CN102382846B - 一种基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选体系，即将经过体外定向分子进化或化学诱变得到的二羟基双加氧酶突变库，涂布于固体培养基上，通过硝酸纤维素膜影印后进行显色初步筛选，再结合96孔板进行活性定量分析。本发明方法能够获得比试管培养更大的筛选能力，能够在短时间内进行二羟基双加氧酶突变库筛选。因而通过本发明方法可以开展二羟基双加氧酶突变和高通量筛选，能够较大幅度的提高二羟基双加氧酶的突变筛选效率。
Description
技术领域
本发明属微生物基因工程领域，具体涉及一种基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选体系，特别是涉及该技术体系在二羟基双加氧酶体外定向改造中的应用。
背景技术
持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs）是一类在环境中长期保持不变且广为传播、具有高脂溶性、对人类和动植物具有毒性的含碳化合物。多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）是最具有代表性的一类POPs。多氯联苯是一类含有209种同分异构体的氯代联苯，氯代程度有1-10种【Furukawa，J Gen Appl Microbiol.2000，46:283-296；Jim和Field，Environmental Pollution，2008，155：1-12】。世界上估计有120万吨PCBs，其中65%存在于电器系统、垃圾场或存储在陆地上，31%已流失到环境中【Abraham等，Curr Opin Microbiol，2002，5:246-253】。1930年，第一次报道了PCBs对人体是具有伤害的。从那时起，PCBs被证实可以致癌，同时对免疫系统、生殖系统、神经系统和内分泌系统有一系列严重的伤害。PCBs有多种毒理效应，具有化学致癌、致畸、致突变效应，其积蓄性将随含氯量的增大而提高，并可经食物链进入人体，在人体中积累和浓缩。对健康问题的关注使得PCBs作为环境清理中一个主要的目标。利用生物对有关PCBs污染土壤的修复（生物降解法）的方法研究一直是学术界的关注热点。尽管微生物只能降解较低浓度废物、速度较慢，但在土壤修复方面，因其具有修复费用低、能彻底清除污染物、不会对环境造成二次污染而被认为是最有潜力和前景的方法【Wiegel和Wu，2000，FEMS Microbiology Ecology32：1-15；Jim和Field，Environmental Pollution，2008，155：1-12】。人们已经从自然界中筛选获得一些PCBs降解菌株，但是原始筛选的菌株存在很多的缺陷，希望通过基因工程的方法改造已有的菌株甚至构建全新的生物工程菌株以提高PCBs污染环境的修复效率。由于多氯联苯的降解牵涉的基因多、难度大，对该领域的研究在国际上尚未有重大进展。
体外定向分子进化是发现和改造生物活性分子的重要方法，提供了一种高效获得多样性的方法。DNA改组是重要的体外分子进化技术，结合高通量筛选能够改造许多重要的医药、工业、环境保护等商业酶。近年来，许多体外分子进化的新策略和新方法层出不穷。推理设计是基于基因和蛋白质信息进行基因和蛋白质序列的改造，作为基因和蛋白质体外快速改造有其重要的一面【Zhao等，2002，Curr.Opin.Biotechnol.13，104-110】。DNA改组技术的发展和成熟是在上世纪九十年代末期。特别是进入21世纪以来，体外分子进化技术在新技术和新理论的推动下，又得到了长足的发展，并在农业、环境污染治理、化学工业、基因治疗、疫苗、蛋白药物等方面有着广泛的应用【Whalen等，2001Curr.Opin.Mol.Ther.3，31-36；Lassner等，2001，Curr.Opin.Plant.Biol.4，152-156；Castle等，2004Science304，1151-1154】。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选体系，该方法能够获得比试管培养更大的筛选能力，能够在短时间内进行二羟基双加氧酶突变库筛选。通过本发明方法可以开展二羟基双加氧酶突变和高通量筛选，能够较大幅度的提高二羟基双加氧酶的突变筛选效率。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。
所述的基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选体系，具体包括以下步骤：
1.二羟基双加氧酶RRBPHCI突变基因的获得
本步骤采用两步连续延伸PCR方法通过二羟基双加氧酶改组突变过程获得全合成的二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的改组突变片段。二羟基双加氧酶突变基因改组突变过程包括：（1）二羟基双加氧酶基因RRBPHCI片段的扩增，（2）二羟基双加氧酶基因片段PCR产物用DNA酶降解得到小片段，（3）小片段进行无引物的PCR扩增，以及（4）取无引物PCR产物为模板进行引物PCR扩增四步。具体介绍分别如下：
（1）二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的扩增：
通过引物RRBPHCI-1（其碱基序列如SEQ ID No2所示）和RRBPHCI-22（其碱基序列如SEQ ID No3所示）进行二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的扩增，所述二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的碱基序列如SEQ ID No1所示。
（2）回收上述二羟基双加氧酶基因扩增产物，回收的二羟基双加氧酶基因的DNA片段用DNA酶进行降解，形成长度为30-200bp的弥散小片段，通过透析袋回收其中的50-100bp的小片段。
（3）将上述回收产物进行无引物PCR扩增，即获得无引物PCR扩增产物，该产物在2%琼脂糖凝胶电泳检测形成200-400bp的弥散条带。
（4）以上述无引物扩增产物为模板，加入引物RRBPHCI-1（其碱基序列如SEQ ID No2所示）和RRBPHCI-22（其碱基序列如SEQ ID No3所示）进行PCR扩增，其扩增产物即为二羟基双加氧酶基因改组突变基因。
2.二羟基双加氧酶基因改组突变基因大肠杆菌突变库的建立
本步骤是将上述二羟基双加氧酶基因改组突变基因经过BamHI和SacI双酶切后，植入同样经过双酶切的含有氨苄青霉素抗性基因的表达载体pYPX251（GenBank登陆号：AY178046）中，该质粒为带庆大霉素抗性基因原核启动子及t1t2终止子的原核表达载体【具体参考文献：Xiong等，AppliedMicrobiology and Biotechnology，2007，74(1):160-168】。
通过电击的方法，将上述获得的含有二羟基双加氧酶基因改组突变基因的表达载体质粒转入宿主菌大肠杆菌DH5α（E.Coli DH5α）中，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜，长出转化子【具体电击的方法参考文献：Sambrook J，Frets E F，Mannsdes T et al.In:Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989】。
3、基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶高通量筛选
试验方法：将37℃培养过夜的含有二羟基双加氧酶基因改组突变基因的大肠杆菌转化子培养皿正面朝上放置于超净台上。打开培养皿，用镊子将硝酸纤维素膜放置于大肠杆菌转化子上。用镊子轻轻压，使硝酸纤维素膜被菌落浸湿。用镊子夹住被菌落浸湿硝酸纤维素膜的一角，轻轻掀起硝酸纤维素膜。超净台风机风干含有菌落的湿硝酸纤维素膜。含有菌落的湿硝酸纤维素膜菌落朝上放置于含有100μmol/L底物2,3-二羟基联的溶液的滤纸上反应，挑选显色快且深的克隆。
本发明的有益效果：
本发明公开了一种基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选体系，该体系能够进行大规模的二羟基双加氧酶突变个体的筛选，能够获得比单个突变体分别筛选更优的筛选能力。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但实施例并不限制于本发明。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株，含有二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的质粒模板FB1652由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。载体、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司和美国NewEngland Biolabs公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。
本发明涉及的分子生物学实验若没有特殊说明，均参考《分子克隆》一书【Sambrook J，Frets E F，Mannsdes T et al.In:Molecular Cloning.2nd ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989】。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。
实施例1：二羟基双加氧酶基因改组突变的获得
（一）试验方法：
1、二羟基双加氧酶基因的PCR扩增
通过引物RRBPHCI-1（其碱基序列如SEQ ID No2所示）和RRBPHCI-22（其碱基序列如SEQ ID No3所示），以含有二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的质粒模板FB1652进行扩增。
扩增反应程序为94℃，10min预变性，94℃变性30s，62℃复性30s和72℃延伸1min30s，共30循环，最后再72℃延伸10min。采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，用DNA胶回收试剂盒回收得到900bp目的基因片段。
2、二羟基双加氧酶基因DNA片段的DNase I降解及回收
1）DNase I降解：
用100μl DNase I缓冲液溶解回收的二羟基双加氧酶基因DNA片段，加入0.1U DNase I，25℃处理15min后70℃处理10min（失活DNA酶）。采用10%丙烯酰胺凝胶电泳鉴定降解产物，降解产物为30-200bp的弥散小片段。本步骤中，DNase I缓冲液的组成为：50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1mmol/LMgCl2。
2）降解产物回收：
用透析袋法回收50-100bp的小片段，用10μl10×无引物PCR缓冲液（50mmol/L KCl+10mmol/LTris-Cl pH9.0+1%Triton）溶解沉淀。
3、降解产物的无引物PCR扩增：
1）反应体系：降解小片段DNA模板：5μl；dNTPs（2.5mmol/L）：4μl；MgCl2（2.5mmol/L）：4.5μl；Taq聚合酶：2U；加ddH2O至终体积为50μl。
2）反应程序为：94℃，30s；40℃，30s；72℃，30s；共45个循环。
3）采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，扩增产物为200-400bp的弥散片段，用透析袋法回收DNA。
4、无引物PCR扩增产物的引物PCR扩增：
1）反应体系：无引物PCR扩增产物模板：5μl；引物RRBPHCI-1（其碱基序列如SEQ ID No2所示）：RRBPHCI-22（其碱基序列如SEQ ID No3所示）：0.2ng；10×PCR buffer：5μl；dNTPs（2.5mmol/L）：4μl；Taq聚合酶：2U；加ddH2O至终体积为50μl。
2）反应程序为：94℃，30s；62℃，30s；72℃，2min；共35个循环。
3）采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，扩增产物为900bp的基因片段，用透析袋回收DNA。
（二）试验结果：
1、采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，得到900bp目的基因片段。
2、采用丙烯酰胺凝胶电泳鉴定降解产物可以看出，二羟基双加氧酶基因的DNA片段经DNase I降解后，形成长度为30-200bp的弥散小片段。
3、回收的降解产物经过无引物PCR扩增后得到200-400bp的弥散片段。
4、用琼脂糖凝胶电泳检测引物PCR扩增结果可以看出，无引物扩增产物经过引物PCR扩增后，得到长度为900bp左右的片段。此片段即为二羟基双加氧酶基因改组突变获得的突变基因。
实施例2：含二羟基双加氧酶突变基因的大肠杆菌转化子的构建
（一）试验方法：
1、突变体库大肠杆菌质粒的构建
按Sambrook分子生物学基本操作【Sambrook J，Frets E F，Mannsdes T etal.In:Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989】，先通过BamHI和SacI将回收的二羟基双加氧酶突变基因进行酶切，再将含有氨苄青霉素抗性基因的表达载体pYPX251酶切，然后用T4DNA连接酶将二羟基双加氧酶突变基因DNA片段连接到表达载体pYPX251中，得到的连接产物即为含二羟基双加氧酶突变基因DNA片段的突变体库的大肠杆菌表达质粒。
2、突变体库转化子的构建
将构建好的含二羟基双加氧酶突变基因DNA片段的突变体库的大肠杆菌表达质粒通过电击转化大肠杆菌菌株DH5α，转化物涂布在含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，长出克隆，即为含有二羟基双加氧酶突变基因的大肠杆菌转化子库。
（二）试验结果：
1、采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定含二羟基双加氧酶突变基因DNA片段的突变体库的大肠杆菌表达质粒，得到900bp目的基因片段和2.8kb的载体。
实施例3：基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧突变酶高通量筛选
（一）试验方法：
1、将37℃培养过夜的含有二羟基双加氧酶突变基因的大肠杆菌转化子培养皿正面朝上放置于超净台上。
2、打开培养皿，用镊子将硝酸纤维素膜放置于大肠杆菌转化子上。
3、等待3-5分钟后，用镊子轻轻压，使硝酸纤维素膜被菌落浸湿。
4、用镊子夹住被菌落浸湿硝酸纤维素膜的一角，轻轻掀起硝酸纤维素膜。
5、超净台风机风干含有菌落的湿硝酸纤维素膜。
6、含有100μmol/L底物2,3-二羟基联的溶液的滤纸上反应。
7、挑选显色快且深的克隆，进一步分析。
（二）试验结果：
1、大肠杆菌库容达到每个9cm的培养皿上约2万左右。
2、部分克隆显黄色。
3、通过96孔板的进一步分析，可以较好的将显色快的突变个体筛选出来。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而并非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (3)
1.一种基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）二羟基双加氧酶突变基因的获得，其具体步骤如下：
1）碱基序列如SEQ ID No1所示的二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的扩增：通过碱基序列如SEQ ID No2所示的引物RRBPHCI-1和碱基序列如SEQID No3所示的RRBPHCI-22进行二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的扩增；
2）回收上述二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的扩增产物，对回收的二羟基双加氧酶基因RRBPHCI的DNA片段用DNA酶进行降解，形成长度为30-200bp的弥散小片段，通过透析袋回收其中的50-100bp的小片段；
3）对上述回收的小片段进行无引物PCR扩增，即获得无引物PCR扩增产物，该产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测形成200-400bp的弥散条带；
4）以上述无引物PCR扩增产物为模板，加入碱基序列如SEQ ID No2所示的引物RRBPHCI-1和碱基序列如SEQ ID No3所示的RRBPHCI-22进行PCR扩增，其扩增产物即为二羟基双加氧酶突变基因；
（2）上述获得的二羟基双加氧酶突变基因，经BamHI和SacI双酶切后，植入含有氨苄青霉素抗性基因的载体pYPX251中，获得带庆大霉素抗性基因、原核启动子及tlt2终止子的二羟基双加氧酶突变基因原核表达载体质粒，再经电击将质粒转入宿主菌大肠杆菌DH5α中，在氨苄青霉素的固体培养基上培养得转化子；
（3）将上述获得的二羟基双加氧酶突变基因的大肠杆菌转化子，影印至硝酸纤维素膜上，以二羟基联苯为底物进行高通量筛选。
2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤（2）得到的转化子带有含庆大霉素抗性基因、原核启动子及tlt2终止子的原核表达载体质粒。
3.权利要求1所述的高通量筛选方法在二羟基双加氧酶突变个体筛选中的应用。
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