centrifugaron durante 10 min. a 14000 rpm. Una alícuota (100 µ?) del sobrenadante se diluyó tres veces, se filtró a través del filtro de 0.2 mieras para el análisis de HPLC. Las muestras se analizaron mediante HPLC usando las siguientes condiciones : Columna: Alltech Prevalí Carbohidrato ES 5 mieras 250 X 4.6 mm Detector: Alltech ELSD 2000 Bomba: Gilson 322 Inyector: Inyector/diluidor Gilson 215 Solventes: Acetonitrilo de grado HPLC (Socher Scientific) y Agua (purificada por Waters Millipoe System) . Gradiente usado para oligasacáridos de bajo grado de polimerización (DP 1-15) . Tiempo % de Agua % de Acetonitrilo 0 15 85 5 15 85 25 50 50 35 50 50 36 80 20 55 80 20 56 15 85 76 15 85 Gradiente usado para sacáridos de alto grado de polimerización (DP20-100 y más alto) Tiempo % de Agua % de Acetonitrilo 0 35 65 60 85 15 70 85 15 85 35 65 100 35 65 Sistema usado para el análisis de datos : Gilson Unipoint Software System Versión 3.2 Las Figuras 10A y 10B muestran el análisis de HPLC de los productos hidroliticos generados por la pululanasa expresada del almidón en la harina del almidón de maiz transgénico. La incubación de la harina de maiz que expresa pululanasa en la solución reguladora de reacción a 75°C durante 30 . minutos da por resultado la producción de oligosacáridos de cadena mediana (DP -10-30) y cadenas de amilosa cortas (DP -100-200) de almidón de maiz. Esta figura también muestra la dependencia de la actividad de pululanasa en la presencia de iones calcio. El maiz transgénico que expresa pululanasa puede ser usado para producir almidón modificado/dextrina que es desrramificado ( l-6 enlace segmentado) y por consiguiente tendrá alto nivel de amilosa/dextrina de cadena recta. También dependiendo de la clase del almidón (por ejemplo, wasy, alto contenido de amilosa, etc.) usado en la distribución de longitud de cadena de la amilosa/dextrina generada por la . ululanasa variará y asi también la propiedad del almidón modificado/dextrina . La hidrólisis de un enlace a. 1-6 también se demostró usando pululan como el sustrato. La pululanasa aislada de la harina de maiz eficientemente hidrolizó pululan. El análisis de HPLC (como es descrito) del producto generado al final de la incubación mostró producción de maltotriosa, como es esperado, debido a la hidrólisis de los enlaces a l-? en las moléculas de pululan por la enzima del maiz . Ejemplo 20 Expresión de pululanasa en maiz La expresión de la pululanasa 6gp3 se analizó adicionalmente mediante la extracción de harina de maiz seguido por PAGE y manchado de eoomassie. La harina de maiz se hizo al moler semillas, durante 30 seg en el molino Kleco. La 'enzima se extrajo de aproximadamente 150 mg de harina con 1 mi de solución reguladora de NaOAc 50 mM pH 5.5. La mezcla se giró con vórtice y se incubó en un agitador a RT durante 1 h, seguido por otros 15 min de incubación a 70°C. La mezcla luego se giró (1400 rpm durante 15 min a RT) y el sobrenadante se uso como el análisis SDS-PAGE. Se observó una banda de proteina del peso molecular apropiado (95 kDal) . Estas muestras se sometieron a una prueba de pululanasa usando dextrinas de limite conjugado con tinte ccmercialmente disponible (LIMIT-DEXTRIZYME, de Megazyme, Ireland) . Altos niveles de .la actividad de pululanasa termofilica se correlacionaron con la presencia de la proteina 95 kD. El manchado de Western y el análisis de ELISA de la semilla de maiz transgénico también demostró la expresión de la proteína ~95 kD que reaccionó con el anticuerpo producido contra la pululanasa (expresado en E. coll) . Ejemplo 21 Incremento en la proporción de hidrólisis de almidón y el rendimiento mejorado de oligosacáridos de cadena pequeña ( fermentables ) mediante la adición de maíz que expresa pululanasa . Los datos mostrados en las Figuras 11A y 11B se generaron del análisis de HPLC, como es descrito en lo anterior, de los productos de la hidrólisis de almidón de dos mezclas de reacción. La primera reacción indicada como ^Amilasa' contiene una mezcla [1:1 (p/p) ] de muestras de harina de maíz a partir de maíz transgénico que expresa o¡-amilasa hecho -de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 4, por ejemplo, y maíz no transgénico A188; y la segunda mezcla de reacción ,Amilasa+Pululanasa' contiene una mezcla 1:1 (p/p)] de muestras de harina de maíz a partir de maíz transgénico que expresa a-amilasa y maíz transgénico que expresa pululanasa hecho de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 19. Los resultados obtenidos sustentan el beneficio de usar pululanasa en combinación con -amilasa durante los procesos de hidrólisis de almidón. Los beneficios son de la proporción incrementada de la hidrólisis de almidón (Figura 11A) y el rendimiento incrementado de oligosacáridos fermentables con bajo DP (Figura 11B.
Se encontró que la -amilasa sola o a-amilasa y pululanasa (o cualquier otra combinación de enzimas hidroliticas de almidón) expresada en el maiz puede ser usada para producir maltodextrina (oligosacáridos de cadena recta o ramificada) (Figuras 11A, 11B, 12 y 13A) . Dependiendo de las condiciones de reacción, el tipo de enzimas hidroliticas y sus combinaciones, y el tipo de almidón usado, variará la composición de. las maltodextrinas producidas, y por consiguiente sus propiedades . La Figura 12 representa los resultados de un experimento llevado a cabo de una manera similar como es descrito para la Figura 11. Los esquemas de temperatura y tiempo diferentes seguido durante la incubación de las reacciones son indicados en la figura. La temperatura de reacción óptima para la pululanasa es de 75°C y para a- amilasa es de <95°C. Por consiguiente, los esquemas indicados fueron seguidos para proporcionar el alcance para llevar a cabo la catálisis por la pululanasa y/o la a-amilasa a su temperatura de reacción óptima respectiva. Claramente se puede deducir del resultado mostrado que la combinación de o¡-• amilasa y pululanasa se desempeñó mejor en hidrolizar al almidón de maiz al final del periodo de incubación de 60 min. El .análisis de HPLC, como es descrito en lo anterior (excepto -150 mg de harina de maiz se usó en esta reacción) , del producto de hidrólisis de almidón de dos conjuntos de mezclas de reacción al final de incubación de 30 min es mostrado en la Figura 13A y 13B. El primer conjunto de reacciones se incubó a 85°C y el segundo se incubó a 95°C. Para cada conjunto existen dos mezclas de reacción; la primera reacción indicada como \Amilasa X Pululanasa' contiene harina de maiz transgénico {generado por la polinización cruzada) que expresa tanto la -amilasa y la pululanása, y la segunda reacción indicada como mezcla de NAmilasar de muestras de harina de maiz de maiz trasgénico que expresa a-amilasa y maiz no transgénico A188 en una relación para obtener la misma cantidad de . actividad de c-amilasa. como es observado en la cruza (Amilasa X Pululanasa) . El rendimiento total de oligosacáridos de bajo DP fue mayor en el caso de la cruza de -amilasa y pululanasa comparada con el maiz que expresa a-amilasa solamente, cuando las muestras de harina de maiz se incubaron a 85 °C. La temperatura de incubación de 95°C inactiva (por lo menos parcialmente) la enzima pululanasa, por consiguiente se puede observar poca diferencia entre la \Amilasa X Pululanasa' y 'Amilasa' . Sin embargo, los datos para ambas de las temperaturas de incubación muestran mejora significante en la cantidad de glucosa producida (Figura 13B) , al final del periodo de incubación, cuando la harina de maiz de la cruza de a-amilasa y pululanasa se usó comparado con el maiz que expresa a-amilasa solamente. Por consiguiente, el uso del maíz que expresa tanto a-artiilasa como pululanasa puede ser especialmente benef-icioso para los procesos donde es importante la hidrólisis completa del almidón a glucosa. Los ejemplos .anteriores proporcionan amplio soporte de que la pululanasa expresada en las semillas de maiz, cuando es usada en combinación con -amilasa, mejora el proceso de hidrólisis de almidón. La actividad de la enzima pululanasa, que es un enlace especifico a 1-6, desramifica el almidón más eficientemente que el -amilasa (una enzima de enlace especifico de a-1-4) reduciendo de esta manera la cantidad.de oligosacáridos ramificados (por ejemplo, dextrina de limite, panosa; estos no son usualmente fermentables) · e incrementando la cantidad de oligosacáridos de cadena corta recta (fácilmente fermentables a etanol, etc.). En segundo lugar, la fragmentación de las moléculas de almidón por la de ramificación catalizada por pululanasa incrementa · la accesibilidad del sustrato para la a-amilasa, por consiguiente, un incremento en eficiencia de los resultados de la reacción catalizada con a-amilasa. Ejemplo 22 Para determinar si la a-amilasa 797GL3 y la alfa-glucosidasa malA podrían funcionar bajo condiciones de pH y temperaturas similares para generar una cantidad incrementada de glucosa sobre aquella producida por cualquier enzima sola, aproximadamente 0.35 ug de enzima alfa glucosidada malA (producida en bacteria) se adicionó a una solución que contiene 1% de almidón y almidón purificado de ya sea semilla de maiz no transgénico (control) o semilla de maiz transgénico 797GL3 (en la semilla de maiz 797GL3 la alfa-amilasa se purifica con el almidón) . Además, el almidón purificado de la semilla de maiz no transgénico y maiz transgénico 797GL3 se adicionó al almidón al 1% de almidón de maiz en la ausencia de cualquier enzima malA. Las mezclas se incubaron a 90°C, pH 6.0 durante 1 hora, se giraron para retirar cualquier material insoluble y la fracción soluble se analizó mediante HPLC para' los niveles de glucosa. Como es mostrado en la Figura 14, la alfa-amilasa 797GL3 y la alfa-glucosidasa malA funcionan a un pH y temperatura similar para descomponer el almidón en glucosa. La cantidad de glucosa generada es significativamente más alta que aquella producida por cualquier enzima sola. Ejemplo 23 Se determinó la utilidad de la glucoamilasa de Thermoanaerobacterium para la hidrólisis de almidón bruto. Como es expuesto en la Figura 15, la conversión de hidrólisis del almidón bruto se probó con agua, a-amilasa de cebada (preparación comercial de Sigma) , glucoamilasa de Thermoanaerobacterum y combinaciones de los mismos se averiguaron a temperatura ambiente y a 30°C. Como es mostrado, .la combinación del a-amilasa de cebada con la glucoamilasa de Thermoanaerobacterium fue capaz de hidrolizar el almidón bruto en glucosa. Además, la cantidad de glucosa producida por la amilasa de. cebada y el GA de thermoanaerobacter es significativamente más alta que aquella producida por cualquier enzima sola. Sje-splo 24 Genes optimizados de maíz y secuencias para la hidrólisis de almidón bruto y vectores para la trans ormación de la planta Las enzimas se seleccionaron basadas en . su habilidad para hidrolizar almidón bruto a temperaturas que varían de aproximadamente 20°-50°C. Los genes o fragmentos de genes correspondientes luego se diseñaron al utilizar codones preferidos de maiz para la construcción de genes sintéticos como es expuesto en el Ejemplo 1. El polipéptido de fusión de a-amilasa/glucoamilasa de Aspergíllus shirousami (sin secuencia de señal) se seleccionó y también la secuencia de aminoácidos como es expuesta en la SEQ ID NO: 5 como es identificada en Biosci. Biotech, Biochem. , 56:884-889 (1992); Agrie. Biol. Chem. 545:1905-14 (1990); Biosci. Biotechnol. Biochem, 56:174-79 (1992) . El ácido nucleico optimizado, del maiz fue diseñado y es representado en la SEQ ID NO: 46. De manera similar, se seleccionó la glucoamilasa de Thermoanaerobacteríum thermósaccharolyticu , que tiene los aminoácidos de la SEQ ID NO: 47 como es publicado en Biosci.
Biotech. Biochem, 62:302-308 (1998). El ácido nucleido optimizado de maiz fue diseñado (SEQ ID NO:48). Se seleccionó la glucoamilasa de Rhizopus oryzae que tiene la secuencia de aminoácidos (sin secuencia de señal) (SEQ ID NO:50), como es descxito en la literatura (Agrie. Biol. C em. (1986) 50, pg 957-964). El ácido nucleico optimizado de maiz fue diseñado y es representado en la SEQ ID NO: 51. Además, se seleccionó la -amilasa de maiz y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 51) y la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID O: 52) se obtuvieron de la literatura. Ver, por ejemplo, Plant Physiol. 105:759-760 (1994). Los casetes de expresión son construidos para expresar el polipéptido de fusión de a-amilasa/glucoamilasa de Aspexgíllus shírousa i del ácido nucleico optimizado de maiz fue diseñado como es representado en la SEQ ID NO: 46, la glucoamilasa de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum del ácido nucleico optimizado de maiz se diseñó como es representado en la SEQ ID ' NO:48, se seleccionó la glucoamilasa de Rhizopus oryzae que tiene la secuencia de aminoácidos (sin secuencia de señal) (SEQ ID NO: 9) del ácido nucleico optimizado de maiz que fue diseñado y es representado en la SEQ ID NO: 50, y la a-amilasa de maiz. Un plásmido que comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeina de maiz (MRVLLVALALLALAASATS ) (SEQ ID NO.17) es fusionado al gen sintético que codifica la enzima. Opcionalmente, la secuencia SEKDEL es fusionada al C-terminal del gen sintético para la dirección y retención en el ER. La fusión es clonada detrás del promotor de ?-zeína de maiz para la expresión específicamente en el endosperma en un plásmido de transformación de planta. La fusión es suministrada al tejido de maiz por medio de la transfección con Agrohacteri m. Ejemplo 25 Casetes de expresión que comprenden las enzimas seleccionadas son construidos para expresar .las enzimas. Un plásmido que comprende la secuencia para un sitio de enlace de almidón bruto es fusionado al gen sintético que codifica la enzima. El sitio de enlace de almidón bruto permite que la fusión de la enzima se enlace al almidón no gelatinizado. La secuencia de aminoácidos del sitio de enlace de almidón bruto (SEQ ID NO: 54) se determinó basada en la literatura, y la secuencia de ácido nucleico se optimizó con el maiz para dar la SEQ ID NO: 54. La secuencia de ácido nucleico optimizado de maiz es fusionado al gen sintético que codifica la enzima en un plásmido para la expresión en una planta. Ejesnplo 26 Construcción de genes optimizados de maiz y vectores para la transformación de planta Los genes o fragmentos de genes se diseñaron al usar codones preferidos de maiz para la construcción de genes sintéticos como es expuesto en el Ejemplo 1. Se seleccionó EGLA . de . Pyrococcus furíosus, secuencia de aminoácidos de endoglucanasa hipertermofilica (sin secuencia de señal) y tiene la secuencia de aminoácidos como es expuesta en la SEQ ID NO: 55, como es identificado en Journal of Bacteriology (1999) 181, pg 284-290). El ácido nucleico optimizado de maiz se diseñó y es representado en la SEQ ID NO: 56. Se seleccionó la xylosa isomerasa de Thermus flavus y la secuencia ¦ de aminoácidos como es expuesta en la SEQ ID NO: 57, como es descrito en Applied Bioc emistry and Biotechnology 62:15-27 (1997) . . Casetes de expresión son construidos para expresar la EGLA (endoglucanasa) de Pyrococcus f riosus del ácido nucleico optimizado de maiz (SEQ ID NO: 56) y la xylosa isomerasa de Thermus flavus de un ácido nucleico optimizado de maiz que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57. Un plásmido que comprende la secuencia de señal N-terminal de ?-zeina de maiz (MRVLLVALALLALAASATS ) (SEQ ID NO: 17) es fusionado al gen optimizado de maiz sintético que codifica la enzima. Ópcionalmente, la secuencia SEKDEL es fusionada al C-terminal del gen sintético para la dirección y detección del ER. La fusión es clonada detrás del promotor de ?-zeina de maíz para la expresión específicamente en el endosperma en un plásmido de transformación de planta. La fusión es suministrada al tejido de maíz por medio de la transfección con Agrobacteríum. Ejemplo 27 Producción de glucosa de la harina de maíz usando enzimas termofílicas expresadas en el maíz La expresión de la a-amilasa tiipertermofílica, 797GL3 y a-glucosidasa (MalA) se muestran para dar por resultado la producción de glucosa cuando es mezclada con una solución acuosa e incubada a 90°C. Una línea de maíz transgénica (línea 168A10B, pNOV4831) que expresa la enzima MalA se identificó al medir la actividad de -glucosidasa como es indicada por la hidrólisis de p-nitrofenil- -glucósido. La semilla de maíz de plantas transgénicas que expresan 797GL3 se molieron a una harina en una celda Kleco creando de esta manera harina de amilsa'. Las semillas de maíz de plantas transgénicas que expresan MalA se molieron a una harina a una celda Kleco creando de esta manera harina MalA. Las semillas de maíz no transgénicas se molieron de la misma manera para generar harina de control . La solución reguladora fue la solución reguladora de MES 50 mM pH 6.0.
Reacciones de hidrólisis de harina de maiz: Las muestras se prepararon como es indicado en la Tabla 5 enseguida. La harina de maiz (aproximadamente 60 mg por muestra) se mezcló con 40 mi de solución reguladora de MES 50 mM H 6.0. Las muestras se incubaron en un baño de agua a 90°C durante 2.5 y 14 horas. A los tiempos de incubación indicados, las muestras se retiraron y se analizaron para el contenido de glucos . Las muestras se analizaron para la glucosa mediante una prueba basada en glucosa oxidasa/peroxidasa de rábano picante. El reactivo GOPOD contuvo: 0.2 mg/ml de or dianisidina, Tris 100 mM pH 7.5, 100 U/ml de glucosa oxidasa y 10 U/ml de peroxídasa de rábano picante. 20 µ? de muestra o muestra diluida se arreglaron en una placa de 96 cavidades junto con los estándares de glucosa (que variaron de 0 a 0.22 mg/ml) . 100 µ? del reactivo GOPOD se adicionó a cada cavidad con mezclado y la placa se incubó a 37°C durante 30 min. 100 µ? de ácido sulfúrico (9M) se adicionaron y se leyó la absorbencia a 540 nm. La concentración de glucosa de las muestras se determinó por referencia curva estándar. La cantidad de glucosa observada en cada muestra es indicada en la Tabla 5. Tabla 5 Muestra Harina Harina Harina Solución Glucosa Glucosa WT de de MalA Reguladora 2.5 h 14 h mg amilasa Mg ml mg mg mg 1 66 0 0 40 0 0 2 31 30 0 40 0.'26 0.50 3 30 0 31.5 40 0 0.09 4 0 32.2 30.0. 40 2.29 13.30 5 0 6.1 56.2 40 1.16 8.52 Estos datos demuestran que cuando la expresión de a-amilasa hipertermofilica y la -glucosidasa en el maíz da por resultado un producto de maíz que generará glucosa cuando se hidrate y se caliente bajo condiciones apropiadas E emplo 28 Producción de Maltodextrinas El grano que expresa a-amilasa termofílica se usó para preparar maltodextrinas. El proceso ejemplificado no requiere el aislamiento previo del almidón ni requiere la adición de enzimas exógenas. Las semillas de maíz de plantas trangénicas que expresan 797GL3 se molieron a una harina en una celda Kleco para crear "harina de amilasa". Una mezcla de semilla al 10% transgénica/90% no transgénicas se molieron de la misma manera para crear "harina de amilasa al 10%". La harina de amilasa y la harina de amilasa al 10% (aproximadamente 60 mg/muestra) se mezclaron con agua a una proporción de 5 µ? de agua por mg de harina. Las suspensiones espesas resultantes se incubaron a' 90°C por hasta 20 horas como es indicado en la Tabla 6. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 0.9 mi de EDTA 50 mM a 85°C y se mezclaron mediante pipeta. Las muestras de 0.2 mi de suspensión espesa se retiraron, se centrifugaron para retirar el material insoluble y se diluyeron 3x en agua. Las muestras se analizaron mediante HPLC con detección ELSD para azúcares y maltodextrinas . El sistema de HPLC de gradiente se equipó con la columna Astee Polymer Amino, tamaño de partícula 5 mieras, 250 X 4.6 m y un detector Alltech ELSD 2000. El sistema se preequilibró con una mezcla 15:85 de agua: acetonitrilo. El gasto de flujo fue de 1 ml/min. Las condiciones iniciales se mantuvieron durante 5 min después de la inyección seguido por un gradiente de 20 min a 50:50 de agua: acetonitrilo seguido por 10 minutos del mismo solvente. El sistema se lavó durante 20 min con 80:20 de agua: acetonitrilo y luego se reequilibró con el solvente de partida . Las áreas pico resultantes se normalizaron para ei volumen y el peso de la harina. El factor de respuesta de ELSD por µg de ' carbohidrato disminuye- con el DP incrementado, asi las maltodextrinas de DP más alto representan un más aleo porcentaje del total que es indicado por el área pico. Las áreas pico relativas de los productos de reacciones con harina de amilasa al 100% son mostradas en la Figura 17. Las áreas pico relativas de los productos de las reacciones con harina de amilasa al 10% son mostradas en la Figura 18. Estos datos demuestran que una variedad de mezclas de maltodextri a pueden ser producidas al variar el tiempo de calentamiento. El nivel de actividad de a-amilasa puede ser variado al mezclar maiz que expresa' a-amilasa transgénica con maiz de tipo silvestre para alterar el perfil de maltodextrina . Los productos de las reacciones de hidrólisis descritos en este ejemplo pueden ser concentrados y purificados para ¦ alimentos y otras aplicaciones mediante' el uso de una variedad de métodos bien definidos que incluyen: centrifugación, filtración, intercambio iónico, permeación de gel, ultrafiltración, manofiltración, osmosis inversa, decoloración con partículas de carbón, secado por rocío y otras técnicas estándares conocidas en la técnica. Ejemplo 29 Efecto del tiempo y la temperatura en la producción de maltodextrina La composición de los productos de maltodextrina del autohidrólisis de grano que contiene a-amilasa termofílica puede ser alterada al variar el tiempo y la temperatura de la reacción.
En otro experimento, la harina de amilasa se produjo como es descrito en el Ejemplo 28 anterior y se mezcló con agua a una relación de 300 µ? de agua por 60 mg de harina. Las muestras de incubaron a 70° , 80°, 90° o 100 °C por hasta 90 minutos. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 900 mi de EDTA 50 mM a 90 °C, se centrifugaron para retirar el material insoluble y se filtraron a través de filtros de nylon 0.45 um.. Los filtrados se analizaron mediante HPLC como es descrito en el Ejemplo 28. El resultado de este análisis es presentado en la Figura 19. La nomenclatura de número DP se refiere al grado de polimerización. DP2 es maltosa; DP3 es maltotriosa, etc. Las maltodextrinas de DP más grande eluyeron en un solo pico cerca del extremo de diluciones son marcadas ">DP12". Este agregado incluye dextrinas que pasaron a través de los filtros de 0.45 um y a través de la columna de protección y no incluyen cualquiera de los fragmentos de almidón muy grandes atrapados por el filtro en la columna de protección. Este experimento demuestra que la composición de maltodextrina del producto puede ser alterada al variar tanto la temperatura como el tiempo de incubación para obtener el producto de maltooligosacárido o maltodextrina deseado. Ejemplo 30 Producción de maltodextrina La composición de los productos de maltodextrina del maíz transgénico que contiene a-amilasa termofilica también puede ser alterada mediante la adición de otras enzimas tales como -glucosidasa y xylosa isomerasa asi como al incluir sales en la mezcla de harina acuosa antes del tratamiento con calor. En otra composición, la harina de amilasa, preparada como es descrito eñ lo anterior se mezcló con MalA purificada y/o xylosa isomerasa bacteriana, designada BD8037. MalA de S. sulfotaricus con una porción de purificación 6His se expresó en E. col!. El ' hidrolizado de células se preparó como es descrito en el Ejemplo 28, luego se purificó a la homogeneidad aparente usando una resina de afinidad de níquel (Probond, Invitrogen) y siguiendo las instrucciones del fabricante para la purificación de proteina nativa. La xylosa isomerasa BD8037 se obtuvo como un polvo liofilizado · de Diversa y se resuspendió en 0.4x del volumen original de agua . La harina de maiz de amilasa se mezcló con soluciones de enzima más agua o solución reguladora. Todas las reacciones contuvieron 60 mg de harina de amilasa y un total de 600 µ? de liquido. Un conjunto de reacciones se reguló en MOPS 50 mM, pH 7.0 a temperatura ambiente, más MgS04 10 mM y CoCl: 1 mM; en un segundo conjunto de reacciones la solución reguladora que contiene metal se reemplazó por agua. Todas las reacciones se incubaron durante 2 horas a 90°C. las fracciones sobrenadantes de reacción se prepararon por centrifugación. Las pelotillas se lavaron con 600 µ? de H20- adicionales y se recentrifugaron. Las fracciones sobrenadantes de cada reacción se combinaron, se filtraron a través de un Centricon 10, y se analizaron mediante HPLC con detección de ELSD como es descrito en lo anterior. Los resultados son graficados en la Figura 20. Ellos demuestran que la amilasa 797GL3 expresada en el grado puede funcionar con otras enzimas termofílicas, con o sin ione's metálicos adicionados, para producir una variedad de mezclas de maltodextrina de. harina de maiz a una alta temperatura. En particular, la inclusión de una glucoamilasa o a-glucosidasa puede dar por resultado un producto con más glucosa y otros productos con bajo DP. La inclusión de una enzima con actividad de glucosa isomerasa da por resultado un producto que tiene fructosa y asi seria más dulce que aquel producido por la amilasa sola o la amilasa con a-glucosidasa . Además, los datos indican que la proporción de raaltosacárido DP5, DP6 y DP7 puede ser incrementado al incluir sales catiónicas divalentes, tales como CoCl2 y MgSC>4. Otro medio para alterar la composición de maltodextrina producida por una reacción tal como aquel descrito aquí incluye: variar el pH de la reacción, variar el tipo de almidón en el grano transgénico o no transgénico, variar la relación de sólidos o mediante la adición de solventes orgánicos. Ejemplo 31 Preparación de dextrinas, o azúcares del grano sin rotura mecánica del grano antes de la recuperación de los productos derivados de almidón Los azúcares y itialtodextrinas se prepararon al poner en contacto el grano transgénico que expresa el -amilasa, 797GL3, con agua y al calentar a 90 °C durante la noche (>14 horas) . Luego el liquido se separó del grano por filtración. El producto liquido sé analizó mediante. HPLC por el método descrito en el Ejemplo 15. La Tabla 6 presenta el perfil de productos detectados . Tabla 6 1 1 Especies moleculares Concentración de Productos i 1 Ug/25 µ? de inyección Fructosa ! 0.4 Glucosa 1 18.0 Maltosa i 56.0 DP3* ; · 26.0 DP4* 15.9 DP5* 11.3 DP6* 5.3 DP7* 1.5 * La cuantificación de DP3 incluye la maltotriosa y puede incluir isómeros de maltotriosa que tienen un enlace a(l->6) en lugar de un enlace a(l— ) . De manera similar, la cuantificación de DP4 a DP7 incluyen los maltooligosacáridos lineales de una longitud de cadena dada asi como isómeros que tienen uno o más enlaces cc(l—6) en lugar de uno o más enlaces a(l?4) . . Estos . datos demuestran que los azúcares y las maltodextrinas pueden ser preparados al poner en contacto grano que expresa -amilasa intacta con agua y calentamiento. Los productos luego pueden ser separados del grano intacto por filtración o centrifugación o por asentamiento gravitatorio . Ejemplo 32 Fermentación de almidón bruto en maíz que expresa glucoamilasa de Rhlzopus oryzae Semillas de maiz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas hechas como es descrito en el Ejemplo 29. Las semillas son molidas a una harina. Las semillas de maiz expresan una proteína que contiene un fragmento activo de la glucoamilasa de Rhizopus aryzae (Secuencia ID NO: 49) dirigida al retículo endoplásmico . Las semillas de maíz son molidas a una harina como es descrito en el Ejemplo 15. Luego se prepara un amasijo que contiene 20 g de harina de maíz, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroajuste (8% de sólidos en peso). El pH es ajustado a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio. Los siguientes componentes se adicionan al amasijo: proteasa (0.60 mi de una dilución 1000 veces diluida de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido . y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%) . Un agujero es cortado en la tapa de la botella de 100 mi que contiene el amasijo para permitir que se ventile el C02. El amasijo luego es inoculado con levadura (1.44 mi) e incubado en un baño ajustado a 90 °F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada a 86°F; en 48 horas es ajustada' a 82°F. La levadura para la inoculación es propagada como es descrito en el Ejemplo 14. Las muestras son retiradas como es descrito en el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 14. Ejemplo 33 Ejemplo de fermentación de almidón bruto en maiz que expresa glucoamilasa de Rhizopus oryzae Semillas de maiz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas hechas como es descrito en el Ejemplo 28. Las semillas son molidas a una harina. Las semillas de maiz expresan una proteína que contiene un fragmento activo de la glucoamilasa de Rhizopus . oryzae (Secuencia ID NO:49) dirigida el retículo endoplásmico . Las semillas de maíz son molidas a una harina como es descrito en el Ejemplo 15. Luego se prepara un amasijo que contiene 20 g de harina de maíz, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroajuste (8% de sólidos en peso). 'El pH es ajustado a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio.
Los siguientes componentes son adicionados al amasijo: proteasa (0.60 mi de una dilución de 1000 veces de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%) . Un agujero es cortado en la tapa de la botella de 100 mi que contiene el amasijo para permitir la ventilación del C02. El amasijo luego es inoculado con levadura (1.44 ml e incubado en un baño de agua ajustado a 90° F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada a 86° F; en 48 horas es ajustada a 82 °F. La levadura para la inoculación es .propagada como es descrito en el Ejemplo 14. Las muestras son retiradas como es descrito en el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 14. Ejemplo 34 Ejemplo de fermentación de almidón bruto en semillas completas de maíz que expresan glucoamilasa de Rhizopus ¦ oryzae con adición de a-ami-lasa exógena Semillas de maíz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas hechas como es descrito en el Ejemplo 28. Las semillas' de maíz expresan una proteina que contiene un fragmento activo de la glucoamilasa de Rhizopus oryzae (Secuencia ID NO: 49) dirigida el retículo endoplásmico. Las semillas de maíz se ponen en contacto con 20 g de harina de maíz, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroajuste (8% de sólidos en peso). El pH es ajustado a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio. Los siguientes componentes son adicionados: a-amilasa de cebada adquirida de Sigma (2 mg) , proteasa (0.60 mi de una dilución de 1000 veces de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%) . Un agujero es cortado en la tapa de la botella de 100 mi que contiene la mezcla para permitir que se ventile el CO2. La mezcla luego es inoculada con levadura (1.44 mi) e incubado en un baño de agua ajustado a 90° F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada a 86UF; en 48 horas es ajustada a 82°F. La levadura para la inoculación es propagada como es descrito en el Ejemplo 14. ' Las muestras sen retiradas como es descrito en el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 14..
Ejemplo 35 Fermentación del almidón bruto en maíz que expresa glucoamilasa de Rhizopus oryzae y aiailasa de Zea mays Semillas de maíz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas hechas como es descrito en el Ejemplo 28. Las semillas de maíz expresan una proteína que contiene un fragmento activo de la glucoamilasa de Rhizopus oryzae (Secuencia ID NO: 9) dirigida al retículo endoplásmico . Las semillas también expresan la amilasa de maíz con el dominio de enlace de almidón bruto como es descrito en el Ejemplo 28. Las semillas de maíz son molidas a una harina como es descrito en el Ejemplo 14. Luego se prepara- un amasijo que contiene 20 g de harina de maíz, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroa uste (8% de sólidos en peso). El pH es ajustado a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio. Los siguientes componentes se adicionan al amasijo: proteasa (0.60 mi de una dilución de 1000 veces de una proteasa comercialmente disponible) , 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%.) . Un agujero es cortado en la tapa de la botella de 100 mi que contiene el amasijo para permitir que se ventile el C02- El amasi o luego es inoculado con levadura (1.44 mi) e incubado en un baño de agua ajustado a 90° F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada a 86°F; en 48 horas es ajustada a' 82 °F. La levadura para la inoculación es propagada como es descrito en el Ejemplo 14. Las muestras son retiradas como es descrito en el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 14. Ejemplo 36 Ejemplo de fermentación de almidón bruto en maiz que expresa glucoamilasa de Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum Semillas de maiz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas hechas como es descrito en el Ejemplo 28. Las semillas de maíz expresan una proteína que contiene un fragmento activo de la glucoamilasa de Thermoánaerobacter thermosaccharolyticum (Secuencia ID NO: 7) dirigida el retículo endoplásmico . Las semillas de maíz son' molidas a una harina como es descrito en el Ejemplo 15. Luego se prepara un- amasijo que contiene 20 g de harina de maíz, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroajuste (8? de sólidos en peso). El pH es ajustado a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio. Los siguientes componentes son adicionados al amasijo: proteasa (0.60 mi de una dilución de 1000 veces de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%) . Un agujero es cortado en la tapa de la botella de 100 mi que contiene el amasijo para permitir que se ventile el C02- El amasijo luego es inoculado con levadura (1,44 mi) e incubado en un baño de agua ajustado a 90°F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada a 86°F; en 43 horas es ajustado a 82 °F. La levadura para la inoculación es propagada como es' descrito en el Ejemplo 14. Las muestras son retiradas como es descrito en el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 14. Ejemplo 37 Ejemplo de fermentación del almidón bruto en maiz que expresa glucoamilasa de Aspergillus nigex Semillas de maiz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas hechas como es descrito en el Ejemplo 28. Las semillas de maiz expresan una proteina que contiene un fragmento activo de la glucoamilasa de Aspergillus niger (Fiil, N:P: "Glucoamylases Gl y G2 de Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs" EMBO J. 3(5), 1097-1102 (1984), Acceso número P04064). El ácido nucleico optimizado de maiz que codifica amilasa tiene la SEQ ID NO: 59 y es dirigido el retículo endoplásmico . Las semillas de maíz son molidas en una harina como es descrito en el Ejemplo 14. Luego se prepara un amasijo que contiene 20 g de harina de 'maiz, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroajuste (8% de sólidos en peso). El pH es ajustado a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio. Los siguientes componentes son adicionados al amasijo: proteasa (0.60 mi de una dilución de .1000 veces de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%) . Un agujero es cortado en la tapa de la botella de 100 mi que contiene el amasijo para permitir que se ventile el CO2. El amasijo luego es inoculado con levadura (1.44 mi) e incubado en un baño de agua ajustado a 90°F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada 86°F; en 48 horas es ajustado a 82°F. La levadura para la inoculación es propagada COÜIO es descrito en el Ejemplo 14. Las muestras son retiradas como es descrito en- el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 14". Ejemplo 39 Ejemplo de fermentación de almidón bruto en maiz que expresa glucoamilasa de Aspergillus niger y amilasa de Zea mays Semillas de maíz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas como es descrito en el Ejemplo 28. Las semillas de maiz expresan una proteina que contiene un fragmento activo de la glucoamilasa de Aspergillus niger (Fiil, N:P: "Glucoamylases Gl y G2 from spergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs" EMBO J. 3(5), 1097-1102 (1984): Acceso número P04064 (SED ID NO: 59, ácido nucleico optimizado de maíz) y es dirigido al retículo endoplásmico . Las semillas también expresan la amilasa de maíz con el dominio de almidón bruto como es descrito en el ejemplo 28. Las semillas de maiz son molidas a una harina como es descrito en el Ejemplo 14. Luego se prepara un amasijo que contiene 20 g de harina de maiz, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroajuste (8% de sólidos en peso) . El pH es ajustado a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio. Los siguientes componentes son adicionados al amasijo: proteasa (0.60 mi de una dilución de 1000 veces de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%) . Un agu ero es cortado en la tapa de la botella de 100 mi' que contiene el amasijo para permitir que se ventile el C02. El amasijo luego es inoculado con levadura (1.44 mi) e incubado en un baño de agua ajustado a 90° F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada a 86°F; en 48 horas es ajustada a 82°F. La levadura para la inoculación es propagada como es, descrito en el Ejemplo 14.
Las muestras son retiradas como es descrito en el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 14. Ejemplo 39 Ejemplo de fermentación de almidón bruto en maiz que expresa glucoamilasa de Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum y arailasa de cebada Semillas de maiz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas hechas como es descrito en el Ejemplo 28. Las semillas de maiz expresan una proteina que contiene un. fragmento activo de la glucoamilasa de Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum (Secuencia ID NO: 7) dirigida el retículo endoplásmico . Las semillas también expresan el gen amyl de amilasa de cebada pl (Rogers, J.C. and Milliman, C. "Isolation and sequence analysis of a barley alpha-amilase cDNA clone" J. Biol. Chem. 258(13), 8169-8174 (1983) modificada para la expresión de la proteína al retículo endoplásmico . ¦ Las semillas de maíz son molidas a una harina como es descrito en el Ejemplo 14. Luego se prepara un amasijo que contiene '20 g de harina de maíz, 23· ral de agua desionizada, 6.0 mi de retroajuste (8¾ de sólidos en peso). -El pK es ajustado a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio. Los siguientes componentes son adicionados al amasijo: proteasa (0.60 mi de una dilución de 1000 veces de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%) . Un agujero es cortado en la tapa de la botella de 100 mi que contiene el amasijo para permitir que se ventile el CO2. El amasijo luego es inoculado con levadura (1.44 mi) e incubado en un baño de agua ajustado a 90° F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada a 86° F; en 48 horas es ajustada a 82° F. La levadura para la inoculación es propagada como es descrito en el Ejemplo 14. Las muestras son retiradas como es. descrito en el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 14. Ejemplo 40 Ejemplo de fermentación de almidón bruto en semillas completas de maíz que expresan glucoamilasa de Thermoanaerohacter thermosaccharolyticum y amilasa de cebada Semillas de maiz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas hechas como es descrito en el Ejemplo 28. Las semillas de maiz expresan una proteina que contiene un fragmento activo de la glucoamilasa de Thermoanaerohacter thermosaccharolyticum (Secuencia ID NO: 7) dirigida el retículo endoplásmico . Las semillas también expresan el gen amyl de amilasa de cebada de bajo pl (Rogers, J.C. and Milliman, C. "Isolation and sequence analysis of a berley alpha-amylase cDNA clone" -J. Biol. Chem. 258 (13.), 8169-8174 (1983) modificado para la expresión de la proteina al retículo endoplásmico . Las semillas de maíz se ponen en contacto con 20 g de harina de maíz, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroajuste (8% de sólidos en peso). El pH es ajustado a 6.0 mediante la adición de hidróxido de amonio. Los siguientes componentes son adicionados a la mezcla: proteasa (0.60 mi de una- dilución de 1000 veces de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor de Urea al 50%) . Un agujero es cortado . en la tapa de la botella de 100 mi que contiene 'el amasijo para permitir que se ventile el COg. La mezcla luego es inoculada con levadura (1.44 mi) e incubada en un baño de agua ajustado a 90° F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada a 86°F; en 48 horas es ajustada a 82 °F. La levadura para la inoculación es propagada como es descrito en el Ejemplo 14. Las muestras son retiradas como es descrito en el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 14. Ejemplo 41 Ejemplo de fermentación de almidón bruto en maíz que expresa una fusión de alfa-amilasa y glucoamilasa Semillas de maiz transgénico son cosechadas de plantas transgénicas hechas como es descrito en el Ejemplo 28, Las . semillas de maiz expresan un polinucleótido optimizado de maiz tal como es proporcionado en la SEQ ID NO: 46, que codifica una fusión de alfa-amilasa y glucoamilasa, tal como es proporcionado en la SEQ ID NO: 5, que es dirigida al retículo endoplásmico . Las semillas de maíz son molidas a una harina como es descrito en el Ejemplo 14. Luego se prepara un amasijo que contiene 20 g de harina de maíz, 23 mi de agua desionizada, 6.0 mi de retroa uste (8% de sólidos en peso). El pH es ajustado a 6.0· mediante la adición de hidróxido de amonio. Los siguientes componentes son adicionados al amasijo: proteasa (0.60 mi de una dilución de 1000 veces de una proteasa comercialmente disponible), 0.2 mg de Lactócido y urea (0.85 mi de una dilución de 10 veces de Licor - de Urea al 50%) . Un agujero es cortado en la tapa de la botella de 100 mi que contiene el amasijo para permitir que se ventile el CO2. El amasijo luego es inoculado con levadura (1.44 mi) e incubado en un baño de agua ajustado a 90° F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura es bajada a 86°F en 48 horas es ajustada a 82 °F. La levadura para la inoculación es propagada como es descrito en el Ejemplo 14.
Las muestras son retiradas como es descrito en el Ejemplo 14 y luego analizadas por los métodos descritos en el Ejemplo 4. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes son incorporadas en la presente por referencia. Mientras que en la especificación anterior esta invención se ha descrito con relación a ciertas modalidades preferidas de la misma, y muchos detalles se han expuesto para propósitos de ilustración, será evidente para aquellos expertos en la técnica que la invención es susceptible a modalidades adicionales y que algunos de. los detalles descritos en la presente pueden ser variados considerablemente sin apartarse de los principios básicos de la invención.
Secuencia de aminoácidos de a-amilasa 797GL3 (SEQ ID NO:l) MAXYIJ3-J33GGVIMQAFYWDW GYDPYDYFDLGEYYQKGTVETRFGSKQEI-INMIOTAHAYGI VI^ VGDYTWTDFS VASG YTA YII)FHPNEIJBAGDSGTFGGY?DICHD YAAYIJtSIGIDAWRFDYVKGYGAWVV DWLJW AKWDFPLYYKMDAAFDN PALVEALKN^ Lrrai^GSSICVGRWVTVP FAGAClHEYTGM SGWTO YGYSVWSYCGVG Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maiz de a-amilasa 797GL3 (SEQ ID NO: 2) ATGGCGAACTACCTGGAGCTGGAGGAGGGCGGCGTGATCATG^ CGTCCCGAGCGGAGGCATCTGGTGGGACACCATCCGCCAGAAGATCCCCGAGTGGTACG ACGCCGGCATCTCCGCGATCTGGATACCGCCAGCTTCCAAGGGCATGTCCGGGGGCTACT - CGATGGGCTACGACCCGTACGACTACTTCGACCTCGGCGAGTACTACCAGAAGGGCACG GTGGAGACGCGCTTCGGGTCCAAGCAGGAGCRCATCAACATGATCAACACGGCGCACGC CTACGGCATCAAGGTCATCGCGGACATCGTGATCAACCACAGGGCCGGCGGCGACCTGG AGTGGAACCCGTTCGTCGGCGACTACACCTGGACGGACTTCTCCAAGGTCGCCTCCGGCA AGTACACCGCCAACTACCTCGACTTCCACCCCAACGAGCTGCACGCXKK5CGACT^ ACGTTCGGCGGCTACCCGGACATC GCCACGACAACTCCTGGGACCAGTACTGGCTCTGG GOCIXX3CAGGAGTCCTACGCGGCCTACC ^ GACTACGTC^*GG KJTACC ;GGCCTGGG CTGGGCGGTGGGCGAGTACTGGGACACCAACG CGACGCGCTG RCAACTGGGCCTACT CCTCCGGCGCCAAGGTGTTCGACT CCCCCTGTACTACAAGATGGACGCGGCCTTCGACA ACAAGAACATCCCGGCGCTCGTCGAGGCCCTGAAGAACGGCGGCACGGTGGTXRIXXCGC GACCCGTTCAAGGCCGTGACCTTCGTCGCCAACCACGACACGGACATCATCRGGAACAA GTACCCGGCGTACGCCTTCATCCTCACC ACCV\GGGCC -CGCCACGATCTTCTACCGCGA CTACGAGGAGTGGCTG AAC AAGG AC AA GCTC AA G AA C CTG ATCTGG ATTCACGAC AACC TCGCGGGCGGCTCGACTAGTATCGTG ACTACGACTCCGACGAGATGATCTTCGTCCGCA ACGGCTACGGCTGCAAGCCCGGCCTGATCACGTACATCAACCIGGGCTCCT^ GCCGCTGGGTGTACGTCCCGAAGTTCGCCGGCGCGTGG TCCACGAGTACACCGGCAAC CTCGGCGGC GGGTGGACAAGTACGTGTACTCCTCCGGCTGGGTC ACCTGGAGGCCCCG GCCTACGACCCCGCCAACGGCCAGTACGGCTACTCCGTGTGGTCCTACTGCGGCGTCGGC Secuencia de aminoácidos de pululanasa 6qp3 (SEQ ID NO: 3) MGHWYKHQRAYQOTGEDDFGKVAV^ AEVWILQGVEHFYEKPDTS^^ EKADPTDlDV NYV TVLSESlJCBEDLJUiDVELIIEGYKPA^ I'E. riFRWSFVSKWVKVIXFKNG^ BT G I TVDPYSKAVYA NQESAVVNI^Tl^ LE SGVKl^ffiGLYLGLTEENTKGPGGVTTG Y WGYDPYLF VPEG YSTDP OTHTRIRBVKE^ AFDQT^FYYFY IDKTGAYIJ^ESGCGJW Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maíz de pululanasa 6gp3 (SEQ ID NO: ) ATGGGCCACTGGTACAAGC-ACCAGCGCGCCTA(- .GTrCAC8 GAAGGTGGCCGTGGTGAAGCTCCX TATGGACCrCACCAAGGTGGGCATC^ TCAACGAGTGGCAGGCGAAGGACGTCGCCAAGGACCCKTT CA CGAGATC A A GGCCG AGGTGTGGATACTCCAG GGC GTGGAGGAGATC TCTACGAGAAGCCGGACAC CTCCCCGCGCATCTTCTTCGCCCAQGCCCGCTCCAACAAGXJTXJA C^ CAACCCGGTGGACACCAAGAAGAAGGAGC GTTCAAGGTGA<XGTCGACGGCAAGGAG ATCCCGGTCTCCCGCG GGAGAAGGCCGACCCGACCGACATCGACOTGAC VACTACG GCGCATOSTGCTCTCCXAGT^^ TCATCGAGGGCTACAAGCCGCK:CCGCGTGATCATGATGGAGATCCTO3ACGACTAC ACT . ACGACGGCGAGCTOGGGGCGGTGTACTOXCGGAGAAGACCATCTI^^ CCAGGTGGIOAACATGGAGTACAAGGGCAACGGCCT GACCTCGACGGCGTG ICTACXN'C ACCAGC GGAGAACT GTGGACCCGTACTCCAAGGCCGTGTACGCCAACAACCAGGAGTCTG^ CGCCCGCACCAACCCGGAGGGCTGGGAGAACGACCGCGGCCCGAAGATCGAGXKKTTAC GAGGACGO^TXL«CTACC-AGATCCACATCG XX½ CGTGAAGAACAAGGGCCTC ACCTCGGCCTCACCGAGGAGAACACCAAGGCCCCGGGCG GCGTGACCACCGC XTCTCCCACCTCGTC CGTIXTTTCGAC RCTACACCGGCGACGAGCTGGACAAGGACTRCGAGAAGTACTACAACT GGGGCTACGACCCGTACCTUI CATGGTGCCGGAGGGCCGCRAC CCACCGAC^ AACCCGCACACCCGAATTCGCGAGGTGAAGGAGATGGTGAAGGCCC CCACAAGCACGG CTTCGACCAGA X3JTGCC0TACTA I CTACCGCATC CGAGTCCGGCTGCGGC^CGTGATC^ GGACACCGTGACCTAC GGGTGAAGGAGTACCAC^TCGACGGCTItXG^ TGGGCCTCATCGACAAGAAGACCATGCT^ CCGACCATCATCeKJTAOGGCGAG^^ CAACTCCGACGTGGCCGGCACXXACGTGGCCGCCT TCCGCGGCTCCGTGTTCAACCCGTCCGTGAAGG<XnT^ AGACCAAGATCAAGCGCOGCGTGGTGGGCTCTA^ Tarrro-eccrcGACCc iGA CTCTGGGACAAGAACTAOTXXKXGCCAAGGCCXJACAAGAAGAA AGGAGCIXJAAGAACGCCCAGAAGCTCGCCGGCGCCAT^^ CCGITCCTCCACGGCGGCCAGGACTTCTC^ AACGCCCCGATC CCATCAACGGCTTCGACTACGAGC^ TTCAACTACCACAAGGGCCTCATCAAGCTC8 AACCXXXSAGOAGATCAACAAGCACeTG^ CTTCATGCTGA^GGACCACGCCGGC^^ . ACGGCAACCTGGAGAAGACCACCTACAAGCTC^ AACTCCCAGAAGGCCGGCACiXL^GGTGATCGAGAC^ CCCXK- CTCCGCCTACGTGCTC^ Secuencia de aminoácidos de -glucosidasa malA de S lfolobus solfa tarí cus (SEQ ID NO: 5) METIKIYE^GVYKVVIGEPFM LGEKAFELDRHR RYVMY VDAGAYI KYQDPLW GLEEYDKVIVTIEEDSVEFYVlECfflUEDVLE YTEL GCT YVHATOMQKEGFRVAGVT-LDIH^^ RVDQ YSPFl^MGKKSESGH-FVG MWPGTIVYPDFFREIXrR GIWIJDhlNEPTOFSRA^ YEAMAI1¾GFRTSHRNEIF1I^RAGYAGIQRYAFIWTGDNTPSTO FVGCDIGGPQGROTAELDl^SMDIJLy KYYAI LFFPFYRS HKATDGIDTEF VFLP YYKE VK EIVELRY FLFYIYSl-AI^ÍASEKGH^ n'SSSNEI FSRErYVS LTITCEÍKPVSKIIVODSM Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maiz de g-glucosidasa malA de Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO: 6) ATGGAOACCAT AAGATCTACGAGAACAAG GGCG GTACAAGG1T3G GATCX XX5AGCC GTrCCCaXGAT X^GTTCCCGCTC^ GCTG GG(X CA.CCATCGTGC AGC AG GGC AAC AAGGTO ATCGTG GAGAAGTCCCTCGA CC TCAAGGAC^ACATCA CGGCCTCGGCGAGAAGGCCTTXXSAGCT CGCTA<_GTGATGTACAACGTGGACXKX QjTGTCCATCX!CGCT nCATCTCCG CTCCGCCTXrAAGGTGATCrTCGAOT CCATCCCGGAGGACTCCGTGGAGTTCTACGTGATCGAGGGCCCGOaCATCGA CTCGAGAAGTACACCGAGCTGACCGG<^GCCGTrcCTCCCGCCGATC TACATCA Crcca3CTACTCC ACT^ ATGCAGAAGGAGGGCirO^GTGGCCG^ TACAAGCTCTIGACCTGGCACCCGTACCGCT CCCGGAGCCGAAGAAGCTCA CTGCACAAGCGCAACGTGAAGCTCATCACCATCGTGGACCACGGCA CCGCXT^ GAACTACm nTCCTCTCro GTTCGTGGGCAAGATGTGGCCGGGCACCACCG GTACCCGGA CCCGCGAGTGG GGGCCGGCC CATC CCGAGTGGCTC rCCCA GGCTCGACATCAACGAGCCGACEGACTICT^ CCTCCCTCCCGGTGCAGTTCCGCGACX3ACir^ : TGCACTACCTCCGGCGCA^ TACGAGG8ATG jCCAGCTTCAAGGGCTTCCGCACCTCCCACCGCAACG CTCTCCCGa3CeGGCTACGCC8 ACCCCGTCCTGGGACGACCTCAAG rcCAGCTCCAGCrcGTGCrCGGCCT^ , GGCGTGCCGTTCGTGCGCTC^GACATCGGCGGCTrC^ GACAACTCGA GGACCTCCIXXnXjAAGTACTAC rcC TCGCC > GUI XX-!ACAAGGCCACCGACGGCATCGACACCGAGC^ AAGGAGAAGGTGAAGGAGATOmjGAGCTGCGCTAC^ CCTCGCCCTCGAGGOnXX!GAGAAGGC CCAGGACGA(^CGAC^TGTACCGCATCGAGGACGAGTACATGGTGGGCAAGTACC^ TCTACGCCCCG ATCG GTCCAAGGAGGA GTCCCGCCTCGTC ACCXTTCOIOCGCGGCAAGT GGTACAACTAC GGAACGGCGAGATCATCAACGGCAAGTCCGTGGTGAAGTCCACCCAC OAGCIGCCGATCTACCTCCGCX3AGGG nXATCATCCCGCTC GTGTACGGCGAGAC rcCl CA¾.GCGCTACGACAACGCCX AGATCAC rc GAGATCAAGTTCTCCCGCGAGATCTACGTGTCCAAGCTC GTXTTCCAAGATCATCXJTGGACGACTCC CACCTACXnXKKXIAAGATOLAGCAGAAGATCCGC Secuencia de cDNA de axy ;SSQ ID N0: 7 ) ATGGCGGC C GGCGAC jTCGCAGCTCCrrCGCAACGCGCGCCGGCCTGGGCGTCCCGGA CGCGTCCACGTTCCGCCGCGGCGCCCCGCAG COGCGGACACGCTCAGCATGC8^ CAGGCGCGCCX¾!GGGGCCAGGTrCCCGTCGCTCGTCGTGTGCGCC^ CGTCGTCTITOTCGGCGCCGAGATGGCGCCGTGGAGCAAGACCGGAGGCCTCGG^ TCCTC KJCGGC€TGCX:GCCGGCCATGGCCGCGAACGGG^ CCCGCTACGACCAGTACAAGGACGCCTGGGACACCAGCGTCGTGTCCGAGATCAAGATG GGAGACGGGTACGAGACGG CAGGTrC rCCACTGCTACAAGCGCGGAG GGAC G TCGTrGACCACCCACTGTTCCIGGAGAGGGTnGGGGAAAGACC ACGGGCCTGTCGCTGGAACGGACTACAGGGACAACCAGCTG X n CAGCClGCrATGC CAGG AGCACT GAAGCTCCAAGGATCCTGAGCCTCAACAACAA^ ACCATACGGGGAGGACGTtXjTXn CGTCTGCAACGACTGGCACA CTACCTCAAGAGCAACTACCAGTCCCACGGCATCTAGAGGGACGCAAAGACCGCTITCT GCATCCAGAACATCTCCTACCAGGGCCGGT CGCCI CTCCG TCCXXXMGAGAI CAAGTCGTCCTTCGATT CATCGACGG GCCGGAAGATCAACTGGATGAAGGCCGGGATCCTCGAGGCCGACAG AGCCCCTACTACXjCCGAGGAGCTCATCTCCGGCATCGCCAGGGGCI ^ CATCATCCXKCTTACCGGCATCAC^ ACCCGAGCAGGGACAAGTACATCGCCGTGAAGTACGACGTG CGACGGCCG GGAGGCC · AAGGCGC GAACAAGGAGGCGCTGCAG GCGG AGG TCGGGCIXX GGTGGACCGGAACA TCCX 3CTCGTGGCGTTGATCGGCAGGCTGGAAGAGCAGAAGGGCCO GCCGCCATCCCGCAGCTCATGGAGATGGTGGAGGACGTGCAGAlXX- rCTGCTGGGCAC . GGGCAAGAAGAAGTTCGAGCGCATGGTCATGAGCGCCGAGGAGAAGTTCCCAGGCAAG GTGCGCGCCGTGGTCAAGTTCAACGCGGCGCTGGCCCACCAC^ . CGTGCTCGCCGTCACCAGCCGCTTCGAGCCCI^ ATACGOAACGCCCTGCGCCTOCGCGTCCACCGGTGGACIGCT^ GG^AGACCGGGTTCCACAIGGGCCGCCTCAGCGTCGACIGCAACGTCGTGG GACG CAAGAAGGTGGCCACCACCTTGCAG XjCGCCATi.^ GTACGAGGAGATGGTGAGGAACTGCATGATCGAG ATCICrCCTGGAAGG^ AGAACTGGGAGAACGTGCTGCTCACKIXnGGGGGTCGCCGGCGG GGCGAGGAGATCGCGCCGCTCGCCAAG AG AACG GGCCG CGCCC Secuencia de aminoácido s de waxy ( SEQ ID NO : 8 ) MAAIATSQLVATRAGLGVPDASTFRRGAAQGlJlGAEASAAAini^ AR GAREPSL V VCAS AGMNWFVG AE. A P WS KXGGLGD VLC JIJPPAMAANGHRVMYVSP RYDQYKDAWDTSWSEI MGDGYETYRFT-¾'CY RGVDRVFVDHPI.F1JERWO TEE IYG PVAGTDYRDNQU FSI-IX-QAAI^^ AGIIJ-ADRVLTVSPYYABEIJSGIARGCEI^ DVSTAVEAKAI-NTa3ALQA QGJ^YGTPCACASTGGLVDTIIEGKTGFH GRLSVI^ PA YEEMVRNCMIQDLS WKGPAKNWENVLLSIJ3VAGGEIHjV Secuencia de ácidos nucleicos de 797GL3/Waxy (SEQ ID NO: 9 ) ATGGíXIAAGTACCTGGAGCTGGAGGAGGGCGGCGTC OjTCCCGAGCGGAGGCATCTGGTGGGACACCATCCGCCAGAAGATCCCCGAGTGGTACG ACXKXXKK^TCTCCGCGATCTGGATACCGCCAGC rCCAAGGGCATG^ CGATGGGCTACGACCCG ACGACTAC rCGACCTCGGCGAGTACTACCAGAAGGGCACG GTGGAGACGCGCTTCGGGTCCAAGCAGGAGCTGATC^CATGATX AACACGGCGCACGC CTACGGCATCAA K3TCATCGCGGACATCGTGATC.¾ACCACA XKX AGTGGAACCCGT CGTCGGCGACTACACCTGGACXJGACITCTCCAAGGTCGCC^CG^ AGTACACCGCCAACTACCTCGACTTCCACCCCAACGAGCTG^ ACGTTCGGCGGCTACCÜJGACATCTGCCACGACLAAGTC GCCTCGC AGGAGTCCTACGCGGCCTACC TG CGCTCCATCGGCATCGACGCGTGGCGCTTC GACTACXJTCAAGGGCTACGGGGCCTGGGTGGTCAAGGACT CTCGGCGGTGGGCGAGrACTGGGACACCAACGTCGACX3CG^ .
CCTCCGGCGCCAAGGTGTTCGACITCCCCCTGTACTACAAGAT^ Á(^GAACATCXXXJGCGC CGTCGAGGCCCTGAAGAA8 GACCCG TCAAGGCKGTGACCTRCGTCGCCAACCACGACACGGACA GTACCCGGCGTACTICCTTCATCCTCACCRACGAGGGCCAGCC^ CTACGAGGAGTGGC GAACAAGGACAAGCRCA^GAAC RGATCTGGATIGACGACAACC TCGG K:-&:GGCTCCACTAC ATCGTCTACTA ACGGCTACGGCTCCAAGCCCGGCCTGATCACGTACATCAACC GGGCRCCTCCAAGGTGG GCCGCTGGGTGTACGTCCCGAAGTTCGCCGGCGCGTGCATCCACGAGTACACCGGCAAC CTCGGCGGCTGGGTGGAGAAGTACGTGTAC RCCTCCGG RGGG CTACCRGGAGGC^ GCCTACGACCCC XAACGGCCAG ACGGCTACTCCGTGTGGTCCTACTGCGGCGTCGGC ACATCGATIGCTGGCATCCIGGAGGCCGACAGGGTCCTCACCG CAGCXXCTACTACGCC GAGGAGCTCATCTCCGGCATCGCCAGGGGC GCGAGCTCGACAACATCATGCGCCRCAC CGGCATGACCGGCATCG CAACGCCATGGACGTCAGCGAGTGGGACCCCAGCAGGGACA AGTACATCGCCGTGAAGTACGACGTGTCGACGGCCGTGGAGGCCAAGGCGCTGAACAAG GAGGCXJCTGCAGGCGGAGG CGGGCTCCCGGTGGACCGGAACATCCCGCTGGTGGCGTT CATCGGCAGG TOGAAGAGCAGAAGGGCCCXI!GACG CATGGCGGCCGCCATCCCC ½GC TCATGGAGATGGTGGAGGACGTGCAGATCGTTCTGCTGGGCACGGGC AGAAGAAGTTC GAGCGCATGCT ^TGAGCGCCGAGGAGAAGTTCCCAGGCAAGGTGCGCGC XJTGGT ^A GTTCAACCK_G<3CGCTG<- -<KIAC GCCTCCGCGTCCACCGGTGGACTCGTCGACACC TC^ CATGGGCCGCCTCAGCGTCGACTGCAAC^ CCACCACCTrGrAGCGCGCCATCAAGGTGGTCGGCACGCCGGO-rTACGAGGAGATGGTG AGGAACTGCATGATCCAGGATCTC rC TGGAAGC jCCCT GCTGCTCAGCCTCGOGGTCG GGCGGCGAGC^ CGCTCGCCAAGGAGAACGTGGCCGCGCCC Secuencia de aminoácidos de 797GL3/ axy (SEQ ID NO: 10) MA YLEH-EGGV1MQAFYWD GYDPYDYFD jEYYQKG /BII^S QELlNMINTAHAYGi YiAD VGDYTWTDFS £VASGK^TAíTyiJ?FHENELI IAG DSGTFGG YPD [Cf IDKS DQYWLWASQES YÁAYlJ«IGroAWW^Y\TKGYGAWVVKDWIJsiWW AKVH)FPLYYKMDAAFDNKJ\TM AFILTYEGQPTIFYRDYEEV^N^ UTYI>D-{^KVGRWVYVPKFAGAC^^ -YGYSVWSYCGVGTSIAGILRADRVLTVSPYYAEBLISGIA^ S£WDPSRDKYIAV TyDVSTAVE_A ^^ AAA3^IAIEMVEDVQIVli^TGK KFER-^ . VLAVTSRFEPCGUQI-O^SM YGTPCÁCA^TGGLVrmE . ^ATTLQik^IKWGTPAYEE VTW -PLAKENVAAP Secuencia de ácidos nucleicos del promotor .ADP-gpp de Zea mays (SEQ ID NO: 11) GGAGAGCTATGAGACCTA GTCCTCAAAGCCACT CTrrGTTACTTCATCA GCATGAACATn -TC CAGCTCAGAAAAAAGTTATCTATGAAAGGTTTCATGT · TrGCCAACTCAAACACCTrCAATATGTTCr^ CTAAAACTATGAACGGGTrACAGAAAGGTAT^ TCATCnATAGATGTC GTTGAGGGGAAAGCCG CTTCAACACACAG TGTCTGC rTATGATGGCATCTa:A AAACATGCATAGGCATATCLAATATGCTC^ TCTlTACTrTATTrATK3TrTGAAAAATATGTCCTG CAATGCATCTITLATTAAATGTGAATrTCAGAA^ TCAAAA TAATTAGCGGCI CTATTATG TATAG AAAGGCCA^ ACTAATGATGGTTCK>T 3CATGAG CTG TCTGTGCGTGGGCATAAAACAAACAGCTTC^^ GAAATGTGAACrCCrmCATTrOXrrATGTGGACATAATGCCAA^ CATGGTrGTTOATGTCTTrACAC^^ TAAACAC^TCAACAGCATCGCAATTAG^ TGTTAGTTTAATI GTAATTGGGAAGTATrAGTGGAAAeAGGATGAGATGCT TGTACTCTGC^AATGGATCTOACGTTATAT^ TCT GCCGACAATATATTGCAAGG ATATGCCTAGTTCC^ TCTAAAAGCATTTrAGTGGCACACA^ TrACTrTGCTTCAG TKK ATTCTTCATA GTCX¾ TCGTCATAAGATGTCATATTAAAGGGCAA^ GTTCXCrrrTTGTAAAAGATTXH^ GGAGGAG Secuencia de ácidos nucleicos del promotor ?-zeina de Zea mays (SEQ ID NO: 12) - GATCATCCAOJTGCAA XOT ATTOGCATG AAAGCTCCAAOAATrrGTTGTATCOT AAAT GCACGTCAAGGOfTATTGGGTAAGA^ AGAAACACGGTGAGTCATGCCGAGATCATAC CATCTGATATACATGCTTAC^ AGA(^TTACAAACAACTCATATTGCATTAC CCCK3ACAGGACAAAAATXXnTGA03TGTAAA TG CAAGCTAAATCTAATTCGTTI ^^ GAGCGACGGAGAAGTACAGAATGATTCCAGATGAACCATCGACG GXJTACGTAAAGAGA GTGAOTAGTCATATACATTTGGCAAGAAACCATGAAG CATAAGAACACAAGAAATIXTKnTAATrAATCAAAGCT rGCACTTCTCCATCACX^CCACrGGGTCn^ CAGAAGAACCCGATCGACA Secuencia de aminoácidos de la fusión de amilasa pNOV6200 (SEQ ID NO: 13) mVIXVAIAI ALAAS ATSAKYT ,?G ,EEGGVIMQAFYVDVPSGGIWWDTIRQKg¾WYDAGI SAIWPPASKGMSGGYS GYDFYDYFDLGEYYQK^^ AI)IVINHRAOGOLEWWFVGDYTWTDFSKVASGí^^ CHDKSWIXJYWLWASQESYAAYLRSIOm YWDTNVDAIIJWAYSSGAKVFDFPLYY DA^ TFVAIffllJrDIIWNKYPAYAFILTYEGQPT^ Y SDEMIFVKNGYGSKPGLnY^^ SGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVG Secuencia de aminoácidos de la fusión de amilasa pNOV6201 (SEQ ID NO: 14) MRVliYALAI-lALAASATSA YI-ELEEGGV SATiVTPPAS G SGGYS GYDPYDYFDLGEYY^ ADIVMJRAGGDIJSWNPI^GD^^ CHDKS IXJYWL ASQESYAAYLRSTGIDAWRro YWDTNVDAIJ-WAYSSGAKY^ TFVANHOTOIIWNKYl'AYAFILTYEGQ^ YDSDEMIFV NGYGSKl aJrYl-^SSKVGRWVY SGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVGSEEDHL Secuencia de aminoácidos de la fusión de amilasa pNQV4029 (SEQ ID NO:15) LAALA S QLVA RAGLGVHJAOTFRRGAAQGL G ARAS AAADTLSMRTS A AAP HQHQ QAI»GAR1^WCASAGAMAKY1£LEEGGVMQAFYWDVK GISAT lFPASKGMSGGYSMGYDPYDYrc>LGEYYQKGT\^^ VIADIV1NH AGGDLEWNPFVGDYTW DFSKV DICHD SWIXíYWL ASQESYAAYLRSIGroAWRro GEYWOTNVDALIJ WAYSSGAKVFD AVTF ANHDTOII NKY^ VYYDSDEMIFVRNGYGSKrciJrYINI j YSSGWVY EAPAY PANGQYGYSVWSYCGVGTSI Secuencia de aminoácidos de la fusión de amilasa pNQV4031 (SEQ ID NO: 16) >,ÍLAAI TSQLVA'I¾AGLG VPDA3TílJiGAA(^LX G Ai^ AA^ ÍLS MRTS AKAAPRHQHQ GISATWffPASKQ SGGYSMGYDPYDYFDLGEY YQ GTVEni ¾KQEIJ MIN AHAYGK VIADIVIffi AGGDLB OTFVGDYTOTDFSKV^ DICHDKSWIXíYWLWASQESYMYU^IGmAVrT^YVKGYOAVAfV DWUWWGGWAV AVTI^ANHOTDIIW KOTA Ai^^ YYYWDEMIFVRNGYGSKPGLirYI LGSSKVGR V,-VYVPKFAGACTHEYTGNLGGVATDKYV YSSGWVYLEAPA YDPANGQY GYSV SYCG VGTS G?? II _EAD R VLTVS PYYAEELIS G3ARGC ELD? RLTG^TCIVNG DVSIJW?PSlyD YL VKYD VST A VEAKAJJflCEAjLQAJE^GlPVDR NIPLVAHGRLEEQKGFDVMAAAIP^^ AVYIQ! AAIAHHIMAGADVIJ^Vre HMGlOSVDC-m^PADVKKVATn^RA^ VLLSLGVAGGEPGVEGEEI APLAKE VAAP Secuencia de señal N-terminal de ?-zeína de maiz (SEQ ID NO: 17) (mVLLVALALLALAASATS ) Secuencia de aminoácidos de glucosa isomerasa de Thermotoga AERPWNRFSDP D AFA VPALFEFCm YFCFHDRDLAEGKTIJgG^üül·X)KV VE IK E MIOSWIOX GTA LFSHPRYMHGAATT T Airnr, prnmRFgyg t ?Gpp??.t??ppt??t?? F.V.V ???-??t?? l^ QKYTJBSLT ysYTV . KTIAEL Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maiz de glucosa isomerasa de Thermotoga maritima (SEQ ID NO: 19) ATGGCCGACn CTTCCCG¾GATCCCGAAGATCC CCCGCTCGCCTTCX:GCT CTACGA AtXACCrCAAGTTCTCCGTGCKXrrTCTGG^ TXX JCGACCCGACCGCSXÍAGCX XXXJTGGAACCC ^^ TTCGCCCCCGTGGAC^CCrCTTCGAGTrCIX GA TTCCACGACCGCGACATt-GCeCCGGAGGGC^ CGACAAGGTGGTGGAGCGCATCAAGGAGCGCATC^ GGGGCACCGCCAACCICTTCltXCACCCGCOCTACATGC^ CCGCCGACGTGTICGCCTACGCCGCCGCC^ GAGCIGGGCGGCGAGGGCTACGTGTrC^ CAACACCGAC TCGGCCTGGAGCrGGAGAACC CGCCCGCTTCCTCCGCATC GTACGCCAAGAAGATCGGCITCACCGGCCAGT 'CCT \TCGAG^ CGACCAAGCACCAGTACGACTTCGACGTGGCC^CC^ GGCCTCGAC GACn CTTCAAGTTCAACATOGAGGCCAACCACGCCAC CACGAGCTGCXX-ATCGCCCGCATXCTC^ CGACCTCCTCCTCGGCTGGGACACXGACCAGrrCCCGACCAACATCTA8 CGCC ATGTACGAGGTGATC AAGGCCGG CG GCI CACCAAGGGCGGCCTC ACTTCGACG CCAAGG GCX3CCGCGCC CCrACAAGGTGGAGGACCTC rCATCG A GGACACCTTCGCCCTCGGCTICAAGA^ GACAAGTTCATCGAGGAGAAGTACCGCTCCT CAAGGAGGGCATCG^ GGAGGGCAAGACCGACTrCGAGAAGCTGGAGGAGTACATCATCGACAAGGAGGACATC GAGGTGCCGTCXXJGCAAGCAGGAGTACCTGGAGTCCCnn^ ACCATCGCCGAGCTGCG TGA Secuencia de aminoácidos de glucosa isomerasa de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NO: 20) ívíAEFFPHPK^QFEGKESTNPLAFKFYDPEEIIDGKPl^ ADRPWNRY DPA!DKAFARVDALFEFCE IJTO KE MKDSNVKLXWGTANIJ¾HPRYMHGAAT^ F GGRTCYiniI-OTOIXíFELENL TAYAFL SHGLDBYFKmiEAl^Tl^GHXFQHELR AI^ QHn I mTLA YE l AGGFrKGG^ Y LVKDGYLDKFIEEKYI^FKEGIGRDrVEGKVDFEKIJ^ IVKTILEL Secuencia de ácidos nucl'eicos optimizada de maíz de glucosa isomerasa de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NO: 21) ATGGCCGAGTTCrrcCCGGAGATCCCGAAGGT^ CCCGCTCK CTTCAAGTTCT ACCAC CAAGTTC CCGTGGCCTTC GGCACACC RCGTGAACGAGG TCGGCC^CCCGACCGCCGACCGCCCATGGAACCOCTACACCGACCCGATCWAO^GGCC TTCGCCCGCGTGGACGCCCTCTTCGAGTRCTGCGAG TTCCACGACCGCGACATCGCCCCOGAGGGCAAGACCC^^ CGACAAGGTGGIGGAGCGCATCAAGGAGCGCATGAAGGAC GGC 3CACGGCTAACCIGTRCTCOCACCC CCGCCGACGTX3 K:GCCTACOCCGCCG X:CAGGTGAAGAAC 3C GAGCTGGGCGGCGAGGGCTACGTGTTCIGGGGCGGCCGCGAGGGCTACGA AACACCCACCTXX-GCTTCGAGCK JAGAACCT CTACGCCAAGCGCATCGGC CACCGGCCArntXrrC^ CGACCAAGCACCAGTACGACTTCGACGTGGCCACCCTCCTACG^ GCCTCGACGAGTACTTCAAGTTCAy\CATCGAGGCCAACCACG<X CCCTCGCCGGCCAC ACCTTCC^GCACGAGCTGCGCATGGCCCGCATCCTCGa AACCAG KJCGACCTCCTCCTCG CTGGGACACCGACCAGTTCCCGACCA^ CACCACCCTCGCCATGTACGAGGTGATCAAGG X^GGCGCICnX^C ACTTCGACGCEAAGGTGCGCCGCGeCTCCTACA^ TCGCCGGCATGGACACCITCGCCCTCG^ GanGCTCGACAAGTTCATC^^ GACATCXnXjGAGGGCAAGGTGGACT OjAGAAGCTGGAGGAG A AGACCATGGAGCTOCCGTCCGGCAAGCAGGAGTACCTGGAGTC ATCGTGAAGACCATCCTGGAGCTGCGCTGA SV57 (SEQ I NO:22X5'AGCGAATTCATGGCGGCTCTGGCCACGT 3*) SV58 (SEQ ?) NO; 3)(5'AGCTAAGCTTCAGGC ^GCGGCCAGGTT(-T 3') Secuencia de aminoácidos de la fusión pNOV7005 6GP3 (SEQ ID NO: 24) MRVliVALALiALAASATSAGHWYKHQR KKKEI-FKV VDGKEIPVSRVBIQUJFro^ . MMETLDDYYYDGELGAVYSPE TnFRVWSPVS WV^^ VWEAVVEGDLDGVFYLYQI-EOTG^ GPK-EGY^DAnYHHIADn 3---NSGVK GLYLGLTEEOT AP8 ILPFFDFYTGDELDKDFEIÍYY GYDPYLFMVPEGRYS GIGVIMDAlVFPIírYGiGEI^AFIXÍ nTYY VTYWVKEYHIDGFRl^MCIJ^^ GTHVAARíDEFRDAI GSVTrNPSV GFV^^ CRT NFKCDNSYNAHSI Gro^ GGÍUUVAF IJ-DHAGGDPWm HELDPLSAYVLYRESE DEL Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maiz de la fusión PNOV7005 6GP3 (SEQ ID NO: 25) ATGAGGGTGTTGCTCGTTGCXOTM GGCCACICGTACAAGCACCAGCGCGCCTACCAGTO-^CCGGCGAGGAC GGTGGCCGTGGTGAAGCTCCCGATGGACCTC^ ACGAGTGGCAG KGAAGGACGTGGCCAAGGACCGCRRCATCGAGATCAAGGACGGX^ GGCCGAGGTGTGGATACTCCAGGGCGTGGAGGAGATCT CTACGAGAAG( GGACACCT CCCCGCGCAI TCTTCGCCCAGGCCCGCTCCAACAAGGT^ ACCCGGTGGACACX:AAGAAGAAGGAGCTGTTCAAGG GACCGTCGACGGCAAGGAGAT CCCGGTG CCCGCGTGGAGAAGGCCGACCCGACCGACA CGACG GACCAACTACGTGC GCATCGTGCTCTCCGAG CCCTCAAGGAG G A GGACCTCCGCAAGGACGTGG AGCTGATC ATCGAGGGCTACAAGCCGGCCCGCGTGATCATGATGGAGATCCTC CGACGGCGAGCTGGGGGCGGTGTACTCCCCGGAGAAGACCAlXriTCCGCGTGTGGTCCC - CGGTGTCCAAGTGGGTGAAGG GCTCC CTTCAAGAACGGCGAGGACACCGAGCCGTAC CAGGTGGTGAACATGGAGTACAAGGGCAACGGCGTGTGGGAGGCCGTGGTGGAGGGCG ACCTCGACGGCGTGTTCTACCTCrACCAGCTGGAGAACTACGGCAAGATCCGCACCACCG TGGACCCGTACTCCAAGGCCGTGTACGCCAACAACCAGGAGTCTGCAGTGGTGAACCTC GCCCGCACCAACCCGGAGGGCTGGGAGAACGACCGCGGCCCGAAGATCGAGGGCTACG AGGA X3C£ATCATCTACGAGATCCACATCGCCGAC^^ GTGAAGAACAA.GGGCCTCTACCTCGGCCTCACCGAGGAGAACACCAAGGCCCX^^ CGTGACCACCGGCCTCTCCCACCTCGTGGAG TGGGCGTXJACCCACGTGCACATCCTCCC GTTCTRCGAC TCTACACCGGCGACGAGCTGGACAAGGACTTCGAGAAGTACRACAACT GGACTACGACCCGTACCTCTTCATGGTGCCGGAGGGCCGCTACTCCACCGA RCGAAGA ACCCGCACACCX GAATTCGCGAGGTGAAGGAGATGGTCAAGG XX KXI¾CAAGCACGGC ATCGGCGTGATC½TGGACATOGTGTRCCCC ^CACCTACGGCATCCGCGAGCTGTCCGCC TTCGACCAGACCGTGCCGrACTACTn_rrAa_¾^ GAGTCGGGCTCK^GCAACGTGATCGCCTCCGAGCGCCCGATOATGCGCAAGTTCATC GGACACCGTGACOTACTGGGTGAAGGAGTACCAC^TCGACGGCTTCCGCTTCGACQ^GA TGGGCCTCATCGACAAGAAGACCATGCTGGAGGTGGAGCGCGCCCTCCACAAGATCGAC CCOACCATCATXXJICTACGGCGAGrc^^ CAAGTCCGACGTGGCCGGCACCCACGTGGCCGCCTrCAACGACGAGTTCCGCGACGCCA AGACGAAGATCAAGCGCGGCGTGGTGGGCTCCAT IAACT TCCTTCGCCCTCGACCCGGAGGAGACCATCAACTACGCCGCCTGCCACGACAACCACACC CTCTGGGACAAGAACTACCTCGCCGCC AAGGCCGACAAGAAGAAGGAGTGGACCGAGGAGGAGCTGAAGAACGCCCAGAAGCrCG CCGGCGCCAIX TCCTCACTAGTCAGCK^ GCCGCACCACCAACTTCAACGACAACTCCTACAACGCCC^ ACTACGAGCGCAAGCTCX^GTTCATCGACGTCTTCAACrACCACAAGGGC TCCGCAAGGAG ACCCGGCCT CCGCC CAAGAACGCCGAGGAGATGAAGAAGCACCTG GAGTTCCTCCCGGGCGGGCGCCGCATCGTGGO nTCATGC CA GGACCACGCCGGCGG CGACCCGTmAAGGACATCGTGGTGATCTACAACGGCAACCTGGAGAAGACCACCTACA AGCTCCX^AGGGCAAGTCGAACGTGGTGGTGAACTCCCAGAAGGCCGGCA ATCGAGACCGTGGAGGGCACCATCGAGCTGGACCCGCTCT^ GAGTCCGAGAAGGACGAGCTGTGA Secuencia de aminoácidos de la fusión pMOV4831 malA (SEQ ID NO : 26 ) MRVLLVAI^IXAI^ASATSMETIK^ QQGN VTVEKSLDLKEHIIGLGE AFELDRKMIRYV ryWTO 10 ATQrFF$SASKVWDV<n£EYUKVV nPEOS VEFY\TEGPRIEDVLEKYTELTGKP LEP WAFGYMERYSYYFQDKVVELVPIMQ mDELHKNVKlJnVDHGIRVDQNYSPFI^G a I^ DT EWWAGLISEWLSG^VIX}IWIJ3 ^ HYUtGlOiVKHE-VIWAm WDDLHUJUJLVLGaLSISGVPFVGOT TpCBDII-i^H-PDYYKBKVKE EDEYMVGKYllYAHVSKEESRLV^ U¾3t>ELrVYGET¾FKR D AJ^^ NTYVAiONQiaRG I LESEKDEL Secuencia de aminoácidos de la fusión pNOV4839 malA (SEQ ID NO: 27) MRVII^VAlJ!vIJL^l^ O iGN VIVEKSLOL EHIlQL^ H^VATGYFmSASKVIFDVGLEEyDKyiYT!PEDSV^ MWAFGYMISKYSYYPQD VVELVDIMQ KUDELHKRNVKLITIVBHGIR^ DTEEWWAGIJSEWI^QGVIXHWLDMNEPTOFS A^ HYLRGKRVKHEKVRNA YFL YEAMAT^ WDDL l^I 2LVLGLSISGVPFVGCI)IGGFQG!^AEmNS I LV ' TIXJIDIEFYFLPDYY EK^TKKVEL Y FLPYWSLALEAS^ EDEYMVGICYLLYAPIVSKEESRLVT^ !EGDELIVYGE SF RYDNAEITSSSNEIIFSREI^ TYVAKI QK1RGKINLE Secuencia de aminoácidos de la fusión pNOV4832 glucosa isomerasa (SEQ ID NO: 28) MRVI YALAIXALAASATS Al^ VAFWHTFVNEGRDPreDPTAERPWNRFSDPNffiKAPARVDA QVK A?JEnTKELGGB3YVFWGGRBGYET^ L-EPKPKBPTTO.^^ LGSIDANQGDLLLGWDTT ^H^TNIYDTTL.^! 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A R VT M-aUDDYYYIXSEI-GAVYÍff'íE im V^'EAVVEGDLIXjVFn.YQIJE-^rYGlORlTVDPYSJAV GPKIEGYEDAHYEÍHIAM GLENSGVKNK^ GIGVTMD VEPKTYGIGELSAH>QTVPYYF^^ VTYWVK£YfflDGF]Ml>QMGIJ©^^ GTIWAAI^EFRDAIRGSVFOTS^ CRTTNFNDNS YNAPISINGFDYH KLQFI V ffYH G LIKlJKE^AflU- NAEEIK HLBFLP GGRRIVAPML DHAGGDPWKDIVVrYN^^ TffiLDPLSAYVLYRESEKDEL Fusión 797GL3 (SEQ ID NO:35) M VI VAIAI ALAASATSAKYLELEEGGVIMQAFYWDVPSG^ SAIWrPPASKGMSGGYSMGYDPYDYTOLGEYYQ ADIVJD HRAGGDLEWNPFVOT C!TOKSWIXJYWLWASQESYAAYLRSIGIDAWRFDYV^ YWDWVDAIIIWAYSSGAKVFDI^^ SGWYLEAPAY PA GQYGYSVWSYCGVGSEKDEL Fusión malA (SEQ ID NO: 36) QQCSííirVIVE LDLKEH^^ IXjVATCYFR^SASKVIFDVGLEEYDKVrTIPEDSVEFY^ KUDELH RI VTi-LrnVDHGIRVIXJ HYUIGKRYKH-XVRNAYH^YEAMAT^ F)EYMVG IiYAPIVSKEESRLVTLPRGK\VT IBGDEUVYGEISFKRYDNAErreSSNE^^ NTYV A I Q IRGKI LESE DEL Secuencia de nucleótidos de la fusión pNOV4829 glucosa isomerasa (SEQ ID NO: 37) ATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGrc TACCCTGGTGCCACGCGGTTCCATGGCCGAGITCT^^ CGAGGGCMGGAGTCCAO-AACCCGCTCaCCTTCCGCrTCTA TCGACGGCAAGCCGCTCAAGGACCACCTTIAAGTrCTC TGAACGAGGG CGCGACCCGTrCGGCGACCCGACCGCCGAGCGCCCG G^ TCCGACCCGATGGACAAGGCCTTCGCa:GCGTGGACGCCCTC^ CTC^CATCGAGTACrTCTGCTTCCACGACC^ CGCGAGACCAACAAGATCCTCGACAAGGTGGIOGAGC^ ACTCCAACGTGAAGC CCICTGGGGCACCGCCAACCTCn'CT ACGGCGOXKCACCACCTGCTCCGCCGACGTGT^ AAGGCCCK¾3AGA ACrAAGGAGCTCCKKX 3CGAGG CGAGGGCTACBAGlAaX^rat^CAC ^CClX! OCTÍGCTCCGCATGGCCGTGGAGTA8CCAAGAAGATC^ TCGAGCCGAAGCCGAAGGAGOCGACC GCACCAGT^^ CACGCCACCCTCGGCGGCCACACCTTCCAGCACGAGCrGCGCAT^ A.A.GC CGGCTCCATCGACGCCAACCAGGGCGACCTXXntXrrCGGCTGGGA G CCCBACX-AACAICTACGACACCACOT GC TCACX^GGGGGGCCTCAACrrCGACGCCAAGGrrG GAGGACCI I CATCGGCCACATCGGCGGCATGGACACC TCGCCCT GCCTACAACrrCGCCAAGGACGGCGTGTrCGACAAaX CATCGAGGAGAAGTACX¾CTC C TCAAGGAGGGCATCGGCAAGGAGATCGTGGAGGGCAAGACCGACTrCGAGAAGCTG GAGGAGTACA CA CGACAAGGAGGACATCGAGC GCCG CCGGCAAGCAGGAGTACCT GGAGTCCCTCCIXIAACTCGTACATCGTGAAGACCAT^ ACGAGCTGTGA Secuencia de aminoácidos de la fusión pNOV4829 glucosa isomerasa (SEQ ID NO: 38) ¾nG2TAAAKFERQHMDSPDLGTLVm^ CFHD D1AJ¾G TLRE K!1JJ ^ VER KER KBS NTV LLWGTANXF3 HPRYMHGAA TCS AT)VFA YA A ?? G???? JP.ITKTT XTGPnYV OGR FGYFTT .] ??G?? G,? FT FKJ ARFT .RMA VF.Y AKKIGP GQFIJEP PKEP KHQYD E1JIMARILGK1XJSIDAN(^DLIJ^ KRASYKVEDI^GHIAGMDTC^ Secuencia de nucleótidos de la fusión pNOV4830 glucosa isomerasa (SEQ ID NO: 39) ATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCA.CATGOACAGCCCAGATCTGGO TACARTGGTGCCACGCGGTRCCATGGCCGAGTTCIT^ CGACKJGCAAGGAGTCCACCAACX^CGCTCGCCTRCAAG^ TCGACGGCAAGCXIGCTCAAGGACCACCTCAAG TGAACGAGG K GCGACCCGTTCGG :GACCCGACCGCCGACCGC ^ ACCGACCCGATGGACAAGGCCTTCGCCCGCGTGGACGCCCITNTGGAG ^ GCTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACCGCGACATCGCXXXX^ CCOCGAGACCAACAAGATCCTCGACAAGCTGGTGGAGCXJCATCA^ GACNXCAACGTGAAGC CCTCTGG< 3CACCGCC\ACX^^ CACGG rGCCACCAO KKnXXX XGACGTGTrc AAGGCCCTGGAGATCACCAAGGAGCTGGGCGGCGAGGGCTACG GTItjrGGGGCGGCCG CGAGGGCTACGAGACCCTCCTCAACACCGACCTCGGCTrcGA» GCI CCT XX3CATGGCCGTG UCTACGC^^ - .
TQ3AGCTXÍAAGCCGAAGGAGCCGACCAAGCACCAG ACX3A TACGCCITCCTCAAGTCCCACGGCCIXX5AC ½GTAC CACGCXACCCra3Ca MXACACCm^ AAGCR_XH3CTCCATCGACX3CCAAC^ G TCCCGACCAAC!GTGTACGACACCACCCrCGCCATG AC!GAGGTGAT^ GCTTCACCAAGGG GGCCTCAAC TCGACGCCAAGGT^ GAGGACCTCI7CATCGGCCACATCCKXGCKATGGACAC GCCTACAAGCTCG GAAGGACGGCGTGCTCGACAAG TCATCnA CTTCCGGGAGGGCATCGGCCGCGACATCGTGGAGCGGAAGCTGGACTTCGAGAAGCTC ' AGGAGTACATCATCGACAAGGAGACCATCGAGCTGCCG1XXGGCAAGCAGGAGTACCTG GAGTCCCTCATCAACTCC ACATCGTGAAGACXATCC GAGCTGTGA Secuencia de aminoácidos de la fusión pNOV4830 glucosa isomerasa (SEQ ID NO: 40) í ETAAAKI^QH DSPDLGTL^ PLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTADRÍW YTDPMDK^ fCFWKDlAFBGKTUÍEmKILDK DViAYAAAQVKKAlJ_aTKELG<JEGY^^ AKM GFTGQH-IEP ?KEPTKHQYDFD VATA Y AFL S HGI-DcYF^ IIEiV^ HATLAGH FQHE LRMARDLÜIMSIDANQGDI^ RASY!CVIiDLHGHIAG l^EYmKEnEI^SGKQEYlíSLMSYr TILBIJ^EKIiEL Secuencia de nucleótidos de la fusión pNOV4835 glucosa isomerasa de Thermotoga marítima (SEQ ID NO: 1) ATGGGCAG<^GCCATCATCATCATCATCAC TATGGCTAGCATGACTGGT KJACAG AATC GGAGATCCCGAAGATCC 3rcCOA(K3GCAAGGAOTC TCTACGACCCGAAC¾-IAGGTXJATCGACGGCAAGC^ GAG 3CCCX3T JAAC03<7ITCTC8 CC CTTCGAG rCTGCGAGAAGCICAAC^TC CCCCCGGAGGGCAAGACCCK^GCGAGACCAACAAGATC CATCAAGGAGCGCATGAAGGACTCCAACGTGAAG<^^ TCTCCCACCCGCGCIACATGCACCKJCGC^ ACC TCGCCGCCCA K3AXJAAGAAGOCCCTGGA CTACGTGTICRCGGGCGGCCGCGAG ^ GGAGCTGGAGAACCTCGCCXXXTIXX^ GCTI IACCGGCCAGN CCTCAT XJAGCCGAAGCCGAAGG GCI CGACGTGGCCACXÍGCCTACGCCTTCCTCAA AGTTCAACATCGAGGCCAACCACGXACCC^ CGCATGGCCCTCATCCTCGG^ ' CTCGGC1XXK3ACACCGACCAGTTCCW CCG< TXXrrACAAGGTGGAGGACCTCTrCATC CG CCTCGC<rrr ^GA TOCCTACAAGC CGCC/\^ CXJAGGAGAAG ACCGC CCTTCAAGGAGGGCATCGGCAAGGAGATCCT ACCGACTTCGAGAAGCTGGAGGAGTACATCATCGACAAGGAGGACAT GAGCTGCCGTC CGGCAAG AG 3AGTACCTGGAGTCCCTCCTCAACTCCTACATCOTGAAGACCA AGCTGCGCTGA Secuencia de aminoácidos de la fusión pNOV4835 glucosa isomerasa de Thermotoga marítima (SEQ ID NO:42) MGSSHHHHHHSSGLVPRGSIffi^^ PNEVIDG PLKDHLKKVAFWinW^ AGHTFQHHJmAIULGKXGSIDANC^DLI G U-iFDAKVRRASYKVED^ Secuencia de nucleótidos de la fusión pNOV4836 glucosa isomerasa de Thexmotoga neapolitana (SEQ ID NQ:43) ATGGGCAGCAGCCATCATtATCATCATCACAGCAGCGGC^ TATOGCTAGCATGACTGCTG^ GGAGATXXX»AAGGTGCAGTrOJAGGGCAAGGAGTCCACCAA r TCTTACGACCCGGAGGAGATCATCGACGGCAAG( GCK 4AG ^ G GGCCrjX^GGCACACCTTCGTGAACGAGGGCCGCGACCCGTTCG^ GACCXKXXGTGGAACCGCTACACCGACCCGATGGAC¾AGGCCr^ CCTCTTCGAGTTXTIX3CGAGAAGCTCAACATCGAGTACITCTG CCCCCGQAGGGCAAGACCCTCCGCGAGACCAACAAGATCCTCGACAAGGTGGTGGAGCG CATC^AGGAGCGCATCAAGGACTCCAACGTGAAGCIT^ TCTCCCACCCGCGCTACAItX^CGGCGCCGCCACCAC^ ACGOCGCCGCCCAGGTGAAGAAGGCCCTGGAGATCACCAAGGAGCT^ CTACínXn CTOGGGCGGCCGCCAGGG CGAGCIGG AGAAC TCGCCCGCTTGCTCCGCATGGCCGTG GACTACGCCAAGCGCA CG GCT CACCGGCCAG IXXTn-ATCGAGCCXJAAGCCGA GACTTCWACGTGGCCACCGCCTACG XTKXrrCAAGTCCCACGGCCrCGACGAGTA AAGTTC!AACATCGAGGCCAACCACGCCACCXrrCGCCGGCCACACC IXXIAGCACGAGCr GCGCATGGCCCCX^TCCXCGGCAAGCTCGGCTCCATCGAC CCTCGGCTCGGACACCX^CCAGTICCCGACCAACCrTOTACGACAC CGAGGTOATCAAG XXX¾3CGGCrrCAC(_AAGG GCCGCGCCTCCTACAAGGTGGAGGACCrCrrCATCGGCCACATCGCCGGC^ TCGCCCTCGGCITCAAGGTGG^ TCGAGGAGAAGTACCGCTCCTrCCGCGAGGGCATCGGCCGCGACATCGTGGAGGGCAAG GTGGACTTCGAGAAGCrGGÁGGAGTACÁTCATCGACAAGGAGACCA CGAGCTGCCG C CGGCAAGCAGGAG ACXnGGAGTCCCTCATCAACTCCTACATCCT AGCTGCGCTGA Secuencia de aminoácidos .de la fusión pNOV4836 glucosa isomerasa de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NO: 4) MGSSHHHHHHSSGLWRGSHMAS TGGQQ G [PMAEFFPEIP VQFEGKESTNPLAEKFYD PE?3D_tX> PLKDHLKFSVAFWHXFVlffiGR Pro EKIMEYH FHDRDIAPEG TIJlEriKK^ GAATIX ADWAYAAAQV K L£ITK2LGCEG Y VFWC ¾EGYETI m IGFEr£NIAiifL RMAVDYAKBIC TGQ^IEPKI SEETKEQYDFD VATA YAFliCSHGIXiEYiXFNIEANHAIlA GHl JHEUtMARlIXíKIXKIDAN^ TOAKVIUíASY VEDLHG-^^ VKfiKVDFP! J^YTTni^RTTFJ. SfigQRYT . ST .T TSVTVKTTT T X Secuencia de aminoácidos de la fusión de -amilasa/glucoamilasa de Asperqillus s irousami (sin secuencia de señal) (SEQ ID NO: 45) AT7ADWI¾QSrSTLLTDRFARTDGS TATC3^AI^ TPVTAQIJPQTrAYGDAYHGYWQQDiy^>n^ HMGYIXJAGSSVDYSVFKPFSSQDYPHPFOT^ YK ÉWYDWVGSLVSNYSIDGLIUDTVKHVQ^ QNVMI mjraTYYPt AFKSTSGSMDDLYNMI TV')Krx^ TOTIAI-A WAAFIILNTX5IP KNYAISKOTGFVTYKNWIY BDTTIA ^ GQQLTEVKK^TVWGSDGmTV^ VARTAttJOTG\D<-AWVSGADS<HV^^ LSTEHYESQAIIQGVSNPSGDI^GGLGE-^^ OQmXDNGY SAATEiy H-VRNDI^YVAQYWNQTGYDLWBBV GSSmTAVQH ALVE GSAFATAVGSSCSWCXSQAPQILCYl^SFWTGSYU^ CDDSTFQPCSPRALANHKE DSF SIYTU^ AAEQLYDALYQ DKQGSLETTOVSIJDFF ALYSGAATGTYSSSS^ IVEXHAA-^GSI-^EDKSDGDELSARDLWSYAALLTAN ^ CAATSASGTYSSVTVTSWPSIVATGGTTITATTTQSG TAVAOTTOLTATTTCGE IYLV^ EYXI^VESDDSVEWESDPNREY VPQ^ Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maíz de la fusión de a-amilasa/glucoamilasa de Aspergillus shirousami (sin -secuencia de señal) (SEQ ID NO: 46) CXXACCeCGGCCGACfGGCGCTC ^ CGCACCXJACGGCTCCACCACCGCCACCTGCAACACC^ CACCTCX ^CKWCATCATCGACAAGCT TCTGGATCACCCCGGTGACCXKCCAGCTCCCGCAGACC^^ ACGGCTAC QGCAGC^G<3ACATC ACTCCC C^CGAG GCCAACCACATGGGCTACGACGGCGCCGGCTCCTCCGTGGACTACTra TTCTCCIXXX&GGACTACTTCCACC^ O^GGTGGAGGACTGCTGGCTCGGCGACAACAC GTGTrCCCTCCCGGACCTC CAAGGACOTGG GAAGAACXJAGTGGTACC ACTGCK3TGGGCTCC IOnt7ICCA.ACTACT CXTATCGACGGCCTCCGCATCGACACCGTGAAGCACGTGCAGAAGG.CTTCTGGCCGGGC TACAACAAGG< G<XGGCCTGTACTGC^ CACCTGCCCG ACCAGAACGTGATGGACGGCGTGCTCAACTACCXXjA CrACT CCTCAACGCCTTCAAGTCCACCrCCGGCTCGATGG^ CGTGAAGTCCGACTGCCCGGACTCCACOnt!C^ CCCGCGC CGCCTCCTACACCAACGACATCGCCCTCGCCAAGAACGTGGCC CATCCTCAACGAGGGCATCCCGATCATCTACGCCGGCCAGGAGCAGCACTACGCCGGCG GGAACGACCCGCCCAACCGCGAGGCCACCTGGCTCTOCGGCTACCCGACCGA^ CTGTACAAGCTCATCGCCTCCGCCAACGCCATC^ GGCTTCGTGACCTACAAGAACTOGCCGAT^ CAAGGGCAC^ACGGCTCCGAGATCGTGACCATCCTCTCCAAC^ ACTCCTACACXXnCTCCCTC^ TGATCGGCTGCACCACCGTGACCGTGGGCTCXZGACGGCAACGTGO^GGTGCCGATGGCC GGCX3G<X rcCCGCGCGTGC C ACCCGACC TCCTCCAAGGCXjGCCACCXi CGACTCCIXj GCCATCCTCAACAACATX-XX3CGCCGAC CGTGGTGGOrrCC< GTCCACCGACAA(XCGOACTACTrCTACACXT CGGCATCXJTCCTCAAGACCCTCG GGAC CACCATCGAGCAC ACATCTC TCCCAGGGCATCATCCAGGGCCTGTCCAACCCGTCCGG CGACCTCTCCTCCGGCGGCC CGGCGAGCCGAAGrrcAACGTGGACGAGACCGCCTACG CCGGCTCCTGGGGCCGCCCGCAGCGCGACGGCCCGGCCCTCCGCGCCACCGCCATGATC GCX7ITCGGC€AGTGGCTCCTCGACAACGGCTAC^ CCGCTCGTGCGCAACGACCTCTCCTACGTGGCCCAGTACTCGAA CTCTGGGAGGAGGTGAACGC rrCCTCCTrCTrCACCATOK GTGGAGGGCTCCGCCTTCGCC^CCGCCGTGGGCTCCXCCTGGTCC GGTGGGACT .
GCT^CGCAGATCCTCTGCTACCTCCAGTC TCGACTCCTCCCGC CCGGCAAGGACACCAACACCCTC^^ ACCCGGAGGCCGGCTGCGACGACTCCACCTTX AGCCGTGCTCC^ ACCACAAGGAGGTGGTGGACrcCTTCCGCrcCATCTACACCCT ACrcCGAGGCCGTGGCCGTGGGCCGCTACCCGGAGGACTCCTACTACAACGG TGGTiraOGCACCCTCGCCGCCGCCGAGCAGCTCTACG AAGCAGGGCTCCCTGGAGATCACCGACGTGTCarrCGAOT GGC KCGCC&CGGGCACCTACTCCTCCTC TGAAGACCTTCGGCGACGGCTrCGrG CCATCGTGGAGACC ACGCCG^ CCCTCTCCGAGCAGTITOACAAGTCCGACGGC GGTCCTACGCCGCCCTCCTCACCGCC.AACAACCGCCGCAACI^ GGGGajAGACCTCCGCCICCTCCGTGCCGGGCACCrGCGCCGCCACCTCCGCCrCCGGCA CCTACTCCTCCG GACCGTGACCrcCTGGCCG CCArCGTGGCCACCGGCGGCA CC^CCGCCACCACCACCG<3 ^ GCCTC(_^C½CCrCCACCACCACCTCCTCCACCT ATCTCCCAGCTCGGCGACTGGGAGACCTCCGACGGCATCGCCCTCTC^ ACCTCCTCCAACCCGCCGTGGTACGTGACCGTGACCCTCCCGGCCGGCGAGTCC TC^ TACAAGTTCATCCGCGTGOACrrCCGACGACTCCOT CGAGTAC ACCGTGCC X¾GGCCTGCGGa3AQTCCACCGCCACCGTGACCGACACCTGGCCC Secuencia de aminoácidos de glucoamilasa de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (sin secuencia de señal) (SEQ ID NO: 47) vi^csNNVssiiaDRFW^^ YYP IDTADVKEIKPIVTIXJ SFVSDBT D AIS P VEKFIt>KSLGYKLV TOKKGRyRIT EIFT D\TCRNSUMKAKEEALEGS1HDYKLYLAYDPHIKNQGSYNE Y ALSSNIGW GYS IGYY TVTTOINnDLDEKKQMT HYDSARGATIEGA FGGSDSEAA TAl-íXLGBDYlWH-kN YIDEWTKT KTNKGAYIASl-SffWGDGQ DDOTGGYHLV^ VVKDNGMIPQNTWISG PYWTSIQLD-^^ ER EHGGYSPATMAAEVAGLTCAAYIAEQN DYESAQ YQEKADN Q ^ H^GQYYI IAGLSDPNADFMiraANGGGVYDQmVDre VVBSTIKVIOTKGPSWYRYNHIX^ TPYVKAitEKPA EGGIlSEQVWEOT Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maíz de glucoamilasa de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (sin secuencia de señal) (SEQ ID NO: 48) GTGCTCTCCGGCTGCTCCAACAACGTGTC TCCGCCGTGAACGG<XC0GGCGAGGAGGACACCTG 3GCCTCCGCCCAGAAGCAGGGCGT GGGCACCGCCAACAACTACG GTCCCOCGT^ CGAGG GTACTACCGGACCATCGACACmXGACGTGAAGGAGATCAAGTI^ CCGACGGCAACrrCCTTCGTGTCC ½COAGACCAAG jAC^ TTCACCGACAAGTCCCTCGGCrACAAC 7ro3TGAACACCGAGAA C .TCAXAAGGAAATCTTCACCGACGTG.AAGCGCAACrCCCTC TCGAGGCCCTCGAGGGCTCCATCCACGACTACAAG rCTACCTCG TCAAGAACCAGGGCTCCTACAACGAGGGC ACGT^ CTCATGGCCAAGCGCGACMCGTGTACACeGCCCrCTC CTACTCCA1CGGCTACTACAAGGTGAACGACATCATGACCGACCTCGACGAGAACAAGC AGATGACCAAGCAC^ACGACTCCGCCCGCCGCAACATCATC^ CTCACCAAGAACTCCGAGTTCGAGATCGTGCT^ GCCAAGACCGCCCTCGAGACCC^ CGACGÁGTGGACCAAGTACTGCAACACCCTCAACAACT CAACGGCAAGGCCAACTCCC TCTACTACAACTCCATGATGATCCTCAAGGCCTCCGAGGACAAGACCAACAAGGGO TACATCGCCTCCCICTCCATCCCGTGGGGCGACG CTACC^CCTCGTGTGGTCCCGCGACCTCT^ CGACGTGGACIXXGCCAACCGCTCCCTCGACTACCTCGC<_^ GCATGATCCCGCAGAACACCTGGATCTCCGGCAAGCCGTATTTC^ ACGAGCAGG<X:GACCCGATCATCC CTCCTACCGCCTCAAGCGCRACGACCTCTACGACT CCCTCGTGAAGCCGCTCGCCGACTTCATCATCAAGATCGGCCCGAAGACCGGCCAGGAG CGCTGGGACIGAGATCGOICGGCTACTCCC^ CACCTGCGCCG<^ACATCGCCGAC ;AGAACAAGGACTACGAGI^GCCX^GAAGTACC AGGAGAAGGOXSACAACTGGCAGAAGCTCAT8^ CCGCTCGGCAACGGCCAGTACTACATCCGC^^ TTCATGATCAACATCGCCAACGGCGGCG . CACCCTCAAGGTCGTXKJACTCCACCATCAA ' ATCGCTACAACCACGACGGCTACGGCGAGCCGTCCAAGACCGAGCTGTACCACGGCGCC GGCAAGGGCCGCCTCrGGCCGCTCCTCACCGGCGAGCGCGGCATGTACGAGATCXK CGC CGGCAAGGACGCCACCCCGTACGTGAAGG<^ATGGAGAAGTTCGCCAACGAGGGCGGC ATCATCTCCGAGC-AGGTG GGGAGGACACCGGCCT XXXjAC^ ' AACTGGGCCCACGCCGAGTACGTGATCCT TITCGCCT GACATGCXXK3ACATCGTGTAC Secuencia de aminoácidos de qlucoamilasa de Rhizopus oryzae (sin secuencia de señal) (SEQ ID NO: 49) AS1PSSASVQLDSYNYDGSTFSGKIYVKN GS YEYWTFSASMGIEIE ni YEVSG TYYDNNNSAN YQVSTSKFTTITATAT TTAPSTST TITPSRSEPAIl^TGNSTlSSWI XQEGISR AA'iLRNíNPFGSATC DAALTSNY YEYNITLS^^ WGRKJNDGPAEJ^TTF^^ EVNGVHFY LMVMRKGLLLGADFAKRNG DST ASTYSSTASTIA^G-GSSFWVSSNNWIQVSQ SV GGVSKKGLDVSTLl-AANrGSVDDGPPIPGSEÍÜlATAVAVEDSFA SIGRYPEDTYNGNG S<^NSW^ SG] ÍY1^GTSDFNNLAQNIALAADR^ ASLrrASYAKAGAPAA Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maiz de glucoamilasa de Rhizopus oryzae (sin secuencia de señal) (SEQ ID NO: 50) (KXTCCATCCCGTCCTX ^ TrCTCO-CCAAAATCTACGTGAAGAACATC GCCGACGGCIXXGACAACTGGAACAACAACGGCAACAC CCCGATCTCCGGCTCCAACTACGAGTACTC 1A^ GGAGTTCTACATCAAGTACGAGGTGTCCGGCAAGACCTA rACGACAAC A CC^CTACCAGGTGT XACC CAAG^^ ACCGCCXXn X^CCTCCACCACCACCCCGCCGTC^ ACCGGCAACIXX^ACCATCTCCTCCTGGATCAAGA^ ATGCTCCGCAACATCAACCOXCGGGCTCCGCCACCG AC(X3<XXK_mX3GACTACTACTAC^ ATCGTGTACGAGTAGVACACCACXX CT XXjGCAA GAC ACCTGACCTI rcCGTGAAGACCCAGTCCACCrc^ GAGCCGAAGTTCAACCCGGACGCCTCCGGCTA CACCGGCG CCTGGGGCCGCCCGCAGAA CGACGGCCCGGC XJAGCGCGCCACCACCT CATCCTCTT^ . GACeAAGGA<X ICTCC ACGTGACCGGC¾<XCTCAAGCCGGCCAT ACTVVCGTXjTGAACGTGTGG CCAACKjCrGCTTCGACCT GTGCACTTCTACACCCTCATGGTGATGCGCAAGGGCCTCCTCCTC^ AAGCGCAACGGCGACTCC^CCCGCG jKXACCTACTCCTCCACXX AACAAAATCTCCrCCTTCTGGG GT(XrrCC^ ACCGGCCÍGCGTGTCCAAGAAGGGCCTCGACGTGTCCAC^ GTGGAGGACTCC IXXKXriXXrirrACC^ AACTC ATCGG^GCTACCCGV3AGGACACCTACAACGGCAAO GA CXK3CAAC0KJCGGCGTGACCG GTCCTCCA.T^ CTCCTCCGCCACCltXGGCAAGAAGTACAlXCrrcGG^ <_CAGAACATCGCCC CGCCGCCGACCGC rcCTCTC CCGCC Secuencia de aminoácidos de alfa amilasa de maiz (SSQ ID NO: 51) MAJffiLAAMCWCSIiVLVLIX^ TGATHVWLPQPSHSVAPQGYMPGRLYDLDAS KYGTHAELKSLTAAFHAKGYO VADVVIN HRCADYKDG GIYCVIEGGTPDSRLDWGPD^CSDDTQYSNGRGH DTCADFAAAPDIDHL GNGEPSS K ADRQELVIWAQAVGGPAAAH)FTrc^ MIGWIi^KAV FVDNHDTGSTXJNSWPFPS ISAI^AVRaWGIHPGSEIJflLAAIXiDLYVAKIDDKVrvra YCV EKHGLRVPAGRHH Secuencia de ácidos nucleicos de alfa amilasa de maíz (SEQ ID NO: 52) ATGGCGAAGCACTTGGC^ TTGCK3CTOXAGCTGGCCX^TCCCAGOT .AAGAAGCAAGGTXKKjTGGTACAACTACCrCCTGOGGCGG TK^ G GGGGCC ACGC ACGTCTGGCTCCCGC AGCCGTCGC ACTCX3GTGGC GGCTACA TGCCCGGGCGGCTC ACGAC TOGACGCGTCCAAGTAC C JCACCC ACGCGGAGC CAAG TCGCTCACCGCGGCGT CCACGO^GGGCGTCCAGTGCGTCGCCGACCT CACCGCK5CGCCGACTACAAGGACGGCXX3CGGCATCT GCCCGACAGCCGCCTCGACTGGGGCCCCGACATGATCTGCA.GCGACGACACGCAGTACT CCAACCK3GCGCGGGCACCGCGACACGGG<¾3CCGAC CACCTCAACCCGCGCGTGCAGCAGGAGCrCTCGGACTXjGCrcAACTGG TCAAGT^ CCTCGGC TCGACGckn K3CGCCTCGACI CGCXIAA GGTGTACGTCGACAGCACX&CCCCCACCTTCOT CTACGA X3GGAACGGCGAGCCOTCCAGC\ACCAGGACGCrGACAGGCAGGAGCn3GTC AACTGGGCGCAGGCGGTGGGCGGCCCCGCCGCGGCGTIXX ACTrCACCACCAA GCTGCAGGCGGCCGTCCAGGGCGAGCTGTGGCGCATGAAGGACGGCAACGGCAAGGCG CCCGGGATGATCGGCTOGCTGCCGGAGAAGGCCXTIX^CGTrCGIOj CGGCTCCACGCAGAACTCXIIXJGCGATTCCCCT TATCC7X¾CGCACCCAGGAACTXXATGCATC IUrA8 GAAGCAGGAGATCAGCGCGCIOTCTGCGGTGAGG CAAGAAACGGGATCCArc AO^GCTGAACATCCTCGCCGCCGACG OGTCATGGTGAAGATCGGGTC^CGGTACGACGTCGGGAACCTGATCC CGCCGTTCCCCXnOGCAACAACTACrcCGm GGGGCGGCACCACTAG Secuencia de aminoácidos del sitio de enlace del almidón bruto (SEQ ID NO: 53) ATGGTTTTATTTGSGGVTSTSKTTTTAS TSTTTSSTSCTTPTAV Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maíz del sitio de enlace del almidón bruto (SEQ ID NO: 54) CACCCCGACCGCCGTGTC Secuencia de aminoácidos de EGLA de Pyrococcus furiosus (sin secuencia de señal) (SEQ ID NO:55) r?FVEKYWISED STSNTSSlP- 2T! LSTIXVI^ WramTGFAi- TYNLTSGYLH^ PJPJ-PS VS LTDF-X BYKL-iP NGLPINFAI-^^ QPAGSKVKEIYVHTVNGITVNATFEV^ SLPNY ELYLE£>VHGTEFG^ Secuencia de ácidos nucleicos optimizada de maíz de EGLA de Pyrococcus furiosus (sin secuencia de señal) (SEQ ID NO: 56) ACCCCGCCGCAGACCACCCTCTCCACCACCAAGG CGGCGAGTGCKXCGGCGCCCCCATCO^ TTXTAGATC-AACCTCTGGAACATCCTCA^ TCACTAG GGCGTGCTCC'ACTACGTGCAGCAGCTCGACAACATCGTGCrCCGCGACCGCT CCAACTGGGTGCACGGCTACCCGGA-AATCTTCTACGGCAACAAGCCC rGGA^ TACGCCACCGACGGCCCXlATCXXGCTCCCGTCCAAGGTG'rCCAACCI^ CTCACCAIGTCCTACAAGCTCGAGCCGAAGAACX^ TCCTOGCTCACCCGCGAGGCCTX^ GATGATCTTOATCTACTACGA^ TGG GCCGATCATCGTGAACGGCACCCt-^^ AACATXX 3CTGGGAGTACGTXKXXri^^ GACCATCCCGTACGGCGCCTTCATCnXXGTGGC^ CACCGAG GTACCrcGAGGACGTGGAGATCGGCACCGAGTTC CATCTCCTAG Secuencia de aminoácidos de xilosa isomerasa de Thermus flavus (SEQ ID NO: 57) MYEPKreHRFITOL'WTVTOT^ TP Q RDnrVgRFg A .nFTVT .ÍTVPVfVT ANT .R FP A FR ÍX A ¡STTRT)PWVW A YAÍ.R Sr.RTM U3AEWAEIYMf rVRE SEVESTDKTOK ^ PNEPRGOIYFTTVGSMLALIHTLDRPER DIJLESSGYQGPIÍHFEAHA^ QEDPATLALLDFirSRE AB.AJ^EAELPl^rri^^ Secuencia de nucleótidos pNOV4800 (secuencia de señal Amy32B con EGLA) ( SEQ ID NO: 58) ATCGGGAAGAACGGCAACCTGTGCTGCTTCICTCT GCG CXXXK!CAIX-AAATCT^^ crcc^CAOTXxn:ccACCccGC^ CCGCTACCCGGACGACGG GAGTGG<XCGGCGCCm ACCCGGAGT CTACATCGAGATCAACCTCTG AGATGACCTACAACCTCACTAGTGGCGTG^ TGCTCCGCGACCGCTCCAACTGGGTGCACGGCTACC^ ( iTGGÁACGCGAACTACGCCACCGACGGCCCGA^^ CTCACCGACTTCTACCTCACCATCTCCTACAAGCTCGAGCCGAAGA^ AACTTCGCCATCGAGTXXTGGCTCACCCGCGAGGCCTGGCGCACCAC GACGAGCAGGAGGTGATGATCTGGATCTACTA8^ GGTGAAGGAGATCGTGGTGCCGATCA CGTGAACGGCACCCCGGTC AGGTCTGGAAGGCCAACATCGGCTGGGAGTACGTCGCCT CCGCATCAAGACC^ AAGG AGG GCACCGTG ACCATCCCGTACGGCGCCTTC ATCIXXXJTG GCCG TlAACAT rCC TCCCTCCCGAACTACACCGAGAAGTACCTCGAGGACGTGGAGATCGGCACCaAGTTCGG CACCCCGTeCAa^CCTCCGTC GCTCGACCGCCC GCTCATCTCCTAG Acido nucleico optimizado de maiz de Aspergill s niger (SEQ ID NO: 59) ATGTCUTTCCGCrCCCTCCrc TCTC<^GCGCGCCACCCTC^^ CCATCCTCAAG^ACATCGGCGC^ GTGCTG KXriXXXXX3TCCACX:GACAAC GGCXJrcGTGCTCAAGACCCTCGTG }AC rCI < ACCATCGAGAACTAGÁTCTGCGCCCAGGC^^ GACeTCTCCTCCGGCGCCGGCCTCGGCGAGCCGA^ CACCGGC CC1XKK3GCCGCCCGCAGCXXX3ACGGCC^ . TCGGCT CGGCGAGTGGCTCCTCGACAACGG TAGACC rCCACGGCGACCGACATCGTGT GGCOXrrCGTCCGCAACGACCTCrcCTACGTG^ GACCTCTGGGAGGAGGTGAACGGCTCC CCT CTIGACCATCGCCGTGCAGCACCGCGCC CT XjTGGAGQG rCCGCCrrcGCCACCGCCG GGGC CCTC ACTTCGACTCCKX GCTCCGGCAAGGACGCCAACACCCT TCGACX GGAGGCCGCCTGCGACGACTCCA.CXJI CCAGC X3 (XAACCACAAGGAGOTGGTGGAOT CCGACTCCGAG CCGTGGCCGTGGGCX:GCTAC(XXK^ CCGTGGTTCCTCTGCACCCTC^ GACAAGCAG!GGCNXXCTTOAGGTGACCGACG TCCGA<^KXGCCACCGG<^CCT^^ CCGTCAAGACCTTCGCCGACGGCT CGTGTCCATC^ GCTCCATGTM3AGK½GTACGACAAGTCCO ACCTGGTCCTACGCCGCCCTCCTCACCGCCAACAACCG^ TCCTGGGGCGAGACCTCCGCCTCCTCCGTGCC^^ GGCACCTACTCCTCCGTGACCGTO^ ACCACCACCGCCACCCCGACCOGCTCCGGCTCCGTGAC^ ACCGCCRCCAAGACC CCACOTXACCTCCTCCACCT^ G<XGTGA(XJTTCGACCTCACCGCCACCACCACCTACGGCGAGA^ TCCATCTCCCAGCTCGGCGACTGGGAGACCTCCGA TACA OXCTC8ACCCGCNCTGGTACGTGACCGTGACCCT GAGTACAAGTTCATCCGCATCGAGTCCGACGACTCCGTCGAGTGC JAG CCGACCCGAA CXTGCXSAGTACACCGTGCCGCAGGCCTC GGCGC LISTADO DE SECUENCIAS <110> Lanahan, Mike <120> PLANTAS Y PARTES DE PLANTAS AUTOPROCESADO AS <130> 109846.317 <140> US 60/315,281 <141> 2001-08-27 <160> 60 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Met Ala Lys Tyr Leu "Glu Leu Glu Glu Gly Gly Val lie Met Gln Ala 1 5 10 - 15 Phe Tyr Trp Asp Val Pro Ser Gly Gly lie Trp Trp Asp Thr lie Arg 20 25 30 Gln Lys lie ' Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly lie Ser Ala lie Trp lie 35 - 40 45 Pro Pro Ala Ser -Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp 50 55 60 Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Lys Gly Thr Val 65 70 75 80 Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gln Glu Leu lie Asn Met lie Asn Thr 85 -· 90 95 Ala His Ala Tyr Gly He Lys Val He Ala Asp He Val He Asn His 100 105 110 Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Val Gly Asp Tyr Thr 115 120 125 Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr 130 135 140 Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Pro Asp He Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gln Tyr Trp 165 170 175 Leu Trp Ala Ser Gln Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser He Gly 180 185 190 He Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly Tyr Gly. Ala Trp Val 195 200 205 Val Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr 210 215 220 Trp Asp Thr Asn Val Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly 225 230 235 240 Ala Lys Val Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Ala Ala Phe 245 . 250 ' 255 Asp Asn Lys Asn He Pro Ala Leu Val Glu Ala Leu Lys Asn Gly Gly 1 260 265 270 Thr Val Val Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn 275 280 285 His Asp Thr Asp lie lie Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe lie 290 295 300 Leu Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Thr lie Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu 305 310 315 320 Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu lie Trp lie His Asp Asn 325 330 335 Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser lie Val Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu et 340 345 350 lie Phe Val Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu lie Thr Tyr 355 360 365 lie Asn Leu Gly Ser Ser Lys Val Gly Arg Trp Val Tyr Val Pro Lys 370 375 380 Phe Ala Gly Ala Cys lie His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp 385 390 395 400 Val Asp Lys Tyr Val Tyr Ser Ser Gly Trp Val Tyr Leu Glu Ala Pro 405 410 415 Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gln Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Ser Tyr 420 425 430 Cys Gly Val Gly 435 <210> 2 <211> 1308 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 atggccaagt acctggagct. ggaggagggc ggcgtgatca tgcaggcgtt ctactgggac 60 gtcccgagcg gaggcatctg gtgggacacc atccgccaga agatccccga gtggtacgac 120 gccggcatct ccgcgatct¾f''"gataccgcca gcttccaagg gcatgtccgg gggctactcg 180 atgggctacg acccgtacga ctacttcgac ctcggcgagt actaccagaa gggcacggtg 240 gagacgcgct tcgggtccaa gcaggagctc atcaacatga tcaacacggc gcacgcctac 300 ggcatcaagg tcatcgcgga catcgtgatc aaccacaggg ccggcggcga cctggagtgg 360 aacccgttcg tcggcgacta cacctggacg gacttctcca aggtcgcctc cggcaagtac 420 accgccaact acctcgactt ccaccccaac gagctgcacg cgggcgactc cggcacgttc 480 ggcggctacc cggacatctg ccaügacaag tcctgggacc agtactggct ctgggcctcg 540 caggagtcct acgcggccta cctgcgctcc atcggcatcg acgcgtggcg cttcgactac 600 gtcaagggct acggggcctg ggtggtcaag gactggctca actggtgggg cggctgggcg 660 gtgggcgagt actgggacac caacgtcgac gcgctgctca actgggccta ctcctccggc 120 gccaaggtgt tcgacttccc cctgtactac aagatggacg cggccttcga caacaagaac 780 atcccggcgc tcgtcgaggc cctgaagaac ggcggcacgg tggtctcccg cgacccgttc 840 aaggccgtga ccttcgtcgc caaccacgac acggacatca tctggaacaa gtacccggcg 900 tacgccttca tcctcaccta cgagggccag cccacgatct tctaccgcga ctacgaggag 960 tggctgaaca aggacaagct caagaacctg atctggattc acgacaacct cgcgggcggc 1020 tccactagta tcgtgtacta cgactccgac gagatgatct tcgtccgcaa cggctacggc 1080 tccaagcccg gcctgatcac gtacatcaac ctgggctcct ccaaggtggg ccgctgggtg 1140 tacgtcccga agttcgccgg cgcgtgcatc cacgagtaca ccggcaacct cggcggctgg 1200 gtggacaagt acgtgtactc ctccggctgg gtctacctgg aggccccggc ctacgacccc 1260 gccaacggcc agtacggcta ctccgtgtgg tcctactgcg gcgtcggc 1308 <210> 3 2 <211> 800 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Met Gly His Trp Tyr Lys His Gln Arg Ala Tyr Gln Phe Thr Gly Glu 1 5 10 15 ASD Asp Phe Gly Lys Val Ala Val Val Lys Leu Pro Met Asp Leu Thr 20 25 30 Lys. Val Gly lie lie Val Arg Leu Asn Glu Trp Gln Ala Lys Asp Val 35 40 45 Ala Lys Asp Arg Phe lie Glu "le Lys Asp Gly Lys Ala Glu Val Trp 50 55 60 lie Leu Gln Gly Val Glu Glu lie Phe Tyr Glu Lys Pro Asp Thr Ser 65 70 75 80 Pro Arg lie Phe Phe Ala Gln Ala Arg Ser Asn Lys Val lie Glu Ala 85 90 95 Phe Leu Thr Asn Pro Val Asp Thr Lys Lys Lys Glu Leu Phe Lys Val 100 105 110 Thr Val Asp Gly Lys Glu lie Pro Val Ser Arg Val Glu Lys Ala Asp 115 120 125 Pro Thr Asp lie Asp Val Thr Asn Tyr Val Arg lie Val Leu Ser Glu 130 ' 135 140 Ser Leu Lys Glu Glu Asp Leu Arg Lys Asp Val Glu Leu lie lie Glu 145 150 155 160 Gly Tyr Lys Pro Ala Arg Val lie Met Met Glu lie Leu Asp Asp Tyr 165 170 175 Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Gly Ala Val Tyr Ser Pro Glu Lys Thr lie 180 ' 185 190 Phe Arg Val Trp Ser Pro Val Ser Lys Trp Val Lys Val Leu Leu Phe 195 ' 200 205 Lys Ásn Gly Glu Asp Thr Glu Pro Tyr Gln Val Val Asn Met Glu Tyr" 210 „ 215 220 Lys Gly Asn Gly Val f'rp Glu Ala Val Val Glu Gly Asp Leu Asp Gly 225 230 235 240 Val Phe Tyr Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Gly Lys lie Arg Thr Thr 245 250 255 Val Asp Pro Tyr Ser Lys Ala Val Tyr Ala Asn Asn Gln Glu Ser Ala 260 265 270 Val Val Asn Leu Ala. 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Ala Gly Thr Glu Val lie Glu Thr Val Glu 770 775 780 Gly Thr lie Glu Leu Asp Pro Leu Ser Ala Tyr Val Leu Tyr Arg Glu 785 790 795 800 <210> 4 <211> 2400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 4 <223> synthetic <400> 4 atgggccact ggtacaagca ccagcgcgcc taccagttca ccggcgagga cgacttcggg 60 aaggtggccg tggtgaagct cccgatggac ctcaccaagg tgggcatcat cgtgcgcctc 120 aacgagtggc aggcgaagga cgtggccaag gaccgcttca tcgagatcaa ggacggcaag 180 gccgaggtgt ggatactcca gggcgtggag gagatcttct acgagaagcc ggacacctcc 240 ccgcgcatct tcttcgccca ggcccgctcc aacaaggtga tcgaggcctt cctcaccaac 300 ccggtggaca ccaagaagaa ggagctgttc aaggtgaccg tcgacggcaa ggagatcccg 360 gtgtcccgcg tggagaaggc cgacccgacc gacatcgacg tgaccaacta cgtgcgcatc 420 gtgctctccg agtccctcaa ggaggaggac ctccgcaagg acgtggagct gatcatcgag 480 ggctacaagc cggcccgcgt gatcatgatg gagatcctcg acgactacta ctacgacggc 540 gagctggggg cggtgtactc cccggagaag accatcttcc gcgtgtggtc cccggtgtcc 600 aagtgggtga aggtgctcct cttcaagaac ggcgaggaca ccgagccgta ccaggtggtg 660 aacatggagt acaagggcaa cggcgtgtgg gaggccgtgg tggagggcga cctcgacggc 720 gtgttctacc tctaccagct ggagaactac ggcaagatcc gcaccaccgt ggacccgtac 780 tccaaggccg tgtacgccaa caaccaggag tctgcagtgg tgaacctcgc ccgcaccaac 840 coggagggct gggagaacga ccgcggcccg aagatcgagg gctacgagga cgccatcatc 900 tacgagatcc acatcgccga catcaccggc ctggagaact ccggcgtgaa gaacaagggc 960 ctctacctcg gcctcaccga ggagaacacc aaggccccgg gcggcgtgac caccggcctc 1020 tcccacctcg tggagctggg cgtgacccac gtgcacatcc tcccgttctt cgacttctac 1080 accggcgacg agctggacaa ggacttcgag aagtactaca actggggcta cgacccgtac 1140 ctcttcatgg tgccggaggg ccgctactcc accgacccga agaacccgca cacccgaatt 1200 cgcgaggtga aggagatggt gaaggccctc cacaagcacg gcatcggcgt gatcatggac 1260 atggtgttcc cgcacacct? 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Asp Leu Leu 450 455 460 Val Lys Tyr Tyr Ala Leu Ala Leu Phe Phe Pro Phe Tyr Arg Ser His 465 470 475 480 Lys Ala Thr Asp Gly lie Asp Thr Glu Pro Val Phe Leu Pro Asp Tyr 485 490 495 Tyr Lys Glu Lys Val Lys Glu lie Val Glu Leu Arg Tyr Lys Phe Leu 500 505 510 Pro Tyr lie Tyr Ser Leu Ala Leu Glu Ala Ser Glu Lys Gly His Pro 6 515 520 525 Val lie Arg Pro Leu Phe Tyr Glu Phe Gln Asp Asp Asp Asp Met Tyr 530 535 540 Arg lie Glu Asp Glu Tyr Met Val Gly Lys Tyr Leu Leu Tyr Ala Pro 545 550 555 560 lie Val Ser Lys Glu Glu Ser Arg Leu Val Thr Leu Pro Arg Gly Lys 565 570 575 Trp Tyr Asn Tyr Trp Asn Gly Glu lie lie Asn Gly Lys Ser Val Val 580 585 590 Lys Ser Thr His Glu Leu Pro lie Tyr Leu Arg Glu Gly Ser lie lie 595 600 605 Pro Leu Glu GÍy Asp Glu Leu lie Val Tyr Gly Glu Thr Ser Phe Lys 610 615 620 Arg Tyr Asp Asn Ala Glu lie Thr Ser Ser Ser Asn Glu lie Lys Phe 625 630 635 640 Ser Arg Glu lie Tyr Val Ser Lys Leu Thr lie Thr Ser Glu Lys Pro 645 650 655 Val Ser Lys lie lie Val Asp Asp Ser Lys Glu lie 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acatctactc cctcgccctc 1560 gaggcctccg agaagggcca cccggtgatc cgcccgctct tctacgagtt ccaggacgac 1620 7 gacgacatgt accgcatcga ggacgagtac atggtgggca agtacctcct ctacgccccg 1680 atcgtgtcca aggaggagtc ccgcctcgtg accctcccgc gcggcaagtg gtacaactac 1740 tggaacggcg agatcatcaa cggcaagtcc gtggtgaagt ccacccacga gctgccgatc 1800 tacctccgcg agggctccat catcccgctc gagggcgacg agctgatcgt gtacggcgag 1860 acctccttca agcgctacga caacgccgag atcacctcct cctccaacga gatcaagttc 1920 tcccgcgaga t ctacgtgtc caagctcacc atcacctecg agaagccggt gtccaagatc 1980 atcgtggacg actccaagga gatccaggtg gagaagacca tgcagaacac ctacgtggcc 2040 aagatcaacc agaagatccg cggcaagatc aacctcgagt ga 2082 <210> 7 <211> 1818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 atggcggctc tggccacgtc gcagctcgtc gcaacgcgcg ccggcctggg cgtcccggac 60 gcgtccacgt tccgccgcgg cgccgcgcag ggcctgaggg gggcccgggc gtcggcggcg 120 gcggacacgc tcagcatgcg gaccagcgcg cgcgcggcgc ccaggcacca gcaccagcag 180 gcgcgccgcg gggccaggtt cccgtcgctc gtcgtgtgcg ccagcgccgg catgaacgtc 240 gtcttcgtcg gcgccgagat ggcgccgtgg agcaagaccg gaggcctcgg cgacgtcctc 300 ggcggcctgc cgccggccat ggccgcgaac gggcaccgtg tcatggtcgt ctctccccgc 360 tacgaccagt acaaggacgc ctgggacacc agcgtcgtgt ccgagatcaa gatgggagac 420 gggtacgaga cggtcaggtt cttccactgc tacaagcgcg gagtggaccg cgtgttcgtt 480 ¦ gaccacccac tgttcctgga gagggtttgg ggaaagaccg aggagaagat ctacgggcct 540 gtcgctggaa cggactacag ggacaaccag ctgcggttca gcctgctatg ccaggcagca 600 cttgaagctc caaggatcct gagcctcaac aacaacccat acttctccgg accatacggg 660 gaggacgtcg tgttcgtctg caacgactgg cacaccggcc ctctctcgtg ctacctcaag 720 agcaactacc agtcccacgg catctacagg gacgcaaaga ccgctttctg catccacaac 780 atctcctacc agggdcggtt cgccttctcc gactacccgg agctgaacct ccccgagaga 84.0 ttcaagtcgt ccttcgattt catcgacggc tacgagaagc ccgtggaagg ccggaagatc 900 aactggatga aggccgggat cctcgaggcc gacagggtcc tcaccgtcag cccctactac 960 gccgaggagc tcatctccgg catcgccagg ggctgcgagc tcgacaacat catgcgcctc 1020 •accggcatca ccggcatcgt caacggcatg gacgtcagcg agtgggaccc cagcagggac 1080 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<211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 53 Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Thr Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr 20 25 30 Thr Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val 35 40 45 <210> 54 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence 56 <220> <223> synthetic <400> 54 gccaccggcg gcaccaccac caccgccacc accaccggct ccggcggcgt gacctccacc 60 tccaagacca ccaccaccgc ctccaagacc tccaccacca cctcctccac ctcctgcacc 120 accccgaccg ccgtgtc 137 <210> 55 <211> 300 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 55 Ile Tyr Phe Val Glu Lys Tyr His Thr Ser Glu Asp Lys Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Thr Ser Ser Thr Pro Pro Gln Thr Thr Leu Ser Thr Thr Lys Val 20 25 30 Leu Lys lie Arg Tyr Pro Asp Asp Gly Glu Trp Pro Gly Ala Pro He 35 40 45 Asp Lys Asp Gly Asp Gly -Asn Pro Glu Phe Tyr lie Glu He Asn Leu 50 55 60 Trp Asn lie Leu Asn Ala Thr Gly Phe Ala Glu Met Thr Tyr Asn Leu 65 70 75 80 Thr Ser Gly Val Leu His Tyr Val Gln Gln Leu Asp Asn He Val Leu 85 90 95 Arg Asp Arg Ser Asn Trp Val His Gly Tyr Pro Glu He Phe Tyr Gly 100 105 110 Asn Lys Pro Trp Asn Ala Asn Tyr Ala Thr Asp Gly Pro He Pro Leu 115 120 125 Pro Ser Lys Val Ser Asn Leu Thr Asp Phe Tyr Leu Thr He Ser Tyr 130 135 140 Lys Leu Glu Pro Lys Asn Gly Leu Pro lie Asn Phe Ala He Glu Ser 145 150 155 160 Trp Leu Thr Arg Glu Ala Trp Arg Thr Thr Gly lie Asn Ser Asp Glu 165 170 175 Gln Glu Val Met lie Trp lie Tyr Tyr Asp Gly Leu Gln Pro Ala Gly 180 185 190 Ser Lys Val Lys Glu lie Val Val Pro lie lie Val Asn Gly Thr Pro 195 200 205 Val Asn Ala Thr Phe Glu Val Trp Lys Ala Asn lie Gly Trp Glu Tyr 210 215 220 Val Ala Phe Arg lie Lys Thr Pro lie Lys Glu Gly Thr Val Thr He 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Ala Phe lie Ser Val Ala Ala Asn lie Ser Ser Leu Pro 245 250 255 Asn Tyr Thr Glu Leu Tyr Leu Glu Asp Val Glu lie Gly Thr Glu Phe 260 265 270 Gly Thr Pro Ser Thr Thr Ser Ala His Leu Glu Trp Trp He Thr Asn 275 280 285 lie Thr Leu Thr Pro Leu Asp Arg Pro Leu lie Ser 290 295 300 <210> 56 <211> 903 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus 57 <400> 56 atctacttcg t ggagaagta ccacacctcc gaggacaagt ccacctccaa cacctcctcc 60 accccgccgc agaccaccct ctccaccacc aaggtgctca agatccgcta cccggacgac 120 ggcgagtggc ccggcgcccc gatcgacaag gacggcgacg gcaacccgga gttctacatc 180 gagatcaacc tctggaacat cctcaacgcc accggcttcg ccgagatgac ctacaacctc 240 actagtggcg tgctccacta cgtgcagcag ctcgacaaca tcgtgctccg cgaccgctcc 300 aactgggtgc acggctaccc ggaaatcttc tacggcaaca agccgtggaa cgccaactac 360 gccaccgacg gcccgatccc gctcccgtcc aaggtgtcca acctcaccga cttctacctc 420 accatctcct acaagctcga gccgaagaac ggtctcccga tcaacttcgc catcgagtcc 480 tggctcaccc gcgaggcctg gcgcaccacc ggcatcaact ccgacgagca ggaggtgatg 540 atctggatct actacgacgg cctccagccc gcgggctcca aggtgaagga gatcgtggtg 600 ccgatcatcg tgaacggcac cccggtgaac gccaccttcg aggtgtggaa ggccaacatc 660 ggctgggagt acgtggcctt ccgcatcaag accccgatca aggagggcac cgtgaccatc 720 ccgtacggcg ccttcatctc cgtggccgcc aacatctcct ccctcccgaa ctacaccgag 780 aagtacctcg aggacgtgga gatcggcacc gagttcggca ccccgtccac cacctccgcc 840 cacctcgagt ggtggatcac caacatcacc ctcaccccgc tcgaccgccc gctcatctcc 900 tag 903 <210> 57 <211> 387 <212> PRT <213> Thermus flavus <400> 57 Met Tyr Glu Pro Lys fro Glu His Arg Phe Thr Phe Gly Leu Trp Thr 1 5 10 15 Val Asp Asn Val Asp Arg Asp Pro Phe Gly Asp Thr Val Arg Glu Arg 20 25 30 Leu Asp Pro Val Tyr Val Val His Lys Leu Ala Glu Leu Gly Ala Tyr 35 40 45 Gly Val Asn Leu His Asp Glu Asp Leu lie Pro Arg Gly Thr Pro Pro 50 55 60 Gln Glu Arg Asp Gln lie Val Arg Arg Phe Lys Lys. Ala Leu Asp Glu 65 7? 75 80 Thr Val Leu Lys Val Pro Met Val Thr Ala Asn Leu Phe Ser Glu Pro 85 90 95 Ala Phe Arg Asp Gly Ala Ser Thr Thr Arg Asp Pro Trp Val Trp Ala 100 105 110 Tyr Ala Leu Arg Lys Ser Leu Glu Thr Met Asp Leu Gly Ala Glu Leu 115 120 125 Gly Ala Glu lie Tyr Met Phe Trp Met Val Arg Glu Arg Ser Glu Val 130 135 140 Glu Ser Thr Asp Lys Thr Arg Lys Val Trp Asp Trp Val Arg Glu Thr 145 150 155 160 Leu Asn Phe Met Thr Ala Tyr Thr Glu Asp Gln Gly Tyr Gly Tyr Arg 165 170 175 Phe Ser Val Glu Pro Lys Pro Asn Glu Pro Arg Gly Asp lie Tyr Phe 180 185 190 Thr Thr Val Gly Ser Met Leu Ala Leu lie His Thr Leu Asp Arg Pro 195 200 205 Glu Arg Phe Gly Leu Asn Pro Glu Phe Ala His Glu Thr Met Ala Gly 210 215 220 Leu Asn Phe Asp His Ala Val Ala Gln Ala Val Asp Ala Gly Lys Leu 225 230 235 240 Phe His lie Asp Leu Asn Asp Gln Arg Met Ser Arg Phe Asp Gln Asp 245 250 255 Leu Arg Phe Gly Ser Glu ¦ Asn Leu Lys Ala Gly Phe Phe Leu Val Asp 260 265 270 58 Leu Leu Glu Ser Ser Gly Tyr Gln Gly Pro Arg His Phe Glu Ala His 275 280 285 Ala Leu Arg Thr Glu Asp Glu Glu Gly Val Trp Thr Phe Val Arg Val 290 295 300 Cys Met Arg Thr Tyr Leu lie lie Lys Val Arg Ala Glu Thr Phe Arg 305 310 315 320 Glu Asp Pro Glu Val Lys Glu Leu Leu Ala Ala Tyr Tyr Gln Glu Asp 325 330 335 Pro Ala Thr Leu Ala Leu Leu Asp Pro Tyr Ser Arg Glu ¦Lys Ala Glu 340 345 350 Ala Leu Lys Arg Ala Glu Leu Pro Leu Glu Thr Lys Arg Arg Arg Gly 355 360 365 Tyr Ala Leu Glu Arg Leu Asp Gln Leu Ala Val Glu Tyr Leu Leu Gly 370 375 380 Val Arg Gly 385 <210> 58 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 58 atggggaaga acggcaacct gtgctgcttc tctctgctgc tgcttcttct cgccgggttg 60 gcgtccggcc atcaaatcta cttcgtggag aagtaccaca cctccgagga caagtccacc 120 tccaacacct c'ctccacccc gccgcagacc accctctcca ccaccaaggt gctcaagatc 180 cgctacccgg acgacggtga gtggcccggc gccccgatcg acaaggacgg cgacggcaac 240 ccg'gagttct acatcgagat caacctctgg aacatcctca acgccaccgg cttcgccgag 300 atgacctaca acctcactag tggcgtgctc cactacgtgc agcagctcga caacatcgtg 36Ó ctccgcgacc gctccaactg ggtgcacggc tacccggaaa tcttctacgg caacaagccg 420 tggaácgcca actacgccac cgacggcccg atcccgctcc cgtccaaggt gtccaacctc 480 accgacttct acctcaccat ctcctacaag ctcgagccga agaacggtct cccgatcaac 540 ttcgccatcg agtcctggct" cacccgcgag gcctggcgca ccaccggcat caactccgac 600 gagcaggagg tgatgatctg gatctactac gacggcctcc agcccgcggg ctccaaggtg 660 aaggagatcg tggtgccgat catcgtgaac ggcaccccgg tgaacgccac cttcgaggtg 720 tggaaggcca acatcggctg ggagtacgtg gccttccgca tcaagacccc gatcaaggag 780 ggcaccgtga ccatcccgta cggcgccttc atctccgtgg ccgccaacat ctcctccctc 840 ccgaactaca ccgagaagta cctcgaggac gtggagatcg gcaccgagtt cggcaccccg 900 tccaccacct ccgcccacct cgagtggtgg atcaccaaca tcaccctcac cccgctcgac 960 cgcccgctca tctcctag 978 <210> 59 <211> 1920 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 59 atgtccttcc gctccctcct cgccctctcc ggcctcgtgt gcaccggcct cgccaacgtg 60 atctccaagc gcgccaccct cgactcctgg ctctccaacg aggccaccgt ggcccgcacc 120 gccatcctca acaacatcgg cgccgacggc gcctgggtgt ccggcgccga ctccggcatc 180 gtggtggcct ccccgtccac cgacaacccg gactacttct acacctggac ccgcgactcc 240 ggcctcgtgc tcaagaccct cgtggacctc ttccgcaacg gcgacacctc cctcctctcc 300 accatcgaga actacatctc cgcccaggcc atcgtgcagg gcatctccaa cccgtccggc 360 gacctctcct ccggcgccgg cctcggcgag ccgaagttca acgtggacga gaccgcctac 420 59 accggctcct ggggccgccc gcagcgcgac ggcccggccc tccgcgccac cgccatgatc 480 ggcttcggcc agtggctcct cgacaacggc tacacctcca ccgccaccga catcgtgtgg 540 ccgctcgtgc gcaacgacct ctcctacgtg gcccagtact ggaaccagac cggctacgac 600 ctctgggagg aggtgaacgg ctcctccttc ttcaccatcg ccgtgcagca ccgcgccctc 660 gtggagggct ccgccttcgc caccgccgtg ggctcctcct gctcctggtg cgactcccag 720 gccccggaga tcctctgcta cctccagtcc ttctggaccg gctccttcat cctcgccaac 780 ttcgactcct cccgctccgg caaggacgcc aacaccctcc tcggctccat ccacaccttc 840 gacccggagg ccgcctgcga cgactccacc ttccagccgt gctccccgcg cgccctcgcc 900 aaccacaagg aggtggtgga ctccttccgc tccatctaca ccctcaacga cggcctctcc 960 gactccgagg ccgtggccgt gggccgctac ccggaggaca cctactacaa cggcaacccg 1020 tggttcctct gcaccctcgc cgccgccgag cagctctacg acgccctcta ccagtgggac 1080 aagcagggct ccctcgaggt gaccgacgtg tccctcgact tcttcaaggc cctctactcc 1140 gacgccgcca ccggcaccta ctcctcctcc tcctccacct actcctccat cgtggacgcc 1200 gtgaagacct tcgccgacgg cttcgtgtcc atcgtggaga cccacgccgc ctccaacggc 1260 tccatgtccg agcagtacga caagtccgac ggcgagcagc tctccgcccg cgacctcacc 1320 tggtcctacg ccgccctcct caccgccaac aaccgccgca actccgtggt gccggcctcc 1380 tggggcgaga cctccgcctc ctccgtgccg ggcacctgcg ccgccacctc cgccatcggc 1440 acctactcct ccgtgaccgt gacctcctgg ccgtccatcg tggccaccgg cggcaccacc 1500 accaccgcca ccccga ccgg ctccggctcc gtgacctcca cctccaagac caccgccacc 1560 gcctccaaga cctccacctc cacctcctcc acctcctgca ccaccccgac cgccgtggcc 1620 gtgaccttcg acctcaccgc caccaccacc tacggcgaga acatctacct cgtgggctcc 1680 atctcccagc tcggcgactg ggagacctcc gacggcatcg ccctctccgc cgacaagtac 1740 acctcctccg acccgctctg gtacgtgacc gtgaccctcc cggccggcga gtccttcgag 1800 tacaagttca tccgcatcga gtccgacgac tccgtggagt gggagtccga cccgaaccgc 1860 gagtacaccg tgccgcaggc ctgcggcacc tccaccgcca ccgtgaccga cacctggcgc 1920 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic 60

Claims (1)

  1. 248 REIVINDICACIONES 1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque a) comprende la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39; 41, 43, 46, 48, "50, 52 o 59 o el complemento de la misma, o un polinucleótido que híbrida al complemento de cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 o 59 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de a-amilasa, pululanasa, a-glucosidasa, glucosa isomerasa o glucoamilasa o b) codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 10, 13., 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, . 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 o 51 o un fragmento-enzimáticamente activo de la misma. 2. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido codifica un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido y un segundo péptido, en donde el primer polipéptido tiene actividad de a-amilasa, pululanasa, ot-glucósidasa, glucosa isomerasa o glucoamilasa. 3. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el segundo péptido comprende un péptido de secuencia de señal. 4. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el péptido de secuencia de señal dirige al primer polipéptido a una 249 vacuola, retículo endoplámico, cloroplasto, gránulo de almidón, semilla o pared celular de una planta. 5. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal N-terminal de waxy, una secuencia de señal N-terminal de ?-zeína, un dominio de enlace de almidón o un dominio de enlace de almidón C-terminal. 6. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido híbrida al complemento de cualquiera de la SEQ ID NO : 2, 9 o 52 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de oc-amilasa. 7. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido híbrida al complemento de cualquiera de la SEQ ID NO: 4 o 25 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de puiulanasa. 8. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido híbrida al complemento de la SEQ ID NO: 6 y codifica un polipéptido que tiene actividad de a-glucosidasa . 9. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido híbrida al complemento de cualquiera de la SEQ ID NO: 19, 21, 31, 39, 41 o 43 bajo condiciones de hibridación de ba a 250 severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de glucosa isomerasa. 10. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido hib ida al complemento de cualquiera de la SEQ ID NO: 46, 48, 50 o 59 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa . 11. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 2 o 9, o un complemento de la misma. 12. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 4 o 25, o un complemento de la misma. 13. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende la SEQ ID NO: 6, o un complemento de la misma. 14. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 19, 21, 37,. 39, 41 o 43, o un complemento de la misma. 15. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 46, 48, 50 o 59, o un complemento de la misma . 16. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido a) que tiene la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 o 59 o el complemento de la misma, o un polinucleótido que hibrida al 251 complemento de cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 o 59 bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de a-amilasa, pululanasa, a-glucosidasa, glucosa isomerasa o glucoamilasa o b) codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 o 51 o un fragmento enzim ticamente activo de la misma. 17. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque es operablemente - enlazado a un promotor. 18. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el promotor es un promotor inducible. 19. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el promotor es un promotor especifico de tejido. 20. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el promotor es un promotor especifico de endosperma. 21. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el promotor especifico de endosperma es un promotor de ?-zeina de maíz o un promotor ADP-gpp de maíz. 22. El cásete de expresión de conformidad con la 252 reivindicación 21, caracterizado porque el promotor comprende la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. 23. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polinucleótido está orientado en la orientación de sentido con relación al promotor. 24. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polinucleótido de a) además codifica una secuencia de señal que es operablemente enlazada al polipéptido codificado por el polinucleótido. 25. Él cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia de señal dirige al polipéptido operablemente enlazado a una vacuola, retículo endoplámico, cloroplasto, granulo de almidón, semilla o pared celular de una planta. 26. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal N- terminal de waxy o una secuencia de señal N-terminal de ?- eína. 27. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 25, -caracterizado porque la secuencia de señal es un dominio de enlace de almidón. 28. - El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polinucleótido de 253 b) es operablemente enlazado a un promotor especifico de tej ido . 29. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación ' 28, caracterizado porque el promotor especifico de tejido es un promotor de ?-zeína de Zea mays o un promotor ADP-gpp de Zea mays. 30. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 2 o 9, o un complemento de la misma. 31. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 6 o un complemento de la misma. 32. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 19, 21, 37, 39, 41 o 43, o un complemento de la misma. 33. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 46, 48, 50 o 59, o un complemento de la misma. 34. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 4 o 25, o un complemento de la misma. 35. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuenci?. de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID 254 NO: 10, 13, 14, 15, 16, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 o 51 o un fragmento enzimátic menté active de la misma. 36. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 10, 13, 14, 15, 16, 33, 35 o 51 o un fragmento activo de la misma, que tiene actividad de -amilasa. 37. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 3, 24 o 34 o un fragmento activo de la misma, que tiene actividad de pululanasa 38. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 5, 26 o 27 o un fragmento activo de la misma, que tiene actividad de a-glucosidasa . 39. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 18, 20, 28, 29, 30, 38, 40, 42 o 44 o un fragmento activo de la misma, que tiene, actividad de glucosa isomerasa. 40. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que 255 tiene "la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 45, 47 o 49 o un fragmento activo de la misma, que tiene actividad de glucoamilasa . 41. Un vector, caracterizado porque comprende el · cásete de expresión de la reivindicación 16. 42. Un vector, caracterizado porque comprende el cásete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 30-40. 43. Una célula, caracterizada porque contiene el cásete de expresión de la reivindicación 16. 44. Una célula, caracterizada porque contiene el cásete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 30-40. 45. La célula de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la célula es seleccionada del grupo que consiste de un Agrohacteríum¡ una célula monocotiledónea, una célula dicotiledónea, una célula Liliopsida, una célula Panicoideae, una célula de maíz y una célula de cereal. 46. La célula de' conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la célula es una célula de maiz. 47. La célula de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la célula es seleccionada del grupo que consiste de un Agrobacterium, una célula monocotiledónea, una célula dicotiledónea, una célula Liliopsida, una célula Panicoidaae, una célula de maiz y una célula de cereal. 256 48. La célula de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque la célula es una célula de maíz. 49. Una planta, caracterizada porque es establemente transformada con el vector de la reivindicación 41. 50. Una planta, caracterizada porque es establemente transformada con el vector de. la reivindicación 42. 51. Una planta, caracterizada porque es establemente transformada con un vector que comprende una • a-amilasa que tiene una . secuencia de · aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 o 35, o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 2 o 9. 52. la planta de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la a-amilasa es hipertermofilica. 53. Una planta, caracterizada porque es establemente transformada con un vector que comprende una pululanasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 24 o 34, o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 4 o 25. 54. Una planta, caracterizada porque es establemente transformada con un vector que comprende una -glucosidasa que tiene una secuencia de aminoácidos de 257 cualquiera de la SEQ ID NO: 26 o 27, o codificada por un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 6. 55. La planta de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque la a-glucosidasa es hipertermofilica - 56. Una planta, caracterizada porque es establemente transformada con un vector que comprende una glucosa isomerasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 18, 20, 28, 29, 30, 38, 40, 42 o 44, o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 19, 21, 37, 39, 41 o 43. 57. La planta de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque la a-glucosidasa es hipertermofilica. 58. Una planta, caracterizada porque es establemente transformada con un vector que comprende una glucosa amilasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 45, 47 o 49, o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 46, 48, 50 o 59. 59. La planta de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque la glucosa amilasa es hipertermofilica. 60. Semilla, fruto o grano de la planta de la reivindicación 49. 258 61. Semilla/ . fruto o grano de la planta de la reivindicación 50. 62. Semilla, fruto o grano de la planta de la reivindicación 51. 63. Semilla, fruto o grano de la planta de la reivindicación 53. 64. Semilla, fruto o grano de la planta de la reivindicación 54. 65. Semilla, fruto o grano de la planta de la reivindicación 56. 66. Semilla, fruto o grano de la planta de la reivindicación 58. 67. Una planta transformada, caracterizada porque el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que codifica por lo menos una enzima procesadora operablemente enlazada a Una secuencia de promotor, la secuencia de este polinucleótido que es optimizada para la expresión en la planta. 68. La planta de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque la planta es una monocotiledonea. 6S. La planta de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la una monocotiledonea es maiz. 70. La planta de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque la planta es una dicotiledónea. 71. La planta de conformidad con la reivindicación 259 67, caracterizada porque la planta es una planta de cereal o una planta comercialmente cultivada. 72. La planta de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque la enzima procesadora es seleccionada del grupo que consiste de una a-amilasa, glucoamilasa, " glucosa isomerasa, glucanasa, ß-amilasa, -glucosidasa, isoamilasa, pululanasa, neo-pululanasa, iso-pululanasa, amilopululanasa, celulasa, e??-1,4-ß-celobiohidrolasa, exo-1, 3—ß-D-glucanasa, ß-glucosidasa, endoglucanasa, L-arabinasa, ß-arabinosidasa, galactanasa, galactosidasa, mananasa, manosidasa, xilanasa, xilosidasa; proteasa, glucanasa, xilanasa, esterasa, fitasa y lipasa. 73. La planta de conformidad con la reivindicación 72, caracterizada porque la enzima procesadora es una enzima procesadora de almidón seleccionada del grupo que consiste de una a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, (3-arailasa, a-glucosidasa, isoamilasa, pululanasa, neo-pululanasa, iso-pululanasa y amilopululanasa. 74. La planta de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque la enzima es seleccionada de a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, -glucosidasa y pululanasa-. 75. La planta de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la enzima es hipertermofilica . 76. La planta de conformidad con la reivindicación 260 72, caracterizada porque la enzima es una enzima degradante no de almidón seleccionada del grupo que consiste de proteasa, glucanasa, xilanasa, esterasa, fitasa y lipasa. 77. La planta de conformidad con la reivindicación 76, caracterizada porque la enzima es hipertermofílica. 78. La planta de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque la enzima se acumula en la vacuola, retículo endoplásmico, cloroplasto, gránulo de almidón, semilla o pared celular de una planta. 79. Lá planta de conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque la enzima se acumula en el retículo endoplásmico . 80. La planta dé conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque la enzima se acumula en el gránulo de almidón. 81. La planta de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque el genoma de la cual además es aumentado con un segundo polinucleótido recombinante que comprende una enzima no hipertermofílica. 82. Una planta transformada, caracterizada porque el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que codifica por lo menos una enzima procesadora seleccionada del grupo que consiste de a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, -glucosidasa y pululanasa, operablemente enlazada a una secuencia de promotor, la 261 secuencia de este polinucleótido que es optimizada para la expresión en la planta. 83. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque la enzima procesadora es hipertermofilica . 84. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque la planta es maíz. 85. Una planta de maíz transformada, caracterizada porque el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que codifica por lo menos una enzima procesadora seleccionada del grupo que consiste de a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, -glucosidasa y pululanasa, operablemente enlazada a una secuencia de promotor, la secuencia de este polinucleótido _ que es optimizada para la expresión en la planta de maíz. 86. La planta de maíz transformada de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque la enzima procesadora es hipertermofilica. 87. Una planta transformada, caracterizada porque el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que tiene la SEQ ID NO: 2, 9 o 52, operablemente enlazado a un promotor y a una secuencia de señal. 88. Una planta transformada, caracterizada porque el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que tiene la SEQ ID NO: 4 o 25, operablemente enlazado a un promotor y a una secuencia de señal. 89. Una planta transformada, caracterizada porque el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que tiene la SEQ ID NO: 6, operablemente enlazado a un promotor y a una secuencia de señal. 90. Una planta transformada, caracterizada porque el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante que tiene la SEQ ID NO: 19, 21, 37, 39, 41 o 43. 91. Una planta transformada, caracterizada porque el genoma de la cual es aumentado con un polinucleótido recombinante. que tiene la SEQ ID NO: 46, 48, 50 o 59. · 92. Un producto de la planta transformada de la reivindicación 82. 93. Un producto de la planta transformada de la reivindicación 85. ¦ 94. Un producto de la planta transformada de cualquiera de las reivindicaciones 87-91. 95. El producto de conformidad con 1.a reivindicación 92, caracterizado porque el producto es semilla, fruto o grano . 96. El producto de conformidad con la reivindicación 92, · caracterizado porgue el producto es la enzima procesadora, almidón o. azúcar. 97. Una planta obtenida de la planta de la reivindicación 82. 263 98. Una planta obtenida de la planta de la reivindicación 85. 99. Una planta obtenida de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 87-91. 100. La planta de conformidad con la reivindicación 97, caracterizada porque es una planta híbrida. 101. La planta de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque es una planta híbrida. 102. La planta de conformidad con la reivindicación 99, caracterizada porque es una planta híbrida. 103. La planta de conformidad con la reivindicación 97, caracterizada porque es una planta endogámica. 10 . La planta de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque es una planta endogámica. 105. La planta de conformidad con la reivindicación 99, caracterizada porque es una planta endogámica. 106. Una composición de almidón, caracterizada porque comprende por lo menos una enzima procesadora que es una proteasa, glucanasa o esterasa. 107. La composición de almidón de conformidad ccn la reivindicación 106, caracterizada porque la enzima es hipertermofílica. 108. Grano, caracterizado porque comprende por lo menos una enzima procesadora, que es una -amilasa, pululanasa, a-glucosidasa, glucoamilasa o glucosa isomerasa. 109. El grano de conformidad con la reivindicación 108,· caracterizado porque la enzima es hipertermofilica . 110. Un método para preparar granulos de almidón, caracterizado porque comprende; a) tratar el grano que comprende por lo menos una enzima procesadora no de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, produciendo una mezcla que comprende gránulos de almidón y productos de degradación no de almidón, en donde el grano es obtenido de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima y b) separar los gránulos de almidón de la mezcla. 111- El método de conformidad con la reivindicación 110,- caracterizado porque la enzima es una proteasa, glucanasa, xilanasa, fitasa o esterasa. 112. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque la enzima es hipertermofilica . 113. El método de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque el grano es grano quebrado. 11 . El método de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque el grano es tratado bajo condiciones de baja humedad. 115. El método de conformidad con la reivindicación 265 110, caracterizado porque el grano es tratado bajo condiciones de alta humedad. 116. El método de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque el grano es tratado con dióxido de azufre . 117. El método de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque además comprende la separación de los ' productos no de almidón de la mezcla. 118. Almidón obtenido por el método de la reivindicación 110. 119. Almidón obtenido por el método de la reivindicación 112. 120. Productos no de almidón obtenidos por el método de la reivindicación 110. 121. Productos no de almidón obtenidos por el método de la reivindicación 112. 122. Un método para producir maíz hiperdulce, cáracterizado porque comprende tratar el maíz transformado a una parte del mismo, el genoma del cual es aumentado con, y expresa en el endosperma un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima degradante de almidón o isomerizante de almidón, bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para convertir polisac ridos en el maíz en azúcar, produciendo maíz hiperdulce. 123. El método de conformidad con la reivindicación 266 122, caracterizado porque el cásete de expresión además comprende un promotor operablemente enlazado al polinucleótido que codifica l enzima. 124. El método de. conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque el promotor es un promotor constitutivo . 125. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque el promotor es un promotor especifico de semilla. 126. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque . el promotor es un promotor especifico de endosperma. 127. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque la enzima es hipertermofilica. 128. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la enzima es a-amilasa. 129. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el cásete de expresión además comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de señal operablemente enlazada a la por lo menos una enzima. 130. El método de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado porque la secuencia de señal dirige la enzima hipertermofilica al apoplasto. 131. El método de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado perqué la secuencia de señal dirige la 267 enzima hipertermofilica al retículo endoplásmico . 132. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque la enzima comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 33 o 35. 133. Un método para producir maíz hiperdulce, caracterizado porque comprende tratar el maíz transformado o una parte del mismo, el genoma del cual es aumentado con, y expresa en el endosperma- un cásete de expresión que codifica una a-amilasa, bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para convertir polisacáridos en el maíz en azúcar, produciendo maíz hiperdulce. 134. El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque la enzima es hipertermofílica. 135. El método de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado porque la a-amilasa hipertermofílica comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 10, 13, 14, 15, 16, 33 o 35, o un fragmento enzimáticamente activo de la misma que tiene actividad de -amilasa. 136. El método de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado porque el cásete de expresión comprende un polínucleótído seleccionado de cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 9 o.52, o un complemento de la misma, o un polinucleótido que híbrida a cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 9 o 52, bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un 268 polipéptido que tiene actividad de a-amilasa. 137. Un método para preparar una solución de producto de almidón hidrolizado, caracterizado porque comprende; a) tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una enzima procesadora bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para de esta manera procesar los gránulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende producto de almidón hidrolizado, en donde ¦ la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de almidón; y b) colectar la sólución acuosa que comprende el producto de almidón hidrolizado. 138. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el producto de almidón hidrolizado comprende una dextina, maltooligosacárido, azúcar y/o mezclas de los mismos. 139. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque la enzima es a-amilasa, a-glucosidasa, glucoamxlasa, pululanasa, amilopululanasa, ' glucosa isomerasa., ß-amilasa, isoamilasa, neopululanas , 269 iso-pululanasa o cualquier combinación de las mismas. 140. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque la por lo menos una enzima procesadora es hipertermofilica . 141. El método de conformidad con la reivindicación 139, caracterizado porque la por lo menos una enzima procesadora es hipertermofilica . 142. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el genoma de la parte de planta es además aumentado con un cásete de expresión que codifica una enzima procesadora de almidón no hipertermofilica. 143. El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque la enzima procesadora de almidón no hipertermofilica es seleccionada del grupo que consiste de amilasa, glucoamilasa, a-glucosidasa, puiulanasa, glucosa isomerasa, o una combinación de las mismas. 144. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque ' la por lo menos una enzima procesadora es expresada en el endosperma. · 145. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque la parte de planta es grano. 146. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque la parte de planta es de maíz, trigo, cebada, centeno, avena, caña de azúcar o arroz. 147. El método de conformidad con la reivindicación 270 137, caracterizado porque la por lo menos una enzima procesadora es operablemente enlazada a un promotor y a una secuencia de señal que dirige la enzima al gránulo de almidón o al retículo endoplásmico, o a la pared celular. 148. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque además comprende aislar el producto de almidón hidrolizado . 149. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque además comprende fermentar el producto de almidón hidrolizado. 150. Un método para preparar producto de almidón hidrolizado, caracterizado porque comprende a) tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una enzima procesadora de almidón, bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima para de esta manera procesar los gránulos de almidón para formar una solución acuosa qúe comprende un producto de almidón hidrolizado, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica por lo menos una -amilasa; y b) colectar la solución acuosa que comprende el producto de almidón hidrolizado. 271 151. El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado porque la -amilasa es hipertermofilica . 152. El método de conformidad con la reivindicación 151, caracterizado porque la a-amilasa hipertermofilica comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 o 35, o un fragmento activo de la misma, que tiene actividad de a-amilasa. 153. El método de conformidad con la reivindicación 151, caracterizado porque el cásete de expresión comprende un polinucleótido seleccionado de cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 9, 46 o 52, o complemento de la misma, o un polinucleótido que híbrida a cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 9, 46 o 52, bajo condiciones de hibridación de baja severidad y codifica un polipéptido que tiene actividad de oí-amilasa. 154. El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado porque el genoma de la planta transformada además comprende un polinucleótido que codifica una enzima procesadora de almidón no hipertermofilica. 155. El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado porque además comprende tratar la parte de planta con una enzima procesadora de almidón no hipertermofilica. 156. Una parte de planta transformada, caracterizada porque comprende por lo menos una enzima procesadora de almidón presente en las células de la planta, 272 en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de almidón. 157. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 156, caracterizada porque la enzima es una enzima procesadora de almidón seleccionada del grupo que consiste de a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, ß-amilasa, a-glucosidasa, isoamilasa, pulunasa, neo-pululanasa, iso-pululanasa y' amilopululanasa . 158. La parte de planta de conformidad con "la reivindicación 156, caracterizada porque la enzima es hipertermofilica. 159. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 156, caracterizada porque la planta es maiz. 160. Una parte ' de planta transformada, caracterizada porque comprende por lo menos una enzima procesadora no de almidón presente en la pared celular o las células de la planta, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora no de almidón o por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón. 161. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 160, caracterizada porque la enzima es 273 hipertermofilica . 162. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 160, caracterizada porque la enzima procesadora no de almidón es seleccionada del grupo que consiste de proteasa, glucanasa, xilanasa, esterasa, fitasa y lipasa. 163. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 156 o 160, caracterizada porque es una mazorca, semilla, fruto, grano, forraje, paja o bagazo. 164. Una parte de planta transformada, caracterizada porque comprende una -amilasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 o 35, o codificada por un polinucleotido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 9, 46 o 52. 165. Una parte' de planta transformada, caracterizada porque comprende una a-glucosidasa que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 5, 26 o 27, o codificada por un polinucleotido que comprende la SEQ ID NO: 6. 166. Una parte de planta transformada, caracterizada porque comprende una glucosa isomerasa que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 28, 29, 30, 38, 40, 42 o 44, o codificada por un polinucleotido que comprende 'cualquiera de la SEQ ID NO: 19, 274 21, 37, 39, 41 o 43. 167. Una parte de planta transformada, caracterizada porque comprende una glucoarailasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45, o SEQ ID NO: 47, o SEQ ID NO: 49, o codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 46, 48, 50 o 59. 168. Una parte de planta transformada, caracterizada porque comprende una pululanasa codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 4 o 25. 169. Un método para convertir almidón en la parte de planta transformada de la reivindicación 156; caracterizado porque comprende activar la enzima procesadora de almidón -contenida en la misma. 170. Un método para convertir almidón a producto derivado de almidón en la parte de planta transformada de la' cualquiera de las reivindicaciones 164-168, caracterizado porque comprende activar la enzima contenida en la misma. 171. Almidón, dextrina, maltooligosacárido o azúcar producido de conformidad con el método de la reivindicación 169. 172. Almidón, dextrina, maltooligosacárido o azúcar producido de conformidad con el método de la reivindicación 170. 173. Un método para usar una parte de planta 275 transformada que comprende por lo menos una enzima procesadora no de almidón en la pared celular o la célula de la parte de planta, caracterizado porque comprende: a) tratar una parte de planta transformada que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima, para de esta manera digerir el polisacárido no de almidón para formar una solución acuosa que comprende oligosacárido y/o azúcares, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de polisacárido no de almidón; y b) colectar la solución acuosa que comprende los oligosacáridos y/o azúcares. 174. El método de conformidad con la reivindicación 173, caracterizado porque la enzima procesadora de polisacárido no de almidón es hipertermofilic . 175. Un método para usar semillas transformadas que comprenden por. lo menos una enzima procesadora, caracterizado porque comp ende; a) tratar semillas transformadas que comprenden por lo menos una proteasa o lipasa bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima, que produce una mezcla acuosa que comprende aminoácidos y ácidos grasos, en donde la semilla es obtenida de .una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima; y b) colectar la mezcla acuosa. 176. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque los aminoácidos, ácidos grasos o ambos, son aislados. 177. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque la por lo menos una proteasa o lipasa es hipertermofilica . 178. Un método para preparar etanol, caracterizado porque comprende: a) tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima, para de esta manera digerir el polisacárido para formar oligosacárido o azúcar fermentable, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que 277 codifica La por lo menos una enzima procesadora de polisacárido; e b) incubar el azúcar fermentable bajo condiciones que promueven la conversión del azúcar fermentable u oligosacárido en etanol. 179. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la parte de planta es un grano, fruto, semilla, tallos, madera, vegetal o raíz. 180. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la parte de planta es obtenida de una planta seleccionada del grupo que consiste de avenas,' cebada, trigo, baya, vids, centeno, maiz, arroz, papa, remolacha, caña de azúcar, piña, hierbas y árboles. 181. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la enzima procesadora de polisacárido es a-amilasa, glucoamilasa, ot-glucosidasa, glucosa isomerasa, pululanasa, o una combinación de" las mismas . 182. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la enzima procesadora de polisacárido es hipertermofilica . 183. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la enzima procesadora de polisacárido es mesofilica. 184. El método de conformidad con la reivindicación 278 181, caracterizado porque la enzima procesadora de polisacárido es hipertermofilic . 185. Un método para preparar etanol, caracterizado porque comprende: a) tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima seleccionada del grupo que consiste de a-amilasa, glucoamilasa, a-glucosidasa, glucosa isomerasa o pululanasa, o una combinación de las mismas, con calor durante una cantidad de tiempo y bajo condiciones para activar la por · lo menos una enzima para digerir de esta manera el polisacárido para formar azúcar fermentable, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada,- el genoma de la cual es aumentado con ' un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima; e b) incubar el azúcar fermentable bajo condiciones que promueven la conversión del azúcar fermentable en etanol. 186. El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque la por lo menos una enzima es •hipertermofilica., 187. El método, de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque la por lo menos una enzima es 279 mesofilica. 188. El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque la a-amilasa tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 o 35, o es codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 2 o 9. 189. El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque la a-glucosidasa tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 5, 26 o 27, o es codificada por un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 6. 190. El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque la glucosa isomerasa tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 28, 29, 30, 38, 40, 42 o 44, o es codificada por un polinucleótido que comprende cualquier de la SEQ ID NO: 19. 21, 37, 39, 41 o 43. 191. El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque la glucoamilasa tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45, o es codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 46, 48, 50, o 59. 192. El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque la pululanasa" tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ TD NO: 24 o 34, o es codificada por un 280 polinucleótido que comprende cualquiera de la SEQ ID- NO: 4 o 25. 193. Un método para preparar etanol, caracterizado porque comprende: a) tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima procesadora no de almidón baj-o condiciones para activar la por lo menos una enzima, para de esta manera digerir el polisacárido no de almidón a oligosacárido y azúcar fermentable, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima; e b) incubar el azúcar fermentable bajo condiciones que promueven la conversión del azúcar fermentable en etanol. 194. El método de conformidad con la reivindicación 193, caracterizado porque la enzima procesadora no de almidón es glucanasa, xilanasa o celula-sa. 195. Un método para preparar etanol, caracterizado porque comprende: a) tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima seleccionada del grupo que consiste de a-amilasa, . glucoamilasa, a-glucosidasa, glucosa isomerasa, o pululanasa, o una combinación de las mismas, bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima .para digerir de esta manera el polisacárido para formar azúcar fermentable, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima; e b) incubar el azúcar fermentable bajo condiciones que. promueven la conversión . del azúcar fermentable en etanol. 196. El método de conformidad con la reivindicación 195, caracterizado porque la por lo menos una enzima es ipertermofilica . 197. Un método para producir un producto alimenticio harinoso endulzado, sin adicionar edulcorante adicional, caracterizado porque comprende: a) tratar una parte de planta que comprende por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para procesar de esta manera los gránulos de almidón en la parte de planta a azúcares para formar un producto endulzado, en donde la parte de planta es obtenida de una 282 planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima; y b) procesar el producto endulzado en un producto alimenticio harinoso. 198. El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado porque el producto alimenticio harinoso es formado del producto endulzado y agua. 199. El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado porque el producto alimenticio harinoso contiene malta, saborizantes, vitaminas, minerales, agentes' colorantes o cuálquier combinación de los mismos. 200. El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado porque la por lo menos una enzima és hipertermofilica. 201. El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado porque la enzima es oc-amilasa, a-glucosidasa, glucoamilasa, pululanasa, glucosa isomerasa, o una combinación de las mismas. 202. El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado porque la planta es seleccionada del grupo que consiste de soya, centeno, avenas, cebada, trigo, maíz, arroz y caña de azúcar. 203. El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado porque el producto alimenticio harinoso es 283 un alimento de cereal. 204. El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado porque el producto alimenticio harinoso es un alimento de desayuno. 205. El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado porque el producto alimenticio harinoso es un alimento listo para comer. 206. El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado porque el producto alimenticio harinoso es un alimento horneado. 207. El método de conformidad con la reivindicación. 197, caracterizado porque el procesamiento es por medio de horneado, ebullición, calentamiento, vaporización, descarga eléctrica o cualquier combinación de los mismos. 208. Un método para endulzar un producto que contiene almidón, sin adicionar edulcorante, caracterizado porque comprende: a) tratar almidón que comprende por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones para activar la por lo menos una enzima, para digerir de esta manera el almidón para formar un azúcar para formar almidón endulzado, en donde el almidón es obtenido de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que 284 codifica la por lo menos una enzima; y b) adicionar el almidón endulzado a un producto para producir un producto que contiene almidón endulzado - 209. El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque la planta transformada es seleccionada del grupo que consiste de maíz, soya, centeno, avenas, cebada, trigo, arroz y caña de azúcar. 210. El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque la por lo menos una enzima es hipertermofílica. 211. El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque la que por lo menos una enzima es a-amilasa, a-glucosidasa, glucoamilasa, pululanasa, glucosa isomerasa, o una combinación de las mismas. 212. Un producto alimenticio harinoso obtenido por el método de la reivindicación 197. 213. Un producto ' que contiene almidón endulzado obtenido por el método de la reivindicación 208. 214. Un método para endulzar un fruto o vegetal que contiene polisacárido, caracterizado porque comprende tratar un fruto o vegetal que comprende por lo menos una enzima procesadora de polisacárido bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para procesar de esta manera el polisacárido en el fruto o vegetal para formar azúcar, 285 produciendo un fruto vegetal endulzado, en donde el fruto o vegetal es obtenido de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora de polisacárido . 215. El método de conformidad con la reivindicación 214, caracterizado porque el fruto o vegetal es seleccionado del grupo que consiste de papa, tomate, banana, calabaza, guisantes y frijoles. 216- El método de conformidad con la reivindicación 214, caracterizado porque la por lo menos una enzima es hipertermofilica. 217. El método de conformidad con la reivindicación 214, caracterizado porque la enzima es a-amilasa, a-glucosidasa, ' glucoamilasa, pululanasa, glucosa isomerasa, o cuasiquier combinación de las mismas. 218. Un método para preparar una solución acuosa que comprende azúcar, caracterizado porque comprende tratar gránulos de almidón obtenidos de la parte de planta de la reivindicación 156 bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para producir de esta manera una solución acuosa que comprende a,zúcar. 219. Un método para preparar productos derivados de almidón a partir de grano, que no involucra molienda húmeda o seca del grano antes de la recuperación de los productos derivados dé almidón, caracterizado porque comprende; a) tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para procesar de esta manera los granulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende dextrinas o azúcares, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la . por lo menos una enzima procesadora de almidón; y b) colectar la solución acuosa que comprende el producto derivado de almidón. 220. El método de conformidad con la reivindicación 219, caracterizado porque la por lo menos una enzima procesadora de almidón es hipertermofilica . 221. Un método para aislar una a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, a-glucosidasa y pululanasa, caracterizado porque comprende cultivar la planta transformada de la reivindicación 82 y aislar la a-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, a-glucosidasa y pululanasa de la misma. 222. El método de conformidad con la reivindicación 221, caracterizado porque la a-amilasa, glucoamilasa, glucosa 287 isomerasa, ot-glucosidasa y pululanasa es hipertermofilica. 223. Un método para preparar maltodextrina, caracterizado porque comprende: a. ) mezclar grano transgénico con agua; b. ) calentar la mezcla c. ) separar el sólido del jarabe de dextrina generado en (b) y d. ) colectar la maltodextrina. 224. El método de conformidad con la reivindicación 223, caracterizado porque el grano transgénico comprende por lo menos una.enzima procesadora de almidón. ' 225. Él método de conformidad con la reivindicación 224, caracterizado porque la enzima procesadora de almidón es a-amilasa, glucoamilasa, a-glucosidasa y glucosa isomerasa. 226. El método de conformidad con la reivindicación 225, caracterizado porque por lo menos una de las enzimas procesadoras de almidón es hipertermofilica. 227. Maltodextrina, caracterizada porque se produce por el método de cualquiera de las reivindicaciones 223-226. 228. Una composición de maltodextrina, caracterizada porque se produce por el método de cualquiera de las reivindicaciones 223-226. 229. Un método para preparar dextrinas, o azúcares a partir de grano, que no implica rotura mecánica del grano antes de la recuperación del producto derivado de almidón, 288 caracterizado porque comprende: a) tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una ensima procesadora de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para procesar de esta manera los gránulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende dextrinas o azúcares, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora; y b) colectar la solución acuosa que comprende azúcar y/o dextrinas. 230- El método de cónformidad con la reivindicación 229, caracterizado porque la enzima procesadora de almidón es a-amilasa, glucoamilasa, a-glucosidasa y glucosa isomerasa. 231. Un método para producir azúcar fermentable, caracterizado porque comprende: a) tratar una parte de planta que comprende gránulos de almidón y por lo menos una enzima procesadora de almidón bajo condiciones que activan la por lo menos una enzima, para procesar de esta manera los gránulos de almidón para formar una solución acuosa que comprende dextrinas o azúcares, en donde la parte de planta es obtenida de una planta transformada, el genoma de la cual es aumentado con un cásete de expresión que codifica la por lo menos una enzima procesadora; y b) colectar la solución acuosa que comprende el azúcar fermentable. 232. El método de conformidad con la reivindicación 249, caracterizado porque la enzima procesadora de almidón es" a-ámilasa, glucoamilasa, -glucosidasa y glucosa isomerasa. 233. Una planta de maíz, caracterizada porque es establemente transformada con un vector que comprende una a-amilasa ipertermofilica. 234. Una planta de maíz, caracterizada porque es establemente transformada con un vector que comprende una secuencia de polinucleótido ' que codifica a-amilasa que es mayor que 60% idéntica a la SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 51.
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