CN101144072A

CN101144072A - 定点突变改造的植酸酶

Info

Publication number: CN101144072A
Application number: CNA2006101221098A
Authority: CN
Inventors: 徐安龙; 荆琛峰; 梁东
Original assignee: Guangdong Zhongda South China Sea Ocean Biotechnology Engineering Center Coltd
Current assignee: Guangdong Zhongda South China Sea Ocean Biotechnology Engineering Center Coltd
Priority date: 2006-09-13
Filing date: 2006-09-13
Publication date: 2008-03-19
Anticipated expiration: 2026-09-13
Also published as: CN101144072B

Abstract

本发明涉及通过基因工程改造得到的植酸酶。本发明所述的一种定点突变改造的植酸酶，它是由具有氨基酸序列为SEQ ID No.1的来源于黑曲霉的植酸酶中制造多个氨基酸取代而产生的，所述的氨基酸取代包括第23、53、136、137和195位的取代。本发明公开了优选的改造的植酸酶以及相应的DNA序列，还公开了所述植酸酶的生产方法及其应用。本发明所述的植酸酶在温度的耐受性方面更加优良，酶活最适pH的范围也得到改良；进一步，利用生物反应器高效表达此突变基因，使定点突变改造后的植酸酶得到高效表达，最终达到工业化生产的要求。

Description

定点突变改造的植酸酶

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及通过基因工程改造得到的植酸酶。

背景技术

植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，结构复杂。植酸分子含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，植酸是饲料中磷的重要贮存形式。正是由于植酸分子上6个磷酸基团带有非常强大的负电荷，能与许多阳离子(钙、镁、磷、铜、锌、锰)结合形成螯合物，这种螯合物不易水解，植酸分子上的磷和阳离子不易被动物所利用，因而被称为抗营养因子。一般动物对饲料中磷的利用率只有10％-30％不等，需要额外补充无机磷酸盐，常用的为磷酸氢钙和骨粉。这不仅大大增加了饲料的成本，造成蛋白质等营养元素的利用率低；而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出体外，造成严重的环境问题。植酸酶的出现使这些问题有望得到解决。

植酸酶(Phytase)即肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。按植酸被水解部位通常所说的植酸酶包括两种，肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(3-Phytase)和肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(6-Phytase)；按植酸酶的pH值作用范围，植酸酶分为酸性、中性及碱性植酸酶。Shieh等(1968)对200种微生物进行了筛选，发现大量的曲霉菌能产生胞外植酸酶，并由土壤中分离到的无花果曲霉(Aspergillus ficuum)NRRL3135能产生最大的酶活性。目前在巴斯德毕赤酵母中表达的植酸酶基因，有来自Aap.niger、Aap.fumigatus、Selenomonas ruminantium等微生物。由于植酸酶制粒过程中都有一个短暂的高温过程，一般在75℃-93℃，现在大多数商品植酸酶都不能耐高温，在高温制粒过程中会损失大量的酶活，造成大量的成本浪费。从嗜温微生物中分离到的高温植酸酶其最适温度在70℃～80℃，虽然有很好的耐温性，但它在37℃下的酶活性极低，没有使用价值；而来源于黑曲霉等的植酸酶在37℃下具有较高酶活性，但它又不能经受制粒时的高温。能在饲料中真正得到推广利用的植酸酶必须是具有良好热稳定性的。所以，如何使得酶既能短暂耐高温又能在动物体中具有高酶活性，是目前饲料用植酸酶制剂急需解决的一个问题。

发明内容

本发明总的目的是通过定点突变的方法对植酸酶基因进行改造，使改造后的植酸酶在温度的耐受性方面更加优良，酶活最适pH的范围也得到改良；进一步，利用生物反应器高效表达此突变基因，使定点突变改造后的植酸酶得到高效表达，最终达到工业化生产的要求。

本发明的首要目的是对黑曲霉(Aspergillusnigeruar)提供一种定点突变改造的植酸酶，所述的植酸酶具有更好的耐热性能和更宽的pH范围。

本发明是对黑曲霉来源的的植酸酶基因(称为PhyA基因)进行定点突变。由黑曲霉(Aspergillusnigeruar)Af293中获得的植酸酶，已经被克隆并测序(Genomicsequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus，Nature438(7071)，1151-1156，2005)，GENEBANK登录号为XP751964。该植酸酶的成熟蛋白具有SEQ ID No.1的氨基酸序列，该成熟蛋白是由SEQ ID No.2的核苷酸序列所编码的。

本发明所述的一种定点突变改造的植酸酶，它是由具有氨基酸序列为SEQ ID No.1的来源于黑曲霉的植酸酶中制造多个氨基酸取代而产生的，所述的氨基酸取代包括第23、53、136、137和195位的取代。

本发明所述的定点突变改造的植酸酶，特别优选的氨基酸取代如下：在第23位的氨基酸取代是用亮氨酸取代谷氨酰胺，在第53位的氨基酸取代是用亮氨酸取代丝氨酸，在第136位的氨基酸取代是用酪氨酸取代丝氨酸，在第137位的氨基酸取代是用甘氨酸取代天冬氨酸，在第195位的氨基酸取代是用缬氨酸取代亮氨酸；所述的定点突变改造的植酸酶具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。

本发明同时提供了一种改善具有SEQ ID No.1的来源于黑曲霉的植酸酶的酶学性质的方法，该方法包括：通过在SEQ ID No.1氨基酸序列的第23、53、136、137和195位引入氨基酸取代以改变所述来源于黑曲霉的植酸酶的氨基酸序列。

特别优选的方法是：在第23位的氨基酸取代是用亮氨酸取代谷氨酰胺，在第53位的氨基酸取代是用亮氨酸取代丝氨酸，在第136位的氨基酸取代是用酪氨酸取代丝氨酸，在第137位的氨基酸取代是用甘氨酸取代天冬氨酸，在第195位的氨基酸取代是用缬氨酸取代亮氨酸；所述的氨基酸取代产生具有SEQ ID No.2氨基酸序列的植酸酶。

本发明还提供了一种DNA分子，其编码如前所述的植酸酶。

特别优选的DNA分子，其含有SEQ ID No.3的核苷酸序列。

耐高温植酸酶是目前植酸酶研究领域中的热点。本发明通过对植酸酶基因的定点突变，提高了植酸酶活性单位，在pH3.0-8.0都可以保持较高的酶活，更重要的是大大提高了酶的耐热性。本发明所述的定点突变改造的植酸酶经90℃处理5分钟，酶活仍保留70％以上，而突变前的植酸酶经90℃处理5分钟，酶活保留不足原来的40％。因此，本发明所述的定点突变改造的植酸酶对大规模产业化有一定的促进作用。

本发明还提供了一种载体，其含有如前所述的DNA分子。

本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如前所述的DNA分子，或者含有如前所述的载体。

当本发明所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。本发明优选的宿主为真菌细胞，例如曲霉属菌株；更优选的宿主是酵母细胞，例如毕氏酵母。

本发明还提供了一种植酸酶的生产方法，该方法包括：在适于植酸酶表达的条件下培养如前所述的宿主细胞，并从培养基中分离本发明所述的定点突变改造的植酸酶。

本发明所述的定点突变改造的植酸酶的基因可以处于任何启动子的控制之下，可以选择组成型或调节型的酵母启动子，也可采用强原核启动子，例如T7启动子。本发明并不限定任何特定的载体、启动子或终止子。所述的载体也可以带有一个选择性标记，通常是抗生素抗性基因或者具有代谢缺陷特征的酵母菌株的互补菌种的基因。优选的是，所述的植酸酶是由宿主细胞分泌到生长培养基中，这使得产物表达量高而且易于分离。可把具有植酸酶活性的蛋白质或多肽连接到信号肽上，该信号肽在引导该蛋白质分泌到细胞外后被切除。本发明并不限定任何特定类型的前导序列或信号肽。

本发明采用毕氏酵母作为植酸酶的表达菌株，在7升发酵罐的发酵实验最终表达量达到3200FTU/ml上清液的表达量，远远高于上海姚泉洪教授等人所报道的同样应用毕氏酵母高效表达耐高温植酸酶的单位表达量(应用毕氏酵母高效表达耐高温植酸酶，彭日荷，姚泉洪等，生物化学与生物物理学报，2002年第06期)。本发明为利用重组酵母工业化大规模、低成本发酵生产耐高温植酸酶奠定了基础。

本发明还提供了一种饲料，其含有本发明所述的定点突变改造的植酸酶。所述的饲料具有良好热稳定性的植酸酶，适应目前工业应用所需，能真正得到推广利用。

附图说明

图1为pPICZαA载体图谱；

图2为pPhyT重组载体的构建示意图，图中的两个重要载体在图1与图3中放大显示；

图3为pPhyT重组载体示意图；

图4为改造前、后的植酸酶在各pH值环境下的酶活曲线图；

图5为改造前、后的植酸酶经高温处理后的相对酶活曲线图。

具体实施方式

实施例1：黑曲霉植酸酶基因的PCR扩增和测序

1、本发明以黑曲霉来源的的植酸酶基因(PhyA)序列作为参考，在信号肽下游设计并合成两条寡核苷酸引物，通过酚抽提的方法提取黑曲霉总DNA，通过PCR法扩增目的基因PhyA，并对PCR产物测定核苷酸序列。

两条PCR引物如下：

F1：TCTCTCGAGAAAAGTCCAAGTCCTGCGATACGGT

R1：AAGAATGCGGCCGCTTATCAACTAAAGCACTCTCCCC

PCR反应体系如下：

Template(模板)	2ul
Template(模板)	2ul	F1	1ul
R1	1ul	F1	1ul
R1	1ul	2×GC buffer I	5ul
高保真酶	0.5ul	2×GC buffer I	5ul
高保真酶	0.5ul	DNTP	8uI
ddH₂O	32.5uI	DNTP	8uI

PCR程序设定：

95℃预变性5min

94℃，30s；65℃，30s；72℃，3min30个循环

72℃，10min

PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，得到大约1.4kb的片段，通过DNA测序，确定为黑曲霉的植酸酶基因。

实施例2：植酸酶基因PHYA与克隆载体pPlCZαA的连接

将PhyA与克隆载体pPlCZαA(如图1所示)分别进行限制性内切酶Xho I/Not l双酶切，酶切条件如下：

PCR片段酶切体系(20ul)		质粒pPlCZαA酶切体系(20ul)
PCR片段酶切体系(20ul)		质粒pPlCZαA酶切体系(20ul)		PCR片段	8ul	质粒	8uI
10×Buffer	2ul	10×Buffer	2ul	PCR片段	8ul	质粒	8uI
10×Buffer	2ul	10×Buffer	2ul	0.1％BSA	0.5ul	0.1％BSA	0.5ul
Xhol	0.5ul	Xhol	0.5ul	0.1％BSA	0.5ul	0.1％BSA	0.5ul
Xhol	0.5ul	Xhol	0.5ul	Not l	0.5ul	Not l	0.5ul
DdH2O	8.5ul	ddH₂O	8.5ul	Not l	0.5ul	Not l	0.5ul

37℃酶切10小时，电泳后分别回收两个目的片段，用T4DNA连接酶连接，连接体系如下：

PCR片段	5ul
PCR片段	5ul	质粒	1uI
T4DNA酶	0.5uI	质粒	1uI
T4DNA酶	0.5uI	10×Buffer	1ul
ddH2O	2.5ul	10×Buffer	1ul
ddH2O	2.5ul	Total	10ul

16℃连接过夜，电泳检测结果显示有一个大约5kb的片段，用Xho l/Not l双酶切后跑电泳结果显示有3.6kb和1.4kb两条带，说明连接成功，构建得到pPhyA载体(PhyA为定点突变改造后的植酸酶基因的代号)，即如图3所示的pPICZαA-PHYA。

实施例3：定点突变

经反复实验摸索，我们确定对以下位点的氨基酸进行定点突变改造：

对于第23位氨基酸突变，设计如下引物：

F2：5’TTGTACTCGCCATTCTTTTC3’

突变位点

R2：5’GCCCCATAGATGAGAAGTCG3’

对于第53位氨基酸突变，设计如下引物：

F3：5’TTGCGCCATGGAGCGCGGTA3’

突变位点

R3：5’TAGCACCTGTACCAAGGTGA3’

对于第136位氨基酸突变，设计如下引物：

F4：5’TACGGTCGGGTTATTGCTTC3’

突变位点

R4：5’GCCTGAGGCGCGAATAAACG3’

对于第137位氨基酸突变，设计如下引物：

F5：5’GGTCGGGTTATGCTTCGGG3’

突变位点

R₅：5’GTAGCCTGAGGCGCGAATAA3’

对于第195位氨基酸突变，设计如下引物：

F6：5’GTGGGAGATGAGGTTGCGGC3’

突变位点

R6：5’CTGACTCGCCTCAAACTTCG3’

PCR程序设定：

95℃预变性5min

94℃，30s；62℃，30s；72℃，3min30个循环

72℃，10min

引物5’端磷酸化，PCR反应后连接测序。

基因是定点突变是采用反向PCR的方法，依次对五个位点进行突变，最终得到本发明耐高温植酸酶的序列。

pPhyT重组载体的整个构建过程如图2所示。

实施例4：pPhyT克隆载体转化毕赤酵母GS115及工程菌筛选

本实施例提供了定点突变后的植酸酶基因(称为PhyT基因)在表达系统中高效表达的方法，包括重组载体的构建、受体菌的遗传转化方法、重组子的筛选与鉴定以及重组子中植酸酶表达方法。

感受态细胞的制备：吸取50ul的甘油保存的毕赤酵母GS115菌种接种于2mlYPD液体培养基，30℃培养10-12h；取活化培养的菌液20ul接种于20ml新鲜YPD液体培养基，30℃培养约16h至OD600＝1.0-1.3；4℃5000rpm离心5min，用20ml冰预冷的无菌水重悬菌体；4℃5000rpm离心5min，重悬于10ml冰预冷的无菌水；4℃5000rpm离心5min，重悬于2ml1mol/L冰预冷的山梨醇溶液；4℃5000rpm离心5min，重悬于120ul1mol/L冰预冷的山梨醇溶液，置于冰上立即使用。

电击转化：取制备好的感受态细胞80ul和5-90ug经Sal l单切线性化的克隆载体pPhyT注入冰预冷的电击杯中，混匀，置冰上5min；按照电压1500V、电容25uF、电阻200Ω的参数电击转化细胞；迅速加入1ml冰预冷的1mol/L山梨醇溶液到电击杯内，混匀；将杯内液体转至1.5ml的Eppendoff管，30℃静置培养1-2h；分别取100ul涂布含100ug/ml Zeocin和含500ug/ml Zeocin的YPDS固体培养平板，30℃培养2-3d。

酵母高拷贝转化子的筛选：挑取在100ug/ml Zeocin YPDS平板上长出的单菌落，在高浓度Zeocin YPDS平板(500ug/ml)上点种培养，在该平板上生长速度及菌落大小与100ug/ml Zeocin YPDS平板上相同的转化子有可能含高拷贝的外源基因，可用于进一步的表达实验。

实施例5：本发明所述的植酸酶的活性测定

按照中华人民共和国国家标准《GB/T18634-2002》进行。植酸酶活性定义是指样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、PH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

U＝F×C/(V×30)

式中：U-试样中植酸酶的活性，U/ml；C-根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；F-试样溶液反应前的总稀释倍数；V-试样体积，ml；30-反应时间，min。

本发明所述的植酸酶活性测定：

标准曲线的制定如表1：

磷浓度(mmol/L)	0	1.5625	3.125	6.25	12.5	25
磷浓度(mmol/L)	0	1.5625	3.125	6.25	12.5	25	OD值	0	0.052	0.097	0.208	0.428	0.819

本发明的植酸酶经过10000倍的稀释，酶解反应后测出的OD值如表2：

样品	1	2	3	平均值
样品	1	2	3	平均值	OD值	0.320	0.319	0.324	0.321

根据标准曲线方程，得出酶解的无机磷当量为9.69umol。

本发明所述的植酸酶的酶活性U＝F×C/(V×30)＝10000×9.69/(1×30)＝3230FTU/ml实施例6：进行7L发酵罐小试

从YPD平板上选取单克隆，接种于20ml BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20h。以1∶50的比例接种到300ml BMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD600＝2～6，用以接种发酵罐。

国产7L发酵罐，加入3L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至5.5，加入PTM1(4.35ml/L)，接入种子菌(1∶10)。发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在300～800rpm之间以维持溶氧20％以上。

发酵分为三个阶段：生长期，从加入种子菌，培养约16～24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；之后进入甘油促生长期，补加50％甘油(含有PTM1，12ml/L)，补料速度为18ml/L.h，持续4～6h；最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTM1，12ml/L)，流速从1ml/L.h经10h线性升至3ml/L.h，持续72h。

发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD600以及菌体湿重，发酵上清用SDS-PAGE检测蛋白表达。取上清液进行植酸酶活性检测，酶活最高可达到3200FTU/ml，远远高于现有文献的报道。

实施例7：对改造前、后的植酸酶的酶活分析

我们设定10个pH梯度，即从pH1～10，对改造前、后的植酸酶的酶活按常规方法进行测定，结果如图4所示。从图4可见，改造前、后的植酸酶的最适pH值均为5.0，但改造前的最高酶活为2139.1FTU/ml，而改造后的最高酶活达到了3230FTU/ml。而且，本发明所述的定点突变改造的植酸酶的pH适用范围更加宽广，在pH3～8的范围内都能保持较高的酶活，达到2500FTU/ml以上；而突变前的植酸酶在的最适pH值为3～6，且在该最适pH范围的酶活远低于本发明所述的定点突变改造的植酸酶的酶活。

我们高温段处理设四个梯度，即75℃、80℃、85℃、90℃，对改造前、后的植酸酶各处理5min，另设一个37℃对照，按常规方法进行测定酶活，结果如图5所示。从图5可见，本发明所述的定点突变改造的植酸酶在耐热性能上有了很大的提高，90℃处理5分钟，酶活仍保留70％以上，仍有2263.9FTU/ml，比改造前的最高酶活2139.1FTU/ml还要高，实现了真正的耐高温。而突变前的植酸酶经90℃处理5分钟，酶活保留不足原来的40％。

SEQUENCE LISTING(序列表)

<11C>广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司

<120>定点突变改造的植酸酶

<130>

<141>2006-09-12

<160>4

<170>Patentln version 3．3

<210>1

<2117439

<212>PRT

<213>黑曲霉(Aspergi l lus nigeruar)

<400>1

<210> 2

<211> 1320

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus nigeruar)

<400> 2

<210>3

<211>439

<212>PRT

<213>黑曲霉(Aspergillus nigeruar)

<400> 3

<210>4

<211>1320

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus nigeruar)

<400> 4

Claims

1.一种定点突变改造的植酸酶，其特征在于：它是由具有氨基酸序列为SEQ IDNo.1的来源于黑曲霉的植酸酶中制造多个氨基酸取代而产生的，所述的氨基酸取代包括第23、53、136、137和195位的取代。

2.根据权利要求1所述的定点突变改造的植酸酶，其特征在于：在第23位的氨基酸取代是用亮氨酸取代谷氨酰胺，在第53位的氨基酸取代是用亮氨酸取代丝氨酸，在第136位的氨基酸取代是用酪氨酸取代丝氨酸，在第137位的氨基酸取代是用甘氨酸取代天冬氨酸，在第195位的氨基酸取代是用缬氨酸取代亮氨酸；所述的定点突变改造的植酸酶具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。

3.一种改善具有SEQ ID No.1的来源于黑曲霉的植酸酶的酶学性质的方法，其特征在于，该方法包括：通过在SEQ ID No.1氨基酸序列的第23、53、136、137和195位引入氨基酸取代以改变所述来源于黑曲霉的植酸酶的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在第23位的氨基酸取代是用亮氨酸取代谷氨酰胺，在第53位的氨基酸取代是用亮氨酸取代丝氨酸，在第136位的氨基酸取代是用酪氨酸取代丝氨酸，在第137位的氨基酸取代是用甘氨酸取代天冬氨酸，在第195位的氨基酸取代是用缬氨酸取代亮氨酸；所述的氨基酸取代产生具有SEQ ID No.2氨基酸序列的植酸酶。

5.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求1或2所述的植酸酶。

6.根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于：其含有SEQ ID No.3的核苷酸序列。

7.一种载体，其特征在于：其含有权利要求5或6所述的DNA分子。

8.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求5或6所述的DNA分子，或者含有权利要求7所述的载体。

9.一种植酸酶的生产方法，其特征在于，该方法包括：在适于植酸酶表达的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的定点突变改造的植酸酶。

10.一种饲料，其特征在于：其含有权利要求1或2所述的植酸酶。