CN1475565A

CN1475565A - 用化学合成和分子进化获得酵母表达高比活植酸酶基因

Info

Publication number: CN1475565A
Application number: CNA02136530XA
Authority: CN
Inventors: 姚泉洪; 彭日荷; 熊爱生
Original assignee: BIOTECHNOLOGY RES CT SHANGHAI; Shanghai Yongye Agricultural Science Bioengineering Co ltd
Current assignee: Xinghu Biotech Co., Ltd., Zhaoqing City, Guangdong Prov.
Priority date: 2002-08-16
Filing date: 2002-08-16
Publication date: 2004-02-18
Anticipated expiration: 2022-08-16
Also published as: CN100398645C

Abstract

本发明公开一种利用化学合成和分子进化获得适于酵母表达高比活植酸酶基因，以合成基因为出发基因，进行体外重组筛选，获得比活高的植酸酶基因phy I，在原核表达质粒上构建突变植酸酶基因文库，利用植酸酶原核表达质粒库转化大肠肝菌，高活性菌株筛选、高密度发酵等制备方法，获得适于酵母表达的高比活植酸酶基因。

Description

用化学合成和分子进化获得酵母表达高比活植酸酶基因

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体地说利用化学合成方法及体外重组技术，改造来源于黑曲霉中的酸性植酸酶基因，使之能在毕赤酵母中高效表达，表达的植酸酶比活提高，结构稳定。

背景技术

植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中。不同的物种产生的植酸酶在比活、最适反应pH、耐热性等性质上存在很大差异。许多微生物都能产生高比活的植酸酶。1968年Shien等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所有22株黑霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于曲霉Aspergillus terreus NO.9A-1，其最适pH为4.5，最适反应温度为70℃，pH在1.2～9.0范围内，该酶均能稳定维持一定活性。此后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶，其中来源于A.ficcum NR-RL3135(A.nigervar.awamori)的植酸酶phyA在酸性条件下有较高酶活性，被认为是目前最具应用前景的饲用植酸梅。植酸酶phyA是一种糖基化蛋白，分子量为85KD。酶反应最适pH为2.5和5.5，最适反应温度为55℃。在37℃、pH2.5的条件下，以植酸为底物的Km值为50mmol，Ca²⁺、Fe²⁺对酶活性无影响，Mn²⁺、Co²⁺有激活作用，能使酶活性分别提高30％和13％。Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Cu⁺对酶活性有抑制作用，其中Cu²⁺、Zn²⁺为非竞争性抑制，Fe²⁺、Cu⁺为竞争性抑制。对酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如L(+)-酒石酸对它却没有抑制作用。

禾谷类、豆科类及油料作物是人的食品和动物饲料中的主要原料。这些原料中虽含有大量的磷，但其中50％-70％是以植酸磷(六磷酸肌醇)的形式存在(Salunkhe 1982，食品研究进展)。单胃动物缺乏分解植酸磷所必需的酶，磷的利用率很低。植酸酶能将植酸磷水解成肌醇和磷酸，在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率。

开发植酸酶的直接原因来源于植酸带来的磷污染。一方面，植酸中螯合的磷无法吸收利用，另一方面则是必须在饲料和食品中添加大量无机磷，造成磷源浪费和环境污染(Cromwell 1991，生物技术在食品工业中的应用进展)。随着养殖业的发展，无机磷的排泄量大幅度上升，磷污染遍及河流、山川和平原耕作地，直接威胁人类自身的生存。自80年代中期，欧洲就致力于寻找全面解决无机磷污染的方案(CouncilDirective91/676/EEC)中，着重强调限制养殖业的磷排泄量。植酸酶是目前所有使用的添加剂中，具有最直接、最显著环保社会效益的酶制剂。由于磷是动物生长过程中的基本元素，为了弥补新陈代谢中磷的消耗，常常需要在食品和饲料中添加无机磷(Common 1989，自然杂志)。植酸酶将植酸中鳌合的磷释放出来，从而减少了饲料中磷酸氢钙等无机磷的使用量，降低幅度达50％-70％。在中国，很多养殖区可以将磷酸氢钙的用量减少70％以上，杂粕用量较大的蛋鸡养殖区，甚至能够全部替代磷酸氢钙。使用植酸酶的饲料，向环境排泄的磷相应减少30％以上(Nelson 1968，畜牧科学)。使用植酸酶在减少饲料中无机磷添加量的同时，大幅度地减轻甚至完全杜绝了磷酸氢钙导致的氟和其它重金属中毒问题。使用植酸酶每年在饲料方面的成本即可减少9200多万元。在赖以生存的环境中，植酸酶从污染的源头轻而易举地消灭磷污染，比常规使用的后期治理的方法更为经济有效。可以预期，植酸酶将以显著的经济效益和社会效益对整个行业的可持续发展产生巨大促进作用。

最新的研究结果还发现了植酸酶的潜在营养价值。植酸通过与金属离子的螯合，降低单胃动物对营养的吸收，植酸酶可以提高动物对磷和钙的消化吸收，Jongbloed于1993年建立了一个关于植酸酶活力与饲料中磷酸盐的当量关系式。在含磷酸盐的饲料中添加500IU植酸酶相当于1g来自于磷酸一钙的磷或1.1g来自于二水磷酸氢钙的磷；Ofier等(1992)、Mroz等(1994)报道，植酸酶能够提高猪禽对氨基酸和氮的回肠消化率。植酸酶通过降低植酸盐的抗营养作用，增加动物对蛋白质和一些金属离子的吸收能力(Wyss1999，应用环境微生物科学)，提高饲料中蛋白质的消化利用率。应用植酸酶，加大了非常规原料资源的使用比例，可以大量节约蛋白质饲料。使用植酸酶能直接降低了饲料的原料成本，从而提高产品的价格竞争力。在中国，每生产1吨全价饲料，至少可以因此增加5-10元的净收益。每生产1吨5％的预混料，则可以增加收益百元以上。

目前生产上采用的植酸酶均来自黑曲霉(Aspergillus niger)。黑曲霉中的植酸酶(PhyA)具有比活高、结构稳定等优点。在植酸酶发展初期，均采用原始菌株发酵生产，然而，原始菌株表达量低，生产成本较高，通过化学诱变或其他诱变方法可以获得产酶量提高的菌株，然而诱变容易导致菌株其它功能的损失，为了获得目的基因高表达且其它功能不受影响的菌株，需要长期观察筛选，所需时间很长，另外，诱变菌株容易退化。利用生物反应器高效表达植酸酶基因，大幅度提高了植酸酶产量，克服了野生型菌株含量低的缺点。

发明内容

本发明是采用化学合成和分子体外重组方法寻找一种在酵母菌中高效表达的高比活植酸酶基因。另一目的是提供酵母表达高比活植酸酶的方法。

本发明从植酸酶基因结构特点出发，结合来源不同黑曲霉中高活性的phyA2基因的优点，利用化学合成方法将原始基因改造成高比活，最适pH值范围为2.5-5.5的酸性植酸酶基因，该基因全部采用酵母偏爱密码。

本发明采用基因合成、分子体外重组筛高活性植酸酶基因，通过载体构建、酵母电击转化、高活性菌株筛选、高密度发酵等步骤来制备高比活植酸酶。

为了提高植酸酶的比活性，首先用PCR扩增酸性植酸酶基因。设计并合成20个寡核苷酸引物，长度为70-90碱基，引物之间连接通过20-30bp重叠序列，Tm值为60-66将所有引物加入反应体系，进行PCR扩增，共进行35个循环，合成酸性植酸酶基因。以合成植酸酶基因为模板，Phyiz1，Phyif1为引物扩增植酸酶基因，进行DNA分子重排，酶切所有重排DNA分子，构建到表达载体中，电击入大肠肝菌，再通过植酸酶表达及活性筛选突变植酸酶基因，最终获得比活提高的植酸酶基因PhyI。按合成基因的两端序列设计出引物，在基因5｀端加入Xhol切点和信号态切割序列，引物为PHY1Z，在基因3｀端加入Not I切点，引物为PHYIF，扩增片段克隆后，Xhol和Not I双酶切，定向插入pPIC9载体，构建成phyI的酵母表达载体(图1)，挑选植酸酶高表达重组酵母P.Pastoris菌种，进行高密度发酵，表达的植酸酶具有较高的比活，1克相当于1000国际单位(IU)。新的酸性植酸酶phyI的比活为原先phyA2的10倍左右。phyI和phyA2的氨基酸数相同，但有7个氨基酸发生了改变。其中包括：31Q＞L，34F＞Y，141S＞P，158F＞L221R＞E，280L＞V，388L＞A等。含有植酸酶基因表达的载体pPPYI 9.4Kb电击转达入毕氏酵母菌，该酵母菌不能利用甲醇作碳源生长，该酵母菌中只含一拷贝的植酸酶基因。

10 20 30 40 50 60 70TTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCCTCTTGTGACACTGTTGATCAAGGTTATCAATGCTTCTCCGAGL A V P A S R N Q S S C D T V D Q G Y Q C F S E

80 90 100 110 120 130 140ACTTCTCACTTGTGGGGTCTATACGCTCCATACTTTTCCTTGGCTAACGAATCCGTCATCTCTCCAGAAGTTT S H L W G L Y A P Y F S L A N E S V I S P E V150 160 170 180 190 200 210CCAGCTGGTTGCAGAGTCACCTTCGCTCAGGTCTTGTCCAGACATGGTGCTAGATACCCAACTGACTCCAAAP A G C R V T F A Q V L S R H G A R Y P T D S K220 230 240 250 260 270 280GGTAAGAAGTATTCTGCTTTGATCGAGGAGATCCAGCAGAACGCTACCACCTTCGATGGTAAGTACGCTTTCG K K Y S A L I E E I Q Q N A T T F D G K Y A F290 300 310 320 330 340 350 360TTGAAGACCTACAACTACTCCTTGGGTGCTGACGACTTGACTCCATTCGGTGAGCAGGAGTTGGTCAACTCTL K T Y N Y S L G A D D L T P F G E Q E L V N S

370 380 390 400 410 420 430GGTATCAAGTTCTACCAGAGATACGAATCCTTGACCAGAAACATCGTTCCATTCATCAGACCCTCTGGTTCCG I K F Y Q R Y E S L T R N I V P F I R P S G S

440 450 460 470 480 490 500TCCAGAGTCATCGCTTCTGGTAAGAAGTTCATCGAGGGTCTCCAATCCACCAAGTTGAAGGACCCAAGAGCCS R V I A S G K K F I E G L Q S T K L K D P R A510 520 530 540 550 560 570CAACCAGGTCAATCCTCTCCAAAGATCGACGTCGTCATCTCTGAGGCTTCCTCTTCCAATAACACCTTGGACQ P G Q S S P K I D V V I S E A S S S N N T L D 580 590 600 610 620 630 640CCTGGTACTTGTACTGTCTTTGAAGACTCCGAATTGGCTGACACTGTCGAGGCTAACTTCACTGCTACCTTCP G T C T V F E D S E L A D T V E A N F T A T F650 660 670 680 690 700 710 720GTTCCATCCATCGAGCAGAGATTGGAGAACGACTTGTCTGGTGTCACCTTGACCGATACCGAAGTTACCTACV P S I E Q R L E N D L S G V T L T D T E V T Y

730 740 750 760 770 780 790TTGATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCTCCACTGTTGACACTAAGTTGTCTCCATTCTGCGACL M D M C S F D T I S T S T V D T K L S P F C D

800 810 820 830 840 850 860TTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACTTGCAATCCGTGAAGAAGTACTACGGTCATGGTGCTL F T H D E W I N Y D Y L Q S V K K Y Y G H G A

870 880 890 900 910 920 930GGTAATCCATTGGGTCCAACTCAAGGTGTTGGTTACGCTAACGAATTGATTGCTAGATTGACCCACTCCCCAG N P L G P T Q G V G Y A N E L I A R L T H S P940 950 960 970 980 990 1000GTCCATGACGACACCTCTTCCAACCACACCTTGGACTCCTCTCCAGCTACCTTCCCATTGAACTCCACCTTGV H D D T S S N H T L D S S P A T F P L N S T L1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080TACGCTGACTTCTCTCACGACAATGGTATCATCTCCATCTTGTTCGCTTTGGGTTTGTACAATGGTACTAAGY A D F S H D N G I I S I L F A L G L Y N G T K

1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150CCTTTGTCCACCACCACTGTCGAAAACATCACCCAAACCGACGGTTTCTCCTCTGCTTGGACTGTTCCATTCP L S T T T V E N I T Q T D G F S S A W T V P F

1160 1170 1180 1190 1200 1210 1220GCTTCCAGAGCGTACGTCGAAATGATGCAATGCCAAGCTGAACAGGAGCCATTGGTCAGAGTCTTGGTCAACA S R A Y V E M M Q C Q A E Q E P L V R V L V N

1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290GATAGAGTCGTCCCATTGCATGGTTGTCCAGTCGATGCTTTGGGTAGATGTACTAGAGACTCCTTCGTCAGAD R V V P L H G C P V D A L G R C T R D S F V R1300 1310 1320 1330 1340GGTTTGTCCTTCGCTAGATCCGGTGGTGACTGGGCTGAATGCTTCGCTTAAG L S F A R S G G D W A E C F A -

比较来源于黑曲霉(A.niger)原始基因phyA2和突变基因phyI的核苷酸序列，去除基因5’分泌信号肽序列，结构基因部分的核苷酸数目均为1347。同源序列为1052，同源性为78％。在突变基因中，全部采用酵母偏爱密码。如精氨酸用AGA，赖氨酸采用AAA，半胱氨酸采用TGC，天冬氨酸采用AAC等等。PHYA -CTGGCAGTCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCAGTTGCGATACGGTCGATCAGGGGT -55

**** ***** ** ** ***** ** *** *** ** ** ** ***** ** *PHYI -TTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCCTCTTGTGACACTGTTGATCAAGGTT -55PHYA -ATCAATGCTTCTCCGAGACTTCGCATCTTTGGGGTCAATACGCACCGTTCTTCTC -110

********************** ** * ******* ****** ** * *** **PHYI -ATCAATGCTTCTCCGAGACTTCTCACTTGTGGGGTCTATACGCTCCATACTTTTC -110PHYA -TCTGGCAAACGAATCGGTCATCTCCCCTGAGGTGCCCGCCGGATGCAGAGTCACT -165

**** ******** ******** ** ** ** ** ** ** ***********PHYI -CTTGGCTAACGAATCCGTCATCTCTCCAGAAGTTCCAGCTGGTTGCAGAGTCACC -165PHYA -TTCGCTCAGGTCCTCTCCCGTCATGGAGCGCGGTATCCGACCGACTCCAAGGGCA -220

************ * *** * ***** ** * ** ** ** ******** ** *PHYI -TTCGCTCAGGTCTTGTCCAGACATGGTGCTAGATACCCAACTGACTCCAAAGGTA -220PHYA -AGAAATACTCCGCTCTCATTGAGGAGATCCAGCAGAACGCGACCACCTTTGACGG -275

**** ** ** *** * ** ******************** ******** ** **PHYI -AGAAGTATTCTGCTTTGATCGAGGAGATCCAGCAGAACGCTACGACCTTCGATGG -275PHYA -AAAATATGCCTTCCTGAAGACATACAACTACAGCTTGGGTGCAGATGACCTGACT -330

** ** ** *** ******* ********* ********* ** *** *****PHYI -TAAGTACGCTTTCTTGAAGACCTACAACTACTCCTTGGGTGCTGACGACTTGACT -330PHYA -CCCTTCGGAGAACAGGAGCTAGTCAACTCCGGCATCAAGTTCTACCAGCGGTACG -385

** ***** ** ****** * ******** ** *************** * ****PHYI -CCATTCGGTGAGCAGGAGTTGGTCAACTCTGGTATCAAGTTCTACCAGAGATACG -385PHTYA -AATCGCTCACAAGGAACATCGTTCCATTCATCCGATCCTCTGGCTCCAGCCGCGT -440

**** * ** ** ****************** ** ******* *** * * **PHYI -AATCCTTGACCAGAAACATCGTTCCATTCATCAGACCCTCTGGTTCCTCCAGAGT -440PHYA -GATCGCCTCCGGCAAGAAATTCATCGAGGGCTTCCAGAGCACCAAGCTGAAGGAT -495

***** ** ** ***** *********** **** ******* *******PHYI -CATCGCTTCTGGTAAGAAGTTCATCGAGGGTCTCCAATCCACCAAGTTGAAGGAC -495PHYA -CCTCGTGCCCAGCCCGGCCAATCGTCGCCCAAGATCGACGTGGTCATTTCCGAGG -550

** * ***** ** ** ***** ** ** *********** ***** ** ****PHYI -CCAAGAGCCCAACCAGGTCAATCCTCTCCAAAGATCGACGTCGTCATCTCTGAGG -550PHYA -CCAGCTCATCCAACAACACTCTCGACCCAGGCACCTGCACTGTCTTCGAAGACAG -605

* *** ***** ***** * ****** ** ** ** ******* ******PHYI -CTTCCTCTTCCAATAACACCTTGGACCCTGGTACTTGTACTGTCTTTGAAGACTC -605PHYA -CGAATTGGCCGATACCGTCGAAGCCAATTTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATT -660

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** * *********** **** ***** ** * ** ** ** ***** *PHYI -GAGCAGAGATTGGAGAACGACTTGTCTGGTGTCACCTTGACCGATACCGAAGTTA -715PHYA -CCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACAC -770

***** * ********************************* *** ** *****PHYI -CCTACTTGATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCTCCACTGTTGACAC -770PHYA -CAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGAC -825

*** **** ** ***** *** ********************************PHYI -TAAGTTGTCTCCATTCTGCGACTTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGAC -825PHYA -TACCTCCAGTCCTTGAAAAAGTATTACGGCCATGGTGCAGGTAACCCGCTCGGCC -880

*** * ** *** **** ***** ***** ******** ***** ** * ** *PHYI -TACTTGCAATCCGTGAAGAAGTACTACGGTCATGGTGCTGGTAATCCATTGGGTC -880PHYA -CGACCCAGGGCGTCGGCTACGCTAACGAGCTCATCGCCCGTCTGACCCACTCGCC -935

* ** ** ** ** ** *********** * ** ** * ********** **PHYI -CAACTCAAGGTGTTGGTTACGCTAACGAATTGATTGCTAGATTGACCCACTCCCC -935PHYA -TGTCCACGATGACACCAGTTCCAACCACACTTTGGACTCGAGCCCGGCTACCTTT -990

***** ** ****** ************ ******** ** ********PHYI -AGTCCATGACGACACCTCTTCCAACCACACCTTGGACTCCTCTCCAGCTACCTTC -990PHYA -CCGCTCAACTCTACTCTCTACGCGGACTTTTCGCATGACAACGGCATCATCTCCA -1045

** * ***** ** * ***** ***** ** ** ***** ** **********PHYI -CCATTGAACTCCACCTTGTACGCTGACTTCTCTCACGACAATGGTATCATCTCCA -1045PHYA -TTCTCTTTGCTTTAGGTCTGTACAACGGCACTAAGCCGCTATCTACCACGACCGT -1100

* * ** ***** ***** ***** ********** * ** ***** ** **PHYI -TCTTGTTCGCTTTGGGTTTGTACAATGGTACTAAGCCTTTGTCCACCACCACTGT -1100PHYA -GGAGAATATCACCCAGACAGATGGATTCTCGTCTGCTTGGACGGTTCCGTTTGCT -1155

** ** ******** ** ** ** ***** *********** ***** ** ***PHYI -CGAAAACATCACCCAAACCGACGGTTTCTCCTCTGCTTGGACTGTTCCATTCGCT -1155PHYA -TCGCGTTTGTACGTCGAGATGATGCAGTGTCAGGCGGAGCAGGAGCCGCTGGTCC -1210

** * ********* ******** ** ** ** ** ******** *****PHYI -TCCAGAGCGTACGTCGAAATGATGCAATGCCAAGCTGAACAGGAGCCATTGGTCA -1210PHYA -GTGTCTTGGTTAATGATCGCGTTGTCCCGCTGCATGGGTGTCCGGTTGATGCTTT -1265

* ******** ** *** * ** ***** ******* ***** ** ********PHYI -GAGTCTTGGTCAACGATAGAGTCGTCCCATTGCATGGTTGTCCAGTCGATGCTTT -1265PHYA -GGGGAGATGTACCCGGGATAGCTTTGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCTAGATCTGGG -1320

*** ******** * ** *** ** ** ** *** *** ******** **PHYI -GGGTAGATGTACTAGAGACTCCTTCGTCAGAGGTTTGTCCTTCGCTAGATCCGGT -1320PHYA -GGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAG -1347

***** ***** ** ** ** *****PHYB -GGTGACTGGGCTGAATGCTTCGCTTAA -1347

附图说明：图1是构建成PHY I的酵母表达载体图。图2是重组菌株高密度发酵时间与植酸酶表达量的关系。图3表示PH值对植酸酶活力的影响。

本发明有益效果通过偏爱密码改造及DNA分子重排获得的植酸酶基因具有以下优点：1 基因能在酵母中高效表达，表达量高于1克/升。2 基因表达产物具有很高的酶比活，新的酸性植酸酶基因PHYI的比活为原先PHYA2的10倍左右。3 新的酸性植酸酶基因PHYI在酵母中也能糖基化。4 新的酸性植酸酶PHYI对温度具有较高的耐受性，最适反应pH值与原始基因一致，为pH2.5-5.5。

具体实施方式

实施例1：酸性植酸酶基因的化学合成

1.利用连续延伸PCR合成耐高温植酸酶基因。引物长度为70-90bp，合成20个寡核苷酸引物，引物与引物之间连接通过20-30bp重叠序列，Tm值为60-66。将所有引物加入反应体系，中间引物量为10-20ng，两侧的引物量为100-200ng。PCR反应体系为100μL。PCR扩增条件为94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共进行35个循环。酸性植酸酶基因合成引物：phyi1：TTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCCTCTTGTGACACTGTTGATCAAGGTTATCAATGCTTCTCCGAGphyi2：GTTATCAATGCTTCTCCGAGACTTCTCACTTGTGGGGTCAATACGCTCCATTCTTTTCCTTGGCTAACGAATCCGTCATCTCTCCAGAAGPhyi3：GAATCCGTCATCTCTCCAGAAGTTCCAGCTGGTTGCAGAGTCACCTTCGCTCAGGTCTTGTCCAGACATGGTGCTAGATACCCAACTGACPhyi4：GGTGCTAGATACCCAACTGACTCCAAAGGTAAGAAGTATTCTGCTTTGATCGAGGAGATCCAGCAGAACGCTACCACCTTCGATGGTAAGPhyi5：CGCTACCACCTTCGATGGTAAGTACGCTTTCTTGAAGACCTACAACTACTCCTTGGGTGCTGACGACTTGACTCCATTCGGTGAGCAGGPhyi6：CTTGACTCCATTCGGTGAGCAGGAGTTGGTCAACTCTGGTATCAAGTTCTACCAGAGATACGAATCCTTGACCAGAAACATCGTTCCATTCPhyi7：GACCAGAAACATCGTTCCATTCATCAGATCCTCTGGTTCCTCCAGAGTCATCGCTTCTGGTAAGAAGTTCATCGAGGGTTTCCAATCCACCphyi8：CGAGGGTTTCCAATCCACCAAGTTGAAGGACCCAAGAGCCCAACCAGGTCAATCCTCTCCAAAGATCGACGTCGTCATCTCTGAGGCTTCCphyi9：CGTCGTCATCTCTGAGGCTTCCTCTTCCAATAACACCTTGGACCCTGGTACTTGTACTGTCTTTGAAGACTCCGAATTGGCTGACACTGPhyi10：GACTCCGAATTGGCTGACACTGTCGAGGCTAACTTCACTGCTACCTTCGTTCCATCCATCAGGCAGAGATTGGAGAACGACTTGTCTGGTGPhyi11：GGTGGAGATGGTGTCGAAGGAGCACATGTCCATCAAGTAGGTAACTTCGGTATCGGTCAAGGTGACACCAGACAAGTCGTTCTCCAATCTCPhYi12：GTCGTAGTTGATCCATTCGTCATGGGTGAACAAGTCGCAGAATGGAGACAACTTAGTGTCAACAGTGGAGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAGphyi13：CAACACCTTGAGTTGGACCCAATGGATTACCAGCACCATGACCGTAGTACTTCTTCAAGGATTGCAAGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTCphyi14：GGTTGGAAGAGGTGTCGTCATGGACTGGGGAGTGGGTCAATCTAGCAATCAATTCGTTAGCGTAACCAACACCTTGAGTTGGACCCAATGphyi15：GTCGTGAGAGAAGTCAGCGTACAAGGTGGAGTTCAATGGGAAGGTAGCTGGAGAGGAGTCCAAGGTGTGGTTGGAAGAGGTGTCGTCATGphyi16：GGTGGTGGACAAAGGCTTAGTACCATTGTACAAACCCAAAGCGAACAAGATGGAGATGATACCATTGTCGTGAGAGAAGTCAGCGTACAAGphy17：CTGGAAGCGAATGGAACAGTCCAAGCAGAGGAGAAACCGTCGGTTTGGGTGATGTTTTCGAGAGTGGTGGTGGACAAAGGCTTAGTACphyi18：GTTGOACCAAGACTCTGACCAATGGCTCCTGTTCAGCTTGGCATTGCATCATTTCGACGTACGCAATGGAAGCGAATGGAACAGTCphyi19：GAAGGAGTCTCTAGTACATCTACCCAAAGCATCGACTGGACAACCATGCAATGGGACGACTCTATCGTTGACCAAGACTCTGACCAATGPhyi20：TTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCACCACCGGTACTAGCGAAGGACAAACCTCTGACGAAGGAGTCTCTAGTACATCTAC实施例2：酸性植酸酶基因的DNA分子重排(DNA Shuffling)

2.1 PCR扩增酸性植酸酶基因及回收

以合成植酸酶基因为模板，phyiZ1，phyiF1为引物扩增植酸酶基因，phyiZ1：(5’-TTGGATCCTTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAAC-3’)；phyiF1：(5’-CGAG CTCTTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCAC-3’)反应条件为：94℃10min预变性，94℃变性30s，72℃退火和延伸1.5min，共30个循环，1％Agrose电泳，透吸袋法回收1.4kp的基因片段。2.2DNase I降解DNA及回收小片段

回收phyi基因片段以DNase I缓冲液(50mmol/L Tris-ClpH7.4+1mmol/L MgCl₂)100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10％丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μl 10×无引物PCR缓冲液(Primerless PCR Buffer)(50mmol/LKCl+10mmol/L Tris-Cl pH9.0+1％Triton)溶解沉淀。2.3无引物PCR(Primerless PCR)

进行Primerless PCR扩增。反应体系：5μl小片段DNA+4μl2.5mmol/L dNTPs+4.5μl 25mmol/L MgCl₂+Taq2U+ddH₂O to 50μl；反应程序为：94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45个循环)，2％Agrose电泳检测PCR扩增结果。

2.4有引物PCR(Primer PCR)

进行PrimerPCR扩增反应。反应体系：5μl Primerless PCR产物+phyiZ10.2ng+phyiF1 0.2ng+10×PCR Buffer 5μl+2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ddH₂O to 50μl。反应程序为：94℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35个循环，1％Agrose电泳检测，回收1.4kp基因片段。2.5高活性植酸酶筛选

回收1.4kb的重排植酸酶基因片段，经BamH I和SacI双酶切后，构建入原核表达载体pG251(CN1338515)启动子和t1t2终止子之间，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，库容达到10⁷，进行高比活植酸酶的筛选。

取1μl细菌稀释96倍，等量加入96孔细菌培养板(12×8)，在每一个孔中加入150μl的LB培养液至OD₆₀₀＝0.4-0.6，从培养板的孔中取出10μl菌液转移到试管中培养，同一行的12个孔和同一列的8个孔中的细菌放置同一根试管中培养，共20根试管，每管加入带氨苄青霉素的LB培养液3mL，培养8-12小时后，离心回收菌体，超声破碎细胞，离心取上清100μl，加入植酸钾钠底物，37℃反应30分钟，加入钼蓝显色剂(钼酸胺，硫酸亚铁，浓硫酸)显色。

取每行中活性最高和每列中活性最高的交接点，将10μl培养板交接点孔中的细菌稀释96倍后，加入另一块培养板培养，每孔150μlLB培养液，10μl菌液，进行新一轮筛选。3-5轮筛选后，取交接点中细菌稀释10-100倍涂布在含氨苄抗生素的LB固体培养板上，挑取单菌落进行活性比较，获得高比活的植酸酶基因phyi。

实施例4：酵母表达植酸酶载体构建

按合成基因的两端序列设计引物，在基因5’端加入xho I切点和信号态切割序列，引物为：PHY1Z(5’-AACTCGAGAAAAGAGAACCTCCGGATTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCC-3’)，在基因3’端加入Not I切点：引物为：PHY1F(5’-AACGCGGCCGCTTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCACCACCGGTAC-3’)。扩增片段克隆后，Xho I和Not I双酶切，定向插入pPIC9载体(Invitrogen company产品)，构建成phyi的酵母表达载体pPphyi(图1)。

实施例5：植酸酶高表达重组酵母筛选

将活化的酵母菌株Pichia Pastoris 于500ml YPD中30℃培养18hr，至OD₆₀₀＝1.7，5000r/min离心收集菌体，先后用500，250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清夜，用20ml预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5ml预冷的山梨醇悬浮，用于电击感受态。

大量抽提酵母表达载体pPphyi，BglII酶切回收小片段，取2μg线性化片段加入50μL感受态细胞，冰浴5min，用Bio-Red GenePulser电击仪电击，参数为2.5Kv，25μF。电击结束后立即加入1.0ml预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于固体选择培养基平板(18.6％山梨醇，2％葡萄糖，1.34％YNB，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，2％琼脂糖)，30℃培养直至转化子出现。用牙签将转化子对应点种到MM(1.34％YNB，0.00004％生物素，0.5％甲醇，1.5％琼脂糖)和MD(1.34％YNB，0.00004％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂糖)平板上，30℃培养2d，在MD上生长正常而在MM上生长不正常或不生长的转化子为阳性克隆。

将重组酵母接种于20ml BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB0.000004％生物素，1％甘油)，30℃培养，离心收集菌体，加入20ml诱导培养基BMMY(用0.5％甲醇代替BMGY中的甘油)，30℃下继续诱导培养36hr。

以甲醇为唯一碳源的MM培养基和以葡萄糖为碳源的MD培养基进行对应培养，进一步筛选定点整合的重组转化子49个，命名为P.pastohs PHYI1、2、3.....49。

将所有的阳性克隆单独接种三角瓶中，30℃培养至OD₆₀₀＝4-5，利用甲醇诱导培养36hr，每个诱导菌株取5μl上清液进行SDS-PAGE检测，另取10μl上清液稀释100倍，以植酸钾钠为底物进行酶活性测定。植酸酶酶活性测定方法采取钼黄法(BASF Company)。植酸酶酶活性单位(U)定义为：在37℃下，每分钟分解植酸盐释放出1nmol/L无机磷酸所需要的酶量为1U。结合电泳条带和酶活力单位，筛选到4株高效表达植酸酶基因的重组子P.pastoris PHYI11，P.pastoris PHYI19、P.pastoris PHYI25、P.pastoris PHYI42。

实施例6：重组菌株的高密度发酵

挑取植酸酶高表达重组酵母P.pastoris PHYI19菌株接种200ml YPED培养基，30℃培养至OD₆₀₀＝3.0，转入B.Braun 5L发酵罐中进行高密度发酵，以YPED培养重组酵母，利用氨水控制pH值为5.5，发酵过程中氧含量控制在20％，培养90hr，甘油耗尽，加入0.5％甲醇，30℃诱导培养。

30℃培养6hr后，重组酵母进入对数生长期，氧消耗加快，须充入纯氧，氧含量控制在20％，在发酵过程中，持续加入氨水调节pH值恒定在5.5，发酵90hr后，OD₆₀₀＝110，加入0.5％甲醇诱导培养，诱导不同时间后取3ul无菌体的诱导培养液进行SDS-PAGE检测。结果(图2)，随着诱导时间的增加，植酸酶的表达量不断提高，60h后，上清液中的表达量保持稳定。重组子P.pastoris FPHY34诱导60hr后，植酸酶表达量高达1.2mg/ml。表达的植酸酶分子量大小约为85kD。

在37℃pH5.5的条件下对含表达产物的培养液进行植酸酶活性测定，重组酵母P.pastoris PHYI19培养60hr后，酶活力为1,030,000u/ml，增加诱导表达时间，植酸酶的表达量仅缓慢增加。

实施例7：植酸酶性质测定

将底物分别配制成pH＝1.5；2.5；3.5；4.5；5.5；6.5，以pH＝5.5时的酶活单位为100％，以高密度发酵上清液测定不同pH条件下植酸酶的相对活力。结果表明该植酸酶在pH2.5-6.5之间均有酶活力，pH值为2.5和5.5时，植酸酶活性最高，表现出两个峰值(图3)。

将上清液用90℃处理不同时间，放置冰上冷却，加入酶反应底物，37℃反应30min，以未经高温处理的发酵液为参比，测定上清液中的残存酶活性。经过80min处理，植酸酶的活性仍保持40％。90℃高温处理120min，仍有部分活性。

Claims

1、一种编码如下的高比活植酸酶蛋白质的基因序列由酵母工程菌发酵获得。

440 450 460 470 480 490 500TCCAGAGTCATCGCTTCTGGTAAGAAGTTCATCGAGGGTCTCCAATCCACCAAGTTGAAGGACCCAAGAGCCS R V I A S G K K F I E G L Q S T K L K D P R A510 520 530 540 550 560 570CAACCAGGTCAATCCTCTCCAAAGATCGACGTCGTCATCTCTGAGGCTTCCTCTTCCAATAACACCTTGGACQ P G Q S S P K I D V V I S E A S S S N N T L D580 590 600 610 620 630 640CCTGGTACTTGTACTGTCTTTGAAGACTCCGAATTGGCTGACACTGTCGAGGCTAACTTCACTGCTACCTTCP G T C T V F E D S E L A D T V E A N F T A T F650 660 670 680 690 700 710 720GTTCCATCCATCGAGCAGAGATTGGAGAACGACTTGTCTGGTGTCACCTTGACCGATACCGAAGTTACCTACV P S I E Q R L E N D L S G V T L T D T E V T Y

800 810 820 830 840 850 860TTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACTTGCAATCCGTGAAGAAGTACTACGGTCATGGTGCTL F T H D E W I N Y D Y L Q S V K K Y Y G H G A870 880 890 900 910 920 930GGTAATCCATTGGGTCCAACTCAAGGTGTTGGTTACGCTAACGAATTGATTGCTAGATTGACCCACTCCCCAG N P L G P T Q G V G Y A N E L I A R L T H S P940 950 960 970 980 990 1000GTCCATGACGACACCTCTTCCAACCACACCTTGGACTCCTCTCCAGCTACCTTCCCATTGAACTCCACCTTGV H D D T S S N H T L D S S P A T F P L N S T L1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080TACGCTGACTTCTCTCACGACAATGGTATCATCTCCATCTTGTTCGCTTTGGGTTTGTACAATGGTACTAAGY A D F S H D N G I I S I L F A L G L Y N G T K

1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290GATAGAGTCGTCCCATTGCATGGTTGTCCAGTCGATGCTTTGGGTAGATGTACTAGAGACTCCTTCGTCAGAD R V V P L H G C P V D A L G R C T R D S F V R1300 1310 1320 1330 1340GGTTTGTCCTTCGCTAGATCCGGTGGTGACTGGGCTGAATGCTTCGCTAAG L S F A R S G G D W A E C F A

2、根据权利要求1所述的能产生植酸酶基因的酵母工程菌，其特征在于构建成的含有PHY I的酵母表达载体pPhy I整合进酵母菌中。

3、根据权利要求1所述的能产生植酸酶基因的酵母工程菌，其特征在于与原始基因有7个氨基酸位点变化。

4、一种具有酵母高表达的权利要求1所述的高比活植酸酶基因工程菌发酵制备植酸酶的方法，其特征在于植酸酶基因

a、采用连续延伸PCR方法化学合成具有酵母偏爱密码的酸性植酸酶基因；

b、以上述合成植酸酶基因为模板，利用DNA分子重排技术，对合成基因进行体外重组，PhyIZ1、PhyIF1为引物扩增重排的植酸酶基因，回收1.4Kb重排的植酸酶基因片段，构建到原核表达载体中，电击法转达入大肠杆菌菌株获得突变体表达文库，进行高比活植酸酶筛选，获得高比活性的植酸酶基因Phy I。

c、采用合成基因两端序列设计引物，在基因5｀端加入Xhol切点和信号态切割序列，引物为Phyl Z，(5’-AACTCGAGAAAAGAGAACCTCCGGATTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCC-3’)，在基因3｀端加入Not I切点，引物为PHY1F(5’-AACGCGGCCGCTTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCACCACCGGTAC-3’)。扩增片段克隆后，Xho I和Not I双酶切，定向插入pPIC9载体，构建成phy I的酵母表达载体pPhy I；

d、植酸酶基因高表达重组酵母筛选；

e、将重组酵母菌株高密度发酵。

5、根椐权利要求4所述的制备具有酵母高表达比活性植酸酶基因的工程菌发酵制备植酸酶的方法，其特征在于构建的酵母表达载体pPhy I，含有权利要求1所述高比活性植酸酶基因序列。

6、根椐权利要求4所述的制备具有酵母高表达比活植酸酶基因的方法，其特征在于合成的植酸酶基因采用引物为Phyl Z和Phyl F扩增片段克隆后，在Xho I和Not I双酶切，定向插入pPIC9载体，构建成phy I的酵母表达载体pPhy I。