CN101605809A - 淀粉吸附区域及其用途 - Google Patents

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CN101605809A CNA2006800562500A CN200680056250A CN101605809A CN 101605809 A CN101605809 A CN 101605809A CN A2006800562500 A CNA2006800562500 A CN A2006800562500A CN 200680056250 A CN200680056250 A CN 200680056250A CN 101605809 A CN101605809 A CN 101605809A
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吕平江
孙玉珠
许嘉钦
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Abstract

本发明涉及淀粉吸附区域，重组蛋白质及其组合物。本发明还涉及分离含有淀粉吸附区域的重组蛋白质的方法。

Description

淀粉吸附区域及其用途
技术领域
本发明涉及淀粉吸附区域，重组蛋白质及其组合物。本发明还涉及分离包含淀粉吸附区域的重组蛋白质的方法。
背景技术
利用微生物系统表达蛋白质已成为制造高价、重要医药蛋白质的主要来源，而如何纯化和回收重组蛋白质则为发酵工艺设计上的重要考虑。传统的蛋白质纯化方法可用以纯化单一产物，改良的方法，更进一步包括使用重组蛋白质。重组蛋白质可通过亲和性管柱层析法加以纯化，所欲纯化之重组蛋白质之成份可通过其与亲和性基质上结合的多肽形成共价性链接而被纯化。
某些系统通过亲和性管柱层析的原理来分离蛋白质。
美国专利第5643758号揭示一种包含麦芽糖结合蛋白质(MBP)的系统。将克隆基因插入pMAL载体内可产生MBP的malE基因下游。将此载体转载至宿主细胞，在宿主细胞中表达该重组蛋白质。将细胞溶离物或培养基分层载入含有亲和性基质-直链淀粉的管柱中并洗涤数次，再使用大量的麦芽糖溶离重组蛋白质。
美国专利第5202247号说明一种包含纤维素吸附区域的系统。纤维素管柱可用于纯化含有纤维素吸附区域的重组蛋白质。将细胞溶离物或培养基分层载入该管柱并加以洗涤。纤维素吸附区域和纤维素间的交互作用来自于彼此间在中性pH值下的疏水性交互作用所产生。一般使用低极性溶液，如乙二醇，进行溶离，之后再以透析和过滤移除低极性溶剂。
此等现行的蛋白质纯化系统的缺点包括：其纯化过程不方便且费力、用于纯化的管柱昂贵。此等蛋白质纯化系统的限制包括：不能在某些条件之下纯化重组蛋白质，例如：含EDTA的样本、使用的蛋白质卷标比标的蛋白质大，而本发明的蛋白质标签较现有的蛋白质标签小。
发明内容
本发明涉及一种淀粉吸附区域(starch binding domain)，其具有如下显示于SEQ ID Nos.1、2或3的氨基酸序列；
SEQ ID No.1：
ASIPSSASVQ LDSYNYDGST  FSGKIYVKNI  AYSKKVTVVYADGSDNWNNN     GNIIAASFSG  PISGSNYEYW  TFSASVKGIKEFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS；
SEQ ID No.2：
ASIPSSASVQ LDSYNYDGST  FSGKIYVKNI  AYSKKVTVIYADGSDNWNNN     GNTIAASYSA  PISGSNYEYW  TFSASINGIKEFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS；或
SEQ ID No.3：ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNIAYSKKVTVIY  ANGSDNWNNN  GNTIAASYSA PISGSNYEYWTF SASINGIK EFYIKYEVS G KTYYDNNNSA NYQVSTS；
或其SEQ ID NO.1、2或3的等位变体及衍生物，其具有淀粉吸附能力者。
本发明中的淀粉吸附区域可取得自同类的碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Module)，如：CBM20或CBM21。本发明一实施例中，淀粉吸附区域可取自CBM21葡萄糖淀粉酶的淀粉吸附区域。本发明较佳的实施例中，淀粉吸附区域可取自根霉属(Rhizopus spp.)。本发明的更佳实施例中，淀粉吸附区域可取自根霉属(Rhizopus spp.)的葡萄糖淀粉酶的淀粉吸附区域。
本发明的淀粉吸附区域包含配体结合位置(或碳水化合物结合位置)，该部位位于芳香性基团上，而该芳香性基团则位于用以和碳水化合物结合的氨基酸序列上第32、47、58、67、83、93和94残基的酪氨酸或/及色氨酸上。本发明的较佳实施例中，活性位点为残基32酪氨酸、残基47色氨酸、残基58酪氨酸、残基83酪氨酸、残基93酪氨酸和残基94酪氨酸。
本发明还涉及一种重组蛋白质，其包含下列序列：
(SBD)m-Ln-X-L’p-(SBD)q
SBD指淀粉吸附区域，L指连接子，L’指连接子，X指目标蛋白质或多胜肽，m为0、1或2，n为0或1，p为0或1，q为0、1或2，其中m和q不会同时为0。
本发明的较佳实施例中，该连接子为RoLK(Rhizopus oryzae GA的连接子)；PH：六个组氨酸；PK：八个赖氨酸；PPT：一个苏氨酸及四个脯氨酸-苏氨酸重复序列[T(PT)4]；或58L：在载体pET39b(+)上介于限制酶切位SpeI及NcoI间的区域。
本发明亦关于一种复合物，其包含下列序列：
(SBD)m-X-(SBD)q
SBD指淀粉吸附区域，X指碳水化合物，m为0、1或2，q为0、1或2，其中淀粉吸附区域利用不同部位同时和碳水化合物结合。
本发明的较佳实施例中，其中X为碳水化合物，其结构包含α-1，4-葡萄糖键接或α-1，6-葡萄糖键接。本发明的更佳实施例中，其碳水化合物为寡醣或环状碳水化合物。其中该淀粉吸附区域和碳水化合物系用配体结合位置(碳水化合物结合位置)或构型方式结合。该淀粉吸附区域包含多个单位系依据碳水化合物的大小决定。
本发明进一步关于一种用以纯化如前所述包含淀粉吸附区域重组蛋白质的方法，其包含：a.将含有重组蛋白质d生物液体直接施加于亲和性基质；和b.调整温度、pH值、离子强度、含糖浓度或酵素组成以溶离重组蛋白质。
本方法中的亲和性基质在其任意部分结构，包含主链、侧链或经修饰残基的内包含下式：
(X-X)n
X指葡萄糖分子，葡萄糖和葡萄糖间的键接为α-1，4-键接或α-1，6-键接，且n为1或大于1。本发明的较佳实施例中，其该亲和性基质为淀粉，温度改变范围指37℃或更高，且步骤a于0～25℃下操作。
附图说明
图1显示SBD-L-eGFP及eGFP-L-SBD重组蛋白质的载体；
图2显示以聚丙烯胺胶体电泳分析于大肠杆菌表达的SBD-PK-eGFP及SBD-PPT-eGFP融合蛋白质的纯化结果；
图3显示以聚丙烯胺胶体电泳分析于大肠杆菌表达的eGFP-PK-SBD及eGFP-PPT-SBD融合蛋白质的纯化结果；
图4显示以聚丙烯胺胶体电泳分析纯化后的融合蛋白质；
图5显示以改良的淀粉层析管柱法纯化SBD-PH-eGFP的结果；
图6显示pH值对于SBD-PH-eGFP和玉米淀粉吸附能力的效用；
图7显示温度对于融合蛋白质和玉米淀粉吸附能力的效用。(A)SBD位于重组蛋白质的N端；(B)SBD位于重组蛋白质的C端；
图8显示RoCBM21的NMR光谱。A：RoCBM21在1H-15N HSQC光谱中的指认酰胺共振图。除了和Y12重叠的Q10及和E87重叠的Y86之外，所有的骨架酰胺峰皆以解出。B：残基F21到Y26在HNCACB光谱中的实例指认条带。Cα为正相位峰(黑色)，Cβ为负相位峰(灰色)。C及D：位于N-折板的反向平行之二及结构及其突出物及C-折板的环状物。粗箭头为NOEs；粗双箭头为条带间的Hα-HαNOEs；细双箭头为条带间的酰胺质子及酰胺质子NOEs；细箭头为条带间的Hα至酰胺质子NOEs；虚线为条带间的氢键。环状区域中的NOEs未标示；
图9显示RoCBM21在溶液中的结构。A：RoCBM21组合的立体视图。RoCBM21之前示图以N端环状物在上、C端环状物在下。B及C显示RoCBM21的N-折板端及C-折板端的β-三明治折迭图。D及E为B及C的表面图示；
图10显示SBD的第一类及第二类拓朴结构。红、橙、黄、绿、蓝、紫分别代表在RoCBM21上的八个β-条带及其在其它SBD中相对应的条带。以紫色标示的条带七及八会和条带六形成氢键。在TvCBM34I的N端前二个β-条带间额外的环状物为粉红色。A：SBDs的一级结构。其二级结构依前述原则标示。B：第一类及第二类拓朴结构的结构概视图。条带的顺序如A所述并标示于第二类拓朴结构的上端。C：第一类(如AnCBM20)及第二类(如RoCBM21)拓朴结构的三度空间构造；
图11显示RoCBM21的配体结合和配体嵌合的研究。A：以配体β-环状糊精选汰前(黑色峰)及选汰后(红色峰)的RoCBM21 1H-15N异核单量子关系光谱(HSQC spectrum)，具较大化学位移扰动的高峰以绿色箭头标示。B：权重平均化学位移扰动依残基数目而改变。黑色、浅黄色、及红色分别代表麦芽三糖、麦芽七糖、β-环状糊精。星号代表位于poly-N loop中其化学位移扰动改变高于0.1的天冬酰氨酸残基(asparagine，N)。扰动临界值定为高于0.1及0.06-0.1(横截面)。C：显示位于RoCBM21结构上依选汰而改变之残基。化学位移改变高于0.06的残基列为显著影响者，以绿色标示；化学位移改变高于0.1者(因此假定其在配体结合时扮演重要角色)，以柱状结构标示。D：显示二个β-环状糊精分子与RoCBM21的嵌合。E及F显示cyclomaltohexaicosaose(v-直链淀粉)与RoCBM21的嵌合。E、F分别为RoCBM21与v-直链淀粉嵌合的结构概视图及表面图。在E中蛋白质条带为黄色，v-直链淀粉以球-棍模式显示。在F中蛋白质为黄色，v-直链淀粉为白色；
图12显示RoGACBM21-βCD复合物的结晶；
图13显示RoGACBM21-βCD的复合物。
具体实施方式
以下实施例为非限制性的，仅作为本发明各个方面及特征的典型实例。
微生物菌株及质体
以大肠杆菌Escherichia coli Top10F’(F’{proABlacIq，lacZΔM15，Tn10(TetR)}mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，80lacZΔM15，ΔlacX74，deoR，recA 1，araD139，Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(StrR)endA 1，nupGλ-)做为载体构建及DNA操作的寄主细胞。
以大肠杆菌Escherichia coli BL21-
Figure A20068005625000101
(DE3)(Stratagene，USA)(BF-ompT hsdS(rB -mB -)dcm+Tetr galλ(DE3)endA Hte[argUproL Camr][argUileYleuWStrep/Specr])做为生产融合蛋白质的之寄主细胞。
载体pET-23a(+)(Novagen，USA)中的T7启动子做为在大肠杆菌中表现融合蛋白质及序列分析之用。
细菌培养
将大肠杆菌培养于含有50μg/ml氨苄西林(ampicillin)的Luria-Bertani(LB)培养基[1％(w/v)tryptone，2％(w/v)酵母菌萃取物，2％(w/v)氯化钠，pH 7.5]中，另以含有1.5％洋菜及50μg/ml氨苄西林的固态LB培养基于37℃筛选转形菌株。
实施例1
(A)质粒的构建
重组载体的构建如图1所示。eGFP、连接子及SBD片段皆以设计的引物通过PCR扩增产生，其引物序列如表1所示。连接子序列可由以下五种候选序列取代(RoLK：Rhizopus oryzae GA的连接子、PH：六个组氨酸、PK：八个赖氨酸、PPT：一个苏氨酸及四个脯氨酸-苏氨酸重复序列[T(PT)4]及58L：在载体pET39b(+)上介于限制酶切位SpeI and NcoI间的区域)。PCR反应的过程如下：混合10ng模板，0.5μl各引物(10μM)，5μl反应缓冲液(10×)，5μl脱氧核苷酸(2.5mM)，0.8μl Ex Taq DNA聚合酶(Takara Mirus Bio，Japan，5U/μl)，加水至50μl终体积。此混合物依下列循环反应：1循环的95℃/5分钟→30循环的[95℃/30秒(高温变性)，53℃/30秒(引物黏合)，72℃/20秒至2分钟(聚合反应)]→和1循环的72℃/5分钟。
表1合成寡核苷酸引物
Figure A20068005625000121
限制酶切位以底线标示。
将前一步骤取得的片段与
Figure A20068005625000131
-T Easy载体(Promega，USA)进行接合反应。混合100ng嵌入DNA片段，1μl载体，1μl接合酶缓冲液[66mMTris-HCl(pH 7.6)，6.6mM MgCl2，10mM DTT，0.1mM ATP]及1μl T4接合酶(Takara Mirus Bio，Japan)，加双蒸水至10μl终体积，置于16℃反应16小时。将接合反应产物转载至大肠杆菌胜任细胞，具有T-载体及所欲克隆序列的转载菌株可通过蓝白菌落筛选得到。大量培养克隆后的菌落，以Gene-SpinTM Miniprep Purification Kit(Protech，Taiwan)纯化质粒，纯化后的质粒以特定限制酶裁剪后，以1％洋菜胶体电泳/1×TAE缓冲液(40mM Tris Base，40mM醋酸和1mM EDTA)于100V下分析处理后的DNA片段大小。随后以EtBr(ethidium bromide，0.5mg/ml)溶液进行胶体染色10分钟，DNA片段即可显示于UV灯之下。将欲得的片段以Gel/PCR DNAfragment extraction kit (Geneaid Biotech，Taiwan)纯化后可供后续实验使用。
在进行接合反应之前，载体pET-23a(+)先通过特定限制酶裁剪。为了构建SBD于5’端，载体先以NdeI及EcoRI裁剪，含有SBD及连接子之DNA片段再以NdeI及KpnI裁剪，含有eGFP之DNA片段则以KpnI及EcoRI裁剪。另一方面，为了构建SBD于3’端，载体先以EcoRI andXhoI裁剪，含有eGFP及连接子的DNA片段则以EcoRI及HindIII裁剪，而含有SBD及连接子的DNA片段以HindIII及XhoI裁剪。将接合反应产物转载至大肠杆菌E.coli Top10F’胜任细胞进行DNA操作及序列确认，之后再转载至大肠杆菌E.coli BL21-
Figure A20068005625000132
(DE3)。
(B)胜任细胞的制备及大肠杆菌转载
以Mandel及Higa于1970年研发的氯化钙转载技术用于制备大肠杆菌胜任细胞[E.coli Top10F’及BL21-
Figure A20068005625000133
(DE3)]。将100μl分装好的冷冻大肠杆菌细胞接种于含有50μg/ml四环素(tetracycline)的5ml LB培养基中，于37℃培养16小时，再取100μl过夜培养的细胞，培养于含有四环素的5ml新鲜LB培养基，于37℃培养，待OD600达到0.5～0.6。的后以16,000xg于4℃离心5分钟以收集细胞，再以10ml冰氯化钙溶液(100mM)重新悬浮离心后的细胞。将重新悬浮的细胞置于冰水浴中30分钟后再离心，离心后以500μl含有15％甘油的冰氯化钙溶液小心缓慢的重新悬浮沉淀的细胞约3小时，以完成胜任细胞的制备。
大肠杆菌的转载是将100μl分装的胜任细胞和10μl接合反应产物混合，静置于冰上30分钟，在热休克步骤中以42℃处理此混合物90秒，再加入500μl LB培养基，于37℃培养30分钟。最后于25℃以16,000xg离心细胞10分钟，并将其涂布于含有50μg/ml安比西林的LB平板培养基，于37℃培养16小时。
(C)小量制备质粒
于37℃，将重组大肠杆菌培养于LB培养基中16小时，再于4℃以16,000xg离心5分钟以收集细胞。质粒DNA以Gene-SpinTM MiniprepPurification Kit纯化之。将离心后的菌体重新悬浮于200μl溶液I(50mMEDTA，25mM Tris pH 8.0，50mM glucose)中，随后加入200μl溶液II(0.2NNaOH，1％SDS)于微量离心管中，将离心管缓慢的上下倒置混合至溶液澄清为止，再加入200μl溶液III(KOAc，11.5％冰醋酸，pH 4.8)于管中，并将管子上下倒置混合5-6次。不溶物可于4℃以16,000xg离心5分钟。将上清液直接移至离心管柱，于16,000xg离心30秒。将离心后的液体弃置，加入700μl清洗溶液(70％酒精)并以16,000xg离心1分钟，弃置离心后的液体，再以16,000xg于4℃离心3分钟以移去残余的酒精。将离心管柱置于新的微量离心管上，加入50-100μl无菌水，最后于4℃，以16,000xg离心5分钟以溶离DNA，并储存于-20℃。
(D)原位聚合酶链式反应(In situ PCR)
自平板培养基上挑选数个大肠杆菌转载菌落作为PCR模板。混合转载菌落模板，0.3μl的10μM正向引物，0.3μl的10μM反向引物，2μl的2.5mM脱氧核苷酸(dGTP，dATP，dCTP and dTTP)，2μl的10×反应缓冲液，0.3μl的5U/μl Vio Taq DNA聚合酶(Viogene，USA)及15.1μl双蒸水，以Perkin Elmer Gene Amp PCR system 2400进行反应。加热循环反应条件如下：
Figure A20068005625000151
(E)DNA测序
以Terminator V3.1Cycle Sequencing Kit(ABI，USA)进行定序反应。反应物混合后进行下列循环：1循环的96℃/1分钟→25循环的[96℃/30秒，50℃/30秒，60℃/2分钟]。将产物和2μl 3M醋酸钠，pH 4.6，50μl 95％酒精及10μl双蒸水混合，置于25℃/15分钟以沉淀聚合反应的产物。于4℃以16,000xg离心20分钟，移除上层液，再加入180μl 70％酒精。混合均匀后，以16,000xg于4℃离心5分钟，再完全移除上清液。离心管中聚合反应的DNA产物以真空离心5分钟干燥的，加入10μl Hi-Diformamide以溶解产物，最后以
Figure A20068005625000153
3100Genetic Analyzer进行DNA自动测序。
(F)利用大肠杆菌表达融合蛋白
以大肠杆菌E.coli BL21-
Figure A20068005625000154
(DE3)表达融合蛋白。含有融合蛋白基因片段的质粒转载至大肠杆菌E.coli BL21-(DE3)胜任细胞中，以含有50μg/ml安比西林的LB平板培养基于37℃培养16小时进行筛选。将单一菌落接种于含有50μg/ml氨苄西林的1ml LB培养基，于37℃培养，待OD600达到0.4-0.6。再加入终浓度1mM异丙基-β-D-硫化半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质产生，于20℃培养16小时，之后收集细胞并重新悬浮于0.1ml结合缓冲液(50mM NaOAc，pH 5.5)，再以超音波震荡器(Misonix，USA)将细胞打破，可溶及不可溶的融合蛋白可于4℃以16,000xg离心10min分离之。
(G)聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
依据Laemmli方法[25]，以1mm平板胶体，包含分离胶体(pH 8.8)及焦集胶体(pH 6.8)，进行不连续聚丙酰胺胶体电泳。样品以样品缓冲液[100mM Tris-HCl(pH 6.8)，200mM DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，及20％甘油]于99℃处理10分钟，12％(w/v)聚丙酰胺胶体电泳以Electrical SupplyMP-250，于25mA分析60分钟。
以考马斯亮蓝溶液(2.5％考马斯亮蓝R-250，45％甲醇，及10％醋酸)漂染电泳分析完的胶片15分钟，将胶片置于退染缓冲液I(40％甲醇及10％醋酸)中退染1小时，再置于退染缓冲液II(7％甲醇及5％醋酸)中，移除剩下的染剂。蛋白质分子量标志(Fermentas，USA)亦于同时分析之。
(H)蛋白质浓度定量
样品的蛋白质浓度以二辛可宁酸试剂套组(BCA Assay Kit，Pierce，USA)定量的，以牛血清蛋白(bovine serum albumin)为标准品。
(I)以直链淀粉树脂层析法纯化融合蛋白
将直链淀粉树脂倒入2.5×10公分管柱中，将离心后含有融合蛋白的大肠杆菌细胞以结合缓冲液(50mM NaOAc，pH 5.5)重新悬浮，再以超音波震荡。于4℃以16,000xg离心15分钟后，保留上清液以进行层析法。将管柱以8倍管柱体积的结合缓冲液清洗后，将澄清的细胞溶出物以流速1ml/min注入管柱中。将管柱以12倍管柱体积的结合缓冲液清洗后，再将融合蛋白以溶离缓冲液(10mM甘氨酸/NaOH，pH11.0)析出。
(J)结果
为了增加以SBD为亲和性标签的应用潜力及研发不同的多胜肽连接子对于蛋白质表达及纯化的效用，将eGFP及SBD与不同连接子如58L、RoLK、PH、PK及PPT构建重组克隆，如图1所示。十个融合蛋白中，其中五个融合蛋白的SBD位于N端，其余则位于C端。位于N端的SBD，于大肠杆菌中可大量表达可溶的SBD-58L-eGFP、SBD-RoLK-eGFP及SBD-PH-eGFP，而SBD-PK-eGFP及SBD-PPT-eGFP则以内涵颗粒方式表达。当SBD位于C端时，eGFP-58L-SBD、eGFP-RoLK-SBD及eGFP-PH-SBD亦可于可溶性分层中大量表达，但eGFP-PK-SBD及eGFP-PPT-SBD的表达亦会导致内涵颗粒产生。大量表达不可溶的SBD-PK-eGFP及SBD-PPT-eGFP与eGFP-PK-SBD及eGFP-PPT-SBD，分别如图2、图3所示。大量表达的SBD-PK-eGFP、SBD-PPT-eGFP、eGFP-PK-SBD及eGFP-PPT-SBD的分子量，以12％聚丙酰胺凝胶电泳分析后，粗估为40kDa。
六个融合蛋白(SBD-58L-eGFP、SBD-RoLK-eGFP、SBD-PH-eGFP、eGFP-58L-SBD、eGFP-RoLK-SBD及eGFP-PH-SBD)于大肠杆菌[E.coliBL21-
Figure A20068005625000171
(DE3)]中于20℃诱导16小时，而成功的表达可溶性融合蛋白。细胞以离心方式收集，重新悬浮于结合缓冲液(50mM NaOAc，pH5.5)以超声波震荡，利用离心方式收集含有大量表达的可溶性融合蛋白上层液，再注入充填直链淀粉树脂的亲合性层析管柱中，以溶离缓冲液(10mM glycine/NaOH，pH11.0)自管柱中溶离纯化融合蛋白。纯化的重组蛋白以12％聚丙酰胺胶体电泳分析，如图4所示。从1L重组细胞培养液中，约可取得100-150mg的纯化融合蛋白，以进行下列分析。
实施例2
(A)pH值对于吸附能力的效用
在测试pH值对于吸附能力效用的实验中，将纯化的融合蛋白(16μM)于25℃搅动入含不同pH值，含终浓度0.1mg/ml的玉米淀粉缓冲液中(Sigma-Aldrich，EC 232-679-6，USA)约1小时。结合测试在pH 2.0-11.0的缓冲液[100mM甘氨酸/盐酸(pH 2-3)，100mM醋酸钠/醋酸(pH 4-5)，100mMNa2HPO4/NaH2PO4(pH 6-7)，100mM Tris/HCl(pH 8)，100mM甘氨酸/氢氧化钠(pH 9-11)]中进行。以二辛可宁酸试剂套组(BCA assay)测定于上层液中未吸附的融合蛋白于吸附前及吸附后的浓度。100％融合蛋白的相对吸附能力以pH5.0时的测定值为基准。
(B)温度对于吸附能力的效用
在测试温度对于淀粉吸附能力效用的实验中，将纯化的融合蛋白(16μM)于4℃、25℃及37℃搅动入含有终浓度0.1mg/ml玉米淀粉的吸附缓冲液(50mM NaOAc，pH 5.5)约3小时。以二辛可宁酸试剂套组(BCA assay)测定于上层液中未吸附的融合蛋白于吸附前及吸附后的浓度。100％融合蛋白的相对吸附能力以4℃的测定值为基准。
(C)以搅拌法纯化
搅拌纯化法是沿用纯化Pseudomonas amyloderamosa isoamylase(Fang，T.Y.et al.，(1994)Enzy Microb Tech 16，247-252)的方法。将含有融合蛋白的大肠杆菌的细胞悬浮于吸附缓冲液(50mM NaOAc，pH 5.5)中，再以超声波震荡。之后于4℃以16,000xg离心15分钟，舍弃不溶的沉淀物。以1
ml溶离缓冲液(10mM甘氨酸/氢氧化钠，pH 11.0)清洗50mg玉米淀粉(Sigma，EC 232-679-6)三次，再以1ml双蒸水清洗。之后以16,000x g离心5分钟去除双蒸水。含有融合蛋白的1ml上层液和50mg淀粉混合后，于25℃连续搅拌3小时。将上层液于4℃以16,000xg离心10分钟去除，淀粉沉淀以1ml吸附缓冲液清洗三次，再以250μl溶离缓冲液溶离四次，保留清洗及溶离的分层液供聚丙烯胺凝胶电泳及其它分析。
(D)以淀粉管柱层析法纯化
此纯化方式沿用含有粗淀粉的漏斗式玻璃过滤器以纯化Pseudomonasamyloderamosa isoamylase(Lin，L.L.et al.，(1994)LettAppl Microbiol 19，383-385)的方法。将含有融合蛋白的大肠杆菌细胞悬浮于吸附缓冲液(50mM NaOAc，pH 5.5)中，再以超声波震荡。之后于4℃以16,000xg离心15分钟，舍弃不溶的沉淀物。将200mg的玉米淀粉(Sigma)以2ml溶离缓冲液(10mM甘氨酸/氢氧化钠，pH11.0)清洗三次，再以2ml双蒸水清洗。淀粉沉淀以2ml吸附缓冲液(50mM NaOAc，pH 5.5)清洗三次，再悬浮于吸附缓冲液中。将淀粉溶液填充于5-ml可抛弃式针筒中，其中针头已被移除并将滤纸置于底部以防止淀粉流失。超声波震荡后，收集3ml细胞可溶分层液，加入淀粉管柱中，以地心引力带动液体流动。以6ml吸附缓冲液洗去非专一性吸附蛋白，再以3ml溶离缓冲液溶离融合蛋白。清洗及溶离步骤可以位于底部的另一的针筒吸取以加速的。保留清洗及溶离的分层液供聚丙烯胺胶体电泳及其它分析。
(E)以改良的淀粉管柱层析法纯化
此淀粉管柱层析法结合流体化床吸附法(fluidized bed adsorption，Hicketier，M.and Buchholz，K.(2002)JBiotechnol 93，253-268；Roy，I.et al.，(2000)Protein Expr Purif 20，162-168)并改良之。将含有融合蛋白的大肠杆菌细胞悬浮于吸附缓冲液(50mM NaOAc，pH 5.5)中，再以超声波震荡。的后于4℃以16,000xg离心15分钟，舍弃不溶的沉淀物。以3ml溶离缓冲液(10mM glycine/NaOH，pH11.0)清洗600mg的玉米淀粉(Sigma)三次，再以双蒸水清洗三次。淀粉沉淀以3ml吸附缓冲液(50mM NaOAc，pH 5.5)清洗三次，最后悬浮于吸附缓冲液中。将淀粉溶液充填于5-ml可抛弃式针筒中，其中针头已被移除，并将滤纸置于底部以防止淀粉流失。此一改良的淀粉管柱设计如图5所示。超声波震荡后的细胞可溶分层液以蠕动式帮浦P1(Amersham Pharmacia Biotech，USA)依1ml/min流速强迫注入淀粉管柱的底部，以6ml吸附缓冲液洗去非专一性吸附蛋白，再以溶离缓冲液溶离融合蛋白。保留清洗及溶离的分层液供聚丙烯胺凝胶电泳及其它分析。
(F)结果
pH值及温度对于粗淀粉吸附的效用
SBD本身于pH 5.0-6.0时即对粗淀粉具有良好的吸附能力，其吸附作用在低于pH 5.0或高于pH 6.0时则会被破坏。因此选择融合蛋白SBD-PH-eGFP，在25℃时，于不同pH值下测试吸附反应，其范围为pH2.0-11.0，以确认含有SBD的融合蛋白，于不同pH值的下仍保有吸附能力。如图6所示，SBD-PH-eGFP与玉米淀粉的最佳吸附能力产生于pH4.0-5.0，最弱吸附能力产生于pH 11.0时。此相对吸附能力是以pH 5.0时的吸附能力为100％来计算。融合蛋白与粗淀粉于pH 4.0-8.0时的吸附能力十分良好，而当pH值低于4或高于8时，吸附能力则快速下降。
除此之外，于不同温度下，测定纯化的融合蛋白于吸附缓冲液(50mMNaOAc，pH 5.5)中的吸附能力，如图7所示。其对于玉米淀粉的最佳吸附效用温度为4℃；于25℃时下列融合蛋白SBD-58L-eGFP、SBD-RoLK-eGFP、SBD-PH-eGFP、eGFP-58L-SBD、eGFP-RoLK-SBD及eGFP-PH-SBD对于玉米淀粉相对的吸附能力分别降至92％、94％、95％、88％、81％及74％。吸附能力于37℃时更进一步被干扰。于37℃时下列融合蛋白SBD-58L-eGFP、SBD-RoLK-eGFP、SBD-PH-eGFP、eGFP-58L-SBD、eGFP-RoLK-SBD及eGFP-PH-SBD对于玉米淀粉相对的吸附能力分别降至14％、37％、9％、21％、16％及8％。因此，为了达成玉米淀粉及融合蛋白的高效吸附能力，温度范围必须介于4℃及25℃；同时又考虑到实验系统降温的成本，因此选用25℃进行后续的实验。
实施例3
(A)以NMR光谱决定结构
NMR资料以Bruker Avance 600MHz或800MHz光谱仪分析之。为了测定结构，将1mM RoCBM21(未标记、15N-标记或13C，15N-双标记)溶于10mM醋酸钠，pH 4.5，以于25℃进行NMR实验。蛋白质浓度以二辛可宁酸试剂套组(Bio-Rad ProteinAssay)定量。骨架归属(assignment)乃以HNCA，HN(CO)CA、HNCACB、CBCA(CO)NH、HNCO及HN(CA)CO实验进行(Cavanagh，J.et al.，(1996)Protein NMR spectroscopy，Academic PressInc.)。由于RoCBM21含有相对较高比例的芳香族残基，其芳香族支链的归属由HBCBCGCDHD及HBCBCGCDCEHE实验协助完成(Yamazaki，T.et al.，(1993)J.Am.Chem.Soc.115，11054-11055)。其余原子的归属则由homonuclear two-dimensional nuclear Overhauser enhancement spectroscopy(NOESY)及15N heteronuclear  single-quantum  coherence-NOESY(HSQC-NOESY)通过化学键相关光谱(through-bond correlation spectra)协助完成。利用Homonuclear double quantum-filtered correlated spectroscopy(DQF-COSY)，homonuclear total correlation spectroscopy(TOCSY)及15NHSQC-TOCSY以取得化学键相关光谱(through-bond correlations)。其混合期如下：TOCSY光谱为90ms，NOESY光谱为50，100或150ms。所有二维光谱皆以512t1增量记录之，而2048t2复合物的资料取样点则以TopSpin 1.3(Bruker)处理。NOESY光谱产生的距离限制以100-ms混合期记录的。以二维15N HSQC光谱记录于25℃溶解于99％D2O 36小时的冷冻干燥RoCBM21，以鉴别被保护的酰胺质子。RoCBM21在冷冻干燥后无法快速溶解，因此要加入过量的D2O以溶解蛋白质。过量的D2O以冷冻干燥去除，以产生500-μl样品。氢键限制得自于HSQC酰胺质子保护作用，由周围NOE信号及HNCOHB  (through-hydrogen bondcoherence)(Cordier，F.，and Grzesiek，S.(1999)J.Am.Chem.Soc.121，1601-1602)确认的。双平面角限制以TALOS程序(Cornilescu，G.et al.，(1999)JBiomol NMR 13，289-302)伴随着N、HA、CA、CB及C原子的化学位移所取得。以Sodium 2，2-dimethyl-2-silapentane-5-sulphonate(DSS)做为质子化学位移的内部基准，异核化学位移则以设定的γ15N/γ1H＝0.101329118及γ13C/γ1H＝0.251449530为基准。RoCBM21化学位移以编号BMRB7083存入Biological Magnetic Resonance Data Bank(BMRB)。
(B)结构计算及分析
部分归属峰列表及化学位移表以SPARKY程序(Goddard，T.D.，andKneller，D.G.(1999))的手动归属法完成。其波峰强度依设定的peak fittingprotocol，依据Lorentzian line shapes完成。RoCBM21结构计算以CNS 1.1(Brunger，A.T.et al.，(1998)Acta Cryst.D54，905-921)及ARIA 2.0(Nilges，M.et al.，(1997)J.Mol.Biol.269，408-422)依torsion angle dynamics(TAD)及standard simulated annealing protocols进行(Nilges，M.et al.，(1988)FEBSLett 239，129-136)。此等计算完成后，利用OPLS力场进行explicit waterrefinement(Linge，J.P.et al.，(2003)Proteins 50，496-506)。自200个结构中，选取15个具最低能量结构者做进一步的分析。以PROCHECK-nmr(Laskowski，R.A.et al.，(1993)J.Appl.Cryst.26，283-291)分析其质量。组合结构的原子坐标以编号(accession ID)2DJM存入Protein Data Bank(PDB)。
(C)化学位移扰动
为了了解RoCBM21的配体结合残基及交互作用，利用麦芽三糖、麦芽七糖及β-环状糊精研究化学位移扰动。制备100-mM麦芽三糖及麦芽七糖为标准液，而制备20-mM β-环状糊精为标准液，因其溶解度低。将RoCBM21(1mM)以各单独配体选汰，利用二维15N HSQC实验以监控其交互作用。套用下列公式以计算1H及15N的加权平均化学位移改变Δδavg＝[(Δδ1HN)2+(0.17Δ815N)2]1/2(Saitoh，T.et al.，(2006)J Biol Chem 281，10482-10488)。
(D)结构比较
用以比较SBD结构的CBMs来自于A.niger glucoamylase(AnCBM20)(Sorimachi，K.et al.，(1996)J Mol Biol 259，970-987)，Thermoactinomycesvulgaris R-47α-amylase I(TvCBM34I)(Abe，A.et al.，(2004)JMol Biol 335，811-822)，Bacillus halodurans maltohexaose-forming amylase(BhCBM25andBhCBM26)(Boraston，A.B.et al.，(2006)J Biol Chem 281，587-598)及Klebsiella pneumoniae pullulanase(KpCBM41)(Mikami，B.et al.，(2006)JMol Biol 359，690-707)。结构重叠分析以网站服务器“FAST”进行(Zhu，J.，and Weng，Z.(2005)Proteins 58，618-627)。
(E)嵌合模拟
利用AutoDock3.05(Morris，G.M.et al.，(1998)J.ComputationalChemistry 19，1639-1662)仿真淀粉分子的于结合点的结合模式。Cyclomaltohexaicosaose的三维结构由PDB(code：1C58)下载。在不同模拟中，碳水化合物分子嵌合于不同结合点。亲合性网格设定为90×90×90，以程序autogrid计算，于0.375
Figure A20068005625000221
间隔下，依三维置中于结合点(Morris，G.M.et al.，(1998)J.Computational Chemistry 19，1639-1662)。利用Lamarckian genetic algorithm(LGA)研究构型。对位于二个结合点中任一处的碳水化合物，进行100组trials，其中族群大小为每组150个样品。最初的位置及构型为随机选择。其转换步骤为2.0
Figure A20068005625000222
旋转步骤为50°。其它嵌合系数如下：mutation rate＝0.02，crossover rate＝0.8，elitism＝1，localsearch rate＝0.06，依1million energy evaluations。从100组trials所得的最终构型丛集，以1.5
Figure A20068005625000223
的根均方差(RMSD)容忍度决定之。
(F)结果
NMR光谱及分子结构
RoCBM21的15N HSQC光谱显示一典型β-条带的良好波峰分散模式(图8A)。光谱质子规格宽度定为16ppm，以配合波峰。最大磁场化学位移为-1.181ppm，属于I79H51；而属于W70的Hε1所造成的最大磁场化学位移为11.88ppm。由于RoCBM21含有大量芳香族残基(18/106)，数个化学位移受到芳香族环的π-电子电流的影响。靠近芳香族环的电子可能经历π-电子电流遮蔽(在环的上或下)或去遮蔽(位于芳香族环的平面)效应。部分归属化学位移曾被BMRB目前的检查化学位移极端值的软件视为可疑(Moseley，H.N.et al.，(2004)JBiomol NMR 28，341-355)，而被BMRBannotator要求仔细的检视。例如，V39Hβ(0.739)的化学位移可能被Y83及W47的环所影响；N52Hβ3(0.775)被W47环，N97Hβ3(-0.09)被Y102环，I79Hγ12(-0.22)被Y40环及Y102Hβ3(0.482)被F82环所影响；结果造成此等化学位移移动磁场。于HNCA，HN(CO)CA，CBCA(CO)NH，HNCACB，HNCO及HN(CA)CO光谱中，其骨架连续吸附力透过整个蛋白质序列持续进行，除了脯氨酸残基及甘氨酸18。介于Asp17、Gly18及Ser19的吸附力于所有骨架吸附实验中皆不存在，因此Gly18酰胺中氮原子的化学位移无法明确归属。一条带图例显示HNCACB光谱中的骨架吸附力如图8B所示。
结构计算依实验步骤中所述的2247限制：2071NOE衍生的距离限制，102双平面角限制及74距离限制。N-及C-β-折板的NOEs如图8所示。依ARIA最终重复计算共产生200个结构，其中15个具最低总能量者存入PDB及用于进一步分析。相对于平均结构来说，以根均方差(RMSD)最低的结构做为代表结构(图9A)。NMR的统计结果归纳于表2。对于已定义区域，根均方差相对于平均结构处，于骨架为0.48士0.06
Figure A20068005625000231
重原子为0.96±0.11；对于所有残基，其骨架为1.14±0.31
Figure A20068005625000232
重原子为1.43±0.29。于Ramachandran plot中，95％的非甘氨酸及非脯氨酸残基位于最适区域或其它额外被允许的区域，98.5％位于一般允许区。大部分组合的N97残基及数个N45及N101残基位于不被允许区。N97及N101位于环8，而N45位于环4，此等环状物位于RoCBM21最具弹性区。
表2 RoCBM21于pH 4.5及298K水溶液中的结构统计
Figure A20068005625000241
Figure A20068005625000251
RoCBM21domain包括106个残基，其序列与其它SBD家族成员相似度低(＜25％)，然而RoCBM21溶液结构显示出多数CBMs特征：一传统β-三明治折叠，及一类免疫球蛋白结构(Boraston，A.B.et al.，(2004)BiochemJ382，769-781)。β-三明治结构是对称的，并由八个反向平行的β-条带构成：β1(V9-Y16)、β2(F21-V27)、β3(V34-D42)、β4(I53-G60)、β5(Y67-A74)、β6(I79-V88)、β7(T92-N95)及β8(Y102-V104)。这些β-条带可再分成包含β-折板(N-折板)的N端条带(图9B)，如β1β2β5；及包含β-折板(C-折板)的C端条带(图9C)，如与β4相连的β3β6β7/8。位于N-折板中间的条带β2，与β1及β5反向平行配对；而位于C-折板中间的条带β6，则与β3、β7及β8反向平行配对。位于二β-折板的间的条带β4，与β3及β5反向平行配对。RoCBM21的疏水性核由位于N-折板的V9、L11、I14、Y16、F21、I25、V27、W70及F72，及位于C-折板的V36、V38、Y40、F82、I84、Y86、V88、Y93、Y102及V104所组成。于β1中，残基L11-Y14与β2非由氢键相连，而是形成一突起(图8C)。β7及β8皆以氢键与β6相连，其间由环8隔开(图8D)。RoCBM21的溶剂可接触表面结构显示于图9D及E。DelPhi静电电位(Rocchia，W.et al.，(2001)J.Phys.Chem.B105，6507-6514)位于其表面。有趣的是，N-及C-折板的表面具有十分特殊的静电电位分布，其中N-折板的表面带有较多带负电的残基，而C-折板的表面带有较多带正电的残基。
SBDs的结构比较
将RoCBM21的结构与其它不同的SBD家族成员相互比较(表3)。图10A-D显示一级、二级、三级及四级结构的相似度。于不同SBDs家族中，依RoCBM21的结构标示及着色出相对的β-条带及环状物(图10A)。二类拓朴学可由结构比较辨别的：AnCBM20、BhCBM25、BhCBM26及KpCBM41的结构为第一类拓朴，而RoCBM21’s及TvCBM34’s的结构为第二类拓朴。此二类拓朴构造相似，除了一条带必须位移使的重叠，例如：位于AnCBM20的β1相当于RoCBM21的β2；其后的相对应的条带可一一列出，RoCBM21最终条带β8可和AnCBM20的条带7重叠。
值得一提的是，AnCBM20的最终条带于RoCBM21的β1中所扮演的角色为与N端β-折板的中间条带(β2或其相对的条带)形成氢键。所有RoCBM21的β-折板皆为反向平行，但AnCBM20的第一及最后的条带则为平行。总的，RoCBM21(第二类拓朴)的整体拓朴与AnCBM20(第一类拓朴)相似，但其相对的条带则位移一个位置。大多数的N端SBDs属于第二类拓朴，而C端的SBDs则为第二类拓朴(KpCBM41例外)(表3)(Mikami，B.et al.，(2006)JMol Biol 359，690-707).
Figure A20068005625000261
BhCBM25和BhCBM26在pdb档中的序列对应到开启读码(openreading frame)BH0413各为第863-958氨基酸序列和第771-863氨基酸序列。
配体结合及化学位移扰动
于本实验中测试的三种直链键接的碳水化合物(麦芽三糖，麦芽七糖，及β-环状糊精)显示相似的化学位移扰动模式；相同的氨基酸残基在选汰中会受影响，但其改变幅度则依碳水化合物而不同。RoCBM21的15NHSQC光谱在β-环状糊精选汰前后为重叠(图11A)，其化学位移改变及受影响的残基归纳于图11B。RoCBM21具有显著化学位移扰动(＞0.1ppm及0.06-0.1ppm)的残基，标示于三维结构中(图11C)。依据此类扰动结果，受配体结合影响的残基可归成三类。第一类包含残基A41、W47、N52、Y83、K85、K91、D95、N96、N97及S99，其位于相对于前述SBDs的结合点一。同理，残基N29、I30、A31、Y32、S33、K34、S57、F58、I62、N66、Y67、E68及Y69构成相对的结合点二。具有显著化学位移扰动改变及二碳水化合物结合点的残基标示于RoCBM21结构上(图11C)。有趣的是，数个位于疏水性核的残基亦受配体结合的影响，分别为L11、V36、V38、W70及I79。环1、4及8为有弹性的区域，其平均根均方差＞1.5
Figure A20068005625000271
除了高弹性外，包含于结合点一的环4及8具有另一特点-皆富含天冬氨酸(asparagines)残基(位于环4的N46、N48、N49、N50及N52及环8的N96、N97、N98及N101)。碳水化合物配体选汰导致天冬氨酸N50、N52、N96、N97及N98大幅度的化学位移扰动。此类poly-N环状物可做为CBM-淀粉交互作用的分子决定点，这些poly-N环状物的出现为某些CBM21成员的特点(Machovic，M.et al.，(2005)Febs J 272，5497-5513)。二个β-环状糊精分子分别嵌合于RoCBM21结合点一及结合点二(图11D)，于结合点一中，在嵌合的β-环状糊精分子及RoCBM21富含天冬氨酸的环状物中，氢键介于葡萄糖残基的羟基O2及O3处；于结合点二中，N29及Y32的支链以氢键和β-环状糊精相结合，此处同时也具有较大的化学位移扰动改变。
由于多数用于SBDs研究中的配体相对较小(葡萄糖数目≤7)，且不含完整的淀粉螺旋结构。为了模拟较大的直链淀粉分子吸附方式，利用cyclomaltohexaicosaose分子(Gessler，K.et al.，(1999)Proc Natl Acad Sci USA96，4246-4251)(v-直链淀粉，PDB code：1C58)分别嵌合于RoCBM21的结合点一与结合点二(图11E及F)。于嵌合复合物的结合点一，环4与v-直链淀粉的交互作用于介于G1-G13及G14-G26的螺旋槽结构间，环8与葡萄糖残基交互作用于螺旋槽G2-G4及G8-G10螺旋槽结构间。于结合点二，环3插入螺旋槽G1-G13及G14-G26的间，而N29及Y32则与葡萄糖残基交互作用。环5与v-直链淀粉构造结合于边缘而非螺旋槽内。
实施例4
(A)材料及方法
RoGACBM21用于结晶中的浓度约为10mg/mL。RoGACBM21-β-环状糊精(βCD)复合物结晶以莫耳浓度1∶2培养，以悬式扩散结晶法进行。1μl蛋白质溶液与1μl结晶溶液混合，并与Linbro plates中的500μl结晶溶液进行平衡。最初的结晶条件由Hampton Research Crystal Screen kits取得，的后再进一步最佳化以得到可供绕射质量的结晶。RoGACBM21-βCD复合物结晶的X光绕射资料于台湾国家同步辐射研究中心的BL13C1仪于波长0.9762
Figure A20068005625000281
时收集。结晶置于尼龙环上，再以液态氮流于100K时急冻。数据以HKL2000程序处理。
(B)结果
RoGACBM21-βCD复合物结晶(图12)在四天中于293K以18％PEG8000及0.2M醋酸锌in 0.1M Na Cacodylate缓冲剂(pH 6.5)所得的最大规格为0.2×0.2×0.5mm。RoGACBM21-βCD复合物结晶绕射为1.8
Figure A20068005625000282
属于orthorhombic P212121space group，其单位细胞系数a＝42.58
Figure A20068005625000283
b＝42.71
Figure A20068005625000284
c＝70.06
Figure A20068005625000285
α＝β＝γ＝90°及Rmerge＝3.4％。其VM(Matthews 1968)估算为2.73
Figure A20068005625000286
Da-1，相对于55％溶剂时，结晶中每一个不对称单位含有一个分子。在RoGACBM21-βCD复合物中(图13)中，一个RoGACBM21分子和β-环状糊精分子结合。于RoGACBM21-βCD复合物观察到二个结合处，结合处一及结合处二。结合处一位于β2-β3环，包含关键的Y32残基；结合处二位于β3-β4环，包含另一个多醣辨识残基W47。
尽管此发明已详尽描述于实施例中，使得所属技术领域的技术人员可以制造及实施，其衍生物、变体及改良亦在不背离此发明的精神及范围下可得。
所属技术领域的技术人员会了解此发明已大为改进计划的执行，可得的结果及其内涵。实施例中的胚胎、动物、植物、微生物及其制造步骤及方法仅为代表例，而非用以限制此发明的范畴。所属技术领域的技术人员可进一步改良及开发其它用途，改良包含于此发明的精神亦属于本发明的权利要求中。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种淀粉吸附区域，其特征在于具有如下显示于SEQ ID No.1、2或3的氨基酸序列；
SEQ ID No.1：
ASIPSSASVQ  LDSYNYDGST  FSGKIYVKNI  AYSKKVTVVYADGSDNWNNN      GNIIAASFSG  PISGSNYEYW  TFSASVKGIKEFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS；
SEQ ID No.2：
ASIPSSASVQ  LDSYNYDGST  FSGKIYVKNI  AYSKKVTVIYADGSDNWNN       GNTIAASYSA  PISGSNYEYW  TFSASINGIKEFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS；或
SEQ ID No.3：
ASIPSSASVQ  LDSYNYDGST  FSGKIYVKNI  AYSKKVTVIYANGSDNWNNN      GNTIAASYSA  PISGSNYEYW  TFSASINGIKEFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS；
或其SEQ ID NO.1、2或3的等位变体和衍生物，其具有淀粉结合能力者，其中淀粉吸附区域在氨基酸序列的残基32、47、58、67、83、93和94的芳香性基团上具有用于碳水化合物结合的活性位点。
2.根据权利要求1所述的淀粉吸附区域，其特征在于该氨基酸残基为酪氨酸或/及色氨酸。
3.根据权利要求1所述的淀粉吸附区域，其特征在于该活性位点为残基32酪氨酸、残基47色氨酸、残基58酪氨酸、残基83酪氨酸、残基93酪氨酸和残基94酪氨酸。
4.一种重组蛋白质，其特征在于包含下列序列：
(SBD)m-Ln-X-L’p-(SBD)q
SBD指淀粉吸附区域，L指连接子，L’指连接子，X指目标蛋白质或多胜肽，m为0、1或2，n为0或1，p为0或1，q为0、1或2，其中m和q不会同时为0。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于该淀粉吸附区域如权利要求1所述的淀粉吸附区域。
6.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于该连接子为RoLK：Rhizopus oryzae GA的连接子；PH：六个组氨酸；PK：八个赖氨酸；PPT：一个苏氨酸及四个脯氨酸-苏氨酸重复序列[T(PT)4]；或58L：在载体pET39b(+)上界于限制酶切位SpeI及NcoI间的区域。
7.一种复合物，其特征在于包含下列序列：
(SBD)m.-X-(SBD)q
SBD指淀粉吸附区域，X指碳水化合物，m为0、1或2，q为0、1或2，但m和q不同时为0，其中当m和q均大于或等于1时，淀粉吸附区域利用不同部位同时和碳水化合物结合。
8.根据权利要求7所述的复合物，其特征在于该碳水化合物的结构包含α-1，4-葡萄糖键接或α-1，6-葡萄糖键接。
9.根据权利要求7所述的复合物，其特征在于该碳水化合物为环状碳水化合物。
10.根据权利要求7所述的复合物，其特征在于该淀粉吸附区域和碳水化合物用配体结合位置或构型方式结合。
11.根据权利要求7所述的复合物，其特征在于该淀粉吸附区域包含多个单位依据碳水化合物的大小决定。
12.一种用以纯化含有如权利要求1淀粉吸附区域的重组蛋白质的方法，其特征在于包含：
a.将含有重组蛋白质的生物液体直接施加于亲和性基质；和
b.调整温度、pH值、离子强度、含糖浓度或酵素组成以溶离重组蛋白质，
其中该亲和性基质在其任意部分结构，包含主链、侧链或经修饰残基之内包含下式：
(X-X)n
X指葡萄糖分子，葡萄糖和葡萄糖间的键接为α-1，4-键接或α-1，6-键接且n为1或大于1。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于该亲和性基质为淀粉。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于温度改变范围指37℃或更高。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤a于0到25℃下操作。

Claims (21)

1.一种淀粉吸附区域，其特征在于具有如下显示于SEQ ID No.1、2或3的氨基酸序列；
SEQ ID No.1：
ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNI AYSKKVTVVYADGSDNWNNN GNIIAASFSG PISGSNYEYW TFSASVKGIKEFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS；
SEQ ID No.2：
ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNI AYSKKVTVIYADGSDNWNNN GNTIAASYSA PISGSNYEYW TFSASINGIKEFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS；或
SEQ ID No.3：
ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNI AYSKKVTVIYANGSDNWNNN GNTIAASYSA PISGSNYEYW TFSASINGIKEFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS；
或其SEQ ID NO.1、2或3的等位变体和衍生物，其具有淀粉结合能力者。
2.根据权利要求1所述的淀粉吸附区域，其特征在于其可取得自CBM20或CBM21。
3.根据权利要求2所述的淀粉吸附区域，其特征在于其可取得自CBM21葡萄糖淀粉酶之淀粉吸附区域。
4.根据权利要求3所述的淀粉吸附区域，其特征在于其可取得自根霉属。
5.根据权利要求4所述的淀粉吸附区域，其特征在于其可取得自根霉属葡萄糖淀粉酶的淀粉吸附区域。
6.根据权利要求5所述的淀粉吸附区域，其特征在于其在氨基酸序列的残基32、47、58、67、83、93和94的芳香性基团上具有用于碳水化合物结合的活性位点。
7.根据权利要求6所述的淀粉吸附区域，其特征在于该氨基酸残基为酪氨酸或/及色氨酸。
8.根据权利要求6所述的淀粉吸附区域，其特征在于该活性位点为残基32酪氨酸、残基47色氨酸、残基58酪氨酸、残基83酪氨酸、残基93酪氨酸和残基94酪氨酸。
9.一重组蛋白质，其特征在于包含下列序列：
(SBD)m-Ln-X-L’p-(SBD)q
SBD指淀粉吸附区域，L指连接子，L’指连接子，X指目标蛋白质或多胜肽，m为0、1或2，n为0或1，p为0或1，q为0、1或2，其中m和q不会同时为0。
10.根据权利要求9所述的蛋白质，其特征在于该淀粉吸附区域系如权利要求1的淀粉吸附区域。
11.根据权利要求9所述的蛋白质，其特征在于该连接子为RoLK：Rhizopus oryzae GA的连接子；PH：六个组氨酸；PK：八个赖氨酸；PPT：一个苏氨酸及四个脯氨酸-苏氨酸重复序列[T(PT)4]；或58L：在载体pET39b(+)上界于限制酶切位SpeI及NcoI间的区域。
12.一复合物，其特征在于包含下列序列：
(SBD)m-X-(SBD)q
SBD指淀粉吸附区域，X指碳水化合物，m为0、1或2，q为0、1或2，其中淀粉吸附区域利用不同部位同时和碳水化合物结合。
13.根据权利要求12所述的复合物，其特征在于该碳水化合物的结构包含α-1，4-葡萄糖键接或α-1，6-葡萄糖键接。
14.根据权利要求12所述的复合物，其特征在于该碳水化合物为环状碳水化合物。
15.根据权利要求12所述的复合物，其特征在于该淀粉吸附区域和碳水化合物用配体结合位置或构型方式结合。
16.根据权利要求12所述的复合物，其特征在于该淀粉吸附区域包含多个单位依据碳水化合物的大小决定。
17.一种用以纯化含有如权利要求1淀粉吸附区域的重组蛋白质的方法，其特征在于包含：
a.将含有重组蛋白质的生物液体直接施加于亲和性基质；和
b.调整温度、pH值、离子强度、含糖浓度或酵素组成以溶离重组蛋白质。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于该亲和性基质在其任意部分结构，包含主链、侧链或经修饰残基之内包含下式：
(X-X)n
X指葡萄糖分子，葡萄糖和葡萄糖间的键接为α-1，4-键结或α-1，6-键接且n为1或大于1。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于该亲和性基质为淀粉。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于温度改变范围指37℃或更高。
21.根据权利要求17所述的方法，其特征在于步骤a于0～25℃下操作。
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