CN105219753A - 一种固定化的有机磷农药降解酶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种米根霉糖化酶的淀粉结合域突变体、该突变体与有机磷农药降解酶的融合酶、制备方法及其在农药废水处理中的应用。通过分析大量淀粉结合域的结合位点，获得多个结合位点突变体，结果发现突变体SBDm(S33T,F58W)具有优良的作为亲和标签结合淀粉基质的性能。将该突变体SBDm与有机磷农药降解酶(OP)融合，可一步快速将有机磷农药降解酶从发酵液中固定在淀粉基质上，而亲和标签和固定化并不影响酶活性。淀粉基质固定化后的降解酶在有机磷农药生产废水处理和其它农药残留去除方面具有很大的应用前景。

Description

一种固定化的有机磷农药降解酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明生物技术领域，具体涉及一种淀粉结合域(starch-bindingdomain,SBD)突变体、SBD突变体与有机磷农药降解酶的融合酶、固定化融合酶以及将该固定化酶用于处理有机磷农药生产废水的方法。

背景技术

农药为现代农业发展和人类粮食供给做出了巨大的贡献。有机磷农药(organophosphoruspesticide)，由于药效高,防治范围广,成本低等优势，是农业生产中使用最为广泛的一大类农药(SinghBK.2009.Organophosphorus-degradingbacteria:ecologyandindustrialapplications.NatureReviewsMicrobiology.7:156-164)。但随着农业的发展,有机磷农药的使用量越来越大,大量有机磷农药残存于水和土壤中,不仅对地表农药残留量超标,造成食品污染，而且通过各种途径和地下水资源造成污染。有机磷农药是一种神经性毒物,在人体内长期蓄积滞留会引发慢性中毒,导致人体神经功能紊乱,发生出汗,迟钝,神经失常和语言失常等症状，此外，还可造成致畸、致癌、致突变等危害，最终威胁到人类的生存与社会的可持续发展。(GrungM,LinY,ZhangH,SteenAO,HuangJ,ZhangG,LarssenT.2015.PesticidelevelsandenvironmentalriskinaquaticenvironmentsinChina-Areview.EnvironInt.81:87-97)。

我国是农药生产和使用的大国，但农药生产的技术含量低、生产工艺落后、设备老化，导致原材料利用率低，损耗较大，一般只有30％-40％得到利用，其余大部分以“三废”形式排入环境中,每生产一吨产品就有几吨甚至十几吨废水排出。农药生产废水历来以毒性大、浓度高、治理难，已进行处理的为数不多，而处理达标的更是少之又少(潘琼,谢武,李亚丽；2012；农药废水处理技术现状与发展趋势探析；农业环境与发展。3:58-59)。因此,在日益重视环境保护能力的趋势下,加强有机磷农药降解方法的研究,解决有机磷农药对环境及食物的污染问题,是人类当前迫切需要解决的问题之一。

有机磷农药降解酶目前已被公认为是消除农药残留的最有潜力的新方法(DengS,ChenY,WangD,ShiT,WuX,MaX,LiX,HuaR,TangX,LiQX.2015.RapidbiodegradationoforganophosphoruspesticidesbyStenotrophomonassp.G1.JHazardMater.297:17-24；HelblingDE.2015.Bioremediationofpesticide-contaminatedwaterresources:thechallengeoflowconcentrations.CurrOpinBiotechnol.33:142-8)。常见的有机磷农药降解酶主要是水解酶类，包括磷酸酶、对硫磷水解酶、酯酶、硫基酰胺酶、裂解酶等，它们主要通过裂解P-O，P-S，P-N等键，使有机磷农药被降解，生成简单无机化合物。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷农药降解酶往往可降解多种有机磷农药(TheriotCM,GrundenAM.2011.Hydrolysisoforganophosphoruscompoundsbymicrobialenzymes.ApplMicrobiolBiotechnol.89,35-43)。

有机磷农药降解酶在原始天然菌株中不仅含量低，而且大多对有机磷农药的降解率较低或作用较慢，不能达到期望的效果。随着基因工程的发展，为有机磷降解酶制剂的大规模廉价生产奠定了基础(ChuXY,WuNF,DengMJ,TianJ,YaoB,FanYL.2006.ExpressionoforganophosphorushydrolaseOPHC2inPichiapastoris:purificationandcharacterization.ProteinExprPurif.49:9-14；IyerR,IkenB,DamaniaA.2013.Acomparisonoforganophosphatedegradationgenesandbioremediationapplications.EnvironMicrobiolRep.5:787-98)。通过分子进化和蛋白质工程的办法，不仅可改造酶活性，而且还可改变底物专一性和结构稳定性等(RochuD,ViguiéN,RenaultF,CrouzierD,FromentMT,MassonP.2004.Contributionoftheactive-sitemetalcationtothecatalyticactivityandtotheconformationalstabilityofphosphotriesterase:temperature-andpH-dependence.BiochemJ.380:627-363)。我们过去对有机磷农药降解酶也做了较多研究，例如通过突变氨基酸残基M164F(专利号：ZL201210458400.8)和L116M(专利号：ZL201310384286.3)，特别是M164F，以及密码子优化，不仅获得了更优良的酶活性，而且表达产量更高。

酶的固定化是目前的热点之一。固定化酶在保持其高效专一及温和酶催化反应特性的同时,可克服游离酶的许多不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、应用工艺简单、成本低等一系列优点(GaoY,TruongYB,CacioliP,ButlerP,KyratzisIL.2014.Bioremediationofpesticidecontaminatedwaterusinganorganophosphatedegradingenzymeimmobilizedonnonwovenpolyestertextiles.EnzymeMicrobTechnol.54:38-44)。

淀粉结合域(Starch-bindingdomain，SBD)作为标签蛋白不仅可以使重组融合酶快速固定在淀粉基质例如玉米颗粒上，还可以在碱性(pH>10)情况下分离纯化重组蛋白或酶。由于玉米基质价格低廉，大大降低了成本，具有很大的应用潜力。根霉特别是米根霉(Rhizopusoryzae)在自然界分布很广，其糖化酶(Glucoamylase，EC.3.2.1.3)活性很强，具有催化淀粉从非还原端水解α-1,4糖苷键逐个释放出单个β-D-葡萄糖，该酶还能水解α-1,6糖苷键和α-1,3糖苷键，能将支链淀粉彻底水解为葡萄糖，现已被广泛的应用于白酒、酒精、食醋、氨基酸、有机酸和抗生素等发酵工业(刘金梅和张凤英。2013。根霉在发酵工业与环境科学中的研究进展。生物技术通报。11:26-33)。

米根霉糖化酶(R.oryzaeglucoamylase)由两个功能区段组成，氨基端淀粉结合域(SBD)属于碳水化合物结合模块家族21(CBM21)和羧端催化结构区段属于糖苷水解酶家族15(GH15)，这两个区段以O-糖基化连接域连接起来。米根霉糖化酶淀粉结合域SBD(以下除非特指，否则SBD均指来自米根霉糖化酶)含106个氨基酸，其中富含苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)等芳香族氨基酸残基，不含半胱氨酸(C)。

根据氨基酸序列的相似性以及结合配体的差异,碳水化合物结合模块家族(CBM)分为67个，而其中10个又具有结合颗粒淀粉的特性，因此又被称为淀粉结合域(CantarelBL,CoutinhoPM,RancurelC,BernardT,LombardV,HenrissatB.2009.TheCarbohydrate-ActiveEnZymesdatabase(CAZy):anexpertresourceforGlycogenomics.NucleicAcidsRes.37(Databaseissue):D233–238)。来自8种不同CMB家属的SBD晶体结构显示虽然它们的氨基酸序列的同源性低于20％，但特有的芳香族氨基酸残基提供了一个稳定相似的三维空间结构(JiangTY,CiYP,ChouWI,LeeYC,SunYJ,ChouWY,LiKM,ChangMD.2012.Twouniqueligand-bindingclampsofRhizopusoryzaestarchbindingdomainforhelicalstructuredisruptionofamylose.PLoSOne.7:e41131)。

Tung等(2008)通过研究米根霉糖化酶SBD与复合物β-环形糊精及麦芽七糖的晶体结构，发现两个受体结合位置：S-I(W47)和S-II(Y32)，而且这两个糖类结合位置是相互作用的，Y32在有受体结合的情況下会产生结构变化。此外，两段独特的含多个天门冬氨酸区域(polyN)以及长链多糖通过Y67和Y93参与或影响与糖结合(TungJY,ChangMD,ChouWI,LiuYY,YehYH,ChangFY,LinSC,QiuZL,SunYJ.2008.Crystalstructuresofthestarch-bindingdomainfromRhizopusoryzaeglucoamylaserevealapolysaccharide-bindingpath.BiochemJ.416:27-36.)

最近Chu等(2014)的晶体结构进一步阐述了SBD的两个淀粉结合位点：S-I是由高度保守的三个芳香族氨基酸残基W47，Y83和Y94组成；而S-II则由F58和Y32构成。他们还证实糖化酶与淀粉作用过程中，两个淀粉结合位点具有协调和强化功能，也就是说S-II可作为初始识别结合位点，而S-I启始时只是协助S-II，并不能直接结合配体。S-I只有在后续更长配体存在时(葡萄糖单元数超过三个)，才参与糖的结合(ChuCH,LiKM,LinSW,ChangMD,JiangTY,SunYJ.2014.CrystalstructuresofstarchbindingdomainfromRhizopusoryzaeglucoamylaseincomplexwithisomaltooligosaccharide:insightsintopolysaccharidebindingmechanismofCBM21family.Proteins.82:1079-85)。

由于淀粉结合域SBD在结构和功能上的独立性以及淀粉(玉米)基质价廉易得，玉米亲和标签研究吸引了大量国内外学者。一开始人们思考是否能够使用基因工程的手段在其它酶的末端添加SBD，从而使这种被改造的酶具有其它的性质(JugeN,J,LeMF,B,FurnissCS,PlanchotV,ArcherDB,WilliamsonG,SvenssonB.2006.Theactivityofbarleyalpha-amylaseonstarchgranulesisenhancedbyfusionofastarchbindingdomainfromAspergillusnigerglucoamylase.BiochimBiophysActa.1764:275-84；杨键，金辉，王青艳，黄日波；2010；淀粉结合域与淀粉酶的融合表达及其酶学性质；生物加工过程；8:39-43)。

但更多的是将SBD作为亲和标签蛋白应用于快速分离纯化重组蛋白。因为重组蛋白纯化是一个复杂，耗时长，花费大的步骤，往往涉及多种分离方法包括盐析、分子筛、离子交换柱等。而亲和层析例如His亲和标签则可一步分离，缩短时间，在实验室常用。但在工业化生产中由于镍柱太昂贵而无法推广使用。因此如能有一种廉价的亲和标签基质替代昂贵镍柱树脂，在实际应用上具有极大意义(GuillénD,Moreno-MendietaS,AguileraP,SánchezS,FarresA,Rodríguez-SanojaR.2013.Thestarch-bindingdomainasatoolforrecombinantproteinpurification.ApplMicrobiolBiotechnol.97:4141-8)。

巨大的商业潜力还使得部分学者在发表文献同时申请了专利,例如Changetal.于2010年就申请了使用野生型米根霉糖化酶的淀粉结合域用来制备重组蛋白和酶的美国专利(Changetal，2010；发明名称：Recombinantproteincomprisingstarchbindingdomainandusethereof；美国专利号7,662,918)。几乎与此同时，杨淑伟和李建中于2011申请了中国发明专利(发明名称:蛋白标签的联合应用；申请号CN201110110355)。在该专利中，他们也利用野生型的米根霉糖化酶玉米结合域作为标签，类泛素小修饰蛋白(SUMO)作为融合蛋白的切割酶，生产多种重组蛋白和酶类。而Aehleetal.对里氏木霉(Trichodermareesei)糖化酶的淀粉结合域进一步作了大量氨基酸突变，并于2015年申请了美国专利(Aehleetal.发明名称：Glucoamylasevariants；美国专利号：9,029,116)。该专利对涉及淀粉结合域和酶活性区域的大量氨基酸作了突变研究，并明确了某些氨基酸突变与酶的热稳定性和专一性相关性。但该研究并不是米根霉糖化酶，而且对SBD的第33位氨基酸和第58位氨基酸并没有作任何改变。

综观以上各种淀粉结合域标签蛋白研究现状，虽然有多篇文献和专利涉及米根霉糖化酶的淀粉结合域(SBD)甚至三维晶体结构，但对该SBD的突变还所知甚少，尤其是同时对第33位和第58位氨基酸突变未见报道。尽管有机磷农药降解酶的表达量很高，但分离纯化成本在产业化过程中仍占了很大部分。到目前为止，还未见使用野生型SBD或者其突变体在分离纯化有机磷农药降解酶的报道，更未见使用玉米固定化的有机磷农药降解酶应用在农药生产废水处理的报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种淀粉结合域突变体、该突变体与有机磷农药降解酶的融合酶、固定化的融合酶及其制备和应用方法。

通过分析国内外多种淀粉结合域的最新研究进展，并在野生型米根霉糖化酶淀粉结合域SBD基础上，使用分子进化和定向突变，获得多个SBD突变体，结果发现突变体SBD具有更优良的结合和分离性质。使用此突变体通过一个连接肽再与有机磷农药降解酶融合，融合后的酶活性与非融合的比较未见改变。融合酶可以一步快速从发酵液中固定在淀粉基质上，固定化率可达到95％，而且其固定化后的酶活性也未受改变。

本发明还提供了一种经毕赤酵母密码子优化后的SBD突变体与有机磷农药降解酶基因序列及利用酵母表达该基因的方法，其制备方法简单，由于使用优化后的密码子，产量高，适合工业化生产。固定化有机磷农药降解酶可广泛应用在高效消除农药生产废水以及农产品中的农药残留。

米根霉糖化酶淀粉结合域(SBD)具有106个氨基酸残基，其基因序列和氨基酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。发明人通过比较并分析其它来自不同种的淀粉结合域，选取可能位于结合中心或者附近的氨基酸残基进行突变，发现当对第33和58位的两个氨基酸残基进行点突变时，所获的淀粉结合域突变体比野生型蛋白在与淀粉基质结合时，其pH范围更广(±pH1)，这有利于重组有机磷降解酶的固定化和在更广泛pH环境中应用。

因此，本发明的目的之一是提供一种淀粉结合域SBD突变体，其对淀粉结合域蛋白第33位的丝氨酸(S)和第58位的苯丙氨酸(F)独立或同时进行突变，所述突变体具有如SeqIDNo.4所述的氨基酸序列，其中第33位氨基酸X1独立选自苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或天冬酰胺(N)，优选为苏氨酸；第58位氨基酸X2独立选自色氨酸(W)、蛋氨酸(M)或异亮氨酸(I)，优选为色氨酸(W)。优选当X1为苏氨酸，X2为色氨酸时，所述的淀粉结合域蛋白突变体具有如SeqIDNo.6所述的氨基酸序列,研究发现该突变体SBDm(S33T,F58W)具有更优良的与淀粉基质结合和分离性质。

本发明还提供了对SeqIDNo.4所述的淀粉结合域SBD突变体在第33和58位外的氨基酸进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得的具有淀粉结合活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的突变体具有至少与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

本发明还提供了编码上述SBD突变体蛋白的基因序列，所述的基因序列具有如SeqIDNo.3所述的核苷酸序列，其中第97-99位的核苷酸N₁N₂N₃为分别编码苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或天冬酰胺(N)的密码子；第172-174位的核苷酸N₄N₅N₆为分别编码色氨酸(W)、蛋氨酸(M)或异亮氨酸(I)的密码子。当编码苏氨酸和色氨酸时，所述的突变体基因具有如SeqIDNo.5所述的核苷酸序列。

同理，本发明还保护对SEQIDNO.3所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留淀粉结合活性的突变体蛋白的DNA分子。优选的突变体基因具有至少与SEQIDNO:3所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

本发明的目的之二是提供一种上述淀粉结合域突变体直接连接或通过连接肽与有机磷农药降解酶连接的融合酶，这样的融合酶可以快速固定在淀粉基质上，应用于农药生产废水处理。该融合蛋白结构中，淀粉结合域突变体的C末端可以直接或通过连接肽与有机磷农药降解酶的N端相连，或者有机磷农药降解酶的C末端直接或通过连接肽与淀粉结合域突变体的N端相连。连接肽为5-15个氨基酸，例如取自于人血清白蛋白结构域I和结构域II之间的氨基酸序列或者形如[GlyGlyGlyGlySer]n的氨基酸序列，n为1-3的整数，优选n为1。优选的连接肽序列为人血清白蛋白结构域I和结构域II之间的氨基酸序列，其序列如SEQIDNo.8，所示，而密码子优化后的DNA序列如SEQIDNo.7所示。

上述的融合酶蛋白结构中，有机磷农药降解酶是使用野生型的有机磷农药降解酶(OP)或其突变体，优选的突变体具有至少与野生型有机磷农药降解酶的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。关于有机磷农药降解酶及其突变体的描述详细可参考中国专利201210458400.8和201310384286.3等文献，在此全部引入作为参考。有机磷农药降解酶蛋白具有300个氨基酸残基，氨基酸序列如SEQIDNo.18。可以对有机磷农药降解酶蛋白L116或M164两个氨基酸残基进行点突变，所获的有机磷农药降解酶突变体比未突变的酶蛋白的生物学活性至少要增强10％以上。其中，第116位的亮氨酸(L)可以突变为蛋氨酸(M)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)，优选为蛋氨酸(M)；第164位蛋氨酸(M)可以突变为苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或异亮氨酸(I)，优选为苯丙氨酸(F)。

优选的，本发明提供的融合酶中，有机磷农药降解酶突变体优选OP_M164F或OP_L116M。OP_M164F的氨基酸序列如SEQIDNo.14所示，而密码子优化后的DNA序列如SEQIDNo.13所示。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种融合酶，其中淀粉结合域突变体SBDm(S33T,F58W)的C末端通过连接肽与有机磷农药降解酶OP_M164F的N端相连，所述融合蛋白具有如SeqIDNo.16所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种制备淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)在保持各自基因密码子阅读框架不变的前提下，在淀粉结合域基因或淀粉结合域-连接肽基因，以及有机磷农药降解酶基因的各两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达载体上；

(2)将表达载体转化导入酵母菌中，经筛选得到重组基因工程菌；

(3)高密度发酵重组酵母菌，诱导表达后离心收集发酵上清液，经分离纯化获得重组淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶。

上述方法步骤(1)中，淀粉结合域和有机磷农药降解酶可以是野生型的，也可以是突变体；其中淀粉结合域突变体、有机磷农药降解酶突变体和连接肽的定义如前所述。

上述方法步骤(1)中，根据全球公共序列数据库GeneBank记载序列号为ABI75077.1的米根霉糖化酶淀粉结合域的核苷酸序列为模板，加上人血清白蛋白结构域I和结构域II之间的连接序列(GeneBank记载序列号为NM_000477.5)，在其融合序列两端引入限制性酶切位点，优选在前端加入限制性内切酶XhoI的酶切位点，后端加入限制性内切酶KpnI的酶切位点。按照毕赤酵母的密码子偏好性改变核苷酸序列，将设计好的DNA序列(SEQIDNo.9)进行化学合成。当以野生型SBD的重组酵母表达载体为模版，使用突变试剂盒对野生型SBD进行基因定点突变(第33位和第58位氨基酸)，获得含SBD突变体的重组酵母表达载体。

有机磷农药降解酶基因片段通过PCR获得。根据我们以前密码子优化后的野生型有机磷农药降解酶基因、突变体OP_M164F、突变体OP_L116M或其突变体基因，设计2个引物,两端分别引入KpnI和XbaI的酶切位点和保护碱基：

上游引物序列:5’gactgtGGTACCGCTGCTCCCGCTCAACAAAAAACTC3’；

下游引物序列:5’gactgtTCTAGACTATTATCTATCAGAACGGATTGG3’；

在一个优选的实施例中，使用突变体OP_M164F基因，所获得的PCR产物的DNA序列如SEQIDNo.13所示。整个融合酶包括淀粉结合域突变体SBDm、连接肽Linker、有机磷农药降解酶OP_M164F,其氨基酸序列如SEQIDNo.16所示，其编码的DNA序列如SEQIDNo.15所述。

上述化学合成的编码淀粉结合域或淀粉结构域-连接肽的DNA序列，以及通过PCR合成的有机磷农药降解酶基因可用本领域公知的方法克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D₂，pPIC9，pHIL-S₁(InvitrogenCorp.SanDiego.California.USA)，动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(AmershamPharmaciaBiotechInc.USA)等。优选的方法是将编码本发明中的目标酶的核酸克隆至酵母表达载体pPICZ-α-A，该质粒为酵母整合型质粒，带有醇氧化酶操纵子(AOX1)5’序列和3’序列，用于方便编码基因整合至酵母染色体，和控制编码基因的表达。这些质粒及对应的宿主菌等可以从InvitrogenCorp.SanDiego.California.USA构得，优选的启动子为AOX1。

在一个优选的实施例中，对野生型淀粉结合域SBD-连接肽基因Linker，有机磷农药降解酶OP_M164F基因,酵母表达载体pPICZ-α-A进行双酶切。优选用限制性内切酶XhoⅠ和KpnI对SBD-Linker基因进行酶切；用KpnI和XbaⅠ对OP_M164F基因进行酶切；对酵母表达载体pPICZ-α-A进行XhoI和1XbaI双酶切。将酶切后的SBD-Linker片段，OP_M164F基因片段与酵母表达载体pPICZ-α-A进行连接，将连接后的产物转入大肠杆菌DH5α内(图1)。选取重组菌落，提取质粒经过双酶切证实并进行DNA序列测定，经确认无误后，继续下面突变工作。

通过比较并分析其它大量不用种类的淀粉结合域，选取可能位于结合中心或者附近的氨基酸残基进行突变，尤其是以下两个氨基酸残基进行点突变：S33T或F58W，更优选的是同时对两氨基酸进行点突变S33T和F58W。点突变可通过本领域常用的基因定点突变技术进行，优选按照碧云天生物技术研究所的《基因定点突变试剂盒》，对这些突变位点合成引物。此试剂盒的原理是只需通过基于PCR的突变质粒的合成,和基于DpnI的模板质粒的消化,转化培养以及后续的酶切或测序鉴定,即可得到预期的突变质粒。

以上述制备得到的含野生型淀粉结合域-连接肽-有机磷农药降解酶融合基因的质粒为模版，进行常规的基因定点突变PCR反应。PCR反应后,直接在PCR反应体系中加入DpnI孵育，DpnI消化完毕后可以直接用于大肠杆菌转化,转化子质粒经过限制性酶切以及DNA序列分析证实正确后用于宿主载体转化。

载体可经转化或转染至原核生物或真核生物宿主。转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态的原生质球等。表达目标蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等,优选为酵母菌，如酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母等，更优选为毕赤酵母。目标蛋白或酶可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是酵母MFα信号肽。

可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌、转基因动植物等，生产本发明的淀粉结合域突变体融合的有机磷农药降解酶。将构建完成的基因工程菌进行液体培养和发酵,通过甲醇诱导。将经甲醇诱导后的培养液离心，收集上清液。可以用各种蛋白分离的方法分离纯化蛋白，如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

本发明还提供了一种固定化有机磷农药降解酶，所述的固定化酶使用玉米颗粒作为基质制备得到，其中淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶结合在玉米颗粒上。

淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶的定义如前所述。在一个优选的实施例中，使用的是含有淀粉结合域突变体的有机磷农药降解酶OP_M164F，也就是融合酶SBDm(S33T,F58W)-Linker-OP_M164F。

本发明还提供了一种制备固定化有机磷农药降解酶的方法，所述方法包括如下的步骤：

(1)预处理淀粉基质；

(2)将预处理的淀粉基质加入到含有淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶的溶液中，混匀，晾干，即得所述的固定化酶。

其中，淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶的定义如前所述。

上述方法步骤(1)，所述的淀粉基质可选自淀粉含量比较高的粮食作物例如玉米、大米、小米、大麦、小麦、燕麦、高粱、马铃薯、红薯、木薯等的颗粒以及由这些淀粉加工过的细微颗粒、凝胶、粉丝等，优选为玉米颗粒。淀粉基质颗粒大小为3250目(2um)-14目(1165um)，更优先的是1250目(10um)-32目(495um)，最优先是180目(83um)-110目(150um)。

上述方法步骤(1)中，可以依次使用碱性溶液、酸性溶液、双蒸水，或者酸性溶液、碱性溶液、双蒸水次序预处理淀粉基质。优选用的碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钙(石灰水)、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水等，更优选的是氢氧化钠、氢氧化钙(石灰水)、氢氧化钾，最优选的是氢氧化钠。优选用的酸性溶液为盐酸、硫酸、硝酸、乙酸(醋酸)、碳酸等,更优选的是盐酸、硫酸、硝酸，最优选的是盐酸。碱性溶液和酸性溶液的优选浓度为0.01M至5M，更为优选的是0.05M至1M，最为优选的是0.1至0.3M。

上述方法步骤(2)中，含有淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶的溶液可以为含有融合酶的发酵液上清液或经分离纯化后的含融合酶溶液。使用时调节溶液pH至1-9，优选为4-6.5，最佳为5.75。将预处理玉米粉颗粒加入到含有融合酶的发酵液上清液或经分离纯化后的含融合酶溶液中，按照0.1mg/ml-50mg/ml比例,更佳为1mg/ml-10mg/ml，最佳为5mg/ml比例混匀，温育1-5小时后(优选2-3小时)，用pH6-8的缓冲液(优选5-100mM磷酸缓冲液)冲洗，晾干，密闭容器4℃保存备用。

SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白浓度分析结果显示，淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合酶的结合率在95.0％以上。在pH1.0和pH9.0之间玉米颗粒都有较好的直接结合农药降解酶的特性，其中pH5.75具有最强的结合能力。这与淀粉结合域未突变的融合酶(SBD-Linker-OPM164F)比较，其结合的pH宽度要大±1，有利于更广pH条件下固定化。其最佳结合pH也从5.5移动到5.75，更接近于中性pH。

使用甲基对硫磷作底物我们也比较了融合酶与非融合酶的活性。结果发现含有淀粉结合域亲和标签的有机磷农药降解酶(融合酶)与单纯非融合的有机磷农药降解酶，在同摩尔条件下比较，其活性为98.4％(p>0.05)，说明融合酶的活性并没有受到影响。此外，通常酶在固定化后往往会发生活性降低。我们的结果发现固定化后的融合酶活性与固定化之前的融合酶没有发生显著变化(97.3％，(p>0.05))。

玉米除了作为酶固定化基质以外，还可以作为亲和标签基质用于分离纯化重组蛋白或酶。我们将上述经过温育后的含有固定化有机磷农药降解酶的玉米颗粒装入柱子，然后用pH≥11的强碱性溶液洗脱，经过透析，pH调整至8.0。我们的结果显示经过玉米基质结合，而后用高pH溶液洗脱分离纯化的有机磷农药降解酶的得率在87.3％，而经过强碱性溶液处理后的酶活性与处理前的比较也没有发生显著变化(96.1％)。说明该淀粉结合域突变体可以作为亲和标签应用于分离纯化其它重组蛋白。

本发明还提供了一种利用上述固定化淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合酶在农药生产污水处理的应用，所述的农药包括甲基对硫磷，敌敌畏，氧化乐果，三唑磷，敌百虫，马拉硫磷，辛硫磷，毒死蜱，丙溴磷，甲拌磷、治螟磷等有机磷农药。

在一个优选的实施例中，使用固定化有机磷农药降解酶对甲基对硫磷模拟废水作了降解试验。首先将上述有机磷农药降解酶固定化后的玉米颗粒装入长为3米的柱子。配制含有甲基对硫磷浓度为0.1％(1000ppm)的10mM磷酸缓冲液(pH7.5)作为模拟农药废水，控制流速为10ml/分钟。我们酶降解结果显示进水口的甲基对硫磷浓度是0.1％或1000ppm，出水口的浓度是3.6ppm，降解效率为99.64％。虽然甲基对硫磷目前并不作为农药使用，但该方法因为检测方便，是一种非常有应用价值的鉴定有机磷农药降解酶降解效果的方法。

在另一个优选的实施例中，使用上述固定化有机磷农药降解酶对农药敌敌畏模拟废水作了降解试验。敌敌畏是目前仍然常用的有机磷农药。我们使用市场上购买的敌敌畏乳油，配置含0.1％(1000ppm)敌敌畏的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)作为模拟农药废水。将有机磷农药降解酶固定化后的玉米颗粒装入长为3米的柱子，控制流速为10ml/分钟。我们酶降解结果显示进水口的敌敌畏浓度是0.1％(1000ppm)，出水口的浓度是6.4ppm，降解效率为99.36％，说明玉米固定化后的有机磷农药降解酶在降解农药生产废水和其它农药污染水方面具有很大的应用价值。

附图说明

图1淀粉结合域(SBD)、连接肽(Linker)、有机磷农药降解酶与表达质粒的构建过程。

图2重组融合酶(淀粉结合域突变体SBDm(S33T,F58W)-连接肽-有机磷农药降解酶OPM164F)的SDS-PAGE凝胶电泳图。图中标号：样品槽M为蛋白分子量标准品(kDa)，自上而下依次为：71、55、35、25；样品槽1，酵母经甲醇诱导后的3ul培养液(第0天)；样品槽2、3、4：酵母经甲醇诱导后的3ul培养液(第3、4、5天)。

具体实施方式

1、野生型淀粉结合域(SBD-连接肽(Linker)、有机磷农药降解酶OP_M164F的DNA设计和合成

根据全球公共序列数据库GeneBank记载序列号为ABI75077.1的米根霉糖化酶的核苷酸序列为模板，将淀粉结合域(SBD)的密码字按照毕赤酵母进行优化(SEQIDNo.1)，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。分别在其前端加入限制性内切酶XhoI的酶切位点，后端加入限制性内切酶KpnI的酶切位点，并在KpnI酶切位点前端加入连接肽Linker如SEQIDNo.8所示，以保持SBD与其它融合酶之间的灵活性。该连接肽来自于人血清白蛋白结构域I和II之间的氨基酸序列，其密码子已按照毕赤酵母作了优化，其DNA序列如SEQIDNo.7所示。XhoI所导致的两个氨基酸(LE)和引入的两个碱性氨基酸(KR)密码子属于毕赤酵母α信号肽，也是毕赤酵母内在酶切位点。将设计好的SBD以及连接肽和限制性内切酶位点(SEQIDNo.9)进行化学合成。此DNA序列在毕赤酵母所产生的氨基酸序列如SEQIDNo.10,其中最前面编码的4个氨基酸属于信号肽而除去。

根据我们以前密码子优化后的有机磷农药降解酶突变体基因OP_M164F(专利号：ZL201210458400.8)设计2个引物,上下游分别引入KpnI和XbaI的酶切位点和保护碱基,此DNA片段编码有机磷农药降解酶OP_M164F基因。上游引物序列:5’gactgtGGTACCGCTGCTCCCGCTCAACAAAAAACTC3’；下游引物序列:5’gactgtTCTAGACTATTATCTATCAGAACGGATTGG3’。委托上海生工生物公司合成引物。PCR的方法是:50μl体系中加入5μl10×Pfu缓冲液(含MgSO₄),40μl水,1ng含有机磷农药降解酶突变体OP_M164F基因的任何质粒,上下游引物各1μl(5μmol/L),1μldNTP(10mMeach),1μlPfuDNA聚合酶。所有试剂均从上海生工订购。用Bio-Rad公司的PCR仪扩增DNA,PCR条件为94℃预变性2分钟,94℃变性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸1分钟,循环35次。反应结束后，用EZ-10SpinColumnPCRProductPurificationKit试剂盒(上海生工生物公司)进行回收纯化。

2、重组质粒构建

野生型淀粉结合域-连接肽、有机磷农药降解酶的重组质粒构建如图1所示。

(1)化学合成的淀粉结合域-连接肽基因用XhoⅠ和KpnI进行双酶切

将含有SBD-Linker的质粒pUC57-SBD-Linker(上海生物工程有限公司)进行双酶切：20ug质粒DNA，20ul10X酶切缓冲液，5ulXhoI和5ulKpnI，加水至总体积200ul，37℃，6小时。

(2)PCR纯化后的有机磷农药降解酶基因OP_M164F用KpnI和XbaⅠ进行双酶切

将编码有机磷农药降解酶基因的PCR产物进行双酶切：10ug质粒DNA，10ul10X酶切缓冲液，2.5ulKpnI和2.5ulXbaI，加水至总体积100ul，37℃，6小时。

(3)pPICZ-α-A质粒的双酶切

为了使表达的融合蛋白能分泌到酵母胞外,选择pPICZ-α-A(Invitrogen公司)作为载体,在该载体克隆位点的XhoI和XbaI,插入融合蛋白的基因。在0.5ml离心管中加入2μg酵母表达载体pPICZ-α-A、3.0μl限制性内切酶XhoⅠ、3.0μ1限制性内切酶XbaⅠ、10μ1限制性内切酶缓冲液，加去离子水至100μl，混合均匀，将混合物放入37℃水浴锅中，反应5小时，取出备用。

上述步骤1-3的酶切DNA产物均用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物公司)进行回收，备用。

(4)将步骤(1)(XhoI/KpnI双酶切),步骤(2)(KpnI/XbaI双酶切)得到的DNA片段产物与步骤(3)pPICZαA(XhoI/XbaI双酶切)质粒通过T4DNA联结酶催化连接。

连接体系的配制：在0.5ml离心管中加入0.1μg酶切酵母表达载体pPICZ-α-A、0.1μg酶切SBD-Linker片段、0.1μg酶切农药降解酶片段、1.0μ1T4DNA连接酶缓冲液(10倍)、1.0μ1T4DNA连接酶混合均匀，16℃条件下，放置12小时，形成混合物备用。

3、连接产物转化至感受态的大肠杆菌DH5α

在1.5ml离心管中加入100μ1大肠杆菌DH5α感受态细胞和8μ1质粒连接混合物，混合均匀，将1.5ml离心管置于冰水混合物中，放置20分钟，后取出将1.5ml离心管置于42℃的水浴锅内，放置90秒，取出，再将1.5ml离心管置于冰水混合物中，放置5分钟后。加入1mlLB液体培养基，混合均匀，37℃摇床温育1小时，3000转/分离心5分钟后，弃去上清液，将管底的菌体涂布于含25μg/ml博莱霉素的LB固体培养基上，放置20分钟，后置于37℃条件下，培养16小时，形成菌落。

4、重组质粒的筛选和鉴定：

选取三个重组菌落，用上海生物工程有限公司的UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒提取质粒。重组质粒经过双酶切证实后，再送至同一公司序列测定，经确认后，获得含野生型淀粉结合域的有机磷农药降解酶表达质粒，pSBD-Linker-OP_M164F。以此质粒为模版，继续下面淀粉结合域SBD的突变工作。

5、淀粉结合域突变体(SBDm)基因

通过对多种天然淀粉结合域(SBD)结合中心以及晶体结构的查找和分析，在确定结合中心的基础上，对第33位氨基酸和第58位氨基酸同时进行替换(S33T，F58W)。密码子优化后的突变体SBDmDNA序列如SEQIDNo.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.6。

(1)按照碧云天生物技术研究所《基因定点突变试剂盒》的要求，对这些突变位点合成以下所需的引物。

第33位氨基酸(S33T)：

5'端引物：

5’ggaaaaatttatgtcaagaacattgcttacACTaagaaagttactgtagtttacgccg3’；

3'端引物：

5’cggcgtaaactacagtaactttcttAGTgtaagcaatgttcttgacataaatttttcc3’。

第58位氨基酸(F58W)：

5'端引物：5’atggaaacaccattgctgcttctTGGtctggccctatctctggatcaa3’；

3'端引物：5’ttgatccagagatagggccagaCCAagaagcagcaatggtgtttccat3’。

(2)基因定点突变反应:

(3)按照上面的顺序依次加入各种试剂，使总体积为49ul。混匀后,加入1ulPfuDNA聚合酶混匀。

按照如下参数设置PCR仪:步骤1(最初变性)：循环为1，温度950C，时间40秒；步骤2(扩增)：循环为18，温度950C，40秒，变性；600C1分钟退火；680C1.5分钟/kb延伸；步骤3(延伸和补全)：循环为1，温度950C，时间40秒；720C10分钟；步骤4(暂时存放)：循环为1，温度40C长时间保持。

(4)DpnI消化

PCR反应后,直接在PCR反应体系中加入1ulDpnI,混匀后370C孵育1小时。DpnI消化完毕后可以直接用于转化,或者-20℃保存备用。

(5)转化和克隆鉴定

根据所使用的感受态细菌,加入尽量多的经过DpnI消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过DpnI消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作,在涂板前通过离心浓缩的办法,把所有被转化后的细菌,全部涂布到含有适当抗生素的平板上,培养过夜。取3个酶切鉴定正确的克隆去测序,最终确认全部3个克隆都是预期的突变克隆，选取pSBDm-Linker-OPM_164F作进一步工作。密码子优化后的突变体SBDm-Linker-OPM164FDNA序列如SEQIDNo.15所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.16。

6、毕赤酵母基因工程菌构建

(1)重组质粒的线性化

在1.5ml离心管中加入50μg重组质粒pSBD-Linker-OP_M164F(野生型淀粉结合域)或者pSBDm-Linker-OP_M164F(突变型淀粉结合域)、10μ1限制性酶切酶SacI、20μ1的10X限制性酶切酶SacI缓冲液和170μ1去离子水，混合均匀，置于37℃水浴锅内，放置4小时。加入12μl5MNaCl，再加入636μl95％乙醇,-20℃放置15min,离心5min(12000rpm)。用1200μl75％乙醇洗涤3次,室温晾干后,溶解在20μl的无菌水-20℃保存,待电转化。

(2)酵母阳性重组子的备制及筛选

在4ml离心管中加入10μg线性化的载体质粒和100μ1的毕赤酵母X-33菌感受态细胞(0D600＝1)，混合均匀。在0℃条件下，将电击杯放于浓度为70％的乙醇中，浸泡30分钟后，取出，在电击杯内放入105μ1混合液，将电击杯放置5分钟，后将电击杯放到电转化仪内，进行电击，电脉冲为25微法，电压为1.4千伏，电阻为200欧姆，电击时间为0.05秒。电击结束后，取出含有混合液的电击杯，后在电击杯内加入1mlD-山梨醇(1M)，将混合物加到1.5ml离心管中，30℃摇床中，转速为225rpm，培养1小时后，取100μ1培养后的混合物，并将其涂布于含有浓度为25μg/ml博莱霉素的YPDS固体培养基上，将涂布后的YPDS固体培养基置于30℃培养箱内，培养4天，得到白色单菌落。将以上得到的全部白色单菌落接种到含500μg/ml博莱霉素的YPDS固体培养基上，置于30℃培养箱内，培养3天，观察到单个菌落，即得到的阳性重组子。

7、阳性酵母重组子的诱导表达

将表达野生型或突变型淀粉结合域的有机磷农药降解酶的酵母菌，接种到100ml锥形瓶中的20mlBMGY液体培养基(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾pH6.0，1.34％YNB4×10^-5％生物素，1％甘油)，将菌液置于30℃条件下，摇床培养(200转/分钟)至OD600＝5时，取8ml菌液离心(4000rpm，3分钟)，将菌体转移到100ml锥形瓶中的20mlBMMY培养基(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾pH6.0，1.34％YNB4×10^-5％生物素,0.5％甲醇)，30℃继续培养120小时，在培养过程中每隔12小时添加0.1ml浓度为100％的无水甲醇，诱导表达直至5天。经离心收集上清,得发酵液。

含野生型淀粉结合域的有机磷农药降解酶(BSD-OP_M164F)或突变型淀粉结合域的有机磷农药降解酶(BSDm-OP_M164F)含414个氨基酸残基，其理论分子量为45.0kDa。经过摇瓶诱导培养四天后，SDS-PAGE电泳分析显示工程株表达的BSDm-OP与BSD-OP和产量和性质相似，约占各自总分泌蛋白的86.7％(图2)和85.4％，而且其分子量与理论值一致。以牛血清白蛋白为标准，最高融合蛋白含量各自为1.73克/升和1.67克/升，与以前我们报道的非融合有机磷农药降解酶的表达产量相似。如果在发酵罐中诱导培养，由于可调节更优的培养条件例如溶氧量和营养成份，表达量往往可比摇瓶高3-10倍。

8、玉米颗粒固定化含淀粉结合域突变型亲和标签的有机磷农药降解酶

重组酶的N-端含有淀粉结合域蛋白可作为亲和标签，结合在玉米颗粒上。本发明还提供了一种使用廉价玉米基质直接从发酵培养液中固定化含野生型或突变型淀粉结合域的有机磷农药降解酶，所述方法包括如下步骤：

(1)、预处理玉米粉颗粒

称取10g玉米粉,先后用1L清水，100mlNaOH(0.1M)，100mlHCl(0.1M)各洗10分钟，最后用双蒸水洗三遍,滤干备用；

(2)、将经甲醇诱导后的培养液，离心(10000rpm,4℃，10分钟)，收集上清液。取50ml发酵上清液加入到250ml三角烧瓶中，然后用1MHCl或1MNaOH调节发酵上清液的pH至5.75；

(3)、烧瓶中加入0.25g预处理的玉米粉(5mg/ml)，室温,摇床上50转/分,2小时；

(4)将玉米粉装入柱子，然后用10ml的磷酸缓冲液(pH8.0)，或不同pH的洗脱液洗脱。

A.固定化率

为了计算降解酶在玉米颗粒上的结合率，按照步骤1-4方法，取发酵上清液、玉米孵育后的发酵上清液、洗脱液样品各100ul，用BCA试剂盒(上海生工生物科技有限公司)测定蛋白浓度。使用牛血清白蛋白BSA作为标准，BCA检测结果显示在pH1.0和pH9.0之间，特别是pH4.0和pH6.5之间玉米颗粒都有很好的固定野生型淀粉结合域SBD-OP或突变型淀粉结合域SBDm-OP农药降解酶的特性，其中SBD-OP最佳结合pH为5.5，而突变体SBDm-OP为pH5.75。突变体具有较高接近于中性的pH，因此作为亲和标签更有益于对pH敏感的酶蛋白分离纯化。

通过SDS-PAGE凝胶电泳分析，上清液中融合酶约占总分泌蛋白的86.7％。经过2小时的孵育，酵母上清液中的82.4％蛋白被吸附在玉米颗粒上。考虑到融合蛋白BSDm-OP约占总分泌蛋白的86.7％，目标蛋白的吸附率在95.0％以上。

B.固定化对酶活性影响

使用甲基对硫磷作底物我们测试并比较了融合酶与非融合酶的活性。结果发现含有淀粉结合域亲和标签的有机磷农药降解酶(融合酶)与单纯非融合的有机磷农药降解酶，在同摩尔条件下比较，其活性为98.4％(p>0.05)，说明融合酶的活性并没有受到影响，很可能在淀粉结合域蛋白与有机磷农药降解酶之间含有连接肽的缘故。

通常酶在固定化后往往会发生活性降低。我们用相同方法比较了固定化前后的酶活性，发现固定化后的融合酶活性与固定化之前的融合酶没有发生显著变化(97.3％，(p>0.05))。

C.固定化酶的结合力

为了测试融合酶在玉米上的固定强度，pH1.0至12.0的各种洗液(10mM)对玉米颗粒上的重组融合酶进行了冲洗，结果发现融合酶在pH1.0-10.0之间牢固地结合在玉米颗粒上。只有当pH10.5或以上时，结合的酶才开始分离。虽然pH10.5或以上碱性较强，但短时间处理并没有对农药降解酶的酶活性产生任何影响。

D.淀粉结合域突变体SBDm可作亲和标签分离纯化其它重组蛋白

玉米除了作为酶固定化基质以外，还可以作为亲和标签基质用于分离纯化重组蛋白或酶。我们将上述固定化有机磷农药降解酶的玉米颗粒装入柱子，然后用pH11.0的强碱性溶液洗脱，经过透析，pH调整至8.0。发现分离纯化后的有机磷农药降解酶的得率在87.3％，而经过碱性溶液处理后的酶活性与处理前的比较也没有发生显著变化(92.5％)，因此可应用于亲和标签分离其它重组蛋白。

9、固定化的淀粉结合域突变体-有机磷农药降解酶在降解甲基对硫磷中应用

国内外对农药废水特别是对有机磷农药废水基本上采用生物法，我国自20世纪60年代也开始对有机磷农药工业废水处理进行研究，并确认生物法是一条可行的技术途径。我国农药废水特别是有机磷农药废水处理是以好氧生物降解为主，包括传统的活性污泥法，其曝气方式为鼓风曝气、表面机械曝气等。生产废水的进水有机磷浓度一般为40～120mg/L，出水达国家规定排放标准为10mg/L(10ppm)左右。

但由于农药废水成分复杂，毒性大，直接采用生物法处理较困难，一般在进行生物处理之前需辅以适当的预处理措施。本发明使用的玉米固定化的有机磷农药降解酶由于是酶，不是微生物，所以对农药废水中的有机磷农药具有很大的耐受性，具有非常明显的成本和简单工艺优势。

本发明提供了一种使用固定化有机磷农药降解酶降解含甲基对硫磷污水或废水的方法。虽然甲基对硫磷目前并不作为农药使用，但因为检测方便，可以作为监测降解其它有机磷农药的基本方法,所述方法包括如下步骤：

(1)制备预处理玉米粉颗粒

称取1000g玉米粉,先用10L清水，继用10LNaOH(0.1M)，然后用10LHCl(0.1M)各洗30分钟。最后用双蒸水洗三遍,滤干备用。

(2)经过诱导培养后，将发酵液离心或过滤除去酵母菌体，用1MHCl或1MNaOH调节发酵上清液的pH至5.75，然后将1000g预处理玉米粉加入到20L发酵上清液，室温,摇床上50转/分,3小时。

(3)将预处理玉米粉装入长为3米的柱子。控制流速为10ml/分钟。模拟农药废水为含有0.1％(1000ppm)甲基对硫磷的磷酸缓冲液(10mM，pH7.5)。

(4)使用甲基对硫磷作底物测试有机磷农药降解酶降活性的方法

用甲醇配制2ml甲基对硫磷(10mg/ml)，然后配制10ml甲基对硫磷降解反应液：7.5ml去离子水+0.5ml1MTris-HCl(pH8.0)缓冲液+1ml甲醇+0.1MZnCl₂(10ul)+10mg/ml甲基对硫磷(50ul)。按以下实验步骤进行甲基对硫磷的浓度测试。取各酶样品10ul,加入到990ul去离子水，配制成10^-2酶液；再取100ul10^-2酶液加入到900ul去离子水，配制成10^-3酶液。在1.5ml离心管加入900ul甲基对硫磷降解反应液和10^-3酶液(100ul)，混匀后加入转移到分光光度计中在412nm波长下，测量光密度。用1.5ml离心管加入900ul甲基对硫磷降解反应液和100ul去离子水作为对照。根据甲基对硫磷降解产物硝基酚(黄色)的固有吸光常数(OD₄₁₂nm＝16500，测量光密度可容易计算出降解浓度。

通过比较进水口和出水口的甲基对硫磷的浓度，可以计算出降解酶的降解效率。我们的结果显示进水口的甲基对硫磷浓度是0.1％(1000ppm)，出水口的浓度是3.6ppm，降解效率达99.64％。

10、固定化的有机磷农药降解酶在降解敌敌畏农药废水中的应用

敌敌畏为广谱性杀虫、杀螨剂，是目前生产量大而且仍然常用的有机磷农药。本发明还提供了一种使用固定化有机磷农药降解酶对敌敌畏模拟废水作了降解方法，所述方法包括如下步骤：

(1)制备预处理玉米粉

称取1000g玉米粉,先用10L清水，继用10LNaOH(0.1M)，然后用10LHCl(0.1M)各洗30分钟。最后用双蒸水洗三遍,滤干备用。

(2)经过诱导培养后，将发酵液离心或过滤除去酵母菌体，用1MHCl或1MNaOH调节发酵上清液的pH调整到5.75，然后加入1000g预处理玉米粉至20L发酵上清液，室温,摇床上50转/分,3小时。

(3)将预处理玉米粉装入长为3米的柱子。模拟农药废水为含0.1％(1000ppm)敌敌畏的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)。敌敌畏农药为市场购买的77.5％(乳油)(江苏省南通江山农药化工股份有限公司，产品编号94264)，控制流速为10ml/分钟。

(4)敌敌畏浓度的测定

敌敌畏浓度测定的原理是基于敌敌畏在碱性溶液中可快速分解成磷酸二甲酯和二氯乙醛，而二氯乙醛在酸性条件下与2,4-二硝基苯肼发生加成反应生成二氯乙醛-2,4-二硝基苯腙。二氯乙醛-2,4-二硝基苯腙溶于乙醇并在乙醇溶液中呈蓝色，根据颜色深浅进行比色定量。

测量方法首先按照以上方法配制溶液，将标准管、样品管一起置于冰水浴中冷至0℃以防止挥发。各管分别加入已预冷至0℃的1.2N氢氧化钠溶液0.5ml，盖紧盖子，颠倒混匀，0℃保持15min以生成二氯乙醛。取出，加入0.3ml含0.1％2，4-二硝基苯肼的4N盐酸溶液混匀，以生成二氯乙醛-2，4-二硝基苯腙。置于37℃水浴1h，取出冷却至室温(20℃)，然后加入4N氢氧化钠溶液0.3ml，混匀。再加入95％乙醇1.4ml，混匀(溶于乙醇呈蓝色)，显色5min。用580nm波长，以标准色列“1”管作参比调节零点，测其光密度。

我们酶降解结果显示进水口的敌敌畏浓度是0.1％(1000ppm)，出水口的浓度是6.4ppm，降解效率为99.36％，说明玉米固定化后的有机磷农药降解酶在降解农药生产废水方面具有很大的应用价值。

Claims (10)

1.一种淀粉结合域SBD突变体，其特征在于：对淀粉结合域蛋白第33位的丝氨酸(S)和第58位的苯丙氨酸(F)独立或同时进行突变，所述突变体具有如SeqIDNo.4所述的氨基酸序列，其中第33位氨基酸X1独立选自苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或天冬酰胺(N)，第58位氨基酸X2独立选自色氨酸(W)、蛋氨酸(M)或异亮氨酸(I)；或对SeqIDNo.4所述的淀粉结合域SBD突变体在第33和58位外的氨基酸进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得的具有淀粉结合活性的衍生蛋白质。

2.根据权利要求1所述的淀粉结合域SBD突变体，其特征在于：所述淀粉结合域突变体蛋白的X1为苏氨酸，X2为色氨酸，所述的淀粉结合域蛋白突变体具有如SeqIDNo.6所述的氨基酸序列。

3.一种编码权利要求1所述的淀粉结合域SBD突变体的基因，所述的基因具有如SeqIDNo.3所述的核苷酸序列，其中第97-99位的核苷酸N₁N₂N₃为分别编码苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或天冬酰胺(N)的密码子，第172-174位的核苷酸N₄N₅N₆为分别编码色氨酸(W)、蛋氨酸(M)或异亮氨酸(I)的密码子；或对SEQIDNO.3所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留淀粉结合活性的突变体蛋白的DNA分子。

4.一种权利要求1-2任一项所述的淀粉结合域突变体与有机磷农药降解酶的融合酶，其特征在于：所述融合蛋白结构中，淀粉结合域突变体的C末端直接或通过连接肽与有机磷农药降解酶的N端相连，或者有机磷农药降解酶的C末端直接或通过连接肽与淀粉结合域突变体的N端相连；其中，连接肽为5-15个氨基酸；有机磷农药降解酶是野生型的有机磷农药降解酶或其突变体。

5.根据权利要求4所述的融合酶，其特征在于：连接肽为取自于人血清白蛋白结构域I和结构域II之间的氨基酸序列，其序列如SEQIDNo.8所示。

6.根据权利要求4所述的融合酶，其特征在于：融合蛋白中的有机磷农药降解酶突变体为对有机磷农药降解酶蛋白L116或M164两个氨基酸残基进行点突变；其中，第116位的亮氨酸(L)可以突变为蛋氨酸(M)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；第164位蛋氨酸(M)可以突变为苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或异亮氨酸(I)。

7.根据权利要求4所述的融合酶，其特征在于：淀粉结合域突变体SBDm(S33T,F58W)的C末端通过连接肽与有机磷农药降解酶OP_M164F的N端相连，所述融合蛋白具有如SeqIDNo.16所示的氨基酸序列。

8.一种制备权利要求4-7任一项所述的淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)在保持各自基因密码子阅读框架不变的前提下，在淀粉结合域基因或淀粉结合域-连接肽基因，以及有机磷农药降解酶基因的各两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达载体上；

(2)将表达载体转化导入酵母菌中，经筛选得到重组基因工程菌；

(3)高密度发酵重组酵母菌，诱导表达后离心收集发酵上清液，经分离纯化获得重组淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶。

9.一种制备固定化权利要求4-7任一项所述的淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶的方法，所述方法包括如下的步骤：

(1)预处理淀粉基质；

(2)将预处理的淀粉基质加入到含有淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合蛋白酶的溶液中，混匀，晾干，即得所述的固定化酶。

10.权利要求9所述的方法制备的固定化淀粉结合域-有机磷农药降解酶融合酶在农药生产污水处理中的应用。